CN103221825A - 生物标志物和治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及癌症生物标志物。特别地，本发明关注作为癌症中患者选择和患者预后的生物标志物的c-met，以及治疗性处理的方法、制品及其制备方法、诊断试剂盒、检测方法及其相关做广告的方法。

Description

生物标志物和治疗方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2010年8月31日提交的美国专利申请号61/378,911、2010年10月5日提交的美国专利申请号61/389,922、2010年10月7日提交的美国专利申请号61/390,995、2010年12月7日提交的美国专利申请号61/420,703、2011年5月18日提交的美国专利申请号61/487,527、2011年6月1日提交的美国专利申请号61/492,338、和2011年6月30日提交的美国专利申请号61/503,489的优先权，通过述及将其内容完整收入本文。
序列表
本申请含有序列表，已经以ASCII格式经EFS-WEB提交且通过述及完整收入本文。2011年8月20日创建的所述ASCII拷贝命名为P4492R1U.txt，并且大小为16,513个字节。
发明领域
本发明关注癌症生物标志物。特别地，本发明关注作为癌症中患者选择和预后的生物标志物的c-met，以及治疗性处理的方法、制品及其制备方法、诊断试剂盒、检测方法及其相关做广告的方法。
发明背景
癌症仍然是对人类健康的最致命威胁之一。在美国，癌症每年影响近130万新患者，而且是位于心脏病之后的第二位死因，占4例死亡中的大约1例。例如，乳腺癌是癌症的第二位最常见形式，而且是美国女性中的第二位癌症杀手。还预测癌症可能在5年内超越心血管疾病成为第一位死因。实体瘤对大多数上述死亡负有责任。虽然某些癌症的医学治疗中已经取得了重大进步，但是所有癌症的总体5年存活率在最近20年里只改进了约10%。癌症（或称作恶性肿瘤）以不受控制的方式快速生长和转移，使得及时检测和治疗极端困难。
尽管癌症治疗获得了重大进展，但是仍然在寻找改良的疗法。
通过述及而完整收录本文中引用的所有参考文献（包括专利申请和出版物）。
发明概述
提供了c-met拮抗剂用于有效治疗癌症患者的用途。本申请还提供了用于诊断疾病的更好方法，以用于任选用c-met拮抗剂治疗该疾病。特别地，本发明提供了来自一项抗c-met抗体MetMAb(onartuzumab)与厄洛替尼(erlotinib,
Figure BDA00003108252600021
)组合在具有二线和三线非小细胞肺癌(NSCLC)的受试者中的随机化II期临床试验的数据。使用c-met生物标志物来鉴定其中MetMAb加厄洛替尼治疗提供有临床意义的好处（通过无进展存活和总体存活来评估）的患者群体和其中MetMAb加厄洛替尼治疗显著提高癌症进展和死亡风险（与单独的厄洛替尼治疗相比）的患者群体。这种更差的结局强调了选择会受益于c-met拮抗剂治疗（例如与EGFR拮抗剂组合）的患者的需要。
在临床试验中，用MetMAb和厄洛替尼治疗对表达高水平c-met生物标志物的NSCLC患者提供了有临床意义的好处。结果显示了通过无进展存活(PFS)和总体存活(OS)评估的功效为正面的，尤其在与单独厄洛替尼治疗的PFS和OS数据比较时。差异是统计学显著的，而且将MetMAb添加至厄洛替尼几乎倍增表达高水平c-met生物标志物的NSCLC患者中的无进展存活和总体存活。临床试验数据还显示了相对于单独用厄洛替尼治疗的表达低水平c-met生物标志物的NSCLC患者中的进展和死亡风险，MetMAb与厄洛替尼组合治疗提高了此类患者中的进展和死亡风险。结果显示了在与单独厄洛替尼治疗的PFS和OS数据比较时，通过PFS和OS评估的功效在MetMAb和厄洛替尼治疗的患者中更差。差异是统计学显著的。
临床试验数据还显示了高（也称作“升高的”）c-met表达与厄洛替尼治疗的NSCLC患者中更差的预后有强关联。相对于表达低c-met生物标志物的NSCLC患者，表达高c-met生物标志物的NSCLC患者具有升高的进展风险且近似倍增死亡风险。如此，高c-met表达是厄洛替尼治疗的二线或三线NSCLC患者中进展和存活的有强烈意义的预后因子。
一方面，本发明提供了用于鉴定有可能响应c-met拮抗剂治疗的癌症患者的方法，包括测定该患者的癌症是否具有大量的c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达指示该患者有可能响应c-met拮抗剂治疗。如本文中使用的，“升高的”或“高”c-met指与患者对治疗的响应性有关的c-met量。
另一方面，本发明提供了用于确定癌症患者预后的方法，包括测定该患者的癌症是否具有大量的c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达指示当该患者用c-met拮抗剂治疗时该患者有可能具有延长的总体存活(OS)和/或无进展存活(PFS)。
另一方面，本发明提供了用于测定c-met生物标志物表达的方法，包括测定患者的癌症是否具有大量的c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达为蛋白质表达且使用IHC在来自该患者的样品中测定，其中高c-met生物标志物表达为50%或更多的肿瘤细胞具有中等c-met染色强度、组合的中等/高c-met染色强度或高c-met染色强度，其中使用c-met抗体检测c-met表达，其中c-met生物标志物表达指示当该患者用c-met拮抗剂治疗时该患者有可能具有延长的OS和/或PFS。
一方面，本发明提供了确定患者预后的方法，包括测定患者癌症样品中c-met生物标志物的量。在一些实施方案中，高c-met生物标志物表达表示当该患者用抗c-met抗体和厄洛替尼组合治疗时延长的PFS和/或OS。在一些实施方案中，低c-met生物标志物表达表示当该患者用抗c-met抗体和厄洛替尼组合治疗时缩短的PFS和/或OS。
一方面，本发明提供了优化治疗功效的方法，包括测定患者癌症样品中c-met生物标志物表达的量。
在本发明方法涉及高c-met生物标志物表达的一些实施方案中，使用免疫组织化学(IHC)在来自患者的样品中测定c-met生物标志物蛋白质表达。在一些实施方案中，IHC得分为2或3。在一些实施方案中，IHC得分为2。在一些实施方案中，IHC得分为3。在一些实施方案中，高c-met生物标志物表达为50%或更多的肿瘤细胞具有中等c-met染色强度、组合的中等/高c-met染色强度或高c-met染色强度。在一些实施方案中，相对于对照细胞团粒中的c-met染色强度测定c-met表达染色强度。在一些实施方案中，细胞系A549具有中等c-met染色强度。在一些实施方案中，细胞系H441具有强c-met染色强度。在一些实施方案中，c-met生物标志物表达为核酸表达且使用基因表达序型分析、PCR（诸如rtPCR）、RNN-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、或FISH在来自患者的样品中测定。在一些实施方案中，其癌症具有大量c-met生物标志物的患者相对于其癌症没有高c-met生物标志物的患者具有升高的更长PFS和/或OS的可能性。在本文中公开的任何发明的一些实施方案中，高c-met生物标志物表达为met诊断阳性（met诊断阳性临床状态），如依照本文中表A定义的。
另一方面，本发明提供了用于鉴定不太可能响应c-met拮抗剂治疗的癌症患者的方法，包括测定该患者的癌症是否具有少量的c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达指示该患者不太可能响应c-met拮抗剂治疗。。如本文中使用的，“少”量的c-met指与对治疗没有响应有关的c-met量，或在一些实施方案中，与更差的对治疗的响应（例如与不治疗相比减少的临床好处）有关的c-met量。在一些实施方案中，c-met生物标志物表达为蛋白质表达且使用免疫组织化学(IHC)在来自该患者的样品中测定。在一些实施方案中，IHC得分为1或0。在一些实施方案中，IHC得分为1。在一些实施方案中，IHC得分为0。在一些实施方案中，低c-met生物标志物表达为阴性c-met染色、少于50%的肿瘤细胞具有弱或组合的弱和中等c-met染色强度、或50%或更多的肿瘤细胞具有弱或组合的弱和中等c-met染色强度但少于50%的肿瘤细胞具有中等或组合的中等和强c-met染色强度。在一些实施方案中，相对于对照细胞团粒中的c-met染色强度测定c-met表达染色强度。在一些实施方案中，细胞系H1155具有阴性c-met染色强度。在一些实施方案中，细胞系HEK-293具有低c-met染色强度。在本文中公开的任何发明的一些实施方案中，低c-met生物标志物表达为met诊断阴性（met诊断阴性临床状态），如依照本文中表A定义的。
依照一个实施方案，本发明涉及用于治疗具有癌症的患者的方法，包括在发现该患者的癌症具有升高（大）量的c-met（即表达高c-met生物标志物）的情况中对该患者施用治疗有效量的c-met拮抗剂。
一方面，本发明提供了用于治疗具有癌症的患者的方法，包括在发现该患者具有大量的c-met生物标志物的情况中对该患者施用治疗有效量的c-met拮抗剂。在一些实施方案中，发现患者的癌症具有大量的c-met生物标志物。在一些实施方案中，c-met拮抗剂为抗c-met抗体。在一些实施方案中，抗c-met抗体为MetMAb(onartuzumab)。在一些实施方案中，使用免疫组织化学(IHC)在来自患者的样品中测定c-met生物标志物蛋白质表达。在一些实施方案中，IHC得分为2或3。在一些实施方案中，IHC得分为2。在一些实施方案中，IHC得分为3。在一些实施方案中，高c-met生物标志物表达为50%或更多的肿瘤细胞具有中等c-met染色强度、组合的中等/高c-met染色强度或高c-met染色强度。在一些实施方案中，相对于对照细胞团粒的c-met染色强度测定c-met表达染色强度。在一些实施方案中，细胞系A549具有中等c-met染色强度。在一些实施方案中，细胞系H441具有强c-met染色强度。在一些实施方案中，c-met生物标志物表达为核酸表达且使用基因表达序型分析、PCR（诸如rtPCR）、RNN-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、或FISH在来自患者的样品中测定。在一些实施方案中，患者具有相对于没有高c-met生物标志物的患者而言更大的PFS和/或OS（的更大可能性）。在本文中公开的任何发明的一些实施方案中，高c-met生物标志物表达为met诊断阳性临床状态，如依照本文中表A定义的。
另外，本发明涉及用于治疗具有癌症的患者的方法，包括在发现该患者的癌症具有少（即少或基本上检测不到）量c-met生物标志物的情况中，对该患者施用治疗有效量的除c-met拮抗剂以外的癌症药物。
另一方面，本发明提供了用于治疗具有癌症的患者的方法，包括对发现表达低c-met生物标志物（即具有少量c-met生物标志物）的患者施用治疗有效量的除c-met拮抗剂以外的癌症药物。在一些实施方案中，发现患者的癌症表达低c-met生物标志物。在一些实施方案中，使用免疫组织化学(IHC)在来自患者的样品中测定c-met生物标志物蛋白质表达。在一些实施方案中，IHC得分为1或0。在一些实施方案中，IHC得分为1。在一些实施方案中，IHC得分为0。在一些实施方案中，低c-met生物标志物表达通过存在阴性c-met染色、少于50%的肿瘤细胞具有弱或组合的弱和中等c-met染色强度、或50%或更多的肿瘤细胞具有弱或组合的弱和中等c-met染色强度但少于50%的肿瘤细胞具有中等或组合的中等和强c-met染色强度来检测。在一些实施方案中，相对于对照细胞团粒的c-met染色强度而言测定c-met表达染色强度。在一些实施方案中，细胞系H1155具有阴性c-met染色。在一些实施方案中，细胞系HEK-293具有低c-met染色强度。在本文中公开的任何发明的一些实施方案中，低c-met生物标志物表达为met诊断阴性临床状态，如依照本文中表A定义的。
本发明还涉及用于为癌症患者选择疗法的方法，包括测定来自该患者的样品中c-met生物标志物的表达，并基于该生物标志物的表达水平选择癌症药物。在一个实施方案中，如果该癌症样品以高水平表达c-met生物标志物的话，为该患者选择c-met拮抗剂治疗（例如抗c-met抗体）。在一些实施方案中，使用治疗有效量的c-met拮抗剂治疗患者的癌症。如此，在一些实施方案中，如果该患者的癌症样品以高水平表达c-met生物标志物的话，为该患者选择c-met拮抗剂治疗（例如抗c-met抗体），并（在选择之后）使用治疗有效量的c-met拮抗剂治疗该患者的癌症。在另一个实施方案中，如果该癌症样品以低水平表达c-met生物标志物（例如癌症样品表达低或基本上检测不到的水平的该生物标志物）的话，为该患者选择用除c-met拮抗剂以外的癌症药物治疗。在一些实施方案中，使用治疗有效量的除c-met拮抗剂以外的癌症药物治疗患者的癌症。如此，在一些实施方案中，如果该癌症样品以低（即低或基本上检测不到的）水平表达c-met生物标志物的话，为该患者选择用除c-met拮抗剂以外的癌症药物（例如EGFR拮抗剂，例如厄洛替尼）治疗，并（在选择之后）使用治疗有效量的c-met拮抗剂治疗该患者的癌症。
此外，本发明涉及为癌症药物（例如c-met拮抗剂）登广告的方法，包括对目标受众宣传该癌症药物用于基于c-met生物标志物的表达来治疗癌症患者的用途。宣传可以通过任何可得手段来进行。在一些实施方案中，该宣传是通过伴随c-met拮抗剂（诸如抗c-met抗体）的商业性配制剂的包装插页进行的。该宣传也可以通过伴随第二药物的商业性配制剂的包装插页来进行（在治疗为使用c-met拮抗剂和第二药物（例如EGFR拮抗剂，诸如厄洛替尼）的组合疗法时)。宣传可以通过书面或口头告知内科医师或健康护理提供者来进行。在一些实施方案中，宣传通过包装插页来进行，其中包装插页提供说明书来接受c-met拮抗剂，和在一些实施方案中，与第二药物，诸如EGFR拮抗剂（诸如厄洛替尼），或在其它实施方案中，与抗VEGF抗体组合治疗。在一些实施方案中，宣传之后是在有或无第二药物（例如厄洛替尼）的情况中用c-met拮抗剂治疗患者。在一些实施方案中，宣传之后是在有或无c-met拮抗剂治疗的情况中用第二药物治疗患者。在一些实施方案中，包装插页指示在患者的癌症样品表达高c-met生物标志物的情况中使用c-met拮抗剂来治疗患者。在一些实施方案中，包装插页指示在患者的癌症样品表达低c-met生物标志物的情况中不使用c-met拮抗剂来治疗患者。在一些实施方案中，高c-met生物标志物表示在用c-met拮抗剂治疗（或在一些实施方案中，用c-met拮抗剂与EGFR拮抗剂组合治疗）患者时PFS和/或OS延长的可能性。在一些实施方案中，低c-met生物标志物表示在用c-met拮抗剂治疗（或在一些实施方案中，用c-met拮抗剂与EGFR拮抗剂组合治疗）患者时PFS和OS缩短的可能性。在一些实施方案中，PFS和/或OS相对于没有用c-met拮抗剂治疗（或在一些实施方案中，用c-met拮抗剂与EGFR拮抗剂组合治疗）的患者缩短。在一些实施方案中，宣传通过包装插页来进行，其中包装插页提供说明书来接受抗c-met抗体与EGFR拮抗剂组合的疗法。在一些实施方案中，宣传之后是在有或无第二药物的情况中用抗c-met抗体治疗患者。
在一些方面，本发明的特征在于指导表达高水平c-met生物标志物的癌症（诸如NSCLC）患者的方法，其通过提供接受抗c-met抗体（例如抗c-met抗体）治疗，和在一些实施方案中，第二药物（诸如EGFR拮抗剂，例如厄洛替尼）治疗以例如延长患者的存活、降低患者的癌症复发风险和/或提高患者的存活可能性的说明书来进行。在一些实施方案中，该治疗包括对NSCLC患者组合施用抗c-met抗体（例如MetMAb）和EGFR拮抗剂（诸如厄洛替尼）。在一些实施方案中，该方法进一步提供说明书来接受至少一种化疗剂治疗。在某些实施方案中，依照该指导方法的指导来治疗患者。在一些实施方案中，包装插页指示在患者的癌症样品表达高c-met生物标志物的情况中使用c-met拮抗剂来治疗患者。在一些实施方案中，说明书指示在患者的癌症样品表达低c-met生物标志物的情况中不使用c-met拮抗剂来治疗患者，其中低c-met生物标志物表示在用c-met拮抗剂治疗（或在一些实施方案中，用c-met拮抗剂与EGFR拮抗剂组合治疗）患者时缩短的PFS和OS。在一些实施方案中，PFS和/或OS相对于没有用c-met拮抗剂治疗（或在一些实施方案中，用c-met拮抗剂与EGFR拮抗剂组合治疗）的患者缩短。
本发明还提供了商业方法，包括销售c-met拮抗剂（例如抗c-met抗体），用于在人患者中治疗癌症（例如NSCLC），例如用于延长存活、降低患者的癌症复发可能性、和/或提高患者的存活可能性，其中患者的癌症表达高（升高的）c-met生物标志物表达。在一些实施方案中，该治疗包括对癌症患者施用抗c-met抗体（例如MetMAb），和在一些实施方案中，施用第二药物（例如EGFR拮抗剂，诸如厄洛替尼）。在一些实施方案中，销售之后是用c-met拮抗剂（诸如抗c-met抗体）治疗和在一些实施方案中，用抗c-met抗体和/或EGFR拮抗剂治疗患者。在一些方面，本发明的特征在于指导表达低（即低或基本上检测不到的）水平c-met生物标志物的癌症（诸如NSCLC）患者的方法，其通过提供接受除c-met拮抗剂以外的癌症药物治疗的说明书来进行。在某些实施方案中，依照该指导方法的指导来治疗患者。
一方面，本发明提供了用于治疗癌症患者的c-met拮抗剂，其中该患者表达大量的c-met生物标志物。在一些实施方案中，患者的癌症表达大量的c-met生物标志物。
一方面，本发明提供了c-met IHC测定法用于鉴定适合c-met拮抗剂治疗的癌症患者的体外用途，其中该患者表达大量的c-met生物标志物。在一些实施方案中，该患者的癌症表达大量的c-met生物标志物。
一方面，本发明提供了诊断试剂盒，其包含一种或多种用于测定来自癌症（例如NSCLC）患者的样品中c-met生物标志物的表达的试剂。该诊断试剂盒适合与本文中描述的任何方法一起使用。在一些实施方案中，检测出高c-met生物标志物表示在患者用c-met拮抗剂治疗时延长的PFS和/或OS。在一些实施方案中，检测出低c-met生物标志物表示在患者用c-met拮抗剂治疗时缩短的PFS和/或OS。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包含使用该试剂盒来选择c-met药物以治疗NSCLC患者的说明书。
一方面，本发明提供了诊断试剂盒用于鉴定适合c-met拮抗剂治疗的癌症患者的用途，其中该患者表达大量的c-met生物标志物。在一些实施方案中，患者的癌症表达大量的c-met生物标志物。
本发明还涉及制品，其包含包装在一起的c-met拮抗剂和包装插页，该c-met拮抗剂在药学可接受载体中，该包装插页指示该c-met拮抗剂用于基于c-met生物标志物的表达治疗癌症患者。治疗方法包括本文中公开的任何治疗方法。在一些实施方案中，包装插页指示在患者的癌症样品表达高c-met生物标志物的情况中使用该c-met拮抗剂来治疗患者。在一些实施方案中，相对于没有用c-met拮抗剂治疗（或在一些实施方案中，用c-met拮抗剂与EGFR拮抗剂组合治疗）的患者，PFS和/或OS有可能延长。在一些实施方案中，包装插页指示在患者的癌症样品表达低c-met生物标志物的情况中，不用c-met拮抗剂来治疗患者。在一些实施方案中，低c-met生物标志物表示在患者用c-met拮抗剂治疗（或在一些实施方案中，用c-met拮抗剂与EGFR拮抗剂组合治疗）时缩短的PFS和OS。在一些实施方案中，相对于没有用c-met拮抗剂治疗（或在一些实施方案中，用c-met拮抗剂与EGFR拮抗剂组合治疗）的患者，PFS和/或OS有可能缩短。
在一个有关的方面，本发明涉及用于制造制品的方法，包括在包装中组合药物组合物和包装插页，该药物组合物包含癌症药物，该包装插页指示该药物组合物用于基于c-met生物标志物的表达治疗癌症患者。治疗方法包括本文中公开的任何治疗方法。在一些实施方案中，包装插页指示在患者的癌症样品表达高c-met生物标志物的情况中使用c-met拮抗剂来治疗患者。在一些实施方案中，包装插页指示在患者的癌症样品表达低c-met生物标志物的情况中不使用c-met拮抗剂来治疗患者。在一些实施方案中，低c-met生物标志物表示在用c-met拮抗剂治疗（或在一些实施方案中，用c-met拮抗剂与EGFR拮抗剂组合治疗）患者时PFS和OS缩短的可能性升高。在一些实施方案中，PFS和/或OS相对于没有用c-met拮抗剂治疗（或在一些实施方案中，用c-met拮抗剂与EGFR拮抗剂组合治疗）的患者缩短。
在本文中描述的任何发明的某些实施方案中，癌症可以是非小细胞肺癌（包括例如鳞状细胞癌(SCC)）、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、间皮瘤、黑素瘤、乳腺癌（包括三重阴性乳腺癌）、甲状腺癌、结肠直肠癌、头和颈癌、骨肉瘤、前列腺癌、或成胶质细胞瘤。在一些实施方案中，癌症为NSCLC。在一些实施方案中，NSCLC为二线或三线局部晚期或转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，NSCLC为腺癌。在一些实施方案中，NSCLC为鳞状细胞癌。本文中描述了其它例示性癌症。在一些实施方案中，NSCLC为至少一种在先化疗方案失败后的局部晚期或转移性NSCLC。
在本文中提供的任何发明的某些实施方案中，患者没有接受超过两种在先IIIB/IV期治疗。在一些实施方案中，患者没有接受超过30天暴露于能通过EGFR抑制起作用的研究药或上市药、或导致剂量改变的已知EGFR相关毒性。EGFR抑制剂包括（但不限于）吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼、和西妥昔单抗(cetuximab)。在一些实施方案中，患者在随机化之前28天内没有接受化疗、生物疗法、放疗或研究药物（例外是任选，可以在随机化之前两周内使用激酶抑制剂，前提是任何药物相关毒性得到恰当解决）。在一些实施方案中，患者不是具有未治疗的和/或活动性的（正在进展中或需要抗惊厥药或皮质类固醇来控制症状）CNS转移的患者。在一些实施方案中，患者癌症的样品显示出具有野生型EGFR。在一些实施方案中，患者癌症的样品没有显示出具有突变型EGFR。实施例中描述了其它患者排除标准，而且本发明涵盖使用其中描述的一项或多项排除。
本领域知道c-met拮抗剂（例如适合在本文中描述的任何发明中使用的c-met拮抗剂），而且本文中进一步描述了一些c-met拮抗剂。在某些实施方案中，c-met拮抗剂为拮抗性抗c-met抗体。在某些实施方案中，抗c-met抗体包含：(a)HVR1，其包含序列GYTFTSYWLH(SEQ ID NO:1)；(b)HVR2，其包含序列GMIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQ ID NO:2)；(c)HVR3-HC，其包含序列ATYRSYVTPLDY(SEQ ID NO:3)；(d)HVR1-LC，其包含序列KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID NO:4)；(e)HVR2-LC，其包含序列WASTRES(SEQ ID NO:5)；和(f)HVR3-LC，其包含序列QQYYAYPWT(SEQID NO:6)。在某些实施方案中，抗c-met抗体是单价的且包含：(a)第一多肽，其包含重链，所述多肽包含序列SEQ ID NO:11；(b)第二多肽，其包含轻链，所述多肽包含序列SEQ ID NO:12；和第三多肽，其包含Fc序列，所述多肽包含序列SEQ ID NO:13，其中重链可变域和轻链可变域作为复合物存在且形成单一抗原结合臂，其中第一和第二Fc多肽在复合物中存在且形成Fc区，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比，该Fc区提高所述抗体片段的稳定性。在某些实施方案中，c-met抗体为MetMAb（可互换地称作“onartuzumab”）。在某些实施方案中，c-met拮抗剂是下述任一项或多项：crizotinib，tivantinib，carbozantinib，MGCD-265，ficlatuzumab，人源化TAK-701，rilotumumab，foretinib，h224G11，DN-30，MK-2461，E7050，MK-8033，PF-4217903，AMG208，JNJ-38877605，EMD1204831，INC-280，LY-2801653，SGX-126，RP1040，LY2801653，BAY-853474，和/或LA480。本文中描述了其它适合在本发明中使用的c-met拮抗剂。
癌症药物可以单独使用或与其它癌症药物组合使用。例如，在一些实施方案中，c-met拮抗剂（例如抗c-met抗体）与EGFR拮抗剂（例如厄洛替尼）组合使用。在某些实施方案中，以三周周期每天一剂150mg施用厄洛替尼。在某些实施方案中，以三周周期每天一剂100mg施用厄洛替尼。在某些实施方案中，以三周周期每天一剂50mg施用厄洛替尼。一种例示性方案是对NSCLC患者施用(a)每三周一剂约15mg/kg抗c-met抗体（诸如MetMAb）；和(b)三周周期每天一剂150mg厄洛替尼（N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉酰胺）。在其它实施方案中，c-met拮抗剂（例如抗c-met抗体）与抗VEGF抗体和化疗（例如紫杉烷）组合使用。一种例示性方案是对三重阴性转移性乳腺癌患者，28天周期第1天和第15天施用一剂10mg/kg抗c-met抗体（例如MetMAb），28天周期第1天和第15天施用一剂10mg/kg抗VEGF抗体（例如贝伐单抗），及28天周期第1天、第8天和第15天通过IV输注施用一剂90mg/m2帕利他赛(paclitaxel)。另一种例示性方案是对三重阴性转移性乳腺癌患者，28天周期第1天和第15天施用一剂10mg/kg抗c-met抗体（例如MetMAb），及28天周期第1天、第8天和第15天通过IV输注施用一剂90mg/m2帕利他赛。在某些实施方案中，以每三周一剂约15mg/kg或以每两周一剂约10mg/kg施用MetMAb。在一些实施方案中，crizotinib与EGFR拮抗剂（在一些实施方案中，厄洛替尼）组合使用。在一些实施方案中，carbozantinib与EGFR拮抗剂（在一些实施方案中，厄洛替尼）组合使用。在一些实施方案中，foretinib与EGFR拮抗剂（在一些实施方案中，厄洛替尼）组合使用。在一些实施方案中，tivantinib与EGFR拮抗剂（在一些实施方案中，厄洛替尼）组合使用。在一些实施方案中，MGCD-265与EGFR拮抗剂（在一些实施方案中，厄洛替尼）组合使用。在一些实施方案中，rilotumumab与EGFR拮抗剂（在一些实施方案中，厄洛替尼）组合使用。在一些实施方案中，ficlatuzumab与EGFR拮抗剂（在一些实施方案中，厄洛替尼）组合使用。在一些实施方案中，人源化抗HGF抗体TAK-701与EGFR拮抗剂（在一些实施方案中，厄洛替尼）组合使用。本文中描述了其它癌症药物。
