RS58448B1

RS58448B1 - Antitela protiv antigena matičnih ćelija specifičan za prostatu i njihova upotreba

Info

Publication number: RS58448B1
Application number: RS20190218A
Authority: RS
Inventors: Michael Bachmann
Original assignee: Gemoab Monoclonals Gmbh
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2019-04-30
Also published as: TR201901991T4; ES2989975T3; EP3505536A1; PT2726507T; JP2019193652A; JP6549622B2; EP3505536B1; JP2014528696A; CY1121249T1; HRP20190289T1; US20140134155A1; JP2017104113A; JP2021121201A; SI2726507T1; US9200078B2; AU2012277784B2; DE102011118022B4; ES2711978T3; DE102011118022A1; EP2726507B1

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na rekombinantna antitela koja se vezuju za antigen matičnih ćelija specifičan za prostatu (PSCA) i njihovu primenu u dijagnostikovanju i terapiji. Ova antitela pogodna su za upotrebu u oblasti medicine, farmacije i biomedicinskog istraživanja.

[0002] Karcinom prostate je jedan od najčešćih razloga povezanih sa kancerom koji izazivaju smrt u Nemačkoj. Standardna terapija za primarni, organ-ograničen karcinom prostate trenutno je radikalna prostatektomija, tj. potpuno uklanjanja prostate, semenih vezikula, i limfnih čvorova. Kao alternativa tome je radioterapija koja se izvodi ozračivanjem prostate radioaktivnim materijalom (brahiterapija). Većina pacijenata sa primarnim, lokalnim karcinomom prostate mogu se uspešno tretirati radikalnom prostatektomijom i radioterapijom. Recidiv se javlja kod oko 20 − 40% obolelih osoba [Roehl 2004].

[0003] Trenutno, razvijaju se različite terapije na bazi antitela. U ovom kontekstu, suštinski je važno da se identifikuju ciljane strukture ćelija kancera koj mogu da služe kao mesta napada za terapeutske agense na bazi antitela. Pogodna ciljana struktura kao mesto napada za lečenje kancera prostate su površinski proteini koji su prisutni primarno u tkivu prostate i koji pokazuju prekomernu ekspresiju malignih ćelija u odnosu na zdrave ćelije.

[0004] Antigen matičnih ćelija specifičan za prostatu (PSCA) je takav površinski molekul koji je obično prisutan u ćelijama prostate i koji je eksprimiran u većoj stopi u ćelijama karcinoma prostate u poređenju sa zdravim tkivom (tumor-povezani antigen). Humani PSCA obuhvata 123 aminokiseline i ima N-terminalnu signalnu sekvencu, C-terminalnu glikozilfosfatidilinozitol (GPI) pričvršćujuću sekvencu i nekoliko mesta N-glikozilacije.

PSCA je uključen u Thy-1/Ly-6 familiju GPI-pričvršćenih ćelijski površinskih molekula jer, između ostalog, poseduje karakteristike sačuvanih cisteinskih ostataka ove familije [Reiter 1998].

[0005] Zbog povećane ekspresije u tumorima prostate, PSCA je pogodan ciljni molekul za terapiju kancera prostate i, sve do sad, razvijene su različite terapijske strategije koje su usmerene ka PSCA kao meta. Dokaz efikasnosti PSCA je da se terapeutska meta u terapiji kancera kod humanih subjekata proizvodi, između ostalog, vakcinisanjem dendritskim ćelijama u koje je prethodno uveden PSCA peptid. Klinička ispitivanja (faza 1 i 2) na 12 pacijenata koji boluju od kancera prostate koji je otporan na hormonsku i na hemoterapiju, pokazala su da je vakcinisanje PSCA peptid-uvedenim dendritskim ćelijama izazvalo T-ćelijski odgovor protiv PSCA koji su u proseku korelirali sa proširenom stopom preživljavanja kod pet pacijenata. Kod jednog pacijenta primećeno je čak i smanjenje mase tumora [Thomas-Kaskel 2006]. WO 2009/032949 A2 opisuje monoklonalna anti-PSCA antitela (1G8) koja se koriste za ciljanje tumora i za njihovo detektovanje. CDR regioni antitela imaju sledeće aminokiselinske sekvence:

[0006] Zbog citotoksičnih osobina 1G8 antitela, ono je nepogodno za strategije ciljanja koje su bazirane na grupisanju efektorskih ćelija (Gu 2005).

[0007] Antitela opisana u WO 2009/032949 A2 koriste se dijagnostički poželjno u obliku funkcionalnog mišjeg i humanizovanog monoklonalnog antitela kao i PSCA-speciﬁčnih minitela i dijatela obeleženim radionuklidima.

[0008] [Feldmann 2010] je ravio bispecifična rekombinantna antitela sa PSCA-vezujućim paratopom i CD3-vezujućim paratopom. PSCA-vezujući paratop bispecifičnih antitela izveden je od PSCA antitela 7F5 [Morgenroth 2007] i obuhvata CDR regione sa sledećim aminokiselinskim sekvencama:

[0009] Bispecifična antitela opisana u [Feldmann 2010] in vitro uspešno izazivaju specifičnu T-ćelijski posredovanu lizu PSCA-pozitivnih tumor ćelije. Za specifičnu lizu od oko 40% uključenih PSCA-pozitivnih tumor ćelija, za odnos efektorskih ćelija prema PSCA-pozitivnim tumor ćelijama od 20:1 najmanje 5 ng bispecifičnog antitela opisanog u [Feldmann 2010] treba da se primeni. In vitro, specifična liza od maksimalno oko 60% uključenih PSCA-pozitivnih tumor ćelije (u prisustvu 50 – 100 ng antitela) postignuto je sa antitelima opisanim u [Feldmann 2010]. Dalje povećanje efektivnosti ne može se dokazati. Čak i u prisustvu 1000 ng bispecifičnog antitela, ne može se lizirati veći deo PSCA-pozitivnih tumor ćelija.

[0010] Poznati in vitro i in vivo podaci pokazuju da PSCA ima velik potencijal kao ciljani antigen za immunoterapiju karcinoma prostate i pogodan je kao dijagnostička meta.

Predmet ovog pronalaska je da se obezbede poboljšana antitela protiv PSCA koja su terapeutski efektivna određenije u obliku bispecifičnih rekombinantnih antitela niske koncentracije i koja su u stanju da efektivno liziraju PSCA-pozitivne tumor ćelije.

[0011] Predmet se rešava prema ovom pronalasku antitelom koje se vezuju za antigen matičnih ćelija specifičan za prostatu (PSCA) (ovde takođe označeno kao anti-PSCA antitelo) koji sadrži regione koji određuju komplementarnost (CDR) sa sledećim aminokiselinskim sekvencama:

- CDR varijabilnog regiona lakog lanca: CDR1 SEQ ID No.1, CDR2 SEQ ID No.2, CDR3 SEQ ID No.3, i

- CDR varijabilnog regiona teškog lanca: CDR1 SEQ ID No.4, CDR2 SEQ ID No.5, CDR3 SEQ ID No.6.

[0012] Antitelo prema ovom pronalasku koje je okarakterisano gore pomenutim CDR-ovima ovde je takođe označeno jednostavno kao MB1. Pronalazači su neočekivano otkrili tokom opsežnog ispitivanja da antitelo prema ovom pronalasku u obliku rekombinantnih bispecifičnih antitela može da posreduje čak i uveoma malim količinama specifičnu lizu PSCA-pozitivnih tumor ćelija. Dalje, neočekivano je otkriveno da je specifična liza PSCA-pozitivnih tumor ćelija posredovana novim antitelima efektivnija. Tako, u in vitro testovima sa bispecifičnim antitelima koja sadrže anti-PSCA antitelo prema ovom pronalasku, više od 90% uključenih PSCA-pozitivnih tumor ćelija je lizirano. Sa novim anti-PSCA antitelom, količina uključenih antitela tako može značajno biti smanjena. U isto vreme, terapeutska efikasnost se povećava jer sa antitelom prema ovom pronalasku PSCA-pozitivne tumor ćelije mogu efektivnije bizi lizirane. Zbog niske koncentracije kojom se može postići efikasnost uz pomoć antitela prema ovom pronalasku, poboljšano ubijanje metastaziranih PSCA-pozitivnih ćelija takođe je moguće sa antitelom prema ovom pronalasku. Uporedni testovi sa anti-PSCA 7F5 iz stanja tehnike u uporedivom bispecifičnom konstruktu jasno potvrđuju superiornost antitela prema ovom pronalasku kako u in vitro (Fig.3) tako i u in vivo ispitivanjima (Fig.4).

[0013] Poželjno anti-PSCA antitela prema ovom pronalasku sadrže CDR regione kakvi su prethodno definisani u kojima aminokiselinska sekvenca varijabilnih regiona lakog i teškog lanca imaju identitet aminokiselinske sekvence od najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, naročito poželjno najmanje 95%, u odnosu na sledeću aminokiselinsku sekvencu:

- varijabilni region lakog lanca SEQ ID No.24, varijabilni region teškog lanca SEQ ID No. 26, ili

- varijabilni region lakog lanca SEQ ID No.20, varijabilni region teškog lanca SEQ ID No. 22.

[0014] Od njih, poželjna su ona anti-PSCA antitela sa CDR regionima kakvi su prethodno definisani čiji varijabilni regioni imaju humanizovanu strukturu. Naročito su poželjna anti-PSCA antitela čiji varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.24, a čiji varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.26.

