CN102167745B - 一种全人源抗IgE单克隆抗体、其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种全人源抗IgE单克隆抗体、其制备方法及用途。本发明构建了大容量的天然人源噬菌体抗体库，从中筛选获得了一株全人源抗IgE抗体2E19，其重链可变区氨基酸序列为SEQID NO：6所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示。本发明还公开了2E19抗体的制备方法以及编码2E19抗体的核苷酸序列、含该核酸序列的表达载体和宿主细胞。本发明的2E19抗体具有更高的抗体亲和力，可显著抑制IgE与细胞表面Fc RI结合导致的脱颗粒，并且不与结合于细胞表面FcεRI的IgE结合。本发明的2E19抗体可用于制备治疗超敏反应性疾病药物，尤其是治疗过敏性哮喘。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种全人源单克隆抗体、其制备方法及用途。
背景技术
超敏反应是指机体受某种抗原物质刺激后产生的一种异常或病理性免疫反应，常表现为免疫反应性增高，多在机体再次接触相同抗原时发生。超敏反应与免疫应答本质上都是机体对某些抗原物质的特异性免疫应答，但前者主要表现为组织损伤和(或)生理功能紊乱，后者主要表现为生理性防御效应。
超敏反应的分类方法很多，但目前大多采用Gell和Coombs(1963)的分类，即根据超敏反应发生的机制和临床特点分为I～IV四个型：①速发型超敏反应(I型)；②细胞毒型超敏反应(II型)；③免疫复合物型超敏反应(III型)；④迟发型超敏反应(IV型)。I、II、III型由抗体介导，可经血清被动转移给其它动物；IV型由T细胞介导，可经细胞转移。超敏反应所致免疫损伤的发生机制十分复杂，临床实践所见往往为混合型，仅以某一型损伤为主。
I型超敏反应
I型超敏反应又称过敏反应(anaphylaxis)或速发型超敏反应(immediatehypersensitivity)。其特点是：主要由特异性IgE抗体所介导；反应发生迅速、恢复也较快；反应发生后，通常引起效应器官功能紊乱，而不发生组织细胞损伤；具有明显个体差异及遗传倾向。
参与I型超敏反应的主要成分和细胞引起I型超敏反应的抗原物质很多，常见的吸入性变应原主要有植物花粉、尘螨、真菌、人或动物皮屑、羽毛和昆虫成份等；食物变应原主要有牛奶、鸡蛋、鱼、虾、蟹、贝等；药物或其他化学物质如青霉素、普鲁卡因、有机碘、免疫血清、化纤和塑料等，它们通过吸入、食入、注射或接触使机体致敏。
引起I型超敏反应的抗体主要是IgE。IgE的重要生物学特性是具有同种组织细胞亲嗜性，通过其Fc片段与自身或同种动物肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的相应受体结合，而使机体处于致敏状态。参与I型超敏反应的主要细胞是肥大细胞和嗜碱性粒细胞，其中的肥大细胞广泛分布于皮肤粘膜下层及其血管周围的疏松结缔组织中；嗜碱性粒细胞主要存在于血液中，有时可到达炎症部位。这两种细胞的表面有大量高亲和性IgE受体(FcεRI，即I型高亲和力受体)，胞质内含有大量嗜碱性颗粒。细胞表面FcεRI与IgE的Fc片段结合后进入致敏状态。当致敏细胞以一定的方式再次接触相同变应原时，即可激发细胞脱颗粒，释放生物活性介质，产生相应的临床症状。
I型超敏反应的发生过程与机制
I型超敏反应的发生过程可大致分为三个阶段，即致敏阶段、发敏阶段和效应阶段。其发生基本过程如下：
1.致敏阶段：变应原初次进入机体时，可刺激B细胞增殖分化，并产生IgE抗体。IgE以其Fc片段与靶细胞(组织中的肥大细胞或血液中的嗜碱性粒细胞)表面的FcεRI结合，成为致敏靶细胞，使机体呈致敏状态。通常致敏状态可维持数月至数年。
2.发敏阶段：相同变应原再次进入致敏机体，通过与致敏靶细胞上两个以上的IgE分子结合，即可能介导桥联反应，即由双价或多价变应原(过敏原)分子和两个以上的IgE分子靠近而发生的构型改变。继而导致FcεRI聚集，介导细胞脱颗粒释放组胺等物质。
3.效应阶段。生物活性介质释放后作用于效应器官，可导致局部或全身性超敏反应的发生。
常见的I型超敏反应性疾病
在不同动物种属或个体，其易受活性介质攻击的组织器官各异，反应程度和部位也视再次接触变应原的量和进入机体的途经不同而有差异。因此，超敏反应的临床表现在不同种属动物和个体间差异很大。I型超敏反应可表现为全身性和局部性超敏反应。
急性全身性超敏反应又称过敏性休克，是发生最为迅速和最为严重的一种超敏反应，如药物过敏性休克和血清过敏性休克等；这类超敏反应性疾病多发生于再次接触变应原后数分钟内，主要表现为烦燥不安、呼吸困难、恶心呕吐、脉博细速、四肢厥冷、血压下降，以至意识障碍和昏迷、抽搐，严重时可因休克而死亡。
局部性超敏反应性疾病较急性全身性超敏反应更为常见，其发生的部位与变应原进入机体的途径有关，如呼吸道超敏反应、消化道超敏反应和皮肤超敏反应等均属于这类反应性疾病。
研究表明，IgE介导的呼吸道超敏反应是引起过敏性休克最主要的机制之一。因此，阻断IgE—IgE受体之间的相互作用，就有可能对这类疾病起到减缓病情的作用。抗IgE单克隆抗体可以抑制IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面高亲和力IgE受体(FcεRI)结合，从而限制了介导过敏反应的物质的释放。这类抗体还可使嗜碱性粒细胞表面的FcεRI减少，从而达到治疗I型过敏性反应的目的。