本文中公开和例示了c-met生物标志物的检测。在本文中描述的任何发明的一些实施方案中，患者癌症中c-met生物标志物的高表达为高蛋白质表达，且在进一步的实施方案中，使用IHC测定。在一些实施方案中，IHC得分为2或3。在一些实施方案中，IHC得分为3。在一些实施方案中，IHC得分为2。在一些实施方案中，高c-met生物标志物为（表示）50%或更多的肿瘤细胞具有中等c-met染色强度、组合的中等/高c-met染色强度或高c-met染色强度。在一些实施方案中，高c-met生物标志物为50%或更多的肿瘤细胞具有中等或高c-met染色强度。在一些实施方案中，c-met生物标志物的高表达为高mRNA表达（且在一些实施方案中，使用定性RT-PCR或原位杂交来检测）。在一些实施方案中，c-met生物标志物的高表达为c-met基因扩增（且在一些实施方案中，使用FISH来检测）。在其它实施方案中，使用基因表达序型分析、PCR（诸如rtPCR）、RNN-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、或FISH来检测c-met生物标志物。在一些实施方案中，PFS和/或OS相对于没有用c-met拮抗剂治疗（或在一些实施方案中，用c-met拮抗剂与EGFR拮抗剂组合治疗）的患者有可能延长（即存在PFS和/或OS延长的可能性）。在本文中公开的任何发明的一些实施方案中，高c-met生物标志物表达为met诊断阳性临床状态，如依照本文中表A定义的。
在本文中描述的任何发明的一些实施方案中，患者癌症中c-met生物标志物的低表达为低蛋白质表达且使用IHC测定。在一些实施方案中，IHC得分为1。在一些实施方案中，IHC得分为0。在一些实施方案中，IHC得分为0或1。在一些实施方案中，低c-met生物标志物为阴性c-met染色、少于50%的肿瘤细胞具有弱或组合的弱和中等c-met染色强度、或50%或更多的肿瘤细胞具有弱或组合的弱和中等c-met染色强度但少于50%的肿瘤细胞具有中等或组合的中等和强c-met染色强度。在一些实施方案中，低c-met生物标志物表示在用c-met拮抗剂治疗（或在一些实施方案中，用c-met拮抗剂与EGFR拮抗剂组合治疗）患者时PFS和OS缩短的可能性升高。在一些实施方案中，PFS和/或OS相对于没有用c-met拮抗剂治疗（或在一些实施方案中，用c-met拮抗剂与EGFR拮抗剂组合治疗）的患者有可能缩短（即存在PFS和/或OS缩短的可能性）。在本文中公开的任何发明的一些实施方案中，低c-met生物标志物表达为met诊断阴性临床状态，如依照本文中表A定义的。
任选地，可以在患者的样品中检测别的生物标志物。在一些实施方案中，发现患者的癌症表达野生型EGFR（在一些实施方案中，进一步表达c-met基因扩增，且在还有别的实施方案中，不表达c-met基因扩增）。在某些实施方案中，发现患者的癌症表达选自kras和EGFR的生物标志物。在一些实施方案中，发现患者的癌症表达突变型kras。在一些实施方案中，发现患者的癌症表达野生型kra。在一些实施方案中，发现患者的癌症表达突变型EGFR。在一些实施方案中，发现患者的癌症（例如患者的NSCLC）表达间变性(anaplastic)淋巴瘤激酶(ALK)易位。在一些实施方案中，ALK易位为EML4-ALK易位。在一些实施方案中，发现患者的癌症表达突变型c-met。在一些实施方案中，发现患者的癌症表达野生型c-met。
本文中公开了别的关于测定生物标志物（例如c-met生物标志物）表达的实施方案。
另一方面，本发明提供了用于评估患者中与表达大量c-met生物标志物的癌症的治疗有关的不利事件的方法，其中治疗用c-met拮抗剂（例如MetMAb(onartuzumab)）且该方法包括监测一种或多种不利事件的数目和/或严重性的步骤。本文中公开了例示性不利事件。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一幅彩色绘制的附图。专利局会在请求和缴纳必要的费用后提供本专利或专利申请公开文本带彩色附图的拷贝。
图1显示对对照细胞团粒的例示性IHC分析。
图2显示对NSCLC肿瘤样品的IHC分析的一个例子。
图3显示用厄洛替尼+安慰剂（实现）或厄洛替尼+MetMAb（虚线）治疗Met高患者的分析。
图4显示用厄洛替尼+安慰剂（实线）或厄洛替尼+MetMAb（虚线）治疗Met低患者的分析。
图5显示用厄洛替尼+安慰剂（实现）或厄洛替尼+MetMAb（虚线）治疗所有患者的分析。
图6显示分亚组检查的PFS。
图7显示分亚组检查的OS。
图8显示厄洛替尼+安慰剂治疗的患者中通过Met表达进行的预后的分析。Met低=虚线；Met高=实线。
图9显示Met高患者中的PFS的亚组分析。
图10显示Met高患者中的OS的亚组分析。
图11显示Met低患者中的PFS的亚组分析。
图12显示Met低患者中的OS的亚组分析。
图13显示用厄洛替尼+安慰剂（实线）或厄洛替尼+MetMAb（虚线）治疗Met诊断阳性患者的最终分析。
图14显示用厄洛替尼+安慰剂（实线）或厄洛替尼+MetMAb（虚线）治疗Met诊断阴性患者的最终分析。
图15显示用厄洛替尼+安慰剂（实线）或厄洛替尼+MetMAb（虚线）治疗所有患者的最终分析。
图16显示分亚组检查的OS。
图17显示Met诊断阴性患者中的OS的最终分析。
图18显示某些患者亚群的OS分析。
图19显示Met表达与厄洛替尼+安慰剂治疗的患者中更差的结局有关。
图20显示MET mRNA水平与met IHC临床得分的关系。
图21显示在使用不太严格的Met表达截留和更加严格的Met表达截留定义的患者中评估的，MetMAb与厄洛替尼组合的治疗效果。所有危害比是自未分层分析评估的。
发明详述
I.定义
在本文中，“患者”为人患者。患者可以是“癌症患者”，即患有或有风险患上一种或多种癌症症状的患者。此外，患者可以是先前治疗过的癌症患者。患者可以是“NSCLC癌症患者”，即患有或有风险患上一种或多种NSCLC症状的患者。此外，患者可以是先前治疗过的NSCLC患者。
如本文中使用的，除非另外指明，术语“c-met”或“Met”指任何天然或变异（无论天然的或合成的）c-met多肽。术语“野生型c-met”一般指包含天然发生c-met蛋白的氨基酸序列的多肽。术语“野生型c-met序列”一般指在天然发生c-met中找到的氨基酸序列。
“抗c-met抗体”指以足够亲和力和特异性结合c-met的抗体。所选择的抗体正常情况下会具有足够强的对c-met的结合亲和力，例如抗体可以以介于100nM-1pM之间的Kd值结合人c-met。抗体亲和力可通过例如基于表面等离振子共振的测定法（诸如BIAcore测定法，如PCT申请公开文本No.WO2005/012359中所记载的）；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法（例如RIA）来测定。在某些实施方案中，抗c-met抗体能在靶向和干扰涉及c-met活性的疾病或状况中用作治疗剂。还有，所述抗体可以进行其它生物学活性测定法，例如为了评估它作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且取决于抗体的靶抗原和预定用途。
“c-met拮抗剂”（可互换地称作“c-met抑制剂”）指干扰c-met活化或功能的药剂。c-met抑制剂的例子包括c-met抗体；HGF抗体；小分子c-met拮抗剂；c-met酪氨酸激酶抑制剂；反义和抑制性RNA（例如shRNA）分子(参见例如WO2004/87207)。优选地，c-met抑制剂是结合c-met的抗体或小分子。在一个具体的实施方案中，c-met抑制剂具有约1,000nM或更低的对c-met的结合亲和力（解离常数）。在另一个实施方案中，c-met抑制剂具有约100nM或更低的对c-met的结合亲和力。在另一个实施方案中，c-met抑制剂具有约50nM或更低的对c-met的结合亲和力。在一个具体的实施方案中，c-met抑制剂共价结合c-met。在一个具体的实施方案中，c-met抑制剂以1,000nM或更低的IC50抑制c-met信号传导。在另一个实施方案中，c-met抑制剂以500nM或更低的IC50抑制c-met信号传导。在另一个实施方案中，c-met抑制剂以50nM或更低的IC50抑制c-met信号传导。
“c-met活化”指c-met受体的活化或磷酸化。一般而言，c-met活化导致信号转导（例如由c-met受体的细胞内激酶结构域引起的，磷酸化c-met或底物多肽中的酪氨酸残基）。c-met活化可以由c-met配体（HGF）结合感兴趣c-met受体来介导。HGF对c-met的结合可活化c-met的激酶结构域并由此导致c-met中酪氨酸残基的磷酸化和/或其它的底物多肽中酪氨酸残基的磷酸化。
受试者“群体”指一组癌症受试者，诸如临床试验中的，或对特定适应证诸如乳腺癌疗法FDA批准之后肿瘤学家看到的。
如本文中使用的，就生物标志物而言，短语“不具有实质性生物标志物表达”或“基本上无生物标志物表达”表示生物标志物不展示具有统计学显著性的背景水平以上的表达水平。如本文中使用的，就生物标志物而言，短语“小或无生物标志物表达”表示生物标志物不展示有生物学意义的量的表达。正如本领域会理解的，表达的量可以定量或定性测定，只要能够进行生物标志物样品与参照对应物之间的比较。可以依照本领域已知的任何测定法或技术来测量或检测表达，包括例如本文中记载的那些（诸如IHC）。
短语“基因扩增”指在特定细胞或细胞系中形成多拷贝的基因或基因片段的过程。
对于本发明的方法，术语“指导”患者意味着通过任何手段，但是优选书面地，诸如以包装插页或其它书面推广材料的形式提供关于可应用疗法、药疗、处理、处理方案、等等的指导。
对于本发明的方法，术语“宣传(promoting)”意味着通过任何手段，包括书面地，诸如以包装插页的形式提供、登广告、出售、或描述特定药物、药物组合、或治疗模态。宣传在本文中指治疗剂，诸如抗c-met抗体和/或厄洛替尼用于适应证，诸如NSCLC治疗的宣传，其中此类宣传得到食品和药品管理局(FDA)批准，认为已证明与受试者群体中统计上显著的治疗功效和可接受的安全性有关。
术语“销售”在本文中用于描述产品（例如药物）的宣传、出售或分发。销售具体包括目的在于包装、登广告、和任何使产品商业化的商业活动。
为了本文中的目的，“先前治疗过的”癌症患者已经接受过在先癌症疗法。
即使对癌症患者施用抗肿瘤剂，诸如化疗剂，“顽固性”或“不应性”(refractory)癌症仍然发生进展。
“癌症药物”指有效治疗癌症的药物。癌症药物的例子包括下文所述化疗剂和化疗方案；c-met拮抗剂，包括抗c-met抗体，诸如MetMAb。
如本文中所使用的，术语“生物标志物”或“标志物”一般指其在哺乳动物组织或细胞中或上的表达或分泌可以通过已知方法（或本文中所公开的方法）来检测且预示或可用于预测（或帮助预测）细胞、组织或患者对治疗方案的响应性的分子，包括基因、mRNA、蛋白质、碳水化合物结构、或糖脂。本文中特别感兴趣的生物标志物是c-met。在一些实施方案中，c-met生物标志物不包括c-met基因的扩增（例如细胞群体中平均3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个拷贝的c-met基因、或更多，诸如平均8个或更多个、或10个或更多个拷贝的c-met基因）。
“患者样品”指从癌症患者得到的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液（羊水）、腹膜液（腹水）、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、循环中的肿瘤细胞、血清或血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。在一个实施方案中，所述样品包含NSCLC（例如鳞状亚型或非鳞状亚型）肿瘤样品。
患者对药物治疗的“有效响应”或“响应性”及类似用语指在施用癌症药物后对处于癌症（例如NSCLC）风险或患有癌症（例如NSCLC）的患者给予的临床或治疗好处。此类好处包括如下任何一项或多项：延长存活（包括总体存活和无进展存活）；导致客观响应（包括完全响应或部分响应）；或改善癌症体征或症状，等。在一个实施方案中，使用生物标志物（例如c-met表达，例如使用IHC测定的）来鉴定预期在用药物（例如抗c-met抗体）治疗时相对于不以相同水平表达该生物标志物的患者具有更大无进展存活(PFS)的患者。在一个实施方案中，使用生物标志物（例如c-met表达，例如使用IHC测定的）来鉴定预期在用药物（例如抗c-met抗体）治疗时相对于用药物治疗的、不以相同水平表达该生物标志物的患者或相对于不用药物治疗的、不以相同水平表达该生物标志物的患者具有缩短的PFS的患者。在一个实施方案中，使用生物标志物来鉴定预期在用药物治疗时相对于不以相同水平表达该生物标志物的患者具有更大总体存活(OS)的患者。在一个实施方案中，使用生物标志物（例如c-met表达，例如使用IHC测定的）来鉴定预期在用药物（例如抗c-met抗体）治疗时相对于用药物治疗的、不以相同水平表达该生物标志物的患者或相对于不用药物治疗的、不以相同水平表达该生物标志物的患者具有缩短的总体存活(OS)的患者。本文中生物标志物的发生有效预测或以高灵敏度预测此类有效响应。
“存活”(survival)指患者保持存活，而且包括总体存活(overall survival)和无进展存活(progress free survival)。
“总体存活”指保持一定时期诸如1年、5年等存活的患者，自诊断或治疗时起计算。
“无进展存活”指保持存活且癌症没有进展或恶化的患者。
“延长存活”意味着使接受治疗的患者的总体存活或无进展存活相对于未接受治疗的患者（即相对于未用药物治疗的患者），或相对于不以指定水平表达生物标志物的患者，和/或相对于用已获批准的抗肿瘤剂（诸如厄洛替尼的化疗方案）治疗的患者有延长。
“客观响应”(objective response)指可测量的响应，包括完全响应(CR)或部分响应(PR)。
“完全响应”(complete response)或“CR”指癌症的所有体征响应治疗而消失。这并不总是意味着癌症已经治愈。
“部分响应”(partial response)或“PR”指一处或多处肿瘤或损害的大小或体内癌症的程度响应治疗而减小。
与癌症（例如NSCLC）患者的临床好处增多有关的生物标志物的“量”或“水平”指生物学样品中的可检测水平，其中生物标志物的水平与患者临床好处增多有关。这些可以通过本领域技术专家知道及本发明也公开的方法来测量。评估的生物标志物的表达水平或量可用于测定对治疗的响应。在一些实施方案中，生物标志物的量或水平使用IHC（例如患者肿瘤样品的）来测定。在一些实施方案中，与癌症患者中临床好处增多有关的c-met生物标志物的量或水平是IHC得分为2、IHC得分为3、或IHC得分为2或3。在一些实施方案中，与癌症患者中临床好处增多有关的c-met生物标志物的量或水平是50%或更多的肿瘤细胞具有中等c-met染色强度、组合的中等/高c-met染色强度或高c-met染色强度。在一些实施方案中，与癌症患者中临床好处增多有关的c-met生物标志物的量或水平是50%或更多的肿瘤细胞具有中等或高c-met染色强度。
与癌症（例如NSCLC）患者的临床好处减少有关的生物标志物的“量”或“水平”指生物学样品中的低可检测水平或无可检测生物标志物，其中生物标志物的水平与患者临床好处减少有关。这些可以通过本领域技术专家知道及本发明也公开的方法来测量。评估的生物标志物的表达水平或量可用于测定对治疗的响应。在一些实施方案中，生物标志物的量或水平使用IHC（例如患者肿瘤样品的）来测定。在一些实施方案中，与癌症患者中临床好处减少有关的c-met生物标志物的量或水平是IHC得分为0、IHC得分为1、或IHC得分为0或1。在一些实施方案中，与癌症患者中临床好处减少有关的c-met生物标志物的量或水平是阴性c-met染色、少于50%的肿瘤细胞具有弱c-met染色强度或组合的弱和中等c-met染色强度、或50%或更多的肿瘤细胞具有弱或组合的弱和中等c-met染色强度但少于50%的肿瘤细胞具有中等或组合的中等和强c-met染色强度。
术语“表达的水平”或“表达水平”一般可互换使用，而且一般指生物学样品中多核苷酸、mRNA、或氨基酸产物或蛋白质的量。“表达”一般指基因所编码的信息转换成细胞中存在的和运行的结构的过程。因此，依照本发明，基因的“表达”可以指转录成多核苷酸、翻译成蛋白质、或甚至蛋白质的翻译后修饰。转录得到的多核苷酸的、翻译得到的蛋白质的、或翻译后修饰得到的蛋白质的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自蛋白质的翻译后加工（例如通过蛋白水解）。在一些实施方案中，“表达的水平”指生物学样品中蛋白质的量，如使用IHC测定的。
在用于本文时，短语“基于……的表达”表示使用关于一种或多种本文中生物标志物的表达水平的信息来通知治疗决定、在包装插页上提供的信息、或销售/宣称指导等。在生物标志物高表达的情况中，患者可以用诸如c-met拮抗剂（例如抗c-met抗体，例如MetMAb）等癌症（例如NSCLC）药物来治疗。在生物标志物的表达水平降低的情况中，患者可以用c-met拮抗剂（例如抗c-met抗体，例如MetMAb）以外的癌症药物来治疗。
“处理”和“治疗”(treatment)指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括那些早就患有良性、癌前、或非转移性肿瘤的以及要预防癌症发生或复发的。
术语“治疗有效量”指在哺乳动物中治疗或预防疾病或病症的治疗剂量。在癌症的情况中，治疗有效量的治疗剂可减少癌细胞的数目；缩小原发性肿瘤的尺寸；抑制（即一定程度的减缓，优选阻止）癌细胞浸润入周围器官；抑制（即一定程度的减缓，优选阻止）肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，体内功效可以通过例如评估存活持续时间、距疾病进展的时间(TTP)、响应率(RR)、响应持续时间、和/或生活质量来测量。
术语“癌（症）”和“癌（性）的”指向或描述哺乳动物中典型的以不受调节的细胞生长为特征的生理疾患。此定义中包括良性和恶性癌症。“早期癌症”或“早期肿瘤”指非侵入性的或转移性的，或者归为0期、I期、或II期癌症的癌症。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤（包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤）、肉瘤（包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤）、神经内分泌肿瘤（包括类癌瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌）、间皮瘤、施旺氏细胞瘤（包括听神经瘤）、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌（例如上皮鳞状细胞癌）、肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺的腺癌和肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric或stomach cancer)包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer或hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌（包括转移性乳腺癌）、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney或renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆管肿瘤、及头和颈癌。在一些实施方案中，癌症是三重阴性转移性乳腺癌，包括任何经组织学确认的具有局部复发性或转移性疾病的三重阴性（ER-、PR-、HER2-）乳腺癌（其中局部复发性疾病不适合具有治愈目的的切除术）。
“展示出c-met表达”的癌或生物学样品指在诊断测试中表达（包括过表达）c-met受体的癌或生物学样品。
“展示出c-met扩增”的癌或生物学样品指在诊断测试中具有扩增的c-met基因的癌或生物学样品。在一些实施方案中，扩增的c-met基因平均（在细胞群体中）大于或等于5个或更多个拷贝的c-met基因，或平均8个或更多个拷贝的c-met基因，或更多。
“不展示c-met扩增”的癌或生物学样品指在诊断测试中不具有扩增的c-met基因的癌或生物学样品。在一些实施方案中，不展示c-met扩增的样品是平均具有少于4个拷贝的c-met基因的样品。
“EGFR”指Ullrich et al.,Nature(1984)309:418425中记载的受体酪氨酸激酶多肽表皮生长因子受体，或者指Her-1和c-erbB基因产物，及其变体，诸如EGFRvIII。EGFR的变体还包括删除、替代和插入变体，例如Lynch et al.,New England Journal of Medicine2004,350:2129；Paez et al.,Science2004,304:1497；Pao et al.,PNAS2004,101:13306中所记载的那些。
“EGFR拮抗剂”（可互换地称作“EGFR抑制剂”）指干扰EGFR活化或功能的药剂。EGFR抑制剂的例子包括EGFR抗体；EGFR配体抗体；小分子EGFR拮抗剂；EGFR酪氨酸激酶抑制剂；反义和抑制性RNA（例如shRNA）分子(参见例如WO2004/87207)。优选地，EGFR抑制剂是结合EGFR的抗体或小分子。在一些实施方案中，EGFR抑制剂是EGFR靶向药物。在一个具体的实施方案中，EGFR抑制剂具有约1,000nM或更低的对EGFR的结合亲和力（解离常数）。在另一个实施方案中，EGFR抑制剂具有约100nM或更低的对EGFR的结合亲和力。在另一个实施方案中，EGFR抑制剂具有约50nM或更低的对EGFR的结合亲和力。在一个具体的实施方案中，EGFR抑制剂共价结合EGFR。在一个具体的实施方案中，EGFR抑制剂以1,000nM或更低的IC50抑制EGFR信号传导。在另一个实施方案中，EGFR抑制剂以500nM或更低的IC50抑制EGFR信号传导。在另一个实施方案中，EGFR抑制剂以50nM或更低的IC50抑制EGFR信号传导。在某些实施方案中，EGFR拮抗剂将EGFR的表达水平或生物学活性降低或抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。
“EGFR活化”指EGFR的活化或磷酸化。一般而言，EGFR活化导致信号转导（例如由EGFR受体的细胞内激酶结构域引起的，磷酸化EGFR或底物多肽中的酪氨酸残基）。EGFR活化可以由EGFR配体结合包含EGFR的EGFR二聚体来介导。EGFR配体对EGFR二聚体的结合可活化二聚体中一个或多个EGFR的激酶结构域并由此导致一个或多个EGFR中酪氨酸残基的磷酸化和/或别的底物多肽中酪氨酸残基的磷酸化。
如本文中所使用的，术语“EGFR靶向药物”指结合EGFR并抑制EGFR活化的治疗剂。此类药剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的例子包括MAb579(ATCC CRL HB8506），MAb455(ATCC CRLHB8507)，MAb225(ATCC CRL8508)，MAb528(ATCC CRL8509)(参见美国专利第4,943,533号,Mendelsohn et al.)及其变体，诸如嵌合化225(C225或Cetuximab；
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)和重构人225(H225)(参见WO96/40210,ImcloneSystems Inc.)；IMC-11F8，一种完全人的EGFR靶向抗体(Imclone)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利No.5,891,996中所记载的；及结合EGFR的人抗体，诸如ABX-EGF(参见WO98/50433,Abgenix)；EMD55900(Stragliotto et al.,Eur.J.Cancer32A:636-640(1996))；EMD7200(matuzumab)，一种针对EGFR的人源化EGFR抗体，其与EGF和TGF-α二者竞争EGFR结合；及mAb806或人源化mAb806(Johns et al.,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可偶联细胞毒剂，如此产生免疫偶联物(参见例如EP659,439A2,MerckPatent GmbH)。结合EGFR的小分子的例子包括ZD1839或Gefitinib(IRESSATM；Astra Zeneca)；CP-358774或厄洛替尼(TARCEVATM；Genentech/OSI)；和AG1478、AG1571(SU5271；Sugen)；EMD-7200。
“聚合酶链式反应”或“PCR”技术在用于本文时一般指其中如1987年7月28日公告的美国专利第4,683,195号中所记载的，扩增微量的核酸、RNA和/或DNA特定片段的流程。通常，需要获知目的区域末端或以外的序列信息，从而可设计寡核苷酸引物；这些引物在序列上将与待扩增模板的相对链相同或相似。两条引物的5’末端核苷酸可与所扩增物质的末端一致。PCR可用于从总基因组DNA和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等扩增特定RNA序列、特定DNA序列。一般参见Mullis等,Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.51:263(1987);Erlich ed.,PCR Technology,Stockton Press,NY,1989。在用于本文时，PCR视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应方法的一个但非唯一的例子，包括使用已知核酸（DNA或RNA）作为引物并利用核酸聚合酶来扩增或生成特定核酸片段，或者扩增或生成与特定核酸互补的特定核酸片段。
“定量实时聚合酶链式反应”或“qRT-PCR”指PCR的一种形式，其中在PCR反应的每个步骤测量PCR产物的量。这种技术已经记载于多份出版物，包括Cronin等,Am.J.Pathol.164(1):35-42(2004);Ma等,Cancer Cell.5:607-616(2004)。
术语“微阵列”指可杂交阵列元素，优选多核苷酸探针在基片上的有序排列。
术语“多核苷酸”在以单数或复数使用时一般指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，可以是未经修饰的RNA或DNA或者是经过修饰的RNA或DNA。如此，例如，本文中所定义的多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、包含单链区和双链区的DNA、单链和双链RNA、及包含单链区和双链区的RNA，包含DNA和RNA的杂合分子，它可以是单链的，或者更典型的是双链的，或者包含单链区和双链区。另外，术语“多核苷酸”在用于本文时指包含RNA或DNA或RNA和DNA二者的三链区。此类区中的链可来自相同分子或来自不同分子。所述区可包含一种或多种分子的整个，但是更典型的是只包含有些分子的一个区。三股螺旋区的分子之一常常是寡核苷酸。术语“多核苷酸”明确包括cDNA。该术语包括包含一种或多种经修饰碱基的DNA（包括cDNA）和RNA。如此，主链为稳定性或其它原因而修饰的DNA或RNA也是“多核苷酸”该术语在本文中的意图所在。此外，包含罕见碱基诸如肌苷或经修饰碱基诸如氚化碱基的DNA或RNA也包括在本文中所定义的术语“多核苷酸”内。一般而言，术语“多核苷酸”涵盖未修饰多核苷酸的所有化学、酶学和/或代谢修饰形式，以及病毒和细胞，包括简单和复杂细胞的特征性的DNA和RNA的化学形式。
术语“寡核苷酸”指相对较短的多核苷酸，包括但不限于单链脱氧核糖核苷酸、单链或双链核糖核苷酸、RNA:DNA杂合物、及双链DNA。寡核苷酸，诸如单链DNA探针寡核苷酸，常常通过化学方法来合成，例如使用商品化的自动化寡核苷酸合成仪。然而，寡核苷酸可通过多种其它方法来制备，包括体外重组DNA介导的技术和通过DNA在细胞和生物体中的表达。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)
