JP5690356B2 - 完全ヒト型抗her2モノクローナル抗体、その調製方法および用途 - Google Patents
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Description
(1)ヒト抗体の軽鎖・重鎖定常領域をコードする遺伝子のクローニング
リンパ球分離液(鼎国生物技術発展公司の製品)を用いて健康なヒトのリンパ球を分離し、TRIzol試薬(Invitrogen社の製品)を用いて総RNAを抽出した。文献(Cell,1980,22:197-207)および文献(Nucleic Acids Research,1982,10:4071-4079)の中で報告されている配列をもとにして、それぞれプライマーを設計し、RT-PCR反応により抗体重鎖・軽鎖定常領域をコードする遺伝子を増幅させた。PCR産物は、アガロースゲル電気泳動による精製・回収を経て、pGEM-Tベクター(Promega社の製品)の中にクローニングした。そして、シーケンス解析によって、正確なクローンの取得を確認した。SEQ ID NO:1とSEQ ID NO:2に、重鎖定常領域(CH)の塩基配列とアミノ酸配列をそれぞれ示す。SEQ ID NO:3とSEQ ID NO:4に、軽鎖定常領域(CL) の塩基配列とアミノ酸配列をそれぞれ示す。本実施例において、正確なクローンをpGEM-T/CH、pGEM-T/CLと記す。
健康なヒト50人の末梢血を各20ml集めし、リンパ球分離液(医科院天津血研所により製造)を用いて単核細胞を分離した。そして、TRIzol試薬(Invitrogen社)を用いて分離されたヒトの末梢血リンパ球から細胞の総RNAを抽出した。cDNA逆転写試薬キット(上海申能博彩生物科技有限公司)を使用し、cDNAの逆転写を行った。上記のステップについて、メーカーが提供する説明書に従って行った。
文献(Immunotechnology,1998,3:271-278)を参考にし、ヒト抗体重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)遺伝子をクローニングするためのプライマーであるVHBack、VHFor、VLBack、VLForを設計し、合成した。VHBack、VHFor、VLBack、VLForの配列はImmunotechnology,1998,3:271-278を参照されたい。VHBackプライマーの5' 末端に制限酵素Sfi Iの認識配列を含む配列atg gcc cag ccg gcc atg gcc、VHForプライマーの5'末端に配列gcc aga acc acc gcc gcc gga gcc acc acc gcc、VLBackプライマーの5'末端に配列tcc ggc ggc ggt ggt tct ggc gga ggc gga tct、VLForプライマーの5'末端に制限酵素Not Iの認識配列を含む配列atg cgg ccg cをそれぞれ加えた。
(2)のcDNAおよび(3)のプライマーを用い、recombinant Phage antibody system試薬キット(Amersham Biosciences社)を利用してファージディスプレイ単鎖抗体ライブラリーを構築した後、特異抗原を使い、ライブラリーに対するパニング(選別)を行った。抗体ライブラリーの構築およびパニングの方法は、recombinant Phage antibody system試薬キットの説明書を参考にした。パニングに用いる特異抗原「ヒトHER2細胞外蛋白」は、参考文献(Proc Natl Acad Sci USA,1992,89: 4285-4289)の方法に従って調製した。数回の抗体ライブラリーのパニングを経て、ヒト抗HER2単鎖抗体3E12ScFvを取得し、シークエンシングを行って、その遺伝子配列を得た。SEQ ID NO:5とSEQ ID NO:6はそれぞれ3E12 ScFv重鎖可変領域VHの塩基配列とアミノ酸配列を示している。SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8はそれぞれ3E12 ScFv軽鎖可変領域VLの塩基配列とアミノ酸配列を示している。
3E12ScFv遺伝子及びpGEM-T/CHをテンプレートとし、PCRの繰り返すことにより完全ヒト型抗体重鎖遺伝子を合成した。反応条件は、95℃15分、94℃50秒→58℃50秒→72℃50秒(30サイクル)、72℃10分である。なお、この完全ヒト型抗体重鎖遺伝子の5'末端は、制限酵素HindIIIの認識配列及びシグナルペプチド遺伝子配列を含み、3 '末端は、翻訳終止コドンTAA及び制限酵素EcoRIの認識配列を含む。シグナルペプチドの遺伝子配列は、 (ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)である。最後に、アガロースゲル電気泳動によりPCR増幅物を分離して目的バンドを回収し、pGEM-T ベクター(Promega社の製品)の中にクローニングし、さらに陽性クローンをスクリーニングし、それらをシークエンシングした。配列が正確なクローンを選んでHindIIIおよびEcoRIで切断し、アガロースゲル電気泳動により完全ヒト型抗体重鎖断片3E12VHCHを精製・回収し、HindIIIおよびEcoRIで切断したプラスミドpcDNA3.1(+)(Invitrogen社)と連結させて、完全ヒト型重鎖真核細胞発現ベクターpcDNA3.1 (+) (3E12VHCH)を構築した。