诺华(Novartis)与Tanox公司联合开发了一种抗IgE人源化抗体药物，商品名Xolair。该药用于成人及青少年中至重度持续性哮喘，但该药对其他过敏状态尚无安全性及有效性的数据。Xolair是一个人源化抗体，保留了鼠源CDR区和少量FR区鼠源残基，仍未能达到全人源化，且存在着亲和力不高的问题。
发明内容
本发明构建了大容量的天然人源噬菌体抗体库，从中筛选获得了一株全人源抗IgE抗体2E19。
更具体地，本发明公开了全人源抗IgE抗体，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示；
本发明公开的上述全人源抗IgE抗体，重链氨基酸序列为SEQ ID NO：10所示，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：12所示；
本发明还公开了一种核苷酸序列，编码上述的全人源抗IgE抗体；
本发明公开了上述核苷酸序列，其中编码全人源抗IgE抗体重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：5所示，编码全人源抗IgE抗体轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：7所示；
本发明公开了上述核苷酸序列，其中编码全人源抗IgE抗体重链的核苷酸序列为SEQ ID NO：9所示，编码全人源抗IgE抗体轻链的核苷酸序列为SEQ IDNO：11所示；
本发明还公开了一种表达载体，含有上述的核苷酸序列，为pcDNA3.1/ZEO(+)或pcDNA3.1(+)；
本发明还公开了上述表达载体转化的宿主细胞，为CHO-K1细胞；
本发明进一步公开了上述全人源抗体的制备方法，包括从噬菌体人源抗体库筛选获得高亲和力全人源抗IgE单链抗体；全人源抗IgE完整抗体分子真核表达载体的构建；全人源抗IgE完整抗体分子在CHO细胞中的表达；全人源抗IgE完整抗体分子的纯化。
本发明最后公开了上述的全人源抗体在制备治疗超敏反应性疾病药物中的用途，其中超敏反应性疾病为I型超敏反应性疾病，包括呼吸道超敏反应、消化道超敏反应和皮肤超敏反应，其中呼吸道超敏反应更具体的为过敏性哮喘。
本发明利用得到的抗体进行了一系列实验，实验结果表明：与Xolair(Omalizumab)比较起来，本发明得到的抗体具有更高的抗体亲和力；并且其可以显著抑制IgE与细胞表面FcεRI结合导致的脱颗粒，其抑制程度显著优于Xolair。同时，本发明得到的抗体不与结合于细胞表面FcεRI的IgE结合，不会导致体内已致敏靶细胞的IgE交联及脱颗粒，因此，本发明抗体用于制备治疗抗过敏药物是安全的。
附图说明
图1.抗IgE抗体2E19抑制IgE与可溶性FcεRI的结合实验结果；
图2.抗IgE抗体2E19抑制IgE与细胞表面FcεRI的结合实验结果；
图3.抗IgE抗体2E19抑制与结合于细胞表面FcεRI的IgE的结合实验结果；
图4.抗IgE抗体2E19抑制IgE与细胞表面FcεRI的结合所引起脱颗粒的功能学实验结果。
具体实施方式
以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。
实施例抗体的制备
(1)人抗体轻、重链恒定区基因的克隆
用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cell，1980，22：197-207)和文献(Nucleic Acids Research，1982，10：4071-4079)报道的序列分别设计引物采用RT-PCR反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH和pGEM-T/CL。
(2)cDNA的制备
收集50健康人的外周血各20ml，混合，用淋巴细胞分离液(医科院天津血研所生产)分离单个核细胞。用Trizol试剂(Invitrogen公司)从分离的人外周血淋巴细胞中提取细胞的总RNA。用cDNA反转录试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司)反转录出cDNA。以上步骤按照厂家提供的说明书进行。
(3)引物设计
参考文献(Immunotechnology，1998，3：271-278)设计并合成克隆人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的VHBack，VHFor，VLBack和VLFor引物。VHBack，VHFor，VLBack和VLFor的序列见Immunotechnology，1998，3：271-278。其中在VHBack引物的5’端加上含有Sfi I位点的序列atg gcc cag ccg gcc atg gcc，在VHFor引物的5’端加上序列gcc aga acc acc gcc gcc gga gcc acc acc gcc，在VLBack引物的5’端加上序列tcc ggc ggc ggt ggt tct ggc gga ggc gga tct，在VLFor引物的5’端加上含有Not I位点的序列atg cgg ccg c。
(4)噬菌体抗体库的构建及筛选
