JP2013520182A - 完全ヒト型vegfモノクローナル抗体、その調製方法および用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、バイオテクノロジー分野に関わる。詳しくは、本発明は、完全ヒト型抗VEGFモノクローナル抗体、その調製方法および用途を開示する。
【解決手段】
本発明は、大容量のファージディスプレイナイーブヒト抗体ライブラリーを構築し、その中から完全ヒト型抗VEGF抗体11A7を選別し、取得する。本発明に係る抗体は、SEQ ID NO:6に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列を有し、SEQ ID NO:8に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する。また、本発明は、11A7抗体の調製方法、11A7抗体をコードする塩基配列、該抗体の核酸配列を含む発現ベクターと宿主細胞を開示する。本発明の11A7抗体は、ヒト型抗体bevacizumabと比べ、より高い抗体親和性、より強い腫瘍細胞増殖抑制能力を有するため、腫瘍の増殖を明らかに抑制でき、抗腫瘍薬の調製に用いることができる。
Description
(1)ヒト抗体軽鎖・重鎖定常領域コードする遺伝子のクローニング
リンパ球分離液(鼎国生物技術発展公司の製品)を用いて健康なヒトのリンパ球を分離し、TRIzol試薬(Invitrogen社の製品)を用いて総RNAを抽出した。文献(Cell,1980,22:197-207)と文献(Nucleic Acids Research,1982,10:4071-4079)の中で報告されている配列をもとにして、それぞれプライマーを設計し、RT-PCR反応により抗体重鎖・軽鎖定常領域コードする遺伝子を増幅した。PCR産物を、アガロースゲル電気泳動による精製・回収を経て、pGEM-Tベクター(Promega社の製品)の中にクローニングした。そして、シーケンス解析によって、正確なクローンの取得を確認した。SEQ ID NO:1とSEQ ID NO:2に、重鎖定常領域(CH)の塩基配列とアミノ酸配列をそれぞれ示す。SEQ ID NO:3とSEQ ID NO:4に、軽鎖定常領域(CL)の塩基配列とアミノ酸配列をそれぞれ示す。本実施例では、正確なクローンをpGEM-T/CH、pGEM-T/CLと記す。
健康なヒト50人の末梢血を各20ml集め、リンパ球分離液(医科院天津血研所により製造)を用いて単核細胞を分離した。そして、TRIzol試薬(Invitrogen社)を用いて分離されたヒトの末梢血リンパ球から細胞の総RNAを抽出した。cDNA逆転写試薬キット(上海申能博彩生物科技有限公司)を使用し、cDNAの逆転写を行った。上記のステップについて、メーカーが提供する説明書に従って行った。
文献(Immunotechnology,1998,3:271-278)を参考にし、ヒト抗体重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)遺伝子をクローニングするためのプライマーであるVHBack、VHFor、VLBack、VLForを設計し、合成した。VHBack、VHFor、VLBack、VLForの配列はImmunotechnology,1998,3:271-278を参照されたい。VHBackプライマーの5' 末端に、制限酵素Sfi Iの認識配列を含む配列atg gcc cag ccg gcc atg gcc、VHForプライマーの5'末端に、配列gcc aga acc acc gcc gcc gga gcc acc acc gcc、VLBackプライマーの5'末端に、配列tcc ggc ggc ggt ggt tct ggc gga ggc gga tct、VLForプライマーの5'末端に、制限酵素Not Iの認識配列を含む配列atg cgg ccg cをそれぞれ加えた。
(2)のcDNAおよび (3)のプライマーを用い、recombinant Phage antibody system試薬キット(Amersham Biosciences社)を利用してファージディスプレイ単鎖抗体ライブラリーを構築した後、特異抗原を使い、ライブラリーに対するパニング(選別)を行った。抗体ライブラリーの構築およびパニングの方法は、recombinant Phage antibody system試薬キットの説明書を参考にした。パニングに用いる特異抗原「遺伝子組換えヒトVEGF165タンパク質」は、R&D社から購入した。数回の抗体ライブラリーのパニングを経て、抗ヒトVEGF単鎖抗体11A7ScFvを取得し、シークエンシングにより、その遺伝子配列を得た。SEQ ID NO:5とSEQ ID NO:6はそれぞれ11A7 ScFv重鎖可変領域VHの塩基配列とアミノ酸配列を示している。SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8はそれぞれ11A7 ScFv軽鎖可変領域VLの塩基配列とアミノ酸配列を示している。
11A7ScFv遺伝子及びpGEM-T/CHをテンプレートとし、PCRの繰り返すことにより完全ヒト型抗体重鎖遺伝子を合成した。反応条件は、95℃15分、94℃50秒→58℃50秒→72℃50秒(30サイクル)、72℃10分である。また、この完全ヒト型抗体重鎖遺伝子の5'末端に制限酵素HindIIIの認識配列及びシグナルペプチド遺伝子配列を含み、3 '末端に翻訳終止コドンTAA及び制限酵素EcoRIの認識配列を含む。シグナルペプチドの遺伝子配列は、 (ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)である。最後に、アガロースゲル電気泳動によりPCR増幅物を分離して目的バンドを回収し、pGEM-T ベクター(Promega社の製品)の中にクローニングし、さらに陽性クローンをスクリーニングし、それらをシークエンス解析した。配列が正確なクローンを選んでHindIIIおよびEcoRIで切断し、アガロースゲル電気泳動により完全ヒト型抗体重鎖断片11A7VHCHを精製・回収し、HindIIIおよびEcoRIで切断したプラスミドpcDNA3.1(+)(Invitrogen社)と連結させて、完全ヒト型重鎖真核細胞発現ベクターpcDNA3.1 (+) (11A7VHCH)を構築した。