[0015] Pojam "antitelo" u smislu ovog pronalaska obuhvata sva antitela ili fragmente antitela koji mogu da se vežu specifično za neki antigen. U slučaju rekombinantnih antitela, to su antitela koja se proizvode uz pomoć genetski modifikovanih organizama. Pojam antitelo obuhvata potpuno monoklonalna antitela kao i njihove epitop-vezujuće fragmente. U ovom kontekstu, epitop-vezujuć fragmenti (ovde takođe označeni kao fragmenti antitela) obuhvataju one delove antitela koji mogu da se vežu za antigen. Fragmenti antitela u smislu ovog pronalaska obuhvataju Fab, Fab', fa(ab’)2, Fd, jednolančane (jedno-lančane) varijabilne fragmente (scFv), jednolančana antitela, disulfid-vezane varijabilne fragmente (sdFv), i fragmente koji sadrže ili varijabilni region lakog lanca (VL) ili varijabilni region teškog lanca (VH). Fragmenti antitela sadrže varijabilne regione bilo same bilo u kombinaciji sa drugim regionima koji se biraju od regiona šarke i prvog, drugog, i trećeg regiona konstantnog regiona (CH1, CH2, CH3).

[0016] Pored toga, pojam antitelo obuhvata rekombinantna antitela, poput dijatela, triatela, i tetratela. Pojmom antitelo takođe su obuhvaćena himerna antitela kod kojih različiti delovi antitela potiču od različitih vrsta, na primer, antitela sa mišjim varijabilnim regionom koji je kombinovan sa humanim konstantnim regionom. Humanizovana antitela takođe su obuhvaćena pojmom antitelo. Cilj humanizacije antitela je smanjivanje imunogenost ksenogenog antitela, na primer mišjeg antitela, za upotrebu u humanom sistemu u kojem su saćuvani potpun vezujući afinitet i specifičnost prema antigenu. Humanizovana antitela mogu se proizvesti različitim poznatim postupcima, na primer, ponovnim dovođenjem na površinu i CDR graftovanjem. Kod ponovnog dovođenja na površinu, svi ne-CDR regioni na površini antitela modifikuju se kombinacijom molekulskog modelovanja, statističkim analizama, i mutagenezom, tako da izbiju na površinu antitela ciljanog organizma. Sa CDR grafovanjem, CDR regioni antitela koja se humanizuje, uvode se u humane varijabilne regione.

[0017] Fragmenti antitela su međusobno vezani ako je potrebn putem linkera. Taj linker obuhvata kratku peptidnu sekvencu (poželjno dužine od 10 do 50 aminokiselinskih ostataka) koja se bira tako da fragment antitela ima takvu trodimenzionalnu strukturu savijanja za VLi VHda ima antigen specifičnost potpunog antitela. Poželjni su glicin serinski linkeri ili linker peptidi sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID No.75 ili SEQ ID No.76.

[0018] Pojam “varijabilni region“ ovde značava delove teških i lakih lanaca antitela koji se razlikuju od antitela u njihovoj sekvenci i određuju specifičnost antitela i koji se vezuju svoj antigen. U ovom kontekstu, varijabilnost se ne distribuira ravnomerno u varijabilnom regionu, već je obično koncentrisana unutar tri definisana segmenta varijabilnog regiona, regiona koji određuju komplementarnost (CDR-ovi, koji su takođe označeni kao hipervarijabilni regioni) koji su sadržani u varijabilnim regionima lakog lanca kao i teškog lanca. Antigen vezujuće mesto antitela, takozvani paratop, okarakterisano je hipervarijabilnim regionima (CDR) lakog i teškog lanca antitela.

[0019] Za opisivanje antitela ovde se takođe koristi pojednostavljen naziv anti-"antigen" antitelo kako bi s pokazalo da je to neko antitelo koje se specifično vezuje za antigen definisan u nazivu. Na primer, “anti-PSCA” antitelo u smislu ovog pronalaska smatra se antitelom koje se specifično vezuje za antigen PSCA. Specifično vezivanje antitela za specifični antigen podrazumeva da se antitelo sa visokim afinitetom vezuje za specifični antigen i vezuje sa značajno nižim afinitetom, a poželjno ne vezuje, za druge antigene.

[0020] Poželjno antitela su prisutna u obliku scFv fragmenta ili F(ab‘)2fragmenta. Dalje poželjno, antitela su bispecifična antitela koja se proizvode rekombinantno i koja sadrže dva različita paratopa sa jednim usmerenim prema PSCA i drugim koji nije usmeren prema PSCA. Drugi paratop bispecifičnog antitela poželjno je usmeren prema površinskoj strukturi efektorske ćelije ili protiv peptida dužine od 10 do 50 aminokiselina (poželjno sekvenca humanog La-proteina dužine od 10 do 50 aminokiselina, naročito poželjno prema peptidu sa jednom od aminokiselinskih sekvenci prema SEQ ID No.75 ili SEQ ID No.76).

[0021] Anti-PSCA antitela prema ovom pronalasku (naivna ili rekombinantna antitela) sa konjugovanom efektorskom grupom su poželjna. U ovom smislu, konjugacija je odnosi na kuplovanje supstance, ovde efektorske grupe, za antitelo. Veza antitela sa efetroskom grupom poželjno se proizvodi rekombinantnom ekspresijom u obliku fuzionog proteina ili in vitro postupcima u kojima je efetroska grupa poželjno vezana hemijskim veznim grupama za antitelo (na primer, thioetaske veze ili disulfidne veze). One se takođe mogu vezati za antitelo intermedijernim molekulom nosačem, na primer, serumskim albuminom. Ukoliko je potrebno, antitelo prema ovom pronalasku sadrži nekoliko efetroskih grupa. U ovom kontekstu, efetroske grupe poželjno se biraju od aktivnih sastojaka, peptida (dužine od 10 do 100 aminokiselina), proteina (dužine od više od 100 aminokiselina), ko-stimulišućih molekula, boja i kontrastnih medijuma.

[0022] Poželjno anti-PSCA antitela prema ovom pronalasku konjuguju se sa aktivnim sastojcima, tj., sa farmaceutski efektivnim supstancama. Poželjno aktivni sastojci obuhvataju toksine, poželjno citostatične agense; od njih, poželjno se biraju: maitansinoidi i analozi maitansinoida, taksoidi, CC-1065 i CC-1065 analozi, dolastatin i analozi dolastatina, metotreksat, daunorubicin, doksorubicin, vincristin, vinblastin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil i kaliheamicin.

[0023] Dalje poželjna anti-PSCA antitela prema ovom pronalasku konjugovan sa kontrasnim medijumima. Poželjni kontrasni medijumi su radionuklidi; od kojih su poželjni radioaktivni izotopi tehnecijum, renijum, itrijum, bakar, galijum, indijum, bizmut i platina, određenije<99m>Tc,<90>Y,<186>Re,<188>Re,<68>Ga, i<111>In.

[0024] Dalje poželjna anti-PSCA antitela prema ovom pronalasku konjugovana su sa proteinom, poželjno enzimom, poželjno enzimom pogodnim za ADEPT sistem, kostimulišućim molekulom, poželjno tolični receptor ligand, od kojih je poželjan CpG, ili sa nukleinskom kiselinom.

[0025] Dalje poželjna anti-PSCA antitela prema ovom pronalasku konjugovana su sa bojama, poželjno fluorescentnim bojama.

[0026] Dalje poželjna antitela prema ovom pronalasku konjugovana su sa peptidom koji sadrži vezujući region za koji se antitelo specifično za taj peptid specifično vezuje. Poželjno, taj peptid obuhvata peptidnu sekvencu dužine od 10 do 50 aminokiseline alfa-helikoidni region humanog La-proteina (aminokiselinska sekvenca humanog La-proteina koja odgovara SEQ ID No.77). Naročito poželjni su peptidi sa identitetom aminokiselinske sekvence od najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, naročito poželjno najmanje 99%, u odnosu na jednu od aminokiselinskih sekvenci prema SEQ ID No.75 ili SEQ ID No.76.

[0027] Naročito je poželjno da se proizvedu anti-PSCA antitela prema ovom pronalasku rekombinacijom. Poželjno, rekombinantna anti-PSCA antitela prema ovom pronalasku sadrže najmanje dve različite vezujuće jedinice, u kojima

- najmanje jedna od vezujućih jedinica specifično se vezuje za PSCA i sadrži paratop anti-PSCA antitela prema ovom pronalasku, i

- najmanje jedna druga od vezujućih jedinica specifično se vezuje za antigen različit od PSCA, poželjno za površinsku strukturu efektorske ćelije.

[0028] Prema tome, PSCA-vezujuća vezujuća jedinica obuhvata anti-PSCA antitelo prema ovom pronalasku i prema tome sadrži najmanje sledeće CDR regione:

- CDR varijabilnog regiona lakog lanca koji obuhvata sledeće aminokiselinske sekvence: CDR1 SEQ ID No.1, CDR2 SEQ ID No.2, CDR3 SEQ ID No.3, i - CDR varijabilnog regiona teškog lanca koji obuhvata sledeće aminokiselinske sekvence: CDR1 SEQ ID No.4, CDR2 SEQ ID No.5, CDR3 SEQ ID No.6

[0029] Pojam "vezujuća jedinica" u smislu ovog pronalaska odnosi se na bilo koju molekulsku strukturu koja se specifično vezuje za definisane supstance ili strukture. Zavisno od supstance ili strukture za koju se vezuje, vezujuća jedinica ima različite strukture. Prema tome, pojam "vezujuća jedinica" u smislu ovog pronalaska obuhvata antitela (u ovom slučaju vezujuća jedinica sadrži najmanje funkcionali paratop antitela) kao i druge molekule, poželjno proteine koji obrazuju specifičnu vezu sa antigenom. Takvi molekuli poželjno su ligandi koji se specifično vezuju za površinsku strukturu (na primer, površinski receptor) na ćeliji, određenije efektorskim ćelijama.

[0030] Poželjno vezujuće jedinice koje su uključene u antitelima prema ovom pronalasku specifično se vezuju za efektorsku ćeliju. Definicija efektorskih ćelija u smislu ovog pronalaska obuhvata sve ćelije nativnog i adaptivnog imunog sistema koji obezbeđuje imune odgovore ili su u njemu aktivno uključene. Poželjno, efektorska ćelija bira se od T-limfocita, NK ćelija, monocita, makrofaga, dendritskih ćelija, i granulocita. Naročito poželjne su vezujuće jedinice which se vezuju prema površinskim strukturama na T-limfocitima.

