JP2023531494A - Ｈｅｒ－２標的化二重特異性組成物ならびにその作製および使用のための方法 - Google Patents

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Abstract

プロテアーゼによる消化の際にポリペプチドから放出可能であるバーコード断片を含む伸長組換えポリペプチドに共有結合で連結されている二重特異性抗体構築物と、タンパク質分解により切断され得る放出セグメントとを含むポリペプチドであって、前記切断により伸長組換えポリペプチドから二重特異性抗体構築物が放出される、ポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドを作製および使用する方法が、本明細書で開示される。本発明は、治療指数が増加したＴＣＥがん治療薬を提供するという、長年にわたる、満たされていない要求に対処する。

Description

配列表の記載：
コンピューター可読形式の配列表を電子申請により本願とともに提出し、配列表は、その全体が参照により本願に組み込まれる。配列表は、ファイル名「７８９－６０１＿２０－１８３２－ＷＯ＿ＳＴ２５＿ＦＩＮＡＬ．ｔｘｔ」を有する２０２１年６月１４日に作成したファイルに含まれており、サイズ１５０２ｋｂである。
参考文献の記載
本願は、発明の名称が「ＢＡＲＣＯＤＥＤ ＢＩＳＰＥＣＩＦＩＣ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＡＮＤ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥ」である２０２０年６月２５日に出願した米国仮特許出願第６３／０４４，３０１号、発明の名称が「ＢＡＲＣＯＤＥＤ ＢＩＳＰＥＣＩＦＩＣ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＡＮＤ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥ」である２０２０年９月１１日に出願した米国仮特許出願第６３／０７７，５０３号、発明の名称が「ＢＡＲＣＯＤＥＤ ＢＩＳＰＥＣＩＦＩＣ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＡＮＤ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥ」である２０２０年１１月２日に出願した米国仮特許出願第６３／１０８，７８３号、発明の名称が「ＨＥＲ２ ＴＡＲＧＥＴＥＤ ＢＩＳＰＥＣＩＦＩＣ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＡＮＤ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥ」である２０２１年３月２６日に出願した米国仮特許出願第６３／１６６，８５７号、および発明の名称が「ＨＥＲ２ ＴＡＲＧＥＴＥＤ ＢＩＳＰＥＣＩＦＩＣ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＡＮＤ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥ」である２０２１年６月３日に出願した米国仮特許出願第６３／１９６，４０８号の優先権を主張するものであり、これら仮特許出願のすべては、それら全体が本明細書に組み込まれる。
背景
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）は、Ｔ細胞による腫瘍抗原の認識の要件を回避する、選択された腫瘍関連抗原を発現する腫瘍に対してＴ細胞の細胞傷害性を再指向させる、がん治療の非常に強力なモダリティーとなる。ＴＣＥの活性は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有効に刺激することによってＴ細胞を活性化するその能力に依存する。それらの極めて強い作用強度は、刺激を受け、合体してＴ細胞と標的細胞との間に免疫シナプスを形成するＴＣＲわずか３つという、細胞傷害性を開始させるための最小の要件から生じる。細胞傷害性のそれらの誘導に加えて、それらの作用強度には、抗腫瘍免疫応答を増強し、増幅する、Ｔ細胞活性化の下流のサイトカイン駆動作用も関与する。したがって、ＴＣＥは、腫瘍が不十分な突然変異を保有するまたは他の手段による免疫監視を逃れてしまっている患者に対する免疫療法に有望である。しかし、このモダリティーは、それ自体の課題がないわけではなく、固形腫瘍におけるＴＣＥの使用は、健康な組織におけるそれらの極めて強い作用強度およびオンターゲット、オフ腫瘍毒性により制限されている。
ＴＣＥは、血液がんに罹患している患者の寛解を誘導する点で非常に有効とされているが、固形腫瘍におけるそれらの使用は、標的をたとえ低レベルであっても発現する正常な組織に対するそれらの極めて強い作用強度およびオンターゲット毒性により制限されている。稀だが印象的な臨床応答が、免疫療法が通常は効かない腫瘍（例えば、マイクロサテライト安定性の結腸直腸および前立腺がん）で観察されているが、低用量でのサイトカイン放出症候群などの毒性が、このモダリティーの臨床的可能性を明らかにするための用量漸増を妨げている。＜１ｕｇ／ｋｇの用量のＩｃｈｎｏｓ ＩＳＢ １３０２ ＨＥＲ２ ＴＣＥで処置された患者において誘導されたグレード４のサイトカイン放出症候群が、比較的組織が限定されている標的に指向された場合であっても、ＴＣＥにより直面する課題を強調する。
ブリナツモマブ（承認されたＣＤ３ｘＣＤ１９二重特異性抗体）での臨床試験は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）が主要安全性関連有害事象の１つであることを明らかにした。低い薬物用量でのＣＲＳおよびオンターゲット毒性によって、診療所における固形腫瘍に対するＴＣＥモダリティーの治療指数および可能性は有意に損なわれている。例えば、カツマキソマブ（ＣＤ３ｘＥｐＣＡＭ）についての臨床試験は、１０μｇ用量で薬物性肝不全に起因して打ち切られた。別の試験、ＨＥＲ２標的化ＴＣＥ（Ｇｌｅｎｍａｒｋ ＧＢＲ１３０２）では、Ｇ４ ＣＲＳの開始に起因して薬剤の用量が１μｇ／ｋｇ未満に制限された。パソツキシズマブ（ｐａｓｏｔｕｘｕｍａｂ）（ＰＳＭＡ標的化ＴＣＥ）は、良好な応答を示したが、４０μｇ／日より多い用量ではＣＲＳにより阻まれた。文献には、ＴＣＥにより提示されるＣＲＳおよびオンターゲット毒性の課題のその他の例が豊富に載っている。
ＣＲＳを回避しようとする試みは、複雑な分子設計を含むが、これらは、毒性および／または増強される免疫原性に起因して失敗に終わっている。これは、固形腫瘍における治療指数の課題を克服することができる新たな戦略に対する満たされていない有意な要求を提示する。ＴＣＥの作用強度を利用することができたなら、そしてＣＲＳおよびオンターゲット毒性の課題を制御することができたなら、広範囲のがんに対して使用することができる可能性がある強力な治療法を生じさせることが可能であるだろう。
原薬などの治療薬は、ポリペプチドを含み、これらのポリペプチドは、原薬の活性に影響を与え得るポリペプチドの混合物を生じさせる結果となる方法で生成され得る。ポリペプチドの混合物は、多くの場合、全長ポリペプチドを、それらのサイズバリアント（例えば、短縮形）とともに含み得る。所望の全長生成物とはサイズが異なるバリアントの存在は、原薬の生物学的挙動に影響を与えることがあり、したがって、ポリペプチド原薬の安全性および／または有効性に影響を与える可能性がある。例えば、がん治療用のタンパク質に基づくプロドラッグは、腫瘍を標的とする活性化メカニズムを用いて操作され得る。より具体的には、治療用の全長タンパク質は、不活性化（非細胞傷害性）プロドラッグ形態であり得るが、その全長構築物の短縮形バリアントは、保護配列を欠いていることがあり得、細胞傷害性（活性）になることがあり得、それ故、プロドラッグ組成物を「夾雑」することがあり得る。一部の事例では、そのようなより短い長さのバリアントは、全長タンパク質と比較して、より大きい免疫原性リスクをもたらすことがあり、腫瘍細胞に対する選択性がより低い毒性を有することがあり、または然程望ましくない薬物動態プロファイルを示す（例えば、その結果、治療域が狭められることになる）ことがある。結果として、タンパク質構造の変動の検出および定量化は、バイオ医薬品の生物学的特性（例えば、臨床的安全性および薬理学的有効性）の評価におよび新たなバイオ医薬品（例えば、有効性が増大され、副作用が低減された）の開発に重要であり得る。「夾雑」短縮化生成物の同定およびその量の定量化のための既存の技法および方法は、感度、容易さ、効率または有効性が限られていることなどの、１つまたは複数の欠点を含み得る。
概要
本発明は、治療指数が増加したＴＣＥがん治療薬を提供するという、長年にわたる、満たされていない要求に対処する。それを行うにあたって、本発明は、ＸＴＥＮ化プロテアーゼ活性化二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＸＰＡＴ）を提供することによるＴＣＥの治療可能性を利用する。ＸＰＡＴは、Ｔ細胞エンゲージャーの固形腫瘍に対する作用強度を維持しつつ毒性プロファイルを改善するための、ひいては治療指数の有意な増加およびこの強力なモダリティーの標的景観の拡大を可能にする、新規戦略に相当する。ある特定の具体的な実施形態では、本発明のＸＰＡＴは、ＨＥＲ２を有する腫瘍を標的とする。より具体的には、ＡＭＸ－８１８は、ＨＥＲ２を標的とする、条件次第で活性化されるプロドラッグＴＣＥであって、プロテアーゼ阻害が有効である健康な組織を取っておいて腫瘍において異常調節されるプロテアーゼ活性を活用するように設計された、ひいては安全域および治療指数を拡大する、ＴＣＥである。
Ｎ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸を有するポリペプチドであって、（ａ）伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）であって、プロテアーゼによる消化の際に前記ポリペプチドから放出可能であるバーコード断片（ＢＡＲ）を含む、ＸＴＥＮ；（ｂ）二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）であって、分化抗原群３Ｔ細胞受容体（ＣＤ３）に特異的に結合し、軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、２（ＣＤＲ－Ｌ２）および３（ＣＤＲ－Ｌ３）と重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、２（ＣＤＲ－Ｈ２）および３（ＣＤＲ－Ｈ３）とを含み、前記ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、第１の抗原結合断片（ＡＦ１）と、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に特異的に結合する第２の抗原結合断片（ＡＦ２）とを含む、二重特異性抗体構築物；ならびに（ｃ）前記ＸＴＥＮと前記二重特異性抗体構築物との間に位置する放出セグメント（ＲＳ）を含み、前記ＸＴＥＮが、（ｉ）少なくとも１００、または少なくとも１５０アミノ酸を含むこと、（ｉｉ）そのアミノ酸残基の少なくとも９０％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）であること、（ｉｉｉ）Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、ＥまたはＰである少なくとも４種の異なるアミノ酸を含むこと、および（ｉｖ）前記ＸＴＥＮが、各々長さ９～１４アミノ酸である複数の非オーバーラップ配列モチーフから形成されることを特徴とし；前記複数の非オーバーラップ配列モチーフが、（１）非オーバーラップ配列モチーフのセットであって、前記非オーバーラップ配列モチーフのセットの各非オーバーラップ配列モチーフが、前記ＸＴＥＮ中で少なくとも２回反復される、非オーバーラップ配列モチーフのセット；および（２）前記ＸＴＥＮ内に１回だけ出現する非オーバーラップ配列モチーフを含むみ；前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、前記ＸＴＥＮ内に１回だけ出現する前記非オーバーラップ配列モチーフの少なくとも一部を含み；前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、前記プロテアーゼによる前記ポリペプチドの完全消化の際に前記ポリペプチドから放出可能であるすべての他のペプチド断片と、配列および分子量の点で異なり；前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、前記ポリペプチドの前記Ｎ末端アミノ酸も、前記Ｃ末端アミノ酸も含まない、ポリペプチドが、本明細書で提供される。
ある特定の実施形態では、前記非オーバーラップ配列モチーフのセットは、各々独立して、配列番号１７９～２００および１７１５～１７２２により本明細書において同定されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、前記非オーバーラップ配列モチーフのセットは、各々独立して、配列番号１８６～１８９により本明細書において同定されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、前記非オーバーラップ配列モチーフのセットは、前記配列モチーフの配列番号１８６～１８９のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つすべてを含む。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮは、１００～３，０００、１５０～３，０００、１００～１，０００、または１５０～１，０００アミノ酸残基の長さを含む。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮは、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、または少なくとも５００アミノ酸残基の長さを含む。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮのアミノ酸残基の少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）である。
ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮは、表３ａに記載の配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、前記バーコード断片（ＢＡＲ）は、前記ＸＴＥＮ中に、存在する場合別のグルタミン酸に直接隣接しているグルタミン酸を含まない。ある特定の実施形態では、前記バーコード断片（ＢＡＲ）は、そのＣ末端にグルタミン酸を有する。ある特定の実施形態では、バーコード断片（ＢＡＲ）は、グルタミン酸残基がすぐ前にあるＮ末端アミノ酸を有する。ある特定の実施形態では、前記バーコード断片（ＢＡＲ）は、前記ポリペプチドの前記Ｎ末端または前記ポリペプチドの前記Ｃ末端のいずれかからある距離に位置し、前記距離は、長さ１０～１５０アミノ酸、または１０～１２５アミノ酸である。ある特定の実施形態では、前記バーコード断片（ＢＡＲ）は、（ｉ）前記ＸＴＥＮ中に、存在する場合別のグルタミン酸に直接隣接しているグルタミン酸を含まないこと；（ｉｉ）そのＣ末端にグルタミン酸を有すること；（ｉｉｉ）グルタミン酸残基がすぐ前にあるＮ末端アミノ酸を有すること；および（ｉｖ）前記ポリペプチドの前記Ｎ末端または前記ポリペプチドの前記Ｃ末端のいずれかからある距離に位置し、前記距離が、長さ１０～１５０アミノ酸、または１０～１２５アミノ酸であることを特徴とする。ある特定の実施形態では、前記バーコード断片（ＢＡＲ）の前記Ｎ末端アミノ酸の前にある前記グルタミン酸残基は、別のグルタミン酸残基に直接隣接していない。
ある特定の実施形態では、前記バーコード断片（ＢＡＲ）は、前記バーコード断片のＣ末端以外の位置に第２のグルタミン酸残基を、前記第２のグルタミン酸のすぐ後にプロリンが続かない限り、含まない。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮは、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＮ末端に位置し、前記バーコード断片（ＢＡＲ）は、前記ポリペプチドの前記Ｎ末端の２００アミノ酸以内、１５０アミノ酸以内、１００アミノ酸以内、または５０アミノ酸以内に位置する。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮは、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＮ末端に位置し、前記バーコード断片（ＢＡＲ１）は、タンパク質の前記Ｎ末端から１０～２００アミノ酸の間、３０～２００アミノ酸の間、４０～１５０アミノ酸の間、または５０～１００アミノ酸の間にある場所に位置する。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮは、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＣ末端に位置し、前記バーコード断片（ＢＡＲ）は、前記ポリペプチドの前記Ｃ末端の２００アミノ酸以内、１５０アミノ酸以内、１００アミノ酸以内、または５０アミノ酸以内に位置する。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮは、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＣ末端に位置し、前記バーコード断片（ＢＡＲ）は、前記タンパク質の前記Ｃ末端から１０～２００アミノ酸の間、３０～２００アミノ酸の間、４０～１５０アミノ酸の間、または５０～１００アミノ酸の間にある場所に位置する。ある特定の実施形態では、前記バーコード断片（ＢＡＲ）は、長さ少なくとも４アミノ酸である。ある特定の実施形態では、前記バーコード断片（ＢＡＲ）は、長さ４～２０アミノ酸の間、５～１５アミノ酸の間、６～１２アミノ酸の間、または７～１０アミノ酸の間である。
ある特定の実施形態では、前記バーコード断片（ＢＡＲ）は、表２に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮは、近位端および遠位端により定義される長さを有し、（１）前記近位端は、前記遠位端と比べて、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）の近くに位置し、（２）前記バーコード断片（ＢＡＲ）は、前記遠位端から測定して、前記ＸＴＥＮの長さの５％～５０％の間、７％～４０％の間、または１０％～３０％の間にわたる前記ＸＴＥＮの領域内に位置する。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮは、追加の１つまたは複数のバーコード断片をさらに含み、前記追加の１つまたは複数のバーコード断片各々は、前記プロテアーゼによる前記ポリペプチドの完全消化の際に前記ポリペプチドから放出可能であるすべての他のペプチド断片と、配列および分子量の点で異なる。ある特定の実施形態では、前記放出セグメント（ＲＳ）は、配列番号７００１～７６２６により本明細書において同定される配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、前記プロテアーゼは、プロリンが後に続かないグルタミン酸残基のＣ末端側で切断する。ある特定の実施形態では、前記プロテアーゼは、Ｇｌｕ－Ｃプロテアーゼである。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、融合タンパク質として発現され、前記融合タンパク質は、非切断状態で、Ｎ末端からＣ末端へＡＦ１－ＡＦ２－ＲＳ－ＸＴＥＮ、ＡＦ２－ＡＦ１－ＲＳ－ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ－ＲＳ－ＡＦ１－ＡＦ２、またはＸＴＥＮ－ＲＳ－ＡＦ２－ＡＦ１である構造配置を有する。ある特定の実施形態では、前記放出セグメント（ＲＳ）は、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）にスペーサーにより融合されている。ある特定の実施形態では、前記スペーサーは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）であり得る少なくとも４種のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、前記スペーサーは、表Ｃに記載の配列に対して、少なくとも８０％、９０％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）の前記ＣＤＲ－Ｈ１および前記ＣＤＲ－Ｈ２は、それぞれ、配列番号８および９のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号１または２のアミノ酸配列を含み、前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号４または５のアミノ酸配列を含み、前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号４または５のアミノ酸配列を含み、前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号４または５のアミノ酸配列を含み、前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号５のアミノ酸配列を含み、前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、４つの鎖可変ドメインフレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）、２（ＦＲ－Ｈ２）、３（ＦＲ－Ｈ３）および４（ＦＲ－Ｈ４）を含み、各々は、それぞれ配列番号６０、６４、６５および６７のアミノ酸配列に対して、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すか、またはそれと同一である。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、４つの鎖可変ドメインフレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）、２（ＦＲ－Ｈ２）、３（ＦＲ－Ｈ３）および４（ＦＲ－Ｈ４）を含み、各々は、それぞれ配列番号６１、６４、６５および６７のアミノ酸配列に対して、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すか、またはそれと同一である。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片は、４つの軽鎖可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ－Ｌ）：ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３およびＦＲ－Ｌ４をさらに含み、各々は、それぞれ配列番号５１、５２、５３および５９のアミノ酸配列に対して、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すか、またはそれと同一である。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片は、４つの軽鎖可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ－Ｌ）：ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３およびＦＲ－Ｌ４をさらに含み、各々は、それぞれ配列番号５１、５２、５４および５９のアミノ酸配列に対して、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すか、またはそれと同一である。
ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片は、４つの軽鎖可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ－Ｌ）：ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３およびＦＲ－Ｌ４をさらに含み、各々は、それぞれ配列番号５１、５２、５５および５９のアミノ酸配列に対して、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すか、またはそれと同一である。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片は、４つの軽鎖可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ－Ｌ）：ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３およびＦＲ－Ｌ４をさらに含み、各々は、それぞれ配列番号５１、５２、５６および５９のアミノ酸配列に対して、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すか、またはそれと同一である。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、軽鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｌ１）、２（ＦＲ－Ｌ２）、３（ＦＲ－Ｌ３）および４（ＦＲ－Ｌ４）と重鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）、２（ＦＲ－Ｈ２）、３（ＦＲ－Ｈ３）および４（ＦＲ－Ｈ４）とをさらに含み、前記ＦＲ－Ｌ１は、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｌ２は、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｌ３は、配列番号５３、５４、５５または５６のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｌ４は、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ１は、配列番号６０または６１のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ２は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ３は、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ４は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、軽鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｌ１）、２（ＦＲ－Ｌ２）、３（ＦＲ－Ｌ３）および４（ＦＲ－Ｌ４）と重鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）、２（ＦＲ－Ｈ２）、３（ＦＲ－Ｈ３）および４（ＦＲ－Ｈ４）とをさらに含み、前記ＦＲ－Ｌ１は、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｌ２は、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｌ３は、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｌ４は、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ１は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ２は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ３は、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ４は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、軽鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｌ１）、２（ＦＲ－Ｌ２）、３（ＦＲ－Ｌ３）および４（ＦＲ－Ｌ４）と重鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）、２（ＦＲ－Ｈ２）、３（ＦＲ－Ｈ３）および４（ＦＲ－Ｈ４）とをさらに含み、前記ＦＲ－Ｌ１は、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｌ２は、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｌ３は、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｌ４は、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ１は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ２は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ３は、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ４は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、軽鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｌ１）、２（ＦＲ－Ｌ２）、３（ＦＲ－Ｌ３）および４（ＦＲ－Ｌ４）と重鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）、２（ＦＲ－Ｈ２）、３（ＦＲ－Ｈ３）および４（ＦＲ－Ｈ４）とをさらに含み、前記ＦＲ－Ｌ１は、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｌ２は、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｌ３は、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｌ４は、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ１は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ２は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ３は、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ４は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、軽鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｌ１）、２（ＦＲ－Ｌ２）、３（ＦＲ－Ｌ３）および４（ＦＲ－Ｌ４）と重鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）、２（ＦＲ－Ｈ２）、３（ＦＲ－Ｈ３）および４（ＦＲ－Ｈ４）とをさらに含み、前記ＦＲ－Ｌ１は、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｌ２は、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｌ３は、配列番号５６のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｌ４は、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ１は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ２は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ３は、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ－Ｈ４は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、前記第１の抗原結合断片の、抗ＣＤ３結合断片の融解温度と比べて高い融解温度（Ｔｍ）；または前記第１の抗原結合断片を試験二重特異性抗原結合構築物に組み込んだときの、前記試験二重特異性抗原結合構築物の、対照二重特異性抗原結合構築物のＴｍと比較して高いＴｍによって明らかなように、配列番号２０６に記載の配列を有する前記抗ＣＤ３結合断片より高い熱安定性を示し、前記試験二重特異性抗原結合構築物は、前記第１の抗原結合断片と、ＣＤ３以外の抗原に結合する参照抗原結合断片とを含み、前記対照二重特異性抗原結合構築物は、配列番号２０６の前記配列からなる前記抗ＣＤ３結合断片と、前記参照抗原結合断片とからなる。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片の前記Ｔｍは、配列番号２０６の前記配列からなる前記抗ＣＤ３結合断片の前記Ｔｍより少なくとも２℃高い、または少なくとも３℃高い、または少なくとも４℃高い、または少なくとも５℃高い。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、重鎖可変領域（ＶＨＩ）を含み、前記ＶＨＩは、配列番号１０２または１０５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するかまたはそれと同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、軽鎖可変領域（ＶＬＩ）を含み、前記ＶＬＩは、配列番号１０１、１０３、１０４、１０６または１０７のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれと同一である。ある特定の実施形態では、前記ＶＨＩおよび前記ＶＬＩは、表Ａに記載の配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むリンカーにより連結されている。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、配列番号２０１～２０５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するかまたはそれと同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、ヒトまたはカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ３に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、ヒトＣＤ３に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、ＣＤ３のＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマまたはＣＤ３ゼータユニットである、ＣＤ３複合体サブユニットに結合する。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、ＣＤ３のＣＤ３イプシロン断片に結合する。一部の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、６．６未満であるかそれに等しい等電点（ｐＩ）を示す。一部の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、両端を含めて６．０～６．６の間の等電点（ｐＩ）を示す。
ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、配列番号２０６で示される配列を有する参照抗原結合断片の等電点（ｐＩ）より少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｐＨ単位低いｐＩを示す。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、ヒトまたはｃｙｎｏ ＣＤ３抗原を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原結合アッセイで決定して、約１０ｎＭ～約４００ｎＭの間の解離定数（Ｋｄ）定数でヒトまたはｃｙｎｏ ＣＤ３に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原結合アッセイで決定して、約１０ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満、または約１００ｎＭ未満、または約１５０ｎＭ未満、または約２００ｎＭ未満、または約２５０ｎＭ未満、または約３００ｎＭ未満、または約３５０ｎＭ未満、または約４００ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でヒトまたはｃｙｎｏ ＣＤ３に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原結合アッセイでのそれぞれの解離定数（Ｋｄ）により決定して、配列番号２０６のアミノ酸配列からなる抗原結合断片の結合親和性と比べて、２分の１以下、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、または１０分の１以下の弱いＣＤ３に対する結合親和性を示す。
ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、キメラまたはヒト化抗原結合断片である。ある特定の実施形態では、前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、線状抗体、または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ある特定の実施形態では、前記第２の抗原結合断片（ＡＦ２）は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、線状抗体、単一ドメイン抗体、または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ある特定の実施形態では、前記第１および第２の抗原結合断片は、（Ｆａｂ’）２または一本鎖ダイアボディとして構成されている。ある特定の実施形態では、前記第２の抗原結合断片（ＡＦ２）は、配列番号７７８～７８３により本明細書において同定されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＩ）；および配列番号８７８～８８３により本明細書において同定されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＩ）を含む。ある特定の実施形態では、前記ＶＨＩＩおよび前記ＶＬＩＩは、表Ａに記載の配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むリンカーにより連結されている。ある特定の実施形態では、前記第１および第２の抗原結合断片は、ペプチドリンカーにより一緒に融合されている。ある特定の実施形態では、前記ペプチドリンカーは、グリシン、セリン、またはプロリンである２または３種のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、前記ペプチドリンカーは、表Ｂに記載の配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮは、第１の複数の非オーバーラップ配列モチーフを含む、複数の非オーバーラップ配列モチーフから形成される第１の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ１）であり；前記ＢＡＲが、第１のバーコード断片（ＢＡＲ１）であり；前記ＲＳが、第１の放出セグメント（ＲＳ１）であり；前記ポリペプチドは、（ｄ）第２の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ２）であって、前記プロテアーゼによる消化の際に前記ポリペプチドから放出可能である第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）を含むＸＴＥＮ２；および（ｅ）前記第２のＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ２）と前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）との間に位置する第２の放出セグメント（ＲＳ２）をさらに含み；前記ＸＴＥＮ２は、（ｉ）少なくとも１００、または少なくとも１５０アミノ酸を含むこと、（ｉｉ）そのアミノ酸残基の少なくとも９０％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）であること；および（ｉｉｉ）Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、またはＰである少なくとも４種の異なるアミノ酸を含むことを特徴とし、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、前記プロテアーゼによる前記ポリペプチドの完全消化の際に前記ポリペプチドから放出可能であるすべての他のペプチド断片と、配列および分子量の点で異なり；前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、前記ポリペプチドの前記Ｎ末端アミノ酸も、前記Ｃ末端アミノ酸も含まない。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮ１は、前記二重特異性抗体構築物のＮ末端に位置し、前記ＸＴＥＮ２は、前記二重特異性抗体構築物のＣ末端に位置する。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮ１は、前記二重特異性抗体構築物のＣ末端に位置し、前記ＸＴＥＮ２は、前記二重特異性抗体構築物のＮ末端に位置する。
ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮ２は、各々長さ９～１４アミノ酸である第２の複数の非オーバーラップ配列モチーフから形成され、前記第２の複数の非オーバーラップ配列モチーフは、（１）前記第２のＸＴＥＮ中で少なくとも２回反復される、非オーバーラップ配列モチーフの第２のセット；および（２）前記第２のＸＴＥＮ内に１回だけ出現する非オーバーラップ配列モチーフを含み；前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、前記第２のＸＴＥＮ内に１回だけ出現する前記非オーバーラップ配列モチーフの少なくとも一部を含む。ある特定の実施形態では、前記非オーバーラップ配列モチーフの第２のセットは、各々独立して、配列番号１７９～２００および１７１５～１７２２により本明細書において同定される。ある特定の実施形態では、前記非オーバーラップ配列モチーフの第２のセットは、各々独立して、配列番号１８６～１８９により本明細書において同定される。ある特定の実施形態では、前記非オーバーラップ配列モチーフの第２のセットは、前記配列モチーフの配列番号１８６～１８９のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つすべてを含む。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮ２は、１００～３，０００、１５０～３，０００、１００～１，０００、または１５０～１，０００アミノ酸残基の長さを含む。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮ２は、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、または少なくとも５００アミノ酸残基の長さを含む。
ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮ２のアミノ酸残基の少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）である。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮ２は、表３ａに記載の配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、前記ＸＴＥＮ２中に、存在する場合別のグルタミン酸に直接隣接しているグルタミン酸を含まない。ある特定の実施形態では、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、そのＣ末端にグルタミン酸を有する。ある特定の実施形態では、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、グルタミン酸残基がすぐ前にあるＮ末端アミノ酸を有する。ある特定の実施形態では、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、前記ポリペプチドの前記Ｎ末端または前記ポリペプチドの前記Ｃ末端のいずれかからある距離に位置し、前記距離は、長さ１０～１５０アミノ酸、または１０～１２５アミノ酸である。ある特定の実施形態では、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、（ｉ）前記ＸＴＥＮ２中に、存在する場合別のグルタミン酸に直接隣接しているグルタミン酸を含まないこと；（ｉｉ）そのＣ末端にグルタミン酸を有すること；（ｉｉｉ）グルタミン酸残基がすぐ前にあるＮ末端アミノ酸を有すること；および（ｉｖ）前記ポリペプチドの前記Ｎ末端または前記ポリペプチドの前記Ｃ末端のいずれかからある距離に位置し、前記距離が、長さ１０～１５０アミノ酸、または１０～１２５アミノ酸であることを特徴とする。
ある特定の実施形態では、前記ＢＡＲ２の前記Ｎ末端アミノ酸の前にある前記グルタミン酸残基は、別のグルタミン酸残基に直接隣接していない。ある特定の実施形態では、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）のＣ末端以外の位置に第２のグルタミン酸残基を、前記第２のグルタミン酸のすぐ後にプロリンが続かない限り、含まない。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮ２は、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＮ末端に位置し、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、前記ポリペプチドの前記Ｎ末端の２００アミノ酸以内、１５０アミノ酸以内、１００アミノ酸以内、または５０アミノ酸以内に位置する。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮ２は、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＮ末端に位置し、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、前記タンパク質の前記Ｎ末端から１０～２００アミノ酸の間、３０～２００アミノ酸の間、４０～１５０アミノ酸の間、または５０～１００アミノ酸の間にある場所に位置する。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮ２は、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＣ末端に位置し、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、前記ポリペプチドの前記Ｃ末端の２００アミノ酸以内、１５０アミノ酸以内、１００アミノ酸以内、または５０アミノ酸以内に位置する。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮ２は、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＣ末端に位置し、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、前記タンパク質の前記Ｃ末端から１０～２００アミノ酸の間、３０～２００アミノ酸の間、４０～１５０アミノ酸の間、または５０～１００アミノ酸の間にある場所に位置する。
ある特定の実施形態では、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、長さ少なくとも４アミノ酸である。ある特定の実施形態では、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、長さ４～２０アミノ酸の間、５～１５アミノ酸の間、６～１２アミノ酸の間、または７～１０アミノ酸の間である。ある特定の実施形態では、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、表２に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮ２は、近位端および遠位端により定義される長さを有し、（１）前記ＸＴＥＮ２の前記近位端は、前記遠位端と比べて、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）の近くに位置し、（２）前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、前記ＸＴＥＮ２の前記遠位端から測定して、前記ＸＴＥＮ２の長さの５％～５０％の間、７％～４０％の間、または１０％～３０％の間にわたる前記ＸＴＥＮ２の領域内に位置する。ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮ２は、追加の１つまたは複数のバーコード断片をさらに含み、前記ＸＴＥＮ２の前記追加の１つまたは複数のバーコード断片各々は、前記プロテアーゼによる前記ポリペプチドの完全消化の際に前記ポリペプチドから放出可能であるすべての他のペプチド断片と、配列および分子量の点で異なる。ある特定の実施形態では、前記第１の放出セグメント（ＲＳ１）および前記第２の放出セグメント（ＲＳ２）は、配列の点で同一である。ある特定の実施形態では、前記第１の放出セグメント（ＲＳ１）および前記第２の放出セグメント（ＲＳ２）は、配列の点で同一ではない。ある特定の実施形態では、前記第２の放出セグメント（ＲＳ２）は、配列番号７００１～７６２６により本明細書において同定される配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、前記第１の放出セグメント（ＲＳ１）および前記第２の放出セグメント（ＲＳ２）は各々、各放出セグメント配列内の１、２または３カ所の切断部位での複数のプロテアーゼによる切断のための基質である。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、融合タンパク質として発現され、前記融合タンパク質は、非切断状態で、Ｎ末端からＣ末端へＸＴＥＮ１－ＲＳ１－ＡＦ１－ＡＦ２－ＲＳ２－ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ１－ＲＳ１－ＡＦ２－ＡＦ１－ＲＳ２－ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ２－ＲＳ２－ＡＦ１－ＡＦ２－ＲＳ１－ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２－ＲＳ２－ＡＦ２－ＡＦ１－ＲＳ１－ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ１－ＲＳ１－ダイアボディＲＳ２－ＸＴＥＮ２、またはＸＴＥＮ２－ＲＳ２－ダイアボディＲＳ１－ＸＴＥＮ１により本明細書において同定される構造配置を有し、前記ダイアボディは、前記ＡＦ１の軽鎖可変領域（ＶＬＩ）、前記ＡＦ１の重鎖可変領域（ＶＨＩ）、前記ＡＦ２の軽鎖可変領域（ＶＬＩＩ）、および前記ＡＦ２の重鎖可変領域（ＶＨＩＩ）を含む。ある特定の実施形態では、前記第１の放出セグメント（ＲＳ１）の前記スペーサーは、第１のスペーサーであり、前記第２の放出セグメント（ＲＳ２）は、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）に第２のスペーサーにより融合されている。ある特定の実施形態では、前記第２のスペーサーは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）である少なくとも４種のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、前記第２のスペーサーは、表Ｃに記載の配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸を含む。