Biacore T100(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用し、VEGF抗体の親和定数を測定する。VEGF165(R&D社の製品)を、アミノカップリング(アミド結合)により、CM5バイオセンサーチップ (GE Healthcare)と共有結合させた。(1)完全ヒト型抗体11A7、(2)Bevacizumab、(3)ヒト型抗体6A6(中国の特許出願番号02111093.X、出願日2002年2月30日、発明の名称『ヒト型抗血管内皮細胞増殖因子モノクローナル抗体、その調製法および医薬組成物』の中で開示された方法に従って調製し、得られた)、(4)陰性対照として抗体(Rituximab市販品)のそれぞれを、洗浄剤としての0.05% PBS TWEEN-20(ICI Americas)を処方して、異なる濃度(2倍希釈)の溶解液に調製し、50μl/minの流速でチップを通過させた。その後、50mM塩酸水溶液5μlを用いて、3μl/minの流速でそれぞれのチップを洗浄し、残留する抗体を固定化リガンドから溶出させた。BIAevalutionソフトウェア(T100 evalution 2.0バージョン、GE Healthcare社)を用い、非線形回帰法を使って結合曲線を分析した分析結果を、表1に示す。実験の結果、完全ヒト型抗体11A7のKD値は、Bevacizumabとヒト型抗体6A6よりも著しく低く、これは、完全ヒト型抗体11A7のVEGFに対する親和性が、Bevacizumabとヒト型抗体6A6よりも高いことが判明した。
親和性実験の結果
実験は次のステップを踏む。
1.成長状態の良好なHUVEC細胞(Cascade Biologics)を細胞濃度を2.5×104/mlに調整した。
2.これを、96ウェルの細胞培養プレートに、1ウェルあたり200μl毎植え付け、37℃で5%のCO2インキュベーターの中で24 時間培養させた後、無血清培地に取り替え、引き続き72 時間培養し、様々な濃度のVEGF抗体を加え、37℃で1 時間インキュベートした。また、陰性対照としては、抗CD20抗体Rituximabを加えた。なお、それぞれの濃度毎に、平行に3つのウェルを使用した。
3.終濃度が25 ng/mlとなるように、VEGF165(R&D)を加え、24 時間培養した。
4. [3 H].TdRをl0μl(1ウェルあたり18.5 kBq)加え、37℃のインキュベーターの中で7 時間インキュベートした。
5.セルコレクターにより、細胞をグラスファイバーフィルターの上に集め、[3H]液体シンチレーションカウンタを使って測定を行った。
実験結果を図1に示す。
実験は次のステップを踏む。
1.VEGF抗体の生体内抗腫瘍活性を調べるため、LM3細胞(ヒト肝癌細胞、復旦大学医学院肝癌研究所、中国・上海)をメスの重症免疫不全マウス(第二軍医大学実験動物センター)の右脇の皮下に植え付けた。腫瘍を植え付けた当日、各VEGF抗体25mg/kgおよび無関係の対照蛋白質Rituximabを与えた。
2.その後、1日おきに、連続4週間皮下注射を行い、6週間後、3日毎に腫瘍の長さ・幅を測り、腫瘍の体積を算出する。
実験結果を図2に示す。
Claims (9)
- SEQ ID NO:6に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列と、SEQ ID NO:8に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する完全ヒト型抗VEGFモノクローナル抗体。
- SEQ ID NO:10に示す重鎖アミノ酸配列と、SEQ ID NO:12に示す軽鎖アミノ酸配列を有する請求項1に記載の完全ヒト型VEGF抗モノクローナル抗体。
- 請求項1に記載の完全ヒト型抗VEGFモノクローナル抗体をコードするヌクレオチドであって、SEQ ID NO:5に示す重鎖可変領域の塩基配列およびSEQ ID NO:7に示す軽鎖可変領域の塩基配列を有することを特徴とするヌクレオチド。
- SEQ ID NO:9に示す重鎖塩基配列およびSEQ ID NO:11に示す軽鎖塩基配列を有する請求項3に記載のヌクレオチド。
- pcDNA3.1/ZEO(+)又はpcDNA3.1 (+)であり、請求項3又は4に記載のヌクレオチドを含む発現ベクター。
- CHO-K1細胞であり、請求項5に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1又は2に記載の完全ヒト型抗VEGFモノクローナル抗体の調製方法であって、ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーからの高親和性完全ヒト型抗VEGF単鎖抗体の選別・取得と、完全ヒト型抗VEGF抗体の完全分子の真核細胞発現ベクターの構築と、完全ヒト型抗VEGF抗体の完全分子のCHO細胞における発現と、完全ヒト型抗VEGF抗体の完全分子の精製の4つのステップを含むことを特徴とする調整方法。
- 請求項1又は2に記載の完全ヒト型抗VEGFモノクローナル抗体の腫瘍治療薬の調製における用途。
- 腫瘍は、結腸・直腸がんである請求項8に記載の用途。
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