[0031] Kada rekombinantno antitelo prema ovom pronalasku sadrži najmanje dva različita antitela (najmanje jedno anti-PSCA antitelo prema ovom pronalasku i najmanje jedno drugo antitelo koje se ne vezuje specifično za PSCA), ono je poželjno u obliku dijatela, triatela ili tetratela. Poželjna su bispecifična antitela iz jednolančanog antitela (jednolančano bispecifično dijatelo, scBsDb) ili bispecifična tandem antitela iz jednolančanih antitela (jednolančano bispecifično tandem antitelo, scBsTaFv). Naročito je poželjno da je rekombinantno antitelo prema ovom pronalasku prisutno u obliku scBsTaFv.

[0032] Poželjno antitela koja se ne vezuju za PSCA-vezujuća antitela koja su sadržana u rekombinantnom antitelu prema ovom pronalasku (u ovom slučaju rekombinantno antitelo je bispecifično antitelo) su antitela koja se vezuju specifično za površinsku strukturu efektorske ćelije. U ovom slučaju vezujuća jedinica koja se ne vezuje za PSCA sadrži najmanje paratop antitela koja se vezuju za površinsku strukturu efektorske ćelije. Naročito je poželjno da su antitela usmerena prema sledećim površinskim strukturama na efektorskim ćelijama: CD3, CD8, CD4, CD25, CD28, CD16, NKG2D, NKp46, NKp44, aktivirajući KIR receptori (aktivirajući imunoglobulinski receptori koji ubijaju ćelije). Naročito su poželjna antitela koja su usmerena prema CD3 (anti-CD3 antitelo), u kojima anti-CD3 antitelo sadrži CDR regione sa sledećim aminokiselinskim sekvencama:

- CDR varijabilnog regiona teškog lanca: CDR1 SEQ ID No.66, CDR2 SEQ ID No.

67, CDR3 SEQ ID No.68, i

- CDR varijabilnog regiona lakog lanca: CDR1 SEQ ID No.58, CDR2 SEQ ID No.59, CDR3 SEQ ID No.60.

[0033] Dalje su poželjna rekombinantna anti-PSCA antitela koja sadrže najmanje dve različite vezujuće jedinice u kojima najmanje jedna druga od vezujućih jedinica je ligand (poželjno protein ili glikan) koji se specifično vezuje za površinsku strukturu efektorske ćelije. Poželjno ligandi utiču na aktivnost efektorskih ćelija njihovim vezivanjem za (efektorsku) ćelijsku površinu. U ovom kontekstu, ligand se bira tako da se specifično vezuje za površinske strukture efektorskih ćelija i, vezivanjem, okida signalne kaskade za aktivaciju efektorskih ćelija. Kako je ligan poželjno proteinska struktura ili glikan koji se specifično vezuje za receptor koji je eksprimiran specifično na površini efektorskih ćelija, gde ligand, zbog njegove vezujuće aktivnosti, na receptorima izaziva aktivaciju efektorske ćelije. Naročito je poželjno da se proteinske strukture biraju od ULB-Ps (npr. ULB-P2), MICA, MICB, i citokina (na primer IL2 i IL15).

[0034] Antitela prema ovom pronalasku, određenije rekombinantna antitela prema ovom pronalasku, pogodna su za specifično vezivanje za PSCA-pozitivne ćelije in vivo i in vitro. Prema tome, ovaj pronalazak takođe obuhvata anti-PSCA antitela prema ovom pronalasku za upotrebu kao lek, određenije za lečenje tumorskih bolesti, kancera prostate, ili kao dijagnostički agens.

[0035] Ovaj pronalazak dalje obuhvata antitela prema ovom pronalasku za terapiju tumorskih bolesti, određenije kancera prostate. Poželjna terapeutska upotreba (poželjno rekombinantnih) antitela prema ovom pronalasku je lečenje tumorskih bolesti, poželjno kancera prostate. U terapeutskoj primeni, antitela prema ovom pronalasku požejno su uključena za ciljanje tumorskog tkiva terapeutski efektivnom supstancom ili efektorskim ćelijama. Za ciljanje tumorskog tkiva terapeutski efektivnom supstancom, poželjno se koriste rekombinantna antitela prema ovom pronalasku koja su konjugovana sa aktivnim sastojkom. Za ciljanje tumorskog tkiva sa efektorskim ćelijama, poželjno se koriste rekombinantna antitela prema ovom pronalasku koja sadrže najmanje dve različite vezujuće jedinice, u kojima najmanje jedna od vezujućih jedinica je anti-PSCA antitelo prema ovom pronalasku, a druga od vezujućih jedinica specifično se vezuje za efektorsku ćeliju, poželjno za CD3 na T ćelijama. Prethodno pomenuta antitela koriste se poželjno u ove svrhe.

[0036] Farmaceutska kombinacija koja sadrži antitelo prema ovom pronalasku zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem ili nosačem, takođe je obuhvaćena ovim pronalaskom. Poželjno, farmaceutska kombinacija prema ovom pronalasku daje se u obliku pogodnom za intravenozno davanje.

1

[0037] Poželjno, antitela su prisutna u farmaceutskoj kombinaciji prema ovom pronalasku u rekombinantnom obliku kao himerna ili, naročito poželjno, humanizovana antitela sa smanjenom imunogenosti.

[0038] Farmaceutske kombinacije prema ovom pronalasku obuhvataju različite dozne oblike i poželjno su pogodne za parenteralno, naročito poželjno za intravenozno davanje. Poželjno, parenteralna farmaceutska kombinacija je u obliku za davanje koji je pogodan za pacijenta. Prema tome, naročito poželjne farmaceutske kombinacije su rastvori, emulzije ili suspenzije antitela u farmaceutski prihvatljivom razblaživaču ili nosaču.

[0039] Farmaceutski prihvatljivi nosači poželjno su sterilne tečnosti, određenije voda, puferovana voda, 0.4% slani rastvor, 0.3% glicin i slično. Farmaceutske kombinacije sterilišu se na uobičajeni način, dobro poznatim tehnologijama. Kombinacije poželjno sadrže farmaceutski prihvatljive ekscipijense kao što su oni potrebni za obezbeđivanje probližno fizioloških uslova i/ili za povećanje stabilnosti antitela sadržanih u kombinacijama kao što su agensi za podešavanje pH vrednosti i puferujući agensi, agensi za podešavanje toksičnosti i slično, koji se poželjno biraju od natrijum acetata, natrijum hlorida, kalijum hlorida, kalcijum hlorida, i natrijum laktata.

[0040] Farmaceutska kombinacija poželjno je injektabilan puferovan rastvor koji sadrži između 0.1 do 500 mg/ml antitela, naročito poželjno između 0.1 do 250 mg/ml antitela, određenije zajedno sa 1 do 500 mmol/l puferujućeg agensa. Injektabilni rastvor požejno je u obliku tečnog ili liofilizovanog doznog oblika. Puferujući agens poželjno se bira od histidina, natrijum sukcinata, natrijum citrata, natrijum fosfata i kalijum fosfata.

[0041] Poželjno, farmaceutska kombinacija prema ovom pronalasku sadrži najmanje dva različita (poželjno rekombinantn) antitela, u kojima je sadržano najmanje jedno anti-PSCA antitelo prema ovom pronalasku, i najmanje jedno drugo rekombinantno antitelo koje formira specifičnu vezu sa anti-PSCA antitelom prema ovom pronalasku. Naročito su poželjne sledeće kombinacije:

a) rekombinantno anti-PSCA antitelo koje je konjugovano sa peptidom dužine od 10 do 50 aminokiselina i još jedno rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za tim peptidom, ili

b) bispecifičo anti-PSCA antitelo koje sadrži, dodatno, antitelo koje se vezuje za peptid dužine od 10 do 50 aminokiselina i još jedno rekombinantno antitelo koje se vezuje protiv antigena različitog od PSCA i koje sadrži peptid za koji se vezuje bispecifično anti-PSCA antitelo.

[0042] Najmanje dva različita antitela su prisutna poželjno odvojeno zapakovana u farmaceutskoj kombinaciji prema ovom pronalasku.

[0043] Poželjno, farmaceutska kombinacija koja sadrži kombinaciju opisanu pod a) obuhvata:

- rekombinantno anti-PSCA antitelo koje je konjugovano sa peptidom, koje sadrži neku aminokiselinsku sekvencu, dužine od 10 do 50 aminokiselina, alfa-helikoidnog regiona humanog La-proteina (aminokiselinska sekvenca humanog La-proteina koja odgovara SEQ ID No.77). Poželjno, anti-PSCA antitelo je konjugovano sa peptidom sa identitetom aminokiselinske sekvence od najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, naročito poželjno najmanje 99%, u odnosu na jednu od aminokiselinskih sekvenci prema SEQ ID No.75 ili SEQ ID No.76.

- dalje (poželjno rekombinantno) antitelo koje sadrži paratop, koje se vezuje specifično protiv peptida anti-PSCA antitela i koje sadrži još jednu vezujuću jedinicu koja se specifično vezuje za površinsku strukturu efektorske ćelije. Poželjno, njegove vezujuće jedinice odgovaraju onima koje su prethodno opisane. U slučaju da je rekombinantno anti-PSCA antitelo konjugovano sa peptidom sa identitetom aminokiselinske sekvence od najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, naročito poželjno najmanje 99%, u odnosu na jednu od aminokiselinskih sekvenci prema SEQ ID No.75 ili SEQ ID No.76, drugo rekombinantno antitelo sadrži poželjno sledeće aminokiselinske sekvence kao paratop koji se vezuje za taj peptid:

o CDR varijabilnog regiona lakog lanca: CDR1 SEQ ID No.78, CDR2 SEQ ID No. 79, CDR3 SEQ ID No.80, i CDR varijabilnog regiona teškog lanca: CDR1 SEQ ID No.81, CDR2 SEQ ID No.82, CDR3 SEQ ID No.83 (ovde takođe označen i kao "5B9" paratop ), ili

o CDR varijabilnog regiona lakog lanca: CDR1 SEQ ID No.84, CDR2 SEQ ID No. 85, CDR3 SEQ ID No.86, i CDR varijabilnog regiona teškog lanca: CDR1 SEQ ID No.87, CDR2 SEQ ID No.88, CDR3 SEQ ID No.89 (ovde takođe označen kao "7B6" paratop).