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磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)（尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)）；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)（屈大麻酚(dronabinol)，）；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)（包括合成类似物托泊替康(topotecan)
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CPT-11（伊立替康(irinotecan)，
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）、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱）；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065（包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物）；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)（特别是隐藻素1和隐藻素8）；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin（包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1）；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)（如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1（参见例如Nicolaou等人.,Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994)）；CDP323，一种口服α-4整联蛋白抑制剂；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团）、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)（包括
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吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂
Figure BDA00003108252600242
脂质体多柔比星TLC D-99
Figure BDA00003108252600243
PEG化脂质体多柔比星
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和脱氧多柔比星）、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)
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替加氟(tegafur)
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卡培他滨(capecitabine)埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；
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多糖复合物（JHS NaturalProducts,Eugene,OR）；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)（尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin)）；乌拉坦(urethan)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)（“Ara-C”）；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)
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清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞（ABRAXANETM）和多西他塞(doxetaxel)
Figure BDA00003108252600253
苯丁酸氮芥(chlorambucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春药类(vincas)，其阻止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱(vinblastine)
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长春新碱(vincristine)
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长春地辛(vindesine)
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和长春瑞滨(vinorelbine)依托泊苷(etoposide)（VP-16）；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovovin)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)，包括贝沙罗汀(bexarotene)
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二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)（例如
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或
Figure BDA000031082526002511
）、依替膦酸钠(etidronate)
Figure BDA000031082526002512
NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)
Figure BDA000031082526002513
阿伦膦酸盐(alendronate)
Figure BDA000031082526002514
帕米膦酸盐(pamidronate)替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)
Figure BDA000031082526002517
以及曲沙他滨(troxacitabine)（1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物）；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如
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疫苗和基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗和
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疫苗；拓扑异构酶1抑制剂（例如
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）；rmRH（例如
Figure BDA00003108252600266
）；BAY439006(sorafenib;Bayer)；SU-11248(Pfizer)；哌立福辛(perifosine)，COX-2抑制剂（如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib)），蛋白体抑制剂（例如PS341）；bortezomib
Figure BDA00003108252600267
CCI-779；tipifarnib（R11577）；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如oblimersen sodium
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pixantrone；EGFR抑制剂（见下文定义）；酪氨酸激酶抑制剂（见下文定义）；及任何上述各项的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多种上述各项的组合，诸如CHOP（环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写）和FOLFOX（奥沙利铂（ELOXATINTM）联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写）。
在本文中，化疗剂包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”类。它们自身可以是激素，包括但不限于：具有混合的激动剂/拮抗剂特性的抗雌激素类，包括他莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX)、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)
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曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)，和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，诸如SERM3；没有激动剂特性的纯的抗雌激素类，诸如氟维司群(fulvestrant)
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和EM800（此类药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、提高ER周转、和/或遏制ER水平）；芳香酶抑制剂类，包括类固醇芳香酶抑制剂类，诸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane)
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和非类固醇芳香酶抑制剂类，诸如阿那曲唑(anastrozole)
Figure BDA000031082526002613
来曲唑(letrozole)
Figure BDA000031082526002614
和氨鲁米特(aminoglutethimide)，和其它芳香酶抑制剂类，包括伏氯唑(vorozole)
Figure BDA000031082526002615
醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)
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法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑；促黄体生成激素释放激素激动剂类，包括亮丙瑞林(leuprolide)
Figure BDA000031082526002617
和戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(triptorelin)；性类固醇类(sex steroids)，包括妊娠素类(progestine)，诸如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)，雌激素类，诸如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普雷马林(premarin)，和雄激素类/类视黄酸类，诸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、所有反式视黄酸(transretionic acid)和芬维A胺(fenretinide)；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合。
本文中化疗剂或化疗方案的具体例子包括：烷化剂类（例如苯丁酸氮芥、苯达莫司汀(bendamustine)、或环磷酰胺）；核苷类似物或抗代谢物（例如氟达拉滨）、氟达拉滨和环磷酰胺(FC)；泼尼松或泼尼松龙(prednisolone)；含烷化剂的组合疗法，包括环磷酰胺、长春新碱、泼尼松龙(CHOP)，或环磷酰胺、长春新碱、泼尼松龙(CVP)，等。
“目标受众(target audience)”指接受如通过推销或做广告（尤其为了特定用途、治疗、或适应症）进行的特定药物宣传或意图进行的特定药物宣传的人群或机构，诸如患者个体，患者群体，报纸、医学文献、和杂志读者，电视或因特网观众，无线电或因特网听众，内科医生，药品公司，等。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症、要与包装的产品组合的其它治疗产品、和/或警告等的信息。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子（例如scFv）；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50%或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50%或更多。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类（同种型），例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ、和μ。
在用于本文时，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于：放射性同位素（例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素）；化学治疗剂或药物（例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)（长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)）、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂）；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体（例如B细胞受体）下调；和B细胞活化。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如记载于Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1、FR2、FR3、和FR4。因而，HVR和FR序列在VH（或VL）中一般以如下的顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR（例如，CDR）对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
在用于本文时，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环（“高变环”）的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中（H1、H2、H3），且三个在VL中（L1、L2、L3）。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性的高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。例示性的CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65、和H3的95-102(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。除了VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-CDR，或a-CDR的CDR区内。例示性的a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58、和H3的95-102(见Almagro和Fransson,Front.Biosci。13:1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基（例如，FR残基）在本文中依照Kabat等，见上文编号。在一个实施方案中，本文中的c-met抗体包含SEQ ID NO：1-6的HVR。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒剂缀合的抗体。
在用于本文时，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“裸抗体”指未与异源模块（例如细胞毒性模块）或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域（CH1、CH2、和CH3）。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“药物配制剂”指其形式容许药物的生物学活性是有效的，且不含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的无菌制备物。
“无菌”配制剂是无菌的或不含所有活的微生物及其孢子。
“试剂盒”指包含至少一种试剂（例如用于治疗癌症（例如NCSLC或三重阴性乳腺癌）的药物，或用于特异性检测本发明的生物标志物基因或蛋白的试剂（例如抗体））的任何制品（例如包装或容器）。所述制品优选以用于实施本发明方法的单位来宣传、分发、或销售。
“药学可接受载体”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
关于参照多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，%氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office,Washington D.C.,20559)，其中其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech,Inc.,South San Francisco,California可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性（或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A）如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的%氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的%氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
II.癌症药物
一方面，本发明涉及基于一种或多种本文中公开的生物标志物的表达来选择能用癌症药物治疗的患者。癌症药物的例子包括但不限于：
-c-met拮抗剂，包括抗c-met抗体；
-化疗剂和化疗方案；
-用于治疗癌症（例如NSCLC）的开发中的或已批准的其它药物或其组合。
在一个实施方案中，药物是抗体，例如针对或结合c-met的抗体。本文中的抗体包括：单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、单臂抗体、scFv、双抗体、或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。在一个实施方案中，抗体是单价的。在另一个实施方案中，抗体是包含Fc区的单臂抗体（即重链可变域和轻链可变域形成单一抗原结合臂），其中Fc区包含第一和第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽以复合物存在且形成Fc区，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比，该Fc区提高所述抗体片段的稳定性。单臂抗体可以是单价的。
在一个实施方案中，c-met拮抗剂是抗c-met抗体。在另一个实施方案中，抗c-met抗体是MetMAb(onartuzumab)或其生物相似形式。MetMAb公开于例如WO2006/015371；Jin et al,Cancer Res(2008)68:4360。在另一个实施方案中，抗c-met抗体包含重链可变域，其包含下述一项或多项：(a)HVR1，其包含序列GYTFTSYWLH(SEQ ID NO:1)；(b)HVR2，其包含序列GMIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQ ID NO:2)；和/或(c)HVR3-HC，其包含序列ATYRSYVTPLDY(SEQ ID NO:3)。在一些实施方案中，抗体包含轻链可变域，其包含下述一项或多项：(a)HVR1-LC，其包含序列KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID NO:4)；HVR2-LC，其包含序列WASTRES(SEQ ID NO:5)；和/或(c)HVR3-LC，其包含序列QQYYAYPWT(SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中，抗c-met抗体包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含：(a)HVR1，其包含序列GYTFTSYWLH(SEQ ID NO:1)；(b)HVR2，其包含序列GMIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQ ID NO:2)；和(c)HVR3-HC，其包含序列ATYRSYVTPLDY(SEQ ID NO:3)，该轻链可变域包含：(a)HVR1-LC，其包含序列KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID NO:4)；HVR2-LC，其包含序列WASTRES(SEQ ID NO:5)；和(c)HVR3-LC，其包含序列QQYYAYPWT(SEQ ID NO:6)。
在任何上述实施方案中，例如，抗c-met抗体可以是人源化的。在一个实施方案中，抗c-met抗体包含任何上述实施方案中的HVR，且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
另一方面，抗c-met抗体包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的VH序列相对于参照序列含有替代（例如保守替代）、插入、或删除，但是包含该序列的抗c-met抗体保留结合人c-met的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:7中替代、改变插入和/或删除了总共1到10个氨基酸。在某些实施方案中，替代、插入、或删除存在于HVR以外的区域（即在FR中）。任选地，抗c-met抗体包含SEQ ID NO:7中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
另一方面，提供抗c-met抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的VL序列相对于参照序列含有替代（例如保守替代）、插入、或删除，但是包含该序列的抗c-met抗体保留结合c-met的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:8中替代、插入和/或删除了总共1到10个氨基酸。在某些实施方案中，替代、插入、或删除存在于HVR以外的区域（即在FR中）。任选地，抗c-met抗体包含SEQ ID NO:8中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
在还有另一个实施方案中，抗c-met抗体包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的VL区和与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的VH区。在还有又一个实施方案中，抗c-met抗体包含：HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1；HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2；HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3；HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:4；HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5；和HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6。
另一方面，提供抗c-met抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。
又一方面，本发明提供与本文中提供的抗c-met抗体结合相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供与下述抗c-met抗体结合相同表位或能被下述抗c-met抗体竞争性抑制的抗体，该抗c-met抗体包含VH序列SEQ IDNO:7和VL序列SEQ ID NO:8。
在本发明的又一个方面，依照任何上述实施方案的抗c-met抗体可以是单克隆抗体，包括单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗c-met抗体是抗体片段，例如单臂、Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体、或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1或IgG4抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。依照另一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体包含上文所述HVR或包含上文所述VH和VL区。