ある特定の実施形態では、前記ＸＴＥＮ１は、表３ａに記載の配列に対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＢｓＡｂは、軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、２（ＣＤＲ－Ｌ２）および３（ＣＤＲ－Ｌ３）と重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、２（ＣＤＲ－Ｈ２）および３（ＣＤＲ－Ｈ３）とを含み、前記ＣＤＲ－Ｈ１、前記ＣＤＲ－Ｈ２、および前記ＣＤＲ－Ｈ３が、それぞれ配列番号８、９、および１０のアミノ酸配列を含む、前記ＡＦ１と、配列番号７７８～７８３により本明細書において同定される軽鎖可変領域（ＶＬＩＩ）および配列番号８７８～８８３により本明細書において同定される重鎖可変領域（ＶＨＩＩ）を含む前記ＡＦ２とを含み；前記ＲＳ１は、配列番号７００１～７６２６により本明細書において同定される配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；前記ＸＴＥＮ２は、表３ａに記載の配列に対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；前記ＲＳ２は、配列番号７００１～７６２６により本明細書において同定される配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へＸＴＥＮ１－ＲＳ１－ＡＦ２－ＡＦ１－ＲＳ２－ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ１－ＲＳ１－ＡＦ１－ＡＦ２－ＲＳ２－ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ２－ＲＳ２－ＡＦ２－ＡＦ１－ＲＳ１－ＸＴＥＮ１、またはＸＴＥＮ２－ＲＳ２－ＡＦ１－ＡＦ２－ＲＳ１－ＸＴＥＮ１により本明細書において同定される構造配置を有する。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、いずれのＸＴＥＮにも連結されていない二重特異性抗体構築物と比較して、少なくとも２倍長い終末相半減期を有する。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、対象への同等用量の投与後に前記二重特異性抗体構築物に選択的に結合するＩｇＧ抗体の産生を測定することにより確認したときに、いずれのＸＴＥＮにも連結されていない二重特異性抗体構築物と比較して免疫原性が低い。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、生理条件下で、約３より大きい、約４より大きい、約５より大きい、または約６より大きい見かけの分子量係数を示す。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、表Ｄ中の配列のような本明細書において同定される配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、上記のポリペプチドと１つまたは複数の薬学的に好適な賦形剤とを含む。ある特定の実施形態では、前記医薬組成物は、任意の臨床的に適切な経路および製剤によるヒトまたは動物への投与用に製剤化される。ある特定の実施形態では、前記医薬組成物は、液体形態であるかまたは凍結されている。ある特定の実施形態では、前記医薬組成物は、単回注射用のプレフィルドシリンジ内にある。ある特定の実施形態では、前記医薬組成物は、投与前に再構成される凍結乾燥粉末として製剤化される。
ある特定の実施形態では、前記組成物は、抗体、抗体断片、抗体コンジュゲート、細胞傷害剤、毒素、放射性核種、免疫調節薬、光活性治療剤、放射線増感剤、ホルモン剤、抗血管新生剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの追加の治療剤との医薬品組合せで存在する。
追加の治療剤は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１（２）阻害剤であり、このＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１（２）阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－Ｌ２抗体である。
ある特定の実施形態では、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１（２）阻害剤は、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１１０６）、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ、ＭＫ－３４７５、ラムブロリズマブ）、ピジリズマブ（ＣＴ－０１１）、ＰＤＲ－００１、ＪＳ００１、ＳＴＩ－Ａ１１１０、ＡＭＰ－２２４およびＡＭＰ－５１４（ＭＥＤＩ０６８０）を含む群から選択される抗ＰＤ－１抗体である。
一実施形態では、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１（２）阻害剤は、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ１１０５）およびＬＹ３３０００５４を含む群から選択される抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり得る。別の実施形態では、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１（２）阻害剤は、抗ＰＤ－Ｌ２抗体である。
ある特定の実施形態では、組合せは、互いに別々の成分を含有するコンビネーションパックである。ある特定の実施形態では、成分は、別々の剤形で同じ疾患の処置における使用のために同時にまたは逐次的に投与される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、過剰増殖性障害を処置するための医薬として使用するための医薬品組合せの一部である。過剰増殖性障害は、乳がん、気道がん、脳がん、生殖器がん、消化管がん、尿路がん、眼がん、肝臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、甲状腺がん、副甲状腺がんおよびそれらの遠隔転移からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、対象の疾患を処置するための医薬の調製に使用される。ある特定の実施形態では、前記疾患は、がんである。
ある特定の実施形態では、対象の疾患を処置する方法であって、それを必要とする前記対象に、医薬組成物または医薬品組合せの１または複数の治療有効用量を投与するステップを含む方法がある。
一実施形態では、疾患は、がんである。ある特定の実施形態では、がんは、膠芽細胞腫、黒色腫、胆管癌、小細胞肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膣がん、血管肉腫、非小細胞肺がん、虫垂がん、扁平上皮がん、唾液腺導管癌、腺様嚢胞癌、小腸がん、および胆嚢がんからなる群から選択される。
対象の疾患を処置する方法であって、それを必要とする前記対象に、上記のような医薬組成物の１または複数の治療有効用量を投与するステップを含む方法が提供される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、治療に有効な処置過程において１または複数の治療有効用量として対象に投与される。ある特定の実施形態では、用量は、任意の臨床的に適切な経路および製剤によりヒトまたは動物に投与される。ある特定の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サル、またはヒトである。
本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、またはその前記ポリヌクレオチド配列の逆相補体を含む核酸も、本明細書で提供される。本明細書に記載の前記ポリヌクレオチド配列と、前記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された組換え調節配列とを含む発現ベクターが、本明細書でさらに提供される。前記発現ベクターを含む宿主細胞が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、原核生物である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
本開示のさらなる態様および利点は、本開示の単に例示的な実施形態が示され、説明される以下の詳細な説明から、当業者には容易に明らかになる。分かるだろうが、本開示は、他の異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、すべて本開示から逸脱することなく、様々な明らかな点で変更が可能である。したがって、図面および説明を本質的に例示的と見なすべきであり、制限的と見なすべきではない。
参照による組み入れ
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願の各々が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の様々な特徴は、添付の特許請求の範囲において特に示されている。本開示の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および以下の添付の図面を参照して得られるであろう。
図１は、様々な長さのＸＴＥＮを有するＸＴＥＮ化プロテアーゼ活性化Ｔ細胞エンゲージャー（「ＸＰＡＴ」）ポリペプチドの混合物を示す。全長のＸＰＡＴ（上）は、Ｎ末端に２８８アミノ酸長のＸＴＥＮおよびＣ末端に８６４アミノ酸長のＸＴＥＮを含む。ＸＰＡＴでは、Ｎ末端のＸＴＥＮとＣ末端のＸＴＥＮの一方または両方において、例えば発酵、精製または生成物調製の他のステップの間に、様々な切断が起こり得る。限定的な切断（ＸＴＥＮの遠位端付近の切断）を有する生成物は全長の構築物と同様の方法で機能する可能性があるが、重度の切断（ＸＴＥＮの近位端に近い切断）はそれらの全長の対応物とは著しく異なる薬理特性を有する可能性がある。切断の存在は、ＸＰＡＴ生成物中の薬理学的に有効なバリアントおよび無効なバリアントを定量化する上で課題となる。全長のＸＰＡＴを使用して図１において例示されているように、各ＸＴＥＮは近位端および遠位端を有し、近位端は、遠位端と比べて、生物学的に活性なポリペプチド（例えば、Ｔ細胞エンゲージャー、サイトカイン、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗体断片、またはＸＴＥＮ化される他のタンパク質）の近くに位置する。
図２は、様々な長さのバーコード付きＸＴＥＮを有するＸＰＡＴポリペプチドの混合物を示す。全長ＸＰＡＴ（上）では、２８８アミノ酸長のＮ末端ＸＴＥＮは、３つの切断可能に融合したバーコード配列「ＮＡ」、「ＮＢ」、および「ＮＣ」（遠位端から近位端に）を含有し、８６４アミノ酸長のＣ末端ＸＴＥＮは、３つの切断可能に融合したバーコード配列「ＣＣ」、「ＣＢ」、および「ＣＡ」（近位端から遠位端に）を含有する。各バーコードは、対応するＸＴＥＮの薬理学的に関連する長さを示すように位置する。例えば、ＸＰＡＴのマイナーなＮ末端切断生成物は、バーコード「ＮＡ」を欠くが（例えば、切断により）、より多くの近位バーコード「ＮＢ」および「ＮＣ」を有し、全長の構築物と実質的に同じ薬理特性を示す可能性がある。対照的に、ＸＰＡＴのメジャーなＮ末端切断生成物は、例えば、Ｎ末端の３つのバーコードのすべてを欠き（例えば、切断により）、全長の構築物と薬理活性が明確に異なる可能性がある。ＸＰＡＴの生物学的に活性なポリペプチド（ここで、Ｔ細胞エンゲージャーの活性部分を構成するタンデムｓｃＦｖ）から、特有のタンパク質分解切断性配列が同定される。ＸＰＡＴの全長バリアント（全長ＸＰＡＴ、マイナーな切断、およびメジャーな切断を含む）に存在するため、生物学的に活性なタンパク質の総量に関する様々な切断生成物の量を定量化するための参照として、この特有のタンパク質分解切断性配列を使用することができる。
図３は、汎用（または通常）ＸＴＥＮにバーコード生成配列を挿入することによって、バーコード付きＸＴＥＮに対する可能な設計を例示する。例示的な汎用（または通常）ＸＴＥＮ（上）は、配列「ＢＣＤＡＢＤＣＤＡＢＤＣＢＤＣＤＡＢＤＣＢ」の非重複１２ｍｅｒモチーフを含み、配列モチーフ「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、および「Ｄ」はそれぞれ３、６、５、および７回出現している。例示的な汎用ＸＴＥＮのＧｌｕ－Ｃプロテアーゼ消化物（上のパネル）は、両末端（「ＮＴ」および「ＣＴ」）を除いて特有のペプチドを生じない。バーコード生成配列「Ｘ」（例えば、特有の１２ｍｅｒ）のＸＴＥＮへの挿入により、ＸＴＥＮのどこにも存在しない特有のタンパク質分解切断性配列（またはバーコード配列）を生じる。バーコード生成配列「Ｘ」は、結果として得られるバーコードがＸＴＥＮの薬理学的に関連する長さをマークするように位置され得る。例えば、切断によりバーコードを欠くＸＴＥＮは、バーコードを有する対応するＸＴＥＮと機能的に異なる場合がある。当業者であれば、バーコード生成配列（「Ｘ」）がバーコード配列自体であり得ることを理解するであろう。あるいは、バーコード生成配列（「Ｘ」）は、結果として得られるバーコード配列と異なり得る。例えば、バーコード配列は、前にあるかまたは後に続く１２ｍｅｒのモチーフの一部と重複し、よって、これを含有し得る。
図４Ａ～４Ｂは、Ｎ末端ＸＴＥＮに関する切断レベルの定量化を例示する。図４Ａは、汎用ＸＴＥＮ（上のパネル）における配列モチーフ（例えば、Ｎ末端から３番目の配列モチーフ「Ｄ」）をバーコード生成モチーフ「Ｘ」と置き換えることによって、バーコード付きＸＴＥＮ（下のパネル）を構築することができることを実証し、この例では、バーコード生成モチーフ（「Ｘ」）は、それ自体特有のタンパク質分解切断性バーコード配列である。図４Ａの下のパネルに示されているように、バーコードは、ＸＴＥＮの重度切断形態のすべてがバーコードを欠き、ＸＴＥＮの限定切断形態のすべてがバーコードを含有するように位置する。図４Ｂは、ＸＰＡＴの２つの異なる混合物における様々な切断生成物の相対的存在量を例示する。混合物のうちの１つでは、バーコードは、生物学的に活性なタンパク質を含有する構築物の９９％に存在する。混合物のうちの他の１つでは、構築物の１３％がバーコードを欠いている（例えば、切断に起因して）。図４Ａ～４Ｂは、実質的に同様の平均分子量を有するが、明らかに異なる薬理活性を有する２つのポリペプチド混合物を区別するためのバーコード付きＸＴＥＮの使用について例示する。 同上。
図５Ａ～５Ｂおよび６Ａ～６Ｃは、様々なレベルの標的抗原発現を有する標的細胞に対するマスクされた（ＸＴＥＮ化）およびマスクされていない二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの用量依存的細胞傷害性を例示する。タンパク質分解によりマスクされていない（脱ＸＴＥＮ化）二重特異性は、例えば、ＳＫ－ＯＶ－３細胞およびＢＴ－４７４細胞を用いて試験した場合に、一桁のｐＭ範囲内のＥＣ５０を有する様々な腫瘍系統に対して強力な細胞傷害性を実証する。ＸＴＥＮ化は、例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを免疫シナプスの形成から保護し、それによって、濃度－応答曲線の右方シフトによって示されている傷害性の低下をもたらす、強固なマスク能力をさらに実証する。
図５Ａ～５Ｂは、一般にＸＴＥＮ化プロテアーゼ活性化Ｔ細胞エンゲージャー（「ＸＰＡＴ」）への、および特にＨＥＲ２－ＸＰＡＴへのＸＴＥＮによる効果的なマスクを例示する。例えば、２つの異なるＨＥＲ２－発現（例えば、がん）細胞系に対するＸＴＥＮ化（マスクされた）ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ（例えば、表Ｄに記載）および対応する脱ＸＴＥＮ化（マスクされていない、活性化）ＨＥＲ２－ＰＡＴの細胞傷害性を用量依存的に観察した。マスクされていない脱ＸＴＥＮ化ＰＡＴ（塗りつぶした丸で示されている）によって、それぞれ３．４ピコモル（ｐＭ）（ＳＫＯＶ３細胞）（図５Ａ）および４．８ｐＭ（ＢＴ４７４細胞）（図５Ｂ）のＥＣ５０値が得られ、一方、対応するマスクされた、ＸＴＥＮ化ＰＡＴ（塗りつぶした四角で示されている）によって、４４，４７４ｐＭ（ＳＫＯＶ３細胞）および４９，３７０ｐＭ（ＢＴ４７４細胞）のＥＣ５０値が得られ、少なくとも１０４倍のマスク効果が示された。
図６Ａは、非がん性組織（心筋細胞）と接触した場合に、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーへのＸＴＥＮによる効果的なマスクを示す。より詳細には、図６Ａは、心筋細胞に対するＸＴＥＮ化（マスクされた）ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ（例えば、表Ｄに記載）および対応する脱ＸＴＥＮ化（マスクされていない、活性化）ＨＥＲ２－ＰＡＴの細胞傷害性を示す。マスクされていない、脱ＸＴＥＮ化ＰＡＴに応答したＴ細胞誘導性細胞溶解による心筋細胞の死滅が観察されたが（およそ６４ｐＭのＥＣ５０濃度を有する）、腫瘍細胞とは対照的に、心筋細胞は、１マイクロモル（μＭ）もの高濃度でマスクされたＸＴＥＮ化ＰＡＴによる死滅に対して不溶性のままであった。
図６Ｂ～６Ｃは、標的細胞を比較的中程度のレベルまたは低レベルに標的抗原発現させるという点で、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーへのＸＴＥＮによる強固なマスクを例証する。例えば、図６Ｂは、ＸＴＥＮ化および脱ＸＴＥＮ化プロテアーゼ活性化Ｔ細胞エンゲージャー（ＰＡＴ）の、ＨＥＲ２発現が低レベルであるがん細胞系、ＭＣＦ－７への細胞傷害性効果を例示し、ここで、ＸＴＥＮポリペプチドによるマスクによって、試験したＨＥＲ２－ＸＰＡＴのＴ細胞媒介性細胞傷害性はおよそ１０４分の１に低下した。別の例として、ＨＥＲ２発現が中程度のレベルである別のがん細胞系、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３に対するＸＴＥＮ化（マスクされた）ＨＥＲ２－ＸＰＡＴおよび対応する脱ＸＴＥＮ化（マスクされていない、活性化）ＨＥＲ２－ＰＡＴの細胞傷害性を測定した（図６Ｃ）。 同上。
図７Ａ～７Ｄは、対象におけるＸＴＥＮ化二重特異性のタンパク質分解による活性化およびそれによって誘導される強固な腫瘍退縮を例示する。図７Ａは、腫瘍保有マウス（例えば、ＢＴ－４７４）において、切断性ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２ Ｔ細胞エンゲージャー（六角形で示されている「ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ」）および対応するマスクされていないＨＥＲ２ Ｔ細胞エンゲージャー（三角で示されている「ＨＥＲ２－ＰＡＴ」）の等モル投与により誘導される同等の有効性を例示する。（＊＊はｐ＜０．０１を示す）。注目すべきことに、２つの試験したＸＴＥＮ化二重特異性間で、腫瘍退縮は、切断性ＸＴＥＮ化構築物（六角形で示されている）では観察されたが、非切断性ＸＴＥＮ化対応物（菱形で示されている）では観察されず、タンパク質分解によってマスクされないこと（脱ＸＴＥＮ化）が有効性に対する必須条件であることを示した。図７Ｂは、単回用量（例えば、１キログラム当たり２．１ミリグラム（ｍｐｋ））による大きな腫瘍に対する切断性ＸＴＥＮ化二重特異性（例えば、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ）の有効性を例示する。本実験において使用した非切断性構築物は、対応する切断性構築物と同一であるが、放出部位が、ＧＡＳＴＥＰアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタメート、および／またはプロリン）から作製される同様の長さの非切断性配列で置き換えられている。図７Ｃは、マスクされていないＨＥＲ２－ＰＡＴ（塗りつぶした四角）および非切断性ＸＰＡＴ（塗りつぶした菱形）と比較した、２つの異なる濃度（１５ｎｍｏｌ／Ｋｇおよび３６ｎｍｏｌ／Ｋｇ）のマスクされたＨＥＲ２－ＸＰＡＴ（塗りつぶした三角）の有効性を示す。ビヒクルおよびビヒクル＋ＰＢＭＣで処置した腫瘍に関するデータも示されている。図７Ｄは、ＢＴ－４７４腫瘍保有マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＨＥＲ２－ＰＡＴの切断パーセンテージを示す。 同上。 同上。 同上。
図８は、ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＸＰＡＴの投与によって対象において誘導されるリンパ球辺縁趨向を例示する。例えば、ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ（例えば、表Ｄに記載）の単回用量の静脈内注入（例えば、１０ｍｌ／ｋｇの投与体積で２５ｍｇ／ｋｇ）の際に、投与の６時間後に開始して投与の少なくとも２４～７２時間後まで継続して、雌性と雄性両方のサル対象（それぞれ、三角と四角で示されている）において、リンパ球数（血液学）の減少が観察された。
図９Ａ～９Ｂ。図９Ａは、対象（例えば、カニクイザル）の血漿循環におけるＸＴＥＮ化プロテアーゼ活性化Ｔ細胞エンゲージャー（ＰＡＴ）の安定性を例示する（例えば、２５ｍｇ／ｋｇ用量で）。ＸＴＥＮ化ＰＡＴのクリアランスが、その非切断性形態に対して有意に増加しないことは、末梢における切断が最小限であることを示す。試験した切断性ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ（塗りつぶした三角と塗りつぶした四角）と非切断性対応物（黒塗りされていない三角と黒塗りされていない四角）の間で同等の薬物動態が観察された。本実験において使用した非切断性構築物は、対応する切断性構築物と同一であるが、放出部位が、ＧＡＳＴＥＰアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタメート、および／またはプロリン）から作製される同様の長さの非切断性配列で置き換えられている。図９Ｂは、投与の９６時間後でさえも、循環中のＨＥＲ２－ＸＰＡＴのタンパク質分解による代謝物の出現頻度が低いことを示す。 同上。
図１０Ａ～１０Ｃ。図１０Ａは、単回用量の、単一対象ＨＥＲ２－ＸＰＡＴの用量漸増を示し、４２ｍｇ／ｋｇまでのすべての用量が耐性であったことを実証する。図１０Ｂは、マスクされていないＨＥＲ２－ＰＡＴの最大耐量が０．２ｍｇ／ｋｇである単一対象ＨＥＲ２－ＰＡＴ漸減スキームを示す。図１０Ｃは、マスクされていないＨＥＲ２－ＰＡＴと比較した場合の、マスクされたＨＥＲ２－ＰＡＴの血漿中濃度（４５０倍高い耐性Ｃｍａｘ）を示す。 同上。 同上。
図１１Ａ～１１Ｅ。図１１Ａおよび１１Ｂは、ＨＥＲ２－ＰＡＴと比較した場合の、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴに応答した末梢Ｔ細胞の活性化がないことを示す末梢Ｔ細胞活性化データを示す。図１１Ｃ～１１Ｅは、様々な濃度のＨＥＲ２－ＸＰＡＴおよびＨＥＲ２－ＰＡＴで処置した対象におけるサイトカインＩＬ－６（図１１Ｃ）、ＴＮＦ－α（図１１Ｄ）およびＩＦＮ－γ（図１１Ｅ）のレベルを示し、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴが、５０ｍｇ／ｋｇでさえもサイトカイン放出を誘導しないことを実証している。注記、サイトカインレベルの正常範囲：ＩＬ－６≦６ｐｇ／ｍｌ、ＴＮＦ－α １～１０ｐｇ／ｍｌ、ＩＦＮ－γ≦１０ｐｇ／ｍｌ。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１２。ＮＨＰおよびヒトからの血漿試料中でｅｘ ｖｉｖｏでインキュベートしたＡＭＸ－８１８は、炎症条件下でさえも、マスクされていないＴＣＥへの最小限の切断しか示さなかった。タンデムｓｃＦｖに結合した蛍光標識（ＤｙＬ６５０）を有するＡＭＸ－８１８を指定した血漿試料中で３７℃にて７日間インキュベートした。次いで、試料をゲル上にランさせ、ＡＭＸ－８１８のマスクされていない活性形態とサイズが類似する代謝物をＬＩ－ＣＯＲ検出器を使用して定量化した。炎症性疾患のヒト試料は、関節リウマチ、狼瘡、炎症性腸疾患、および多発性硬化症を有する患者に由来した。がんのヒト試料は、肺、乳房、および結腸の腫瘍を有する患者に由来した。試料サイズ：健康なＮＨＰ Ｎ＝４、健康なヒト Ｎ＝４、「炎症性の」ＮＨＰ Ｎ＝６、「炎症性の」ヒト Ｎ＝２７、がんのヒト Ｎ＝１１。
図１３Ａ～図１３Ｂ。本発明の好ましいＨＥＲ２－ＸＰＡＴの安全性プロファイルを指示する追加データを提供する。図１３Ａにおけるデータは、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ形式と非切断性ＨＥＲ２－ＰＡＴ形式の間で同等のＰＫを示し、プロテアーゼ放出部位が、高用量であっても、カニクイザルの循環中でおおいに安定なままであることを実証している。図１３Ｂは、高用量のＨＥＲ２ ＸＰＡＴであっても、一方または両方のＸＴＥＮマスクを欠く代謝物の全身蓄積は非常に限定されたものであることを示す。 同上。
図１４Ａ～１４Ｄ。ＡＭＸ８１８および８１８－ＰＡＴは、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞に応答して、Ｔ細胞上でのＰＤ－１の表面発現を誘導する。表面のＰＤ－１発現は、指定した濃度の試験物に関して、５：１のエフェクター：標的比でのＰＢＭＣおよびＳＫＯＶ３細胞の４８時間の同時インキュベーション後に、フローサイトメトリーによってＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞上で評価した。図１４Ａおよび図１４Ｃは、ＡＭＸ８１８および８１８－ＰＡＴの存在下で、ＣＤ４＋ Ｔ細胞上での表面ＰＤ１発現を示す。図１４Ｂおよび図１４Ｄは、ＡＭＸ８１８および８１８－ＰＡＴの存在下で、ＣＤ８＋ Ｔ細胞上での表面ＰＤ１発現を示す。 同上。 同上。 同上。
図１３Ａ～１３Ｃ。ＡＭＸ８１８および８１８－ＰＡＴは、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞に応答して、Ｔ細胞上でのＰＤ－Ｌ１の表面発現を誘導する。図１５Ａおよび図１５Ｂは、指定した濃度の試験物に関する、５：１のエフェクター：標的比のＳＫＯＶ３細胞上でのＰＤ－Ｌ１発現を示す。図１５Ｃは、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞上での表面ＨＥＲ２発現を示す。 同上。 同上。
図１６Ａ～１６Ｃ。ＸＰＡＴは、生きたマウスに移植したヒト腫瘍において、マスクされていないＴＣＥへと優先的に切断され、健康な組織では最小限の切断しか観察されていない。単回用量の１．８ｍｇ／ｋｇ（１３ｎＭ）の赤色蛍光標識した（Ａｌｅｘａ）ＸＰＡＴをヒト腫瘍を移植したマウスに注射した（図１６Ａ）。２日後に、腫瘍および健康な臓器を採取し、ｉｎ ｖｉｖｏでプロテアーゼ切断を測定した（図１６Ｂに示されている結果）。緑色蛍光標識した（Ｄｙｌ８００）ＸＰＡＴは、処理中の関連性のない細胞内プロテアーゼの放出に起因し得る人工的な切断を考慮して、プロテアーゼ阻害剤の存在下で組織採取後に添加した。赤色と緑色で蛍光標識したＸＰＡＴにより生じた切断生成物を比較することによって、本発明者らは、様々な組織でｉｎ ｖｉｖｏで発生した切断と組織処理中に人為的に発生した切断を決定することができる。概して、腫瘍を移植したマウスに注射してから２日目までに、腫瘍内のＸＰＡＴの２０％が活性化される（９種類の腫瘍にわたりｎ＝３１、図１６Ｃ）。 同上。 同上。
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好ましい実施形態の詳細な説明
満たされていない有意な要求が、がん治療にはある。ＴＣＥは、ある特定のがんの寛解を誘導する点で有効であることが示されているが、健康な組織におけるそれらの極めて強い作用強度およびオンターゲット、オフ腫瘍毒性に起因して、広範な治療薬を生み出していない。説明として、ＴＣＥは、Ｔ細胞と腫瘍細胞とを架橋し、Ｔ細胞の媒介により腫瘍細胞を活性化し、さらに、サイトカイン増幅カスケードの開始を活性化し、それによってさらなる死滅が促進され、長期にわたる免疫が得られる可能性がある。抗原－ＭＨＣ認識に非依存的な方法で細胞溶解性パーフォリン／グランザイムを放出するようにＴＣＥにより活性化されるＴ細胞。これは、直接的な腫瘍細胞死、および腫瘍細胞からの強力なサイトカイン応答の開始による腫瘍死滅の増幅という、２倍の応答を生じさせる。直接的な腫瘍細胞死は、腫瘍抗原の放出をもたらす。サイトカイン応答としては、数ある中で特に、ＣＤ８ Ｔ細胞活性を刺激し、ＡＰＣによる抗原提示を刺激する、インターフェロン－γの増加；活性化されたＴ細胞の増殖の増加を引き起こすＩＬ２の増加；ならびにＴ細胞動員を増加させるＣＸＣＬ９および１０応答の増加が挙げられる。まとめると、腫瘍抗原の放出、およびサイトカイン応答の開始は、内因性Ｔ細胞応答の活性化をもたらし、それに起因してエピトープ拡大が生じて長期にわたる免疫を誘導する可能性がある。
ＴＣＥに伴う毒性の課題は、大部分の腫瘍標的が、ある程度、健康な組織にも発現されること、および正常な細胞もまた、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）をもたらすサイトカイン応答を生じさせ得ることに起因する。ＴＣＥによるＴ細胞活性化に対する健康な組織のこれら２つの強力な応答は、これらの作用因子の治療指数の全般的な欠如をもたらす。
本発明は、ＨＥＲ２を標的とする、条件次第で活性化されるＴＣＥ、ＸＰＡＴまたはＸＴＥＮ化プロテアーゼ活性化二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（本明細書ではＨＥＲ２－ＸＰＡＴと呼ばれ、ＡＭＸ８１８として例示される）を提供することにより、既存のＴＣＥの欠点を克服する。より詳細には、本発明のＸＰＡＴは、健康な組織に対して腫瘍に存在する異常調節されたプロテアーゼ活性を活用し、ひいては治療指数の拡大を可能にする。ＸＰＡＴコアは、ＣＤ３を標的とする２つの一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）と腫瘍標的（例示的な実施形態では、腫瘍標的はＨＥＲ２である）とからなる。２つの非構造化ポリペプチドマスク（ＸＴＥＮ）がコアに結合されており、これらのＸＴＥＮは、腫瘍標的および／またはＣＤ３のどちらかの標的エンゲージメントを構造的に低減させ、タンパク質半減期を延長する。ＸＴＥＮポリマーの特性はまた、免疫原性の可能性を最小限に抑える。その安定した三次構造の欠如が、抗体結合に不利であり、ペプチドＭＨＣ ＩＩ結合のアンカー残基として役立つ疎水性、芳香族および正荷電残基の非存在が、Ｔ細胞エピトープへの結合の可能性を低下させるからである。ヒトの場合、ＸＴＥＮを含有する薬物で処置された＞２００名の患者において、半減期が延長されたヒト成長ホルモンおよび第ＶＩＩＩ因子の形態に関連して、ＸＴＥＮポリマーの最小の免疫原性が観察された。ＸＴＥＮマスクの基部のプロテアーゼ切断部位は、腫瘍微小環境においてＸＰＡＴのタンパク質分解活性を可能にし、これにより、標的を発現する腫瘍細胞を死滅させるように細胞傷害性Ｔ細胞を再指向させることができる小型の極めて強力なＴＣＥが引き離される。プロテアーゼ活性が厳重に調節される健康な組織では、ＸＰＡＴは、主として、無傷のプロドラッグとして不活性のままであるはずであり、それ故、マスクされていないＴＣＥと比較して治療指数を拡大する。
局所的活性化に加えて、マスクされていないＰＡＴ形態の短い半減期は、治療指数をさらに広げるはずであり、さらに、固形腫瘍の根絶を改善するためのＴ細胞免疫性の作用強度をもたらすはずである。ＸＰＡＴに使用される放出部位は、あらゆるがんの顕著な特徴（成長；生存および死亡；血管新生；浸潤および転移；炎症；ならびに免疫回避）にまとめて関与する広範囲の腫瘍にわたって、プロテアーゼにより切断され得る。したがって、ＸＰＡＴのＴＣＥ活性は、がんおよび腫瘍発症のすべてのステージで上方調節されるが健康な組織では厳重に調節される増強されたプロテアーゼ活性を活用することにより、腫瘍に局在化される。
例示的なＨＥＲ２－ＸＰＡＴ成分であるＡＭＸ－８１８は、健康な組織では十分な防御をもたらすが広範囲のがんにわたって腫瘍では必要な作用強度を保持する望ましいバランスを達成するように最適化されたものである。プロドラッグによるＴ細胞活性化の可能性を低下させるために、より長いＸＴＥＮポリマーマスク（ＨＥＲ２部位における２５６アミノ酸に対して５７６アミノ酸のマスク）に加えて、ａ－ＣＤ３ドメインに対するより低い結合親和性を選択した。腫瘍におけるＡＭＸ－８１８の十分な活性化を確保するために、ＸＴＥＮの基部のプロテアーゼ放出部位を、がんにおいて過剰発現または異常調節されることが報告されている３つの異なるクラスの中の少なくとも８つの異なるプロテアーゼにより切断されるように操作した。これらは、いくつかのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、マトリプターゼ、ｕＰＡ、およびシステインプロテアーゼ、レグマインを含む。安全性チェックポイントとして、ＡＭＸ－８１８によるＣＤ３とＨＥＲ２両方のコエンゲージメントがＴ細胞活性化に必要とされる。Ｔ細胞の活性化は、ＡＭＸ－８１８が、ＨＥＲ２発現が非存在である炎症組織においてマスクされなかった場合、またはＡＭＸ－８１８が、プロテアーゼが厳重に制御されている健康な組織において発現されたＨＥＲ２に遭遇した場合、起こらないはずである。このＡＮＤゲート特色は、上昇したプロテアーゼ活性と高度なＨＥＲ２発現の両方が存在する腫瘍において優先的活性化をもたらすと予想される。
したがって、ＸＰＡＴ上のＸＴＥＮの存在は、長い半減期、弱い標的エンゲージメントおよびごくわずかなＴ細胞活性化を有する薬剤を生じさせる。ＸＴＥＮが腫瘍微小環境においてプロテアーゼの作用により除去されると、ＸＰＡＴのこの優先的活性化によって、短い半減期、最適な標的エンゲージメント、および非常に効率的なＴ細胞活性化を有する活性化薬物（ＸＴＥＮを伴わない、ＰＡＴ）が生成され、その結果、治療指数が向上した強力な活性化薬物が生成される。本発明のＨＥＲ２－ＸＰＡＴは、Ｔ細胞エンゲージャーの固形腫瘍に対する作用強度を維持しつつ毒性プロファイルを改善でき、したがって、治療指数の有意な増加、およびこの強力なモダリティーの標的景観の拡大を可能にする。
例示的なＨＥＲ２－ＸＰＡＴである、ＡＭＸ－８１８から生成されたデータの概要
ＡＭＸ－８１８の標的結合およびｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性は、複数の研究で特徴付けられている。表面プラズモン共鳴を利用する平衡結合分析は、毒性およびＰＫ研究のための種としてのカニクイザルの使用を支持する、ヒトＨＥＲ２およびＣＤ３とカニクイザルＨＥＲ２およびＣＤ３との間のＡＭＸ－８１８およびその代謝物に対する極めて同等の親和性を実証した。タンパク質分解により活性化されたＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）は、ヒトおよびカニクイザルＨＥＲ２に、それぞれ２．４ｎＭおよび２．０ｎＭの親和性で、ならびにヒトおよびカニクイザルＣＤ３に、それぞれ２６．３ｎＭおよび２１．５ｎＭの親和性で結合した。ＡＭＸ－８１８のマスクは、両方の種について、ＨＥＲ２へのその親和性を１０分の１に、ＣＤ３へのその親和性をおおよそ６分の１にした。ＡＭＸ－８１８は、ヒトおよびカニクイザルＨＥＲ２に２４．９ｎＭおよび２０．１ｎＭの親和性で結合し、その一方で、ヒトおよびカニクイザルについてのＣＤ３親和性は、それぞれ、１６０ｎＭおよび１４０．３ｎＭであった。
ＴＣＥの活性は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有効に刺激することによってＴ細胞を活性化するその能力に依存する。ＴＣＥの極めて強い作用強度は、刺激を受け、合体してＴ細胞と標的細胞との間に免疫シナプスを形成するＴＣＲがわずか３つという、細胞傷害性を開始させるための最小の要件から生じる。Ｔ細胞エンゲージャーが細胞傷害性を誘導することは元々公知であるが、それらの作用強度には、抗腫瘍免疫応答を増強し、増幅する、Ｔ細胞活性化の下流のサイトカイン駆動作用も関与する。ＡＭＸ－８１８、その原型ＡＭＸ－８１８－Ｐ１、およびそのタンパク質分解代謝物によるＴ細胞の活性化を、ＨＥＲ２を高度に発現する腫瘍細胞であるＢＴ－４７４（乳房）およびＳＫＯＶ－３（卵巣）の存在下で、ジャーカットＮＦＡＴ－レポーター細胞および初代ヒトＰＢＭＣを利用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで特徴付けた。ヒトＴ細胞は、フローサイトメトリーにより表面活性化マーカーＣＤ６９および阻害性受容体ＰＤ－１の上方調節についても評価した。Ｔ細胞活性化の間接的な尺度として、ＰＤ－１のリガンドであるＰＤ－Ｌ１の上方調節をＳＫＯＶ３腫瘍標的の表面で評価した。それは、活性化Ｔ細胞により分泌されるＩＦＮ－γに応答して誘導されるからである。
ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）は、ジャーカットＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターＴ細胞をＢＴ－４７４細胞の存在下、７０ｐＭ範囲のＥＣ５０値で活性化したが、マスクされたＡＭＸ－８１８およびＡＭＸ－８１８－Ｐ１への応答は、大幅に４桁減弱され、最大応答が、活性化ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）のものと比較して８０～９０％低下した。ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）によるＴ細胞活性化は、ＨＥＲ２＋ＢＴ－４７４腫瘍細胞の非存在下では観察されず、このことにより、ＣＤ３の一価エンゲージメントが活性化に十分なものでなかったこと、およびＣＤ３と腫瘍標的の両方のコエンゲージメントが、有効なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激に必要であったことが実証された。単独でマスクされたＡＭＸ－８１８代謝物である、ＡＭＸ－８１８（１ｘ－Ｃ）およびＡＭＸ－８１８（１ｘ－Ｎ）は、中間の活性を見せた。ＡＭＸ－８１８－ＮｏＣｌｖＳｉｔｅは、検出可能なＴ細胞活性化を誘導せず、このことは、ＡＭＸ－８１８により観察される最小の応答が、タンパク質分解的切断により駆動された可能性が高いことを示唆していた。
ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）およびプロドラッグＡＭＸ－８１８は、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットとＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの両方の表面でのＣＤ６９およびＰＤ－１の発現ならびにＳＫＯＶ３腫瘍細胞上でのＰＤ－Ｌ１の発現を同等の程度に誘導した。しかし、ＡＭＸ－８１８についての用量応答曲線は、ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）のものと比べて平均で４００～６５０倍大きくシフトされ、このことにより、ＡＭＸ－８１８上のＸＴＥＮマスクの有効な機能的マスクがさらに実証された。
ＡＭＸ－８１８およびその代謝物を、それらの細胞傷害活性および炎症性サイトカインの誘導について特徴付けた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として使用し、ＨＥＲ２高発現ＢＴ－７４７乳房腫瘍系を腫瘍標的細胞として選択した。心臓組織は、ＨＥＲ２を発現することが公知であり、稀にではあるが、心毒性が一部のＨＥＲ２標的療法で処置された患者において観察されているため、初代心筋細胞（ＨＥＲ２ 低から中等度）を、ＡＭＸ－８１８およびそのタンパク質分解代謝物のより生理的な細胞溶解標的を示すために選択した。発光に基づく細胞傷害性アッセイを１：１のエフェクター：標的細胞比で行い、無細胞上清をＴＣＥ誘導サイトカインの測定のために収集した。
ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）は、ＢＴ－４７４腫瘍細胞に対して非常に強力な細胞傷害性を明示し、５～１１ｐＭ範囲の半最大阻害濃度（ＩＣ５０）値でほぼ完全な標的細胞死滅を示した。ＨＥＲ２発現がより少ないヒト心筋細胞－異常調節されたプロテアーゼ活性を示すと予想されない細胞－を標的として用いると、細胞傷害性応答は、おおよそ１３分の１になり、最大死滅は、不完全であり、５０～６０％にしか達しなかった。ＢＴ－４７４および心筋細胞の両方に対するＡＭＸ－８１８による細胞傷害性応答は、強く減弱され、平均ＩＣ５０値が２５００倍～３０００倍シフトされ、このことにより、そのＸＴＥＮポリマーマスクによるプロドラッグの有効な機能的マスクが実証された。マスクは、標的細胞死滅を開始させるために必要な機能的免疫シナプスの形成を妨げることによる標的結合の低減に対するそれらの複合的影響を優に上回る細胞傷害性からの相乗的防御をもたらす。ＡＭＸ－８１８およびその原型ＡＭＸ－８１８－Ｐ１は、それらのほぼ同一の組成と一致する同等の細胞傷害性を示した。単独でマスクされたタンパク質分解代謝物である、ＡＭＸ－８１８（１ｘ－Ｎ）およびＡＭＸ－８１８（１ｘ－Ｃ）の細胞傷害性は、ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）とＡＭＸ－８１８の中間であり、このことにより、単独マスクによる部分的な防御が実証された。ＡＭＸ－８１８により観察された細胞傷害性は、両方のプロテアーゼ切断部位を欠いている形式であるＡＭＸ－８１８－ＮｏＣｌｖＳｉｔｅによって提供される活性のさらなる低減に基づいて、タンパク質分解的切断に起因する可能性が高かった。
一般に、細胞傷害性アッセイからの上清中のサイトカイン分泌を誘導する点でのＡＭＸ－８１８およびその代謝物の相対作用強度は、ＢＴ－４７４および心筋細胞標的細胞の両方に対する細胞傷害性に関して観察されたものとよく似ていた（ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）が最も強力であり、＞単独でマスクされた形態＞ＡＭＸ－８１８であり、ＡＭＸ－８１８が最も強度が低かった）。サイトカインＩＣ５０値は、細胞傷害応答についてのものより平均して高く、このことにより、これら２つの間で細胞傷害性のほうが感度の高いアッセイであることが実証された。ＡＭＸ－８１８の応答は、ＢＴ－４７４および心筋細胞の両方の存在下で、ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）のものと比べて数桁低減され、その一方で、単独でマスクされた代謝物ＡＭＸ－８１８（１ｘ－Ｎ）およびＡＭＸ－８１８（１ｘ－Ｃ）は、中間の応答を示した。
心筋細胞の存在下では、試験したその最高濃度（３００ｎＭ）でＡＭＸ－８１８により誘導されたサイトカインの最大レベルは、ＩＬ－６を除いて、ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）により誘導されたものと比べて著しく低下した。ＢＴ－４７４および心筋細胞の両方の存在下で、上昇したＩＬ－６レベルが、ＡＭＸ－８１８とＡＭＸ－８１８－ＮｏＣｌｖＳｉｔｅの両方の３００ｎＭ濃度で検出され、そのレベルは、殆どの場合、ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）により生じた最大レベルを２～６倍上回っていた。注目すべきことに、これは、ＩＬ－６のピーク全身レベルが、ＡＭＸ－８１８の４２ｍｇ／ｋｇのＭＴＤでよりＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）の０．２ｍｇ／ｋｇのＭＴＤでのほうが、＞９倍高い、カニクイザルにおいて観察されたものとは対照的である。
ＨＥＲ２を発現する標的細胞の非存在下でのサイトカインの誘導を評価した際、サイトカインＩＬ－２、ＩＬ－４、ＴＮＦ－α、およびＩＦＮ－γは、懸濁およびプレート被覆ＡＭＸ－８１８またはＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）で処理されたヒトＰＢＭＣ培養物では誘導されなかった。試験したその最高濃度（５００ｎＭ）で、可溶性ＡＭＸ－８１８は、すべてのＰＢＭＣドナーから低いＩＬ－１０レベルを誘導した。ＩＬ－６は、注目に値する例外であり、５００ｎＭで、可溶性形態で、ＡＭＸ－８１８は、抗ＣＤ３抗体陽性対照により誘導されるレベルを上回るＩＬ－６レベルをその手段で平均４．６倍増加の差をつけてすべてのドナーから誘導した。高いＩＬ－６レベルが湿潤プレート被覆形式で５つのドナーのうちの２つからも誘導され、より低いＩＬ－６レベルが最高濃度のＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）でも見られた。しかし、重要なこととして、そのような上昇したＩＬ－６レベルは、ＣＲＳの条件下でＩＬ－６分泌に通常は共に関連付けられるサイトカインであるＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２の増加を伴わず、５０ｍｇ／ｋｇ以下のＡＭＸ－８１８が投与されたカニクイザルでも観察されなかった。対照的に、活性化ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）は、ｃｙｎｏにおいて用量≦０．３ｍｇ／ｋｇで高いＩＬ－６レベルを誘導し、これには追加の炎症性サイトカインの増加が伴った。
ｉｎ ｖｉｖｏ薬理学、ＰＫおよび毒性研究を、ＡＭＸ－８１８およびその代謝物の有効性および安全性を特徴付けるために行った。標準的な毒性エンドポイントに加えて、循環中のＡＭＸ－８１８のタンパク質分解安定性を、高用量のＡＭＸ－８１８を投与したまたは炎症誘発条件下のカニクイザルにおいて、およびｉｎ ｖｉｔｒｏで、がんまたは全身性自己免疫疾患に罹患している患者からの血漿中での長期インキュベーション後に、評価した。腫瘍におけるＡＭＸ－８１８の優先的切断は、プロテアーゼ依存性の有効性をもたらすことは明らかであったが、ＮＨＰ中でのその末梢安定性によってＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）と比べて大きい安全域が得られ、それによって治療指数の増加が予測された。まとめると、これらのデータは、循環および末梢組織中で同時に生じる安定性および有効なマスクによって腫瘍に局所化された活性を可能にする、ＡＭＸ８１８の条件次第の強力なマスクを裏付ける。
ＨＥＲ２発現腫瘍を死滅させるようにＴ細胞を再指向させる点でのＡＭＸ－８１８の影響を評価するために、いくつかのｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究を行った。ＡＭＸ－８１８は、マウスＨＥＲ２またはＣＤ３に対して交差反応性ではないので、免疫不全マウスにヒトＨＥＲ２発現異種移植片腫瘍を接種し、ヒトＰＢＭＣ（ｈＰＢＭＣ）をエフェクターＴ細胞源として生着させた。ＡＭＸ－８１８の抗腫瘍活性を、ＨＥＲ２高発現ＢＴ－４７４乳房モデル（約９７５，０００のＨＥＲ２受容体）およびＨＥＲ２低発現ＨＴ－５５結腸直腸モデル（２５，０００の受容体）において評価した。
ＢＴ４７４モデルにおいて、２．１ｍｇ／ｋｇの等モル用量のＡＭＸ－８１８およびその原型ＡＭＸ－８１８－Ｐ１、または０．９ｍｇ／ｋｇのマスクされていないＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）の投与は、腫瘍退縮をロバストかつ完全に誘導した。ＡＭＸ－８１８の抗腫瘍有効性は、そのプロテアーゼ放出部位を欠いている形態のＡＭＸ－８１８（ＡＭＸ－８１８－ＮｏＣｌｖＳｉｔｅ）で処置されたマウスにおける有意な腫瘍成長阻害の欠如により実証されるように、そのマスクのプロテアーゼ切断に依存した。ＡＭＸ－８１８－Ｐ１およびＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）は、フローサイトメトリーによってＣＤ４およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の上方調節により評価して、腫瘍微小環境においてＴ細胞の同等の活性化を誘導した。重要なこととして、Ｔ細胞の活性化およびそれらの死滅させる再指向化のためのＨＥＲ２とＣＤ３の両方の二重エンゲージメントの必要性と一致して、Ｔ細胞は、ヒトＨＥＲ２が発現されない、マスクされていないＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）によってでさえ、末梢では活性化されなかった。
ＡＭＸ－８１８の単回２．１ｍｇ／ｋｇ用量は、大きい定着ＢＴ－４７４腫瘍（４７８ｍｍ３の平均腫瘍体積）を担持しているマウスにおいて投与４日以内に腫瘍退縮を誘導するのに十分なものであった。ｈＰＢＭＣを欠いている担腫瘍マウスにおける投与の際の、非腫瘍結合バリアントＮＢ－ＸＰＡＴ（そのＨＥＲ２結合ドメインが非ＨＥＲ２結合ｓｃＦｖで置き換えられたバージョンのＡＭＸ－８１８）の活性の欠如またはＡＭＸ－８１８の活性の欠如により実証されるように、有効性は、ＨＥＲ２発現とＴ細胞の両方に依存した。これらの発見は、ＡＭＸ－８１８のその活性にとっての二重エンゲージメントの必要性をさらに裏付け、ＨＥＲ２が非存在である正常な組織ではＡＭＸ－８１８が切断されるはずであるという安全性尺度を提供する。
ＨＥＲ２低発現ＨＴ－５５を担持しているマウスでは、ＡＭＸ－８１８は、５．１ｍｇ／ｋｇですべてのマウスにおいて完全な腫瘍退縮を誘導し（１０３％ＴＧＩ、ｐ＜０．０１）、２．１ｍｇ／ｋｇで７０％腫瘍成長阻害を誘導する、用量依存性かつプロテアーゼ依存性の有効性も誘導した。２５，０００のＨＥＲ２受容体を発現するモデルにおけるＡＭＸ－８１８による有効性は、低いＨＥＲ２発現レベルを有する腫瘍を含む複数のがん型に罹患している患者を処置する可能性をもたらす。最終的に、平均で２５．２％のＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）と蛍光標識ＡＭＸ－８１８が優先的にマスクされないことは、腫瘍において、ＢＴ－４７４担腫瘍マウスにおける２日のインキュベーション後に併せた心臓、脳および肝臓組織における＜２％と比較して顕著であった。これは、腫瘍ではプロテアーゼの局所的異常調節が主要な占有因子であり、正常な組織ではプロテアーゼ阻害が優位であることを支持する。