[0044] Njihove poželjne kombinacije su

- anti-PSCA antitelo koje sadrži peptid sa identitetom aminokiselinske sekvence od najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, naročito poželjno najmanje 99%, u odnosu na jednu od aminokiselinskih sekvenci prema SEQ ID No.75 sa još jednim antitelom koje sadrži 5B9 paratop, ili

- anti-PSCA antitelo koje sadrži peptid sa identitetom aminokiselinske sekvence od najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, naročito poželjno najmanje 99%, u odnosu na jednu od aminokiselinskih sekvenci prema SEQ ID No.76 sa još jednim antitelom koje sadrži ovaj 7B6 paratop.

[0045] Poželjno, farmaceutska kombinacija koja sadrži kombinaciju opisanu pod b) obuhvata:

- Još jedno antitelo koje se specifično vezuje za površinsku strukturu efektorske ćelije i sadrži neku aminokiselinsku sekvenca, dužine od 10 do 50 aminokiselina, alfahelikoidnog regiona humanog La-proteina, poželjno peptid sa identitetom aminokiselinske sekvence od najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, naročito poželjno najmanje 99%, u odnosu na jednu od aminokiselinskih sekvenci prema SEQ ID No.75 ili SEQ ID No.76.

- Bispecifično anti-PSCA antitelo koje je konjugovano sa antitelom koje specifično vezuje aminokiselinsku sekvencu, dužine od 10 do 50 aminokiselina, alfa-helikoidnog regiona humanog La-proteina. U slučaju da drugo rekombinantno antitelo sadrži peptid sa identitetom aminokiselinske sekvence od najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, naročito poželjno najmanje 99%, u odnosu na jednu od aminokiselinskih sekvenci prema SEQ ID No.75 ili SEQ ID No.76, bispecifič anti-PSCA antitelo poželjno sadrži 5B9 paratop ili 7B6 paratop kakvi su prethodno definisani.

[0046] Njihove poželjne kombinacije su

- bispecifično anti-PSCA antitelo koje sadrže 5B9 paratop i još jedno rekombinantno antitelo koje sadrži peptid sa identitetom aminokiselinske sekvence od najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, naročito poželjno najmanje 99%, u odnosu na jedno od aminokiselinskih sekvenci prema SEQ ID No.75, ili

- bispecifično anti-PSCA antitelo koje sadrže 7B6 paratop i još jedno rekombinantno antitelo koje sadrži peptid sa identitetom aminokiselinske sekvence od najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, naročito poželjno najmanje 99%, u odnosu na jednu od aminokiselinskih sekvenci prema SEQ ID No.76.

1

[0047] Poželjna dijagnostička upotreba je in vivo dijagnostikovanje u kojem se anti-PSCA antitelo prema ovom pronalasku konjugovano sa kontrastnim medijumom koristi za ciljani transport kontrastnog medijuma do tumorskog tkiva. Dalja poželjna dijagnostička upotreba anti-PSCA antitela prema ovom pronalasku je in vitro dijagnostikovanje u kojem se poželjno anti-PSCA antitelo prema ovom pronalasku konjugovano sa bojom koristi za detekciju PSCA-pozitivnih ćelija u uzorku, naročito uzorku tkiva.

[0048] Ovaj pronalazak takođe obuhvata dijagnostičku kombinaciju koja sadrži anti-PSCA antitelo prema ovom pronalasku. Anti-PSCA antitelo je u njemu poželjno prisutno u puferovanom rastvoru, poželjno u puferovanom slanom rastvoru.

[0049] Ovaj pronalazak takođe obuhvata nukleinsku kiselinu čija nukleotidna sekvenca kodira anti-PSCA antitelo prema ovom pronalasku. Poželjno, segmenti tog koda za CDR varijabilnih regiona lakog i teškog lanca sadrže sledeće nukleotidne sekvence:

- CDR varijabilnog regiona lakog lanca: CDR1 SEQ ID No.7, CDR2 SEQ ID No.9, CDR3 SEQ ID No.11, i CDR varijabilnog regiona teškog lanca: CDR1 SEQ ID No.

13, CDR2 SEQ ID No.15, CDR3 SEQ ID No.17, ili

- CDR varijabilnog regiona lakog lanca: CDR1 SEQ ID No.8, CDR2 SEQ ID No.10, CDR3 SEQ ID No.12, i CDR varijabilnog regiona teškog lanca: CDR1 SEQ ID No.

14, CDR2 SEQ ID No.16, CDR3 SEQ ID No.18.

[0050] Pojam "nukleinske kiseline" u smislu ovog pronalaska obuhvata pored deoksiribonukleinske kiseline (DNK) i ribonukleinske kiseline (RNK) takođe i druge linearne polimere u kojima su baze adenin (A), citozin (C), gvanin (G), i timin (T) ili uracil (U) složene u pogodnoj sekvenci (sekvenca nukleinske kiseline). Ovaj pronalazak tako takođe obuhvata odgovarajuće RNK sekvence (u kojima je timin zamenjen sa uracilom), komplementarne sekvence, i sekvence sa modifikovanom kičmom nukleinske kiseline ili 3’ ili 5' terminusima. U ovom kontekstu, pojam “sekvenca nukleinske kiseline sa modifikovanom kičmom“ obuhvata sve druge linearne polimere u kojima su baze adenin (A), citozin (C), gvanin (G), i timin (T) ili uracil (U) složene u pogodnu sekvencu, kao što su npr. sekvence sa fosfotioatom, fosfoamidatom ili O-metil-izvedenom kičmom, peptid nukleinske kiseline (PNK), i zaključane nukleinske kiseline (LNK), ili mešane kičme. U ovom kontekstu, pojam “modifikovan 3’ ili 5’ terminus“ obuhvata modifikacije koje služe za stabilizaciju kao i vezivanje markera. Primeri markera su enzimi, boje ili fluorescentne boje, radionukleotidi, kao i hapteni, kao npr. digoksigenin ili biotin.

[0051] Ovaj pronalazak takođe obuhvata vektor (takođe: "ekspresioni vektor") koji sadrži nukleinsku kiselinu prema ovom pronalasku. U smislu ovog pronalaska, ekspresioni vektor se shvata kao plazmid, virus ili drugi nosač koji sadrže sekvencu nukleinske kiseline prema ovom pronalasku rekombinacijom putem umetanja ili uključivanja. Ekspresioni vektor sadrži tipično početnu tačku replikacije, promoter, kao i specifične genske sekvence koje omogućavaju odabir fenotipa ćelija domaćina koje sadrže taj ekspresioni vektor.

[0052] Ovaj pronalazak dalje obuhvata ćeliju domaćina ili ne-humani organizam domaćin koji sadrže nukleotidnu sekvencu prema ovom pronalasku ili vektor prema ovom pronalasku. U ovom kontekstu, nukleotidna sekvenca ili vektor rekombinantno su sadržani u ćeliji domaćinu ili ne-humanom organizmu domaćinu.

[0053] Ćelija domaćin u smislu ovog pronalaska je prirodno javljajuća ćelija ili transformisana ili genetski modifikovana ćelijska linija koja sadrži najmanje jedan vektor prema ovom pronalasku. Ovaj pronalazak obuhvata u ovom kontekstu prelazne transfektante (npr., mRNK injektovanjem) ili ćelije domaćine u kojima je najmanje jedan ekspresioni vektor prema ovom pronalasku uključen plazmid ili veštački hromozom, kao i ćelije domaćine u kojima je ekspresioni vektor prema ovom pronalasku integrisan stabilno u genom domaćina.

[0054] Ćelija domaćin poželjno se bira od ćelije prokariota i eukariota. Humane embrionske matične ćelije koje se dobijaju uništavanjem embriona nisu ćelije domaćini u smislu ovog pronalaska. Poželjno prokariotske ćelije biraju se od ćelija Escherichia coli i Bacillus subtilis. Poželjno eukariotske ćelije bitaju se od ćelija kvasca (poželjno Saccharomyces cerevisiae ili Pichia pastoris), ćelija insekata, ćelija amfibija i ćelija sisara (poželjno CHO, HeLa, HEK293).

[0055] Ne-humani organizmi domaćini sadrže vektor prema ovom pronalasku koji je integrisan stabilno u genom organizma domaćina ili pojedinačnih ćelija organizma domaćina. Poželjno organizmi domaćin si biljke, beskičmenjaka ili kičmenjaka, određenije Bovidae, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Xenopus laevis, medaka ribice, zebrice ili Mus musculus, ili ćelija ili embriona navedenih organizama.

1

[0056] Ovaj pronalazak obezbeđuje anti-PSCA antitela i odgovarajuće eskpresione sisteme sa kojima se PSCA mogu vezati na efikasniji način. Na ovaj način, anti-PSCA antitelo prema ovom pronalasku naročito je pogodno za primenu u terapeutskom sistemu kojim se ubijanje tumorskih ćelija može posredovati gupisanjem efektorskih ćelija. Zbog većeg afiniteta antitela prema ovom pronalasku prema PSCA, suštinski manja količina antitela potrebna je za vezivanje (na primer, u terapeutskoj upotrebi). Pokazano je da anti-PSCA antitelo prema ovom pronalasku može da posreduje specifičnu lizu PSCA-pozitivnih tumorskih ćelija pri znatno nižim koncetracijama i sa značajno većom efikasnošću. To ima, sa jedne strane, troškovne prednosti jer se potrošnja antitela može smanjiti. Sa druge strane, u terapeutskoj upotrebi očekuje se poboljšano ciljanje primarnih i metastaziranih ćelija kao i manje sporednih efekata a zbog manjih količina koje se daju.