在一些实施方案中，抗c-met抗体是单价的，而且包含：(a)第一多肽，其包含重链可变域（其具有序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)）、CH1序列、和第一Fc多肽；(b)第二多肽，其包含轻链可变域（其具有序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:8)）、和CL1序列；和(c)第三多肽，其包含第二Fc多肽，其中重链可变域和轻链可变域作为复合物存在且形成单一抗原结合臂，其中第一和第二Fc多肽在复合物中存在且形成Fc区，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比，该Fc区提高所述抗体片段的稳定性。在一些实施方案中，第一多肽包含Fc序列CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:9)，而第二多肽包含Fc序列CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:10)。
在另一些实施方案中，抗c-met抗体是单价的，而且包含：(a)第一多肽，其包含重链，所述多肽包含序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:11)；(b)第二多肽，其包含轻链，所述多肽包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:12)；和第三多肽，其包含Fc序列，所述多肽包含序列DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:13)，其中重链可变域和轻链可变域作为复合物存在且形成单一抗原结合臂，其中第一和第二Fc多肽在复合物中存在且形成Fc区，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比，该Fc区提高所述抗体片段的稳定性。
本文中描述了且本领域知道适合用于本发明方法的其它抗c-met抗体。例如，WO05/016382中公开的抗c-met抗体（包括但不限于抗体13.3.2、9.1.2、8.70.2、8.90.3）；由以ICLC编号PD03001保藏于CBA（Genoa）的杂交瘤细胞系生成或识别HGF受体β链胞外域上表位（所述表位与该单克隆抗体识别的表位相同）的抗c-met抗体；WO2007/126799中公开的抗c-met抗体（包括但不限于04536、05087、05088、05091、05092、04687、05097、05098、05100、05101、04541、05093、05094、04537、05102、05105、04696、04682）；WO2009/007427中公开的抗c-met抗体（包括但不限于于2007年3月14日以编号I-3731、于2007年3月14日以编号I-3732、于2007年7月6日以编号I-3786、于2007年3月14日以编号I-3724保藏于CNCM（Institut Pasteur,Paris,France）的抗体）；20110129481中公开的抗c-met抗体；US20110104176中公开的抗c-met抗体；WO2009/134776中公开的抗c-met抗体；WO2010/059654中公开的抗c-met抗体；WO2011020925中公开的抗c-met抗体（包括但不限于自于2008年3月12日以编号I-3949保藏于CNCM（Institut Pasteur,Paris,France）的杂交瘤和于2010年1月14日以编号I-4273保藏的杂交瘤分泌的抗体）。
一方面，抗c-met抗体包含促进抗体片段内Fc序列的异二聚化，同时将同二聚化降至最低的至少一项特征。此类特征改善免疫球蛋白群体的产量和/或纯度和/或同质性。在一个实施方案中，抗体包含构成“结”和“穴”的Fc突变，如WO2005/063816中描述的。例如，穴突变可以是Fc多肽中的T366A、L368A和/或Y407V中的一项或多项，而空穴突变可以是T366W。
在一些实施方案中，c-met拮抗剂是抗肝细胞生长因子(HGF)抗体，例如人源化抗HGF抗体TAK701、rilotumumab、Ficlatuzumab、和/或WO2007/143090中描述的人源化抗体2B8。在一些实施方案中，抗HGF抗体是US7718174B2中描述的抗HGF抗体。
在一些实施方案中，c-met拮抗剂是c-met小分子抑制剂。在一些实施方案中，c-met小分子抑制剂是选择性c-met小分子抑制剂。
在一个实施方案中，c-met拮抗剂结合c-met胞外域。在一些实施方案中，c-met拮抗剂结合c-met激酶域。在一些实施方案中，c-met拮抗剂与肝细胞生长因子(HGF)竞争c-met结合。在一些实施方案中，c-met拮抗剂结合HGF。在某些实施方案中，c-met拮抗剂抑制细胞系EBC-1、H441和/或KP4的细胞增殖，例如HGF诱导的细胞增殖。在一些实施方案中，以600nM或更少（更有力）、500nM或更少、400nM或更少、300nM或更少或更有力的Ki抑制细胞增殖。在某些实施方案中，在10%胎牛血清存在下用c-met拮抗剂处理EBC-1细胞时，c-met拮抗剂抑制c-met信号传导（例如磷酸-c-met、磷酸-AKT、磷酸-MAPK）。在一些实施方案中，以600nM或更少（更有力）、500nM或更少、400nM或更少、300nM或更少（更有力）的Ki抑制c-met信号传导。在某些实施方案中，c-met拮抗剂治疗（能够治疗）鳞状细胞癌。在某些实施方案中，c-met拮抗剂治疗（能够治疗）表达野生型k-ras的NSCLC。
在某些实施方案中，c-met抑制剂不是非ATP竞争性小分子。在某些实施方案中，c-met拮抗剂抑制细胞系EBC-1、H441和/或KP4的细胞增殖，例如HGF诱导的细胞增殖。在某些实施方案中，在10%胎牛血清存在下用c-met拮抗剂处理EBC-1细胞时，c-met拮抗剂抑制c-met信号传导（例如磷酸-c-met，和下游c-met信号传导途径，例如磷酸-AKT、磷酸-MAPK）。在某些实施方案中，c-met拮抗剂不抑制细胞系MDA-MB-231和HT29的细胞增殖（在外源HGF存在或缺失下）。在某些实施方案中，在10%胎牛血清存在下，c-met拮抗剂不抑制细胞系MDA-MB-231和HT29的细胞增殖。用于测定细胞增殖的方法是本领域公知的，而且WO2009/111691；WO2006/015371；及Jin et al,Cancer Res(2008)68:4360中描述了一些方法。在某些实施方案中，c-met拮抗剂治疗（能够治疗）鳞状细胞癌。在某些实施方案中，c-met拮抗剂治疗（能够治疗）表达野生型k-ras的NSCLC。在某些实施方案中，c-met拮抗剂不是Tivantinib(ARQ-197)。在一个特别的实施方案中，c-met拮抗剂以1,000nM或更少（即更有力）的IC50抑制c-met信号传导。在另一个实施方案中，c-met拮抗剂以400nm或更少、500nM或更少、600nm或更少、700nm或更少的IC50抑制c-met信号传导。在另一个实施方案中，c-met拮抗剂以50nM或更少的IC50抑制c-met信号传导。在某些实施方案中，c-met拮抗剂不是crizotinib。在某些实施方案中，c-met拮抗剂不是foretinib。在某些实施方案中，c-met拮抗剂不是ficlatuzumab。
在某些实施方案中，c-met拮抗剂是下述任一：SGX-523，Crizotinib（PF-02341066；3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺；CAS no.877399-52-5）；JNJ-38877605（CAS no.943540-75-8），BMS-698769，PHA-665752(Pfizer)，SU5416，INC-280（Incyte；SU11274（Sugen；[(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-N-甲基-2-氧二氢吲哚-5-磺酰胺；CAS no.658084-23-2]），Foretinib(GSK1363089)，XL880（CAS no.849217-64-7；XL880是met和VEGFR2和KDR的抑制剂）；MGCD-265（MethylGene；MGCD-265靶向c-MET、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、Ron和Tie-2受体；CAS no.875337-44-3），Tivantinib（ARQ197；(-)-(3R,4R)-3-(5,6-二氢-4H-吡咯[3,2,1-ij]喹啉-1-基)-4-(1H-吲哚-3-基)吡咯烷-2,5-二酮；参见Munchi et al,Mol CancerTher June20109;1544；CAS no.905854-02-6），LY-2801653(Lilly)，LY2875358(Lilly)，MP-470，Rilotumumab（AMG102，抗HGF单克隆抗体），抗体223C4或人源化抗体223C4(WO2009/007427)，人源化L2G7（人源化TAK701；人源化抗HGF单克隆抗体）；EMD1214063(Merck Sorono)，EMD1204831(Merck Serono)，NK4，Cabozantinib（XL-184，CAS no.849217-68-1；carbozantinib是met和VEGFR2的一种双重抑制剂），MP-470（SuperGen；是c-KIT、MET、PDGFR、Flt3、和AXL的一种新型抑制剂），Comp-1，Ficlatuzumab（AV-299；抗HGF单克隆抗体），E7050（Cas no.1196681-49-8；E7050是一种双重c-met和VEGFR2抑制剂(Esai)；MK-2461（Merck；N-((2R)-1,4-二恶烷-2-基甲基)-N-甲基-N'-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-氧-5H-苯并[4,5]环庚[1,2-b]吡啶-7-基]磺酰胺；CAS no.917879-39-1）；MK8066(Merck)，PF4217903(Pfizer)，AMG208(Amgen)，SGX-126，RP1040，LY2801653，AMG458，EMD637830，BAY-853474，DP-3590。在某些实施方案中，c-met拮抗剂是crizotinib、tivantinib、carbozantinib、MGCD-265、ficlatuzumab、人源化TAK-701、rilotumumab、foretinib、h224G11、DN-30、MK-2461、E7050、MK-8033、PF-4217903、AMG208、JNJ-38877605、EMD1204831、INC-280、LY-2801653、SGX-126、RP1040、LY2801653、BAY-853474,和/或LA480中任一种或多种。在某些实施方案中，c-met拮抗剂是crizotinib、tivantinib、carbozantinib、MGCD-265、ficlatuzumab、人源化TAK-701、rilotumumab、和/或foretinib中任一种或多种。
EGFR拮抗剂包括抗体，诸如称作nimotuzumab(YM Biosciences)的人源化单克隆抗体，完全人的ABX-EGF(panitumumab,Abgenix Inc.)以及US6,235,883中记载的称作E1.1，E2.4，E2.5，E6.2，E6.4，E2.11，E6.3和E7.6.3的完全的抗体；MDX-447(Medarex Inc)。pertuzumab(2C4)是直接结合HER2但干扰HER2-EGFR二聚化，由此抑制EGFR信号传导的人源化抗体。结合EGFR的抗体的其它例子包括MAb579(ATCC CRL HB8506)，MAb455(ATCC CRL HB8507)，MAb225(ATCC CRL8508)，MAb528(ATCC CRL8509)(参见美国专利No.4,943,533,Mendelsohn et al.)及其变体，诸如嵌合化225(C225或Cetuximab；
Figure BDA00003108252600391
)和重构人225(H225)(参见WO96/40210,Imclone Systems Inc.)；IMC-11F8，一种完全人的EGFR靶向抗体(Imclone)；结合II型突变EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利No.5,891,996中所记载的；及结合EGFR的人抗体，诸如ABX-EGF(参见sWO98/50433,Abgenix)；EMD55900(Stragliotto et al.Eur.J.Cancer32A:636-640(1996))；EMD7200(matuzumab)，一种针对EGFR的人源化EGFR抗体，其与EGF和TGF-α二者竞争EGFR结合；及mAb806或人源化mAb806(Johns et al.,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可偶联细胞毒剂，如此产生免疫偶联物(参见例如EP659,439A2,MerckPatent GmbH)。
在本发明的方法中有用的抗EGFR抗体包括任何以足够亲和力和特异性结合EGFR且能降低或抑制EGFR活性的抗体。所选择的抗体在正常情况下会具有足够强的对EGFR的结合亲和力，例如抗体可以以介于100nM-1pM之间的Kd值结合人c-met。抗体亲和力可通过例如基于表面等离振子共振的测定法（诸如BIAcore测定法，如PCT申请公开文本No.WO2005/012359中所记载的）；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法（例如RIA）来测定。优选地，本发明的抗EGFR抗体能在靶向和干扰涉及EGFR/EGFR配体活性的疾病或状况中用作治疗剂。还有，可以对所述抗体进行其它生物学活性测定法，例如为了评估它作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且取决于抗体的靶抗原和预定用途。
双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合EGFR和c-met。在另一个例子中，例示性的双特异性抗体可结合同一蛋白质（例如c-met蛋白质）的两种不同表位。或者，可以将c-met或EGFR臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子（例如CD2或CD3），或IgG的Fc受体(FcγR)，诸如FcγRI(CD64)，FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合，从而将细胞防御机制聚焦于表达c-met或EGFR的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位至表达EGFR或c-met的细胞。这些抗体拥有结合EGFR或c-met的臂和结合细胞毒剂（例如皂草毒蛋白，抗干扰素-α，长春花生物碱，蓖麻毒蛋白A链，甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原）的臂。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段（例如F(ab')2双特异性抗体）。在一个实施方案中，双特异性抗体是US20100254989A中记载的任何双特异性MET-EGFR抗体。
EGFR拮抗剂还包括小分子，诸如US5616582，US5457105，US5475001，US5654307，US5679683，US6084095，US6265410，US6455534，US6521620，US6596726，US6713484，US5770599，US6140332，US5866572，US6399602，US6344459，US6602863，US6391874，WO9814451，WO9850038，WO9909016，WO9924037，WO9935146，WO0132651，US6344455，US5760041，US6002008，US5747498中记载的化合物。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774，厄洛替尼，OSI Pharmaceuticals)；PD183805(CI1033，2-丙烯酰胺，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二氢氯化物，Pfizer Inc.)；
Figure BDA00003108252600401
(ZD1839，Gefitinib，AstraZeneca)；ZM105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺，Boehringer Ingelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉yl]-2-丁炔酰胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)；lapatinib(Tykerb，GlaxoSmithKline)；ZD6474(Zactima，AstraZeneca)；CUDC-101(Curis)；canertinib(CI-1033)；AEE788(6-[4-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]苯基]-N-[(1R)-1-苯基乙基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺，WO2003013541，Novartis)和PKI166(4-[4-[[(1R)-1-苯基乙基]氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-酚，WO9702266Novartis)。
在一个实施方案中，抗体（例如本文方法中使用的抗体）可掺入任何单一或组合特征，如下文1-6节描述的。
1.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段，单臂抗体，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，见例如Pluckthün,于ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994);还可见WO93/16185;及美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基，并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如EP404,097;WO1993/01161;Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003);及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体（Domantis,Inc.,Waltham,MA；见例如美国专利No.6,248,516B1）。
单臂抗体（即重链可变域和轻链可变域形成单一抗原结合臂）公开于例如WO2005/063816；Martens et al,Clin Cancer Res(2006),12:6144。对于需要拮抗功能且抗体二价性导致不想要的激动效应的病理状况治疗，单臂抗体（即包含单一抗原结合臂的抗体）的单价性状导致和/或确保抗体结合靶分子时的拮抗功能。另外，包含Fc区的单臂抗体的特征在于与具有相似/基本上相同的抗原结合特征的Fab形式相比卓越的药动学属性（诸如体内降低的清除速率和/或延长的半衰期），如此克服使用常规单价Fab抗体的主要缺点。用于制备单臂抗体的技术包括但不限于“结入穴”工程（参见例如美国专利No.5,731,168）。MetMAb是单臂抗体的一个例子。[添加其它单臂单价形式？Genmab？]
可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞（例如大肠杆菌或噬菌体）的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。
2.嵌合的和人源化的抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567;及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区（例如，自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区）和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR（或其部分）自非人抗体衍生，而FR（或其部分）自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体（例如衍生HVR残基的抗体）的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann等,Nature332:323-329(1988);Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989);美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409;Kashmiri等,Methods36:25-34(2005)（描述了SDR(a-CDR)嫁接）；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)（描述了“重修表面”）；Dall’Acqua等,Methods36:43-60(2005)（描述了“FR改组”）；及Osbourn等,Methods36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)（描述了FR改组的“引导选择”方法）。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区（见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993)）；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区（见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);及Presta等J.Immunol.,151:2623(1993)）；人成熟的（体细胞突变的）框架区或人种系框架区（见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)）；和通过筛选FR文库衍生的框架区（见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996)）。
3.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了
Figure BDA00003108252600431
技术；美国专利No.7,041,870，其描述了
Figure BDA00003108252600432
技术，和美国专利申请公开文本No.US2007/0061900，其描述了
Figure BDA00003108252600433
技术）。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系（见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991)）。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826（其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体）和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)（其描述了人-人杂交瘤）的。人杂交瘤技术（Trioma技术）也记载于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
4.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等于Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,2001)，并且进一步记载于例如McCafferty等,Nature348:552-554;Clackson等,Nature352:624-628(1991);Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Marks和Bradbury,于Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003);Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004);及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以（例如自人）克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373、和美国专利公开文本No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
5.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对c-met，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合c-met的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达c-met的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达（见Milstein和Cuello,Nature305:537(1983)、WO93/08829、和Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991)）、和“突起-入-空穴”工程化（见例如美国专利No.5,731,168）。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段（见例如美国专利No.4,676,980,及Brennan等,Science,229:81(1985)）；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体（见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)）；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术（见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)）；及使用单链Fv(sFv)二聚体（见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994)）；及如例如Tutt等J.Immunol.,147:60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”（见例如US2006/0025576A1）。