用語法
本明細書で使用される場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、それらに帰する意味を有する。
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の明白な指示がない限り、複数の被指示語を含む。例えば、用語「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」は、その混合物を含む、複数の細胞を含む。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書では同義で使用される。前記ポリマーは、直鎖状または分岐していてもよく、改変されたアミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸が割り込んでいてもよい。これらの用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより改変された、アミノ酸ポリマーも包含する。
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、グリシンならびにＤまたはＬ光学異性体とアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物の両方を含むがこれらに限定されない、天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸のいずれかを指す。標準１または３文字コードが、アミノ酸を表記するために使用される。
「宿主細胞」は、対象ベクターのレシピエントであり得る、またはそうであった、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含む。子孫は、天然に存在するまたは遺伝子操作された変異のため、元の親細胞と（形態の点でまたは全ＤＮＡ補体のゲノミクスの点で）必ずしも完全に同一でないことがある。
「キメラ」タンパク質は、自然に存在する位置とは異なる配列内の位置にある領域を含む少なくとも１つの融合ポリペプチドを含有する。前記領域は、通常は別々のタンパク質中に存在し得、一緒に融合ペプチドに持ち込まれるか、またはそれらは、通常は同じタンパク質中に存在し得るが、融合ポリペプチド内に新たな配置で配置される。キメラタンパク質は、例えば、化学合成により作出されることもあり、またはペプチド領域が所望の関係性でコードされているポリヌクレオチドの翻訳により作出されることもある。
「コンジュゲートした」、「連結した」、「融合した」および「融合」は、本明細書では同義で使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含めて手段は何であれ２つまたはそれより多い化学元素または成分の接合を指す。
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、同義で使用される。これらは、任意の長さの重合体形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのどちらか、またはそのアナログを指す。ポリヌクレオチドは、いかなる三次元構造を有するものであってもよく、公知のまたは未知の、いかなる機能を果すものであってもよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの、改変ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への改変は、ポリマーを組み立てる前に付与されることもあり、または組み立てた後に付与されることもある。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド成分が割り込んでいることもある。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識成分とのコンジュゲーションなどにより、さらに改変されることもある。
本明細書で使用される場合、「相同性」を有する、または「相同」であるポリヌクレオチドは、本明細書で定義されるようなストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであって、それらの配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、よりいっそう好ましくは９９％の配列同一性を有するものである。
用語「同一性パーセント」および「同一性％」は、ポリヌクレオチド配列に適用される場合、標準アルゴリズムを使用してアラインメントされた少なくとも２つのポリヌクレオチド配列間の残基一致パーセンテージを指す。そのようなアルゴリズムは、比較されることになる配列に標準化された再現可能な方法でギャップを挿入して、２配列間のアラインメントを最適化することができ、したがって、２配列のより有意義な比較を達成することができる。同一性パーセントは、例えば、特定の配列番号により定義されるような、定義されたポリヌクレオチド配列全体の長さにわたって測定されることもあり、またはより短い長さにわたって、例えば、より大きい定義されたポリヌクレオチド配列から取った断片、例えば、連続する少なくとも４５、少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも２１０または少なくとも４５０残基の断片の長さにわたって測定されることもある。そのような長さは例示的なものに過ぎず、本明細書で表、図または配列表に示される配列によって裏付けられるいずれの断片長も、同一性パーセンテージが測定され得る長さを説明するために使用され得ることは、理解される。
本明細書で同定されるポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインメントし、最大の配列同一性パーセントを達成するために必要に応じてギャップを導入した後に、第２の参照ポリペプチド配列またはその一部分のアミノ酸残基と同一である、問い合わせ配列中のアミノ酸残基のパーセンテージであって、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさない、パーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野における技能の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの、一般に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。同一性パーセントは、例えば、特定の配列番号により定義されるような、定義されたポリペプチド配列全体の長さにわたって測定されることもあり、またはより短い長さにわたって、例えば、より大きい定義されたポリペプチド配列から取った断片、例えば、連続する少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０または少なくとも１５０残基の断片の長さにわたって測定されることもある。そのような長さは例示的なものに過ぎず、本明細書で表、図または配列表に示される配列によって裏付けられるいずれの断片長も、同一性パーセンテージが測定され得る長さを説明するために使用され得ることは、理解される。
本明細書で使用される場合、ＸＴＥＮ配列の「反復性」は、３－ｍｅｒ反復性を指し、コンピュータープログラムもしくはアルゴリズムにより、または当技術分野において公知の他の手段により測定され得る。ＸＴＥＮの３－ｍｅｒ反復性は、ポリペプチド内のオーバーラップ３－ｍｅｒ配列の出現数を決定することにより評価される。例えば、２００アミノ酸残基のポリペプチドは、１９８のオーバーラップ３アミノ酸配列（３－ｍｅｒ）を有するが、ユニーク３－ｍｅｒ配列の数は、配列内の反復性の量に依存することになる。全ポリペプチド配列中の３－ｍｅｒの反復性の度合を反映するスコアを生成することができる（本明細書では以降、「部分列スコア」という）。本発明の文脈において、「部分列スコア」は、ポリペプチドの連続する２００アミノ酸の配列全体にわたった各ユニーク３－ｍｅｒフレームの出現の合計を、その２００アミノ酸の配列内のユニーク３－ｍｅｒ部分列の絶対数で割ったものを意味する。反復および非反復ポリペプチドの最初の２００アミノ酸から導出されるそのような部分列スコアの例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開番号第ＷＯ２０１０／０９１１２２Ａ１号の実施例７３に提示されている。一部の実施形態では、本発明は、１６未満、または１４未満、または１２未満、またはより好ましくは１０未満の部分列スコアを有し得るＸＴＥＮを各々が含むＢＰＸＴＥＮを提供する。
用語「実質的に非反復のＸＴＥＮ」は、本明細書で使用される場合、（１）同一のアミノ酸の種類のものである４つの連続するアミノ酸の事例がＸＴＥＮ配列中にほとんどあるいは全くないＸＴＥＮ、および（２）１２の、または１０もしくはそれ未満の部分列スコア（本明細書中の前段落で定義された）を有するＸＴＥＮ、あるいはポリペプチド配列を構成する配列モチーフの、Ｎ末端からＣ末端への順序での、パターンが存在しないＸＴＥＮを指す。
「ベクター」は、挿入された核酸分子を宿主細胞内および／または宿主細胞間に移入する核酸分子、好ましくは、適切な宿主において自己複製する核酸分子を指す。この用語は、細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡの挿入のために主として機能するベクターと、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために主として機能するベクターの複製と、ＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターとを含む。上記機能のうち１つより多くを提供するベクターも含まれる。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入されたときにポリペプチドに転写および翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」は、所望の発現産物を生じさせるように機能することができる発現ベクターから構成される好適な宿主細胞を通常は含意する。
用語「ｔ１／２」は、本明細書で使用される場合、ｌｎ（２）／Ｋｅｌとして算出される終末相半減期を意味する。Ｋｅｌは、対数濃度対時間曲線の終端線形部分の線形回帰により算出される終末相消失速度定数である。半減期は、典型的には、生存生物体内に蓄積された投与物質の半量が正常な生物学的プロセスにより代謝または消失されるのに必要な時間を指す。用語「ｔ１／２」、「終末相半減期」、「消失半減期」および「循環半減期」は、本明細書では同義で使用される。
用語「抗原」、「標的抗原」または「免疫原」は、抗体断片または抗体断片に基づく治療薬が結合するまたはそれに対して特異性を有する、構造または結合決定基を指すために、本明細書では同義で使用される。
用語「ペイロード」は、本明細書で使用される場合、小分子のファーマコフォアに相当するものである、生物活性または治療活性を有するタンパク質またはペプチドを指す。ペイロードの例としては、これらに限定されないが、サイトカイン、酵素、ホルモンおよび血液、ならびに成長因子が挙げられる。ペイロードは、遺伝的に融合されたまたは化学的にコンジュゲートされた部分、例えば、化学療法剤、抗ウイルス性化合物、毒素、または造影剤をさらに含み得る。これらのコンジュゲートされた部分を、切断性または非切断性であり得るリンカーによってポリペプチドの残部に接合することができる。
本明細書で使用される場合、「処置」もしくは「処置すること」または「緩和すること」または「緩解させること」は、本明細書では同義で使用される。これらの用語は、治療利益および／または予防利益を含むがこれらに限定されない、有益なまたは所望される結果を得るためのアプローチを指す。「治療利益」とは、処置されている基礎障害の根絶または緩解を意味する。また、治療利益は、対象が依然として基礎障害に罹患している可能性があるにもかかわらず対象に改善が見られるような、基礎病態に関連する生理的症状のうちの１つまたは複数についての根絶または緩解により実現される。予防利益のために、組成物が、特定の病態を発症するリスクのある対象に投与されることもあり、または疾患の生理的症状のうちの１つもしくは複数を報告する対象に、たとえこの疾患の診断が下されていなくても、投与されることもある。
「治療効果」は、本明細書で使用される場合、生物活性タンパク質が有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の、本開示の融合ポリペプチドにより生じる、ヒトもしくは他の動物における病態の治癒、軽減、緩解もしくは予防、またはヒトもしくは動物の肉体的もしくは精神的健康を別様に増強することを含むがこれらに限定されない、生理的効果を指す。治療有効量の決定は、特に、本明細書で提供される詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内である。
用語「治療有効量」および「治療有効用量」は、本明細書で使用される場合、単独でのまたは融合タンパク質組成物の一部としてのどちらかでの生物活性タンパク質の量であって、１用量または反復用量で対象に投与されたとき、病状または病態の任意の症状、態様、測定パラメーターまたは特徴に対して任意の検出可能な有益な効果を及ぼすことができる量を指す。そのような効果は、必ずしも有益である必要はない。病態は、障害または疾患を指す場合もある。
用語「治療有効用量レジメン」は、本明細書で使用される場合、単独でのまたは融合タンパク質の一部としてのどちらかでの生物活性タンパク質の連続投与用量についてのスケジュールであって、用量が、病状または病態の任意の症状、態様、測定パラメーターまたは特徴に対して持続的な有益な効果をもたらすように治療有効量で与えられる、スケジュールを指す。
融合ポリペプチド
本明細書で開示されるものは、１つまたは複数の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ（単数または複数）（本明細書において下記でさらに十分に説明される通り）と、ＸＴＥＮに連結された二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）と、１つまたは複数の放出セグメント（ＲＳ）とを含み、放出セグメントがＸＴＥＮと二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）との間に位置する、ポリペプチド（または融合ポリペプチド）であって、Ｎ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸を有するポリペプチド（または融合ポリペプチド）を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、第１のＸＴＥＮ（例えば、下記の「伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）」セクションで説明されるもの、または本明細書中の他のどこかの箇所で説明されるもの）を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、第２のＸＴＥＮ（例えば、下記の「伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）」セクションで説明されるもの、または本明細書中の他のどこかの箇所で説明されるもの）をさらに含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、そのＮ末端にまたはその付近に、ＸＴＥＮ（「Ｎ末端ＸＴＥＮ」）を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、そのＣ末端にまたはその付近に、ＸＴＥＮ（「Ｃ末端ＸＴＥＮ」）を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端ＸＴＥＮとＣ末端ＸＴＥＮの両方を含む。一部の実施形態では、第１のＸＴＥＮは、Ｎ末端ＸＴＥＮであり、第２のＸＴＥＮは、Ｃ末端ＸＴＥＮである。一部の実施形態では、第１のＸＴＥＮは、Ｃ末端ＸＴＥＮであり、第２のＸＴＥＮは、Ｎ末端ＸＴＥＮである。
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）、生物活性ポリペプチド（「ＢＰ」）は、ポリペプチド内の１つまたは複数のＸＴＥＮに連結されているので、ポリペプチドは、ＸＴＥＮ含有融合ポリペプチド：「ＢＰＸＴＥＮ」と呼ばれ得る。
ＸＴＥＮは、プロテアーゼによる融合ポリペプチド（またはＢＰＸＴＥＮ）の消化の際にＸＴＥＮから放出可能である（放出されるように構成されている）、１つまたは複数のバーコード断片（下記でさらに十分に説明される通り）を含み得る。一部の実施形態では、各バーコード断片は、プロテアーゼによるポリペプチドの完全消化の際にポリペプチドから放出可能であるすべての他のペプチド断片（存在する場合、すべての他のバーコード断片を含む）と、配列および分子量の点で異なる。
（融合）ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドからバーコード断片を放出するプロテアーゼ消化の際に、ポリペプチドから放出可能である（放出されるように構成されている）、１つまたは複数の参照断片（下記でさらに十分に説明される通り）を含み得る。一部の実施形態では、各参照断片は、プロテアーゼによるポリペプチドの消化の際にポリペプチドから放出可能であるすべての他のペプチド断片と、配列および分子量の点で異なる、単一の参照断片であり得る。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸を有する。ポリペプチドは、（ａ）伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）であって、プロテアーゼによる消化の際にポリペプチドから放出可能であるバーコード断片（ＢＡＲ）を含む、ＸＴＥＮ；（ｂ）分化抗原群３Ｔ細胞受容体（ＣＤ３）に特異的に結合する第１の抗原結合断片（ＡＦ１）を含む、二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）であって、ＡＦ１が、軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、２（ＣＤＲ－Ｌ２）および３（ＣＤＲ－Ｌ３）と重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、２（ＣＤＲ－Ｈ２）および３（ＣＤＲ－Ｈ３）とを含み、ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に特異的に結合する第２の抗原結合断片（ＡＦ２）とを含む、二重特異性抗体構築物；ならびに（ｃ）ＸＴＥＮと二重特異性抗体構築物との間に位置する放出セグメント（ＲＳ）を含み得、ここで、ＸＴＥＮは、（ｉ）少なくとも１００、または少なくとも１５０アミノ酸を含むこと、（ｉｉ）そのアミノ酸残基の少なくとも９０％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）により本明細書において同定されること；（ｉｉｉ）Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、ＥまたはＰにより本明細書において同定される少なくとも４種の異なるアミノ酸を含むこと；および（ｉｖ）ＸＴＥＮが、各々長さ９～１４アミノ酸である複数の非オーバーラップ配列モチーフから形成されることを特徴とし；複数の非オーバーラップ配列モチーフは、（１）非オーバーラップ配列モチーフのセットであって、非オーバーラップ配列モチーフのセットの各非オーバーラップ配列モチーフが、ＸＴＥＮ中で少なくとも２回反復される、非オーバーラップ配列モチーフのセット；および（２）ＸＴＥＮ内に１回だけ出現する非オーバーラップ配列モチーフを含み；バーコード断片（ＢＡＲ）は、ＸＴＥＮ内に１回だけ出現する非オーバーラップ配列モチーフの少なくとも一部を含み；バーコード断片（ＢＡＲ）は、プロテアーゼによるポリペプチドの完全消化の際にポリペプチドから放出可能であるすべての他のペプチド断片と、配列および分子量の点で異なり；バーコード断片（ＢＡＲ）は、ポリペプチドのＮ末端アミノ酸も、Ｃ末端アミノ酸も含まない。ポリペプチドは、融合タンパク質として発現され得る。融合タンパク質は、非切断状態で、Ｎ末端からＣ末端へＡＦ１－ＡＦ２－ＲＳ－ＸＴＥＮ、ＡＦ２－ＡＦ１－ＲＳ－ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ－ＲＳ－ＡＦ１－ＡＦ２、またはＸＴＥＮ－ＲＳ－ＡＦ２－ＡＦ１により本明細書において同定される構造配置を有し得る。
本開示のポリペプチドの一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、第１の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ１）であり；ＸＴＥＮ１が形成される複数の非オーバーラップ配列モチーフは、第１の複数の非オーバーラップ配列モチーフであり；ＢＡＲは、第１のバーコード断片（ＢＡＲ１）であり；ＲＳは、第１の放出セグメント（ＲＳ１）である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、（ｄ）第２の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ２）であって、プロテアーゼによる消化の際にポリペプチドから放出可能である第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）を含む、ＸＴＥＮ２；および（ｅ）第２のＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ２）と二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）との間に位置する第２の放出セグメント（ＲＳ２）をさらに含み；ＸＴＥＮ２は、（ｉ）少なくとも１００、または少なくとも１５０アミノ酸を含むこと、（ｉｉ）そのアミノ酸残基の少なくとも９０％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）により本明細書において同定されること；および（ｉｉｉ）Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、ＥまたはＰにより本明細書において同定される少なくとも４種の異なるアミノ酸を含むことを特徴とし、第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、プロテアーゼによるポリペプチドの完全消化の際にポリペプチドから放出可能であるすべての他のペプチド断片と、配列および分子量の点で異なり；第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、ポリペプチドのＮ末端アミノ酸も、Ｃ末端アミノ酸も含まない。ＸＴＥＮ１は、二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＮ末端に位置し得、ＸＴＥＮ２は、二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＣ末端に位置し得る。あるいは、ＸＴＥＮ１は、二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＣ末端に位置し得、ＸＴＥＮ２は、二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＮ末端に位置し得る。ポリペプチドの一部の実施形態では、（ｉｖ）ＸＴＥＮ２は、各々長さ９～１４アミノ酸である第２の複数の非オーバーラップ配列モチーフから形成され得、第２の複数の非オーバーラップ配列モチーフは、（１）非オーバーラップ配列モチーフの第２のセットであって、非オーバーラップ配列モチーフの第２のセットの各非オーバーラップ配列モチーフが、第２のＸＴＥＮ中で少なくとも２回反復される、非オーバーラップ配列モチーフの第２のセット；および（２）第２のＸＴＥＮ内に１回だけ出現する非オーバーラップ配列モチーフを含み；第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）は、第２のＸＴＥＮ内に１回だけ出現する非オーバーラップ配列モチーフの少なくとも一部を含む。ポリペプチドは、融合タンパク質として発現され、この融合タンパク質は、非切断状態で、Ｎ末端からＣ末端へＸＴＥＮ１－ＲＳ１－ＡＦ１－ＡＦ２－ＲＳ２－ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ１－ＲＳ１－ＡＦ２－ＡＦ１－ＲＳ２－ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ２－ＲＳ２－ＡＦ１－ＡＦ２－ＲＳ１－ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２－ＲＳ２－ＡＦ２－ＡＦ１－ＲＳ１－ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ１－ＲＳ１－ダイアボディＲＳ２－ＸＴＥＮ２、またはＸＴＥＮ２－ＲＳ２－ダイアボディＲＳ１－ＸＴＥＮ１により本明細書において同定される構造配置を有し得る。ダイアボディは、ＡＦ１の軽鎖可変領域（ＶＬＩ）、ＡＦ１の重鎖可変領域（ＶＨＩ）、ＡＦ２の軽鎖可変領域（ＶＬＩＩ）、およびＡＦ２の重鎖可変領域（ＶＨＩＩ）を含み得る。
本開示のポリペプチドの一部の実施形態では、（ａ）第１の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ１）は、表３ａに記載の配列に対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、（ｂ）二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）は、（Ｉ）軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、２（ＣＤＲ－Ｌ２）および３（ＣＤＲ－Ｌ３）と重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、２（ＣＤＲ－Ｈ２）および３（ＣＤＲ－Ｈ３）とを含む第１の抗原結合断片（ＡＦ１）であって、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３が、それぞれ配列番号８、９、および１０のアミノ酸配列を含む、ＡＦ１と、（ＩＩ）配列番号７７８～７８３により本明細書において同定される軽鎖可変領域（ＶＬＩＩ）および配列番号８７８～８８３により本明細書において同定される重鎖可変領域（ＶＨＩＩ）を含む、第２の抗原結合断片（ＡＦ２）とを含み；（ｃ）第１の放出セグメント（ＲＳ１）は、配列番号７００１～７６２６により本明細書において同定される配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；（ｄ）第２の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ２）は、表３ａに記載の配列に対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；（ｅ）第２の放出セグメント（ＲＳ２）は、配列番号７００１～７６２６により本明細書において同定される配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へＸＴＥＮ１－ＲＳ１－ＡＦ２－ＡＦ１－ＲＳ２－ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ１－ＲＳ１－ＡＦ１－ＡＦ２－ＲＳ２－ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ２－ＲＳ２－ＡＦ２－ＡＦ１－ＲＳ１－ＸＴＥＮ１、またはＸＴＥＮ２－ＲＳ２－ＡＦ１－ＡＦ２－ＲＳ１－ＸＴＥＮ１により本明細書において同定される構造配置を有し得る。
伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）
鎖長およびアミノ酸組成
一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、少なくとも１００、または少なくとも１５０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、長さ１００～３，０００、または１５０～３，０００アミノ酸である。一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、長さ１００～１，０００、または１５０～１，０００アミノ酸である。一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、長さ少なくとも（約）１００、少なくとも（約）１５０、少なくとも（約）２００、少なくとも（約）２５０、少なくとも（約）３００、少なくとも（約）３５０、少なくとも（約）４００、少なくとも（約）４５０、少なくとも（約）５００、少なくとも（約）５５０、少なくとも（約）６００、少なくとも（約）６５０、少なくとも（約）７００、少なくとも（約）７５０、少なくとも（約）８００、少なくとも（約）８５０、少なくとも（約）９００、少なくとも（約）９５０、少なくとも（約）１，０００、少なくとも（約）１，１００、少なくとも（約）１，２００、少なくとも（約）１，３００、少なくとも（約）１，４００、少なくとも（約）１，５００、少なくとも（約）１，６００、少なくとも（約）１，７００、少なくとも（約）１，８００、少なくとも（約）１，９００、または少なくとも（約）２，０００アミノ酸である。一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、長さが最大で（約）１００、最大で（約）１５０、最大で（約）２００、最大で（約）２５０、最大で（約）３００、最大で（約）３５０、最大で（約）４００、最大で（約）４５０、最大で（約）５００、最大で（約）５５０、最大で（約）６００、最大で（約）６５０、最大で（約）７００、最大で（約）７５０、最大で（約）８００、最大で（約）８５０、最大で（約）９００、最大で（約）９５０、最大で（約）１，０００、最大で（約）１，１００、最大で（約）１，２００、最大で（約）１，３００、最大で（約）１，４００、最大で（約）１，５００、最大で（約）１，６００、最大で（約）１，７００、最大で（約）１，８００、最大で（約）１，９００、または最大で（約）２，０００アミノ酸である。一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、長さ（約）１００、（約）１５０、（約）２００、（約）２５０、（約）３００、（約）３５０、（約）４００、（約）４５０、（約）５００、（約）５５０、（約）６００、（約）６５０、（約）７００、（約）７５０、（約）８００、（約）８５０、（約）９００、（約）９５０、（約）１，０００、（約）１，１００、（約）１，２００、（約）１，３００、（約）１，４００、（約）１，５００、（約）１，６００、（約）１，７００、（約）１，８００、（約）１，９００、または（約）２，０００アミノ酸を有するか、または前述の任意の２つの間の範囲の長さを有する。一部の実施形態では、ＸＴＥＮのアミノ酸残基の少なくとも９０％は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）により本明細書において同定される。一部の実施形態では、ＸＴＥＮのアミノ酸残基の少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）である。一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮポリペプチドを構成する任意の他の非オーバーラップ配列モチーフに対して実質的に無作為に割り当てられている、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、またはＰである少なくとも４種の異なるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＸＴＥＮ（例えば、ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２など）は、（ｉ）少なくとも１００、または少なくとも１５０アミノ酸を含むこと、（ｉｉ）ＸＴＥＮのアミノ酸残基の少なくとも９０％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）であること；および（ｉｉｉ）ＸＴＥＮポリペプチドを構成する任意の他の非オーバーラップ配列モチーフに対して実質的に無作為に割り当てられている、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、またはＰからの少なくとも４種の異なるアミノ酸を含むことを特徴とする。本明細書で使用される場合、用語「グルタメート」が、「グルタミン酸」の同義語であること、および側鎖カルボキシルが脱プロトン化されているか否かを問わず、グルタミン酸残基を指すことは、当業者には理解されるであろう。一部の実施形態では、ＸＴＥＮ含有融合ポリペプチドは、第１のＸＴＥＮおよび第２のＸＴＥＮを含む。一部の実施形態では、第１のＸＴＥＮ中のアミノ酸の総数、および第２のＸＴＥＮ中のアミノ酸の総数の和は、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、または少なくとも８００アミノ酸である。
非オーバーラップ配列モチーフ
一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、複数の非オーバーラップ配列モチーフを含むか、またはそれらから形成される。一部の実施形態では、非オーバーラップ配列モチーフの少なくとも１つは、繰り返し出てきて（またはＸＴＥＮ中で少なくとも２回反復され）、非オーバーラップ配列モチーフの少なくとももう１つは、繰り返し出てこない（またはＸＴＥＮ内に１回しか見られない）。一部の実施形態では、複数の非オーバーラップ配列モチーフは、（ａ）（繰り返し出てくる）非オーバーラップ配列モチーフのセットであって、非オーバーラップ配列モチーフのセットの各非オーバーラップ配列モチーフが、ＸＴＥＮ中で少なくとも２回反復される、非オーバーラップ配列モチーフのセット；および（ｂ）ＸＴＥＮ内に１回しか出現しない（または見られない）非オーバーラップ（繰り返し出てこない）配列モチーフを含む。一部の実施形態では、各非オーバーラップ配列モチーフは、長さ９～１４（または１０～１４、もしくは１１～１３）アミノ酸である。一部の実施形態では、各非オーバーラップ配列モチーフは、長さ１２アミノ酸である。一部の実施形態では、複数の非オーバーラップ配列モチーフは、非オーバーラップ（繰り返し出てくる）配列モチーフのセットを含み、非オーバーラップ配列モチーフのセットの各非オーバーラップ配列モチーフは、（１）ＸＴＥＮ中で少なくとも２回反復され、（２）長さ９～１４アミノ酸の間である。一部の実施形態では、（繰り返し出てくる）非オーバーラップ配列モチーフのセットは、配列番号１７９～２００および１７１５～１７２２により本明細書の表１において同定される１２－ｍｅｒ配列モチーフを含む。一部の実施形態では、（繰り返し出てくる）非オーバーラップ配列モチーフのセットは、配列番号１８６～１８９により本明細書の表１において同定される１２－ｍｅｒ配列モチーフを含む。一部の実施形態では、（繰り返し出てくる）非オーバーラップ配列モチーフのセットは、表１中の配列番号１８６～１８９の１２－ｍｅｒ配列モチーフのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つすべてを含む。
表１． ＸＴＥＮの構築のための例示的な１２－ｍｅｒ配列モチーフ
Figure 2023531494000001
Figure 2023531494000002
 ＊様々な順列で一緒に使用されたたときに「ファミリー配列」になる、個々のモチーフ配列を示す
バーコード断片
一部の実施形態では、ポリペプチドは、プロテアーゼによる消化の際にポリペプチドから放出可能であるバーコード断片（例えば、ＸＴＥＮの第１、第２または第３のバーコード断片）を含む。一部の実施形態では、バーコード断片は、（１）ＸＴＥＮ内に１回しか出現しない（または見られない）（繰り返し出てこない、非オーバーラップ）配列モチーフの少なくとも一部を含むＸＴＥＮの一部分であり；（２）プロテアーゼによるポリペプチドの完全消化の際にポリペプチドから放出可能であるすべての他のペプチド断片と、配列および分子量の点で異なる。用語「バーコード断片」（または「バーコード」もしくは「バーコード配列」）が、ポリペプチド内の切断可能に融合されたＸＴＥＮの部分、またはポリペプチドから放出された結果として生ずるペプチド断片のどちらかを指し得ることは、当業者には理解されるであろう。
一部の実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのＮ末端アミノ酸も、Ｃ末端アミノ酸も含まない。下記でまたは本明細書中の他の箇所でさらに十分に説明されるように、一部の実施形態では、バーコード断片は、融合ポリペプチドのＧｌｕ－Ｃ消化の際に放出可能である（放出されるように構成されている）。一部の実施形態では、バーコード断片は、ＸＴＥＮ中に、存在する場合別のグルタミン酸に直接隣接しているグルタミン酸を含まない。一部の実施形態では、バーコード断片は、そのＣ末端にグルタミン酸を有する。ＸＴＥＮ内で切断可能に融合されたときに、たとえ他の「非バーコード」アミノ酸残基が同じＸＴＥＮ内のバーコード断片のＣ末端側に位置していたとしても、バーコード断片のＣ末端が、バーコード断片内の「最後の」（または最もＣ末端側の）アミノ酸残基を指し得ることは、当業者には理解されるであろう。一部の実施形態では、バーコード断片は、グルタミン酸残基がすぐ前にあるＮ末端アミノ酸を有する。一部の実施形態では、Ｎ末端アミノ酸の前にあるグルタミン酸残基は、別のグルタミン酸残基に直接隣接していない。一部の実施形態では、バーコード断片は、バーコード断片のＣ末端以外の位置に（第２の）グルタミン酸残基を、グルタミン酸のすぐ後にプロリンが続かない限り、含まない。一部の実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのＮ末端またはポリペプチドのＣ末端のいずれかからある距離に位置し、その距離は、１０～１５０、または１０～１２５アミノ酸である。一部の実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのＮ末端から３００、２８０、２６０、２５０、２４０、２２０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４８、４０、３６、３０、２４、２０、１２、もしくは１０アミノ酸以内に、またはそのアミノ酸の場所に、あるいは前述のいずれかの間の範囲内の場所に位置する。一部の実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのＮ末端の２００アミノ酸以内、１５０アミノ酸以内、１００アミノ酸以内、または５０アミノ酸以内に位置する。一部の実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのＮ末端から１０～２００アミノ酸の間、３０～２００アミノ酸の間、４０～１５０アミノ酸の間、または５０～１００アミノ酸の間にある場所に位置する。一部の実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのＣ末端から３００、２８０、２６０、２５０、２４０、２２０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４８、４０、３６、３０、２４、２０、１２、もしくは１０アミノ酸以内に、またはそのアミノ酸の場所に、あるいは前述のいずれかの間の範囲内の場所に位置する。一部の実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのＣ末端の２００アミノ酸以内、１５０アミノ酸以内、１００アミノ酸以内、または５０アミノ酸以内に位置する。一部の実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのＣ末端から１０～２００アミノ酸の間、３０～２００アミノ酸の間、４０～１５０アミノ酸の間、または５０～１００アミノ酸の間にある場所に位置する。一部の実施形態では、バーコード断片（ＢＡＲ）は、（ｉ）ＸＴＥＮ中に、存在する場合別のグルタミン酸に直接隣接しているグルタミン酸を含まないこと；（ｉｉ）そのＣ末端にグルタミン酸を有すること；（ｉｉｉ）グルタミン酸残基がすぐ前にあるＮ末端アミノ酸を有すること；および（ｉｖ）ポリペプチドのＮ末端またはポリペプチドのＣ末端のいずれかからある距離に位置し、その距離が、長さ１０～１５０アミノ酸、または１０～１２５アミノ酸であることを特徴とする。一部の実施形態では、バーコード断片は、（ｉ）ポリペプチドのＮ末端アミノ酸もＣ末端アミノ酸も含まず、（ｉｉ）ＸＴＥＮ中に別のグルタミン酸に直接隣接しているグルタミン酸を含まず、（ｉｉｉ）そのＣ末端にグルタミン酸を有し、（ｉｖ）グルタミン酸残基がすぐ前にあるＮ末端アミノ酸を有し、（ｖ）ポリペプチドのＮ末端またはポリペプチドのＣ末端のいずれかからある距離に位置し、その距離は、長さ１０～１５０、または１０～１２５アミノ酸である。一部の実施形態では、Ｎ末端アミノ酸の前にあるグルタミン酸残基は、別のグルタミン酸残基に直接隣接していない。一部の実施形態では、バーコード断片は、バーコード断片のＣ末端以外の位置にグルタミン酸残基を、グルタミン酸のすぐ後にプロリンが続かない限り、含まない。用語「距離」が、本明細書で使用される場合、ポリペプチドのＮ末端からバーコード断片の最もＮ末端側のアミノ酸残基までのアミノ酸残基の数、またはポリペプチドのＣ末端からバーコード断片の最もＣ末端側のアミノ酸残基までのアミノ酸残基の数を指し得ることは、当業者には理解されるであろう。一部の実施形態では、生物活性ポリペプチドに融合したバーコード付きＸＴＥＮについて、バーコード付きＸＴＥＮに含有される少なくとも１つのバーコード断片（または少なくとも２つのバーコード断片、もしくは３つのバーコード断片）は、生物活性ポリペプチドから少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００アミノ酸に位置する。一部の実施形態では、バーコード断片は、長さ少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８アミノ酸である。一部の実施形態では、バーコード断片は、長さ少なくとも４アミノ酸である。一部の実施形態では、バーコード断片は、長さ４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５アミノ酸であるか、または前述の値のいずれかの間の範囲内にある。一部の実施形態では、バーコード断片は、長さ４～２０アミノ酸の間、５～１５アミノ酸の間、６～１２アミノ酸の間、または７～１０アミノ酸の間である。一部の実施形態では、バーコード断片は、配列番号６８～７７により本明細書の表２において同定されるアミノ酸配列を含む。
表２． Ｇｌｕ－Ｃ消化の際に放出され得る例示的なバーコード断片
Figure 2023531494000003
本開示のポリペプチドの一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、近位端および遠位端により定義される長さを有し、（１）近位端は、遠位端と比べて、二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）の近くに位置し、（２）バーコード断片（ＢＡＲ）は、遠位端から測定して、ＸＴＥＮの長さの５％～５０％の間、７％～４０％の間、または１０％～３０％の間にわたるＸＴＥＮの領域内に位置し得る。
本開示のポリペプチドの一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、追加の１つまたは複数のバーコード断片をさらに含み、前記追加の１つまたは複数のバーコード断片各々は、前記プロテアーゼによる前記ポリペプチドの完全消化の際に前記ポリペプチドから放出可能であるすべての他のペプチド断片と、配列および分子量の点で異なる。一部の実施形態では、バーコード付きＸＴＥＮは、１つのバーコード断片しか含まない。一部の実施形態では、バーコード付きＸＴＥＮは、上記のまたは本明細書中の他のどこかの箇所で説明されるものなどの、第１のバーコード断片を含む、バーコード断片のセットを含む。一部の実施形態では、バーコード断片のセットは、上記のまたは本明細書中の他のどこかの箇所で説明されるものなどの、第２のバーコード断片（またはさらなるバーコード断片）を含む。一部の実施形態では、バーコード断片のセットは、上記のまたは本明細書中の他のどこかの箇所で説明されるものなどの、第３のバーコード断片を含む。Ｎ末端ＸＴＥＮ内の融合されたバーコード断片のセットは、バーコードのＮ末端セット（「Ｎ末端セット」）と呼ばれ得る。Ｃ末端ＸＴＥＮ内の融合されたバーコード断片のセットは、バーコードのＣ末端セット（「Ｃ末端セット」）と呼ばれ得る。一部の実施形態では、Ｎ末端セットは、第１のバーコード断片および第２のバーコード断片を含む。一部の実施形態では、Ｎ末端セットは、第３のバーコード断片をさらに含む。一部の実施形態では、Ｃ末端セットは、第１のバーコード断片および第２のバーコード断片を含む。一部の実施形態では、Ｃ末端セットは、第３のバーコード断片をさらに含む。一部の実施形態では、第２のバーコード断片は、同じセットの第１のバーコード断片のＮ末端側に位置する。一部の実施形態では、第２のバーコード断片は、同じセットの第１のバーコード断片のＣ末端側に位置する。一部の実施形態では、第３のバーコード断片は、第１のバーコード断片と第２のバーコード断片の両方のＮ末端側に位置する。一部の実施形態では、第３のバーコード断片は、第１のバーコード断片と第２のバーコード断片の両方のＣ末端側に位置する。一部の実施形態では、第３のバーコード断片は、第１のバーコード断片と第２のバーコード断片との間に位置する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、第１のバーコード断片、さらなる（第２の）バーコード断片、および少なくとも１つの追加のバーコード断片を含むバーコード断片のセットを含み、このバーコード断片のセットの各バーコード断片は、（１）第２のＸＴＥＮの一部分であり、（２）プロテアーゼによるポリペプチドの完全消化の際にポリペプチドから放出可能であるすべての他のペプチド断片と、配列および分子量の点で異なる。
例示的なバーコード付きＸＴＥＮ
１つのバーコード（例えば、配列番号８００２～８００３、８００５～８００９、および８０１３）、または２つのバーコード（例えば、配列番号８００１、８００４、および８０１２）または３つのバーコード（例えば、配列番号８０１１）を含有する１３の例示的なバーコード付きＸＴＥＮのアミノ酸配列が、表３ａに示される。これら１３の例示的なバーコード付きＸＴＥＮのうち、６つ（配列番号８００１～８００３、８００８～８００９、および８０１１）は、生物活性タンパク質におけるその生物活性タンパク質のＣ末端に融合されることになり、７つ（配列番号８００４～８００７、８０１０、および８０１２～８０１３）は、その生物活性タンパク質のＮ末端に融合されることになる。一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、表３ａの配列番号８００１～８０２０により本明細書において同定される配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
表３ａ． 例示的なバーコード付きＸＴＥＮ
Figure 2023531494000004
Figure 2023531494000005
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一部の実施形態では、バーコード付きＸＴＥＮは、表３ｂに収載されるいずれかのものなどの汎用ＸＴＥＮに、以下の基準のうちの１つまたは複数に従って１つまたは複数の突然変異を加えることにより、得ることができる：ＸＴＥＮにおける配列変化を最小限に抑えること、ＸＴＥＮにおけるアミノ酸組成の変化を最小限に抑えること、ＸＴＥＮの正味電荷を実質的に維持すること、ＸＴＥＮの低い免疫原性を実質的に維持すること（または改善すること）、およびＸＴＥＮの薬物動態特性を実質的に維持すること（または改善すること）。一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、表３ｂに収載される配列番号６０１～６５９のいずれか１つに対して、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、表３ｂに収載される配列番号６０１～６５９のいずれかに対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）、しかし１００％未満の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列は、表３ｂからの対応する配列の１つまたは複数の突然変異（例えば、１０未満、８未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満の突然変異）により得られる。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、グルタミン酸残基の欠失、グルタミン酸残基の挿入、グルタミン酸残基での置換、もしくはグルタミン酸残基の置換、またはこれらの任意の組合せを含む。ＸＴＥＮ配列が、表３ｂに収載される配列番号６０１～６５９のいずれか１つと異なるが、それに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）の配列同一性を有する一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列と表３ｂの対応する配列との差異の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または約１００％は、グルタミン酸の欠失、グルタミン酸残基の挿入、グルタミン酸残基での置換、もしくはグルタミン酸残基の置換、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列と表３ｂの対応する配列との差異の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または約１００％は、グルタミン酸残基での置換、もしくはグルタミン酸残基の置換、または両方を含む。用語「第１のアミノ酸での置換」は、本明細書で使用される場合、第１のアミノ酸残基での第２のアミノ酸残基の置き換えを指し、したがって、第２のアミノ酸残基が、得られる配列内の置換位置を占める結果となる。例えば、「グルタミン酸での置換」は、グルタミン酸残基（Ｅ）での非グルタミン酸残基（例えば、セリン（Ｓ））の置換を指す。用語「第１のアミノ酸の置換」は、本明細書で使用される場合、第２のアミノ酸残基での第１のアミノ酸残基の置き換えを指し、したがって、第１のアミノ酸残基が、得られる配列内の置換位置を占める結果となる。例えば、「グルタミン酸の置換」は、非グルタミン酸残基（例えば、セリン（Ｓ））でのグルタミン酸残基の置換を指す。
表３ｂ． 操作してバーコード付きＸＴＥＮにするための例示的な汎用ＸＴＥＮ