采用(2)中的cDNA和(3)中的引物，利用recombinant Phage antibody system试剂盒(Amersham Biosciences公司)构建噬菌体单链抗体库，然后用特异性抗原对文库进行淘选。抗体库构建和淘选方法参照recombinant Phage antibodysystem试剂盒说明书进行，用于淘选的特异性抗原“重组人IgE抗体Fc段”按参考文献(Protein Engineering 8；2(193-199)1995)”的方法制备。经多次淘选抗体库后获得了一株抗人IgE单链抗体2E19ScFv，测序后获得其基因序列。SEQID NO：5和SEQ ID NO：6分别显示了2E19ScFv重链可变区VH的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别显示了2E19ScFv轻链可变区VL的核苷酸序列和氨基酸序列。
(5)全人源抗体在真核细胞中的表达
以2E19ScFv基因和pGEM-T/CH为模版，通过重叠PCR合成全人源抗体重链基因，反应条件为：95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟。并使此全人源抗体重链基因的5′端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3′端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。最后琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收目的条带并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收全人源抗体重链片段2E19VHCH，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)进行连接，构建成全人源重链真核表达载体pcDNA3.1(+)(2E19VHCH)。
以2E 19ScFv基因和pGEM-T/CL截体为模板，通过重叠PCR合成全人源化抗体轻链基因，反应条件为：95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟，得到PCR产物，其5′端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3′端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收全人源抗体轻链片段2E19VLCL，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3.1/ZEO(+)(Invitrogen公司)载体进行连接，构建成全人源轻链真核表达载体pcDNA3.1/ZEO(+)(2E19VLCL)。
于3.5cm组织培养皿中接种3×105CHO-K1细胞(ATCC CRL-9618)，细胞培养至90％-95％融合时进行转染：取质粒10μg(质粒pcDNA3.1(+)(2E19VHCH)4μg，质粒pcDNA3.1/ZEO(+)(2E 19VLCL)6μg)和20μl Lipofectamine2000Reagent(Invitrogen公司产品)按Lipofectamine2000Reagent试剂盒说明书进行转染。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418(Invitrogen公司产品)和250μg/ml Zeocin(Invitrogen公司产品)的DMEM培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：羊抗人IgG(Fc)(KPL公司)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品Human myelomaIgG1，κ(Sigma)，37℃温育2h，加入HRP-羊抗人IgG(κ)((SouthernBiotechnology Associates公司)进行结合反应，37℃温育1h，加入TMB显色液于37℃作用5min，最后用H2SO4终止反应，测A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化全人源抗体2E19。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。SEQID NO：9和SEQ ID NO：10分别显示了全人源抗体2E19的重链核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12分别显示了全人源抗体2E19的轻链核苷酸序列和氨基酸序列。
实验例
实验例1.抗IgE抗体2E19的亲和力检测
运用Biacore T100系统(Biacore AB，Uppsala，Sweden)通过表面等离子体激元共振(SPR)检测抗IgE抗体的亲和力常数。将重组人IgE抗体Fc段通过氨基共价结合与CM5生物传感芯片(Biacore)上，将①全人源抗体2E19；②全人源抗体Xolair(Omalizumab，市售产品国外上市)；③阴性对照抗体Trastuzumab(市售产品)(以PBS/0.05％TWEEN-20(ICI Americas)(去污剂)配溶液，配成不同的浓度(2倍比浓度稀释)，以50μl/min的流速通过芯片。每次检查之后，用5μl 50mM盐酸水溶液以3μl/min的流速洗涤，从而将残留的抗体从固定化的配体上洗脱下来。用BIAevalution软件(T100evalution 2.0版，Biacore)，通过非线性回归法分析结合曲线。结果如表1所示，全人源抗体2E19的KD值为0.21nM，显著低于全人源抗体Omalizumab，说明全人源抗体2E19对IgE抗体的亲和力高于Omalizumab，实验结果见表1