本文中的抗体或片段还包括包含结合c-met及另一种不同抗原（诸如EGFR）的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”（见例如US2008/0069820）。
6.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。
在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体（例如人源化或人抗体）的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变（例如改善）（例如升高的亲和力、降低的免疫原性）和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性（例如结合亲和力）。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶（例如对于ADEPT）或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
在抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright等TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏附着（直接或间接）于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构（例如，复合的、杂合的和高甘露糖的结构）的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位（Fc区残基的Eu编号方式）的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No.US2003/0157108(Presta,L.);US2004/0093621(KyowaHakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US2003/0157108;WO2000/61739;WO2001/29246;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);美国专利申请No US2003/0157108A1,Presta,L;及WO2004/056312A1,Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞（见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004);Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006);及WO2003/085107）。
进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO2003/011878（Jean-Mairet等）；美国专利No.6,602,684（Umana等）；及US2005/0123546（Umana等）。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO1997/30087（Patel等）；WO1998/58964(Raju,S.)；及WO1999/22764(Raju,S.)。
在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰（例如替代）的人Fc区序列（例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区）。
在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能（诸如补体和ADCC）是不必要的或有害的。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的（美国专利No.6,737,056）。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体（美国专利No.7,332,581）。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体（见例如美国专利No.6,737,056;WO2004/056312，及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)）。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区的位置298、333、和/或334（残基的EU编号方式）的替代的Fc区。
在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的（即，改善的或降低的）C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551、WO99/51642、及Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有替代，例如，Fc区残基434的替代的（美国专利No.7,371,826）。
还可见Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988);美国专利No.5,648,260;美国专利No.5,624,821;及WO94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。
在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205（Kabat编号方式）；重链的A118（EU编号方式）；和重链Fc区的S400（EU编号方式）。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三
Figure BDA00003108252600481
烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸（均聚物或随机共聚物）、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇（例如甘油）、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
在一个实施方案中，药物是包含与一种或多种细胞毒剂，诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素（例如，蛋白质毒素、细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素、或其片段）、或放射性同位素缀合的抗体（诸如c-met抗体）的免疫缀合物。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木素生物碱（见美国专利No.5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0425235B1）；auristatin诸如单甲基auristatin药物模块DE和DF（MMAE和MMAF）（见美国专利No.5,635,483和5,780,588及7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物（见美国专利No.5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001和5,877,296;Hinman等,Cancer Res.53:3336-3342(1993);及Lode等,Cancer Res.58:2925-2928(1998)）；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)（见Kratz等,CurrentMed.Chem.13:477-523(2006);Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362(2006);Torgov等,Bioconj.Chem.16:717-721(2005);Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834(2000);Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002);King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002);及美国专利No.6,630,579）；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)诸如多西他赛(docetaxel)、帕利他塞、larotaxel、tesetaxel、和ortataxel；单端孢霉素(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所描述的抗体，所述酶活性毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文中所描述的抗体。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在使用放射性缀合物进行检测时，它可以包含供闪烁法研究用的放射性原子，例如tc99m或I123，或供核磁共振(NMR)成像（又称为磁共振成像，mri）用的自旋标记物，诸如再一次的碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来生成抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异硫氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Res52:127-131(1992);美国专利No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖，但不限于用交联试剂制备的此类缀合物，所述交联试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、和sulfo-SMPB，及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们是商品化的（例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A）。
III.诊断方法
一方面，本发明提供了用于鉴定有可能响应c-met拮抗剂治疗的癌症患者的方法，包括测定该患者的癌症是否具有大量的c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达指示该患者有可能响应c-met拮抗剂治疗。
另一方面，本发明提供了用于确定癌症患者预后的方法，包括测定该患者的癌症是否具有大量的c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达指示当该患者用c-met拮抗剂治疗时该患者有可能具有延长的总体存活(OS)和/或无进展存活(PFS)。
另一方面，本发明提供了用于测定c-met生物标志物表达的方法，包括测定患者的癌症是否具有大量的c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达为蛋白质表达且使用IHC在来自该患者的样品中测定，其中高c-met生物标志物表达为50%或更多的肿瘤细胞具有中等c-met染色强度、组合的中等/高c-met染色强度或高c-met染色强度，其中使用c-met抗体检测c-met表达，其中c-met生物标志物表达指示当该患者用c-met拮抗剂治疗时该患者有可能具有延长的OS和/或PFS。
一方面，本文中的发明涉及用于为癌症（例如NSCLC）患者选择疗法的方法，包括测定来自该患者的样品中c-met生物标志物的表达，并基于该生物标志物的表达水平选择癌症药物。在一个实施方案中，高水平的生物标志物会导致选择c-met拮抗剂，诸如c-met抗体用于治疗患者。在另一个实施方案中，在生物标志物低（即低或基本上检测不到的水平）存在的情况中，会为患者选择除c-met拮抗剂以外的癌症药物治疗。在一些实施方案中，样品为患者癌症（例如NSCLC）的样品。
一方面，本发明提供了优化治疗功效的方法，包括测定患者癌症样品中的c-met生物标志物表达。在一些实施方案中，检测出高c-met生物标志物表示在用c-met拮抗剂治疗患者时延长的PFS和/或OS。在一些实施方案中，检测出低c-met生物标志物表示在用c-met拮抗剂治疗患者时缩短的PFS和/或OS。在一些实施方案中，癌症为NSCLC。
一方面，本发明提供了确定患者预后的方法，包括测定患者癌症样品中c-met生物标志物的水平。在一些实施方案中，高c-met生物标志物表示与其癌症具有低c-met生物标志物的患者相比PFS和/或OS缩短的可能性。在一些实施方案中，高c-met生物标志物表达表示当患者用c-met拮抗剂治疗时延长的PFS和/或OS。在一些实施方案中，低c-met生物标志物表达表示当患者用c-met拮抗剂治疗时缩短的PFS和/或OS。在一些实施方案中，癌症为NSCLC，且高c-met生物标志物表达表示当患者用c-met拮抗剂与EGFR拮抗剂组合治疗时延长的PFS和/或OS。在一些实施方案中，癌症为NSCLC，且低c-met生物标志物表达表示当患者用c-met拮抗剂与EGFR拮抗剂组合治疗时缩短的PFS和/或OS。
一方面，c-met生物标志物的量使用一种方法来测定，该方法包括：(a)用抗c-met抗体对样品（诸如患者癌症样品）实施IHC分析；并b)测定样品中c-met生物标志物的表达。在一些实施方案中，相对于参照值来确定c-met IHC染色强度。在一些实施方案中，使用本文中（例如下文III.7节中表A中）公开的c-met染色强度评分方案来测定c-met生物标志物表达。在一些实施方案中，该方法进一步包括基于IHC得分对患者分层。
一方面，c-met生物标志物表达的量使用一种方法来测定，该方法包括测定样品（诸如患者的癌症样品）中c-met生物标志物的表达的步骤，其中使用抗c-met抗体对患者的样品进行IHC分析。在一些实施方案中，相对于参照值来确定c-met IHC染色强度。在一些实施方案中，使用本文中（例如下文III.7节中表A中）公开的c-met染色强度评分方案来测定c-met生物标志物表达。
在一些实施方案中，IHC分析进一步包括形态学染色，或是在之前或是在之后。在一个实施方案中，使用苏木精来对载玻片的细胞核染色。苏木精广泛可得。合适苏木精的一个例子是苏木精II(Ventana)。当期望浅蓝色核时，可以在苏木精染色之后使用发蓝试剂。
本文中公开了使用IHC来检测c-met生物标志物，而且本文中（例如下文III.7节中表A中）公开了c-met染色强度评分方案。如本文中记录的，可以检测其它生物标志物。本文中公开了例示性其它生物标志物。在本文中公开的任何发明的一些实施方案中，高c-met生物标志物表达为met诊断阳性临床状态，如依照本文中表A定义的。在本文中公开的任何发明的一些实施方案中，低c-met生物标志物表达为met诊断阴性临床状态，如依照本文中表A定义的。
一方面，c-met生物标志物的量使用一种方法来测定，该方法包括：(a)用抗c-met抗体对样品（诸如患者癌症样品）实施基因表达序型分析、PCR（诸如rtPCR）、RNN-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、或FISH；并b)测定样品中c-met生物标志物的表达。如上所述，可以检测其它生物标志物。本文中公开了例示性其它生物标志物。
对来自患者的样品测试一种或多种本文中的生物标志物的表达。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液（羊水）、腹膜液（腹水）、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、肿瘤细胞、血清或血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。在一个实施方案中，患者样品是福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)肿瘤样品（例如NSCLC肿瘤样品或乳腺癌肿瘤样品）。可以在用癌症药物（诸如抗c-met拮抗剂）治疗患者之前获得样品。可以自原发性肿瘤或自转移性肿瘤获得样品。可以在首次诊断癌症时或例如在肿瘤转移之后获得样品。在一些实施方案中，肿瘤样品为肺、淋巴结、肝或脑。
用于测定基因扩增、蛋白质、或mRNA表达的各种方法包括但不限于基因表达序型分析、聚合酶链式反应(PCR)（包括定量实时PCR(qRT-PCR)）、RNA-Seq、FISH、微阵列分析、基因表达连续分析(SAGE)、MassARRAY、蛋白质组学、免疫组织化学(IHC)、等。在一些实施方案中，对蛋白质表达定量。此类蛋白质分析可以使用IHC来实施，例如对患者肿瘤样品实施。
现在会更加详细地描述用于测定生物标志物表达的各种例示性方法。
1.基因表达序型分析
一般而言，基因表达序型分析的方法可分成两大组：基于多核苷酸杂交分析的方法，和基于多核苷酸测序的方法。本领域中已知用于样品中mRNA表达定量的最常使用的方法包括Northern印迹和原位杂交(Parker&Barnes,Methods in Molecular Biology106:247-283(1999))；RNA酶保护测定法(Hod,Biotechniques13:852-854(1992))；及聚合酶链反应(PCR)(Weis等,Trends inGenetics8:263-264(1992))。或者，可采用能识别特定双链体（包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体）的抗体。基于测序的基因表达分析的代表性方法包括基因表达连续分析(SAGE)和通过大规模平行签名测序(MPSS)的基因表达分析。
2.聚合酶链式反应(PCR)
在上文所列的技术中，一种灵敏且灵活的定量方法是PCR，其可用于比较不同样品群中的，正常和肿瘤组织中的，有或无药物处理下的mRNA水平，表征基因表达样式，区分密切相关的mRNA，及分析RNA结构。
第一步是从靶样品分离mRNA。起始材料典型的是分别从人肿瘤或肿瘤细胞系及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。如此，可从多种原发性肿瘤中分离RNA，包括乳房、肺、结肠、前列腺、脑、肝、肾、胰、脾、胸腺、睾丸、卵巢、子宫等肿瘤或肿瘤细胞系，及来自健康供体的合并DNA。如果mRNA的来源是原发性肿瘤，那么mRNA可从例如冷冻的或归档的石蜡包埋且固定（例如福尔马林固定）的组织样品提取。用于提取mRNA的通用方法是本领域众所周知的，公开于分子生物学的标准教科书中，包括Ausubel等人，《Current Protocols of Molecular Biology》，John Wiley and Sons，1997。用于从石蜡包埋组织提取RNA的方法公开于例如Rupp and Locker,Lab Invest.56:A67(1987);De Andrés et al.,BioTechniques18:42044(1995)。具体而言，RNA分离可使用来自商业制造商诸如Qiagen的纯化试剂盒、缓冲液组和蛋白酶依照制造商的说明书进行。例如，来自培养细胞的总RNA可使用QiagenRNeasy微型柱分离。其它商品化RNA分离试剂盒包括
Figure BDA00003108252600541
完整DNA和RNA纯化试剂盒(
Figure BDA00003108252600542
Madison,Wis.)和石蜡块RNA分离试剂盒(Ambion,Inc.)。来自组织样品的总RNA可使用RNA Stat-60(Tel-Test)分离。从肿瘤制备的RNA可通过例如氯化铯密度梯度离心来分离。
由于RNA不能充当PCR的模板，通过PCR进行基因表达序型分析的第一步是将RNA模板逆转录成cDNA，接着是它在PCR反应中的指数式扩增。最常用的两种逆转录酶是禽类成髓细胞白血病病毒逆转录酶(AMV-RT)和莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)。逆转录步骤典型的使用特异性引物、随机六聚物或oligo-dT引物引发，取决于表达序型分析的境况和目标。例如，提取的RNA可使用GENEAMPTMRNA PCR试剂盒(Perkin Elmer,Calif.,USA)遵循制造商的说明书逆转录。然后可将衍生的cDNA作为模板用于后续PCR反应。尽管PCR步骤可使用多种热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶，典型的采用Taq DNA聚合酶，它具有5'-3'核酸酶活性但缺乏3'-5'校正内切核酸酶活性。如此，
Figure BDA00003108252600551
PCR典型的利用Taq或Tth聚合酶的5'-核酸酶活性来水解与其靶扩增子结合的杂交探针，但是可使用具有等效5'核酸酶活性的任何酶。使用两种寡核苷酸引物来生成扩增子，典型的是PCR反应的。第三种寡核苷酸或探针设计用于检测位于前两种PCR引物之间的核苷酸序列。探针是Taq DNA聚合酶不可延伸的且用报道荧光染料和淬灭荧光染料标记。在两种染料正如它们在探针上的那样位置靠近时，任何激光诱发的来自报道染料的发射受到淬灭染料的淬灭。在扩增反应期间，Taq DNA聚合酶以模板依赖性方式切割探针。所得探针片段在溶液中解离，来自所释放报道染料的信号不再受到第二荧光团的淬灭效应的作用。每合成一个新的分子就释放一个分子的报道染料，未淬灭报道染料的检测提供了数据定量阐述的基础。
Figure BDA00003108252600552
PCR可使用商品化设备进行，诸如例如ABI PRISM序列检测系统
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(Perkin-Elmer-Applied Biosystems,Foster City,Calif.,USA)或Lightcycler(Roche Molecular Biochemicals,Mannheim,Germany)。在一个优选的实施方案中，在实时定量PCR装置上运行5'核酸酶规程，诸如ABI PRISM序列检测系统。该系统由热循环仪、激光（器）、电荷耦合装置(CCD)、照相机和计算机组成。该系统在热循环仪上以96孔形式扩增样品。在扩增过程中，通过光纤电缆实时收集所有96个孔的激光诱发的荧光信号，并在CCD处检测。该系统包括用于运行设备和分析数据的软件。
5'-核酸酶测定法数据最初表述为Ct，或循环阈值(threshold cycle)。正如上文所讨论的，在每个循环期间记录荧光值并代表至扩增反应中该点时扩增的产物的量。首次记录到有统计学意义的荧光信号的点即循环阈值(Ct)。
为了将错误和样品间变异的影响降至最低，通常使用内部标准物进行PCR。理想的内部标准物在不同组织间以恒定水平表达，不受实验处理的影响。最频繁的用于基因表达样式标准化的RNA是持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和P-肌动蛋白的mRNA。
PCR技术的一种最新变异是定量实时PCR(qRT-PCT)，它通过双重标记的荧光生成探针（即
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探针）测量PCR产物积累。实时PCR与定量竞争性PCR（其中使用每种靶序列的内部竞争物来进行标准化）和定量比较性PCR（使用样品内包含的标准化基因或持家基因供RT-PCR之用）都兼容。更多详情参阅例如Held et al.,Genome Research6:986-994(1996)。
多份发表的期刊论文给出了使用固定的、石蜡包埋的组织作为RNA来源用于基因表达序型分析的代表性方案的步骤，包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增（例如Godfrey et al.,J.Molec.Diagnostics2:84-91(2000);Spechtet al.,Am.J.Pathol.158:419-29(2001)）。简言之，一种代表性方法由切出石蜡包埋的肿瘤组织样品的约10微米厚切片开始。然后，提取mRNA，并除去蛋白质和DNA。分析RNA浓度后，在必要时可包括RNA修复和/或扩增步骤，并使用基因特异启动子逆转录RNA，随后是PCR。
依照本发明的一个方面，PCR引物和探针是基于待扩增基因中存在的内含子序列设计的。在这个实施方案中，引物/探针设计的第一步是描绘基因内的内含子序列。这可通过公众可得到的软件来进行，诸如由Kent,W.,GenomeRes.12(4):656-64(2002)开发的DNA BLAT软件或BLAST软件，包括其变异。后续步骤遵循完全建立的PCR引物和探针设计方法。
为了避免非特异性信号，重要的是在设计引物和探针时掩盖(mask)内含子内的重复序列。这可容易的通过使用Repeat Masker程序来实现，该程序可通过贝勒医学院(Baylor College of Medicine)在线获得，它针对重复元件文库筛选DNA序列并返回其中掩盖了重复元件的查询序列。然后可使用任何商品化或通过其它途径公众可获得的引物/探针设计包将掩盖后的内含子序列用于设计引物和探针序列，诸如Primer Express(Applied Biosystems)；MGBassay-by-design(Applied Biosystems)；Primer3(Rozen and Skaletsky(2000)Primer3在万维网上供一般用户和生物学家编程员使用。在Krawetz S,MisenerS编的《Bioinformatics Methods and Protocols:Methods in Molecular Biology》中，Humana Press，Totowa，N.J.，第365-386页)。
PCR引物设计中考虑的因素包括引物长度、解链温度(meltingtemperature,Tm)、G/C含量、特异性、互补引物序列、和3'-末端序列。一般而言，最佳的PCR引物通常长17-30个碱基，包含约20-80%诸如例如约50-60%G+C碱基。典型的优选Tm在50和80℃之间，例如约50-70℃。
关于PCR引物和探针设计的进一步指导参见例如Dieffenbach et al.，“General Concepts for PCR Primer Design”（PCR引物设计的一般概念），在《PCR Primer,A Laboratory Manual》中，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1995，第133-155页；Innis and Gelfand，“Optimization of PCRs”（PCR的优化），在《PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications》中，CRC Press，London，1994，第5-11页；及Plasterer,T.N.,Primerselect:Primerand probe design.Methods Mol.Biol.70:520-527(1997)，将其完整公开内容明确收入本文作为参考。
3.RNN-Seq