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一部の実施形態では、バーコード付きＸＴＥＮの配列の構築のために、アミノ酸突然変異が、表３ｂのものに対して中程度の長さのＸＴＥＮ、および表３ｂのものより長い長さのＸＴＥＮ、例えば、表１の１つまたは複数の１２－ｍｅｒモチーフが表３ｂの汎用ＸＴＥＮのＮまたはＣ末端に付加されているものに関して行われる。
本開示に従って使用され得る汎用ＸＴＥＮ配列の追加の例は、米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５４Ａ１号、同第２０１０／０３２３９５６Ａ１号、同第２０１１／００４６０６０Ａ１号、同第２０１１／００４６０６１Ａ１号、同第２０１１／００７７１９９Ａ１号、もしくは同第２０１１／０１７２１４６Ａ１号、または国際特許出願公開番号第ＷＯ２０１００９１１２２Ａ１号、同第ＷＯ２０１０１４４５０２Ａ２号、同第ＷＯ２０１０１４４５０８Ａ１号、同第ＷＯ２０１１０２８２２８Ａ１号、同第ＷＯ２０１１０２８２２９Ａ１号、同第ＷＯ２０１１０２８３４４Ａ２号、同第ＷＯ２０１４／０１１８１９Ａ２号、もしくは同第ＷＯ２０１５／０２３８９１号において開示されている。
一部の実施形態では、ポリペプチド鎖のＮ末端に隣接している、ポリペプチド鎖内の融合されたバーコード付きＸＴＥＮ（「Ｎ末端ＸＴＥＮ」）は、融合タンパク質の精製を助長するために、Ｎ末端でＨＨＨＨＨＨ（配列番号４８）またはＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号４９）のＨｉｓタグに結合され得る。一部の実施形態では、ポリペプチド鎖のＣ末端で、ポリペプチド鎖内の融合されたバーコード付きＸＴＥＮ（「Ｃ末端ＸＴＥＮ」）は、融合タンパク質の精製を助長するために、Ｃ末端に配列ＥＰＥＡを含み得るか、またはそれが結合され得る。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端バーコード付きＸＴＥＮとＣ末端バーコード付きＸＴＥＮの両方を含み、Ｎ末端バーコード付きＸＴＥＮは、Ｎ末端でＨＨＨＨＨＨ（配列番号４８）またはＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号４９）のＨｉｓタグに結合されており、Ｃ末端バーコード付きＸＴＥＮは、Ｃ末端で配列ＥＰＥＡに結合されており、それによって、融合ポリペプチドの精製、例えば、ＩＭＡＣクロマトグラフィーを含むがこれに限定されない当技術分野において公知のクロマトグラフィー法、Ｃ－ｔａｇＸＬアフィニティーマトリックス、および下記の実施例セクションで説明されるものを含むがそれらに限定されない他のそのような方法により、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％の純度への精製が助長される。
プロテアーゼ消化
上記のまたは本明細書中の他のどこかの箇所で説明されるバーコード断片は、ＸＴＥＮ内に切断可能に融合され、プロテアーゼによるポリペプチドの消化の際にＸＴＥＮから放出可能であり得る（放出されるように構成され得る）。一部の実施形態では、プロテアーゼは、Ｇｌｕ－Ｃプロテアーゼである。一部の実施形態では、プロテアーゼは、プロリンが後に続かないグルタミン酸残基のＣ末端側で切断する。バーコード付きＸＴＥＮ（バーコード断片をその中に含有するＸＴＥＮ）が、高い効率、精度および正確度のプロテアーゼ消化を達成するように設計されることは、当業者には理解されるであろう。例えば、ＸＴＥＮ配列中の隣接するＧｌｕ－Ｇｌｕ（ＥＥ）残基がＧｌｕ－Ｃ消化の際に様々な切断パターンを生じさせる結果となり得ることは、当業者には理解されるであろう。したがって、Ｇｌｕ－Ｃプロテアーゼがバーコード放出に使用される場合、バーコード付きＸＴＥＮまたはバーコード断片は、いずれのＧｌｕ－Ｇｌｕ（ＥＥ）配列も含有しないことがある。ジペプチドＧｌｕ－Ｐｒｏ（ＥＰ）配列が、融合ポリペプチド中に存在する場合、バーコード放出プロセス中にＧｌｕ－Ｃプロテアーゼにより切断され得ないことも、当業者には理解されるであろう。
ＢＰＸＴＥＮの構造の立体配置
一部の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、単一のＢＰおよび単一のＸＴＥＮを含む。そのようなＢＰＸＴＥＮは、Ｎ末端からＣ末端方向へ各々記載される、次の立体配置順列を少なくとも有し得る：ＢＰ－ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ－ＢＰ、ＢＰ－Ｓ－ＸＴＥＮ、およびＸＴＥＮ－Ｓ－ＢＰ。
一部の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、Ｃ末端ＸＴＥＮ、および必要に応じて、ＸＴＥＮとＢＰとの間にスペーサー配列（Ｓ）（例えば、本明細書に、例えば表Ｃに、記載されるもの）を含む。そのようなＢＰＸＴＥＮは、式Ｉ（Ｎ末端からＣ末端へ描示される）：
（ＢＰ）－（Ｓ）ｘ－（ＸＴＥＮ） （Ｉ）
により表され得、式中、ＢＰは、本明細書における下記に記載の生物活性タンパク質であり；Ｓは、ＢＰ放出セグメント（本明細書において下記でさらに十分に説明される通り）を必要に応じて含み得る、１～約５０の間のアミノ酸残基を有するスペーサー配列（例えば、本明細書に、例えば表Ｃに、記載されるもの）であり；ｘは、０または１のどちらかであり；ＸＴＥＮは、本明細書における上記のまたは本明細書中の他のどこかの箇所で説明される任意のものであり得る。
一部の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、Ｎ末端ＸＴＥＮ、および必要に応じて、ＸＴＥＮとＢＰとの間にスペーサー配列（Ｓ）（例えば、本明細書に、例えば表Ｃに、記載されるもの）を含む。そのようなＢＰＸＴＥＮは、式ＩＩ（Ｎ末端からＣ末端へ描示される）：
（ＸＴＥＮ）－（Ｓ）ｘ－（ＢＰ） （ＩＩ）
により表され得、式中、ＢＰは、本明細書における下記の生物活性タンパク質であり；Ｓは、ＢＰ放出セグメント（本明細書において下記でさらに十分に説明される通り）を必要に応じて含み得る、１～約５０の間のアミノ酸残基を有するスペーサー配列（本明細書に、例えば表Ｃに、記載されるもの）であり；ｘは、０または１のどちらかであり；ＸＴＥＮは、本明細書における上記のまたは本明細書中の他のどこかの箇所に記載の任意のものであり得る。
一部の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、Ｎ末端ＸＴＥＮとＣ末端ＸＴＥＮの両方を含む。そのようなＢＰＸＴＥＮ（例えば、図１～２におけるＸＰＡＴ）は、式ＩＩＩ：
（ＸＴＥＮ）－（Ｓ）ｙ－（ＢＰ）－（Ｓ）ｚ－（ＸＴＥＮ） （ＩＩＩ）
により表され得、式中、ＢＰは、本明細書における下記の生物活性タンパク質であり；Ｓは、ＢＰ放出セグメント（本明細書において下記でさらに十分に説明される通り）を必要に応じて含み得る、１～約５０の間のアミノ酸残基を有するスペーサー配列（本明細書に、例えば表Ｃに、記載されるもの）であり；ｙは、０または１のどちらかであり；ｚは、０または１のどちらかであり；ＸＴＥＮは、本明細書における上記のまたは本明細書中の他のどこかの箇所に記載の任意のものであり得る。
生物活性ポリペプチド
ＸＴＥＮ（本明細書における上記のまたは本明細書中の他のどこかの箇所で説明される通り）に融合された生物活性タンパク質（ＢＰ）、特に、表６ａ～６ｆのものにより本明細書において同定される配列を含む、本明細書において下記で開示されるものは、それらの対応する核酸およびアミノ酸配列とともに、当技術分野において周知である。これらのＢＰの説明および配列は、公開データベース、例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅｓ（例えば、ＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ）、およびサブスクリプション提供データベース、例えばＧｅｎＳｅｑ（例えば、Ｄｅｒｗｅｎｔ）で入手可能である。ポリヌクレオチド配列は、所与のＢＰをコードする野生型ポリヌクレオチド配列（例えば、全長または成熟のどちらか）であることもあり、または一部の事例では、配列は、ポリヌクレオチドのＤＮＡ配列が、例えば、特定の種における発現のために最適化されている、野生型ポリヌクレオチド配列のバリアント（例えば、野生型生物活性タンパク質をコードするポリヌクレオチド）であることもあり、または野生型タンパク質のバリアント、例えば、部位特異的突然変異体もしくは対立遺伝子バリアントをコードするポリヌクレオチドであることもある。当技術分野において公知の方法を使用して、および／または本明細書で提供されるガイダンスおよび方法と併用して、本発明により企図されるＢＰＸＴＥＮ構築物を作出するために、ＢＰの野生型もしくはコンセンサスｃＤＮＡ配列またはコドン最適化バリアントを使用することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
ＢＰＸＴＥＮ（少なくとも１つのＢＰと少なくとも１つのＸＴＥＮとを含む融合ポリペプチド）に含めるためのＢＰは、任意の生物学的、治療上、予防上もしくは診断上興味のある任意のタンパク質、または対象に投与されたときに生物活性の媒介にまたは疾患、障害もしくは状態の予防もしくは緩解に有用な任意のタンパク質を含み得る。薬物動態パラメーターの増加、溶解度上昇、安定性向上、活性のマスク、もしくは何らかの他の増強された薬学的特性が探究されるＢＰ、または終末相半減期の延長が、有効性、安全性を向上させることになる、もしくは投与頻度を低減する結果となる、および／もしくは患者のコンプライアンスを改善するＢＰは、特に興味深い。したがって、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物は、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの曝露を増加させること、または対象に投与されたときにＢＰＸＴＥＮが治療域内に留まる長さを延ばすことにより、生物活性化合物の治療有効性を改善することを含む、様々な目的を念頭において、調製される。
ＢＰは、天然、全長タンパク質であることもあり、または天然タンパク質の生物活性の少なくとも一部分を保持する、生物活性タンパク質の断片もしくは配列バリアントであることもある。
一実施形態では、対象組成物に組み込まれるＢＰは、自然界に見られるタンパク質に対応する配列を有する組換えポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、ＢＰは、天然ＢＰの生物活性の少なくとも一部分を保持する天然配列の配列バリアント、断片、ホモログおよび模倣物であり得る。非限定的な例では、ＢＰは、本明細書において同定されるタンパク質配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示す配列であり得る。さらなる非限定的な例では、ＢＰは、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含む二重特異性配列であって、標的細胞の腫瘍特異的マーカーまたは抗原に対して特異的な結合親和性を有する第１の結合ドメインが、表６ｆにより本明細書において同定される抗ＣＤ３抗体の対のＶＬおよびＶＨ配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示し、エフェクター細胞に対して特異的な結合親和性を有する第２の結合ドメインが、表６ａにより本明細書において同定される抗標的細胞抗体の対のＶＬおよびＶＨ配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示す、二重特異性配列であり得る。一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結された単一のＢＰ分子を含み得る。一部の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、第１のＢＰと、同ＢＰの第２の分子とを含み得、その結果、１つまたは複数のＸＴＥＮ（例えば、グルカゴンの２分子、またはｈＧＨの２分子）に連結された２つのＢＰを含む融合タンパク質が生じる。
一般に、ＢＰは、ｉｎ ｖｉｖｏで使用されるとき、またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに用いられるとき、所与の標的（または所与の数の標的）に対する結合特異性、または別の所望の生物学的特徴を示すことになる。例えば、ＢＰは、アゴニスト、受容体、リガンド、アンタゴニスト、酵素、抗体（例えば、単一特異性または二重特異性）、またはホルモンであり得る。疾患または障害に使用される、またはそれに有用であることが公知であるＢＰであって、天然ＢＰが比較的短い終末相半減期を有し、薬物動態パラメーター（スペーサー配列の切断により融合タンパク質から必要に応じて放出され得る）の向上が、低頻度の投与または薬理効果の増強を可能にするＢＰは、特に興味深い。最小有効用量または血中濃度（Ｃｍｉｎ）と最大耐用用量または血中濃度（Ｃｍａｘ）との間の狭い治療域を有するＢＰも興味深い。そのような場合、選ばれたＸＴＥＮ配列を含む融合タンパク質へのＢＰの連結は、これらの特性の改善をもたらすことができ、したがって、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して、それらを治療または予防剤として有用なものにし得る。
本発明の組成物により包含されるＢＰは、グルコースおよびインスリン障害、代謝障害、心血管疾患、凝固および出血性障害、成長障害または状態、内分泌障害、眼疾患、腎疾患、肝疾患、腫瘍形成性状態、炎症状態、自己免疫性状態などを含むがこれらに限定されない、様々な治療または疾患カテゴリーの処置に有用であり得る。
「抗ＣＤ３」は、ＯＫＴ３（ムロモナブとも呼ばれる）およびヒト化抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｈＯＫＴ３１（Ａｌａ－Ａｌａ））（ＫＣ Ｈｅｒｏｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３４６： １６９２－１６９８． ２００２）を含む、Ｔ細胞表面タンパク質ＣＤ３、その種および配列バリアント、ならびに断片に対するモノクローナル抗体を意味する。抗ＣＤ３は、Ｔ細胞活性化および増殖を、すべての分化Ｔ細胞上に存在するＴ細胞受容体複合体に結合することにより防止する。本発明の抗ＣＤ３含有融合タンパク質は、初発１型糖尿病を遅らせるために特に使用され得、これには、治療用エフェクターとしての抗ＣＤ３の使用はもちろん、ＢＰＸＴＥＮ組成物中の第２の治療用ＢＰに対する標的化部分としての抗ＣＤ３の使用も含まれる。抗ＣＤ３の可変領域の配列および抗ＣＤ３の作出は、米国特許第５，８８５，５７３号および同第６，４９１，９１６号に記載されている。
対象組成物のＢＰは、天然、全長ポリペプチドに限定されず、それらの組換えバージョンならびに生物活性および／または薬理活性バリアントもしくは断片も含む。例えば、ＢＰの生物活性または薬理学的特性に関して本発明の精神を逸脱することなく、様々なアミノ酸置換をＧＰに加えてバリアントを作出することができることは、理解されるであろう。ポリペプチド配列中のアミノ酸の保存的置換の例は、表５に示されている。しかし、ＢＰの配列同一性が、本明細書で開示される特定の配列と比較して１００％未満であるＢＰＸＴＥＮの実施形態では、本発明は、他の１９の天然Ｌ－アミノ酸のいずれかでの、隣接アミノ酸残基を含む、ＢＰの配列内の任意の位置にあり得る所与のＢＰの所与のアミノ酸残基の置換を企図している。いずれか１つの置換が生物活性の望ましくない変化をもたらす場合には、代替アミノ酸のうちの１つを利用することができ、構築物を、本明細書に記載される方法により、または例えば米国特許第５，３６４，９３４号（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の、保存的および非保存的突然変異についての教示およびガイドラインのいずれかを使用して、または当業者に一般に公知の方法を使用して、評価することができる。加えて、バリアントは、例えば、１つまたは複数のアミノ酸残基がＢＰの全長天然アミノ酸配列のＮまたはＣ末端において付加または欠失されているポリペプチドであって、天然ペプチドの生物活性の少なくとも一部分を保持するポリペプチドも含み得る。
表５： 例示的な保存的アミノ酸置換
Figure 2023531494000021
一部の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に組み込まれるＢＰは、ある配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、代替的に少なくとも約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、または１００％の配列同一性を示す配列を有し得る。一部の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮに組み込まれるＢＰは、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含む二重特異性配列であって、標的細胞の腫瘍特異的マーカーまたは抗原に対して特異的な結合親和性を有する第１の結合ドメインが、表６ｆにより本明細書において同定される抗ＣＤ３抗体の対のＶＬおよびＶＨ配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示し、エフェクター細胞に対して特異的な結合親和性を有する第２の結合ドメインが、表６ａにより本明細書において同定される抗標的細胞抗体の対のＶＬおよびＶＨ配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示す、二重特異性配列であり得る。前述の実施形態のＢＰを、本明細書に記載のアッセイまたは測定されたもしくは決定されたパラメーターを使用して活性について評価することができ、対応する天然ＢＰ配列と比較して、少なくとも約４０％、または約５０％、または約５５％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、またはそれより高い活性を保持する配列は、対象ＢＰＸＴＥＮ内への組込みに好適であると見なされることになる。好適な活性レベルを保持することが判明したＢＰを、本明細書における上記のまたは本明細書中の他のどこかの箇所で説明される１つまたは複数のＸＴＥＮポリペプチドに連結させることができる。一実施形態では、好適な活性レベルを保持することが判明したＢＰを、表３ａ～３ｂからの配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性）を有する１つまたは複数のＸＴＥＮポリペプチドに連結させ、キメラ融合タンパク質とすることができる。
Ｔ細胞エンゲージャー
ＢＰＸＴＥＮの追加の構造の立体配置式は、ＢＰが二重特異性抗体である、ＸＴＥＮ化プロテアーゼ活性化Ｔ細胞エンゲージャー（「ＸＰＡＴ」（単数または複数））（例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）に関する。一部の実施形態では、ＸＰＡＴ組成物は、（１）第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含む第１の部分；および（２）放出セグメントを含む第２の部分、および（３）バルキング部分を含む第３の部分を含む。一部の実施形態では、ＸＰＡＴ組成物は、式Ｉａの立体配置（Ｎ末端からＣ末端へ描示される）：
（第１の部分）－（第２の部分）－（第３の部分）（Ｉａ）
を有し、式中、第１の部分は、第１の結合ドメインが、標的細胞の腫瘍特異的マーカーまたは抗原に対して特異的な結合親和性を有し、第２の結合ドメインが、エフェクター細胞に対して特異的な結合親和性を有する、２つのｓｃＦｖを含む二重特異性のものであり；第２の部分は、哺乳動物プロテアーゼにより切断され得る放出セグメント（ＲＳ）（本明細書において下記でさらに十分に説明される通り、プロテアーゼは、腫瘍特異的または抗原特異的であることによって、活性化し得る）を含み：第３の部分は、バルキング部分である。前述の実施形態では、第１の部分の結合ドメインは、順序（ＶＬ－ＶＨ）１－（ＶＬ－ＶＨ）２（ここで、「１」および「２」は、それぞれ第１および第２の結合ドメインを表す）、または（ＶＬ－ＶＨ）１－（ＶＨ－ＶＬ）２、または（ＶＨ－ＶＬ）１－（ＶＬ－ＶＨ）２、または（ＶＨ－ＶＬ）１－（ＶＨ－ＶＬ）２（ここで、対の結合ドメインは、ポリペプチドリンカー（本明細書において下記でさらに十分に説明される通り）により連結されている）であり得る。一実施形態では、第１の部分ＶＬおよびＶＨは、表６ａ～６ｆに記載されており；ＲＳは、表８ａ～８ｂに記載の配列の群により本明細書において同定され（下記でより十分に説明される通り）；バルキング部分は、ＸＴＥＮ、アルブミン結合ドメイン、アルブミン、ＩｇＧ結合ドメイン、プロリンとセリンとアラニンとからなるポリペプチド、脂肪酸、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＧＡ、またはヒドロキシエチルデンプンである。所望される場合、バルキング部分は、表３ａ～３ｂに記載の配列に対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＸＴＥＮである。前述の実施形態では、組成物は、組換え融合タンパク質である。一部の実施形態では、部分は、化学的コンジュゲーションにより連結されている。
一部の実施形態では、ＸＰＡＴ組成物は、式ＩＩａの立体配置（Ｎ末端からＣ末端へ描示される）：
（第３の部分）－（第２の部分）－（第１の部分）（ＩＩａ）
を有し、式中、第１の部分は、第１の結合ドメインが、標的細胞の腫瘍特異的マーカーまたは抗原に対して特異的な結合親和性を有し、第２の結合ドメインが、エフェクター細胞に対して特異的な結合親和性を有する、２つのｓｃＦｖを含む二重特異性のものであり；第２の部分は、哺乳動物プロテアーゼにより切断され得る放出セグメント（ＲＳ）を含み；第３の部分は、バルキング部分である。前述の実施形態では、第１の部分の結合ドメインは、順序（ＶＬ－ＶＨ）１－（ＶＬ－ＶＨ）２（ここで、「１」および「２」は、それぞれ第１および第２の結合ドメインを表す）、または（ＶＬ－ＶＨ）１－（ＶＨ－ＶＬ）２、または（ＶＨ－ＶＬ）１－（ＶＬ－ＶＨ）２、または（ＶＨ－ＶＬ）１－（ＶＨ－ＶＬ）２（ここで、対の結合ドメインは、本明細書に記載のポリペプチドリンカーにより連結されている）であり得る。一実施形態では、第１の部分ＶＬおよびＶＨは、表６ａ～６ｆで同定され；ＲＳは、表８ａ～８ｂに記載の配列の群として本明細書において同定され；バルキング部分は、ＸＴＥＮ、アルブミン結合ドメイン、アルブミン、ＩｇＧ結合ドメイン、プロリンとセリンとアラニンとからなるポリペプチド、脂肪酸、またはＦｃドメインである。所望される場合、バルキング部分は、表３ａ～３ｂに記載の配列に対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＸＴＥＮである。前述の実施形態では、組成物は、組換え融合タンパク質である。一部の実施形態では、部分は、化学的コンジュゲーションにより連結されている。
一部の実施形態では、ＸＰＡＴ組成物は、式ＩＩＩａの立体配置（Ｎ末端からＣ末端へ描示される）：
（第５の部分）－（第４の部分）－（第１の部分）－（第２の部分）－（第３の部分） （ＩＩＩａ）
を有し、式中、第１の部分は、第１の結合ドメインが、標的細胞の腫瘍特異的マーカーまたは抗原に対して特異的な結合親和性を有し、第２の結合ドメインが、エフェクター細胞に対して特異的な結合親和性を有する、２つのｓｃＦｖを含む二重特異性のものであり；第２の部分は、哺乳動物プロテアーゼにより切断され得る放出セグメント（ＲＳ）を含み；第３の部分は、バルキング部分であり；第４の部分は、第２の部分と同一であってもよく、または異なっていてもよい、哺乳動物プロテアーゼにより切断され得る放出セグメント（ＲＳ）を含み；第５の部分は、第３の部分と同一であってもよく、または異なっていてもよい、バルキング部分である。前述の実施形態では、第１の部分の結合ドメインは、順序（ＶＬ－ＶＨ）１－（ＶＬ－ＶＨ）２（ここで、「１」および「２」は、それぞれ第１および第２の結合ドメインを表す）、または（ＶＬ－ＶＨ）１－（ＶＨ－ＶＬ）２、または（ＶＨ－ＶＬ）１－（ＶＬ－ＶＨ）２、または（ＶＨ－ＶＬ）１－（ＶＨ－ＶＬ）２（ここで、対の結合ドメインは、本明細書に記載のポリペプチドリンカーにより連結されている）であり得る。前述の実施形態では、ＲＳは、表８ａ～８ｂに記載の配列と同一である。前述の実施形態では、バルキング部分は、ＸＴＥＮ、アルブミン結合ドメイン、アルブミン、ＩｇＧ結合ドメイン、プロリンとセリンとアラニンとからなるポリペプチド、脂肪酸、またはＦｃドメインである。所望される場合、バルキング部分は、表３ａ～３ｂに記載の配列により本明細書において同定される配列に対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＸＴＥＮである。前述の実施形態では、組成物は、組換え融合タンパク質である。一部の実施形態では、部分は、化学的コンジュゲーションにより連結されている。
対象組成物は、それらの設計および特異的成分に基づいて、有利には、二重特異性治療薬であって、それらが、標的組織、または疾患により不健康にされた組織に伴って見いだされるプロテアーゼによって切断されると、より高い選択性、より長い半減期を有し、より低い毒性およびより少ない副作用につながる、二重特異性治療薬を提供し、したがって、対象組成物は、当技術分野において公知の二重特異性抗体組成物と比較して、改善された治療指数を有する。そのような組成物は、がんを含むがこれに限定されない、ある特定の疾患の処置に有用である。本発明の組成物が、非特異的相互作用のこの低減を、結合ドメインをバルキーなＸＴＥＮ分子に置くことによる立体障害と、長い柔軟なＸＴＥＮポリペプチドの柔軟な非構造化特徴が、組成物に繋留されることにより、振動することおよび結合ドメインの周りを回ることができることによって組成物と組織または細胞との間の遮断をもたらす、立体障害とを含む、メカニズムの組合せ、ならびに細胞または組織に侵入する無傷組成物の能力の、個々の結合ドメインのサイズと比較して大きい分子量に起因する（両方によりＸＴＥＮの実際の分子量にもたらされる、および非構造化ＸＴＥＮの大きい流体力学半径に起因する）低減により達成することは、当業者には理解されるであろう。しかし、組成物は、ＲＳを切断することができるプロテアーゼを有するまたは分泌する標的組織もしくは細胞に近接している場合、あるいは結合ドメインがリガンドに結合したときに標的細胞または組織に内在化された場合、二重特異性結合ドメインが、プロテアーゼの作用によりＸＴＥＮのバルクから遊離され、これにより立体障害障壁が取り除かれ、その薬理効果をより自由に発揮することができるように、設計される。対象組成物は、細胞、組織または臓器への治療用二重特異性抗体組成物の選択的送達が所望される様々な状態の処置に使用される。一実施形態では、標的組織は、白血病、リンパ腫、または臓器もしくは系の腫瘍であり得る、がんである。
結合ドメイン
本開示は、エフェクター細胞に付随するリガンドまたは受容体に結合できる、およびがん、腫瘍または他の悪性組織である罹病組織または細胞の抗原に結合できる、一本鎖結合ドメイン、例えば、これらに限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、線状抗体、単一ドメイン抗体、単一ドメインラクダ科動物抗体、単一ドメイン抗体分子（ｓｃＦｖ）、およびダイアボディの使用を企図している。一部の実施形態では、抗原結合断片（ＡＦ）（例えば、第１の抗原結合断片（ＡＦ１）、または第２の抗原結合断片（ＡＦ２））は、（各々独立して）キメラまたはヒト化抗原結合断であり得る。抗原結合断片（ＡＦ）（例えば、第１の抗原結合断片（ＡＦ１）、または第２の抗原結合断片（ＡＦ２））は、（各々独立して）Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、線状抗体、または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。２つの抗原結合断片（例えば、第１および第２の抗原結合断片）は、（Ｆａｂ’）２または一本鎖ダイアボディとして構成され得る。一部の実施形態では、二重特異性のものは、標的細胞マーカーへの結合特異性を有する第１の結合ドメイン、およびエフェクター細胞抗原への結合特異性を有する第２の結合ドメインを含む。一部の実施形態では、第１および第２の結合ドメインは、非抗体足場、例えば、アンチカリン、アドネクチン、フィノマー、アフィリン、アフィボディ、センチリン、またはＤＡＲＰｉｎであり得る。他の実施形態では、腫瘍細胞標的の結合ドメインは、腫瘍細胞により過剰発現されるタンパク質のペプチド断片を担持しているＭＨＣに結合するように操作されたＴ細胞受容体の可変ドメインである。一部の実施形態では、ＸＰＡＴ組成物は、広い治療域を提供するために、標的組織プロテアーゼの位置、および標的とされないように意図された健康な組織中のそのプロテアーゼの存在、および健康な組織中の標的リガンドの存在、しかし不健康な標的組織中のそのリガンドのより大きな存在を考慮して設計される。「治療域」は、所与の治療用組成物についての最小有効用量と最大耐用用量との間の最大差を指す。広い治療域の達成を助長するために、組成物の第１の部分の結合ドメインは、バルキング部分（例えば、ＸＴＥＮ）の近接により遮蔽され、その結果、一方または両方のリガンドに対する無傷組成物の結合親和性が、哺乳動物プロテアーゼにより切断された組成物と比較して低下されることによって、第１の部分がバルキング部分の遮蔽効果から解放される。
一本鎖結合ドメインに関しては、十分に確立されているように、Ｆｖは、完全抗原認識および結合部位を含有する最小の抗体断片であり、非共有結合で会合している１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の二量体からなる。ＶＨ鎖およびＶＬ鎖各々の中に、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を規定するように相互作用する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）があり、結合ドメインのこれら６つのＣＤＲが、抗体または一本鎖結合ドメインに抗原結合特異性を付与する。一部の場合には、各結合ドメイン内に３、４または５つのＣＨＲを各々が有するｓｃＦｖが作出される。ＣＤＲに隣接しているフレームワーク配列は、種を超えて天然免疫グロブリン内に本質的に保存されている三次構造を有し、フレームワーク残基（ＦＲ）は、ＣＤＲをそれらの適切な配向で保持する役目を果たす。定常ドメインは、結合機能に必要とされないが、ＶＨ－ＶＬ相互作用の安定化に役立ち得る。一部の実施形態では、ポリペプチドの結合部位のドメインは、同じ免疫グロブリンまたは異なる免疫グロブリンどちらかのＶＨ－ＶＬ、ＶＨ－ＶＨまたはＶＬ－ＶＬドメイン対であり得るが、一般に、親抗体からのそれぞれのＶＨおよびＶＬ鎖を使用して一本鎖結合ドメインを作製することが好ましい。ポリペプチド鎖内のＶＨおよびＶＬドメインの順序は、本発明については限定されず、与えられるドメインの順序は、通常は機能の損失を一切伴わずに逆にすることができるが、当然のことながら、ＶＨおよびＶＬドメインが、抗原結合部位が正しく折り重なり得るように配置される。したがって、対象組成物の二重特異性ｓｃＦｖ実施形態の一本鎖結合ドメインは、順序（ＶＬ－ＶＨ）１－（ＶＬ－ＶＨ）２（ここで、「１」および「２」は、それぞれ第１および第２の結合ドメインを表す）、または（ＶＬ－ＶＨ）１－（ＶＨ－ＶＬ）２、または（ＶＨ－ＶＬ）１－（ＶＬ－ＶＨ）２、または（ＶＨ－ＶＬ）１－（ＶＨ－ＶＬ）２（ここで、対の結合ドメインは、本明細書の下記に記載のポリペプチドリンカーにより連結されている）であり得る。
それ故、本明細書で開示される例示的な二重特異性一本鎖抗体における結合ドメインの配置は、第１の結合ドメインが第２の結合ドメインのＣ末端側に位置するものであり得る。Ｖ鎖の配置は、ＶＨ（標的細胞表面抗原）－ＶＬ（標的細胞表面抗原）－ＶＬ（エフェクター細胞抗原）－ＶＨ（エフェクター細胞抗原）、ＶＨ（標的細胞表面抗原）－ＶＬ（標的細胞表面抗原）－ＶＨ（エフェクター細胞抗原）－ＶＬ（エフェクター細胞抗原）、ＶＬ（標的細胞表面抗原）－ＶＨ（標的細胞表面抗原）－ＶＬ（エフェクター細胞抗原）－ＶＨ（エフェクター細胞抗原）またはＶＬ（標的細胞表面抗原）－ＶＨ（標的細胞表面抗原）－ＶＨ（エフェクター細胞抗原）－ＶＬ（エフェクター細胞抗原）であり得る。第２の結合ドメインが第１の結合ドメインのＮ末端側に位置する配置については、以下の順序が可能である：ＶＨ（エフェクター細胞抗原）－ＶＬ（エフェクター細胞抗原）－ＶＬ（標的細胞表面抗原）－ＶＨ（標的細胞表面抗原）、ＶＨ（エフェクター細胞抗原）－ＶＬ（エフェクター細胞抗原）－ＶＨ（標的細胞表面抗原）－ＶＬ（標的細胞表面抗原）、ＶＬ（エフェクター細胞抗原）－ＶＨ（エフェクター細胞抗原）－ＶＬ（標的細胞表面抗原）－ＶＨ（標的細胞表面抗原）またはＶＬ（エフェクター細胞抗原）－ＶＨ（エフェクター細胞抗原）－ＶＨ（標的細胞表面抗原）－ＶＬ（標的細胞表面抗原）。本明細書で使用される場合、「のＮ末端側」または「のＣ末端側」およびその文法上の異表記は、二重特異性一本鎖抗体の絶対ＮまたはＣ末端に置かれることではなく一次アミノ酸配列内の相対位置を意味する。それ故、非限定的な例として、「第２の結合ドメインのＣ末端側に位置する」第１の結合ドメインは、第１の結合が、二重特異性一本鎖抗体内の第２の結合ドメインのカルボキシル側に位置することを意味し、追加の配列、例えば、Ｈｉｓタグ、または別の化合物、例えば、放射性同位体が、二重特異性一本鎖抗体のＣ末端に位置する可能性を除外しない。
一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含む第１の部分を含み、これらの結合ドメインの各々がｓｃＦｖであり、各ｓｃＦｖが１つのＶＬおよび１つのＶＨを含む。一部の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含む第１の部分を含み、これらの結合ドメインは、ダイアボディ立体配置であり、各ドメインが１つのＶＬドメインおよび１つのＶＨを含む。
本発明のＸＰＡＴ組成物のｓｃＦｖ実施形態は、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含み、ＶＬおよびＶＨドメインは、標的細胞およびエフェクター細胞抗原の腫瘍特異的マーカーまたは抗原への結合特異性をそれぞれ有するモノクローナル抗体に由来すると考えられる。他の場合には、第１および第２の結合ドメインは各々、標的細胞マーカー、例えば、腫瘍特異的マーカーおよびエフェクター細胞抗原への結合特異性をそれぞれ有するモノクローナル抗体に由来する６つのＣＤＲを含む。他の実施形態では、対象組成物の第１の部分の第１および第２の結合ドメインは、各結合ドメイン内に３、４または５つのＣＨＲを有し得る。他の実施形態では、本発明の実施形態は、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含み、これらの各々が、ＣＤＲ－Ｈ１領域、ＣＤＲ－Ｈ２領域、ＣＤＲ－Ｈ３領域、ＣＤＲ－Ｌ１領域、ＣＤＲ－Ｌ２領域、およびＣＤＲ－Ｈ３領域を含み、これらの領域の各々は、標的細胞の腫瘍特異的マーカーまたは抗原におよびエフェクター細胞抗原にそれぞれ結合できるモノクローナル抗体に由来する。一実施形態では、本発明は、第２の結合ドメインが、ヒトＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体に由来するＶＨおよびＶＬ領域を含む、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ｓｃＦｖの第２の結合ドメインが、ＶＨおよびＶＬ領域を含み、各ＶＨおよびＶＬ領域が、表６ａで同定される抗ＣＤ３抗体の対のＶＬおよびＶＨ配列に対して、少なくとも約９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を示すか、またはその対の配列と同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明の第２のドメイン実施形態は、ＣＤＲ－Ｈ１領域、ＣＤＲ－Ｈ２領域、ＣＤＲ－Ｈ３領域、ＣＤＲ－Ｌ１領域、ＣＤＲ－Ｌ２領域、およびＣＤＲ－Ｈ３領域を含み、これらの領域の各々が、表６ａに記載の抗体として本明細書において同定されるモノクローナル抗体に由来する。前述の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメインは、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、または単一ドメインラクダ科動物抗体として構成され得る。
他の実施形態では、対象組成物の第２のドメインは、表６ａに記載の抗体として本明細書において同定される抗ＣＤ３抗体に由来する。前述の一実施形態では、対象組成物の第２の結合ドメインは、表６ａに記載の抗体の群として本明細書において同定される抗ＣＤ３抗体の対のＶＬおよびＶＨ領域配列を含む。一部の実施形態では、本発明は、第２の結合ドメインが、ＶＨおよびＶＬ領域を含み、各ＶＨおよびＶＬ領域が、表６ａのｈｕＵＣＨＴ１抗ＣＤ３抗体の対のＶＬおよびＶＨ配列に対して、少なくとも約９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を示すか、またはその対の配列と同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。前述の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメインは、ｓｃＦｖ、ダイアボディの一部分、単一ドメイン抗体、または単一ドメインラクダ科動物抗体として構成され得る。
他の実施形態では、組成物の第１のドメインのｓｃＦｖは、表６ｆに記載の抗体として同定される抗腫瘍細胞抗体に由来する。一部の実施形態では、本発明は、第１の結合ドメインが、ＶＨおよびＶＬ領域を含み、各ＶＨおよびＶＬ領域が、表６ｆで同定される抗腫瘍細胞抗体の対のＶＬおよびＶＨ配列に対して、少なくとも約９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を示すか、またはその対の配列と同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。前述の一部の実施形態では、述べられている組成物の第１のドメインは、本明細書で開示される抗腫瘍細胞抗体の対のＶＬおよびＶＨ領域配列を含む。前述の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメインは、ｓｃＦｖ、ダイアボディの一部分、単一ドメイン抗体、または単一ドメインラクダ科動物抗体として構成され得る。
一部の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含む第１の部分を含み、これらの結合ドメインは、ダイアボディ立体配置であり、結合ドメインの各々が１つのＶＬドメインおよび１つのＶＨドメインを含む。一実施形態では、本発明のダイアボディ実施形態は、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含み、ＶＬおよびＶＨドメインは、標的細胞の腫瘍特異的マーカーまたは抗原へのおよびエフェクター細胞抗原への結合特異性をそれぞれ有するモノクローナル抗体に由来する。一部の実施形態では、本発明のダイアボディ実施形態は、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含み、これらの各々が、ＣＤＲ－Ｈ１領域、ＣＤＲ－Ｈ２領域、ＣＤＲ－Ｈ３領域、ＣＤＲ－Ｌ１領域、ＣＤＲ－Ｌ２領域、およびＣＤＲ－Ｈ３領域を含み、これらの領域の各々は、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原におよびエフェクター細胞抗原にそれぞれ結合できるモノクローナル抗体に由来する。本発明のダイアボディ実施形態は、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含み、そのＶＬおよびＶＨドメインは、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原へのおよびエフェクター細胞抗原への結合特異性をそれぞれ有するモノクローナル抗体に由来すると考えられる。一部の実施形態では、本発明のダイアボディ実施形態は、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含み、これらの各々が、ＣＤＲ－Ｈ１領域、ＣＤＲ－Ｈ２領域、ＣＤＲ－Ｈ３領域、ＣＤＲ－Ｌ１領域、ＣＤＲ－Ｌ２領域、およびＣＤＲ－Ｈ３領域を含み、これらの領域の各々は、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原におよびエフェクター細胞抗原にそれぞれ結合できるモノクローナル抗体に由来する。一実施形態では、本発明は、ダイアボディの第２の結合ドメインが、ヒトＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体に由来する対のＶＨおよびＶＬ領域を含む、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ダイアボディの第２の結合ドメインが、ＶＨおよびＶＬ領域を含み、各ＶＨおよびＶＬ領域が、表６ａで同定される抗ＣＤ３抗体の対のＶＬおよびＶＨ配列に対して、少なくとも約９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を示すか、またはその対の配列と同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ダイアボディの第２の結合ドメインが、ＶＨおよびＶＬ領域を含み、各ＶＨおよびＶＬ領域が、表６ａのｈｕＵＣＨＴ１抗体のＶＬおよびＶＨ配列に対して、少なくとも約９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を示すか、またはその対の配列と同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。他の実施形態では、組成物のダイアボディの第２の結合ドメインは、本明細書に記載される抗ＣＤ３抗体に由来する。一部の実施形態では、本発明は、ダイアボディの第１の結合ドメインが、ＶＨおよびＶＬ領域を含み、各ＶＨおよびＶＬ領域が、表６ｆで同定される抗腫瘍細胞抗体のＶＬおよびＶＨ配列に対して、少なくとも約９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を示すか、またはその対の配列と同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。他の実施形態では、組成物のダイアボディの第１のドメインは、本明細書に記載される抗腫瘍細胞抗体に由来する。
本発明の対象組成物の結合親和性および／または他の生物活性を測定するための方法は、本明細書で開示されるもの、または当技術分野において一般に公知の方法であり得る。例えば、Ｋｄで示される、結合対（例えば、抗体と抗原）の結合親和性は、放射性結合アッセイ、非放射性結合アッセイ、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｂｉａｃｏｒｅ）、ならびに酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、結合平衡除外アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））、または実施例に記載のものを含むがこれらに限定されない、様々な好適なアッセイを使用して決定することができる。結合親和性の増加または減少、例えば、バルキング部分が結合されているキメラポリペプチドアセンブリーと比較して、切断されてバルキング部分が除去されたキメラポリペプチドアセンブリーの結合親和性の増加または減少は、キメラポリペプチドアセンブリーの、バルキング部分を有するまたは有さないその標的結合パートナーへの結合親和性を測定することにより決定することができる。
対象キメラアセンブリーの半減期の測定は、様々な好適な方法により行うことができる。例えば、物質の半減期は、物質を対象に投与すること、および生体試料（例えば、体液、例えば、血液または血漿または腹水）を定期的に採取して試料中の物質の濃度および／または量を経時的に決定することにより、決定することができる。生体試料中の物質の濃度は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロット、ならびに高圧液体クロマトグラフィーおよび高速タンパク質脂質クロマトグラフィーをはじめとするクロマトグラフィー技法を含む、様々な好適な方法を使用して、決定することができる。一部の場合には、物質は、試料（例えば、血液試料または血漿試料）中の物質の濃度を決定するために使用され得る検出可能なタグ、例えば、放射性タグまたは蛍光タグで、標識され得る。次いで、様々な薬物動態パラメーターがその結果から決定され、この決定は、ソフトウェアパッケージ、例えばＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用して、または当技術分野において公知の手動計算により、行うことができる。
加えて、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の物理化学的特性を測定して、溶解度、構造、および安定性の保持を確認することができる。対象組成物のアッセイが行われ、それによって、結合解離定数（Ｋｄ、ＫｏｎおよびＫｏｆｆ）、リガンド－受容体複合体の解離の半減期、および遊離リガンドと比較して捕捉されたリガンドの生物活性を阻害する結合ドメインの活性（ＩＣ５０値）をはじめとする、リガンドへの結合ドメインの結合特徴の決定が可能になる。用語「ＩＣ５０」は、リガンドアゴニストの最大の生物学的応答の半分を阻害するために必要とされる濃度を指し、一般に、競合結合アッセイにより決定される。用語「ＥＣ５０」は、活性物質の最大の生物学的応答の半分を達成するために必要とされる濃度を指し、一般に、ＥＬＩＳＡまたは細胞に基づくアッセイ（本明細書に記載される実施例の方法を含む）により決定される。
抗ＣＤ３結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、第２の部分の結合ドメインは、ＣＤ３に結合するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ３イプシロンおよび／またはＣＤ３デルタに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＤ３に対するモノクローナル抗体のＶＬおよびＶＨ配列の例示的な、非限定的な例は、表６ａに提示される。一実施形態では、本発明は、表６ａに記載の抗ＣＤ３ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、ＣＤ３に対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリーを提供する。一部の実施形態では、本発明は、表６ａに記載の抗ＣＤ３イプシロンＶＬおよびＶＨ配列を含む、ＣＤ３イプシロンに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリーを提供する。一部の実施形態では、本発明は、第１の部分のｓｃＦｖの第２の結合ドメインが、ＶＨおよびＶＬ領域を含み、各ＶＨおよびＶＬ領域が、表６ａのｈｕＵＣＨＴ１抗ＣＤ３抗体の対のＶＬおよびＶＨ配列に対して、少なくとも約９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を示すか、またはその対の配列と同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＣＤＲ－Ｌ１領域、ＣＤＲ－Ｌ２領域、ＣＤＲ－Ｌ３領域、ＣＤＲ－Ｈ１領域、ＣＤＲ－Ｈ２領域およびＣＤＲ－Ｈ３領域を含むＣＤ３に対する結合親和性を有する結合ドメインを含み、各々が、表６ａに記載のそれぞれの抗ＣＤ３ ＶＬおよびＶＨ配列に由来するものである、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＣＤＲ－Ｌ１領域、ＣＤＲ－Ｌ２領域、ＣＤＲ－Ｌ３領域、ＣＤＲ－Ｈ１領域、ＣＤＲ－Ｈ２領域およびＣＤＲ－Ｈ３領域を含むＣＤ３に対する結合親和性を有する結合ドメインを含み、ＣＤＲ配列が、ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号５０）、ＹＴＳＲＬＥＳＱＱＧＮＴＬＰＷＴ（配列番号７８）、ＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮ（配列番号７９）、ＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴ（配列番号８０）、およびＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶ（配列番号８１）である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。
ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）と会合している細胞表面分子群であって、ＴＣＲの細胞表面発現で、およびペプチド：ＭＨＣリガンドがＴＣＲに結合すると起こるシグナル伝達カスケードで機能する、細胞表面分子群である。典型的には、抗原がＴ細胞受容体に結合すると、ＣＤ３は、細胞膜を介してＴ細胞内の細胞質にシグナルを送る。これにより、Ｔ細胞の活性化が生じ、Ｔ細胞が迅速に分裂して、ＴＣＲが曝露された特定の抗原を攻撃するように感作された新たなＴ細胞を産生する。ＣＤ３複合体は、ＣＤ３イプシロン分子とともに４つの他の膜結合ポリペプチド（ＣＤ３－ガンマ、－デルタ、および／または－ゼータ）から構成される。ヒトの場合、ＣＤ３－イプシロンは、第１１染色体上のＣＤ３Ｅ遺伝子によりコードされる。ＣＤ３鎖の各々についての細胞内ドメインは、Ｔ細胞受容体エンゲージメント時に細胞内シグナル伝達機構の核形成点としての機能を果たす、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。