表1亲和力试验结果
实验例2.抗IgE抗体2E19抑制IgE与可溶性FcεRI的结合实验
人IgE可与其受体FcεRI特异结合。辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgE与FcεRI结合的量效曲线应为“S”形，即随着HRP-IgE浓度的增加，显色程度也逐渐增加，直至达到饱和；抗IgE抗体可与IgE的受体结合部位特异结合，并抑制IgE与相应受体FcεRI的结合。若反应体系中存在抗IgE抗体对HRP-IgE的竞争，在HRP-IgE浓度一定的条件下，随着加入的抗IgE浓度的增加，FcεRI结合的HRP-IgE量逐渐减少，因此量效曲线呈反“S”形；在包被受体和HRP-IgE相同的条件下，IC50值越小，则说明加入的抗IgE抗体与HRP-IgE竞争的能力越强，即抗体的活性越好。
重组人FcεRI(R&D)，用PBS稀释至5μg/ml，加入酶标板，100μl/孔，37℃包被2小时。弃去孔中液体，用含0.1％Tween20的PBS(PBST)洗涤3次，每次在吸水纸上拍干。用PBS将牛血清白蛋白稀释至3％，加入酶标板，加满孔，4℃封闭过夜。弃去孔中液体，用PBST洗涤3次，每次在吸水纸上拍干。用PBS将HRP-IgE(IgE为细胞CRL-8033分泌表达，用Pierce公司HRP标记试剂盒标记获得)稀释至6μg/ml，用稀释好的HRP-IgE将全人源抗IgE单克隆抗体2E19、Xolair(Novartis)和阴性对照Trastuzumab(Genentech)稀释至100μg/ml，并连续2倍比稀释。将稀释好的HRP-IgE将全人源抗IgE单克隆抗体2E19、Xolair和阴性对照Trastuzumab加入酶标板中，100μl/孔，设置复孔。37℃反应45分钟。弃去孔中液体，用PBST洗涤3次，每次在吸水纸上拍干。新鲜配制的TMB显色底物(A液与B液等体积混合，晶美生物)，100μl/孔加入酶标板，室温避光反应5-10分钟。加入终止液，100μl/孔。酶标仪检测A450nm，630nm为参考波长。结果见表2和图1。
表2
实验结果显示，本发明全人源抗IgE单克隆抗体2E19阻断IgE与与可溶性FcεRI结合的IC50最小，因此其与IgE的亲和力最高。
实验例3.抗IgE抗体2E19抑制IgE与细胞表面FcεRI的结合实验
人IgE可与其受体FcεRI特异结合。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的IgE与FcεRI阳性细胞结合的量效曲线应为“S”形，即随着FITC-IgE浓度的增加，细胞表面荧光强度也逐渐增加，直至达到饱和；抗IgE抗体可与IgE的受体结合部位特异结合，并抑制IgE与相应受体FcεRI的结合。若存在抗IgE抗体对FITC-IgE的竞争，在FITC-IgE浓度固定的条件下，随着加入的抗IgE浓度的增加，细胞结合的FITC-IgE量逐渐减少，因此量效曲线呈反“S”形；在靶细胞和FITC-IgE相同的条件下，IC50值越小，则说明加入的抗IgE抗体与FITC-IgE竞争的能力越强，即抗体的活性越好。
对数生长期CRL2256-FcεRI(参见Wilson，A.P.，C.E.Pullar，A.M.Camp，andB.A.Helm.1993.Eur.J.Immunol.23：240.)细胞，0.25％胰蛋白酶消化，计数，含1％血清的PBS洗涤，调整细胞密度至1×105/ml，加入流式细胞仪专用管，100μl/管；含1％血清的PBS将FITC-IgE(IgE为细胞CRL-8033分泌表达，用透析法标记FITC(Amresco)获得)稀释至20μg/ml。用稀释好的FITC-IgE将人源化抗IgE单克隆抗体2E19、Xolair(Novartis)、阴性对照Trastuzumab分别稀释至200μg/ml，并连续倍比稀释。将稀释液加入上述流式管中，100μl/管，设复管，冰浴避光反应45分钟；含1％胎牛血清的PBS洗涤细胞2次，每次200g离心5分钟，弃上清，细胞沉淀重悬于300μl含1％胎牛血清的PBS，流式细胞仪检测每管的荧光强度。以样品浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，结果见表3和图2。
表3
实验结果显示，本发明全人源抗IgE单克隆抗体2E19阻断IgE与细胞表面FcεRI结合的IC50值最小，因此其与IgE的亲和力最高。
实验例4。抗IgE抗体2E19抑制与结合于细胞表面FcεRI的IgE的结合实验引起I型超敏反应的抗体主要是IgE。IgE的重要生物学特性是具有同种组织细胞亲嗜性，通过其Fc片段与自身或同种动物肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的相应受体(FcεRI)结合，而使机体处于致敏状态。参与I型超敏反应的主要细胞是肥大细胞和嗜碱性粒细胞。这两种细胞的表面有大量高亲和性IgE受体(FcεRI)，胞质内含有大量嗜碱性颗粒。细胞表面FcεRI与IgE的Fc片段结合后进入致敏状态。当致敏细胞以一定的方式再次接触相同变应原时，即可激发细胞脱颗粒，释放生物活性介质，产生相应的临床症状。机体中可能存在已致敏的肥大细胞和嗜碱性粒细胞，若人源化抗IgE单克隆抗体可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE结合，则可导致桥联反应，激发细胞脱颗粒，释放生物活性介质，产生相应的临床症状。因此，人源化抗IgE单克隆抗体只能与游离IgE结合而不能结合肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面IgE，才能产生治疗效果而不至于恶化病情。