RNA-Seq（也称作全转录组鸟枪测序(WTSS)）指使用高通量测序技术来对cDNA测序以获得关于样品的RNA内容物的信息。描述RNA-Seq的出版物包括：Wang et al.“RNA-Seq:a revolutionary tool for transcriptomics”NatureReviews Genetics10(1):57-63(January2009)；Ryan et al.BioTechniques45(1):81-94(2008)；及Maher et al."Transcriptome sequencing to detect gene fusions incancer".Nature458(7234):97-101(January2009)。
4.微阵列
差异基因表达也可使用微阵列技术来鉴定或验证。如此，可使用微阵列技术在新鲜的或石蜡包埋的肿瘤组织中测量乳腺癌相关基因的表达序型。在这种方法中，在微芯片基片上涂布(plate)或排列(array)感兴趣多核苷酸序列（包括cDNA和寡核苷酸）。然后使排列的序列与来自感兴趣细胞或组织的特异性DNA探针杂交。正如在PCR方法中一样，mRNA的来源典型的是从人肿瘤或肿瘤细胞系及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。如此，RNA可以从多种原发性肿瘤或肿瘤细胞系分离。如果mRNA的来源是原发性肿瘤，那么mRNA可从例如冷冻的或归档的石蜡包埋且固定（例如福尔马林固定）的组织样品提取，所述组织样品是日常临床实践中常规制备和保存的。
在微阵列技术的一个具体实施方案中，将PCR扩增的cDNA克隆的插入物以密集阵列应用至基片。优选的是，将至少10,000种核苷酸序列应用至基片。以每种10,000个成分固定在微芯片上的微阵列基因适于在严格条件下杂交。荧光标记的cDNA探针可通过从感兴趣组织提取的RNA的逆转录中掺入荧光核苷酸来生成。应用至芯片的经标记cDNA探针与阵列上的每个DNA斑点以特异性发生杂交。严格清洗以除去非特异性结合的探针后，通过共聚焦激光显微镜检术或通过其它检测方法诸如CCD照相机扫描芯片。每种阵列成分的杂交的定量容许评估相应mRNA的丰度。凭借双重有色荧光，将从两种RNA来源生成的分开标记的cDNA探针与阵列成对杂交。如此同时测定来自对应于每种指定基因的两种来源的转录物的相对丰度。小型化规模的杂交提供了大量基因表达样式的便利且快速评估。此类方法已经显示出检测以每个细胞少数拷贝表达的罕见转录物所要求的灵敏度及可再现的检测表达水平的至少约2倍差异(Schena et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(2):106-149(1996))。微阵列分析可使用商品化设备遵循制造商的方案进行，诸如使用Affymetrix 技术、或Incyte的微阵列技术。
为大规模分析基因表达而开发的微阵列方法使得有可能系统搜索多种肿瘤类型中的癌症分类和后果预测的分子标志物。
5.基因表达连续分析(SAGE)
基因表达连续分析(SAGE)是容许同时且定量分析大量基因转录物且不需要为每种转录物提供个别杂交探针的一种方法。首先，生成包含足以唯一鉴定一种转录物的信息的一种短序列标签（约10-14bp），倘若该标签是从每种转录物内的一个唯一位置得到的。然后，将许多转录物连接起来以形成长、连续分子，它们可测序，以同时揭示多种标签的身份(identity)。任何转录物群的表达样式可通过测定个别标签的丰度并鉴定与每种标签对应的基因来定量评估。更多详情参见例如Velculescu et al.,Science270:484-487(1995);Velculescu et al.,Cell88:243-51(1997)。
6.MassARRAY技术
MassARRAY(Sequenom,San Diego,Calif.)技术是一种使用质谱术(MS)进行检测的自动化、高通量基因表达分析方法。依照此方法，在分离RNA、逆转录并PCR扩增之后，对cDNA进行引物延伸。纯化cDNA衍生的引物延伸产物，并分配到芯片阵列上，该芯片阵列预先加载有MALDI-TOF MS样品制备所需要的成分。通过分析所获得的质谱中的峰面积对反应中存在的各种cDNA定量。
7.免疫组化
免疫组化(“IHC”)方法也适用于检测本发明的生物标志物的表达水平。组织切片的免疫组化染色已经证明是一种评估或检测样品中蛋白质存在的可靠方法。免疫组化技术利用抗体来探查和显现原位细胞抗原，通常通过显色或者荧光方法。如此，使用对每种标志物特异性的抗体或抗血清，优选多克隆抗血清，最优选单克隆抗体来检测表达。如下文极为详细讨论的，抗体可通过直接标记抗体自身来检测，例如用放射性标记物、荧光标记物、半抗原标记物诸如生物素、或酶诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。或者，未标记一抗与经标记二抗联合使用，包括对一抗特异性的抗血清、多克隆抗血清或单克隆抗体。免疫组化方案和试剂盒是本领域众所周知的，而且可通过商业途径获得。
现有两种常用的IHC方法：直接和间接测定法。根据第一种测定法，直接测定抗体与靶抗原的结合。这种直接测定法使用经过标记的试剂，诸如荧光标签或酶标记的第一抗体(primary antibody)，其不需要进一步的抗体相互作用就能显现。在一种典型的间接测定法中，未偶联的第一抗体结合至抗原，然后经过标记的第二抗体(secondary antibody)结合至第一抗体。若第二抗体偶联有酶标记物，则添加显色底物或荧光底物以提供抗原的显现。因为数个第二抗体可以与第一抗体上的不同表位反应，所以发生信号放大。
用于免疫组化的第一和/或第二抗体通常用可检测模块进行标记。可利用许多标记物，一般可分成以下几类：
(a)放射性同位素，诸如35S、14C、125I、3H和131I。例如，可使用CurrentProtocols in Immunology,卷1和2,Coligen等编,Wiley-Interscience,New York,N.Y.,Pubs.1991中描述的技术用放射性同位素标记抗体，并可使用闪烁计数来测量放射性。
(b)胶体金颗粒。
(c)荧光标记物，包括但不限于稀士螯合物（铕螯合物）、德克萨斯红、若丹明、荧光素、丹酰、丽丝胺、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白、或商品化荧光团诸如SPECTRUM
Figure BDA00003108252600591
和SPECTRUM
Figure BDA00003108252600592
和/或上述一种或多种的衍生物。例如，可使用Current Protocols in Immunology,见上文中披露的技术使荧光标记物与抗体偶联。可使用荧光计对荧光进行定量。
(d)可利用各种酶-底物标记物且美国专利No.4,275,149中提供了有关它们中的一些的综述。酶一般催化可使用多种技术测量的显色底物的化学改变。例如，酶可以催化可通过分光光度法测量的底物的颜色改变。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。上文描述了用于对荧光改变进行定量的技术。化学发光底物通过化学反应变成电子激发态，然后可发射可测量（例如使用化学发光计）或给荧光受体提供能量的光。酶标记物的例子包括萤光素酶（例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456）、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮类、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶（例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、杂环氧化酶（诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶）、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于使酶与抗体偶联的技术描述于O'Sullivan等,Methods for the Preparation ofEnzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay,Methods inEnzym.,J.Langone和H.Van Vunakis编,Academic Press,New York,73:147-166(1981)。
酶-底物组合的例子包括例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRPO)，其以过氧化氢为底物，其中过氧化氢氧化染料前体（例如邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)）。3,3-Diaminobenzidine(DAB)may also be used to visualize the HRP-labeledantibody；
(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯基磷酸酯；和
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与显色底物（例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷)或荧光底物（例如4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷）。
本领域技术人员可利用许多其它酶-底物组合。有关它们的一般性综述参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。
有时，将标记物与抗体间接偶联。熟练技术人员了解实现这一目的的多种技术。例如，可将抗体与生物素偶联，而且可以将上述四大类标记物中的任一种与亲合素偶联，或反之亦然。生物素选择性结合亲合素，由此标记物可与抗体以这种间接方式偶联。或者，为了实现标记物与抗体的间接偶联，将抗体与小型半抗原偶联，并将上述不同类型的标记物之一与抗半抗原抗体偶联。由此，可实现标记物与抗体的间接偶联。
在上文讨论的样品制备规程外，可能还需要在IHC之前、期间或之后对组织切片进行进一步的处理。例如，可以实施表位修复法，诸如在柠檬酸盐缓冲液中对组织样品进行加热(参见例如Leong等Appl.Immunohistochem.4(3):201(1996))。
在任选的封闭步骤后，将组织切片在合适条件下暴露于第一抗体足够时间，使得第一抗体结合至组织样品中的靶蛋白抗原。实现这一目的的适宜条件可以通过常规实验来确定。
抗体与样品的结合程度通过使用上文讨论的任一种可检测标记物来测定。优选地，标记物是酶标记物（例如HRPO），其催化显色底物诸如3,3'-二氨基联苯胺色原体的化学变化。优选的是，将酶标记物偶联至特异性结合第一抗体的抗体（例如第一抗体是家兔多克隆抗体，第二抗体是山羊抗家兔抗体）。
可以将如此制备的标本放置好并盖上盖玻片。然后进行载玻片评估，例如利用显微镜。
IHC可以与形态学染色组合，或是在之前或是在之后。脱石蜡后，可以用形态学染料对封固在载玻片上的切片染色以进行评估。使用的形态学染料提供组织切片的精确形态学评估。可以用一种或多种染料对切片染色，每种染料独特染色不同细胞成分。在一个实施方案中，使用苏木精来对载玻片上的细胞核染色。苏木精广泛可得。合适苏木精的一个例子是苏木精II(Ventana)。当期望浅蓝色核时，可以在苏木精染色之后使用发蓝试剂。本领域技术人员会领会，通过延长或缩短载玻片保持在染料中的时间长度可以对给定组织优化染色。
用载玻片制备和IHC加工的自动化系统是商品化的。
Figure BDA00003108252600611
BenchMark XT系统是此类自动化系统的一个例子。
染色后，可以通过显微术的标准技术来分析组织切片。通常，病理学家或类似人员对组织评估异常或正常细胞或特定细胞类型的存在并提供感兴趣细胞类型的位置。如此，例如，病理学家或类似人员会检查载玻片并鉴定正常细胞（诸如正常肺细胞）和异常细胞（诸如异常或赘生肺细胞）。可以使用定义感兴趣细胞位置的任何手段（例如X-Y轴上的坐标）。
适合用于IHC的抗c-met抗体是本领域公知的，而且包括SP-44(Ventana)、DL-21(Upstate)、ab27492(Abcam)、PA1-37483(Pierce Antibodies)。本领域技术人员理解，例如使用本文中公开的IHC方案，通过与c-met抗体比较，可以鉴定和表征别的合适的抗c-met抗体。
可以利用具有各种染色强度的对照细胞团粒作为IHC分析的对照以及评分对照。例如，H441（强c-met染色强度）；A549（中等c-met染色强度）；H1703（弱c-met染色强度），HEK-293(293)（弱c-met染色强度）；和TOV-112D（阴性c-met染色强度）或H1155（阴性c-met染色强度）。在一些实施方案中，例示性c-met IHC评分强度可以参考本文中图1和/或2。在一些实施方案中，图1描绘例示性0、1+、2+和3+c-met IHC评分强度，例如依照下文表A的评分方案。在一些实施方案中，图2描绘例示性c-met IHC得分0、1、2、和3，例如依照下文表A的评分方案。
本文中例示了c-met免疫组织化学方案和评分方案。可以依照表A来评估C-met染色强度标准：
表A
Figure BDA00003108252600621
在一些实施方案中，如下定义临床“Met诊断阳性”和“Met诊断阴性”分类：
Met诊断阳性：IHC得分2或3（如表A中定义的），和
Met诊断阴性：IHC得分0或1（如表A中定义的）。
在一些实施方案中，有关的高c-met生物标志物为IHC得分2、IHC得分3、或IHC得分2或3。在一些实施方案中，高c-met生物标志物为50%或更多的肿瘤细胞具有中等c-met染色强度、组合的中等/高c-met染色强度或高c-met染色强度。在一些实施方案中，高c-met生物标志物为50%或更多的肿瘤细胞具有中等或高c-met染色强度。在一些实施方案中，在样品中分析至少50个肿瘤细胞。在一些实施方案中，在样品中分析至少10、20、30、40、50、60、或70或更多个肿瘤细胞。在一些实施方案中，高c-met生物标志物表达为met诊断阳性（met诊断阳性临床状态），如依照本文中表A定义的。
在一些实施方案中，低c-met生物标志物为IHC得分0、IHC得分1或IHC得分0或1。在一些实施方案中，低c-met生物标志物为阴性c-met染色、少于50%的肿瘤细胞具有弱或组合的弱和中等c-met染色强度、或50%或更多的肿瘤细胞具有弱或组合的弱和中等c-met染色强度但少于50%的肿瘤细胞具有中等或组合的中等和强c-met染色强度。在一些实施方案中，在样品中分析至少10、20、30、40、50、60、或70或更多个肿瘤细胞。在一些实施方案中，低c-met生物标志物表达为met诊断阴性（met诊断阴性临床状态），如依照本文中表A定义的。
8.蛋白质组学
术语“蛋白质组”定义为某一时间点样品（例如组织、生物体或细胞培养物）中存在的蛋白质的全体。蛋白质组学包括研究样品中蛋白质表达的全局变化（也称为“表达蛋白质组学”）等。蛋白质组学典型的包括下列步骤：(1)通过二维凝胶电泳(2-D PAGE)将样品中的各种蛋白质分开；(2)鉴定从凝胶中回收的各种蛋白质，例如通过质谱术或N-末端测序；及(3)使用生物信息学分析数据。蛋白质组学方法是其它基因表达序型分析方法的有用补充，可以单独使用或联合其它方法，用于检测本发明的诊断标志物的产物。
9.基因扩增
使用本领域技术人员知道的某些技术来实现对c-met基因扩增的检测。例如，可以使用比较性基因组杂交来生成DNA序列拷贝数作为染色体位置的函数的图。参见例如Kallioniemi et al.(1992)Science258:818-821。也可以例如通过Southern杂交（使用对c-met基因特异性的探针）或通过实时定量PCR来检测c-met基因的扩增。
在某些实施方案中，检测c-met基因的扩增通过直接评估c-met基因的拷贝数来实现，例如通过使用与c-met基因杂交的探针来进行。例如，可实施FISH测定法。在某些实施方案中，检测c-met基因的扩增通过间接评估c-met基因的拷贝数来实现，例如通过评估位于c-met基因以外但与c-met基因共扩增的染色体区的拷贝数来进行。还可使用体内诊断测定法来评估生物标志物表达，例如通过施用结合待检测分子且标记有可检测标记物（例如放射性同位素）的分子（诸如抗体），然后对患者进行外部扫描以定位所述标记物。
IV.治疗方法
一方面，本发明提供了用于治疗癌症患者的方法，包括在发现该患者具有大（升高）量的c-met生物标志物的情况中对该患者施用治疗有效量的c-met拮抗剂。
本发明还涉及用于治疗NSCLC患者的方法，包括在发现该患者具有大量的c-met生物标志物的情况中（例如在该患者的癌症表达高c-met生物标志物的情况中，如使用IHC测定的）对该患者施用治疗有效量的c-met拮抗剂（例如抗c-met抗体，例如MetMAb）。在一些实施方案中，NSCLC为鳞状细胞癌。在一些实施方案中，NSCLC为腺癌。在一些实施方案中，NSCLC为二线或三线局部晚期或转移性NSCLC。在一些实施方案中，NSCLC为至少一种在先化疗方案失败后的局部晚期或转移性NSCLC。本文中讨论和例示了使用IHC测定c-met表达的方法。在一些实施方案中，患者的癌症显示出表达高c-met，IHC得分为2、IHC得分为3、或IHC得分为至少2（2或3）。在一些实施方案中，患者的癌症（来自患者癌症的样品）显示出含有50%或更多的肿瘤细胞具有中等c-met染色强度、组合的中等/高c-met染色强度或高c-met染色强度。在一些实施方案中，高c-met生物标志物为50%或更多的肿瘤细胞具有中等或高c-met染色强度。在一些实施方案中，使用本文中公开的标准将c-met生物标志物状态打分为高或低。
此外，本发明提供了用于治疗NSCLC患者的方法，包括在发现该患者具有大量的c-met生物标志物的情况中对该患者施用治疗有效量的c-met拮抗剂（诸如抗c-met抗体，诸如MetMAb）和EGRF拮抗剂（诸如厄洛替尼）的组合。相对于具有降低量的c-met生物标志物的患者，本文中治疗的患者期望会受益于（或更有可能展现出）更大的无进展存活(PFS)和总体存活(OS)。本文中描述了例示性EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，NSCLC为至少一种在先化疗方案失败后的局部晚期或转移性NSCLC。
本发明另外涉及用于治疗具有癌症（诸如NSCLC）的患者的方法，包括在发现患者具有降低量的c-met拮抗剂的情况中（例如在患者的癌症表达降低的c-met生物标志物的情况中，例如通过IHC测定的）对该患者施用治疗有效量的除c-met拮抗剂以外的癌症药物。在一些实施方案中，患者的癌症没有可检测地表达c-met或以IHC得分0、IHC得分1、或IHC得分0或1表达c-met。在一些实施方案中，使用本文中公开的标准将c-met生物标志物状态评分为阴性。在一些实施方案中，患者的癌症（来自患者癌症的样品）显示出含有阴性c-met染色、少于50%的肿瘤细胞具有弱或组合的弱和中等c-met染色强度、或50%或更多的肿瘤细胞具有弱或组合的弱和中等c-met染色强度但少于50%的肿瘤细胞具有中等或组合的中等和强c-met染色强度。
本发明的癌症药物可以单独使用或与其它癌症药物组合使用。例如，可以以每三周一剂约15mg/kg或以每两周一剂约10mg/kg施用抗c-met抗体（例如MetMAb）。
例如，c-met抗体可以与至少一种别的治疗剂，例如与化疗剂、与其它c-met拮抗剂（诸如其它c-met抗体）、与EGFR拮抗剂（诸如厄洛替尼）、或与抗VEGF抗体（诸如贝伐单抗）共施用。c-met抗体可以与别的c-met拮抗剂共施用。上文所述此类组合疗法涵盖组合施用（其中同一配制剂或分开的配制剂中包括两种或更多种治疗剂）和分开施用，在该情况中，第一药物的施用可以在第二药物的施用之前、同时、和/或之后。在一个实施方案中，每三周一剂约15mg/kg抗c-met抗体（诸如MetMAb）与三周周期每天一剂150mg厄洛替尼（N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉酰胺）组合使用。在其它实施方案中，c-met拮抗剂（例如抗c-met抗体）与抗VEGF抗体和化疗（例如紫杉烷）组合使用。一种例示性方案是对三重阴性乳腺癌患者，28天周期第1天和第15天施用一剂10mg/kg抗c-met抗体（例如MetMAb），28天周期第1天和第15天施用一剂10mg/kg抗VEGF抗体（例如贝伐单抗），及28天周期第1天、第8天和第15天通过IV输注施用一剂90mg/m2帕利他赛。一种例示性方案是对三重阴性转移性乳腺癌患者，28天周期第1天和第15天施用一剂10mg/kg抗c-met抗体（例如MetMAb），及28天周期第1天、第8天和第15天通过IV输注施用一剂90mg/m2帕利他赛。
癌症药物也可以与放射疗法组合使用。
可以通过任何合适的手段，包括胃肠外、肺内、和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本文中的药物。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用、推注施用、和脉冲输注。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体（当单独使用或与一种或多种其它别的治疗剂组合使用时）的合适剂量会取决于要治疗的疾病的类型、抗体的种类、疾病的严重性和病程、是出于预防还是治疗目的施用抗体、之前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答、以及主治医师的斟酌决定。抗体适合于在一次或一系列的治疗中施用于患者。取决予上文提及的因素，一种典型日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复施用，取决于病情，治疗通常会持续直至出现疾病症状得到期望的抑制为止。然而，可使用其它剂量方案。通过常规技术和测定方法易于监测该治疗的进展。
要理解，可以替换抗体或在抗体外使用本发明的免疫偶联物作为药物来实施任何上述配制剂或治疗方法。
在一些实施方案中，患者没有接受超过两种在先IIIB/IV期治疗。在一些实施方案中，患者没有接受超过30天暴露于能通过EGFR抑制起作用的研究药或上市药、或导致剂量改变的已知EGFR相关毒性。EGFR抑制剂包括（但不限于）吉非替尼、厄洛替尼、和西妥昔单抗。在一些实施方案中，患者在随机化之前28天内没有接受化疗、生物疗法、放疗或研究药物（例外是任选，可以在随机化之前两周内使用激酶抑制剂，前提是任何药物相关毒性得到恰当解决）。在一些实施方案中，患者不是具有未治疗的和/或活动性的（正在进展中或需要抗惊厥药或皮质类固醇来控制症状）CNS转移的患者。实施例中描述了其它患者排除标准，而且本发明涵盖使用其中描述的一项或多项排除。在一些实施方案中，患者癌症的样品显示出具有野生型EGFR。在一些实施方案中，患者癌症的样品没有显示出具有突变型EGFR。
V.制品
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于治疗癌症（诸如NSCLC或乳腺癌）的制品。所述制品包括容器和容器上或伴随容器的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶(bottles)、管形瓶(vials)、注射器(syringes)、等。所述容器可以用多种材料诸如玻璃或塑料制成。所述容器容纳或装有包含癌症药物作为活性剂的组合物，并可以具有无菌出入口（例如该容器可以是具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶）。
所述制品可以进一步包括第二容器，该容器装有药学可接受的稀释缓冲剂，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液、和右旋糖溶液。制品还可包括从商业和使用者观点看有需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、和注射器。
本发明的制品还包括信息，例如以包装插页的形式，指示所述组合物用于基于本文中生物标志物的表达水平，治疗癌症。所述插页或标签可采取任何形式，诸如纸或在电子介质上，诸如磁记录介质（例如软盘）或CD-ROM。所述标签或插页还可包括关于所述试剂盒或制品中药物组合物和剂量形式的其它信息。
依照本发明的一个实施方案，提供了制品，其包含包装在一起的c-met拮抗剂（例如抗c-met抗体）和包装插页，该c-met拮抗剂在药学可接受载体中，该包装插页指示该c-met拮抗剂用于基于c-met生物标志物的表达来治疗癌症（诸如NSCLC）患者。
本发明还涉及用于制造制品的方法，包括在包装中组合药物组合物和包装插页，该药物组合物包含c-met拮抗剂（例如抗c-met抗体），该包装插页指示该药物组合物用于基于c-met生物标志物的表达治疗癌症（诸如NSCLC）患者。
所述制品可以进一步包括别的容器，该容器装有药学可接受的稀释缓冲剂，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液、和/或右旋糖溶液。制品还可包括从商业和使用者观点看有需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、和注射器。
VI.诊断试剂盒
本发明还涉及可用于检测任何一种或多种本文中鉴定的生物标志物的诊断试剂盒。因而，提供了诊断试剂盒，其包含用于测定来自癌症患者的样品中c-met、k-ras、ALK和EGFR生物标志物中一种或多种的表达的一种或多种试剂。任选地，该试剂盒进一步包含使用该试剂盒来选择癌症药物（例如c-met拮抗剂，诸如抗c-met抗体）以治疗癌症患者的说明书，如果该患者以高水平表达c-met生物标志物的话。在另一个实施方案中，该说明书关于使用该试剂盒来选择除c-met拮抗剂以外（或除抗c-met抗体以外）的癌症药物，如果该患者以降低的水平表达该生物标志物的话。
VII.做广告的方法
本文中的发明还关注一种用于为癌症药物做广告的方法，其包括给目标受众宣传所述癌症药物（例如抗c-met抗体）用于基于c-met生物标志物的表达，治疗癌症患者的用途。
做广告为经由非个人媒体进行的、通常付费的通讯，其中发起人受到鉴别且信息受到控制。为本文目的的做广告包括宣传(publicity)、公共关系(public relations)、产品布置(product placement)、赞助(sponsorship)、保险(underwriting)、和促销(sales promotion)。该术语还包括出现在任何印刷传播媒体中的商业信息公告，其设计用于引起大众的兴趣以劝说、通知、宣传、激发、或以其它方式改变行为，向购买、支持、或认可本文中发明的有利方式发展。
本文中诊断方法的广告和宣传可通过任何手段实现。用于传递这些信息的广告媒体的例子包括电视、电台、电影、杂志、报纸、因特网、和告示板，包括商业性的，即出现在广播媒体中的信息。广告还包括那些在食品货车座位上、机场通道墙壁上、和公共汽车侧面上的广告、或电话等候信息或店内PA系统中听到的广告、或可放置视觉或听觉通讯的任何地方的广告。
宣传或做广告手段的更特定的例子包括电视、电台、电影、因特网（诸如网络传播和网络研讨会(webinar)）、意图到达同步用户的交互式计算机网络、固定的或电子的告示板和其它公共标牌、海报、传统的或电子的文献（诸如杂志和报纸）、其它媒体渠道、讲座或个体接触，例如通过电子邮件、电话、即时信息、邮寄、快递、大众(mass)、或载体邮件(carrier mail)、亲自访问等进行。