いくつかの治療戦略は、ＴＣＲシグナル伝達を標的とすることによりＴ細胞免疫、特に、免疫抑制レジメンで広く臨床使用されている抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をモジュレートする。ＣＤ３特異的マウスｍＡｂ ＯＫＴ３は、ヒトにおける使用が認可された最初のｍＡｂであり（Ｓｇｒｏ， Ｃ． Ｓｉｄｅ－ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｍｕｒｏｍｏｎａｂ ＣＤ３／ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３： ｂｉｂｌｉｏｇｒａｐｈｉｃ ｒｅｖｉｅｗ． Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １０５：２３－２９， １９９５）、免疫抑制剤として移植（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ， Ｃｌｉｎ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ７：４２２－４３０， （１９９３）；Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３：１２３－１３２ （２００３）；Ｋｕｍａｒ， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． Ｐｒｏｃ． ３０：１３５１－１３５２ （１９９８））、１型糖尿病、および乾癬の際に広く臨床使用されている。重要なこととして、抗ＣＤ３ ｍＡｂは、部分的Ｔ細胞シグナル伝達およびクローンアネルギーを誘導し得る（Ｓｍｉｔｈ， ＪＡ， Ｎｏｎｍｉｔｏｇｅｎｉｃ Ａｎｔｉ－ＣＤ３ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｄｅｌｉｖｅｒ ａ Ｐａｒｔｉａｌ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｉｇｎａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｃｅ Ｃｌｏｎａｌ Ａｎｅｒｇｙ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５：１４１３－１４２２ （１９９７））。ＯＫＴ３は、Ｔ細胞マイトジェンおよび強力なＴ細胞キラーとして文献に記載されている（Ｗｏｎｇ， ＪＴ． Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＤ３ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｍｅｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ ｂｙ ｉｎｔｅｒ－Ｔ ｃｅｌｌ ｂｒｉｄｇｉｎｇ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５０：６８３－６８９ （１９９０））。特に、Ｗｏｎｇの研究は、ＣＤ３ Ｔ細胞と標的細胞を架橋することによって標的の死滅を達成することができること、およびＦｃＲ媒介ＡＤＣＣも、補体結合も、二価抗ＣＤ３ ＭＡＢが標的細胞を溶解するために必要でないことを実証した。
ＯＫＴ３は、時間依存的にマイトジェン活性と殺Ｔ細胞活性の両方を示し、サイトカイン放出につながるＴ細胞の初期活性化後、ＯＫＴ３のさらなる投与をすると、その後、すべての公知Ｔ細胞機能が遮断される。ＯＫＴ３に、同種移植組織拒絶反応の低減またはさらには消滅のための治療レジメンにおける免疫抑制薬のような広い応用が見いだされているのは、Ｔ細胞機能のこのその後の遮断に起因する。ＣＤ３分子に特異的な他の抗体は、Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １ （１９８９）， ５４６－５０において開示されており、ＷＯ２００５／１１８６３５およびＷＯ２００７／０３３２３０には、抗ヒトモノクローナルＣＤ３イプシロン抗体が記載されており、米国特許第５，８２１，３３７号には、マウス抗ＣＤ３モノクローナルＡｂ ＵＣＨＴ１（ｍｕｘＣＤ３、Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７５， ２１７－２２５ （１９９２））およびこの抗体のヒト化バリアント（ｈｕ ＵＣＨＴ１）のＶＬおよびＶＨ配列が記載されており、米国特許出願公開第２０１２００３４２２８号には、ヒトおよび非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン鎖のエピトープに結合できる結合ドメインが開示されている。
表６ａ： 抗ＣＤ３モノクローナル抗体および配列
Figure 2023531494000022
Figure 2023531494000023
Figure 2023531494000024
 ＊ 下線付き配列は、存在する場合、ＶＬおよびＶＨ内のＣＤＲである
ＣＤ３細胞抗原結合断片
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の対象組成物実施形態のいずれかに組み込むことができる、エフェクター細胞抗原に対して特異的な結合親和性を有する抗原結合断片（ＡＦ１）に関する。一部の場合には、エフェクター細胞抗原は、形質細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ細胞）、マスト細胞、樹状細胞、調節性Ｔ細胞（ＲｅｇＴ細胞）、ヘルパーＴ細胞、骨髄性細胞、またはＮＫ細胞である、エフェクター細胞の表面に発現される。
エフェクター細胞抗原に結合する様々なＡＦ１は、罹病細胞または組織の細胞死滅をもたらすために組成物の形で罹病細胞または組織に付随するＨＥＲ２抗原に対して結合親和性を有する抗原結合断片と対合させるのに、特に有用である。結合特異性は、相補性決定領域、すなわちＣＤＲ、例えば、軽鎖ＣＤＲまたは重鎖ＣＤＲによって決まり得る。多くの場合、結合特異性は、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲによって決まる。重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲの所与の組合せは、他の参照抗原と比較して、エフェクター細胞抗原へのより大きい親和性および／または特異性を付与する、所与の結合ポケットを提供する。エフェクター細胞抗原に対する結合親和性を有する第２の抗原結合断片（ＡＦ２）に、短い、柔軟なペプチドリンカーによって連結されている、ＨＥＲ２に対する第１の抗原結合断片（ＡＦ１）を有する、結果として生じる二重特異性組成物は、各抗原結合断片が、それらのそれぞれのリガンドに対する特異的な結合親和性を有することから、二重特異性である。そのような組成物では、疾患組織のＨＥＲ２に対するＡＦ２と、エフェクター細胞マーカーに指向されたＡＦ１とが、エフェクター細胞を疾患組織の細胞にごく近接させて罹病組織の細胞の細胞溶解を果たすために、組み合わせて使用されることは、理解されよう。さらに、ＡＦ１およびＡＦ２は、切断可能な放出セグメントとＸＴＥＮとを含む特別に設計されたポリペプチドに組み込まれ、このポリペプチドは、放出セグメント配列中の１つまたは複数の場所で放出セグメントを切断できるプロテアーゼを有する疾患組織に近接しているときに放出セグメントが切断されて、融合しているＡＦ１とＡＦ２が放出されることにより活性化されるプロドラッグ特徴を組成物に付与するように特別に設計されたポリペプチドである。
一実施形態では、対象組成物のＡＦ１は、Ｔ細胞の表面に発現されるエフェクター細胞抗原に対する結合親和性を有する。一部の実施形態では、対象組成物のＡＦ１は、ＣＤ３に対する結合親和性を有する。一部の実施形態では、対象組成物のＡＦ１は、ＣＤ３複合体のメンバーに対する結合親和性を有し、このメンバーには、個別形態または無関係に組み合わせられた形態での、ＣＤ３複合体のすべての公知ＣＤ３サブユニット、例えば、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、およびＣＤ３ゼータが含まれる。一部の実施形態では、ＡＦ１は、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３ゼータに対する結合親和性を有する。
本開示により企図される抗原結合断片の起源は、天然に存在する抗体もしくはその断片、天然に存在しない抗体もしくはその断片、ヒト化抗体もしくはその断片、合成抗体もしくはその断片、ハイブリッド抗体もしくはその断片、または操作された抗体もしくはその断片に由来し得る。所与の標的マーカーに対する抗体を生成するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、モノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製することができ、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）により作製することができる。抗体およびそれらの断片、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）、一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびにドメイン抗体（ｄＡｂ）の構造は、よく理解されている。所与の抗原に対する結合親和性を有する所望の抗原結合断片を有するポリペプチドを生成するための方法は、当技術分野において公知である。
本明細書で開示される組成物実施形態のための用語「抗原結合断片」の使用は、対応する無傷抗体のリガンドである抗原に結合する能力を保持する抗体の部分または断片を含むように意図さていることは、理解されるであろう。そのような実施形態では、抗原結合断片は、これらに限定されないが、ＣＤＲおよび介在フレームワーク領域、抗体の軽鎖および／もしくは重鎖（ＶＬ、ＶＨ）の可変もしくは超可変領域、可変断片（Ｆｖ）、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）、ＶＨＨラクダ科動物抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、線状抗体、単一ドメイン抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ＢＨＨもしくはＢＮＡＲ型の単一ドメイン重鎖免疫グロブリン、単一ドメイン軽鎖免疫グロブリン、または抗原に結合できる抗体の断片を含有する当技術分野において公知の他のポリペプチドであり得る。ＣＤＲ－ＨおよびＣＤＲ－Ｌを有する抗原結合断片を、Ｎ末端からＣ末端へ、（ＣＤＲ－Ｈ）－（ＣＤＲ－Ｌ）または（ＣＤＲ－Ｈ）－（ＣＤＲ－Ｌ）の配向で構成することができる。２つの抗原結合断片のＶＬおよびＶＨを、一本鎖ダイアボディ立体配置で構成することもでき、すなわち、ＡＦ１およびＡＦ２のＶＬおよびＶＨを、適切な長さのリンカーを用いてダイアボディとしての配置を可能にするように構成することもできる。
本開示の様々なＣＤ３結合ＡＦ１は、本明細書に記載のポリペプチド実施形態においてそれらの安定性を増強するように特異的に改変されている。抗体のタンパク質凝集は、それらの開発性における重要な課題であり続け、抗体産生における主要な注目分野のままである。抗体の凝集は、そのドメインの部分的なアンフォールディングによって誘発され、モノマー間の会合、その後の核形成および凝集体成長をもたらし得る。抗体および抗体ベースのタンパク質の凝集傾向は、外部の実験条件によって影響を受け得るが、それらの配列および構造によって決定される本質的な抗体特性に強く依存する。タンパク質は、それらのフォールディングされた状態でほんのわずかに安定であることが周知であるが、ほとんどのタンパク質が、本来、それらのフォールディングされていないかまたは部分的にフォールディングされていない状態で凝集しやすく、その結果生じる凝集体が、極めて安定かつ長寿命であり得ることはあまり理解されていないことが多い。凝集傾向の低下は、発現力価の増加を伴うことも示されているが、タンパク質凝集を低下させることが、開発プロセスを通じて有益であり、臨床研究へのより効率的経路をもたらし得ることを示す。治療用タンパク質にとって、凝集体は、患者における有害な免疫応答の重大なリスク因子であり、種々のメカニズムによって形成される可能性がある。凝集を制御することによって、タンパク質の安定性、製造性、消耗率、安全性、製剤化、力価、免疫原性、および溶解性を改善することができる。サイズ、疎水性、静電性および電荷分布などのタンパク質の本質的特性は、タンパク質の溶解性において重要な役割を果たす。表面疎水性に起因して治療用タンパク質の溶解度が低いことにより、製剤開発がより困難になることが示されており、不十分な生体内分布、望ましくない薬物動態挙動およびｉｎ ｖｉｖｏでの免疫原性がもたらされる場合がある。候補のモノクローナル抗体の全体的な表面疎水性を低下させることによって、精製および投与レジメンに関連する利益およびコスト削減ももたらされ得る。個々のアミノ酸は、構造解析によって抗体の凝集能に寄与するものとして同定することができ、ＣＤＲおよびフレームワーク領域に位置し得る。特に、残基は、所与の抗体において疎水性の問題を引き起こすリスクが高いことが予測され得る。一実施形態では、本開示は、ＣＤ３に特異的に結合する能力を有するＡＦ１であって、親抗体または抗体断片に対して、フレームワーク領域において疎水性アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、疎水性アミノ酸が、イソロイシン、ロイシンまたはメチオニンである、ＡＦ１を提供する。一部の実施形態では、ＣＤ３ ＡＦ１は、１つまたは複数のフレームワーク領域において疎水性アミノ酸の少なくとも２つのアミノ酸置換を有し、疎水性アミノ酸は、イソロイシン、ロイシンまたはメチオニンである。
等電点（ｐＩ）は、抗体または抗体断片が正味の電荷を有さないｐＨである。ｐＨが抗体または抗体断片のｐＩより低い場合、正味の正電荷を有することになる。正電荷がより大きくなることは、血液クリアランスおよび組織での保持の増加、ならびに一般的には半減期がより短くなることと相関する傾向がある。ｐＨが抗体または抗体断片のｐＩより高い場合、負電荷を有することになる。負電荷は、一般的に、組織取込みの低下およびより長い半減期をもたらす。フレームワーク残基に対する突然変異によりこの電荷を操作することができる。これらの考察を、出発点として利用される親抗体に対して個々のアミノ酸置換がなされた、本明細書に記載の実施形態のＡＦ１の配列の設計に反映させた。ポリペプチドの等電点は、数学的に（例えば、計算によって）またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて実験的に決定することができる。等電点（ｐＩ）はタンパク質が正味電荷ゼロを有するｐＨであり、タンパク質配列中の特定のアミノ酸に関する電荷を使用して計算することができる。電荷の推定値は、酸解離定数またはｐＫａ値と呼ばれ、ｐＩを計算するために使用される。ｐＩは、毛管等電点電気泳動（Ｄａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｏｆ ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ， ｔａｒｇｅｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ａｎｄ ＦｃＲｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． ｍＡｂｓ ７：１０８４ （２０１５）；Ｌｉ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ． Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｃａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｈａｒｇｅ． ｍＡｂｓ ６， １２５５－１２６４ （２０１４）を参照されたい）などの方法または当技術分野で公知の他の方法によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで決定することができる。一部の実施形態では、ＡＦ１およびＡＦ２の等電点は、互いに特定範囲内にあるように設計され、それによって安定性が促進される。
一実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチド実施形態のうちのいずれかにおいて使用するための抗原結合断片（例えば、ＡＦ１またはＡＦ２）であって、ＣＤＲ－ＬおよびＣＤＲ－Ｈを含み（表６ｂを参照されたい）、（ａ）分化抗原群３Ｔ細胞受容体（ＣＤ３）に特異的に結合し、（ｂ）それぞれ配列番号８、９、および１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む、抗原結合断片（例えば、ＡＦ１またはＡＦ２）を提供する。一部の実施形態では、抗原結合断片（ＡＦ）のＣＤＲ－Ｈ１およびＣＤＲ－Ｈ２は、それぞれ配列番号８および９のアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチド実施形態のうちのいずれかにおいて使用するための抗原結合断片（例えば、ＡＦ１またはＡＦ２）であって、ＣＤＲ－ＬおよびＣＤＲ－Ｈを含み、（ａ）分化抗原群３Ｔ細胞受容体（ＣＤ３）に特異的に結合し、（ｂ）それぞれ配列番号８、９、および１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む、抗原結合断片（例えば、ＡＦ１またはＡＦ２）を提供する。抗原結合断片（例えば、ＡＦ１またはＡＦ２）は、ＣＤＲ－Ｌを含んでもよく、ＣＤＲ－Ｌは、配列番号１または２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４または５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ３を含む。ペプチドがＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含む抗原結合断片（ＡＦ）（例えば、ＡＦ１またはＡＦ２）を含む一部の実施形態では、ＡＦのＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号１または２のアミノ酸配列を含んでもよく、ＡＦのＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号４または５のアミノ酸配列を含んでもよく、ＡＦの前記ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６のアミノ酸配列を含んでもよい。ペプチドがＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含む抗原結合断片（ＡＦ）（例えば、ＡＦ１またはＡＦ２）を含む一部の実施形態では、ＡＦのＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよく、ＡＦのＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号４または５のアミノ酸配列を含んでもよく、ＡＦの前記ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６のアミノ酸配列を含んでもよい。ペプチドがＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含む抗原結合断片（ＡＦ）（例えば、ＡＦ１またはＡＦ２）を含む一部の実施形態では、ＡＦのＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２のアミノ酸配列を含んでもよく、ＡＦのＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号４または５のアミノ酸配列を含んでもよく、ＡＦの前記ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６のアミノ酸配列を含んでもよい。ペプチドがＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含む抗原結合断片（ＡＦ）（例えば、ＡＦ１またはＡＦ２）を含む一部の実施形態では、ＡＦのＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよく、ＡＦのＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号４のアミノ酸配列を含んでもよく、ＡＦの前記ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６のアミノ酸配列を含んでもよい。ペプチドがＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含む抗原結合断片（ＡＦ）（例えば、ＡＦ１またはＡＦ２）を含む一部の実施形態では、ＡＦのＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２のアミノ酸配列を含んでもよく、ＡＦのＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号５のアミノ酸配列を含んでもよく、ＡＦの前記ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６のアミノ酸配列を含んでもよい。
一部の実施形態では、直前の段落の前述の抗原結合断片（ＡＦ）（例えば、ＡＦ１またはＡＦ２）の実施形態は、軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ－Ｌ）および重鎖フレームワーク領域（ＦＲ－Ｈ）をさらに含み（表６ｃを参照されたい）、抗原結合断片（ＡＦ）は、配列番号５１のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ１、配列番号５２のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ２、配列番号５３～５６のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ３、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ４を含んでもよい。抗原結合断片（ＡＦ）は、配列番号５１のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ１、配列番号５２のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ２、配列番号５３のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ３、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ４を含んでもよい。抗原結合断片（ＡＦ）は、配列番号５１のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ１、配列番号５２のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ２、配列番号５４のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ３、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ４を含んでもよい。抗原結合断片（ＡＦ）は、配列番号５１のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ１、配列番号５２のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ２、配列番号５５のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ３、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ４を含んでもよい。抗原結合断片（ＡＦ）は、配列番号５１のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ１、配列番号５２のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ２、配列番号５６のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ３、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ４を含んでもよい。抗原結合断片（ＡＦ）は、配列番号６０～６３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ１、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ２、配列番号６５または６６のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ３、および配列番号６７のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ４を含んでもよい。抗原結合断片（ＡＦ）は、配列番号６０のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ１、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ２、配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ３、および配列番号６７のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ４を含んでもよい。抗原結合断片（ＡＦ）は、配列番号６１のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ１、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ２、配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ３、配列番号６７のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ４を含んでもよい。本明細書に記載のポリペプチド実施形態のうちのいずれかにおいて使用するための抗原結合断片（ＡＦ）（例えば、ＡＦ１またはＡＦ２）は、軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ－Ｌ）および重鎖フレームワーク領域（ＦＲ－Ｈ）を含んでもよく、ＡＦは、配列番号５１のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ１、配列番号５２のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ２、配列番号５３～５６のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ３、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ４、配列番号６０または６１のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ１、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ２、配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ３、および配列番号６７のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ４を含んでもよい。ＡＦは、配列番号５１のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ１、配列番号５２のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ２、配列番号５３のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ３、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ４、配列番号６０のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ１、配列番号６４のア

ミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ２、配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ３、および配列番号６７のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ４を含んでもよい。ＡＦは、配列番号５１のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ１、配列番号５２のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ２、配列番号５４のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ３、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ４、配列番号６１のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ１、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ２、配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ３、および配列番号６７のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ４を含んでもよい。ＡＦは、配列番号５１のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ１、配列番号５２のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ２、配列番号５５のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ３、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ４、配列番号６１のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ１、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ２、配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ３、および配列番号６７のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ４を含んでもよい。ＡＦは、配列番号５１のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ１、配列番号５２のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ２、配列番号５６のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ３、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｌ４、配列番号６１のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ１、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ２、配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ３、および配列番号６７のアミノ酸配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示すかまたはそれと同一であるＦＲ－Ｈ４を含んでもよい。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチド実施形態のうちのいずれかにおいて使用するための抗原結合断片（ＡＦ）（例えば、ＡＦ１またはＡＦ２）であって、表６ｄの配列番号１０２または配列番号１０５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するかまたはそれと同一である可変重鎖（ＶＨ）アミノ酸配列を含む、ＡＦを提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチド実施形態のうちのいずれかにおいて使用するためのＡＦであって、表６ｄの配列番号１０１、１０３、１０４、１０６、または１０７のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するかまたはそれと同一である可変軽鎖（ＶＬ）アミノ酸配列を含む、ＡＦを提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチド実施形態のうちのいずれかにおいて使用するための抗原結合断片（例えば、ＡＦ１またはＡＦ２）であって、表６ｅの配列番号２０１～２０５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するかまたはそれと同一であるアミノ酸配列を含んでもよい、ＡＦを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、当技術分野で公知のＣＤ３結合抗体または抗原結合断片と比較して、安定性が増強されたＣＤ３タンパク質複合体に結合する抗原結合断片（例えば、ＡＦ１またはＡＦ２）を提供する。さらに、本開示のＣＤ３抗原結合断片は、それらが統合されるキメラ二重特異性抗原結合断片組成物により程度の高い安定性を付与するように設計され、融合タンパク質の発現および回収の改善、貯蔵寿命の増加および対象に投与された場合の安定性の増強をもたらす。１つのアプローチにおいて、本開示のＣＤ３ ＡＦは、当技術分野で公知のある特定のＣＤ３結合抗体および抗原結合断片と比較して、より程度の高い熱安定性を有するように設計される。結果として、それらが統合されるキメラ二重特異性抗原結合断片組成物の構成成分として利用されるＣＤ３ ＡＦは、高い熱安定性および低い凝集傾向を含む好ましい医薬特性を示し、結果として、製造および保存中の発現および回収の改善をもたらし、さらに血清半減期の延長を促進する。熱安定性などの生物物理学的特性は、それらの本質的特性がおおいに異なる抗体可変ドメインによって限定されることが多い。高い熱安定性は、高い発現レベルおよび凝集しにくいことを含む他の望ましい特性と関連することが多い（Ｂｕｃｈａｎａｎ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＩｇＧ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｏ ａｄｄｒｅｓｓ ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｔｉｏｎ， ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． ＭＡｂｓ ２０１３； ５：２５５）。熱安定性は、分子の半分が変性する温度として定義される「融解温度」（Ｔｍ）を測定することによって決定される。各ヘテロダイマーの融解温度はその熱安定性を示している。Ｔｍを決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、以下の実施例において記載された方法を含み、当技術分野で公知である。ヘテロダイマーの融点は、示差走査熱量測定（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ （２００３） Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２０：１９５２－６０；Ｇｈｉｒｌａｎｄｏ ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６８：４７－５２）などの技法を使用して測定することができる。あるいは、ヘテロダイマーの熱安定性は、円二色性を使用して（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｓｃｉ ４０：３４３－９）、または以下の実施例に記載されたように測定することができる。
本開示のポリペプチドの一部の実施形態では、抗原結合断片（例えば、ＡＦ１またはＡＦ２）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、第１の抗原結合断片の、抗ＣＤ３結合断片の融解温度（Ｔｍ）と比べて高い融解温度、または第１の抗原結合断片を試験二重特異性抗原結合構築物に組み込んだときの、試験二重特異性抗原結合構築物の、対照の二重特異性抗原結合構築物のＴｍと比較して高いＴｍによって明らかなように、配列番号２０６（表６ｅを参照されたい）の配列からなる抗ＣＤ３結合断片より高い熱安定性を示す可能性があり、試験二重特異性抗原結合構築物は、第１の抗原結合断片と、ＣＤ３以外の抗原に結合する参照抗原結合断片を含み、対照の二重特異性抗原結合構築物は、配列番号２０６（表６ｅを参照されたい）の配列からなる抗ＣＤ３結合断片と、参照抗原結合断片からなる。第１の抗原結合断片の融解温度（Ｔｍ）は、配列番号２０６（表６ｅを参照されたい）の配列からなる抗ＣＤ３結合断片のＴｍより少なくとも２℃高い、少なくとも３℃高い、または少なくとも４℃高い、または少なくとも５℃高い可能性がある。
本開示のＣＤ３結合断片および抗ＣＤ３結合断片を含む抗ＣＤ３二重特異性抗体および参照結合の熱変性曲線は、本開示の構築物が、配列番号７８１（表６ｆを参照されたい）に示されている配列からなる抗原結合断片または対照二重特異性抗体より熱変性に対する抵抗性が高いことを示しており、対照二重特異性抗原結合断片は、配列番号７８１（表６ｆを参照されたい）および本明細書に記載のＨＥＲ２実施形態に結合する参照抗原結合断片を含む。一実施形態では、本明細書に記載の対象組成物の実施形態のうちのいずれかのポリペプチドは、本明細書に記載の実施形態の抗ＣＤ３ ＡＦを含み、ＡＦのＴｍは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて融解温度の増加によって決定された場合、配列番号７８１（表６ｆを参照されたい）の配列からなる抗原結合断片のＴｍより少なくとも２℃高い、または少なくとも３℃高い、または少なくとも４℃高い、または少なくとも５℃高い、または少なくとも６℃高い、または少なくとも７℃高い、または少なくとも８℃高い、または少なくとも９℃高い、または少なくとも１０℃高い。
一部の実施形態では、本明細書に記載の対象組成物の実施形態のうちのいずれかのポリペプチドは、ヒトまたはカニクイザル（ｃｙｎｏ）のＣＤ３に特異的に結合する抗原結合断片（ＡＦ）を含む。抗原結合断片（ＡＦ）は、ヒトＣＤ３に特異的に結合することができる。抗原結合断片（ＡＦ）は、ＣＤ３のＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３ゼータユニットとして本明細書において同定されたＣＤ３複合体サブユニットに結合することができる。抗原結合断片（ＡＦ）は、ＣＤ３のＣＤ３イプシロン断片に結合することができる。抗原結合断片（ＡＦ）は、ヒトまたはｃｙｎｏのＣＤ３抗原を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原結合アッセイで決定して、約１０ｎＭから約４００ｎＭの間、または約５０ｎＭから約３５０ｎＭの間、または約１００ｎＭから３００ｎＭの間の解離定数（Ｋｄ）定数でヒトまたはｃｙｎｏのＣＤ３に特異的に結合することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の対象組成物の実施形態のうちのいずれかのポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原結合アッセイで決定して、約１０ｎＭ、もしくは約５０ｎＭ、もしくは約１００ｎＭ、もしくは約１５０ｎＭ、もしくは約２００ｎＭ、もしくは約２５０ｎＭ、もしくは約３００ｎＭ、もしくは約３５０ｎＭより弱いか、または約４００ｎＭより弱い解離定数（Ｋｄ）でヒトまたはｃｙｎｏのＣＤ３に特異的に結合する抗原結合断片（ＡＦ）を含む。明確性のために、４００のＫｄを有する抗原結合断片（ＡＦ）は１０ｎＭのＫｄを有するものよりより弱くそのリガンドに結合する。一部の実施形態では、本明細書に記載の対象組成物の実施形態のうちのいずれかのポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原結合アッセイにおいて各解離定数（Ｋｄ）により決定して、配列番号７８１（表６ｆを参照されたい）のアミノ酸配列からなる抗原結合断片より２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１以下、または１０分の１以下の弱い結合親和性でヒトまたはｃｙｎｏのＣＤ３に特異的に結合する抗原結合断片（ＡＦ）を含む。一部の実施形態では、本開示は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原結合アッセイにおいて各解離定数（Ｋｄ）により決定して、対象ポリペプチドに組み込まれる本明細書に記載の抗ＨＥＲ２ ＡＦ実施形態のものに対して２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、２０分の１、５０分の１、１００分の１以下、または１０００分の１以下の弱いＣＤ３に対する結合親和性を示す抗原結合断片（ＡＦ）（抗ＣＤ３ ＡＦ）を含む二重特異性ポリペプチドを提供する。標的リガンドに対する対象組成物の結合親和性は、米国特許第５，５３４，６１７号に記載されたチップが結合した受容体もしくは結合タンパク質を用いるＢｉａｃｏｒｅアッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイ、本明細書の実施例に記載されたアッセイ、放射性受容体アッセイ、または当技術分野で公知の他のアッセイなどの結合アッセイまたは競合アッセイを使用してアッセイすることができる。次いで、結合親和性定数は、ｖａｎ Ｚｏｅｌｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９９８） １９）１２）：４８７に記載されたＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などの標準的な方法、または当技術分野で公知の他の方法を使用して決定することができる。
関連する態様では、本開示は、ＣＤ３に結合し（抗ＣＤ３ ＡＦ）、かつ当技術分野で公知のＣＤ３に結合する抗体または抗原結合断片を含む対応する組成物と比較して増強された安定性を本開示の組成物に付与する等電点（ｐＩ）を有するように設計されているキメラの二重特異性ポリペプチド組成物に組み込まれる抗原結合断片（ＡＦ）を提供する。一実施形態では、本明細書に記載の対象組成物の実施形態のうちのいずれかのポリペプチドは、ＣＤ３に結合するＡＦ（抗ＣＤ３ ＡＦ）を含み、抗ＣＤ３ ＡＦは、両端を含めて６．０～６．６の間であるｐＩを示す。一部の実施形態では、本明細書に記載の対象組成物の実施形態のうちのいずれかのポリペプチドは、ＣＤ３に結合するＡＦ（抗ＣＤ３ ＡＦ）を含み、抗ＣＤ３ ＡＦは、参照抗原結合断片（例えば、配列番号２０６（表６ｅを参照されたい）に示されている配列からなる）のｐＩより少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０ｐＨ単位低いｐＩを示す。一部の実施形態では、本明細書に記載の対象組成物の実施形態のうちのいずれかのポリペプチドは、ＨＥＲ２抗原に結合する別のＡＦ（抗ＨＥＲ２ ＡＦ）に融合したＣＤ３に結合するＡＦ（抗ＣＤ３ ＡＦ）を含み、抗ＣＤ３ ＡＦは、ＨＥＲ２抗原またはそのエピトープに結合するＡＦのｐＩの少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、または１．５ｐＨ単位以内のｐＩを示す。一部の実施形態では、本明細書に記載の対象組成物の実施形態のうちのいずれかのポリペプチドは、ＨＥＲ２抗原に結合するＡＦ（抗ＨＥＲ２ ＡＦ）に融合したＣＤ３に結合するＡＦ（抗ＣＤ３ ＡＦ）を含み、ＡＦは、抗ＣＤ３ ＡＦのｐＩの少なくとも約０．１～約１．５、または少なくとも約０．３～約１．２、または少なくとも約０．５～約１．０、または少なくとも約０．７～約０．９ｐＨ単位以内のｐＩを示す。２つの抗原結合断片のｐＩがこのような範囲内にあるこのような設計によって、得られる融合した抗原結合断片は、それらが組み込まれるキメラ二重特異性抗原結合断片組成物に高い度合の安定性を付与し、可溶性の非凝集形態の融合タンパク質の発現の改善および回収の増強、製剤化されたキメラ二重特異性ポリペプチド組成物の貯蔵寿命の増加、ならびに組成物が対象に投与された場合の安定性の増強をもたらすことになることが特に意図される。別の言い方をすれば、２つのＡＦ（抗ＣＤ３ ＡＦおよび抗ＨＥＲ２ ＡＦ）を比較的狭いｐＩ範囲内に有することは、ＡＦ（抗ＣＤ３ ＡＦおよび抗ＨＥＲ２ ＡＦ）の両方が安定である緩衝液または他の溶液の選択を可能にし、それによって組成物の全体的安定性を促進する可能性がある。抗原結合断片（ＡＦ）は、６．６未満であるかそれに等しい等電点（ｐＩ）を示し得る。抗原結合断片（ＡＦ）は、両端を含めて６．０～６．６の間である等電点（ｐＩ）を示し得る。抗原結合断片（ＡＦ）は、配列番号２０６（表６ｅを参照されたい）に示されている配列からなる参照抗原結合断片の等電点（ｐＩ）より少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０ｐＨ単位低いｐＩを示し得る。抗原結合断片（ＡＦ）は、約１０ｎＭから約４００ｎＭの間の解離定数（Ｋｄ）定数で（例えば、ヒトまたはｃｙｎｏのＣＤ３抗原を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原結合アッセイで決定して）、ヒトまたはｃｙｎｏのＣＤ３に特異的に結合することができる。抗原結合断片（ＡＦ）は、約１０ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満、または約１００ｎＭ未満、または約１５０ｎＭ未満、または約２００ｎＭ未満、または約２５０ｎＭ未満、または約３００ｎＭ未満、または約３５０ｎＭ未満、または約４００ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）で（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原結合アッセイにおいて決定される）、ヒトまたはｃｙｎｏのＣＤ３に特異的に結合することができる。抗原結合断片（ＡＦ）は、配列番号２０６（表６ｅを参照されたい）のアミノ酸配列からなる抗原結合断片のものに対して２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１以下、または１０分の１以下の弱いＣＤ３に対する結合親和性を示し得る（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原結合アッセイにおける各解離定数（Ｋｄ）により決定される）。
ある特定の実施形態では、抗原結合断片のＶＬおよびＶＨは、一緒に接合した場合に可撓性の特徴を有する２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５の親水性アミノ酸からなる比較的長いリンカーにより融合されている。一実施形態では、本明細書に記載のｓｃＦｖ実施形態のうちのいずれかのＶＬおよびＶＨは、配列ＧＳＧＥＧＳＥＧＥＧＧＧＥＧＳＥＧＥＧＳＧＥＧＧＥＧＥＧＳＧ（配列番号８２）、ＴＧＳＧＥＧＳＥＧＥＧＧＧＥＧＳＥＧＥＧＳＧＥＧＧＥＧＥＧＳＧＴ（配列番号８３）、ＧＡＴＰＰＥＴＧＡＥＴＥＳＰＧＥＴＴＧＧＳＡＥＳＥＰＰＧＥＧ（配列番号８４）、またはＧＳＡＡＰＴＡＧＴＴＰＳＡＳＰＡＰＰＴＧＧＳＳＡＡＧＳＰＳＴ（配列番号８５）を有する親水性アミノ酸の比較的長いリンカーにより連結されている。一部の実施形態では、ＡＦ１とＡＦ２は、３、４、５、６、または７のアミノ酸を有する親水性アミノ酸の短いリンカーにより一緒に連結されている。一実施形態では、短いリンカー配列は、配列ＳＧＧＧＧＳ（配列番号８６）、ＧＧＧＧＳ（配列番号８７）、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号８８）、ＧＧＳ、またはＧＳＰとして本明細書において同定されている。一部の実施形態では、本開示は、一本鎖ダイアボディを含む組成物であって、フォールディング後に、第１のドメイン（ＶＬまたはＶＨ）が最後のドメイン（ＶＨまたはＶＬ）と対合して一方のｓｃＦｖを形成し、真中の２つのドメインが対合して他方のｓｃＦｖを形成し、ここで、第１のドメインと第２のドメイン、および第３のドメインと最後のドメインは、前述の短いリンカーのうちの１つにより一緒に融合されており、第２の可変ドメインと第３の可変ドメインは、前述の比較的長いリンカーのうちの１つにより融合されている、組成物を提供する。当業者によって認識されるように、短いリンカーと比較的長いリンカーの選択は、隣接する可変ドメインが誤って対合するのを防止し、それによって、第１の抗原結合断片および第２の抗原結合断片のＶＬおよびＶＨを含む一本鎖ダイアボディ立体配置の形成を促進するためである。
表６ｂ． 例示的なＣＤ３ ＣＤＲ配列
Figure 2023531494000025
 表６ｃ． 例示的なＣＤ３ ＦＲ配列
Figure 2023531494000026
Figure 2023531494000027
 表６ｄ： 例示的なＣＤ３ ＶＬおよびＶＨ配列
Figure 2023531494000028
 表６ｅ： 例示的なＣＤ３ ｓｃＦｖ配列
Figure 2023531494000029
Figure 2023531494000030
Figure 2023531494000031
抗ＨＥＲ２結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＨＥＲ－２に対する結合親和性を有する第１の部分結合ドメインおよびＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＨＥＲ－２に対するモノクローナル抗体由来のＶＬおよびＶＨを含む。ＨＥＲ－２に対するモノクローナル抗体は当技術分野で公知である。ＶＬおよびＶＨ配列の例示的な非限定的な例は、表６ｆに示されている。一実施形態では、本発明は、表６ｆに記載の抗ＨＥＲ－２ ＶＬおよびＶＨ配列を含む腫瘍特異的マーカーＨＥＲ－２に対する結合親和性を有する第１の部分結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＣＤＲ－Ｌ１領域、ＣＤＲ－Ｌ２領域、ＣＤＲ－Ｌ３領域、ＣＤＲ－Ｈ１領域、ＣＤＲ－Ｈ２領域、およびＣＤＲ－Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物であって、それぞれが、表６ｆに記載の各ＶＬおよびＶＨ配列に由来する、組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイで決定して、１０－１０より大きく１０－７ＭまでのＫｄ値を有する。ポリペプチドがＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合断片（抗ＨＥＲ２ ＡＦ）を含む一部の実施形態では、抗ＨＥＲ２ ＡＦ（例えば、ＡＦ１またはＡＦ２）は、（１）表６ｆの配列番号７７８～７８３として示されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＩ）、および（２）表６ｆの配列番号８７８～８８３として示されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＩ）を含んでもよい。キメラポリペプチドアセンブリー組成物が、前述の結合ドメインまたはその配列バリアント（バリアントが記載の抗原に対する結合特異性を示す限り）のうちのいずれか１つを含んでもよいことが特に企図される。一実施形態では、配列バリアントは、ＶＬまたはＶＨ配列のアミノ酸の異なるアミノ酸による置換によって作成されることになる。欠失バリアントでは、本明細書に記載されているＶＬまたはＶＨ配列における１つまたは複数のアミノ酸残基が除去されている。したがって、欠失バリアントは、結合ドメインポリペプチド配列のすべての断片を含む。置換バリアントでは、ＶＬまたはＶＨ（またはＣＤＲ）ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基が除去され、代替の残基で置き換えられている。一態様では、置換は本質的に保存的であり、このタイプの保存的置換は当技術分野で周知である。さらに、本明細書で開示される第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを含む組成物は、本明細書で開示される方法のうちのいずれかにおいて利用することができることが特に企図される。
表６ｆ． 抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体および配列
Figure 2023531494000032