对数生长期CRL2256-FcεRI细胞(参见Wilson，A.P.，C.E.Pullar，A.M.Camp，andB.A.Helm.1993.Eur.J.Immunol.23：240.)，0.25％胰蛋白酶消化，计数，含1％血清的PBS洗涤，调整细胞密度至1×105/ml，加入流式细胞仪专用管，100μl/管；含1％血清的PBS将IgE(细胞CRL-8033分泌表达)稀释至10μg/ml，加入上述流式管中，100μl/管，设复管，冰浴反应45分钟；含1％胎牛血清的PBS洗涤细胞2次，每次200g离心5分钟，弃上清。含1％胎牛血清的PBS将2E19及Xolair(Novarits)分别稀释至50μg/ml，并连续10倍比稀释，加入流式管中，100μl/管，冰浴反应45分钟；含1％胎牛血清的PBS洗涤细胞2次，每次200g离心5分钟，弃上清；含1％胎牛血清的PBS将FITC标记的抗人IgG抗体(Zymed)稀释1000倍，加入流式管中，100μl/管，冰浴避光反应45分钟，含1％胎牛血清的PBS洗涤细胞2次，每次200g离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用0.5ml PBSS重悬，流式细胞仪检测每管的荧光强度。以样品浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，结果见图3。
本发明全人源抗IgE单克隆抗体2E19和Xolair相似，不与结合于细胞表面FcεRI的IgE结合，因此不会导致体内已致敏靶细胞的IgE交联及脱颗粒。实验例5.抗IgE抗体2E19抑制IgE与细胞表面FcεRI的结合所引起脱颗粒的功能学实验
引起I型超敏反应的抗体主要是IgE。IgE的重要生物学特性是具有同种组织细胞亲嗜性，通过其Fc片段与自身或同种动物肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的相应受体(FcεRI)结合，而使机体处于致敏状态。参与I型超敏反应的主要细胞是肥大细胞和嗜碱性粒细胞。这两种细胞的表面有大量高亲和性IgE受体(FcεRI)，胞质内含有大量嗜碱性颗粒。细胞表面FcεRI与IgE的Fc片段结合后进入致敏状态。当致敏细胞以一定的方式再次接触相同变应原，或抗IgE抗体等介导细胞表面IgE发生桥联反应，即可激发细胞脱颗粒，释放生物活性介质。重组抗IgE单克隆抗体可以阻断IgE与细胞表面FcεRI的结合，因而可抑制桥联反应的发生，从而阻断细胞脱颗粒。通过检测反应体系中组织胺的含量可以反映细胞发生脱颗粒的程度。
对数生长期CRL2256-FcεRI细胞(参见Wilson，A.P.，C.E.Pullar，A.M.Camp，andB.A.Helm.1993.Eur.J.Immunol.23：240.)，0.25％胰蛋白酶消化，计数，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液(Gibco)调整细胞密度至1×105/ml，接种入24孔细胞培养板，1ml/孔；完全培养液(Gibco)将IgE(细胞CRL-8033分泌表达)稀释至50μg/ml，稀释好的IgE将全人源抗IgE单克隆抗体2E19、Xolair(Novarits)和Trastuzumab(Genentech)稀释至500μg/ml，并继续10倍比序列稀释。将全人源抗IgE单克隆抗体2E19、Xolair和Trastuzumab的序列稀释液加入24孔细胞培养板，1ml/孔，设置复孔；37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；弃去培养上清，按2ml/孔加入无血清RPMI-1640培养液(Gibco)稀释的IgE多抗(晶美生物)(10μg/ml)，37℃，5％CO2培养箱中培养20分钟；取每孔上清用ELISA试剂盒(Biosource，KHB1000)检测组织胺浓度。以样品浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，结果见表4和图4。
表4
本发明全人源抗IgE单克隆抗体2E19可以显著抑制IgE与细胞表面FcεRI结合导致的脱颗粒，抑制程度显著优于Xolair。
一种全人源抗IgE单克隆抗体、其制备方法及用途
SEQUENCE LISTING
<110>百迈博药业有限公司
<120>一种全人源抗IgE单克隆抗体、其制备方法及用途
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<211>990
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<213>人抗体重链恒定区(CH)的核苷酸序列
<400>1
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggaaga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tcccggtaaa 990
<210>2
<211>330
<212>PRT