[0057] Ovaj pronalazak biće detaljnije opisan uz pomoć sledećih slika nacrta i primera izvođenja koji ni na koji način ne ograničavaju ovaj pronalazak.

Fig. 1 Šematski prikaz različitih rekombinantnih antitela prema ovom pronalasku. A) Bispecifično antitelo u obliku scBsTaFv koja sadrže vezujuću jedinicu protiv PSCA i vezujuću jedinicu protiv CD3. B) Rekombinantno antitelo prema ovom pronalasku protiv PSCA koje sadrži peptidni tag (5B9), za upotrebu sa takođe prikazanim bispecifičnim antitelom u obliku scBsTaFv koje sadrže vezujuću jedinicu protiv CD3 i vezujuću jedinicu protiv 5B9 regiona humanog La-proteina. C) Rekombinantno antitelo prema ovom pronalasku protiv PSCA koje sadrži peptidni tag (7B6), za upotrebu sa takođe prikazanim bispecifičnim antitelom u obliku scBsTaFv koje sadrži vezujuću jedinicu protiv CD3 i vezujuću jedinicu protiv 7B6 regiona humanog Laproteina. Respektivne VHi VLsubjedinice vezane su linker peptidima sa aminokiselinskim sekvencama prikazanim na crtežima.

Fig. 2 SDS PAGE rekombinantnih antitela. Traka 1: bispecifično humanizovano antitelo CD3-7B6 (scBsTaFv CD3-7B6); traka 2: bispecifična humanizovana antitela CD3-5B9 (scBsTaFv CD3(G4S)-5B9); traka 3: bispecifično mišje antitelo CD3-PSCA(7F5) prema ovom pronalasku (scBsTaFv CD3-PSCA(7F5)); traka 4: monospecifično humanizovano antitelo scFv PSCA(MB1)-7B6 prema ovom pronalasku; traka 5: bispecifična humanizovana antitela CD3-PSCA(MB1) (scBsTaFv CD3-PSCA(MB1)); traka 6: monospecifično humanizovano antitelo scFv PSCA(MB1)-5B9 prema ovom

1

pronalasku. M … marker sa veličinama fragmenta (od vrha ka dnu): 70 kDa, 55 kDa, 40 kDa, 35 kDa, 25 kDa, 15 kDa.

Fig. 3 Specifična liza<51>Cr-uvedene PC3-PSCA tumor ćelijama u testu prema primeru 4.

Stubovi odgovaraju sledećim testovima: 1 (crni) … humanizovano bispecifično scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) iz Primera 1; 2 (beli) … mišje bispecifičnono scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) iz Primera 1; 3 (šrafiran) … humanizovano bispecifično scBsTaFv CD3-PSCA(7F5) (uporedni primer); 4 (tačkasti) … mišje bispecifično scBsTaFv CD3-PSCA(7F5) (uporedni primer).

Fig. 4 Formirana površina tumora posle transfera PSCA-pozitivnih tumor ćelija, T ćelija i antitela, kako je opisano u Primeru 5. A) Efektorski ciljani odnos 1:1; B) Efektorski ciljani odnos 10:1. Numerisane linije odgovaraju sledećim testovima: 1 … bispecifično kontrolno antitelo anti-CD3xanti-5B9 (kontrola); 2 … monospecifično humanizovano scFv anti-PSCA(MB1) iz Primera 1 (kontrola); 3 … kontrolni test bez antitela (negativna kontrola); 4 … humanizovano bispecifično scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) iz Primera 1 (prema ovom pronalasku); 5 … humanizovano bispecifično scBsTaFv CD3-PSCA(7F5) kako je opisano u Primeru 3 (uporedni primer); 6 … humanizovano bispecifično scBsDb CD3xPSCA(7F5) koje sadrži PSCA-vezujuće varijabilne regione 7F5 antitelo (uporedni primer).

Primer 1: Priprema bispecifičnih rekombinantnih antitela (scBsTaFv) koja se specifično vezuju za PSCA (direktno ciljanje)

[0058] Za upotrebu u ciljanju PSCA<+>ćelija, bispecifično antitelo (jednolančano bispecifično dijatelo, scBsTaFv) pripremljeno je koje se vezuje jednom vezujućom jedinicom za PSCA i drugom vezujućom jedinicom za CD3. Bispecifično antitelo ovde je takođe jednostavnije naznavo CD3-PSCA(MB1) i šematski je prikazano na Fig.1A.

[0059] PSCA-vezujući domen sadrži varijabilni region anti-PSCA MB1 antitela prema ovom pronalasku (mišje anti-PSCA antitelo: težak lanac SEQ ID No.22, laki lanac SEQ ID No.20; humanizovano anti-PSCA antitelo: težak lanac SEQ ID No.26, laki lanac SEQ ID No.24). Ono služi za vezivanje za PSCA-pozitivne tumor ćelije. Drugi domen vezuje se za CD3, komponentu T ćelijskog receptorskog kompleksa, i služi za aktivaciju T ćelija. To omogućava gupisanje T ćelija za PSCA-pozitivne ćelije i posreduje na ovaj način specifičnu lizu PSCA-

1

pozitivnih ćelija T ćelijama.

[0060] Za generisanje monoklonalnih anti-PSCA MB1 antitela, H-2d pozitivni C3Hx Balb/C F1 miševi imunizovani su sa P815 ćelijama, pri čemu je PSCA rekombinantno eksprimirano na površini. Fuzijom ćelija slezine i ćelija mijeloma, generisane su ćelije hibridoma koje luče monoklonalna anti-PSCA antitela. Nakon jednog kloniranja ovih ćelija hibridoma, omogućeno je biranje klona MB1. Za generisanje rekombinantnih anti-PSCA MB1 antitela identifikovane su sekvence nukleinske kiseline varijabilnnog domena teškog (VH) i lakog (VL) lanca antitela. U ove svrhe, prvo je izolovana mRNK iz ćelija hibridoma koje luče anti-PSCA MB1 i transkriprovane sa cDNK. Zatim je varijabilni domen teškog lanca izotipa IgG1 amplifikovan degenerisanim prajmerima (prajmerski par SEQ ID No.90 i 91) kao i varijabilni domen lakog κ lanca pomoću degenerisanih prajmera (prajmerski par SEQ ID No.92 i 93). PCR proizvodi su subklonirani u vektoru pGEM T-easy i sekvencionisani.

[0061] Za kloniranje mišjih jednolančanih fragmenata (scFv) anti-PSCA MB1 antitela (ovde označena kao "scFv MB1"), u kojima je varijabilni region teškog lanca vezan uz pomoć tri glicin-serinska linkera (G4S, SEQ ID No.131) sa varijabilnim regionom lakog lanca, sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca anti-PSCA MB1 antitela amplifikovana pomoću prajmerskog para prema SEQ ID No.94 i 95. Sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca anti-PSCA MB1 antitela amplifikovana pomoću prajmerskog para prema SEQ ID No.96 i 97. Amplifikovane nukleinske kiseline fuzionisane su preklapanjem PCR za scFv PSCA MB1 i klonirane putem SfiI i NotI u eukariotskiom ekspresionom vektoru pSecTag2B (ekspresioni vektor ovde je takođe označen i kao "pSecTag2B_scFv MB1 mišji").

[0062] Za kloniranje bispecifičnog tandem antitela (scBsTaFv) koje je usmereno prema PSCA i CD3 i koje sadrži CDR regione mišjeg MB1 antitela, sekvenca nukleinske kiseline mišjeg anti-CD3 scFv amplifikovana je sa prajmerskim parom prema SEQ ID No.98 i 99 i putem ili ApaI 3'-terminalno kloniranim iz mišjeg scFv MB1 u prethdono proizveden ekspresioni vektor "pSecTag2B_scFv MB1 mišji" tako da je generisan vektor "pSecTag2B_ scBsTaFv PSCA (MB1)-CD3 mišji".

[0063] Za kloniranje bispecifičnog tandem antitela (scBsTaFv) koje je usmereno prema PSCA i CD3 i koje sadrži CDR regione humanogizovanog MB1 antitela, regioni okvira (FWR)

1

PSCA MB1 i CD3 antitela su humanizovana. U ove svrhe, FWR varijabilni domeni mišjeg antitela zamnejni su sa humanim FWR sekvencama visoko homolognog humanog IgG1. Dodatno, sekvence humanizovanog antitela optimizovane su uzimajući u obzir njihovu ekspresiju i lučenje od strane humanih ćelijskih linija. Za humanizaciju mišjeg scFv CD3 ili scFv MB1 prvo su humanizovane VHi VLsekvence amplifikovane pojedinačno kakoje prethodno opisano i zatim spojene sa PCR. Humanizacija VHili VLsekvenci koja se događa kroz aglomeraciju preklapajućih oligonukleotida i naknadnu amplifikaciju humanogizovane VHili VLsekvence nukleinske kiseline. Kako bi se utvrdile sekvence preklapajućih oligonukleotida, prvo je mišja VH iliVLsekvenca upoređena sa humanom IgG bazom podataka (NCBI IgBlast), identifikovano je humano IgG koje obezbeđuje najveću homologiju, a zatim je konačno teoretski kreirana humanizovana VHili VLsekvenca, i sintetizovani su preklapajući oligonukleotidi. Konstruisana su različita bispecifična antitela u kojima su korišćeni peptidi različite dužine.