Figure 2023531494000033
 ＊ 下線および太字の配列は、存在する場合、ＶＬおよびＶＨ内のＣＤＲである
表Ａ： 分子内の長いリンカー
Figure 2023531494000034
 表Ｂ： 分子内の短いリンカー
Figure 2023531494000035
本開示のポリペプチドの一部の実施形態では、抗原結合断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）のペアは、リンカー、または長いリンカー（例えば、親水性アミノ酸からなる）により連結されていてもよい。抗原結合断片（例えば、第１の抗原結合断片（ＡＦ１）、第２の抗原結合断片（ＡＦ２））の軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）を連結するこのようなリンカーは（各々独立して）、表Ａに記載の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。抗原結合断片（例えば、第１の抗原結合断片（ＡＦ１）、第２の抗原結合断片（ＡＦ２））の軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）を連結するこのようなリンカーは（各々独立して）、表Ａに記載の配列と同一なアミノ酸配列を含んでもよい。本開示のポリペプチドの一部の実施形態では、２つの抗原結合断片（例えば、第１および第２の抗原結合断片）はペプチドリンカー、または短いリンカーにより一緒に融合されていてもよい。２つの抗原結合断片（例えば、第１および第２の抗原結合断片）を連結するこのようなペプチドリンカーは、表Ｂに記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。２つの抗原結合断片（例えば、第１および第２の抗原結合断片）を連結するこのようなペプチドリンカーは、表Ｂに記載の配列と同一なアミノ酸配列を含んでもよい。一部の場合には、第１の抗原結合断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。一部の場合には、第２の抗原結合断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。第１および第２の抗原結合断片の２つの一本鎖可変断片は、ペプチドリンカーにより一緒に連結されていてもよい。本開示のポリペプチドの一部の実施形態では、第１の抗原結合断片のＶＬとＶＨを連結するために使用されるリンカーまたは／および第２の抗原結合断片のＶＬとＶＨを連結するために使用されるリンカーは、表ＡのＬ７であってもよい。このような実施形態では、２つの抗原結合断片を連結するために使用されるペプチドリンカーは、表ＢのＳ－１またはＳ－２であってもよい。一部の実施形態では、本開示は、一本鎖ダイアボディを含むポリペプチドであって、フォールディング後に、第１のドメイン（ＶＬまたはＶＨ）が最後のドメイン（ＶＨまたはＶＬ）と対合して一方のｓｃＦｖを形成し、真中の２つのドメインが対合して他方のｓｃＦｖを形成し、ここで、第１のドメインと第２のドメイン、および第３のドメインと最後のドメインは、表Ｂに記載の配列によって本明細書において同定された親水性アミノ酸の短いリンカーにより一緒に融合されており、第２の可変ドメインと第３の可変ドメインは、表Ａにおいて同定された長いリンカーにより融合されている、ポリペプチドを提供する。当業者によって認識されるように、短いリンカーと長いリンカーの選択は、隣接する可変ドメインが誤って対合するのを防止し、それによって、第１の結合部分および第２の結合部分のＶＬおよびＶＨを含む一本鎖ダイアボディ立体配置の形成を促進するためである。
表Ｃ： 放出セグメントと二重特異性抗体構築物の間の例示的なスペーサー
Figure 2023531494000036
Figure 2023531494000037
本開示のポリペプチドの一部の実施形態では、放出セグメント（ＲＳ）（例えば、第１の放出セグメント（ＲＳ１）、第２の放出セグメント（ＲＳ２）など）は、二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）にスペーサーにより融合されてもよい。このようなスペーサーは（各々独立して）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）である少なくとも４種のアミノ酸を含む。本開示のペプチドは、二重特異性抗体構築物に第１のスペーサーにより融合した第１の放出セグメントおよび二重特異性抗体構築物に第２のスペーサーにより融合した第２の放出セグメントを含んでもよい。スペーサー（例えば、第１のスペーサー、第２のスペーサーなど）は（各々独立して）、表Ｃに記載の配列に対して少なくとも（約）８０％、少なくとも（約）９０％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。スペーサー（例えば、第１のスペーサー、第２のスペーサーなど）は（各々独立して）、表Ｃに記載の配列と同一なアミノ酸配列を含む。
非構造化立体構造
典型的には、融合タンパク質のＸＴＥＮ構成成分は、ポリマーの長さが延長されているにもかかわらず、生理条件下で変性したペプチド配列と同様に挙動するよう設計されている。変性したとは、ペプチド骨格の大きな立体構造の自由度によって特徴付けられる、溶液中のペプチドの状態を記載するものである。ほとんどのペプチドおよびタンパク質は、高濃度の変性剤の存在下または高温で変性した立体構造をとる。変性した立体構造のペプチドは、例えば、特徴的な円二色性（ＣＤ）スペクトルを有し、ＮＭＲによって決定される場合、ロングレンジ相互作用がないことによって特徴付けられる。「変性立体構造」および「非構造化立体構造」は、本明細書において同義的に使用される。一部の場合には、本発明は、生理条件下で、二次構造を大きく欠く変性配列に類似し得るＸＴＥＮ配列を提供する。他の場合には、ＸＴＥＮ配列は、生理条件下で、二次構造を実質的に欠く場合がある。「大きく欠く」とは、この文脈において使用される場合、本明細書に記載の手段によって測定または決定される場合、ＸＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基の５０％未満しか二次構造に寄与していないことを意味する。「実質的に欠く」とは、この文脈において使用される場合、本明細書に記載の手段によって測定または決定される場合、ＸＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基の少なくとも約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または少なくとも約９９％が二次構造に寄与していないことを意味する。
所与のポリペプチドにおける二次構造および三次構造の存在または非存在を識別するために、種々の方法が当技術分野において確立されている。特に、ＸＴＥＮ二次構造は、分光光度的に、例えば、「遠ＵＶ」スペクトルの領域（１９０～２５０ｎｍ）での円二色性分光法によって測定することができる。アルファヘリックスおよびベータシートなどの二次構造エレメントは、それぞれ、形状および大きさが特徴的なＣＤスペクトルを生じさせる。二次構造は、ポリペプチド配列に関して、例えば、米国特許出願公開第２００３０２２８３０９Ａ１号に記載されているように、ある特定のコンピュータープログラムまたはアルゴリズム、例えば、周知のＣｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ， Ｐ． Ｙ．， ｅｔ ａｌ． （１９７４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １３： ２２２－４５）およびＧａｒｎｉｅｒ－Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ－Ｒｏｂｓｏｎ（「ＧＯＲ」）アルゴリズム（Ｇａｒｎｉｅｒ Ｊ， Ｇｉｂｒａｔ ＪＦ， Ｒｏｂｓｏｎ Ｂ． （１９９６）， ＧＯＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６６：５４０－５５３）を介して予測することもできる。所与の配列について、アルゴリズムにより、いくつかの二次構造が存在するかまたは二次構造が全く存在しないかを予測することができ、例えば、アルファヘリックスもしくはベータシートを形成する配列の残基の総計および／もしくはパーセンテージ、またはランダムコイル形成（二次構造が欠如している）が生じることが予測される配列の残基のパーセンテージとして表される。
一部の場合には、本発明の融合タンパク質組成物において使用されるＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定される場合、０％～約５％未満の範囲のアルファヘリックスのパーセンテージを有し得る。他の場合には、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定される場合、０％～約５％未満の範囲のベータシートのパーセンテージを有し得る。一部の場合には、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定される場合、０％～約５％未満の範囲のアルファヘリックスのパーセンテージおよび０％～約５％未満の範囲のベータシートのパーセンテージを有し得る。好ましい実施形態では、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、約２％未満のアルファヘリックスのパーセンテージおよび約２％未満のベータシートのパーセンテージを有することになる。他の場合には、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定される場合、高い度合のランダムコイルのパーセンテージを有し得る。一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定される場合、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、より好ましくは少なくとも約９２％、より好ましくは少なくとも約９３％、より好ましくは少なくとも約９４％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、およびもっとも好ましくは少なくとも約９９％のランダムコイルを有し得る。
正味電荷
他の場合には、ＸＴＥＮポリペプチドは、ＸＴＥＮ配列において、正味の電荷を有するアミノ酸残基を組み込むこと、および／または疎水性アミノ酸の割合を低下させることによって付与される非構造化特徴を有し得る。全体的な正味電荷および正味電荷密度は、ＸＴＥＮ配列における荷電アミノ酸の含有量を改変することによって制御することができる。一部の場合には、組成物のＸＴＥＮの正味電荷密度は、＋０．１電荷／残基を上回っていても－０．１電荷／残基を下回っていてもよい。他の場合には、ＸＴＥＮの正味電荷は、約０％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、または約２０％またはそれより高い割合であってもよい。
ヒトまたは動物のほとんどの組織および表面は正味の負電荷を有するため、ＸＴＥＮ配列は正味の負電荷を有するように設計され、ＸＴＥＮ含有組成物と血管、健康な組織、または様々な受容体などの様々な表面の間の非特異的相互作用を最小限にすることができる。特定の理論に拘束される訳ではないが、ＸＴＥＮは、個々に高い正味の負電荷を有し、ＸＴＥＮポリペプチドの配列にわたって分布されるＸＴＥＮポリペプチドの個々のアミノ酸間の静電反発により、開いた立体構造をとることができる。配列の長さが伸長したＸＴＥＮにおける正味の負電荷のこのような分布により、非構造化立体構造が導かれ、次に、流体力学的半径が有効に増大し得る。したがって、一実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮ配列がグルタミン酸を約８、１０、１５、２０、２５、またはさらには約３０％含有するＸＴＥＮを提供する。本発明の組成物のＸＴＥＮは一般に、正に荷電したアミノ酸を有さないかまたは低い含有量で有する。一部の場合には、ＸＴＥＮは、正電荷を有する約１０％未満のアミノ酸残基、または正電荷を有する約７％未満、もしくは約５％未満、もしくは約２％未満のアミノ酸残基を有してもよい。しかし、本発明は、リシンなどの正電荷を有する限られた数のアミノ酸をＸＴＥＮに組み込み、リシンのイプシロンアミンと、ペプチド上の反応性基、リンカー架橋、またはＸＴＥＮ主鎖にコンジュゲートされる薬剤もしくは小分子上の反応性基との間のコンジュゲーションを可能にし得る構築物を企図する。前述のように、ＸＴＥＮと、生物学的に活性なタンパク質と、代謝性疾患または障害の処置において有用な化学療法剤とを含む融合タンパク質を構築することができ、ここで、ＸＴＥＮ構成成分中に組み込まれた薬剤の分子の最大数は、リシンまたはＸＴＥＮ中に組み込まれた反応性側鎖を有する他のアミノ酸（例えば、システイン）の数によって決定される。
一部の場合には、ＸＴＥＮ配列は、セリンまたはグリシンなどの他の残基によって分離された荷電残基を含んでもよく、これらはより良好な発現または精製挙動をもたらす可能性がある。正味電荷に基づき、対象組成物のＸＴＥＮは、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、またはさらには６．５の等電点（ｐＩ）を有してもよい。好ましい実施形態では、ＸＴＥＮは、１．５から４．５の間の等電点を有することになる。これらの実施形態では、本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物中に組み込まれたＸＴＥＮは、非構造化立体構造および哺乳動物のタンパク質および組織へのＸＴＥＮ構成成分の結合の低下に寄与し得る生理条件下で正味の負電荷を有することになる。
疎水性アミノ酸によりポリペプチドに対する構造が付与され得るため、本発明は、典型的には、５％未満、または２％未満、または１％未満の疎水性アミノ酸含有量になるＸＴＥＮ内の疎水性アミノ酸の含有量を提供する。一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ構成成分内のメチオニンおよびトリプトファンのアミノ酸含有量は、典型的には、５％未満、または２％未満、最も好ましくは１％未満である。一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、正電荷を有する１０％未満のアミノ酸残基、または正電荷を有する約７％未満、もしくは約５％未満、もしくは約２％未満のアミノ酸残基を有する配列を有し、メチオニン残基とトリプトファン残基の合計は、２％未満となり、アスパラギン残基とグルタミン残基の合計は、全ＸＴＥＮ配列の１０％未満となる。
流体力学的半径の増加
一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、高い流体力学的半径を有し、対応する増加した見かけの分子量を、ＸＴＥＮが組み込まれたＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に付与することができる。ＸＴＥＮをＢＰ配列と連結することにより、ＸＴＥＮと連結していないＢＰと比較して流体力学的半径の増大、見かけの分子量の増大、および見かけの分子量係数の増大を有し得るＢＰＸＴＥＮ組成物がもたらされ得る。例えば、半減期の延長が望まれる治療適用では、１つまたは複数のＢＰを含む融合タンパク質に流体力学的半径が大きいＸＴＥＮを組み込んだ組成物は、組成物の流体力学的半径を、およそ３～５ｎｍの糸球体の孔径を越えて有効に拡大し（約７０ｋＤａの見かけの分子量に対応する）（Ｃａｌｉｃｅｔｉ． ２００３． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ５５：１２６１－１２７７）、その結果、循環タンパク質の腎臓クリアランスが低下し得る。タンパク質の流体力学的半径は、その分子量によってだけでなく、形状および緻密さを含むその構造によっても決定される。特定の理論に拘束される訳ではないが、ＸＴＥＮは、二次構造を付与する可能性が欠如している配列内の特定のアミノ酸によって付与されるペプチドの個々の電荷間の静電気的反発または固有の柔軟性に起因して、開いた立体構造をとり得る。ＸＴＥＮポリペプチドの開いた、伸長した、構造化されていない立体構造は、配列の長さおよび／または分子量が同等であり、典型的な球状タンパク質などの二次構造および／または三次構造を有するポリペプチドと比較して、より大きく比例する流体力学的半径を有し得る。流体力学的半径を決定するための方法は、例えば、米国特許第６，４０６，６３２号および同第７，２９４，５１３号に記載の通り、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用することによるものなど、当技術分野で周知である。長さが増大したＸＴＥＮを付加することにより、流体力学的半径のパラメーター、見かけの分子量、および見かけの分子量係数が比例的に増大し、それにより、ＢＰＸＴＥＮを所望の特徴的カットオフ見かけの分子量または流体力学的半径に合わせて調整することが可能になる。したがって、ある特定の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を、融合タンパク質が少なくとも約５ｎｍ、または少なくとも約８ｎｍ、または少なくとも約１０ｎｍ、または１２ｎｍ、または少なくとも約１５ｎｍの流体力学的半径を有することができるようにＸＴＥＮを用いて構成することができる。前述の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質内のＸＴＥＮによって付与される大きな流体力学的半径により、生じた融合タンパク質の腎臓クリアランスの低下がもたらされる可能性があり、それにより、対応する終末相半減期の増加、平均保持時間の増加、および／または腎臓クリアランス速度の低下が導かれる。
一部の実施形態では、選択した長さおよび配列のＸＴＥＮは、生理条件下で、少なくとも約１５０ｋＤａ、または少なくとも約３００ｋＤａ、または少なくとも約４００ｋＤａ、または少なくとも約５００ｋＤａ、または少なくとも約６００ｋＤａ、または少なくとも約７００ｋＤａ、または少なくとも約８００ｋＤａ、または少なくとも約９００ｋＤａ、または少なくとも約１０００ｋＤａ、または少なくとも約１２００ｋＤａ、または少なくとも約１５００ｋＤａ、または少なくとも約１８００ｋＤａ、または少なくとも約２０００ｋＤａ、または少なくとも約２３００ｋＤａまたはそれより多い分子量の見かけの分子量を有する融合タンパク質を作成するために、ＢＰＸＴＥＮに選択的に組み込まれていてもよい。一部の実施形態では、選択された長さおよび配列のＸＴＥＮは、生理条件下で、少なくとも３、あるいは少なくとも４、あるいは少なくとも５、あるいは少なくとも６、あるいは少なくとも７、あるいは少なくとも８、あるいは少なくとも９、あるいは少なくとも１０、あるいは少なくとも１５の見かけの分子量係数、または少なくとも２０もしくはそれより大きい見かけの分子量係数を有するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をもたらすＢＰに選択的に連結されていてもよい。一部の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、生理条件下で、融合タンパク質の実際の分子量に対して、約４～約２０であるか、または約６～約１５であるか、または約８～約１２であるか、または約９～約１０である見かけの分子量係数を有する。一部の実施形態では、（融合）ポリペプチドは、生理条件下で、約６より大きい見かけの分子量係数を示す。
終末相半減期の増加
一部の実施形態では、（融合）ポリペプチドは、いずれのＸＴＥＮにも連結していない生物学的に活性なポリペプチドと比較して、少なくとも２倍長い、または少なくとも３倍長い、または少なくとも４倍長い、または少なくとも５倍長い終末相半減期を有する。一部の実施形態では、（融合）ポリペプチドは、いずれのＸＴＥＮにも連結していない生物学的に活性なポリペプチドと比較して、少なくとも２倍長い終末相半減期を有する。
本明細書に記載のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の実施形態のうちのいずれかの治療有効用量の、それを必要とする対象への投与により、ＸＴＥＮに連結しておらず、同等用量で対象に投与された対応するＢＰと比較して、融合タンパク質に関する治療域内で少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、またはそれより長く費やした時間増加がもたらされる可能性がある。
低免疫原性
一部の実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮ配列が低い度合の免疫原性を有するか、または実質的に非免疫原性である組成物を提供する。ＸＴＥＮの低免疫原性には、いくつかの因子、例えば、実質的に非反復性の配列、非構造化立体構造、溶解度の度合が高いこと、自己凝集の度合が低いかまたはそれが欠如していること、配列内のタンパク質分解部位の度合が低いかまたはそれが欠如していること、およびＸＴＥＮ配列内のエピトープの度合が低いかまたはそれが欠如していることが寄与する可能性がある。
当業者であれば、一般に、反復度合の高い短いアミノ酸配列（例えば、２００アミノ酸長の配列が、３または４ｍｅｒの限られたセットの平均２０回またはそれより多い繰り返しを含有する）を有する、および／または連続的反復アミノ酸残基（例えば、５または６ｍｅｒの配列が同一のアミノ酸残基を有する）を有するポリペプチドが、凝集するか、またはより高次の構造を形成するか、または接触点を形成し、結晶または疑似結晶構造をもたらす傾向を有することを理解するであろう。
一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、実質的に非反復性であり、（１）ＸＴＥＮ配列は、アミノ酸がセリンでなければ、同一のアミノ酸種である３つの連続したアミノ酸を有さず、この場合、３以下の連続するアミノ酸はセリン残基であってもよい；および（２）ＸＴＥＮは、２００アミノ酸長のＸＴＥＮの配列内に１６回より多く、１４回より多く、１２回より多く、または１０回より多く出現する３アミノ酸配列（３ｍｅｒ）を含有しない。当業者であれば、このような実質的に非反復性の配列が、凝集する傾向が低く、よって、配列またはアミノ酸残基が他の方法でより反復的であれば凝集する可能性が高い帯電アミノ酸の頻度が比較的低い長い配列のＸＴＥＮの設計を可能にすることを理解するであろう。
立体構造エピトープは、タンパク質抗原の多数の不連続なアミノ酸配列で構成されるタンパク質表面の領域によって形成される。タンパク質の正確なフォールディングにより、これらの配列が、宿主体液性免疫系によって「外来」と認識され得る、明確に定義された安定な空間的配置、またはエピトープになり、その結果、タンパク質に対する抗体の産生または細胞媒介性免疫応答の誘発がもたらされる。後者の場合には、個体におけるタンパク質に対する免疫応答は、その個体のＨＬＡ－ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性の機能であるＴ細胞エピトープ認識の影響を重度に受ける。ＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体のＴ細胞の表面上の同族のＴ細胞受容体による会合により、ＣＤ４分子などのある特定の他の補助受容体の架橋結合と一緒に、Ｔ細胞内で活性化状態を誘導することができる。活性化により、Ｂ細胞などの他のリンパ球をさらに活性化するサイトカインが放出され、抗体が産生されるか、または完全な細胞性免疫応答としてキラーＴ細胞が活性化される。
ＡＰＣ（抗原提示細胞）の表面上での提示のために所与のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドの能力は、いくつかの因子、とりわけ、その一次配列に左右される。一実施形態では、度合の低い免疫原性は、抗原提示細胞における抗原プロセシングに抵抗するＸＴＥＮ配列を設計し、および／またはＭＨＣ受容体に十分に結合しない配列を選択することによって実現され得る。本発明は、ＭＨＣ ＩＩ受容体との結合を低下させると共に、Ｔ細胞受容体または抗体が結合するエピトープの形成が回避され、その結果免疫原性の度合が低くなるように設計された実質的に非反復性のＸＴＥＮポリペプチドを有するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。免疫原性の回避は、部分的に、ＸＴＥＮ配列の立体構造上の可動性、すなわち、アミノ酸残基の選択および順序に起因する二次構造の欠如の直接的な結果である。例えば、水溶液中または生理条件下で、立体構造エピトープがもたらされ得る緻密にフォールディングされた立体構造をとる傾向の低い配列が特に興味深い。従来の治療実務および投与を使用するＸＴＥＮを含む融合タンパク質の投与により、一般に、ＸＴＥＮ配列に対する中和性抗体は形成されず、ＢＰＸＴＥＮ組成物中のＢＰ融合パートナーの免疫原性も低下する場合がある。
一実施形態では、対象融合タンパク質において利用されるＸＴＥＮ配列は、ヒトＴ細胞によって認識されるエピトープを実質的に含まなくてもよい。免疫原性の低いタンパク質を生成するためにこのようなエピトープを排除することは、以前に開示されており、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９８／５２９７６、ＷＯ０２／０７９２３２、およびＷＯ００／３３１７を参照されたい。ヒトＴ細胞エピトープについてのアッセイについて記載されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２８１： ９５－１０８）。Ｔ細胞エピトープまたは非ヒト配列の生成を伴わずにオリゴマー形成することができるペプチド配列が特に興味深い。これは、これらの配列の直列反復配列をＴ細胞エピトープの存在について、およびヒトのものではない６～１５ｍｅｒ、特に、９ｍｅｒの配列の出現について試験し、次いで、ＸＴＥＮ配列の設計を変更して、エピトープ配列を排除または撹乱することによって実現することができる。一部の場合には、ＸＴＥＮ配列は、ＭＨＣ受容体に結合することが予測されるＸＴＥＮのエピトープの数の制限によって実質的に非免疫原性となる。ＭＨＣ受容体に結合することが可能なエピトープの数の低減により、同時に、Ｔ細胞活性化およびＴ細胞ヘルパー機能の潜在性が低下し、Ｂ細胞の活性化または上方制御が低下し、抗体産生が低減する。低程度の予測Ｔ細胞エピトープは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／１４４５０２Ａ２号の実施例７４において示されているように、ＴＥＰＩＴＯＰＥ（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １７： ５５５－６１）などのエピトープ予測アルゴリズムによって決定することができる。タンパク質内の所与のペプチドフレームのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：５５５に開示されている通り、そのペプチドフレームと多数の最も一般的なヒトＭＨＣ対立遺伝子の結合のＫｄ（解離定数、親和性、解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ））の対数である。スコアは、約１０～約－１０の少なくとも２０ｌｏｇ（１０ｅ１０Ｋｄ～１０ｅ－１０Ｋｄの結合制約に対応する）の範囲にわたり、ＭＨＣ上のペプチド提示の間にアンカー残基としての機能を果たし得る疎水性アミノ酸、例えば、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＦを回避することによって低下させることができる。一部の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮに組み込まれるＸＴＥＮ構成成分は、約－５もしくはそれより大きいか、または－６もしくはそれより大きいか、または－７もしくはそれより大きいか、または－８もしくはそれより大きいＴＥＰＩＴＯＰＥスコア、または－９もしくはそれより大きいＴＥＰＩＴＯＰＥスコアの予測Ｔ細胞エピトープを有さない。本明細書で使用される場合、「－９またはそれより大きい」というスコアは、両端を含めて１０～－９のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを包含するが、－１０は－９未満であるため－１０というスコアは包含しない。
一部の実施形態では、対象ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に組み込まれたものを含む、本発明のＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮの配列由来の公知のタンパク質分解部位を制限し、それによりＸＴＥＮの、ＭＨＣ ＩＩ受容体に結合することができる小さなペプチドへのプロセシングを低減することによって、実質的に非免疫原性となり得る。一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、二次構造を実質的に欠く配列を使用し、構造のエントロピーが高いことに起因して多くのプロテアーゼに対する抵抗性を付与することによって実質的に非免疫原性にされ得る。したがって、ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを低下させること、およびＸＴＥＮから公知のタンパク質分解部位を排除することにより、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物のＸＴＥＮを含むＸＴＥＮ組成物が、免疫系のものを含む哺乳動物の受容体と実質的に結合することができなくなり得る。一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮは、哺乳動物の受容体に対して＞１００ｎＭのＫｄの結合性、または哺乳動物の細胞表面または循環ポリペプチド受容体に対して５００ｎＭを超えるＫｄ、または１μＭを超えるＫｄを有してもよい。
さらに、実質的に非反復性の配列およびＸＴＥＮのこのような実施形態の対応するエピトープの欠如により、Ｂ細胞のＸＴＥＮに結合するまたはＸＴＥＮによって活性化される能力が限定される場合がある。ＸＴＥＮはその伸長した配列にわたって多くの異なるＢ細胞と接触することができるが、それぞれ個々のＢ細胞は個々のＸＴＥＮと１つまたは少数の接触しかできない。結果として、ＸＴＥＮは、典型的には、Ｂ細胞の増殖、よって免疫応答を刺激する傾向がはるかに低い場合がある。一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、融合していない対応するＢＰと比較して免疫原性が低下している場合がある。一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮの哺乳動物に対する最大３回の非経口用量の投与により、１：１００の血清希釈度では検出可能であるが１：１０００の希釈度では検出できない抗ＢＰＸＴＥＮ ＩｇＧがもたらされ得る。一部の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮの哺乳動物に対する最大３回の非経口用量の投与により、１：１００の血清希釈度では検出可能であるが、１：１０００の希釈度では検出できない抗ＢＰ ＩｇＧがもたらされ得る。一部の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮの哺乳動物に対する最大３回の非経口用量の投与により、１：１００の血清希釈度では検出可能であるが、１：１０００の希釈度では検出できない抗ＸＴＥＮ ＩｇＧがもたらされ得る。前述の実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、またはカニクイザルであってもよい。
非反復性の程度の低い配列（同一である３つの連続するアミノ酸を有するものなど）と比較した実質的に非反復性の配列を有するＸＴＥＮのある特定の実施形態の追加的な特徴は、非反復性ＸＴＥＮが抗体とより弱い接触（例えば、一価の相互作用）しか形成せず、それによって、免疫クリアランスの可能性が低くなり、その結果、ＢＰＸＴＥＮ組成物が循環中にとどまる時間が長くなる可能性があることであり得る。
一部の実施形態では、（融合）ポリペプチドは、いずれのＸＴＥＮにも連結していない生物学的に活性なポリペプチドと比較して免疫原性が低く、ここで、免疫原性は、対象への同等用量の投与後に、生物学的に活性なポリペプチドに選択的に結合するＩｇＧ抗体の産生を測定することによって確認される。
スペーサーおよびＢＰ放出セグメント
一部の実施形態では、各ＢＰの生物活性の少なくとも一部は、インタクトなＢＰＸＴＥＮによって保持される。一部の実施形態では、ＢＰ構成成分は、本明細書の以下においてより十分に説明されているように、ＢＰＸＴＥＮ中のスペーサー配列内に組み込まれた選択的な切断配列の切断によってＸＴＥＮから放出された際に、生物学的に活性となるか、または生物活性が増加するかのいずれかである。
任意のスペーサー配列群は、本発明に包含される融合タンパク質において選択的である。スペーサーは、宿主細胞由来の融合タンパク質の発現を増強するために、またはＢＰ構成成分が、その所望の三次構造を呈する、および／またはその標的分子と適切に相互作用することができるように立体障害を減少させるために提供されてもよい。スペーサーおよび所望のスペーサーを同定する方法については、例えば、参照により本明細書に具体的に組み込まれる、Ｇｅｏｒｇｅ， ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １５：８７１－８７９を参照されたい。一実施形態では、スペーサーは、１から５０の間のアミノ酸残基の長さ、または約１～２５残基の長さ、または約１～１０残基の長さである１つまたは複数のペプチド配列を含む。スペーサー配列は、切断部位を除いて、２０種の天然のＬアミノ酸のいずれかを含んでもよく、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）を含み得るがこれらに限定されない、立体障害を起こさない親水性アミノ酸を含むことが好ましい。一部の実施形態では、スペーサーは、ポリグリシンもしくはポリアラニンであってもよく、または優位には、グリシン残基とアラニン残基の組合せの混合物であってもよい。切断配列を除くスペーサーポリペプチドは、ほぼ実質的に二次構造を欠く。一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物中の一方または両方のスペーサー配列はそれぞれ、同一であっても異なっていてもよい切断配列をさらに含有してもよく、切断配列は、プロテアーゼによって作用して、融合タンパク質からＢＰを放出させ得る。
一部の場合には、切断配列のＢＰＸＴＥＮへの組込みは、ＸＴＥＮから放出された際に、活性またはより活性となるＢＰの放出を可能にするように設計されている。切断配列は、ＢＰ配列に十分に近接して、一般にＢＰ配列末端から１８アミノ酸以内、または１２アミノ酸以内、または６アミノ酸以内、または２アミノ酸以内のアミノ酸に位置し、その結果、切断後にＢＰに結合した残りの残基はいずれも、ＢＰの活性（例えば、受容体への結合など）をほとんど妨害せず、さらに切断配列を切断することができるようにプロテアーゼへの十分なアクセスをもたらす。一部の実施形態では、切断部位は、ＢＰＸＴＥＮが対象への投与後に切断され得るように、哺乳動物対象にとって内因性のプロテアーゼによって切断され得る配列である。このような場合には、ＢＰＸＴＥＮは、プロドラッグまたはＢＰに対する循環デポーとして機能し得る。本発明によって企図される切断部位の例としては、以下に限定されないが、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＩＩａ（トロンビン）、エラスターゼ－２、グランザイムＢ、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１７もしくはＭＭＰ－２０である哺乳動物内因性プロテアーゼによって、または非哺乳動物プロテアーゼ、例えば、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ）またはソルターゼＡによって切断可能なポリペプチド配列が挙げられる。前述のプロテアーゼによって切断されることが知られている配列は、当分野で公知である。例示的な切断配列および配列内のカット部位は、配列バリアントと共に表７ａに表示されている。例えば、トロンビン（活性化凝固第ＩＩ因子）は、配列の４位のアルギニンの後でカットされる、配列ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号２２２）に作用する［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３６： Ｄ３２０］。活性ＦＩＩａは、リン脂質およびカルシウムの存在下でのＦＸａによるＦＩＩの切断によって産生され、凝固経路の第ＩＸ因子から下流にある。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割はフィブリノーゲンを切断することであり、これにより次に、クロット形成が開始する。ＦＩＩａ活性は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要な場合にのみ生じる。しかし、凝固は、ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号２２２）配列のＢＰＸＴＥＮのＢＰとＸＴＥＮとの間への組込みによる、哺乳動物における進行中のプロセスであるため、ＸＴＥＮドメインは、凝固が生理的に必要とされる場合に、外来的であるかまたは本質的であるかのどちらかの凝固経路の活性化と同時に、隣のＢＰから除去されて、それによって経時的にＢＰが放出される。同様に、他の配列の、内因性プロテアーゼによる作用を受けるＢＰＸＴＥＮへの組込みは、ＢＰの持続放出を提供し、これは、ある特定の場合には、ＢＰＸＴＥＮの「プロドラッグ」形態から、ＢＰにとってより高い度合の活性を提供し得る。
一部の場合には、カット部位の両側に隣接するわずか２または３のアミノ酸（合計４～６のアミノ酸）が切断配列に組み込まれることになる。他の場合には、公知の切断配列は、１つもしくは複数の欠失もしくは挿入、または公知の配列の任意の１もしくは２もしくは３のアミノ酸に対する１もしくは２もしくは３のアミノ酸の置換を有することができ、欠失、挿入または置換は、プロテアーゼに対する感受性の非存在ではなく、感受性の低下または増強を生じて、ＸＴＥＮからのＢＰの放出速度を適応させる能力を生じる。例示的な置換は表７ａに示されている。
表７ａ： ＢＰ放出のためのプロテアーゼ切断配列
Figure 2023531494000038
 ↓は切断部位を示す；
ＮＡ： 該当なし；
＊ スラッシュの前、間、または後の複数のアミノ酸の列挙は、その場所で置換され得る代替アミノ酸を示す；
「－」は、いずれかのアミノ酸が中欄に示される対応するアミノ酸で置換されてもよいことを示す
一部の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、プロテアーゼによって作用する場合に融合タンパク質からＢＰを放出するよう構成された１つまたは複数の切断配列をさらに含み得るスペーサー配列を含んでもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数の切断配列は、表７ａからの配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％）の配列同一性を有する配列であってもよい。
一部の実施形態では、本開示は、疾患組織または疾患組織の近くに見られる細胞に関連するか、またはそれによって生じる１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼに対する基質であるＢＰ放出セグメントペプチド（または放出セグメント（ＲＳ））を提供する。このようなプロテアーゼとしては、以下に限定されないが、表７ｂのプロテアーゼを含むがこれらに限定されないメタロプロテイナーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、およびセリンプロテアーゼなどのプロテアーゼの分類が挙げられる。ＲＳは、とりわけ、対象組換えポリペプチドへの組込みにとって有用であり、哺乳動物プロテアーゼによるＲＳの切断によって活性化され得るプロドラッグ形式を付与する。本明細書に記載されているように、ＲＳは対象組換えポリペプチド組成物中に組み込まれ、組み込まれた結合部分をＸＴＥＮに連結させ（この立体配置は以下にさらに十分に説明されている）、その結果、ＲＳが基質である１つまたは複数のプロテアーゼの作用によるＲＳの切断の際に、結合部分とＸＴＥＮは組成物から放出され、結合部分はＸＴＥＮによってもはや保護されず、それらのリガンドに結合する十分な能力を取り戻す。第１および第２の抗体断片を含むこれらの組換えポリペプチド組成物において、組成物は、活性化可能な抗体組成物（ＡＡＣ）として本明細書において言及されている。
表７ｂ： 標的組織のプロテアーゼ
Figure 2023531494000039
Figure 2023531494000040
一実施形態では、本開示は、最適にアラインされた場合に、表８ａに示されている配列によって本明細書において同定される配列に対して、少なくとも８８％、または少なくとも９４％、または１００％の配列同一性を有する第１の放出セグメント（ＲＳ１）配列を含む活性化可能な組換えポリペプチドであって、ＲＳ１が、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼに対する基質である、活性化可能な組換えポリペプチドを提供する。他の実施形態では、本開示は、最適にアラインされた場合に、表８ａに示されている配列によって本明細書において同定される配列に対して、それぞれ少なくとも８８％、または少なくとも９４％、または１００％の配列同一性を有するＲＳ１および第２の放出セグメント（ＲＳ２）配列を含む活性化可能な組換えポリペプチドであって、ＲＳ１およびＲＳ２がそれぞれ、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼに対する基質である、活性化可能な組換えポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本開示は、最適にアラインされた場合に、表８ｂに示されている配列によって本明細書において同定される配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９７％、または１００％の同一性を有する第１のＲＳ（ＲＳ１）配列を含む活性化可能な組換えポリペプチドであって、ＲＳが、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼに対する基質である、活性化可能な組換えポリペプチドを提供する。他の実施形態では、本開示は、最適にアラインされた場合に、表８ｂに示されている配列によって本明細書において同定される配列に対して、それぞれ少なくとも８８％、または少なくとも９４％、または１００％の配列同一性を有するＲＳ１および第２の放出セグメント（ＲＳ２）配列を含む活性化可能な組換えポリペプチドであって、ＲＳ１およびＲＳ２がそれぞれ、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼに対する基質である（例えば、各放出セグメント配列内の１、２、または３つの切断部位において）、活性化可能な組換えポリペプチドを提供する。ＲＳ１およびＲＳ２を含む活性化可能な組換えポリペプチドの実施形態では、２つの放出セグメントは同一であってもよく、または配列は異なっていてもよい。
本開示は、表７ｂのプロテアーゼを含む、メタロプロテイナーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、またはセリンプロテアーゼである１、２または３つの異なる分類のプロテアーゼに対する基質である放出セグメントを企図する。特定の特徴において、ＲＳは、以下に限定されないが、腫瘍、がん細胞、および炎症組織などの疾患組織または細胞に密接に関連して見られるか、またはそれと共存するプロテアーゼに対する基質としての機能を果たし、ＲＳの切断の際には、それ以外の場合には対象組換えポリペプチド組成物のＸＴＥＮによって保護されている（よって、それらの各リガンドに対して低い結合親和性しか有さない）結合部分が、組成物から放出され、標的および／またはエフェクター細胞のリガンドに結合するそれらの完全な能力を取り戻す。一部の実施形態では、対象組換えポリペプチド組成物のＲＳは、表７ｂのプロテアーゼを含むがこれらに限定されない、標的化細胞内に位置する細胞プロテアーゼに対する基質であるアミノ酸配列を含む。対象組換えポリペプチド組成物の別の特定の特徴では、２つまたは３つの分類のプロテアーゼに対する基質であるＲＳは、異なるプロテアーゼによってＲＳ配列の異なる位置で切断されることが可能な配列により設計された。よって、２、３、またはそれより多い分類のプロテアーゼに対する基質であるＲＳは、ＲＳ配列において２、３、または複数の異なる切断部位を有するが、それにもかかわらず、単一のプロテアーゼによる切断によって、ＲＳを含む組換えポリペプチド組成物からの結合部分およびＸＴＥＮの放出がもたらされる。
一実施形態では、対象組換えポリペプチド組成物に組み込むための本開示のＲＳは、メプリン、ネプリライシン（ＣＤ１０）、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ－１、Ａディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７（ＴＡＣＥ）、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２８（ＭＤＣ－Ｌ）、トロンボスポンジンモチーフを有するＡＤＡＭ（ＡＤＡＭＴＳ）、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＭＭＰ－１（コラゲナーゼ１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－１（ＭＭＰ－１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－２（ＭＭＰ－２、ゲラチナーゼＡ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－３（ＭＭＰ－３、ストロメライシン１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－７（ＭＭＰ－７、マトリライシン１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－８（ＭＭＰ－８、コラゲナーゼ２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－９（ＭＭＰ－９、ゲラチナーゼＢ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－１０（ＭＭＰ－１０、ストロメライシン２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－１１（ＭＭＰ－１１、ストロメライシン３）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－１２（ＭＭＰ－１２、マクロファージエラスターゼ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－１３（ＭＭＰ－１３、コラゲナーゼ３）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－１４（ＭＭＰ－１４、ＭＴ１－ＭＭＰ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－１５（ＭＭＰ－１５、ＭＴ２－ＭＭＰ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－１９（ＭＭＰ－１９）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－２３（ＭＭＰ－２３、ＣＡ－ＭＭＰ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－２４（ＭＭＰ－２４、ＭＴ５－ＭＭＰ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－２６（ＭＭＰ－２６、マトリライシン２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－２７（ＭＭＰ－２７、ＣＭＭＰ）、レグマイン、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＸ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、セクレターゼ、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、プラスミン、トロンビン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ、ＫＬＫ３）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、エラスターゼ、トリプターゼ、ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）、ＤＥＳＣ１、ヘプシン（ＨＰＮ）、マトリプターゼ、マトリプターゼ－２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４（ＣＡＰ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、カリクレイン関連ペプチダーゼ（ＫＬＫファミリー）、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、およびＫＬＫ１４を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数のプロテアーゼに対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＡＤＡＭ１７に対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＢＭＰ－１に対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、カテプシンに対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＨｔｒＡ１に対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、レグマインに対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＭＭＰ－１に対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＭＭＰ－２に対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＭＭＰ－７に対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＭＭＰ－９に対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＭＭＰ－１１に対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＭＭＰ－１４に対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、ｕＰＡに対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、マトリプターゼに対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＭＴ－ＳＰ１に対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、好中球エラスターゼに対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、トロンビンに対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＴＭＰＲＳＳ３に対する基質である。一実施形態では、ＲＳは、ＴＭＰＲＳＳ４に対する基質である。一実施形態では、対象組換えポリペプチド組成物のＲＳは、レグマイン、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１１、ＭＭＰ－１４、ｕＰＡ、およびマトリプターゼを含むがこれらに限定されない少なくとも２つのプロテアーゼに対する基質である。一部の実施形態では、対象組換えポリペプチド組成物のＲＳは、レグマイン、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１１、ＭＭＰ－１４、ｕＰＡ、およびマトリプターゼに対する基質である。