<213>人抗体重链恒定区(CH)的氨基酸序列
<400>2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210>3
<211>318
<212>DNA
<213>人抗体轻链恒定区(CL)的核苷酸序列
<400>3
actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60
actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120
aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180
aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240
cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300
ttcaacaggg gagagtgt 318
<210>4
<211>106
<212>PRT
<213>人抗体轻链恒定区(CL)的氨基酸序列
<400>4
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210>5
<211>366
<212>DNA
<213>全人源抗体2E19重链可变区核苷酸序列
<400>5
caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg tttccggata caccctcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120
cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaggt tttgatcctg aagatggtga aacaatctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aacagacggt 300
acaactggaa cgactgctga atacttccag cactggggcc agggcaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210>6
<211>122
<212>PRT
<213>全人源抗体2E19重链可变区氨基酸序列
<400>6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Gly Thr Thr Gly Thr Thr Ala Glu Tyr Phe Gln His Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>7
<211>339
<212>DNA
<213>全人源抗体2E19轻链可变区核苷酸序列
<400>7
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaattatg tatactggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat aggaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgag tggtccaggg 300
tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgt 339
<210>8
<211>113
<212>PRT
<213>全人源抗体2E19轻链可变区氨基酸序列
<400>8
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Pro Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210>9
<211>1356
<212>DNA
<213>全人源抗体2E19的重链核苷酸序列
<400>9
caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg tttccggata caccctcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120
cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaggt tttgatcctg aagatggtga aacaatctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aacagacggt 300
acaactggaa cgactgctga atacttccag cactggggcc agggcaccct ggtcaccgtc 360
tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaa 1356
<210>10
<211>452
<212>PRT
<213>全人源抗体2E19的重链氨基酸序列
<400>10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Gly Thr Thr Gly Thr Thr Ala Glu Tyr Phe Gln His Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210>11