Humanizacija anti-CD3 antitela

[0064] Za humanizaciju varijabilnog regiona teškog lanca anti-CD3 antitela, oligonukleotidi prema SEQ ID No.100 do 105 su aglomerisani. Zatim je humanizovana sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca anti-CD3 antitela (sa a G4S linker peptidom, SEQ ID No.132) amplifikovana pomoću prajmerskog para prema SEQ ID No.105 i 106. Za humanizaciju varijabilnog regiona lakog lanca anti-CD3 antitela, oligonukleotidi prema SEQ ID No.107 do 112 su aglomerisani. Humanizovana sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca anti-CD3 antitela amplifikovana je sa prajmerskim parom prema SEQ ID No. 112 i 113.

[0065] Za generisanje humanizovanih scFv anti-CD3 antitela u kojima je varijabilni region teškog lanca vezan jednim glicin-serinskim linkerom (G4S) sa varijabilnim regionom lakog lanca, humanizovana sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca anti-CD3 antitela prvo je klonirana putem SfiI i BamHI u ekspresionom vektoru pSecTag2B, a zatim putem BamHI i NotI humanizovana sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca anti-CD3 antitela umetnuta je nizvodno u isti ekspresioni vektor.

[0066] Za generisanje humanizovanih scFv anti-CD3 antitela u kojima je varijabilni region teškog lanca vezan uz pomoć tri glicin-serinska linkera (G4S) sa varijabilnim regionom lakog lanca, humanizovana sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca anti-

1

CD3 antitela pripremljena je sa tri glicin-serinska linkera (G4S). U ove svrhe, humanizovana sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca anti-CD3 antitela (sa tri G4S linker peptida) amplifikovana je pomoću prajmerskog para prema SEQ ID No.105 i 114 i putem SfiI i BamHI kloniranih u ekspresionom vektoru pSecTag2B, a zatim putem BamHI i NotI humanizovana sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca anti-CD3 antitela was umetnuta je nizvodno u isti ekspresioni vektor.

Humanizacija anti-PSCA MB1 antitela

[0067] Za humanizaciju varijabilnog regiona lakog lanca anti-PSCA MB1 antitela, oligonukleotidi prema SEQ ID No.115 do 118 su aglomerisani. Humanizovana sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca anti-PSCA MB1 antitela amplifikovana je sa prajmerskim parom prema SEQ ID No.119 i 120.

[0068] Za humanizaciju varijabilnog regiona teškog lanca anti-PSCA MB1 antitela, oligonukleotidi prema SEQ ID No.121 do 125 su aglomerisani. Humanizovana sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca anti-PSCA MB1 antitela amplifikovana je sa prajmerskim parom prema SEQ ID No.126 i 127.

Priprema bispecifičnog humanizovanog antitela scBsTaFv CD3-PSCA(MB1)

[0069] Konačno, humanizovane sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca MB1 antitela su aglomerisane i amplifikovane putem preklapanja PCR upotrebom prajmera prema SEQ ID No.128 i 129. Tako generisana sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humanizovano scFv MB1 (u redosledu VL-G4SG4SGASAAG4SG4S-VH, linker peptid prema SEQ ID No.130) klonirana je putem XhoI i ApaI nizvodno od prethodno opisanih humanizovanih scFv anti-CD3 antitela (sa tri G4S linker peptida) pri čemu je ekspresioni vektor "pSecTag2B_ scBsTaFv PSCA(MB1)-CD3 human" generisan.

[0070] Za eksprimiranje bispecifičnog humanizovanog antitela prema Fig.1 A, Hek293T ćelije transfektovane su sa ekspresionim vektorom i izlučena antitela su prečišćena od supernatanta ćelijske kulture putem nickl-afinitetnom hromatografijom, ako je potrebno u kombinaciji sa frakcionisanim amonijum sulfatnim talogom. Fig.2, traka 5, prikazuje SDS sliku gel elektroforeze prečišćenog bispecifičnog antitela.

2

Primer 2: Priprema bispecifičnih rekombinantnih antitela koja se specifično vezuju za PSCA (modularno ciljanje)

[0071] Za obezbeđivanje farmaceutske kombinacije prema ovom pronalasku (“sistem 1 modularnog ciljanja“, šematski prikazan na Fig.1B), proizvedena su sledeća rekombinantna antitela:

- rekombinantno anti-PSCA antitelo prema ovom pronalasku koje sadrži peptid prema SEQ ID No.75 (ovde takođe "E5B9"). Ovo antitelo nazvano je kako sledi scFv PSCA(MB1)-E5B9.

- bispecifično antitelo (scBsTaFv) usmereno prema CD3 i peptid prema SEQ ID No.75.

Paratop usmeren prema CD3 koji obuhvata sledeće aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona: težak lanac SEQ ID No.65, laki lanac SEQ ID No.57. Paratop usmeren prema peptidu prema SEQ ID No.75 koje obuhvata sledeće aminokiselinske sekvence hipervarijabilnih regiona varijabilnih regiona: laki lanac CDR1 SEQ ID No.

78, CDR2 SEQ ID No.79, CDR3 SEQ ID No.80, težak lanac CDR1 SEQ ID No.81, CDR2 SEQ ID No.82, CDR3 SEQ ID No.83. Ovo antitelo nazvano je kako sledi scBsTaFv CD3-5B9. Pripremljena su dva različita scBsTaFv CD3-5B9 koja se jedva međusobno razlikuju u linker peptidu između VH i VL anti-CD3 antitela (videti Fig. 1B).

Kloniranje humanogizovan scFv PSCA(MB1)-E5B9:

[0072] Za generisanje humanizovanog scFv PSCA(MB1) sa E5B9 epitopom na C terminusu (MB1 [VL-G4SG4SGASAAG4SG4S-MB1 VH]-[G4S-E5B9], prikazano na Fig.1B na dnu), humanizovano scFv PSCA (MB1 (VL-G4SG4SGASAAG4SG4S-MB1 MB1 VH-G4S, linker peptid prema SEQ ID No.130 i 132) opisan u Primeru 1 amplifikovan je putem prajmera prema SEQ ID No.134 i 135 i zatim putem SfiI i NotI kloniran u pSecTag2B. Posle aglomeracije oligonukleotida prema SEQ ID No.136 i 137, sekvenca nukleinske kiseline za E5B9 kloniran je putem NotI i XhoI na 3' kraju humanogizovan scFv PSCA (MB1), pri čemu je generisan "pSecTag2B_ scFv PSCA (MB1)-E5B9 humanizovan" konstrukt.

Kloniranje dva efektorska modula "scBsTaFv CD3 (G4S)-5B9" i “scBsTaFv CD3 (3xG4S)-5B9“ koja se vezuju za T ćelije i za E5B9 peptid

[0073] Kako je šematski prikazano na Fig.1B, za izgradnju sistema I modularnog ciljanja koji obuhvata scFv PSCA(MB1)-5B9 proizvedena su dva takozvana efektorska modula (bispecifična antitela scBsTaFv CD3-5B9) koja se razlikuju u broju glicin-serinskih (G4S) elemenata linker peptida između VHi VLlanaca anti-CD3 domena i prema tome su nazvani "scBsTaFv CD3(G4S)-5B9" ili „scBsTaFv CD3(3xG4S)-5B9“.

- Kloniranje "scBsTaFv CD3(G4S)-5B9" humanizovanog (videti šematski prikaz na Fig. 1B na vrhu):

Za humanizaciju varijabilnog regiona teškog lanca 5B9 antitela (specifično usmereno prema peptidu E5B9), oligonukleotidi prema SEQ ID No.138 do 142 su aglomerisani. Zatim je humanizovana sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca 5B9 antitela (sa a G4S linker peptidom, SEQ ID No.132) amplifikovana pomoću prajmerskog para prema SEQ ID No.143 i 144. Za humanizaciju varijabilnog regiona lakog lanca 5B9 antitela oligonukleotidi prema SEQ ID No.145 do 149 su aglomerisana. Humanizovana sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca 5B9 antitela je amplifikovana sa prajmerskim parom prema SEQ ID No.150 i 151.

Konačno, humanizovane sekvence nukleinske kiseline za 5B9 VHi 5B9 VLsu aglomerisane i amplifikovane putem preklapanja PCR upotrebom prajmera prema SEQ ID No. 152 i 153. Tako generisana sekvenca nukleinske kiseline za humanizovano scFv 5B9 (VH-3xG4S-VL) klonirana je humanizovana putem XhoI i ApaI nizvodno humanogizovanog scFv CD3 VH-G4S-VLu “pSecTag2B_scFv CD3 VH-G4S-VL“, pri čemu je generisan "pSecTag2B_scBsTaFv CD3(G4S)-5B9 humanizovan" vektor.

- Kloniranje“scBsTaFv CD3 (3xG4S)-5B9“ humanizovanog (videti šematski prikaz na Fig. 1B, u sredini):

Humanizovana sekvenca za scFv 5B9 (VH-3xG4S-VL) klonirana je humanizovana putem XhoI i ApaI nizvodno humanizovanog scFv CD3 (VH-3xG4S-VL) u "pSecTag2B_scFv CD3 VH-3xG4S-VL" pri čemu je generisan “pSecTag2B_scBsTaFv CD3(3xG4S)-5B9 humanizovan“ vektor.

[0074] Za obezbeđivanje farmaceutske kombinacije prema ovom pronalasku (“sistem 2 modularnog ciljanja“, šematski prikazan na Fig.1C), proizvedena su sledeća rekombinantna antitela:

- rekombinantno anti-PSCA antitelo prema ovom pronalasku koje sadrži peptid prema SEQ ID No.76 (ovde takođe nazvan “E7B6"). Ovo antitelo nazvano je kako sledi scFv PSCA(MB1)-E7B6.

- bispecifično antitelo (scBsTaFv) usmereno prema CD3 i peptid prema SEQ ID No.76.