所使用的做广告的类型会取决于许多因素，例如待传达的目标受众的性质，例如医院、保险公司、诊所、医生、护士、和患者，以及成本考虑和管理药物和诊断剂做广告的相关管辖权法律和条例。可根据由服务相互作用和/或其它数据（诸如用户人口统计状况和地理学定位）限定的用户表征使做广告个性化或用户化。
实施例
材料和方法
样品：分析来自一项盲目、II期、随机化、多中心试验（下文进一步描述）的治疗前患者样品，该试验设计评估NSCLC中用MetMAb加厄洛替尼或厄洛替尼加安慰剂治疗的初步活性和安全性。要求加入该研究的所有患者提交相应肿瘤的福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤标本或未染色的石蜡载玻片（15片载玻片）。
免疫组织化学(IHC)：将福尔马林固定的、石蜡包埋的组织切片脱石蜡，之后进行抗原修复、封闭和抗c-Met一抗温育。二抗温育和酶促显色后，将切片复染色并在醇和二甲苯系列中脱水，之后盖上盖玻片。
下面的方案用于IHC。使用Ventana Benchmark XT系统来实施c-met IHC染色，其中使用下述试剂和材料：
一抗：Ventana抗总cMET(SP44)兔单克隆一抗(产品目录号M3444.R)
标本类型：福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)样品和不同染色强度的对照细胞团粒
规程物种：人
仪器：BenchMark XT
表位修复条件：细胞条件化1（CC1，Ventana，产品目录号950-124）
一抗条件：10ug/ml/16Min，37度
稀释剂：Ventana抗体稀释缓冲液（Tris HCl缓冲液，产品目录号95119）
作为阴性对照的未实验
Figure BDA00003108252600691
抗体：未实验兔IgG，3ug/ml（Ventana确认阴性对照兔IgG，产品目录号760-1029）
检测：Ultraview通用DAB检测试剂盒（Benchmark Reagent，聚合物系统，Ventana产品目录号760-500），依照制造商的说明书使用。
复染色：Ventana苏木精II（产品目录号790-2208）/带发蓝试剂（产品目录号760-2037）
Benchmark XT方案如下：
1.石蜡（选择）
2.脱石蜡（选择）
3.细胞条件化（选择）
4.调节器#1（选择）
5.温和CC1（选择）
6.标准CC1（选择）
7.抗体温育温度（选择）
8.37度抗体温育（选择）
9.滴定（选择）
10.手动应用（一抗），并温育（0小时16分钟）
11.复染色（选择）
12.应用一滴（苏木精II）（复染色），应用盖玻片，并温育（4分钟）
13.后复染色（选择）
14.应用一滴（发蓝试剂）（后复染色），应用盖玻片，并温育（4分钟）
15.在肥皂水中清洗载玻片以除去油\
16.用水漂洗载玻片
17.经由95%乙醇、100%乙醇至二甲苯使载玻片脱水（Leica自动染色机程序#9）
18.盖上盖玻片。
通过IHC对c-met表达评分：使用IHC评估肿瘤标本中c-met表达的存在或缺失。NSCLC中存在宽动态范围的c-met染色强度，其中有阴性、弱、中等、或强强度的肿瘤细胞染色。另外，NSCLC肿瘤组织内的c-met表达常常是异质的；就是说，肿瘤细胞在样品内展现不同水平的met表达。在通过IHC评估c-met表达时考虑IHC染色的强度（阴性、弱、中等、或强）和以不同强度水平染色的肿瘤细胞的比例二者。用于定义met诊断阳性肿瘤和met诊断阴性肿瘤的标准在非盲研究之前(before study unblinding)定义，如通过遵循下文评分系统的IHC确定的。
对肿瘤细胞的c-Met染色评分。在大多数情况中，染色主要是膜性的，有一些胞质信号(M,c)，然而，在5-10%的样品中也观察到优势胞质染色(C,m)。将染色归类为强(3+)、中等(2+)、弱(1+)、可疑(+/-)或阴性(-)染色强度。强染色强度的特征在于茶褐色至黑色胞质和/或类似强度的增厚的、变暗的膜。中等染色强度的特征在于褐色胞质和/或膜。中等染色缺少在强染色强度中看到的黑色且膜更薄。弱染色强度的特征在于浅棕色胞质。弱信号缺少在中等染色强度中看到的丰富的褐色且膜更薄。阴性或可疑信号强度的特征在于没有任何可检测信号或淡灰色或微褐色信号，而非褐色，且没有膜染色增强的证据。
在评估染色强度之外，目测评估具有异质信号的样品中各种染色强度/样式的百分比。
包括下述具有各种染色强度的对照细胞团粒作为IHC分析的对照以及评分对照：H441（+++（强）染色）；A549（++（中等）染色）；H1703（+（弱）染色）；和TOV-112D（-（阴性）染色）或H1155（-（阴性）染色）。对于肺样品，还使用支气管上皮作为内部对照，因为它展现中等(2+)膜染色。还使用同种型对照抗体来测定测试样品的基础背景染色。使用阳性对照抗体（诸如Ki-67）来评估组织质量。图2显示依照上文IHC方案制备的，IHC得分为0、1、2、或3的NSCLC组织样品的一个例子。如图2所示，c-met染色信号可以遍及肿瘤的赘生物部分均质分布，具有均匀水平的强度，或者异质分布，具有超过一种强度水平。染色可以是异质的，例如样品可以具有超过一种强度水平。图1显示依照上文IHC方案制备的例示性对照细胞团粒。
评估IHC染色后，以下述评分截留，基于至少50个肿瘤细胞的分析，报告IHC得分：
*可互换地称作“IHC临床得分”或“临床得分”
记录血管染色，但不用于IHC得分，部分是由于一些活检样品中缺少足够的血管系统。
临床“Met诊断阳性”和“Met诊断阴性”分类定义如下：
Met诊断阴性：IHC得分0或1
Met诊断阳性：IHC得分2或3
为清楚起见，注意，本申请使用下述术语：
IHC得分 临床诊断分类
0或1 Met诊断阴性，可互换地称作Met Dx-、Met低、Met-低、Met低
2或3 Met诊断阳性，可互换地称作Met Dx+、Met高、Met-高、Met高
另外，在2010年8月31日提交的美国专利申请No.61/378,911（一项与本申请有关的专利申请）中，分别使用术语“met阳性”和“met阴性”来指IHC得分2或3和IHC得分0或1。
临床试验
肺癌是全球癌症死亡的首要原因：它比乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、黑素瘤和前列腺癌组合杀死更多的人。每年有118万人因该疾病而死亡(Parkin DM.CA Cancer J Clin(2005)55:74-108)。大多数肺癌患者在疾病处于晚期阶段且已经扩散至身体其它部分时得到诊断。
非小细胞肺癌(NSCLC)是该疾病的最常见形式，占所有病例的大约85%。只有7.5%诊断有晚期（IV期）NSCLC的人预期在五年后活着。NSCLC可分类为腺癌、鳞状细胞癌或大细胞癌。腺癌是NSCLC的最常见形式。越来越多的证据表明两种主要NSCLC组织学亚型，即腺癌（占肺癌的大约40%）和SCC（占肺癌的大约25%）展现独特的生物学特性，导致对相似疗法的差异响应。虽然在腺癌中有活性，但是Pemtrexed在SCC中显示相对更低的功效(Scagliotti et al,2008,J Clin Oncol.26(21):3543-51.Epub2008May27)。用贝伐单抗治疗具有中央定位的SCC的NSCLC患者导致出血风险升高(Sandler etal2006,N Engl J Med.355(24):2542-50)。最后，具有转移性疾病的SCC患者在历史上具有与腺癌相比更差的总体存活。如此，仍然需要为此组织学子集鉴定有效方案。
这项研究的原始方案记载于例如WO2010/045345；然而，稍后修改了该研究以添加如下50名具有鳞状细胞组织学的患者的登记。将患者以1:1的比率随机化分入两个治疗分支之一：MetMAb+厄洛替尼对厄洛替尼+安慰剂。一旦120名患者（构成“总”群体）登记，合格限制于具有鳞状细胞癌(SCC)组织学的患者以确保该研究中登记总共大约80名具有SCC的患者。构成“总”群体的头120名患者的随机化依照吸烟状况、性能状态、和组织学来分层，而接下来的50名SCC患者的随机化会依照吸烟状况和性能状态来分层。在这项研究期间，患者和治疗个体（包括调查人员）对研究药物的治疗指派（MetMAb或安慰剂）是盲的。在2010年6月8日或之前自这项研究获得的数据的一项方案特异性分析（n=128名患者）提示肿瘤表达更低水平c-met的患者没有受益于MetMAb。基于这些数据，停止了新患者进入研究的筛选和登记，并如下修改该试验：
·在具有c-met诊断阴性肿瘤的患者中停止MetMAb，其中某些患者例外，根据调查人员的判断，该患者正受益于研究药物。
·出于除疾病进展以外的原因停止MetMAb的具有c-met诊断肿瘤的患者能够容许继续接受厄洛替尼单一疗法。
·随机化分入安慰剂+厄洛替尼分支、展现出疾病进展的具有c-met诊断阴性肿瘤的患者只容许穿越至接受MetMAb（在继续厄洛替尼之外），如果在疾病进展时获得新鲜组织活检且IHC结果显示肿瘤为c-met诊断阳性的话。
·所有其他患者继续依照方案接受治疗。
修改后的研究的主要目的是评估MetMAb加厄洛替尼相对于厄洛替尼加安慰剂在具有Met阳性肿瘤（如通过免疫组织化学测定的）的患者中、在具有鳞状细胞组织学的患者中、以及在所有患者（即包括具有Met阴性肿瘤的患者）中的无进展存活(PFS)。
这项研究的次要目的是：(a)评估具有鳞状细胞组织学的患者中的无进展存活(PFS)；(b)测定具有c-met阳性肿瘤、鳞状细胞组织学的患者中以及总患者群体中的总体RECIST1.0响应率和响应持续时间；(b)表征MetMAb加厄洛替尼在具有NSCLC的患者中的安全性和耐受性；和(c)评估具有NSCLC的患者中MetMAb和厄洛替尼二者的最小浓度(Cmin)和最大浓度(Cmax)。
这项研究的别的目的是(a)评估具有鳞状细胞组织学、c-met阳性肿瘤的患者中以及总群体中的总体存活；(b)依照治疗组及在具有阳性肿瘤的患者中、以及在总群体中评估FDG-PET响应率；(c)依照治疗组及在Met阳性肿瘤、鳞状细胞组织学中、以及在总群体中评估FDG-PET响应者较之不响应者中的无进展存活(PFS)；(d)评估第一次肿瘤评估时的实体瘤响应评估标准(RECIST)1.0响应与PFS之间的关系；(e)评估响应与HGF/Met和/或EGFR信号传导途径相关生物标志物（包括但不限于IL8和血清HGF）的变化（或基线表达）之间的关系；(f)评估在研究时发生进展的患者中的潜在抗性机制；和(g)评估具有c-met阳性肿瘤的患者中以及总群体中的进展前时间。
研究设计。这项研究是一项II期、双盲、随机化、多中心试验，设计用于评估MetMAb加厄洛替尼治疗较之厄洛替尼加安慰剂在二线和三线NSCLC中的初步活性和安全性。将来自大约40个多国场所的组织学未明确的大约120名患者以1:1的比率随机化分入两个治疗分支之一：MetMAb加厄洛替尼对厄洛替尼加安慰剂。一旦120名患者（构成“总”群体）登记，合格限制于具有鳞状细胞癌(SCC)组织学的患者以确保该研究中登记总共大约80名具有SCC的患者。构成“总”群体的头120名患者的随机化依照吸烟状态（不吸烟者和超过10年前停止的吸烟者对当前的吸烟者和不到10年前停止的吸烟者）、性能状态和组织学来分层，而接下来的50名SCC患者的随机化会依照吸烟状态和性能状态来分层。继续每个分支中的治疗直至达到疾病进展、不可接受的毒性、或任何其它停止标准。在疾病进展时，给予随机化分入厄洛替尼加安慰剂分支的患者接受MetMAb的选项（在继续厄洛替尼之外），前提是他们继续达到合格标准。为了产生假设的目的，汇总了自这种穿越获得的安全性数据。如上所述，在2010年6月8日或之前自这项研究获得的数据的一项方案特异性分析（n=128名患者）提示肿瘤表达较低水平c-met的患者没有受益于MetMAb。基于这些数据，停止了新患者进入研究的筛选和登记，并如上所述修改该试验。
在该研究期间，收集关于肿瘤测量和存活状态的数据来评估PFS、总体存活(OS)和总体响应率(ORR)。在基线时及对于头四个周期以大约每6周的间隔（即每两个MetMAb/安慰剂3周周期）获得CT扫描。四个周期后，大约每9周（每三个MetMAb/安慰剂周期）实施例行CT扫描。在基线时及在周期1的第
Figure BDA00003108252600741
天获得FDG-PET成像。在这项研究的过程期间，图像阅读设备(IRF)评估FDG-PET结果并基于收到的数据确定FDG-PET成像是否应当在所有参与场所继续或者FDG-PET成像是否应当限于少数场所。在一些患者中，收集探索性血清和血浆样品以测定MetMAb加厄洛替尼对潜在活性标志物（包括但不限于IL-8和HGF）的循环水平的影响。将这些和其它标志物与临床结局关联起来有助于鉴定预测性生物标志物，例如循环中的可能影响药物活性或对疗法的响应的标志物。在预定的时间自同意的患者采集血液制备血清和血浆，并评估这项探索性标志物的水平。
测定治疗前肿瘤样品中的c-met和/或EGFR的表达。通过IHC和/或FISH分析来测定c-met和/或EGFR表达。
由于完全确立了东亚人在用EGFR定向疗法治疗时的存活好处，因此这项研究不容许超过20%的可评估研究群体是东亚人。
结局测量。这项研究的主要结局测量是由实体瘤响应评估标准(RECIST)1.0定义的无进展存活(PFS)或最后一次测量30天内任何原因的死亡。
这项研究的次要结局测量如下：
(a)总体响应(OR)（部分响应加完全响应），如使用RECIST1.0在Met阳性肿瘤和总体中测定的；和
(b)OR的持续时间。
探索性结局测量包括下述：
(a)FDG-PET响应率，如基于欧洲癌症研究组织(EORTC)的定义测定的；
(b)不利事件和严重不利事件的发生率、性质和严重程度，及监测研究药物施用期间和之后生命体征、体检发现、和临床实验室结果的变化；和
(c)总体存活（自随机化直至最后一次研究治疗30天内任何原因的死亡的时间）。
会在具有c-met阳性肿瘤的患者中、在SCC患者中、及在“总”群体中评估主要和次要结局测量。
会收集血清样品，用于分析MetMAb和厄洛替尼药动学和药效学。
患者选择标准。如果成人患者具有不可手术的局部晚期或转移性（IIIb/IV期）NSCLC（例如如通过组织学研究确定的）且接受过至少一种但不超过两种针对IIIb/IV期NSCLC疾病的在先方案的话，他们对于参与这项研究是合格的。在随机化之间要求在该场所可得的能够做出NSCLC的确定性诊断的代表性福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤标本及组织块中的足够可存活肿瘤细胞（优选的）或15张未染色的连续载玻片，伴有一份相关病理学报告。细胞学样品或细针穿刺样品是不可接受的。如果患者提供至少大于或等于5张未染色的连续载玻片或愿意同意且接受治疗前肿瘤核心或切除活检的话，患者仍然可以是合格的。细胞学或细针穿刺样品是不可接受的。
在这项研究中，癌症分期遵循美国癌症联合委员会的AJCC癌症分期手册，第6版。在他们的一线方案（针对IIIb/IV期的）之前接受了针对I-IIIa期的新辅助和/或辅助疗法的患者对于参与研究是合格的，前提是他们还接受了针对IIIb/IV期疾病的一线疗法。在一些实施方案中，至少一种含有化疗的方案（针对任何阶段）是基于铂的。患者必须具有可测量疾病，如通过RECIST测定的。在一些实施方案中，患者在治疗前FDG-PET扫描上有至少一处可测量损害也是CT上依照RECIST的靶损害。在一些实施方案中，患者提供治疗前肿瘤标本，且在治疗前FDG-PET扫描上拥有至少一处可测量损害也是CT上依照RESIST的靶损害。
在一些实施方案中，排除的受试者是具有超过两种针对IIIB/IV期的在先治疗的受试者。在一些实施方案中，排除的受试者包括具有超过30天的对能通过EGFR抑制起作用的研究药或上市药的暴露，或导致剂量改变的已知EGFR相关毒性的受试者。EGFR抑制剂包括（但不限于）吉非替尼、厄洛替尼、和西妥昔单抗。在一些实施方案中，排除的受试者包括在随机化之前28天内接受化疗、生物学疗法、放疗或调查药物（例外是，在随机化之前两周内可使用激酶抑制剂，前提是任何药物相关毒性得到恰当解决）受试者或具有未治疗的和/或活动性的（正在进展中或需要抗惊厥药或皮质类固醇来控制症状）CNS转移的受试者。在一些实施方案中，具有脑转移历史的受试者对于参与研究是合格的，只要他们达到下述标准：(a)CNS以外的可测量疾病，如由RECIST定义的；(b)CNS定向疗法完成与射线照相术研究筛选之间没有暂时进展的射线照相术证据；(c)CNS定向治疗，可包括神经手术或立体定向放射手术；(d)CNS射线照相术研究的筛选于自放疗完成起≥4周且自皮质类固醇和抗惊厥药停止起≥2周；(e)在第1天之前≥4周完成放疗和立体定向放射手术；和(f)在第1天之前≥24周完成神经手术，和在第1天之前≥12周完成脑活检。
在一些实施方案中，排除的受试者还包括具有严重系统性疾病历史的受试者，包括随机化之前最后6个月内的心肌梗死，不受控制的高血压（在服用抗高血压药时持续血压>150/100mmHg），不稳定的心绞痛，纽约心脏协会(NYHA)II级或更大的充血性心力衰竭，需要药疗的不稳定的症状性心律失常（具有慢性房性心律失常，即心房颤动或发作性室上性心动过速的患者是合格的），或II级或更大的周围血管疾病；不受控制的糖尿病，如表现为禁食血清葡萄糖水平>200mg/dL；随机化之前28天内大手术或重大外伤损伤；预期研究过程期间需要大手术；随机化之前7或14天内局部姑息性放疗或随机化之前尚未解决至II级或更少的、源自放疗的持续不利反应；不能进行口服药疗或需要IV营养法或完全胃肠外营养（含脂质），或影响胃肠吸收的在先手术规程。在一些实施方案中，排除的受试者包括具有任何下述未纠正异常血液学值的受试者（在随机化之前2周内）：ANC<1,500个细胞/μL，血小板计数<100,000个细胞/μL，血红蛋白<9.0g/dL，在RBC输注之后，其它基线实验室值（在随机化之前2周内），血清胆红素>1.5xULN，血清肌酸酐>1.5xULN，不受控制的高钙血症（>11.5mg/dL或>1.5电离钙）。在一些实施方案中，排除的受试者包括具有不受控制的糖尿病的受试者和具有需要继续使用双膦酸盐疗法的症状性高钙血症的受试者。
在一些实施方案中，排除的受试者包括怀孕或哺乳的女性；可以与医学监测人员讨论在随机化之前5年内经历过推定手术或放疗治愈的具有其它恶性肿瘤的受试者（例如子宫颈的上皮内癌、前列腺切除术后的局限性前列腺癌、或皮肤基底细胞/鳞状细胞癌）；或混乱或定向障碍的证据、或重大精神病的历史。还可参见厄洛替尼的标签上的另外的排除。
统计方法和功效分析。主要和次要功效分析包括所有随机化患者，其中患者分配至他们随机化时分入的治疗分支。安全线分析包括所有接受至少一剂研究治疗的随机化患者，其中患者分配至与实际接受的方案有关的治疗分支。恰当地使用均值、标准偏差、中值、和范围（对于连续变量）及比例（对于分类变量）汇总人口统计学和基线特征（例如年龄和性别）。依照总患者群体及依照治疗分支呈现汇总。任何变量的基线值定义为在第一次施用研究治疗之前可得的最后一个值。
使用Kaplan-Meier方法学来评估每个治疗分支的中值PFS。通过计算机可读形式(CRF)数据，而非通过由交互式话频可读系统在随机化时收集的数据来确定分层因素，除非CRF数据缺失。使用一种分层Cox回归模型及MetMAb治疗的指示变量确定危害比（即治疗效果的量级和95%置信区间）的评估。将与关于“总”群体患者中的PFS描述的分析方法相同的分析方法应用于具有met阳性肿瘤的患者和具有SCC组织学的患者。最后一次处理30天内任何原因的死亡都作为PFS事件包括在内。客观响应定义为在相隔大于或等于四周的两个连续时机测定到的完全或部分响应。没有基线后肿瘤评估的患者认为是不响应者。为每个治疗分支计算客观响应率和95%置信区间(Blyth-Still-Casella)的估值。计算肿瘤响应率中的差异的置信区间(Satnes andSnell1980;Berger and Boos1994)。对于具有客观响应的患者，客观响应的持续时间定义为自初始响应至疾病进展或最后一次治疗30天后任何原因的死亡的时间。用于操作审查和用于分析的方法与关于PFS描述的相同。对具有met阳性肿瘤的患者、具有SCC组织学的患者及依照“总”患者群体评估所有次要功效终点。
试验药物。MetMAb是一种针对c-met的已知的重组、人源化、单价的单克隆抗体。MetMAb作为无菌液体在一次使用15-cc管形瓶中供应。每个管形瓶在10ml中含有600mg MetMAb，浓度为60mg/ml，在10mM乙酸组氨酸、120nM海藻糖、0.02%聚山梨酯20，pH5.4中。MetMAb管形瓶冷藏于2C-8C，而且保持冷藏直至临使用。MetMAb在生理盐水(0.9%)中稀释之后静脉内施用。
厄洛替尼
Figure BDA00003108252600771
作为含有盐酸盐形式厄洛替尼的常规、立即释放片剂提供。在活性组分厄洛替尼之外，片剂还含有乳糖（含水的）、微晶纤维素、淀粉羟乙酸钠和硬脂酸镁。可得到含有25mg、100mg和150mg厄洛替尼的片剂。
安慰剂由250cc0.9%NSS（盐水IV溶液，0.9%）组成。
研究治疗。MetMAb的剂量为15mg/kg，静脉内，3周周期的第1天。使用筛选时的重量来确定MetMAb的实际剂量。厄洛替尼的剂量为150mg，口服，3周周期的每一天。厄洛替尼的剂量水平可以因可能可归于厄洛替尼的毒性（例如疹、腹泻）而降低至100mg（第一次降低）或50mg（第二次降低）。
MET和EGFR拷贝数：通过荧光原位杂交(FISH)来评估MET和EGFR基因拷贝数。将每个细胞大于或等于5个拷贝的MET指定为FISH阳性(参见Cappuzzo et al,J Clin Oncol(2009)27:1667-9)。真MET扩增定义为大于或等于10%的肿瘤细胞中大于或等于15个拷贝的MET的紧密的基因簇或MET/CEP7比大于或等于2。对于评估MET和EGFR拷贝数二者的实验，基于多项临床研究(参见例如Varella-Garcia et al,J Clin Pathol(2009)62,970-7;Capuzzo et al,JNCI(2005);97:643-55.)中使用的评分标准来认定肿瘤是MET和EGFR FISH阳性的：FISH阳性：基因扩增或高多体性(polysomy)，FISH阴性：低多体性，三体性(trisomy)或二体性(disomy)，基因扩增：紧密的基因簇或≥10%的肿瘤细胞中≥15个拷贝的MET或MET/CEP7比≥2，高多体性：≥40%的肿瘤细胞中≥4个拷贝的MET。
EGFR、KRAS和MET基因型测定：自宏观解剖的肿瘤组织载玻片分离DNA。使用DxS基因型测定试剂盒来评估EGFR和KRAS突变，通过DHPLC(Transgenomics Inc,Omaha NE)来评估MET外显子14变体，并通过焦（磷酸）测序来评估MET N275S多态性。
mRNA序型分析：使用Fluidigm平台对自宏观解剖的肿瘤组织载玻片提取的RNA评估MET，HGF，EGFR，AREG，和EREG mRNA表达。将转录物水平相对于两种在肺组织中稳定表达的参照基因的均值标准化，并将结果表述成标准化表达值(2-ΔCt)。
血浆HGF：通过捕捉ELISA评估治疗前收集的血浆中的HGF水平。
基于2010年6月8日或之前的数据截留日的分析的结果
自2009年3月至2010年3月，128名具有二线或三线NSCLC的患者在全球25个地点登记并随机分至：(a)MetMAb(15mg/kg IV q3wk)加厄洛替尼治疗（可互换地称作“ME”）(n=64)或(b)安慰剂加厄洛替尼治疗（可互换地称作“PE”）(n=64)。这项研究中使用的数据截留日是2010年6月8日或之前。
患者部署显示于表1。
表1：患者部署
Figure BDA00003108252600791
患者人口统计学显示于表2。
表2：患者人口统计学
Figure BDA00003108252600792
*在121名具有可评估组织样品的患者中
**在112名具有可评估组织样品的患者中。
基线特征在总(ITT)群体中得到较好的平衡，包括Met高肿瘤（51%/56.5%；PE/ME）、Kras突变（23%/23%）和EGFR突变（11%/12.5%）的流行性。对于组织，在121名患者（95%的患者）中Met IHC分析是可评估的，及在112名患者中，EGFR和KRAS突变是可评估的。
依照Met状态的基线特征显示于表3。
表3：依照Met状态的基线特征
Figure BDA00003108252600801
*在112名具有可评估肿瘤样品的患者中
在这项研究中，自100%的患者获得了组织。95%的患者具有足够的组织用于通过IDC评估Met。54%的患者具有“Met高”NSCLC。
MetMAb和厄洛替尼治疗给具有Met高NSCLC的患者提供有临床意义的好处（图3）。在用MetMAb加厄洛替尼治疗的Met-高患者中观察到PFS好处（危害比(HR)0.56；95%CI0.31，1.02；p=0.05）和OS好处（HR0.55；95%CI0.25，1.16；p=0.11）二者。观察到各曲线的早期和持续分开。在具有met高NSCLC的患者中，与厄洛替尼+安慰剂治疗相比，将MetMAb添加至厄洛替尼几乎倍增了无进展存活和总体存活（ME中的PFS为12.4周，PE中的PFS为6.4周；ME中的OS为7.7周，PE中的OS为7.4周）。23名来自厄洛替尼+安慰剂分支的患者穿越至MetMAb，而且23名穿越至ME的患者中12人具有Met高生物标志物表达。
Met低NSCLC患者没有受益于MetMAb+厄洛替尼治疗（图4）。较之厄洛替尼和安慰剂治疗，MetMAb提高Met低NSCLC患者中的进展和死亡风险：PFS（HR2.01；95%CI1.04，3.91；p=0.04）和OS（HR3.26；95%CI1.20，8.80；p=0.01）二者在ME分支中更差。约70%用MetMAb和厄洛替尼治疗的Met低患者到第一次评估（第6周时的CAT扫描）发生进展。
总群体中的PFS和OS（图5）。PFS和OS在总群体中的MetMAb加厄洛替尼和安慰剂加厄洛替尼治疗分支中没有显著差异。MetMAb加厄洛替尼治疗在总群体中相对于安慰剂加厄洛替尼治疗没有显示出好处。总（可互换地称作“意图治疗”或ITT）群体中的PFS和OS的HR为1.09（95%CI0.71，1.67；p=0.70）和1.09（95%CI0.62，1.91；p=0.76）。中值PFS和中值OS与先前报告的类似疾病背景中的发现一致。23名来自厄洛替尼+安慰剂分支的患者穿越至MetMAb+厄洛替尼治疗。客观响应率为：厄洛替尼+安慰剂n=3(4.7%)，厄洛替尼+MetMAb n=4(6.3%)。
依照亚组检查了PFS（图6）。Met IHC状态3和2患者显示受益于MetMAb+厄洛替尼治疗，其中状态3患者显示更大的好处。Met IHC状态0和1患者没有受益于MetMAb加厄洛替尼治疗。状态0患者在服用MetMAb+厄洛替尼时比状态1患者更差。在其它亚组中没有观察到MetMAb+厄洛替尼治疗的选择性好处，包括：组织学分类（非鳞状对鳞状细胞），吸烟史，ECOGCC，EGFR突变或Kras突变。
图9显示Met高患者中的PFS的亚组分析。
还依照亚组检查了OS（图7）。与PFS结果类似，Met高IHC状态3和2患者显示受益于MetMAb+厄洛替尼治疗，其中状态3患者显示更大的好处。Met低IHC状态0和1患者没有受益于MetMAb加厄洛替尼治疗。状态0患者在服用MetMAb+厄洛替尼时比状态1患者更差。在其它亚组中没有观察到MetMAb+厄洛替尼治疗的选择性好处，包括：组织学分类（非鳞状对鳞状细胞），吸烟史，ECOGCC，EGFR突变或Kras突变。
图10显示Met高患者中的OS的亚组分析。图11和12分别显示Met低患者中的PFS和OS的亚组分析。
还在Met高群体（排除具有已知EGFR突变的患者）中分析了总体存活。MetMAb+厄洛替尼治疗（相对于安慰剂+厄洛替尼）的受益程度（OSHR=0.55，95%CI0.26，1.20，p=0.13）大致等于Met高群体（包括具有已知EGFR突变的患者）中的总体存活。如此，Met高患者受益于MetMAb+厄洛替尼不是由EGFR突变状态驱动的。
依照Met状态的关键预后变量显示于表4。
表4：依照Met状态的关键预后变量
Figure BDA00003108252600821