ヒト乳癌細胞SK-BR-3(HER2高発現、ATCC番号:HTB-30)、BT-474(HER2中発現、ATCC番号:HTB-20)、MCF-7(HER2低発現、ATCC番号:HTB-22)をそれぞれ稀釈度が異なる抗HER2抗体(Trastuzumab、hGH0/1、3E12を含む)とともに37℃で20時間培養した。次に、細胞を洗浄した後、AnnexinV/PI試薬キット(BD社の製品)を用いて、製品説明書に従い、早期アポトーシス細胞の百分率を測定した。抗アポトーシス実験の結果を、図1に示す。3E12抗体のSK-BR3細胞殺傷能力は、Trastuzumab抗体およびhGH0/1より明らかに強い(抗体濃度≧0.025 nMであるとき、t 検定においてP<0.05)で、同様の結果がBT-474細胞でも得られた(抗体濃度≧0.025 nMであるとき、t 検定においてP<0.05)。しかしながら、HER2低発現のMCF-7細胞では、3E12抗体の殺傷能力はTrastuzumab抗体およびhGH0/1抗体とそれほど変わらなかった。これらの結果は、3E12抗体による細胞殺傷がHER2に特異的で、そのHER2中・高発現の細胞に対する殺傷能力が、Trastuzumab抗体およびhGH0/1抗体よりも強いことを示している。
ヒト乳癌細胞SK-BR-3、BT-474、MCF-7細胞をそれぞれ稀釈度が異なる抗HER2抗体と37℃でインキュベーションし、5日目にMTT法を用いて、その発色度合いから増殖抑制率を算出した。増殖抑制実験の結果を、図2に示す。3E12抗体のSK-BR3細胞に対する増殖抑制能力は、明らかにTrastuzumab抗体およびhGH0/1よりも強い(抗体濃度≧0.1 nMであるとき、t 検定においてP<0.05)で、同様の結果がBT-474細胞においても得られた(抗体濃度≧0.1 nMであるとき、t 検定においてP<0.05)。しかしながら、HER2低発現のMCF-7細胞においては、3E12抗体の細胞に対する増殖抑制能力は、Trastuzumab抗体およびhGH0/1抗体とそれほど変わらなかった。これらの結果は、3E12抗体による細胞増殖抑制がHER2に特異的であり、かつそのHER2中・高発現の細胞に対する増殖抑制能力がTrastuzumab抗体およびhGH0/1抗体よりも強いことを示している。
それぞれのSCIDマウス(上海斯莱克社より購入)に対し、0日目にHER2高発現のヒト乳癌細胞BT-474を皮下に植え付け、腫瘍が0.3 cm3まで増殖した時点で、担癌マウスに0.5 mg/kgおよび5 mg/kg の各種抗HER2抗体を腹腔内に注射し、これを毎週2回行い、連続3週間治療した。各グループのマウスの体重と腫瘍の大きさの変化を定期的に調べ、120日間観察した。そして、抗HER2抗体の抗腫瘍効果を評価した。生体内抗腫瘍効果試験を、図3に示す。HER2高発現のBT-474乳癌に対する3E12抗体の増殖抑制能力は、明らかにTrastuzumab抗体およびhGH0/1よりも強い(投薬量25 mg/kgである場合、50、60、70、80、90、100、110、120日目のとき、Mann-Whitney 検定においてP<0.05)。
Claims (10)
- SEQ ID NO:6で示す重鎖可変領域アミノ酸配列と、SEQ ID NO:8で示す軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する完全ヒト型抗HER2抗体。
- SEQ ID NO:10で示す重鎖アミノ酸配列と、SEQ ID NO:12で示す軽鎖アミノ酸配列を有する請求項1に記載の完全ヒト型抗HER2抗体。
- 請求項1又は2に記載の完全ヒト型抗HER2抗体をコードする単離されたヌクレオチド。
- SEQ ID NO:5で示す完全ヒト型抗HER2抗体重鎖可変領域をコードする塩基配列と、SEQ ID NO:7で示す完全ヒト型抗HER2抗体軽鎖可変領域をコードする塩基配列を有する請求項3に記載のヌクレオチド。
- SEQ ID NO:9で示す完全ヒト型抗HER2抗体重鎖をコードする塩基配列と、SEQ ID NO:11で示す完全ヒト型抗HER2抗体軽鎖をコードする塩基配列を有する請求項4に記載のヌクレオチド。
- pcDNA3.1/ZEO(+)又はpcDNA3.1 (+)に請求項3〜5のいずれかに記載のヌクレオチドを挿入してなる発現ベクター。
- CHO-K1細胞を請求項6に記載の発現ベクターによって形質転換してなる形質転換体。
- 請求項1又は2に記載の完全ヒト型抗HER2抗体の腫瘍治療薬調製における使用。
- 前記腫瘍は、HER2高発現腫瘍である請求項8に記載の使用。
- 前記HER2高発現腫瘍は、乳腺腫瘍である請求項9に記載の使用。
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