Paratop usmeren prema CD3 obuhvata sledeće aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona: težak lanac SEQ ID No.65, laki lanac SEQ ID No.57. Paratop usmeren prema peptidu prema SEQ ID No.76 obuhvata sledeće aminokiselinske sekvence hipervarijabilnih regiona varijabilnih regiona: laki lanac CDR1 SEQ ID No.84, CDR2 SEQ ID No.85, CDR3 SEQ ID No.86, težak lanac CDR1 SEQ ID No.87, CDR2 SEQ ID No.88, CDR3 SEQ ID No.89. Ovo antitelo nazvano je kako sledi scBsTaFv CD3-7B6.

Kloniranje humanogizovanog scFv PSCA(MB1)-E7B6:

[0075] Za generisanje humanizovanog scFv PSCA(MB1) sa E7B6 epitopom na C terminusu MB1 [VL-G4SG4SGASAAG4SG4S-MB1 VH]-[G4S-E7B6], prikazano na Fig.1C na dnu), prvo je izvedena aglomeracija oligonukleotida prema SEQ ID No.154 i 155, a zatim kloniranje E7B6 sekvence nukleinske kiseline putem NotI i XhoI na 3' kraju u "pSecTag2B_ scFv PSCA(MB1) humanizovan" (VL-G4SG4SGASAAG4SG4S-VH-G4S, po analogiji gore opisanog konstrukta sa E5B9 peptidom), pri čemu je generisan "pSecTag2B_ scFv PSCA(MB1)-E7B6 humanizovan" vektor.

Kloniranje efektorskiog modula „scBsTaFv CD3 (3xG4S)-7B6“ humanizovanog koji se vezuje za T ćelije i za E7B6 peptid:

[0076] Za humanizaciju varijabilnog regiona teškog lanca 7B6 antitela (specifično usmereno prema peptidu E7B6) preklapajući oligonukleotidi prema SEQ ID No.156 do 160 su aglomerisani. Zatim je humanizovana sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca 7B6 antitela (sa G4S linker peptidom, SEQ ID No.132) amplifikovana pomoću prajmerskog para prema SEQ ID No.161 i 162. Za humanizaciju varijabilnog regiona lakog lanca 7B6 antitela oligonukleotidi prema SEQ ID No.163 to 167 su aglomerisani.

Humanizovana sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca 7B6 antitela amplifikovan je sa prajmerskim parom prema SEQ ID No.168 i 169.

[0077] Konačno, humanizovane sekvence nukleinske kiseline za 7B6 VHi 7B6 VLsu aglomerisane i amplifikovane putem preklapanja PCR upotrebom prajmera prema SEQ ID No. 170 i 171. Tako generisana sekvenca nukleinske kiseline za humanizovano scFv 7B6 (VH-3xG4S-VL) je klonirana humanizovana putem XhoI i ApaI nizvodno humanogizovanog scFv CD3 VH-G4S-VLu “pSecTag2B_scFv CD3 VH-G4S-VL“, pri čemu je generisan "pSecTag2B_scBsTaFv CD3(G4S)-7B6 humanizovan" vektor.

2

[0078] Za ekspresiju jedne fuzije proteina sistema 1 i 2 modularnog ciljanja, Hek293T ćelije transfektovane su sa ekspresionim vektorima, i izlučena rekombinantna scFv (scFv PSCA-E5B9 ili scFv PSCA-E7B6) i bispecifična antitela (scBsTaFv CD3 (G4S)-5B9 ili scBsTaFv CD3 (3xG4S)-5B9 i scBsTaFv CD3-7B6) su prečišćena od supernatanta ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom na Ni-NTA agaroza (Qiagen, Hilden, Germany) (ako je potrebno, u kombinaciji sa frakcionisanim amonijum sulfatnim talogom). Pomoću SDS PAGE i Imunoblot-a, verifikovane su čistoća i stabilnost derivata rekombinantnog antitela (Fig. 2).

Primer 3: Određivanje konstantne disocijacije vezivanja za PSCA

[0079] Određivanje konstante afiniteta za respektivni anti-PSCA domen rekombinantnih, bispecifičnih antitela sa anti-PSCA MB1 antitelom (prema ovom pronalasku) i anti-PSCA 7F5 antitelom (uporedni primer, antitelo od [Feldmann 2010]) bazirano je na protočnoj citometrijskoj analizi vezivanja za PSCA-pozitivne PC3 ćelije.

[0080] Za generisanje vezujućih krivi domena rekombinantnih anti-PSCA antitela, svaka od 2x10<5>PSCA-pozitivnih ćelija su inkubisane sa 100 µl bispecifičnih antitela (MB1 i 7F5) tokom 1h na 4°C. Antitela su upotrebljena pri sledećim koncentracijama, respektivno:

Količina antitela po seriji u ng Koncentracije antitela u pmol/l 1000 90000

100 9000

50 4500

10 900

5 450

1 90

0.5 45

0.1 9

0.05 4.5

0.01 0.9

0.001 0.09

[0081] Da bi se verifikovalo specifično vezivanje rekombinantnih CD3-PSCA antitela, mišjeanti-c-myc IgG-FITC ogledno antitelo (AbD Serotec, Düsseldorf, Germany) je upotrebljeno koje je po završetku prve faze bojenja inkubisano tokom 30min na 4°C sa anti-PSC antitelom obeleženim sa PSCA-pozitivnim ćelijama. Kao negativna kontrola, izveden je uzorak u kojem su PSCA-pozitivne ćelije obojene samo sa oglednim antitelo mišjim-anti-c-myc IgG-FITC. Ćelije su analizirane u BD FACS Calibur Flow Cytometer (BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Germany), a podaci procenjeni pomoću softvera WinMDI 2.8 (Joseph Trotter, La Jolla, CA, USA).

[0082] Za procenu, utvrđene MFI vrednosti (srednje vrednosti intenziteta fluorescencije) upoređene sa koncentracijama testiranog antitela koncentracije i u svakom slučaju linija napredovanja polinomskog regresionog tipa drugog reda je izračunata. Da bi se odredila konstanta afiniteta, linija napredovanja je izračunata iz polinomskog regresionog tipa drugog reda je i ubačena. Krive vezivanja koje su ovako dobijene služe kao osnova za izračunavanje konstantne afiniteta KDkoja je definisana kao koncentracija koja je dostignuta na 50% vrednosti maksimalne MFI vrednosti, i prema tome koja je dostignuta na polovini maksimalne zasićenosti vezivanja. Da bi se izračunala ova konstanta, prvo je formiran prvi derivat krive vezivanja koja prati kvadratnu funkciju. Da bi se odredio maksimum funkcije bazirane na ovoj jednačini, prvi derivat je podešen na “nula" i podeljen sa x. Maksimun funkcije ymaxi prema tome ymax/2 koji odgovara MFI vrednosti na polovini zasićenosti mesta vezivanja, izračunat je upotrebom dobijene vrednosti za x u izvornoj jednačini. Kako KDvrednost odgovara x vrednosti u ymax/2, ono se konačno može izračunati upotrebom ymax/2 vrednosti u kvadratnoj funkciji krive vezivanja i transponovati jednačinu za x.

[0083] Sledeće KDvrednosti određene na ovaj način vezuju se za PSCA:

[0084] Moguće je na ovaj način pokazati da afinitet anti-PSCA antitela prema ovom pronalasku prema antigenu PSCA je veći u opsegu u poređenju sa antitelom 7F5 iz stanja tehnike.

Primer 4: Specifična liza PSCA+ ćelija sa bispecifičnim anti-PSCA antitelima

[0085] U testu oslobađanja hroma, pretkodno aktivirana PBMC 5x10<4>zajedno su uzgajana sa 5x10<3 51>Cr-uvedenim PC3-PSCA tumor ćelijama (efektorski ciljani odnos = 10:1) u prisustvu

2

i odsustvu rekombinantnih antitela u RPMI medijumu u ukupnoj zapremini od 200 µl. U ove svrhe, korišćena su antitela prema ovom pronalasku iz Primera 1 (u mišjem kao i u humanizovanom obliku). Kao uporedni primer upotrebljeno je mišje anti-PSCA(7F5) antitelo iz stanja tehnike, u bispecifičnom antitelu iste konfiguracije. Varijabilni regioni 7F5 antitela odgovaraju: teškom lancu SEQ ID No.48, lakom lancu SEQ ID No.50. Izvedeni su eksperimenti sa sledećim konkretnim konstruktima antitela:

1. humanizovano bispecifično scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) iz Primera 1

2. mišje bispecifično scBsTaFv CD3-PSCA (MB1) iz Primera 1

3. humanizovano bispecifično scBsTaFv CD3-PSCA(7F5) (uporedni primer)

4. mišje bispecifično scBsTaFv CD3-PSCA(7F5) (uporedni primer)

[0086] Posle 20 h inkubacije na 37°C u inkubatoru hromoslobođen u medijumu je izmeren. Specifična liza izračunata je na sledeći način:

Specifična liza u % = [oslobođen<51>Cr - spontano oslobođen<51>Cr (minimum)]/[maksimalno oslobođen<51>Cr (maksimum) - minimum] x 100%

[0087] Rezultati in vitro eksperiment grafički su prikazani na Fig.3. Prikazan je procentulani odnos liziranih PC3 ćelija u odnosu na ukupno uključene PC3 ćelije (Y axis). Dok su antitela prema ovom pronalasku eksperimentalnih grupa 1 i 2 već na količinama manjim od 1 ng pokazala snažnu lizu PSCA-pozitivnih ćelija, primetna liza može se zapaziti sa poznatim 7F5 antitelima u uporedivom konstruktu (eksperimentalne grupe 3 i 4) tek nakon upotrebe nekoliko ng antitela. Određena je maksimalna liza od oko 60% uključenih PC3 ćelija. Sa antitelima prema ovom pronalasku, liza od oko 80% uključenih PC3 ćelija već je primećena sa upotrebom nižih količina antitela. Maksimalno, više od 90% uključenih PC3 ćelije je lizirano sa antitelom prema ovom pronalasku (eksperimentalna grupa 1).