Met表达对于更差的结局是具有预后性的（图8）。在一项厄洛替尼+安慰剂治疗的患者的分析中，相对于Met低患者（中值PFS11.4周；中值OS9.2周），Met高患者具有升高的进展风险（HR=1.73；中值PFS为6.4周）和大致倍增的死亡风险（HR=2.52；中值OS为7.4周）。如此，Met表达是厄洛替尼治疗的二线或三线NSCLC患者中进展和存活的预后因子：Met高患者在用厄洛替尼治疗时更差，而Met低患者在用厄洛替尼治疗时更好。
进展样式（靶的生长相对于新损害(growth of target verses new lesion)）在各治疗组间及依照met状态相当（表5）。
表5：进展样式
Figure BDA00003108252600822
进展样式（靶生长对新损害）在各治疗组间及依照Met状态相当。
ORR的功效分析显示于表6。
表6：ORR的功效分析
Figure BDA00003108252600831
依照Met状态的治疗暴露显示于表7。
表7：依照Met状态的治疗暴露
Figure BDA00003108252600832
安全性：厄洛替尼+MetMAb治疗得到较好耐受。表8显示所有不利事件，不管关系，在该研究中观察到大于10%的报告频率。除水肿（主要是1-2级）以外，厄洛替尼+MetMAb的总体毒性与厄洛替尼+安慰剂相当。
表8：所有不利事件
Figure BDA00003108252600841
表9显示在该研究中观察到的所有3-5级不利事件（频率>5%）。没有5级事件。疹、腹泻、和疲劳在Met高和Met低亚群二者中的各治疗分支之间相当。级别≥3的不利事件的发生率在Met高组中在ME与PE之间相似（54%比53%）；然而，级别≥3的不利事件的发生率在Met低组中在ME分支中更高（52%比PE分支中的35%）。
表9：3-5级不利事件
Figure BDA00003108252600842
安全性汇总显示于表10。
表10：安全性的汇总
Figure BDA00003108252600852
*对于厄洛替尼+MetMAb分支中Met高的患者：吸入性肺炎，梗阻性疝，缺氧，脑梗死，食管狭窄，疲劳，NOS，和指(趾)甲毒性。
**对Met低的患者导致死亡的AE：肺炎，肺栓塞，咯血，NSCLC
结论
·抗c-met抗体MetMAb是Met受体的一种选择性的且有力的抑制剂。
·Met高表达与用安慰剂治疗的患者中更差的结局有关联。
·厄洛替尼和MetMAb组合治疗使具有Met高NSCLC的患者受益。
·用厄洛替尼+MetMAb治疗的具有Met低NSCLC的患者的更差结局不能通过不利事件来解释。
·厄洛替尼+MetMAb得到较好耐受，而且没有新的重大安全性发现。
·总群体较之具有Met高NSCLC的患者的结果突显了使用诊断的重要性。
基于2010年11月15日或之前的数据截留日的最终分析
自2009年3月至2010年3月，128名具有二线或三线NSCLC的患者在全球25个地点登记并随机分至：(a)MetMAb(15mg/kg IV q3wk)加厄洛替尼治疗（可互换地称作“ME”）(n=64)或(b)安慰剂加厄洛替尼治疗（可互换地称作“PE”）(n=64)。这项研究中使用的数据截留日是2010年11月15日或之前。
患者部署显示于表11。
表11：患者部署
Figure BDA00003108252600861
患者人口统计学显示于表12。
表12：患者人口统计学
Figure BDA00003108252600862
*在121名具有可评估组织样品的患者中
**在112名具有可评估组织样品的患者中。
基线特征在总(ITT)群体中得到较好的平衡，包括具有Met诊断阳性肿瘤（51%/56.5%；PE/ME）、Kras突变（23%/23%）和EGFR突变（11%/12.5%）的患者的流行性。对于组织，在121名患者（95%的患者）中Met IHC分析是可评估的，及在112名患者中，EGFR和KRAS突变是可评估的。
依照Met状态的基线特征显示于表13。
表13：依照Met状态的基线特征
Figure BDA00003108252600871
*在128名具有可评估组织样品的患者中
**在112名具有可评估组织样品的患者中
在这项研究中，自100%的患者获得了组织。95%的患者具有足够的组织用于通过IDC评估Met。54%的患者具有“Met高”NSCLC。
MetMAb和厄洛替尼治疗给具有Met诊断阳性NSCLC的患者提供统计学显著的且有临床意义的好处（图13）。在用MetMAb加厄洛替尼治疗的Met诊断阳性患者中观察到PFS好处（危害比(HR)0.53；95%CI0.28-0.99；p=0.04）和OS好处（HR.37；95%CI0.19-0.72；p=0.002）二者。观察到各曲线的早期和持续分开。将MetMAb添加至厄洛替尼导致死亡风险降低几乎三倍。用MetMAb+厄洛替尼(ME)治疗的患者中的中值PFS为2.9个月，较之用安慰剂+厄洛替尼(PE)治疗的患者中的1.5个月；用MetMAb+厄洛替尼治疗的患者中的中值OS为12.6个月，较之用安慰剂+厄洛替尼治疗的患者中的3.8个月。
Met诊断阴性NSCLC患者没有受益于MetMAb+厄洛替尼治疗（图14）。较之厄洛替尼和安慰剂治疗，MetMAb提高Met低NSCLC患者中的进展和死亡风险：PFS（HR1.82；95%CI0.99-3.32；p=0.05）和中值OS（HR1.78；95%CI0.79-3.99；p=0.16）二者在MetMAb+厄洛替尼分支中更差。约70%用MetMAb和厄洛替尼治疗的Met低患者到第一次评估（第6周时的CAT扫描）发生进展。
总群体中的PFS和OS显示于图15。PFS和OS在总群体中的MetMAb加厄洛替尼和安慰剂加厄洛替尼治疗分支中没有显著差异。MetMAb加厄洛替尼治疗在总群体中相对于安慰剂加厄洛替尼治疗没有显示出好处。总（可互换地称作“意图治疗”或ITT）群体中的PFS和OS的危害比为1.09（95%CI0.73-1.62；p=0.69）和0.8（95%CI0.5-1.3；p=0.76）。中值PFS和中值OS与先前报告的类似疾病背景中的发现一致。
还依照亚组检查了OS（图16）。Met诊断阳性IHC状态3和2患者显示受益于MetMAb+厄洛替尼治疗，其中状态3患者显示更大的好处。Met诊断阴性IHC状态0和1患者没有受益于MetMAb加厄洛替尼治疗，而且状态0患者在服用MetMAb+厄洛替尼时比状态1患者更差。在其它亚组中没有观察到MetMAb+厄洛替尼治疗的选择性好处，包括：组织学分类（非鳞状对鳞状细胞），吸烟史，ECOGCC，EGFR突变或Kras突变。
图17显示Met诊断阴性患者中的OS的亚组分析。
还在关键患者子群体中分析了总体存活：MET FISH阳性患者（定义为大于或等于五个拷贝的MET），Met诊断阳性/MET FISH阴性，Met诊断阳性/EGFR野生型，和Met诊断阳性/MET FISH阴性/EGFR野生型（图18）。将MetMAb添加至厄洛替尼的好处并非MET FISH阳性患者专有，在MET FISH阴性/Met诊断阳性患者中也观察到了，提示IHC是受益于MetMAb的更灵敏预测物。Met诊断阳性患者受益于MetMAb+厄洛替尼并非由EGFR突变状态驱动。
依照Met状态的关键预后变量显示于表14。
表14：依照Met状态的关键预后变量
Figure BDA00003108252600881
Figure BDA00003108252600891
Met表达对于更差的结局是具有预后性的（图19）。在一项厄洛替尼+安慰剂治疗的患者的分析中，相对于Met诊断阴性患者（中值PFS2.7个月；中值OS15.3个月），Met诊断阳性患者具有升高的进展风险（HR=1.7；中值PFS为1.5个月）和升高的死亡风险（HR=3.8；中值OS为3.8个月）。如此，Met表达是厄洛替尼治疗的二线或三线NSCLC患者中进展和存活的预后因子：Met诊断阳性患者在用厄洛替尼治疗时更差，而Met诊断阴性患者在用厄洛替尼治疗时更好。
安全性：厄洛替尼+MetMAb治疗得到较好耐受。安全性数据汇总于表15。
表15：安全性数据的汇总
在两种诊断群体中，添加MetMAb都没有实质性地提高任何特定不利事件的频率（大于或等于10），例外是外周性水肿，在Met诊断阳性和诊断阴性群体中都是MetMAb治疗分支更高。MetMAb治疗没有添加实质性的新毒性，也没有加剧已知的厄洛替尼毒性，不管Met诊断状态，尽管更高比例的服用MetMAb+厄洛替尼的Met诊断阳性患者因不利事件而停药且更高比例的服用MetMAb+厄洛替尼的Met诊断阴性患者具有显著的不利事件和3级或更高级别的不利事件。
肿瘤生长和疾病进展：在周期2（此时发生了大多数PFS事件）时根据Met状态各治疗分支间肿瘤生长速率没有显著差异。
还使用不同IHC评分方案在患者中评估了MetMAb+厄洛替尼治疗的总体存活治疗效果以定义评分为“met阳性”的患者：
·不太严格的截留为大于或等于10%的肿瘤细胞具有中等(2+)或高(3+)IHC染色强度（“10%Met诊断阳性”）
·更加严格的截留为大于或等于90%的肿瘤细胞具有中等(2+)或高(3+)IHC染色强度（“90%Met诊断阳性”）。
患者子集中的治疗效果的估值表述为危害比，使用一种不分层Cox模型获得，包括95%置信区间。这项分析的结果显示于图21。当使用10%作为截留时，作为10%Met诊断阳性选择的患者(n=87)中的HR为0.52，95%CI为0.30，0.92。当使用50%作为截留（即大于或等于50%的肿瘤细胞具有中等(2+)或高(3+)IHC染色强度）时，作为Met诊断阳性选择的患者(n=66)中的HR为0.38，95%CI为0.20，0.71。当使用90%作为截留时，作为90%Met诊断阳性选择的患者(n=47)中的HR为0.30，95%CI为0.14，0.64。在(a)作为10%Met诊断阳性选择且(b)使用50%截留时不是Met诊断阳性的患者(n=21)中，HR为2.83，95%CI为0.53，15.2。在(a)使用50%截留时作为Met诊断阳性选择且(b)不是90%Met诊断阳性的患者(n=19)中，HR为0.75，95%CI为0.24，2.42。上述对不同IHC评分方案的详细分析支持使用大于或等于50%的肿瘤细胞以中等(2+)或高(3+)强度通过IHC对Met染色作为Met诊断阳性的定义。
结论
·抗c-met抗体MetMAb是Met受体的一种选择性的且有力的抑制剂。
·Met高表达与用安慰剂治疗的患者中更差的结局有关联。
·厄洛替尼和MetMAb组合治疗使具有Met诊断阳性NSCLC的患者受益。
·用厄洛替尼+MetMAb治疗的具有Met诊断阳性NSCLC的患者的更差结局不能通过不利事件来解释。
·厄洛替尼+MetMAb得到较好耐受，而且没有新的重大安全性发现。
·总群体较之具有Met诊断阳性NSCLC的患者的结果突显了使用诊断的重要性。
来自OAM4558g的探索性生物标志物分析：一项在具有晚期非小细胞肺癌 (NSCLC)的患者中以安慰剂作为对照的厄洛替尼±MetMAb II期研究
通过FISH、qRT-PCR或各种突变检测技术自存档的肿瘤组织标本测量与c-Met和/或EGFR信号传导有关的探索性肿瘤生物标志物。通过ELISA测量血浆HGF水平。独立于Met临床诊断状态对结局进行分析。
结果：具有可评估肿瘤或血浆标本的患者的基线特征一般是相当的。
EGFR和KRAS突变：自n=112名(93%)患者获得了EGFR和KRAS数据，MET自n=87名(72%)患者获得了外显子14变体，且自n=113名(93%)患者获得了MET N375S snp。EGFR突变预测研究中6/7的客观响应，而且在各治疗分支间相当。KRAS突变（在23%(26/112)的可评估标本中检测到）与EGFR突变（在12%(13/112)的可评估标本中检测到）互相排斥，而且没有显著影响MetMAb在ITT或Met诊断阳性/阴性群体中的结局。
MET变体数据：在1%(n=1)的可评估标本中鉴定出MET外显子14删除突变。在11%(n=12)的可评估标本中鉴定出MET N375S snp。由于各治疗分支间的不平衡，未能实施结局分析。
MET FISH：自n=96(75%)名患者获得了FISH数据。在MET FISH阳性（定义为每个细胞≥5个拷贝的MET）的EGFR野生型患者中有朝向结局改善的非显著趋势，但是更低的阈值（例如≥4个拷贝（HR=0.89，p=0.82））则不然。总的说来，74%的FISH阳性患者也是Met诊断阳性的。在8%的患者中检测到真正的基因扩增。然而，Met诊断阳性和MET FISH阴性的EGFR野生型患者展示出结局改善的趋势（OS HR=0.45，p=0.07），指示使用FISH评估met基因扩增潜在地错失可能受益于MetMAb疗法的一个大的患者群体。在MET和EGFR FISH阳性患者中在OS方面没有显著差异。
通过qRT-PCR进行的MET和EGFR途径基因分析，和血浆HGF水平分析：自n=67名患者(49%)获得了mRNA数据（图20）。观察到肿瘤MET mRNA水平与Met IHC临床得分之间的非统计学显著关联；然而，MET mRNA或其它基因的表达没有独立预测具有mRNA数据的患者群体的PFS或OS好处（表16）。
表16。MET、EGFR、AREG和EREG表达与结局的关联。
Figure BDA00003108252600911
自n=96名(70%)获得了基线血浆HGF数据。在治疗前收集的血浆中具有低HGF蛋白质水平的患者中明显有结局改善的非显著趋势。
结论：本文中呈现的数据支持Met IHC作为来自MetMAb治疗的OS好处的最有力、灵敏且独立的预测物。鉴于此项研究是小规模研究，对这些生物标志物的进一步研究是必要的。
虽然出于清楚理解的目的，前述发明已经作为例示和例子相当详细地进行了描述，但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。
Figure IDA00003108253200021
Figure IDA00003108253200031
Figure IDA00003108253200041
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Figure IDA00003108253200071
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Claims (78)

1.一种用于鉴定有可能响应c-met拮抗剂治疗的癌症患者的方法，包括测定该患者的癌症是否具有大量的c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达指示该患者有可能响应c-met拮抗剂治疗。
2.一种用于确定癌症患者预后的方法，包括测定该患者的癌症是否具有大量的c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达指示当该患者用c-met拮抗剂治疗时该患者有可能具有延长的总体存活(OS)和/或无进展存活(PFS)。
3.一种用于鉴定不太可能响应c-met拮抗剂治疗的癌症患者的方法，包括测定该患者的癌症是否具有少量的c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达指示该患者不太可能响应c-met拮抗剂治疗。
4.权利要求1或2的方法，其中使用免疫组织化学(IHC)在来自该患者的样品中测定c-met生物标志物蛋白质表达。
5.权利要求4的方法，其中IHC得分为2或3。
6.权利要求4的方法，其中高c-met生物标志物表达为50%或更多的肿瘤细胞具有中等c-met染色强度、组合的中等/高c-met染色强度或高c-met染色强度。
7.权利要求10的方法，其中相对于对照细胞团粒中的c-met染色强度测定c-met表达染色强度。
8.权利要求7的方法，其中细胞系A549具有中等c-met染色强度。
9.权利要求7的方法，其中细胞系H441具有强c-met染色强度。
10.权利要求1或2的方法，其中c-met生物标志物表达为核酸表达且使用rtPCR、RNN-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、或FISH在来自该患者的样品中测定。
11.权利要求1、2和4-10任一项的方法，其中该患者具有相对于没有高c-met生物标志物的患者而言更大的PFS和/或OS。
12.权利要求3的方法，其中c-met生物标志物表达为蛋白质表达且使用免疫组织化学(IHC)在来自该患者的样品中测定。
13.权利要求12的方法，其中IHC得分为1或0。
14.权利要求13的方法，其中IHC得分为0。
15.权利要求12的方法，其中低c-met生物标志物表达为阴性c-met染色、少于50%的肿瘤细胞具有弱或组合的弱和中等c-met染色强度、或50%或更多的肿瘤细胞具有弱或组合的弱和中等c-met染色强度但少于50%的肿瘤细胞具有中等或组合的中等和强c-met染色强度。
16.权利要求15的方法，其中相对于对照细胞团粒的c-met染色强度而言测定c-met表达染色强度。
17.权利要求16的方法，其中细胞系H1155具有阴性c-met染色强度。
18.权利要求16的方法，其中细胞系HEK-293具有低c-met染色强度。
19.权利要求1-18任一项的方法，其中该患者样品是患者癌症的样品。
20.权利要求19的方法，其中在该c-met拮抗剂治疗之前获得该样品。
21.权利要求20的方法，其中在癌症药物治疗之前获得该样品。
22.权利要求20的方法，其中在该癌症已经转移之后获得该样品。
23.权利要求1-22任一项的方法，其中该样品是福尔马林固定且石蜡包埋的。
24.权利要求1-23任一项的方法，其中使用抗c-met抗体SP44实施c-met IHC。
25.权利要求1-24任一项的方法，其中该癌症为非小细胞肺癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、间皮瘤、黑素瘤、乳腺癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、头和颈癌、骨肉瘤、前列腺癌、或成胶质细胞瘤。
26.权利要求25的方法，其中该癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。
27.权利要求26的方法，其中该NSCLC为二线或三线局部晚期或转移性非小细胞肺癌。
28.权利要求26或27的方法，其中该NSCLC为腺癌。
29.权利要求26或27的方法，其中该NSCLC为鳞状细胞癌。
30.权利要求1-29任一项的方法，其中该c-met拮抗剂为拮抗性抗c-met抗体。
31.权利要求30的方法，其中该抗c-met抗体包含：(a)HVR1，其包含序列GYTFTSYWLH(SEQ ID NO:1)；(b)HVR2，其包含序列GMIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQ ID NO:2)；(c)HVR3-HC，其包含序列ATYRSYVTPLDY(SEQ ID NO:3)；(d)HVR1-LC，其包含序列KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID NO:4)；(e)HVR2-LC，其包含序列WASTRES(SEQ ID NO:5)；和(f)HVR3-LC，其包含序列QQYYAYPWT(SEQ ID NO:6)。
32.权利要求31的方法，其中该抗c-met抗体是单价的且包含：(a)第一多肽，其包含重链，所述多肽包含序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:11)；(b)第二多肽，其包含轻链，所述多肽包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:12)；和第三多肽，其包含Fc序列，所述多肽包含序列DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:13)，其中重链可变域和轻链可变域作为复合物存在且形成单一抗原结合臂，其中第一和第二Fc多肽在复合物中存在且形成Fc区，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比，该Fc区提高所述抗体片段的稳定性。
33.权利要求1-32任一项的方法，其中该c-met拮抗剂是crizotinib、tivantinib、carbozantinib、MGCD-265、ficlatuzumab、人源化TAK-701、rilotumumab、foretinib、h224G11、DN-30、MK-2461、E7050、MK-8033、PF-4217903、AMG208、JNJ-38877605、EMD1204831、INC-280、LY-2801653、SGX-126、RP1040、LY2801653、BAY-853474,和/或LA480中一项或多项。
34.权利要求33的方法，其中治疗与EGFR拮抗剂治疗组合。
35.权利要求34的方法，其中该EGFR拮抗剂为厄洛替尼(erlotinib)。
36.权利要求1-32任一项的方法，其中该c-met拮抗剂为onartuzumab且治疗进一步包含厄洛替尼治疗。
37.权利要求33的方法，其中该c-met拮抗剂为crizotinib、tivantinib、carbozantinib、MGCD-265、ficlatuzumab、人源化TAK-701、或foretinib，且治疗进一步包含厄洛替尼治疗。
38.一种用于测定c-met生物标志物表达的方法，包括测定患者的癌症是否具有高水平的c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达为蛋白质表达且使用IHC在来自该患者的样品中测定，其中高c-met生物标志物表达为50%或更多的肿瘤细胞具有中等c-met染色强度、组合的中等/高c-met染色强度或高c-met染色强度，其中使用c-met抗体检测c-met表达，其中c-met生物标志物表达指示当该患者用c-met拮抗剂治疗时该患者有可能具有延长的OS和/或PFS。
39.一种用于治疗具有癌症的患者的方法，包括在发现该患者的癌症具有大量的c-met生物标志物的情况中对该患者施用治疗有效量的c-met拮抗剂。
40.权利要求39的方法，其中该c-met拮抗剂为抗c-met抗体。
41.权利要求39的方法，其中该抗c-met抗体为onartuzumab。
42.权利要求39-41任一项的方法，其中使用免疫组织化学(IHC)在来自该患者的样品中测定c-met生物标志物蛋白质表达。
43.权利要求42的方法，其中IHC得分为至少2。
44.权利要求42的方法，其中高c-met生物标志物表达为50%或更多的肿瘤细胞具有中等c-met染色强度、组合的中等/高c-met染色强度或高c-met染色强度。
45.权利要求44的方法，其中相对于对照细胞团粒的c-met染色强度而言测定c-met表达染色强度。
46.权利要求45的方法，其中细胞系A549具有中等c-met染色强度。
47.权利要求45的方法，其中细胞系H441具有强c-met染色强度。
48.权利要求42的方法，其中c-met生物标志物表达为核酸表达且使用rtPCR、RNN-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、或FISH在来自该患者的样品中测定。
49.权利要求39-48任一项的方法，其中该患者具有相对于没有高c-met生物标志物的患者而言更大的PFS和/或OS。
50.一种用于治疗具有癌症的患者的方法，包括在发现该患者的癌症具有少量c-met生物标志物的情况中，对该患者施用治疗有效量的除c-met拮抗剂以外的药物。
51.权利要求50的方法，其中使用免疫组织化学(IHC)在来自该患者的样品中测定c-met生物标志物蛋白质表达。
52.权利要求51的方法，其中IHC得分为1或更低。
53.权利要求51的方法，其中低c-met生物标志物表达通过存在阴性c-met染色、少于50%的肿瘤细胞具有弱或组合的弱和中等c-met染色强度、或50%或更多的肿瘤细胞具有弱或组合的弱和中等c-met染色强度但少于50%的肿瘤细胞具有中等或组合的中等和强c-met染色强度来检测。
54.权利要求53的方法，其中相对于对照细胞团粒的c-met染色强度而言测定c-met表达染色强度。
55.权利要求54的方法，其中细胞系H1155具有阴性c-met染色。
56.权利要求54的方法，其中细胞系293具有低c-met染色强度。
57.权利要求50-56任一项的方法，其中该癌症为非小细胞肺癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、间皮瘤、黑素瘤、乳腺癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、头和颈癌、骨肉瘤、前列腺癌、或成胶质细胞瘤。
58.权利要求57的方法，其中该癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)。
59.权利要求58的方法，其中该NSCLC为二线或三线局部晚期或转移性非小细胞肺癌。
60.权利要求58或59的方法，其中该NSCLC为腺癌。
61.权利要求58或59的方法，其中该NSCLC为鳞状细胞癌。
62.权利要求2的方法，其中该患者具有NSCLC且用抗c-met抗体和EGFR拮抗剂的组合治疗。
63.权利要求62的方法，其中该EGFR拮抗剂为厄洛替尼。
64.权利要求6的方法，其中该患者具有NSCLC且用(a)onartuzumab，以每三周一剂约15mg/kg；和(b)厄洛替尼(N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉酰胺)，以三周周期每天一剂150mg治疗。
65.一种用于为癌症患者选择疗法的方法，包括测定该患者的癌症中c-met生物标志物的表达，并基于该生物标志物的表达水平选择癌症药物。
66.权利要求65的方法，其中如果该癌症样品以高水平表达该生物标志物的话，为该患者选择c-met拮抗剂治疗。
67.权利要求65的方法，其中如果该癌症样品以低水平或基本上检测不到的水平表达该生物标志物的话，为该患者选择用除c-met拮抗剂以外的癌症药物治疗。
68.一种为c-met抗体登广告的方法，包括对目标受众宣传该c-met抗体用于基于c-met生物标志物的表达来治疗癌症患者的用途。
69.权利要求68的方法，其中该宣传是通过伴随该抗c-met抗体的商业性配制剂的包装插页进行的。
70.权利要求68的方法，其中该宣传是通过伴随第二药物的商业性配制剂的包装插页进行的。
71.权利要求70的方法，其中该第二药物为EGFR拮抗剂。
72.权利要求71的方法，其中该抗c-met抗体为MetMAb且该EGFR拮抗剂为厄洛替尼。
73.权利要求68的方法，其中如果该癌症样品以高水平表达该生物标志物的话，为该患者选择c-met拮抗剂治疗。
74.权利要求68的方法，其中该宣传是通过包装插页来进行的，其中该包装插页提供接受抗c-met抗体连同EGFR拮抗剂的说明书。
75.权利要求74的方法，其中该宣传之后是在有或无该第二药物的情况中用该抗c-met抗体治疗该患者。
76.一种诊断试剂盒，其包含一种或多种用于测定来自NSCLC患者的样品中c-met生物标志物的表达的试剂，其中检测出大量的c-met生物标志物表示在用c-met拮抗剂治疗该患者时延长的PFS或OS，且其中检测出少量的或基本上检测不到的量的c-met生物标志物表示在用c-met拮抗剂治疗该患者时缩短的PFS。
77.权利要求76的诊断试剂盒，其进一步包含如果测定出大量的c-met生物标志物的话，使用该试剂盒来选择c-met药物以治疗该NSCLC患者的说明书。
78.一种制备权利要求76的诊断试剂盒的方法，包括在包装中组合包含癌症药物的药物组合物和包装插页，该包装插页指示该药物组合物用于基于c-met生物标志物的表达来治疗癌症患者。
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