<211>657
<212>DNA
<213>全人源抗体2E19的轻链核苷酸序列
<400>11
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaattatg tatactggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat aggaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgag tggtccaggg 300
tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgta ctgtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210>12
<211>219
<212>PRT
<213>全人源抗体2E19的轻链氨基酸序列
<400>12
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Pro Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
Claims (7)
1.一种全人源抗IgE单克隆抗体，其特征在于，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:6所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:8所示。
2.权利要求1所述的全人源抗IgE单克隆抗体，其特征在于，重链氨基酸序列为SEQ ID NO:10所示，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:12所示。
3.编码权利要求1所述的全人源抗IgE单克隆抗体的DNA序列，其特征在于，重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示，轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示。
4.编码权利要求2所述的全人源抗IgE单克隆抗体的DNA序列，其特征在于，重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:9所示，轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:11所示。
5.含有权利要求3或4所述的DNA序列的表达载体，为pcDNA3.1/ZEO(+)(2E19VLCL)或pcDNA3.1(+)(2E19VHCH)。
6.含有权利要求5所述的表达载体的宿主细胞，为CHO-K1细胞。
7.权利要求1或2所述的全人源抗IgE单克隆抗体在制备治疗超敏反应性疾病药物中的用途，其中超敏反应性疾病为过敏性哮喘。
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SHANGHAI BAIMAI PHARMACEUTICAL CO.,LTD. Free format text: FORMER OWNER: BAIMAIBO PHARMACEUTICAL CO., LTD. Effective date: 20130130 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: HONG KONG, CHINA TO: 201203 PUDONG NEW AREA, SHANGHAI |
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| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20130130 Address after: 201203 Shanghai city Pudong New Area libing Road No. 301 Applicant after: Shanghai Baimai Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: Room 511, No., Xingang center, Guangdong Road, 30 Tsim Sha Tsui, Kowloon, China Applicant before: Baimaibo Pharmaceutical Co., Ltd. |
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20190515 Address after: Room 801, Building A, Kechuang Park, 398 Ma Huan Road, Lihai Town, Binhai New Town, Shaoxing City, Zhejiang Province Patentee after: Yuehai Baiao Pharmaceutical (Shaoxing) Co., Ltd. Address before: 201 203 No. 301 Li Bing Road, Pudong New Area, Shanghai Patentee before: Shanghai Baimai Pharmaceutical Co.,Ltd. |