Primer 5: Inhibicija rasta tumora sa scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) humanizovanim in vivo

[0088] Kao dokaz efikasnosti anti-PSCA MB1 antitela prema ovom pronalasku, efektorsko bispecifično antitelo scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) izvedeno iz njega i proizvedeno prema primeru 1 (šematski prikazano na Fig.1 A, na vrhu), testirano je u mišjem modelu tumora. Kao model organizam, upotrebljeni su goli miševi koji su razvili tumore posle transfera PSCA-pozitivnih PC3 tumor ćelija. U ovom eksperimentu, transferovane su PSCA-pozitivne tumor ćelije u kombinaciji sa T ćelijama i antitelom.

2

[0089] Sledeća antitela upotrebljena su u ove svrhe u koje je po mišu ubrizgano 10 µg antitela: (1) bispecifično kontrolno antitelo anti-CD3xanti-5B9 (kontrola)

(2) monospecifično humanizovano scFv anti-PSCA(MB1) iz Primera 1 (kontrola)

(3) kontrola bez antitela (negativna kontrola)

(4) humanizovano bispecifično scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) iz Primera 1

(5) humanizovano bispecifično scBsTaFv CD3-PSCA(7F5) kakvo je opisano u Primeru 3 (uporedni primer)

(6) humanizovano bispecifično scBsDb CD3xPSCA(7F5) koje sadrži PSCA-vezujuće varijabilne regione 7F5 antitela (uporedni primer)

[0090] Efekat bispecifičnih antitela baziran je na grupisanju CD3-pozitivnih T ćelija na PSCA-pozitivnim tumor ćelijama i lizi tumor ćelija koja je na ovaj način posredovana.

[0091] U prvom eksperimentu 5x10<3>PSCA-pozitivnih tumor ćelija transferovano je u 8 golih miševi u svakoj eksperimentalnoj grupi i 5x10<3>T ćelija (efektorski ciljani odnos 1:1). U kontrolnim grupama (1) i (3) pronađen je rapidan rast tumora u odsustvu anti-PSCA antitela. Kontrola (2) kod koje je injektovano monospecifično scFv anti-PSCA(MB1) takođe pokazuje rapidan rast tumora. Citotoksični efekat monospecifičnog antitela se prema tome može isključiti, a efikasnost se u potpunosti može dodeliti bispecifičnom konstruktu. Površina tumora formiranih tumora određena je 25 dana nakon transferovanja ćelija. Tri kontrolne grupe nije pokazalo značajne razlike u površini tumora (Fig.4A).

[0092] Sa transferom bispecifičnih uporednih antitela koja sadrže varijabilne regione anti-PSCA 7F5 antitela (uporedne grupe (5) u obliku tandem antitela i (6) u obliku dijatela) takođe je pokazan rapidan rast tumora (podaci nisu prikazani). U drugom eksperimentu u kojem su tumor ćelije u efektorskom ciljanom odnosu od 10:1 (to jest sa 10-strukom količinom T ćelija; transfer 5x10<3>PSCA-pozitivnih tumor ćelija i 5x10<4>T ćelija), takođe je primećen rapidan rast tumora koji statistički nije pokazao značajnu razliku u odnosu na kontrolnu grupu (1) (Fig. 4B). Rast tumora nije inhibiran sa anti-PSCA 7F5 antitelima već je jedva nešto odložen. Čak i sa T ćelijama u višku, nije bilo moguće primetiti in vivo inhibiciju rasta tumora od strane anti-PSCA 7F5 antitela.

2

[0093] Transfer bispecifičnog antitela scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) prema ovom pronalasku iz Primera 1 sa efektorskim ciljanim odnosom 1:1 omogućio je smanjenje rasta tumora u značajnoj meri. Tokom 25 dana nakon ćelijskog transfera u 2 od 8 test životinjskih tumora sa pojavljivanjem jasno smanjene površine (prečnika oko 2 mm), 6 od 8 test životinja se rešilo tumora (Fig 4A). Anti-PSCA MB1 antitelo prema ovom pronalasku (eksperimentalna grupa (4)) prema tome je jasno superiornije sa uporedno konstruisanim anti-PSCA 7F5 antitelom (eksperimentalna grupa (5)) u pogledu in vivo efikasnosti pod istim eksperimentalnim uslovima.

Navedena nepatentna literatura

[0094] Feldmann A, Stamova S., Bippes CC, Bartsch H, Wehner R, Schmitz M, Temme A, Cartellieri M, Bachmann M. Retargeting of T cells to prostate stem cell antigenic expressing tumor cells: comparison of different anti-body formats. Prostate.2011 Jun 15; 71 (9):998-1011. doi: 10.1002/pros.21315. Epub 2010 Dec 28.

[0095] Gu Z, Yamashiro J, Kono E, Reiter RE Anti-prostate stem cell antigen monoclonal antibody 1G8 induces cell death in vitro and inhibits tumor growth in vivo via a Fc independent mechanism. Cancer Res.2005 Oct 15; 65 (20):9495-500.

[0096] Morgenroth A, Cartellieri M, Schmitz M, Günes S., Weigle B, Bachmann M, Abken H, Rieber EP, Temme A. Targeting of tumor cells expressing the prostate stem cell antigenic (PSCA) using genetically engineered T-cells. Prostate.2007 Jul 1; 67 (10):1121-31.

[0097] Reiter, R.E., Gu, Z., Watabe, T., Thomas, G., Szigeti, K., Davis, E., Wahl, M., Nisitani, S., Yamashiro, J., Le Beau, M.M., Loda, M. and Witte, O.N. Prostate stem cell antigen: A cell surface marker overexpressed in prostate cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 95(4): 1735-40 (1998).

[0098] Roehl, K.A., M. Han, C. G. Ramos, J. A. V. Antenor, and W. J. Catalona. Cancer progression and survival rates following anatomical radical retropubic prostatectomy in 3,478 consecutive patients: long-term results. J Urol, 172 (3):910-4, Sep 2004.

[0099] Thomas-Kaskel, A. K., R. Zeiser, R. Jochim, C. Robbel, W. Schultze-Seemann, C. F. Waller, and H. Veelken. Vaccination of advanced prostate cancer patients with PSCA and PSA peptide-loaded dendritic cells induces DTH responses that correlate with superior overall survival. Int J Cancer, 119 (10):2428-34, Nov.2006.

2

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

Claims

Patentni zahtevi

1. Antitelo koje vezuje antigen matičnih ćelija specifičan za prostatu, u kojem

- regioni koji određuju komplementarnost (CDR) varijabilnog regiona lakog lanca obuhvataju sledeće aminokiselinske sekvence: CDR1 SEQ ID No.1, CDR2 SEQ ID No.2, CDR3 SEQ ID No.3 i

- CDR varijabilnog regiona teškog lanca obuhvataju sledeće aminokiselinske sekvence:

CDR1 SEQ ID No.4, CDR2 SEQ ID No.5, CDR3 SEQ ID No.6.

2. Antitelo prema zahtevu 1 čiji varijabilni regioni obuhvataju humanizovanu aminokiselinsku sekvencu.

3. Antitelo prema zahtevu 1 ili 2, koje obuhvata najmanje dve različite vezujuće jedinice, pri čemu

- najmanje jedna od vezujućih jedinica vezuje se za antigen matičnih ćelija specifičan za prostatu i obuhvata regione koji određuju komplementarnost definisani u zahtevu 1 i

- najmanje jedna druga od vezujućih jedinica specifično se vezuje za antigen različit od antigena matičnih ćelija specifičan za prostatu.

4. Antitelo prema zahtevu 3, u kojem se druga vezujuća jedinica specifično vezuje za površinsku strukturu efektorske ćelije, pri čemu se ta vezujuća jedinica poželjno bira između vezujuće jedinice antitela ili liganda koji se vezuje za površinsku strukturu efektorske ćelije.

5. Antitelo prema zahtevu 4, u kojem se efektorska ćelija bira između T-limfocita, NK ćelija, i monocita, poželjno T-limfocita.

6. Antitelo prema zahtevu 3, u kojem se druga vezujuća jedinica specifično vezuje za peptid dužine od 10 do 50 aminokiselina, poželjno peptid sa aminokiselinskom sekvencom koja odgovara delimičnoj sekvenci humanog La-proteina dužine od 10 do 50 aminokiselina, naročito poželjno peptid sa jednom od aminokiselinskih sekvenci prema SEQ ID No.75 ili SEQ ID No.76.

7. Antitelo prema jednom od zahteva 3 do 6 u obliku dijatela, triatela ili tetratela.

4

8. Antitelo prema jednom od zahteva 1 do 7 za upotrebu kao lek, određenije za lečenje tumorskih bolesti, poželjno kancera prostate, ili kao dijagnostički agens.

9. Nukleinska kiselina čija nukleotidna sekvenca kodira rekombinantno antitelo prema jednom od zahteva 1 do 7.

10. Vektor koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema zahtevu 9.

11. Ćelija domaćin ili ne-humani organizam domaćin koji sadrži nukleotidnu sekvencu prema zahtevu 9 ili vektor prema zahtevu 10.

12. Farmaceutska kombinacija koja sadrži rekombinantno antitelo prema jednom od zahteva 1 do 7 zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem ili nosačem, poželjno u obliku pogodnom za intravenozno davanje.

13. Farmaceutska kombinacija prema zahtevu 12, koja sadrži najmanje dva različita rekombinantna antitela, od kojih je najmanje jedno antitelo prema jednom od zahteva 1 do 7 i najmanje jedno dalje rekombinantno antitelo, koje sa antitelom prema jednom od zahteva 1 do 7 formira specifičnu vezu.

14. Dijagnostička kombinacija koja sadrži rekombinantno antitelo prema jednom od zahteva 1 do 7.