表８ａ： ＢＰ放出セグメント配列
Figure 2023531494000041
Figure 2023531494000042
Figure 2023531494000043
 表８ｂ： 放出セグメント配列
Figure 2023531494000044
Figure 2023531494000045
Figure 2023531494000046
Figure 2023531494000047
Figure 2023531494000048
Figure 2023531494000049
Figure 2023531494000050
Figure 2023531494000051
Figure 2023531494000052
Figure 2023531494000053
Figure 2023531494000054
一部の実施形態では、対象組換えポリペプチドに組み込むためのＲＳは、それらが基質である様々なプロテアーゼに対して、様々な切断速度および様々な切断効率を有するために選択的に感受性であるように設計することができる。所与のプロテアーゼは、健康な組織または循環中と比較して、腫瘍、血液がん、または炎症組織もしくは炎症部位を含むがこれらに限定されない疾患組織において異なる濃度で見られる場合があるため、本開示は、組換えポリペプチドが、標的細胞または組織およびそれと共存するプロテアーゼに近い場合に、健康な組織または循環中におけるＲＳの切断速度と比較して、プロドラッグ形態から活性形態へと優先的に変換され（すなわち、ＲＳの切断後の組換えポリペプチドからの結合部分およびＸＴＥＮの分離および放出によって）、その結果、放出された抗体断片結合部分が、循環中に残っているプロドラッグ形態と比較して、疾患組織中のリガンドに結合する能力がより高いことを確認するために、所与のプロテアーゼに対してより高いかまたはより低い切断効率を有するように操作された個々のアミノ酸配列を有しているＲＳを提供する。このような選択的設計によって、得られる組成物の治療指数が改善され、このような部位特異的活性化を組み込まない従来の治療薬に対して副作用が低減され得る。
本明細書で使用される場合、切断効率は、初期基質濃度が６μＭである反応が行われる生化学的アッセイ（実施例においてさらに詳述される）において、それぞれがプロテアーゼ酵素に供された場合に切断された対照基質ＡＣ１６１１のパーセンテージに対する、切断されたＲＳを含む試験基質のパーセンテージの比率のｌｏｇ２値として定義され、反応物は、３７℃で２時間インキュベートされた後、ＥＤＴＡを添加することによって停止され、消化産物と未切断基質の量を非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、切断されたパーセンテージの比率を確立する。切断効率は以下のように計算される。
Figure 2023531494000055
 よって、切断効率が－１であることは、切断された試験基質の量が、対照基質の量と比較して５０％であったことを意味し、一方、切断効率が＋１であることは、切断された試験基質の量が、対照基質の量と比較して２００％であったことを意味する。対照に対して試験プロテアーゼによる切断速度が速ければ切断効率は高くなり、対照に対して試験プロテアーゼによる切断速度が遅ければ切断効率は低くなる。実施例において詳述されるように、アミノ酸配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴ（配列番号７００１）を有する対照ＲＳ配列ＡＣ１６１１（ＲＳＲ－１５１７）は、個々のプロテアーゼによる切断速度に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ生化学アッセイにおいて試験された場合、プロテアーゼであるレグマイン、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１４、ｕＰＡ、およびマトリプターゼによる適切なベースラインの切断効率を有するものとして確立された。ＲＳペプチド中の個々の位置におけるアミノ酸の選択的置換により、ＲＳのライブラリーが作成され、７つのプロテアーゼのパネル（実施例においてより十分に詳述される）に対して評価され、所望の切断効率を有するＲＳを実現するために適切なアミノ酸置換のガイドラインを確立するために使用されるプロファイルが得られた。所望の切断効率を有するＲＳを作製する際には、親水性アミノ酸であるＡ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、およびＴを使用する置換が好ましいが、ＲＳがプロテアーゼによる切断に対する感受性を少なくともある程度保持する限り、他のＬ－アミノ酸が所与の位置で置換され、切断効率を調整してもよい。活性を保持または効果的にするためのペプチド中のアミノ酸の保存的置換は、十分に当業者の知識および能力の範囲内にある。一実施形態では、本開示は、配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴ（配列番号７００１）を有する対照配列ＲＳＲ－１５１７の同じプロテアーゼによる切断と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生化学競合アッセイにおいて少なくとも０．２ｌｏｇ２、または０．４ｌｏｇ２、または０．８ｌｏｇ２、または１．０ｌｏｇ２高い切断効率を有するレグマイン、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１１、ＭＭＰ－１４、ｕＰＡ、またはマトリプターゼを含むがこれらに限定されないプロテアーゼによって、切断されるＲＳを提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴ（配列番号７００１）を有する対照配列ＲＳＲ－１５１７の同じプロテアーゼによる切断と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生化学競合アッセイにおいて少なくとも０．２ｌｏｇ２、または０．４ｌｏｇ２、または０．８ｌｏｇ２、または１．０ｌｏｇ２低い切断効率を有するレグマイン、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１１、ＭＭＰ－１４、ｕＰＡ、またはマトリプターゼを含むがこれらに限定されないプロテアーゼによって、切断されるＲＳを提供する。一実施形態では、本開示は、レグマイン、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１１、ＭＭＰ－１４、ｕＰＡ、またはマトリプターゼを含むがこれらに限定されないプロテアーゼによるＲＳの切断速度が、配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴ（配列番号７００１）を有する対照配列ＲＳＲ－１５１７と比較して、少なくとも２倍、または少なくとも４倍、または少なくとも８倍、または少なくとも１６倍早いＲＳを提供する。一部の実施形態では、本開示は、レグマイン、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１１、ＭＭＰ－１４、ｕＰＡ、またはマトリプターゼを含むがこれらに限定されないプロテアーゼによるＲＳの切断速度が、配列ＥＡＧＲＳＡＮＨＥＰＬＧＬＶＡＴ（配列番号７００１）を有する対照配列ＲＳＲ－１５１７と比較して、２分の１以下、または４分の１以下、または８分の１以下、または１６分の１以下の遅いＲＳを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、複数のＲＳを含むＡＡＣであって、各ＲＳ配列が、表８ａに記載の配列の群によって本明細書において同定され、ＲＳが、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンである１～６のアミノ酸によって互いに連結されている、ＡＡＣを提供する。一実施形態では、ＡＡＣは、第１のＲＳと第１のＲＳとは異なる第２のＲＳを含み、各ＲＳ配列は、表８ａに記載の配列によって本明細書において同定され、ＲＳは、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンである１～６のアミノ酸によって互いに連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＣは、第１のＲＳ、第１のＲＳとは異なる第２のＲＳ、および第１および第２のＲＳとは異なる第３のＲＳを含み、各配列は、表８ａに記載の配列によって本明細書において同定され、第１および第２および第３のＲＳは、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンである１～６のアミノ酸によって互いに連結されている。ＡＡＣの複数のＲＳを連結して、複数のプロテアーゼによって異なる切断速度または切断効率で切断され得る配列を形成できることが特に意図される。一部の実施形態では、本開示は、表８ａ～８ｂに記載の配列によって本明細書において同定されるＲＳ１およびＲＳ２ならびに本明細書の上記のまたは本明細書の他のいずれかの箇所で記載されているものなどのＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２を含むＡＡＣであって、ＲＳ１がＸＴＥＮ１と結合部分の間で融合されており、ＲＳ２がＸＴＥＮ２と結合部分の間で融合されている、ＡＡＣを提供する。このような組成物は、健康な組織または正常な循環中にある場合と比較して、複数のプロテアーゼを発現する罹患した標的組織によってより容易に切断されることが企図されており、結合部分を有する得られる断片が標的組織、例えば、腫瘍により容易に浸透し、標的細胞およびエフェクター細胞（または単一の結合部分に関して設計したＡＡＣの場合には標的細胞だけ）に結合および連結する能力が増強するという結果をもたらす。
本開示のＲＳは、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患および組換えポリペプチドの活性の局在化が望ましい他の状態の処置のための治療薬として、組換えポリペプチド中に含まれるのに有用である。対象組成物は、満たされていない必要性に対処するものであり、注射の際に活性である従来の抗体治療薬または二重特異性抗体治療薬と比較して、終末相半減期の増強、標的化送達、および健康な組織に対する毒性の低下を伴う治療可能比の改善を含む１つまたは複数の態様において優れている。
一部の実施形態では、（融合）ポリペプチドは、（第１の）ＸＴＥＮと生物学的に活性なポリペプチドの間に位置する第１の放出セグメント（ＲＳ１）を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、生物学的に活性なポリペプチドと第２のＸＴＥＮの間に位置する第２の放出セグメント（ＲＳ２）をさらに含む。一部の実施形態では、ＲＳ１とＲＳ２は、配列が同一である。一部の実施形態では、ＲＳ１とＲＳ２は、配列が同一ではない。一部の実施形態では、ＲＳ１は、表８ａ～８ｂの配列またはそのサブセットによって本明細書において同定される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＲＳ２は、表８ａ～８ｂの配列またはそのサブセットによって本明細書において同定される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＲＳ１とＲＳ２はそれぞれ、各放出セグメント配列内の１、２または３つの切断部位での複数のプロテアーゼによる切断のための基質である。
参照断片
一部の実施形態では、（融合）ポリペプチドは、プロテアーゼによる消化の際にポリペプチドから放出可能である１つまたは複数の参照断片をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の参照断片はそれぞれ、生物学的に活性なポリペプチドの一部を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の参照断片は、プロテアーゼによるポリペプチドの消化の際に、ポリペプチドから放出可能である他のペプチド断片のすべてと配列および分子量が異なる単一の参照断片である。
例示的なポリペプチド
本開示の組成物の一部の実施形態では、ポリペプチドは、表Ｄに記載の配列（配列番号１２～４７からなる）またはそのサブセットに対して少なくとも（約）８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである。ポリペプチドは、表Ｄに記載の配列（配列番号１２～４７）またはそのサブセットに対して少なくとも（約）８１％、少なくとも（約）８２％、少なくとも（約）８３％、少なくとも（約）８４％、少なくとも（約）８５％、少なくとも（約）８６％、少なくとも（約）８７％、少なくとも（約）８８％、少なくとも（約）８９％、少なくとも（約）９０％、少なくとも（約）９１％、少なくとも（約）９２％、少なくとも（約）９３％、少なくとも（約）９４％、少なくとも（約）９５％、少なくとも（約）９６％、少なくとも（約）９７％、少なくとも（約）９８％、少なくとも（約）９９％、または（約）１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。ポリペプチドは、表Ｄに記載の配列（配列番号１２～４７）またはそのサブセットに対して少なくとも（約）９０％、少なくとも（約）９１％、少なくとも（約）９２％、少なくとも（約）９３％、少なくとも（約）９４％、少なくとも（約）９５％、少なくとも（約）９６％、少なくとも（約）９７％、少なくとも（約）９８％、少なくとも（約）９９％、または（約）１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。ポリペプチドは、表Ｄに記載の配列（配列番号１２～４７）またはそのサブセットに対して同一なアミノ酸配列を含んでもよい。本開示の組成物が、バリアントが実質的に類似するかまたは同一の生物活性（複数可）および／または活性メカニズムを示す限り、挿入されたリンカー配列を含むか、またはそれに結合した精製タグ配列を含むなどの、表Ｄに記載のアミノ酸配列の配列バリアントを含んでもよいことが特に企図される。
表Ｄ： ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列
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ポリペプチド混合物
本明細書の開示には、様々な長さの複数のポリペプチドを含む混合物であって、ポリペプチドの第１のセットとポリペプチドの第２のセットを含む混合物も含まれる。一部の実施形態では、ポリペプチドの第１のセットの各ポリペプチドは、（ａ）プロテアーゼによる消化によってポリペプチドから放出可能であり、（ｂ）ポリペプチドの第１のセットから放出可能である他のすべての断片の配列および分子量とは異なる配列および分子量を有するバーコード断片を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドの第２のセットは、ポリペプチドの第１のセットのバーコード断片（例えば、切断による）を欠く。一部の実施形態では、ポリペプチドの第１のセットとポリペプチドの第２のセットは両方、（ａ）ポリペプチドの第１のセットとポリペプチドの第２のセットに共通し、（ｂ）プロテアーゼによる消化によって放出可能である参照断片をそれぞれ含む。一部の実施形態では、参照断片を含むポリペプチドに対するポリペプチドの第１のセットの比率は、０．７０を超える。一部の実施形態では、参照断片を含むポリペプチドに対するポリペプチドの第１のセットの比率は、０．８０、０．９０、０．９５、または０．９８を超える。一部の実施形態では、参照断片は、ポリペプチドの第１のセットおよびポリペプチドの第２のセットの各ポリペプチドにおいて１回だけ生じる。一部の実施形態では、プロテアーゼは、グルタミン酸残基のＣ末端側で切断するプロテアーゼである。一部の実施形態では、プロテアーゼは、Ｇｌｕ－Ｃプロテアーゼである。一部の実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンではない。一部の実施形態では、様々な長さのポリペプチドは、本明細書の上記に記載されたまたは本明細書の他のいずれかの箇所に記載されたいずれかなどの少なくとも１つの伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含むポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドの第１のセットは全長ポリペプチドを含み、バーコード断片は、全長ポリペプチドの一部である。一部の実施形態では、全長ポリペプチドは、本明細書の上記に記載されたまたは本明細書の他のいずれかの箇所に記載されたいずれかなどの（融合）ポリペプチドである。一部の実施形態では、バーコード断片は、全長ポリペプチドのＮ末端アミノ酸とＣ末端アミノ酸の両方を欠く（含まない）。一部の実施形態では、様々な長さのポリペプチドの混合物は、全長ポリペプチドのＮ末端切断、Ｃ末端切断、またはＮ末端とＣ末端の両方の切断により、互いに異なる。一部の実施形態では、ポリペプチドの第１のセットとポリペプチドの第２のセットは、１つまたは複数の薬理特性において異なっていてもよい。非限定的な例示的特性には以下が含まれる。
ポリペプチドの特徴付け方法
本明細書の開示には、様々な長さのポリペプチドを含む混合物において、混合物中のポリペプチドの第２のセットに対する混合物中のポリペプチドの第１のセットの相対量を評価するための方法であって、（１）ポリペプチドの第１のセットの各ポリペプチドがポリペプチドにおいて１回だけ生じるバーコード断片を共有し、（２）ポリペプチドの第２のセットの各ポリペプチドが第１のセットのポリペプチドによって共有されているバーコード断片を欠き、第１のポリペプチドとポリペプチドの第２のセットの両方の個々のポリペプチドが参照断片をそれぞれ含む、方法が含まれる。本方法は、混合物とプロテアーゼを接触させて、ポリペプチドの第１のセットとポリペプチドの第２のセットの切断により得られる複数のタンパク質分解断片を生成するステップを含んでもよく、複数のタンパク質分解断片は、複数の参照断片、および複数のバーコード断片を含む。本方法は、参照断片の量に対するバーコード断片の量の比率を決定し、それによって、ポリペプチドの第２のセットに対するポリペプチドの第１のセットの相対量を評価するステップをさらに含んでもよい。一部の実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドの第１のセットの各ポリペプチドにおいて１回だけ生じる。一部の実施形態では、参照断片は、ポリペプチドの第１のセットおよびポリペプチドの第２のセットの各ポリペプチドにおいて１回だけ生じる。一部の実施形態では、複数のタンパク質分解断片は、複数の参照断片、および複数のバーコード断片を含む。一部の実施形態では、プロテアーゼは、プロリン残基が後に続かないグルタミン酸残基のＣ末端側でポリペプチド（または様々な長さのポリペプチド）の第１および第２のセットを切断する。一部の実施形態では、プロテアーゼは、Ｇｌｕ－Ｃプロテアーゼである。一部の実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンではない。一部の実施形態では、参照断片の量に対するバーコード断片の量の比率を決定するステップは、プロテアーゼと接触させた後の混合物由来のバーコード断片と参照断片を同定するステップを含む。一部の実施形態では、バーコード断片および参照断片は、それらの各質量に基づいて同定される。一部の実施形態では、バーコード断片および参照断片は、質量分析によって同定される。一部の実施形態では、バーコード断片および参照断片は、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって同定される。一部の実施形態では、参照断片に対するバーコード断片の比率を決定するステップは、アイソバリック標識化を含む。一部の実施形態では、参照断片に対するバーコード断片の比率を決定するステップは、同位体標識された参照断片と同位体標識されたバーコード断片の一方または両方で混合物をスパイクすることを含む。一部の実施形態では、様々な長さのポリペプチドは、本明細書の上記に記載されたまたは本明細書の他のいずれかの箇所に記載された少なくとも１つの伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含むポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、（ｉ）少なくとも１００、または少なくとも１５０のアミノ酸を含む、（ｉｉ）ＸＴＥＮのアミノ酸残基の少なくとも９０％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）である、および（ｉｉｉ）Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、またはＰである少なくとも４種の異なるアミノ酸を含むという点で特徴付けられる。一部の実施形態では、バーコード断片は、存在する場合、ＸＴＥＮの一部である。一部の実施形態では、様々な長さのポリペプチドの混合物は、本明細書の上記のまたは本明細書の他のいずれかの箇所に記載されたポリペプチドを含む。一部の実施形態では、様々な長さのポリペプチドは、全長ポリペプチドおよび切断されたその断片を含む。一部の実施形態では、様々な長さのポリペプチドは、全長ポリペプチドおよび切断されたその断片から本質的になる。一部の実施形態では、様々な長さのポリペプチドの混合物は、全長ポリペプチドのＮ末端切断、Ｃ末端切断、またはＮ末端とＣ末端の両方の切断により、互いに異なる。一部の実施形態では、全長ポリペプチドは、本明細書の上記に記載されたまたは本明細書の他のいずれかの箇所に記載されたポリペプチドである。一部の実施形態では、参照断片に対するバーコード断片の量の比率は、０．５０、０．６０、０．７０、０．８０、０．９０、０．９５、０．９８、または０．９９を超える。
ペプチドのアイソバリック標識に基づく定量化
一部の実施形態では、アイソバリック標識を使用して、参照断片に対するバーコード断片の比率を決定することができる。当業者であれば、アイソバリック標識が定量プロテオミクスにおいて使用される質量分析戦略であり、ペプチドまたはタンパク質（またはその一部）が、アイソバリック（質量が同一）であるが、その構造周囲の重同位体の分布の点で異なる様々な化学基で標識されることを理解するであろう。これらのタグは、一般に、タンデム質量タグと呼ばれ、タンデム質量分析中の高エネルギー衝突誘起解離（ＣＩＤ）の際に、質量タグが特定のリンカー領域で切断され、それによって異なる質量のレポーターイオンが得られるように設計されている。当業者であれば、最も一般的なアイソバリックタグのうちの１つがアミン反応性タグであることを理解するであろう。
切断生成物を検出および定量化する（例えば、アイソバリック標識による）能力の増強により、精製された原薬／製品中の不要なバリアントの存在を最小限にするための精製ステップを含む製造プロセスの設計に役立ち得る知識を生み出すことができる。
組換え生成
本明細書における開示は核酸を含む。核酸は、本明細書の上記に記載されたまたは本明細書の他のいずれかの箇所に記載されたいずれかなどの（融合）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（またはポリヌクレオチド配列）を含んでもよく、または核酸は、このようなポリヌクレオチド（またはポリヌクレオチド配列）の逆相補体を含んでもよい。
本明細書における開示は、先行する段落に記載されたいずれかなどのポリヌクレオチド配列、およびポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含む発現ベクターを含む。
本明細書における開示は、先行する段落において記載されたいずれかなどの発現ベクターを含む宿主細胞を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は原核生物である。一部の実施形態では、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。一部の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物の細胞である。
一部の実施形態では、本開示は、対象組成物を製造する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ポリペプチドまたはＢＰＸＴＥＮ融合ポリペプチドの発現を促進する条件下で、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのポリペプチドまたはＸＴＥＮ含有組成物をコードする核酸構築物を含む宿主細胞を培養し、それに続いて、標準的な精製方法（例えば、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなど）を使用してポリペプチドまたはＢＰＸＴＥＮ融合ポリペプチドを回収するステップを含み、ここで、発現したポリペプチドまたはＢＰＸＴＥＮ融合ポリペプチドの結合断片の少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９９％が正しくフォールディングする組成物が回収される。作製する方法の一部の実施形態では、発現したポリペプチドまたはＢＰＸＴＥＮ融合ポリペプチドは、ポリペプチドまたはＢＰＸＴＥＮ融合ポリペプチドの少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９９％がモノマー可溶性形態で回収されるように回収される。
一部の実施形態では、本開示は、Ｅ．ｃｏｌｉまたは哺乳動物宿主細胞を使用して、機能的タンパク質の高い発酵発現レベルでポリペプチドおよびＢＰＸＴＥＮ融合ポリペプチドを作製する方法、ならびに高い発現レベルで細胞傷害活性のポリペプチド構築物組成物を生成する方法において有用な構築物をコードする発現ベクターを提供する方法に関する。一実施形態では、本方法は、１）本明細書で開示される実施形態のうちのいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製するステップと、２）生物システムにおける高レベルのタンパク質発現に適切な転写および翻訳配列の制御下でプラスミドまたは他のベクターであり得る発現ベクター中にポリヌクレオチドをクローニングするステップと、３）適切な宿主細胞を発現ベクターにより形質転換するステップと、４）ポリペプチド組成物の発現に好適な条件下で従来の栄養培地中で宿主細胞を培養するステップとを含む。所望の場合、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。本方法によって、ポリペプチドの発現は、宿主細胞の発現産物の少なくとも０．０５ｇ／Ｌ、または少なくとも０．１ｇ／Ｌ、または少なくとも０．２ｇ／Ｌ、または少なくとも０．３ｇ／Ｌ、または少なくとも０．５ｇ／Ｌ、または少なくとも０．６ｇ／Ｌ、または少なくとも０．７ｇ／Ｌ、または少なくとも０．８ｇ／Ｌ、または少なくとも０．９ｇ／Ｌ、または少なくとも１ｇ／Ｌ、または少なくとも２ｇ／Ｌ、または少なくとも３ｇ／Ｌ、または少なくとも４ｇ／Ｌ、または少なくとも５ｇ／Ｌの発酵力価をもたらし、発現したタンパク質の少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９９％は正しくフォールディングされる。本明細書で使用される場合、「正しくフォールディングされる」という用語は、組成物の抗原結合断片の構成成分が、その標的リガンドに特異的に結合する能力を有することを意味する。一部の実施形態では、本開示は、ポリペプチドまたはＢＰＸＴＥＮ融合ポリペプチドを産生するための方法であって、発酵反応において、宿主細胞の乾燥重量１グラム当たり約１０ミリグラム（ｍｇ／ｇ）を超える濃度のポリペプチド産物を、または発酵反応が６００ｎｍの波長で少なくとも１３０の光学密度に到達する場合に、少なくとも約２５０ｍｇ／ｇ、もしくは約３００ｍｇ／ｇ、もしくは約３５０ｍｇ／ｇ、もしくは約４００ｍｇ／ｇ、もしくは約４５０ｍｇ／ｇ、もしくは約５００ｍｇ／ｇのポリペプチドを発現するのに有効な条件下で、ポリペプチドまたはＢＰＸＴＥＮ融合ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養するステップを含み、発現したタンパク質の抗原結合断片が正しくフォールディングされる、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ポリペプチドまたはＢＰＸＴＥＮ融合ポリペプチドを産生するための方法であって、発酵反応において、宿主細胞の乾燥重量１グラム当たり約１０ミリグラム（ｍｇ／ｇ）を超える濃度のポリペプチド産物を、または発酵反応が６００ｎｍの波長で少なくとも１３０の光学密度に到達する場合に、少なくとも約２５０ｍｇ／ｇ、もしくは約３００ｍｇ／ｇ、もしくは約３５０ｍｇ／ｇ、もしくは約４００ｍｇ／ｇ、もしくは約４５０ｍｇ／ｇ、もしくは約５００ｍｇ／ｇのポリペプチドを発現するのに有効な条件下で、組成物をコードするベクターを含む宿主細胞を培養するステップを含み、発現したポリペプチド産物が可溶性である、方法を提供する。
医薬組成物
本明細書の開示には、本明細書の上記に記載されたまたは本明細書の他のいずれかの箇所に記載されたいずれかなどの（融合）ポリペプチド、および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。一部の実施形態では、医薬組成物は、皮内、皮下、経口、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、硝子体内、髄腔内、または筋肉内投与用に製剤化される。一部の実施形態では、医薬組成物は、液体形態であるか、または凍結されている。一部の実施形態では、医薬組成物は、眼または別の身体部分内に移植されているデバイスである。一部の実施形態では、医薬組成物は、単回注射用のプレフィルドシリンジ内にある。一部の実施形態では、医薬組成物は、投与前に再構成される凍結乾燥粉末として製剤化される。
一部の実施形態では、用量は、皮内に、皮下に、経口的に、静脈内に、硝子体内に（またはその他の場合には眼内注射される）、動脈内に、腹部内に、腹腔内に、髄腔内に、または筋肉内に投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、眼または他の身体部分内に移植したデバイスを使用して投与される。一部の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サル、またはヒトである。
医薬組成物は、任意の好適な経路によって療法用に投与されてもよい。さらに、医薬組成物は、他の薬学的に活性な化合物または本発明の複数の化合物を含有してもよい。
一部の実施形態では、医薬組成物は、皮下に、経口的に、筋肉内に、または静脈内に投与されてもよい。一実施形態では、医薬組成物は、治療有効用量で投与される。前述の一部の場合には、治療有効用量は、ＸＴＥＮに連結しておらず、同等用量で対象に投与された融合タンパク質の対応するＢＰと比較して、融合タンパク質に関する治療域内で費やした時間増加をもたらす。治療域内で費やした時間増加は、ＸＴＥＮに連結していない対応するＢＰより少なくとも３倍多く、あるいは、ＸＴＥＮに連結していない対応するＢＰより少なくとも４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍多くてもよい。
一部の実施形態では、本発明は、疾患、障害または状態を処置する方法であって、治療有効用量レジメンを使用して投与される医薬組成物の複数の連続用量を使用して、上記医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。前述の一実施形態では、治療有効用量レジメンは、ＸＴＥＮに連結しておらず、同等用量レジメンで対象に投与された融合タンパク質の対応するＢＰと比較して、融合タンパク質の血中レベルに関して少なくとも２つの連続的Ｃｍａｘピークおよび／またはＣｍｍトラフ間で、少なくとも３倍、あるいは少なくとも４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍の時間増加をもたらし得る。前述の一部の実施形態では、融合タンパク質の投与により、ＸＴＥＮ（複数可）に連結しておらず、対象への治療有効レジメンを使用して対象に投与された対応する生物学的に活性なタンパク質構成成分と比較して、医薬組成物の融合タンパク質のより少ない投与頻度またはモル単位のより低い総投与量を使用して、少なくとも１つの測定パラメーターにおいて同等の改善が生じる。
一実施形態では、医薬組成物は、皮下投与される。この実施形態では、組成物は、投与前に再構成される凍結乾燥粉末として供給されてもよい。組成物は、患者に直接投与され得る液体形態または凍結状態で供給されてもよい。一実施形態では、組成物は、患者が組成物を容易に自己投与できるように、プレフィルドシリンジ内に液体として供給される。
本発明において有用な延長放出製剤は、マトリックスおよびコーティング組成物を含む経口製剤であってもよい。好適なマトリックス材料としては、ワックス（例えば、カルナウバ、ミツロウ、パラフィンワックス、セレシン、シェラックワックス、脂肪酸、および脂肪アルコール）、油、硬化油または脂肪（例えば、硬化ナタネ油、ヒマシ油、牛脂、パーム油、およびダイズ油）、およびポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびポリエチレングリコール）を挙げることができる。他の好適なマトリックス打錠材料は、他の担体、および充填剤を含む微結晶セルロース、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロースである。錠剤はまた、顆粒、コーティングされた粉末、またはペレットを含有してもよい。錠剤はまた、多層であってもよい。多層錠は、有効成分が顕著に異なる薬物動態プロファイルを有する場合に特に好ましい。必要に応じて、完成錠剤は、コーティングされていてもコーティングされていなくてもよい。
コーティング組成物は、不溶性マトリックスポリマーおよび／または水溶性材料を含んでもよい。水溶性材料は、ポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどのポリマー、または糖類などのモノマー材料（例えば、ラクトース、スクロース、フルクトース、マンニトールなど）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなど）、有機酸（例えば、フマル酸、コハク酸、乳酸、および酒石酸）、およびこれらの混合物であってもよい。必要に応じて、腸溶性ポリマーがコーティング組成物に組み込まれてもよい。好適な腸溶性ポリマーとしては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸、ポリビニル酢酸フタル酸、酢酸フタル酸セルロース、セルロース酢酸トリメリテート、シェラック、ゼイン、およびカルボキシ基を含有するポリメタクリレートが挙げられる。コーティング組成物は、例えば、ジエチルフタレート、クエン酸エステル、ポリエチレングリコール、グリセロール、アセチル化グリセリド、アセチル化クエン酸エステル、ジブチルセバケート、およびヒマシ油などの好適な可塑剤を添加することによって可塑化されてもよい。コーティング組成物は、充填剤を含んでもよく、充填剤は、二酸化ケイ素、二酸化チタン、タルク、カオリン、アルミナ、デンプン、粉末セルロース、ＭＣＣ、またはポラクリリンカリウムなどの不溶性材料であってもよい。コーティング組成物は、有機溶媒または水性溶媒またはこれらの混合物中の溶液またはラテックスとして塗布することができる。水、低級アルコール、低級塩素化炭化水素、ケトン、またはこれらの混合物などの溶媒が使用されてもよい。
本発明のＢＰＸＴＥＮポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するために公知の方法に従って製剤化することができ、それによって、ポリペプチドは、水溶液または緩衝液、薬学的に許容される懸濁液およびエマルションなどの薬学的に許容される担体ビヒクルとの混合物中で組み合わされる。非水性溶媒の例としては、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコールおよび植物油が挙げられる。治療用製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． （１９８０）に記載されたように、所望の純度を有する有効成分を、必要に応じた生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって保存用に調製される。本発明の組成物は、種々の賦形剤を使用して製剤化することができる。好適な賦形剤としては、微結晶性セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ １０２、Ａｖｉｃｅｌ ＰＨｌＯｌ）、ポリメタクリレート、ポリ（アクリル酸エチル、メタクリル酸メチル、トリメチルアンモニオエチルメタクリレートクロリド（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ））（例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ ＲＳ－３０Ｄ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ ＫｌＯＯＭ、Ｐｒｅｍｉｕｍ ＣＲ Ｍｅｔｈｏｃｅｌ ＫｌＯＯＭ、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｅ５、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標））、ステアリン酸マグネシウム、タルク、クエン酸トリエチル、エチルセルロース分散液（Ｓｕｒｅｌｅａｓｅ（登録商標））、および硫酸プロタミンが挙げられる。低速放出剤は、担体も含んでよく、担体は、例えば、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤を含んでもよい。これらの低速放出剤には、薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩などの無機塩類、ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩などの有機酸の塩も使用することができる。組成物は、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体、ならびに湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤などの物質を含有してもよい。リポソームも担体として使用することができる。
一部の実施形態では、本発明の組成物は、有益な活性薬剤を長時間にわたって制御された様式で送達する際の有用性が実証されているリポソーム内に封入される。リポソームは、捕捉された水性体積を含有する閉じた二分子膜である。リポソームは、単一の膜二分子層を有する単層小胞またはそれぞれが水性層で次の膜二分子層と分離された複数の膜二分子層を有する多層小胞であってもよい。得られる膜二分子層の構造は、脂質の疎水性（非極性）尾部が二重層の中心に向かって方向付けられ、一方、親水性（極性）頭部が水性相に向かって方向付けられるようにする。一実施形態では、リポソームを、単核食細胞系の臓器、主に肝臓および脾臓による取り込みを回避する可撓性の水溶性ポリマーでコーティングすることができる。リポソームを取り囲むための好適な親水性ポリマーとしては、限定することなく、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３１６，０２４号；同第６，１２６，９６６号；同第６，０５６，９７３号；同第６，０４３，０９４号に記載された、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルトアミドおよび親水性のペプチド配列が挙げられる。
リポソームは、当技術分野で公知の任意の脂質または脂質の組合せで構成されていてもよい。例えば、小胞形成性脂質は、米国特許第６，０５６，９７３号および同第５，８７４，１０４号に開示されているホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、およびスフィンゴミエリンなどのリン脂質を含む、天然に存在する脂質であっても、合成脂質であってもよい。小胞形成性脂質は、同じく米国特許第６，０５６，９７３号に開示されている糖脂質、セレブロシド、またはカチオン性脂質、例えば、１，２－ジオレイルオキシ－３－（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ－［１－（２，３，－ジテトラデシルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；Ｎ－［１［（２，３，－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）；Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；３［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｉ）；またはジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）であってもよい。米国特許第５，９１６，５８８号および同第５，８７４，１０４号に開示されている通り、小胞に対して安定性を付与するために、コレステロールも適切な範囲内で存在してもよい。
追加のリポソーム技術は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７５９，０５７号；同第６，４０６，７１３号；同第６，３５２，７１６号；同第６，３１６，０２４号；同第６，２９４、１９１号；同第６，１２６，９６６号；同第６，０５６，９７３号；同第６，０４３，０９４号；同第５，９６５，１５６号；同第５，９１６，５８８号；同第５，８７４，１０４号；同第５，２１５，６８０号；および同第４，６８４，４７９号に記載されている。これらには、リポソームおよび脂質でコーティングされた微小気泡、ならびにそれらを製造するための方法が記載されている。よって、当業者は、本発明の開示およびこれらの他の特許の開示の両方を考慮して、本発明のポリペプチドの延長放出のためのリポソームを生成することができる。液体製剤について、所望の特性は、製剤が、静脈内、筋肉内、関節内、または皮下投与のために２５ゲージ、２８ゲージ、３０ゲージ、３１ゲージ、３２ゲージの針を通過できる形態で供給されることである。
経皮製剤による投与は、一般に、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１８６，９３８号および同第６，１８３，７７０号、同第４，８６１，８００号、同第６，７４３，２１１号、同第６，９４５，９５２号、同第４，２８４，４４４号、およびＷＯ８９／０９０５１に記載されたものを含む、当技術分野で公知の方法を使用して実施することができる。経皮パッチは、吸収の問題を有するポリペプチドに関して特に有用な実施形態である。パッチは、１２時間、２４時間、３日間および７日間にわたり皮膚浸透性有効成分の放出を制御するために作製することができる。一例では、毎日２倍過剰の本発明のポリペプチドが不揮発性流体中に配置される。本発明の組成物は、粘性の不揮発性の液体形態で提供される。特定の製剤の皮膚を通過する浸透は、当技術分野の標準的な方法（例えば、Ｆｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍ． ６４： １９４－１９５ （１９７５））によって測定することができる。好適なパッチの例は、受動移行皮膚パッチ、イオン導入皮膚パッチ、またはＮｉｃｏｄｅｒｍなどのマイクロニードルを用いるパッチである。他の実施形態では、組成物は、鼻腔内、口腔、または舌下経路を介して脳に送達され、活性剤の嗅覚路を通じたＣＮＳへの移行を可能とし、全身投与を低下させ得る。この投与経路で通常使用されるデバイスは、米国特許第６，７１５，４８５号に含まれる。この経路を介して送達される組成物は、ＣＮＳ投与の増加または全身負荷の低下を可能にし、ある特定の薬物に関連する全身毒性リスクを低下させ得る。皮下に移植可能なデバイスでの送達のための薬学的組成物の調製は、当技術分野で公知の方法、例えば米国特許第３，９９２，５１８号；同第５，６６０，８４８号；および同第５，７５６，１１５号に記載された方法を使用して実施することができる。
浸透圧ポンプは、錠剤、丸剤、カプセル剤または移植可能なデバイスの形態で低速放出剤として使用され得る。浸透圧ポンプは、当技術分野で周知であり、延長放出薬物送達用の浸透圧ポンプの提供に経験がある会社から、当業者が容易に入手可能である。例は、ＡＬＺＡのＤＵＲＯＳ（商標）；ＡＬＺＡのＯＲＯＳ（商標）；Ｏｓｍｏｔｉｃａ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌのＯｓｍｏｄｅｘ（商標）システム；Ｓｈｉｒｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＥｎＳｏＴｒｏｌ（商標）システム；およびＡｌｚｅｔ（商標）である。浸透圧ポンプ技術について説明する特許は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，８９０，９１８号；同第６，８３８，０９３号；同第６，８１４，９７９号；同第６，７１３，０８６号；同第６，５３４，０９０号；同第６，５１４，５３２号；同第６，３６１，７９６号；同第６，３５２，７２１号；同第６，２９４，２０１号；同第６，２８４，２７６号；同第６，１１０，４９８号；同第５，５７３，７７６号；同第４，２００，０９８４号；および同第４，０８８，８６４号である。本発明の開示とこれらの他の特許の開示の両方を考慮して、当業者は、本発明のポリペプチドの延長放出のための浸透圧ポンプを生成することができる。
注射器ポンプは、低速放出剤として使用されてもよい。このようなデバイスは、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９７６，６９６号；同第４，９３３，１８５号；同第５，０１７，３７８号；同第６，３０９，３７０号；同第６，２５４，５７３号；同第４，４３５，１７３号；同第４，３９８，９０８号；同第６，５７２，５８５号；同第５，２９８，０２２号；同第５，１７６，５０２号；同第５，４９２，５３４号；同第５，３１８，５４０号；および同第４，９８８，３３７号に記載されている。本発明の開示とこれらの他の特許の開示の両方を考慮して、当業者は、本発明の組成物の延長放出のための注射器ポンプを生成することができる。
薬学的キット
一部の実施形態では、本発明は、ＢＰＸＴＥＮポリペプチドの使用を容易にするキットを提供する。一実施形態では、キットは、少なくとも第１の容器内に、注射用、または滅菌水、緩衝液、もしくはデキストロースによる再構成用に用意された製剤中に一緒に、（ａ）それを必要とする対象への投与の際に疾患、状態または障害を処置するのに十分な量のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物；および（ｂ）ある量の薬学的に許容される担体を；ＢＰＸＴＥＮ薬物ならびに貯蔵および取扱い条件を明記したラベル、ならびに薬物の承認された適応症のシート、承認された適応症の防止および／または処置に使用するためのＢＰＸＴＥＮ薬物の再構成および／または投与の使用説明書、適切な投与情報および安全性情報、ならびに薬物のロットおよび有効期限を明示した情報と一緒に含む。前述の一部の実施形態では、キットは、対象に送達される適切な濃度のＢＰＸＴＥＮを使用者に提供する、ＢＰＸＴＥＮ組成物に好適な希釈剤を収容できる第２の容器を含むことができる。
処置方法
本明細書の開示には、対象における疾患の処置のための医薬の調製において、本明細書の上記に記載されたまたは本明細書の他のいずれかの箇所に記載されたいずれかなどのポリペプチドの使用が含まれる。一部の実施形態では、処置される特定の疾患は、生物学的に活性なタンパク質の選択に応じて変わる。一部の実施形態では、疾患は、がん（その任意の形態を含む）である。一部の場合には、がんまたは腫瘍は、低、中、または高レベルのＨＥＲ２発現によって特徴付けることができる。
本明細書の開示には、対象における疾患を処置する方法であって、本明細書の上記に記載されたまたは本明細書の他のいずれかの箇所に記載されたいずれかなどの医薬組成物の１または複数の治療有効用量をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、方法が含まれる。一部の実施形態では、疾患は、がん（その任意の形態を含む）である。一部の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サル、およびヒトである。一部の場合には、がんまたは腫瘍は、低、中、または高レベルのＨＥＲ２発現によって特徴付けられ得る。
ある特定の実施形態では、本発明のＨＥＲ－２標的化二重特異性組成物（特に、ＡＭＸ８１８）は、がんの影響を処置または軽快するのに有効な第２の治療剤と有利に組み合わせることができる。追加の治療剤は、抗体、抗体断片、抗体コンジュゲート、細胞傷害剤、毒素、放射性核種、免疫調節薬、光活性治療剤、放射線増感剤、ホルモン剤、抗血管新生剤、およびこれらの組合せからなる群から選択されてもよい。特に好ましい第２または追加の治療剤としては、他のＨＥＲ２標的化薬、化学療法剤、放射線治療剤、ならびにＨＥＲ３およびＨＥＲ２駆動型がんの処置に対する抵抗性に関与する他の標的を標的とする薬剤が挙げられる。
本発明において使用され得る治療用抗体の例としては、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、ブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｚ）、アドトラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）、イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ）、ベドリズマブ（Ｅｎｔｙｖｉｏ）、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚａｍａｂ）アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）、Ｂ－７０１、オファツムマブ、オビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）パニツムマブ、プロザリズマブ、ＢＩ－７５４０９１、ＯＲＥＧ－１０３、ＣＯＭ－７０１、ＢＩ－７５４１１１、およびこれらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態によれば、抗体、その断片、またはそのコンジュゲートは、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、ブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｚ）、アドトラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ）、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、アレムツズマブアテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）、オファツムマブ、オビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）パニツムマブ、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
他の実施形態では、追加の薬剤は、ＤＮＡ損傷剤、代謝拮抗薬、微小管阻害剤、抗生剤などであってもよい。ＤＮＡ損傷剤には、アルキル化剤、白金系薬剤、挿入剤、およびＤＮＡ複製阻害剤が含まれる。ＤＮＡアルキル化剤の非限定的な例としては、シクロホスファミド、メクロレタミン、ウラムスチン、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、テモゾロミド、その薬学的に許容される塩、プロドラッグ、およびこれらの組合せが挙げられる。白金系薬剤の非限定的な例としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、サトラプラチン、トリプラチン四硝酸塩、その薬学的に許容される塩、プロドラッグ、およびこれらの組合せが挙げられる。挿入剤の非限定的な例としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、その薬学的に許容される塩、プロドラッグ、およびこれらの組合せが挙げられる。ＤＮＡ複製阻害剤の非限定的な例としては、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩、テニポシド、その薬学的に許容される塩、プロドラッグ、およびこれらの組合せが挙げられる。代謝拮抗剤としては、メトトレキサートおよびペメトレキセド（ｐｒｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）などの葉酸アンタゴニスト、６－メルカプトプリン、ダカルバジン、およびフルダラビンなどのプリンアンタゴニスト、ならびに５－フルオロウラシル、アラビノシルシトシン、カペシタビン、ゲムシタビン、デシタビンなどのピリミジンアンタゴニスト、その薬学的に許容される塩、プロドラッグ、およびこれらの組合せが挙げられる。微小管阻害剤としては、限定されないが、ビンカアルカロイド、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、およびイキサベピロン（Ｉｘｅｍｐｒａ（登録商標））が挙げられる。抗生剤としては、限定されないが、アクチノマイシン、アントラサイクリン、バルルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、その薬学的に許容される塩、プロドラッグ、およびこれらの組合せが挙げられる。
細胞傷害剤の例は当業者に公知であり、例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、ウラムスチン、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、テモゾロミド、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、サトラプラチン、トリプラチン四硝酸塩、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、メトトレキサート、ペメトレキセド、６－メルカプトプリン、ダカルバジン、フルダラビン、５－フルオロウラシル、アラビノシルシトシン、カペシタビン、ゲムシタビン、デシタビン、ビンカアルカロイド、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、イキサベピロン（Ｉｘｅｍｐｒａ）、アクチノマイシン、アントラサイクリン、バルルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、その薬学的に許容される塩、プロドラッグ、およびこれらの組合せからなる群から選択されてもよい。
本発明に従う細胞傷害剤は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の阻害剤も含む。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の阻害剤の非限定的な例としては、Ａ－６７４５６３（ＣＡＳ番号５５２３２５－７３－２）、ＡＧＬ ２２６３、ＡＭＧ－３１９（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、Ｃａｌｉｆ．）、ＡＳ－０４１１６４（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イルメチレン－チアゾリジン－２，４－ジオン）、ＡＳ－６０４８５０（５－（２，２－ジフルオロ－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イルメチレン）－チアゾリジン－２，４－ジオン）、ＡＳ－６０５２４０（５－キノキシリン－６－メチレン－１，３－チアゾリジン－２，４－ジオン）、ＡＴ７８６７（ＣＡＳ番号８５７５３１－００－１）、ベンズイミダゾールシリーズ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＢＭＬ－２５７（ＣＡＳ番号３２３８７－９６－５）、ＢＶＤ－７２３、ＣＡＬ－１２０（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）、ＣＡＬ－１２９（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＡＬ－１３０（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＡＬ－２５３（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＡＬ－２６３（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＡＳ番号６１２８４７－０９－３、ＣＡＳ番号６８１２８１－８８－９、ＣＡＳ番号７５７４７－１４－７、ＣＡＳ番号９２５６８１－４１－０、ＣＡＳ番号９８５１０－８０－６、ＣＣＴ１２８９３０（ＣＡＳ番号８８５４９９－６１－６）、ＣＨ５１３２７９９（ＣＡＳ番号１００７２０７－６７－１）、ＣＨＲ－４４３２（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｌｔｄ．、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）、ＦＰＡ １２４（ＣＡＳ番号９０２７７９－５９－３）、ＧＳ－１１０１（ＣＡＬ－１０１）（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＧＳＫ ６９０６９３（ＣＡＳ番号９３７１７４－７６－０）、Ｈ－８９（ＣＡＳ番号１２７２４３－８５－０）、ホノキオール、ＩＣ８７１１４（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＰＩ－１４５（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ Ｉｎｃ．）、ＫＡＲ－４１３９（Ｋａｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｃｈｉｌｗｏｒｔｈ、ＵＫ）、ＫＡＲ－４１４１（Ｋａｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＫＩＮ－１（Ｋａｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＫＴ ５７２０（ＣＡＳ番号１０８０６８－９８－０）、ミルテホシン、ＭＫ－２２０６二塩酸塩（ＣＡＳ番号１０３２３５０－１３－２）、ＭＬ－９（ＣＡＳ番号１０５６３７－５０－１）、ナルトリンドール塩酸塩、ＯＸＹ－１１１Ａ（ＮｏｒｍＯｘｙｓ Ｉｎｃ．、Ｂｒｉｇｈｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）、ペリホシン、ＰＨＴ－４２７（ＣＡＳ番号１１９１９５１－５７－１）、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｎ．Ｊ．）のＰＩ３キナーゼデルタ阻害剤、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｉｎｃ．）のＰＩ３キナーゼデルタ阻害剤、Ｉｎｃｏｚｅｎ（Ｉｎｃｏｚｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．、Ｈｙｄｒａｂａｄ、Ｉｎｄｉａ）のＰＩ３キナーゼデルタ阻害剤、Ｉｎｃｏｚｅｎ（Ｉｎｃｏｚｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）のＰＩ３キナーゼデルタ阻害剤２、Ｒｏｃｈｅ－４（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｉｎｃ．）のＰＩ３キナーゼ阻害剤、Ｒｏｃｈｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｉｎｃ．）のＰＩ３キナーゼ阻害剤、Ｒｏｃｈｅ－５（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｉｎｃ．）のＰＩ３キナーゼ阻害剤、Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）のＰＩ３－アルファ／デルタ阻害剤、Ｃｅｌｌｚｏｍｅ（Ｃｅｌｌｚｏｍｅ ＡＧ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＰＩ３－デルタ阻害剤、Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）のＰＩ３－デルタ阻害剤、Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ－１（Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）のＰＩ３－デルタ阻害剤、Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ－２（Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）のＰＩ３－デルタ阻害剤、Ｃｅｌｌｚｏｍｅ（Ｃｅｌｌｚｏｍｅ ＡＧ）のＰＩ３－デルタ／ガンマ阻害剤、Ｃｅｌｌｚｏｍｅ（Ｃｅｌｌｚｏｍｅ ＡＧ）のＰＩ３－デルタ／ガンマ阻害剤、Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ Ｉｎｃ．）のＰＩ３－デルタ／ガンマ阻害剤、Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ Ｉｎｃ．）のＰＩ３－デルタ／ガンマ阻害剤、Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）のＰＩ３－デルタ／ガンマ阻害剤、Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）のＰＩ３－デルタ／ガンマ阻害剤、Ｅｖｏｔｅｃ（Ｅｖｏｔｅｃ）のＰＩ３－ガンマ阻害剤、Ｃｅｌｌｚｏｍｅ（Ｃｅｌｌｚｏｍｅ ＡＧ）のＰＩ３－ガンマ阻害剤、Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）のＰＩ３－ガンマ阻害剤、Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ－１（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ Ｉｎｃ．）のＰＩ３Ｋデルタ／ガンマ阻害剤、Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ－１（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ Ｉｎｃ．）のＰＩ３Ｋデルタ／ガンマ阻害剤、ピクチリシブ（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｉｎｃ．）、ＰＩＫ－９０（ＣＡＳ番号６７７３３８－１２－４）、ＳＣ－１０３９８０（Ｐｆｉｚｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）、ＳＦ－１１２６（Ｓｅｍａｆｏｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）、ＳＨ－５、ＳＨ－６、テトラヒドロクルクミン、ＴＧ１００－１１５（Ｔａｒｇｅｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、トリシリビン、Ｘ－３３９（Ｘｃｏｖｅｒｙ、Ｗｅｓｔ Ｐａｌｍ Ｂｅａｃｈ、Ｆｌａ．）、ＸＬ－４９９（Ｅｖｏｔｅｃｈ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、その薬学的に許容される塩、およびこれらの組合せが挙げられる。
併用療法における追加の薬剤は、植物または動物起源の毒物または毒液であってもよい。例は、ジフテリア毒素またはその部分である。他の例では、追加の薬剤は、「放射性核種」、すなわち、例えば、静脈内または経口的に患者へと投与される放射性物質であってもよく、その後、患者の正常な代謝を介して、標的臓器または組織へと浸透し、そこで、局所的な放射線を短時間にわたり送達する。放射性核種の例としては、以下に限定されないが、Ｉ－１２５、Ａｔ－２１１、Ｌｕ－１７７、Ｃｕ－６７、Ｉ－１３１、Ｓｍ－１５３、Ｒｅ－１８６、Ｐ－３２、Ｒｅ－１８８、Ｉｎ－１１４ｍ、およびＹ－９０が挙げられる。
「免疫調節薬」という用語は、免疫系が、それらの産生を誘発した抗原を認識し、これと反応する、抗体または感作細胞を産生する能力を、増進させるかまたは低減することにより、免疫応答を変化させる物質を意味する。免疫調節薬は、組換え調製物、合成調製物、または天然調製物であってもよく、サイトカイン、コルチコステロイド、細胞傷害剤、チモシン、および免疫グロブリンを含む。一部の免疫調節薬は、体内に天然で存在し、これらのうちのある特定のものは、薬理学的調製物中で利用可能である。免疫調節薬の例としては、以下に限定されないが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、ＬＡＧ－３、ＩＭＰ－３２１、ＪＣＡＲ－０１４、ＡＳＬＡＮ－００２（ＢＭＳ－７７７６０７）、インターフェロン、イミキモドおよび細菌に由来する細胞膜画分、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２６、ＣＸＣＬ７、合成シトシンリン酸－グアノシン（ＣｐＧ）、免疫チェックポイント阻害剤、およびこれらの組合せが挙げられる。特にリンホトキシンおよびＬｉＧＨＴを標的とする標的化サイトカイン療法は、本発明の組成物との組合せにおいても有用であり得る。
一部の併用処置において、追加の薬剤は、腫瘍細胞を放射線療法に対してより感受性にする「放射線増感剤」であってもよい。放射線増感剤の例としては、ミソニダゾール、メトロニダゾール、チラパザミン、およびｔｒａｎｓクロセチン酸ナトリウム、およびこれらの組合せが挙げられる。
また他の実施形態では、追加の薬剤は、新たな血管の成長を低減または阻害する「抗血管新生」剤、例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の阻害剤および内皮細胞遊走の阻害剤などである。抗血管新生剤としては、限定されないが、２－メトキシエストラジオール、アンギオスタチン、ベバシズマブ、軟骨由来血管新生阻害因子、エンドスタチン、ＩＦＮ－α、ＩＬ－１２、イトラコナゾール、リノマイド、血小板因子－４、プロラクチン、ＳＵ５４１６、スラミン、タスキニモド、テコガラン、テトラチオモリブデン酸、サリドマイド、トロンボスポンジン、トロンボスポンジン、ＴＮＰ－４７０、ジブ－アフリベルセプト、その薬学的に許容される塩、プロドラッグ、およびこれらの組合せが挙げられる。
特に好ましい実施形態では、本発明のＨＥＲ２標的化二重特異性組成物は、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１組成物、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０などと組み合わされてもよい。このような併用療法の特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＰＤ－１としても公知の細胞表面受容体プログラム細胞死タンパク質１のアンタゴニスト、およびＰＤ－Ｌ１のアンタゴニストと組み合わされてもよい。
ＰＤ－１は、免疫系を下方調節する際、およびＴ細胞炎症活性を抑制することによって自己寛容を促進する際に重要な役割を果たす。ＰＤ－１リガンド、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の、Ｔ細胞に見られるＰＤ－１受容体への結合により、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生が阻害される。ＰＤ－１リガンドの上方調節はいくつかの腫瘍において生じ、この経路を介するシグナル伝達は、腫瘍の活性Ｔ細胞免疫監視機構の阻害に寄与し得る。抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１受容体に結合し、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ３との相互作用をブロックし、抗腫瘍免疫応答を含む免疫応答のＰＤ－１経路を媒介する阻害を解除する。
当業者は、使用することができる様々な抗ＰＤ－１抗体を知っている。一部の実施形態では、本発明の化合物と組み合わせて使用される例示的な抗ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））である。他の実施形態では、上記の化合物と組み合わせて使用される抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））である。他の実施形態では、上記の化合物と組み合わせて使用される抗ＰＤ－１抗体は、ピディリズマブ（Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）である。
当業者に公知の追加のＰＤ－１抗体としては、ＡＧＥＮ－２０３４（Ａｇｅｎｕｓ）、ＡＭＰ－２２４（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、ＢＣＤ－１００（Ｂｉｏｃａｄ）、ＢＧＢＡ－３１７（Ｂｅｉｇｅｎｅ）、ＢＩ－７５４０９１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＣＢＴ－５０１（Ｇｅｎｏｒ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）、ＣＣ－９０００６（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、セミプリマブ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、デュルバルマブ＋ＭＥＤＩ－０６８０（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、ＧＬＳ－０１０（Ｈａｒｂｉｎ Ｇｌｏｒｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＢＩ－３０８（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＪＮＪ－３２８３（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＪＳ－００１（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｕｎｓｈｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．）、ＭＥＤＩ－０６８０（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、ＭＧＡ－０１２（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、ＭＧＤ－０１３（Ｍａｒｃｏｇｅｎｉｃｓ）、パゾパニブ塩酸塩＋ペムブロリズマブ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＤＲ－００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＦ－０６８０１５９１（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＲＥＧＮ－２８１０（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ＳＨＲ－１２１０（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｏ．）、ＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ Ｉｎｃ．）、ＬＺＭ－００９（Ｌｉｖｚｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ）およびＡＢＢＶ－１８１（ＡｂｂＶｉｅ Ｉｎｃ）が挙げられる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
本発明の併用療法に関する好ましい一実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））である。
他の実施形態では、本発明の組成物は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わされる。本発明の組合せにおいて使用されるこのような例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、デュルバルマブ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ ＬＬＣ）、アテゾリズマブ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ，Ｃｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ Ｌｔｄ）、アベルマブ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）、ＣＸ－０７２（ＣｙｔｏｍＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ）、ＢＭＳ－９３６５５９（ＶｉｉＶ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｔｄ）、ＳＨＲ－１３１６（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｏ Ｌｔｄ）、Ｍ－７８２４（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）、ＬＹ－３３０００５４（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ）、ＦＡＺ－０５３（Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＧ）、ＫＮ－０３５（ＡｌｐｈａＭａｂ Ｃｏ Ｌｔｄ）、ＣＡ－１７０（Ｃｕｒｉｓ Ｉｎｃ）、ＣＫ－３０１（ＴＧ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ）、ＣＳ－１００１（ＣＳｔｏｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏ Ｌｔｄ）、ＨＬＸ－１０（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈｅｎｌｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ Ｌｔｄ）、ＭＣＬＡ－１４５（Ｍｅｒｕｓ ＮＶ）、ＭＳＢ－２３１１（ＭａｂＳｐａｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓｕｚｈｏｕ）Ｃｏ Ｌｔｄ）およびＭＥＤＩ－４７３６（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）からなる群から選択されてもよい。
ある特定の他の実施形態では、本発明の併用療法は、他のＨＥＲ２直接療法を含んでもよい。例えば、本発明の組成物をトラスツズマブおよびトラスツズマブ、トラスツズマブベースのＡＤＣ、Ｋａｄｃｙｌａ、Ｅｎｈｅｒｔｕなどの関連するＨＥＲ２ベースの（すなわち、トラスツズマブエピトープを標的とするもの）治療、ラパチニブ、ネラチニブ、ツカチニブなどのＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤、ＴＬＲ、およびサイトカインなどのイムノコンジュゲートを標的とするＨＥＲ２と組み合わせるのが有利である場合がある。本発明の組成物との組合せにおいて有用であり得る他の免疫療法およびチェックポイント阻害剤ベースの療法としては、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＴＩＭ３ベースの療法が挙げられる。本発明の組成物は、ＣＡＲ－Ｔ、ＮＫ、またはＴ細胞ベースの療法、および免疫療法ワクチンとさらに組み合わされてもよい。サイトカインおよびサイトカインを標的とする療法との組合せも企図される。特に興味深いのは、ＴＧＦｂ、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ１～３ならびにアバスチン、ラムシルマブ、またはアキシチニブ、レンバチニブ、カボザンチニブ、レゴラフェニブ、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｂ）、ソラフェニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤などの抗血管新生標的化療法の使用であり得る。他の実施形態では、ＣＤＫ４／６阻害剤、例えば、パルボシクリブなどが使用されてもよい。セツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ、およびオシメルチニブなどのＥＧＦＲ阻害剤も併用療法において有用であり得る。
以下は、本開示の組成物および組成物の評価の例である。様々な他の実施形態が、上記で提供された一般的な説明を考慮して実践され得ることが理解される。
（実施例１）
汎用ＸＴＥＮからの最小限の突然変異によるバーコード付きＸＴＥＮの設計
この実施例は、汎用ＸＴＥＮ（本明細書で上記の表３ｂのうちの１つなど）のアミノ酸配列を最小限に突然変異させることによるバーコード付きＸＴＥＮへの例示的な設計アプローチを例示する。最小限の突然変異を実施するための関連基準には、以下のもののうちの１つまたは複数が含まれる：（ａ）対応するＸＴＥＮの配列変化を最小限にすること；（ｂ）対応するＸＴＥＮのアミノ酸組成の変化を最小限にすること；（ｃ）対応するＸＴＥＮの正味電荷を実質的に維持すること；（ｄ）対応するＸＴＥＮの低い免疫原性を実質的に維持すること；（ｅ）ＸＴＥＮによって与えられる薬物動態特性を実質的に維持すること。
例えば、表９の汎用ＸＴＥＮに対して、グルタミン酸残基の欠失、グルタミン酸残基の挿入、グルタミン酸残基の置換、もしくはグルタミン酸残基への置換、またはこれらの任意の組合せを含む１つまたは複数の突然変異を実施することによって、バーコード付きＸＴＥＮを構築した。
表９． バーコード付きＸＴＥＮの操作のために使用される４種の汎用ＸＴＥＮ
Figure 2023531494000074
Figure 2023531494000075
（実施例２）
生物学的に活性なポリペプチド（「ＢＰ」）に融合させるためのバーコード付きＸＴＥＮの配列分析およびその選択
この実施例は、生物学的に活性なポリペプチドに融合させるためのバーコード付きＸＴＥＮ（および２つ以上のバーコード付きＸＴＥＮをセットにしたアセンブリー）の設計および選択を例示する。ＸＴＥＮ内のバーコード断片の位置およびＸＴＥＮが生物学的に活性なタンパク質に融合されてＸＴＥＮ含有構築物（例えば、ＸＴＥＮ化プロテアーゼ活性化Ｔ細胞エンゲージャー（ＸＰＡＴ））を形成する方法に応じて、バーコード断片はＸＴＥＮの切断を示し得る。
２つの例示的なＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ８６４およびＸＴＥＮ２８８＿１）に関して、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでＧｌｕＣ消化分析を実施し、ＸＴＥＮの完全なＧｌｕＣ消化の際に放出可能であるペプチド断片を同定した。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析では、連続したグルタミン酸残基（例えば、「ＥＥ」）を有するＸＴＥＮに関して、ＧｌｕＣがグルタミン酸残基のいずれか１つの後で切断される可能性があることを考慮に入れている。以下の表１０にまとめた結果において示されているように、１０ｍｅｒのペプチド配列「ＴＰＧＴＳＴＥＰＳＥ」（配列番号９６）および１４ｍｅｒのペプチド配列「ＧＳＡＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥ」（配列番号９７）はそれぞれ、長いほうのＸＴＥＮ８６４に１回だけ出現し、他のすべてのペプチド配列は、ＸＴＥＮ８６４に２回またはそれより多い回数出現している。そして、１４ｍｅｒのペプチド配列「ＧＳＡＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥ」（配列番号９７）も、短い方のＸＴＥＮ２８８＿１に１回だけ出現する。
候補バーコードの特有性は、ＸＴＥＮを含有する構築物から放出可能である他のすべてのペプチド断片との関係で評価される。したがって、１つのＸＴＥＮ内のバーコード配列は、その中に含有される任意の他のＸＴＥＮ、その中に含有される生物学的に活性なタンパク質、またはその隣接する構成成分間の接続を含む、ＸＴＥＮ含有構築物の他のどこにも存在することができない。例えば、表１１は、２つのＸＴＥＮのセットに対するペプチドの「特有性」の表を示す。ＸＴＥＮ８６４とＸＴＥＮ２８８の両方に存在するため、１４ｍｅｒのペプチド配列「ＧＳＡＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥ」（配列番号９７）は、ＸＴＥＮ８６４とＸＴＥＮ２８８の両方を含むＸＴＥＮのセットに対して特有ではなく、よって、２つのＸＴＥＮ配列の両方を含有するポリペプチド産物の切断を検出するためのバーコードとして使用できないかもしれない。
バーコード（またはバーコードのセット）の選択は、ＸＴＥＮ内の候補バーコードの適切な位置または場所を特定および決定することをさらに含んでもよい。候補バーコードの位置または場所は、ＸＴＥＮ（および全体としてのＸＴＥＮ含有構築物）の薬理学的関連情報、例えば臨界長を超えるＸＴＥＮの切断および／またはＸＴＥＮ配列における欠失と関連付けることができる。１０ｍｅｒのペプチド「ＴＰＧＴＳＴＥＰＳＥ」（配列番号９６）は、ＸＴＥＮ８６４がＸＴＥＮ含有物のＮ末端に配置され、生成物のＮ末端からの２３８アミノ酸の切断が生成物の薬理特性に大きな影響を与えない場合には、好適なバーコード断片として機能し得る。
表１０． ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＧｌｕＣ消化分析のための代表的なＸＴＥＮ配列
Figure 2023531494000076
 表１１． ペプチド「特有性」分析
Figure 2023531494000077
Figure 2023531494000078
 アンダーラインを付した配列はすべて特有のＧｌｕＣペプチドを生じる
非－ＸＴＥＮコアは下線およびイタリック
バーコードペプチドは太字である
例示的なバーコードペプチド配列は、以下の表１２において例示されている。これらのバーコード配列は、式（Ｉ）に従って隣接される：
ＡＡＡ－Ｇｌｕ－バーコードペプチド－ＢＢＢ、
式中、「ＡＡＡ」はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＰｒｏを表し、「ＢＢＢ」はＧｌｕＣ消化によるバーコードペプチドの効率的な放出を促進するように構成されたＧｌｙ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒを表す。注目すべきは、ＸＴＥＮにおける各バーコードペプチドの挿入により、挿入されたバーコードペプチドの直前または直後に、さらに特有の配列が生じる可能性があることである。
表１２． バーコードペプチドの非限定的な例のリスト
Figure 2023531494000079
（実施例３）
ＸＴＥＮ化ポリペプチド構築物の全配列におけるＸＴＥＮの設計および選択
この実施例は、Ｎ末端の一方とＣ末端の他方の２つのＸＴＥＮを含有するポリペプチド構築物の全配列の設計を例示している。
以下の表１３は、代表的なバーコード付きＢＰＸＴＥＮ（Ｎ末端とＣ末端の両方にバーコード付きＸＴＥＮを含有する）と参照ＢＰＸＴＥＮ（Ｎ末端とＣ末端の両方に汎用ＸＴＥＮを含有する）において使用されるＸＴＥＮ配列を例示している。代表的なバーコード付きＢＰＸＴＥＮでは、ＢＰのＮ末端にバーコード付きＸＴＥＮ（配列番号８０１４）が融合されており、ＢＰのＣ末端に別のバーコード付きＸＴＥＮ（配列番号８０１５）が融合されている。参照ＢＰＸＴＥＮでは、ＢＰのＮ末端に「Ｒｅｆ－Ｎ」ＸＴＥＮが融合されており、ＢＰのＣ末端に「Ｒｅｆ－Ｃ」ＸＴＥＮが融合されている。「Ｒｅｆ－Ｎ」ＸＴＥＮは、バーコード付きＸＴＥＮ配列番号８０１４と同等の長さであり；「Ｒｅｆ－Ｃ」ＸＴＥＮは、バーコード付きＸＴＥＮ配列番号８０１５と同等の長さである。バーコード付きＢＰＸＴＥＮと参照ＢＰＸＴＥＮはそれぞれ、ＢＰ構成成分中に参照配列を含有する。参照配列は特有であり、ＧｌｕＣプロテアーゼによって完全に消化される際に、対応するＢＰＸＴＥＮから放出可能である他のすべてのペプチド断片とは分子量が異なる（例えば、実施例５による）。参照配列の特有性は、ＢＰＸＴＥＮ構築物から放出可能である他のすべてのペプチド断片との関係で評価される。
表１３． 全長ＢＰＸＴＥＮ構築物において使用されるＮ末端およびＣ末端のＸＴＥＮの代表的セット
＊バーコードペプチドは太字である
アンダーラインを付した配列はすべて特有のＧｌｕＣペプチドを生じる；
Figure 2023531494000080
（実施例４）
バーコード付きＸＴＥＮ化融合ポリペプチドの組換え構築および生成
実施例４は、本明細書で開示される方法を使用する、Ｃ末端にバーコード付きＸＴＥＮ、Ｎ末端に別のバーコード付きＸＴＥＮを含有するＸＴＥＮ化融合ポリペプチドの組換え構築、生成、および精製を例示する。
発現：抗ＣＤ３配列（例えば、表６ａ～６ｅに記載）、抗ＨＥＲ２配列（例えば、表６ｆに記載）、Ｃ末端にバーコード付きＸＴＥＮ（例えば、表３ａに記載）、およびＮ末端にバーコード付きＸＴＥＮ（例えば、表３ａに記載）を含有するＸＴＥＮ化融合ポリペプチドをコードする構築物は、占有のＥ．ｃｏｌｉ ＡｍＥ０９８株で発現され、Ｎ末端の分泌リーダー配列（ＭＫＫＮＩＡＦＬＬＡＳＭＦＶＦＳＩＡＴＮＡＹＡ）（配列番号１００）を介してペリプラズムに分配され、これはトランスロケーション中に切断される。発酵培養物は、動物を含まない複合培地を用いて３７℃で増殖させ、リン酸塩枯渇の前に２６℃に温度シフトさせる。採取中、発酵の全ブロスは、細胞をペレット化するために遠心分離される。採取の際に、総体積と細胞湿重量（ＷＣＷ：上清に対するペレットの比）を記録し、ペレット化した細胞を収集して－８０℃で凍結させる。
回収：凍結した細胞ペレットを、Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭのクエン酸）に再懸濁させ、３０％の細胞湿重量を目標とする。再懸濁液はｐＨ４．４で平衡化させ、出力温度がモニターされ、１５±５℃に維持されている間に、１７，０００±２００ｂａｒでホモジナイズする。ホモジネートのｐＨは規定範囲内であることが確認されている（ｐＨ４．４±０．１）。
清澄化：エンドトキシンおよび宿主細胞の不純物を低減するために、ホモジネートを低温（１０±５℃）、酸性（ｐＨ４．４±０．１）で一晩（１５～２０時間）凝結させる。不溶性画分を除去するために、凝結したホモジネートを８，０００ＲＣＦで、２～８℃にて４０分間遠心分離し、上清を保持する。核酸、脂質、およびエンドトキシンを除去するため、および濾過助剤として作用させるために、上清を０．１％（ｍ／ｍ）の珪藻土に対して調整する。濾過助剤を懸濁化させるために、上清をインペラによって混合し、３０分間平衡化させる。デプスフィルターと、それに続く０．２２μｍのフィルターからなるフィルタートレインを組み立て、次いで、ＭＱでフラッシングする。上清を、２５±５ｐｓｉｇの圧力損失を維持するように流量をモジュレートしながら、フィルタートレインを通してポンプで送る。
精製
プロテインＬによる捕捉：宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、および核酸を除去するために、ＢＰＸＴＥＮ分子のａＨＥＲ２ ｓｃＦｖ内に存在するカッパドメインを捕捉するために、プロテインＬを使用する。プロテインＬ固定相（Ｔｏｓｏｈ ＴＰ ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ｌ－６５０Ｆ）、プロテインＬ移動相Ａ（１１．５ｍＭのクエン酸、２４．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のポリソルベート８０、ｐＨ５．０）、およびプロテインＬ移動相Ｂ（１１ｍＭのリン酸、０．００５％のポリソルベート８０、ｐＨ２．０）がここで使用される。カラムは、プロテインＬ移動相Ａで平衡化される。濾液はｐＨ５．５±０．２に調整し、２～４ｇ／Ｌ－レジンを目標としてプロテインＬカラムにロードし、次いで、２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）が（ローカル）ベースラインに戻るまでプロテインＬ移動相Ａを用いて追跡する。結合した物質を移動相Ｂで溶出し、０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４を０．４ＣＶでプレスパイクした２ＣＶ画分として収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析する。
Ｃタグ中間体の精製：Ｃ末端の完全性を確保するために、Ｃタグ親和性クロマトグラフィーを使用してＣ末端－ＥＰＥＡタグを捕捉する。ここでは、Ｃタグ固定相（Ｔｈｅｒｍｏ ＣタグＸＬ）、Ｃタグ移動相Ａ（５０ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のポリソルベート８０、ｐＨ６．５）、およびＣタグ移動相Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、０．６ＭのＭｇＣｌ２、０．００５％のポリソルベート８０、ｐＨ７．０）を使用する。Ｃタグ移動相Ａを用いてカラムを平衡化する。ＩＭＡＣ溶出液を、２ｇ／Ｌ－レジンを標的とするＣタグカラムにロードし、２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）が（ローカル）ベースラインに戻るまでＣタグ移動相Ａを用いて追跡する。結合した物質はＣタグ移動相Ｂで溶出される。Ｃタグ溶出液は２ＣＶフラクションとして収集され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析される。
ＡＥＸポリッシング：モノマー生成物からダイマーと凝集物を分離するために、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーを利用し、電気陰性であるＮ末端とＣ末端のＸＴＥＮドメインを捕捉する。ここでは、ＡＥＸ１固定相（ＢＩＡ ＱＡ－８０）、ＡＥＸ１移動相Ａ（５０ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のポリソルベート８０、ｐＨ６．５）、およびＡＥＸ１移動相Ｂ（５０ｍＭのヒスチジン、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のポリソルベート８０、ｐＨ６．５）が使用される。ＡＥＸ移動相Ａを用いてカラムを平衡化する。Ｃタグ溶出液を、ＭＱを用いて１０ｍＳ／ｃｍに希釈し、２ｇ／Ｌ－レジンを目標としてロードし、次いで、２８０ｎｍの吸光度が（ローカル）ベースラインに戻るまでＡＥＸ移動相Ａを用いて追跡する。結合した物質を６０ＣＶで０％のＢ～１００％のＢの勾配で溶出する。Ａ２８０が（ローカル）ベースラインより２ｍＡＵ以上高い間に、画分を１ＣＶのアリコートに収集する。溶出画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥ－ＨＰＬＣで分析し、９８％以上がモノマーであることが判明した画分をプールし（ＡＥＸ Ｐｏｏｌ）、さらに処理する。
製剤化：生成物を製剤用緩衝剤に交換し、生成物を目標濃度（０．５ｇ／Ｌ）にするために、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）を使用する。０．１ｍ２の面積および１５ｐｓｉのＴＭＰ標的を有する１０ｋＤａの膜を使用して、ＡＥＸプールを０．５ｇ／Ｌに濃縮し、次いで、Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のポリソルベート８０、ｐＨ６．５）で１０倍希釈する。ＡＥＸプールを１０倍濃縮し、さらに２回１０倍希釈する。回収した製剤化された生成物を、ＢＳＣ内で０．２２μｍで濾過し、アリコートとし、標識し、バルク原薬（ＢＤＳ）として－８０℃で保存する。ＢＤＳは、様々な分析方法によって、すべてのロット出荷基準を満たすことが確認される。全体的な品質はＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、ダイマーおよび凝集物に対するモノマーの比はＳＥ－ＨＰＬＣで分析し、Ｎ末端の品質と製品の均質性はＨＩ－ＨＰＬＣで分析する。同一性はＥＳＩ－ＭＳによって確認する。
（実施例５）
プロテアーゼ消化によるバーコードペプチドの放出
この実施例は、本明細書で開示される方法を使用する、ＸＴＥＮ含有構築物の様々な長さまたは切断形態を含有するポリペプチド混合物からのバーコード断片および参照断片の放出について例示する。
ＸＴＥＮ含有構築物の試料は、ＤＴＴ、次いで、ヨードアセトアミドで順次インキュベートすることで還元およびアルキル化される。次いで、試料を緩衝剤交換し、サイズ排除スピンカートリッジを使用して脱塩させる。Ｇｌｕ－Ｃプロテアーゼを基質に対する酵素の比が１：５で試料に添加し、試料を３７℃でインキュベートし、消化させる。次いで、試料を４℃に移してタンパク質分解反応を停止させ、オートサンプラーバイアルに入れて、分析する。
（実施例６）
バーコードペプチドおよび参照ペプチドの検出および定量化
この実施例は、個々のバーコードペプチドの定量測定値を作成するために使用される質量分析方法を例示する。ＬＣ－Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＰＲＭ）法は、高分解度精密質量（ＨＲＡＭ）質量分析計にプログラムされている。従来のＤａｔａ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（ＤＤＡ）質量分析法とは異なり、ＰＲＭ法は１回のランで１５～３０種類のペプチドの特定のセットに焦点を当て、デューティサイクルごとに一回、ＭＳ－ＭＳによってそれぞれをシーケンシングする。そのため、この方法では、インタクトなペプチドの断片化されていない前駆体イオンと、その配列を確認するためのペプチドの各断片イオンについて、ｅＸｔｒａｃｔｅｄ Ｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ（ＸＩＣ）が生じる。断片イオンのＸＩＣは、前駆体イオン断片より高感度で選択的に定量的であることが多い。使用したＬＣ－ＰＲＭ法には、７種類のバーコードペプチドの軽鎖バージョンと重鎖バージョンが含まれる。これらの１４種類のペプチドのすべての断片イオンのクロマトグラフピーク面積を取得後に測定し、最も強い断片イオンを定量測定に使用する。次いで、ＰＡＴバーコードペプチドに対するＸＴＥＮバーコードペプチドのピーク面積比が、ＸＴＥＮ分子にわたる様々な点での相対的なＸＴＥＮ：ＰＡＴ存在量について計算される。
（実施例７）
質量分析（ＭＳ）によりペプチドを定量化するための安定な同位体標識化
この実施例は、ＸＴＥＮ含有ポリペプチド由来のバーコードペプチドの絶対的（相対的ではなく）定量化を可能にする安定な同位体標識化スキームを例証する。Ｃ末端のグルタミン酸が（１３Ｃ）５Ｈ７（１５Ｎ）Ｏ３重標識アナログで置き換えられたバーコードペプチドの合成アナログが専門業者から調達される標準的な重標識アミノ酸定量スキームを用いることになる。既知量のＸＴＥＮバーコード含有ポリペプチドが、重標識合成ペプチドが一定濃度で保持されるマトリックス中に、連続的に希釈された場合の検量線を作成する。この検量線からクロマトグラフィーピーク面積の重：軽比率を、同じスパイクレベルの重標識ペプチドを含有する研究試料に対して較正することによって、正確な定量を実施することができる。
（実施例８）
ＸＴＥＮ含有ポリペプチドの切断の定量化
この実施例は、ＸＴＥＮ含有ポリペプチドの混合物中の長さバリアントまたは切断バリアントの定量化について例証する。
例えば、バーコードペプチド「ＳＧＰＧＳＴＰＡＥＳＧＳＥ」（配列番号１５０）は、実施例３に記載され、実施例３から得られた代表的なバーコード付きＢＰＸＴＥＮ配列中に位置する７６のアミノ酸であり、ＢＰＸＴＥＮのＮ末端でＸＴＥＮの重度の切断を示す。潜在的なバーコード断片「ＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＳＧＴＳＥ」（配列番号１５１）がＮ末端に位置することも考慮する。実施例６の手順の後に、生物学的に活性なタンパク質（例えば、ｓｃＦｖ断片）の配列からの特有の参照ペプチド配列に対する各バーコードペプチドの存在量の測定比率は、全長ポリペプチドと、試料混合物中の薬理学的有効性に影響を及ぼし得る切断を有するバリアントとの合計量を示す。少なくとも１つの参照断片の存在量の測定を使用して、試料混合物中のポリペプチドのすべてのバリアントの合計量を示す。したがって、参照断片とバーコード断片の間の存在量の差は、切断されたポリペプチドバリアントの量を知らせる。ＬＣ－ＭＳデータを分析し、参照断片に対するバーコード断片の量の比率を決定し、ポリペプチド混合物中の薬理学的に有効なバリアントの相対量を示す。
２つ（または３つ）のバーコードのセットを使用して、ポリペプチドの切断の異なるレベルを示す。ＬＣ－ＭＳデータを使用し、参照断片の量に対する各バーコード断片の量の比率を決定し、それによって、ポリペプチド混合物中の切断バリアントの分布を定量化する。
（実施例９）
標的細胞に対するＸＴＥＮ化（マスクされた）および脱ＸＴＥＮ化（マスクされていない、活性化）ＸＰＡＴ（プロテアーゼ活性化Ｔ細胞エンゲージャー）のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性
この実施例は、一般にＸＴＥＮ化プロテアーゼ活性化Ｔ細胞エンゲージャー（「ＸＰＡＴ」）への、および特にＨＥＲ２－ＸＰＡＴへのＸＴＥＮによるマスクを例証する。この実施例は、ＸＴＥＮ化（マスクされた）ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ（例えば、表Ｄに記載のように）および対応する脱ＸＴＥＮ化（マスクされていない）ＨＥＲ２－ＰＡＴの細胞傷害性の差を例証する。
ＸＴＥＮ化ＰＡＴ（表Ｄに記載のように）および対応する脱ＸＴＥＮ化ＰＡＴ（プロテアーゼ処理済）の細胞傷害性を、処理後に溶解した標的細胞のウェルに存在するＡＴＰの量を細胞生存率の測定代理として利用するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを使用して決定した。ＨＥＲ２発現標的細胞を白色不透明の底プレートに様々な密度（ＢＴ４７４：２０ｋの細胞／ウェル、およびＳＫＯＶ３：１０ｋの細胞／ウェル）で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩（１８～２４時間）インキュベートさせた。一晩のインキュベーションの終了前に、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を解凍し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ＰＢＭＣは、スクリーニングされた健康なドナーから、全血またはＢｉｏＩＶＴから入手したリンパ球濃縮バフィーコート調製物のいずれかからＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって単離された。１０ＸのＸＴＥＮ化および脱ＸＴＥＮ化ＰＡＴの滴定を、ＸＴＥＮ化ＰＡＴについては２４００ｎＭ、脱ＸＴＥＮ化ＰＡＴについては１０ｎＭの開始濃度で、９点３倍滴定（１０点目は未処置）を使用して調製した。ＰＢＭＣをウェルに１：１のエフェクター：標的の比率で播種した。１０ＸのＸＴＥＮ化および脱ＸＴＥＮ化ＰＡＴの滴定を、それぞれ２４０ｎＭおよび１ｎＭの開始濃度に対して、ウェル中に１０倍希釈した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベーション後に、プレートを１ＸのＰＢＳで３回洗浄し、１００μＬの１ＸのＰＢＳをすべてのウェルに添加した。１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光基質溶液をすべてのウェルに添加し、プレートを室温で１～５分間インキュベートした。次いで、３００～５００ｒｐｍで３０～６０秒間プレートをプレート振盪機で振盪して、ウェルの内容物を混合し、次いで、積分時間１００ｍｓを使用してルミノメータで読み取った。生じたシグナルの強度は、ウェル中に存在する生細胞の量に相関する。すべての非処置ウェルからのシグナルの平均を計算し、処置ウェルからの生細胞％を決定するために使用した（（処置シグナル／非処置シグナルの平均）＊１００＝生細胞％）。生存％を濃度別にプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用する４パラメーターロジスティック回帰式を用いて半数最大応答（ＥＣ５０）値を導出した。
ＸＴＥＮ化ＰＡＴと対応する脱ＸＴＥＮ化ＰＡＴは、試験したすべてのＨＥＲ２発現細胞系に関して細胞傷害性の大きな差異を示し、ＸＴＥＮ化によってマスクされた二重特異性抗体（不活性化状態）の細胞溶解活性の低下がもたらされることを確認した。図５Ａ～５Ｂに示されているように、ＢＴ－４７４およびＳＫ－ＯＶ－３細胞に関する脱ＸＴＥＮ化（マスクされていない、活性化）ＰＡＴの細胞傷害性は、用量依存的に観察され、０．３ｎＭで最大約８０％の死滅が観察された。図５Ａ～５Ｂに示されているように、脱ＸＴＥＮ化ＰＡＴは、４．８ｐＭ（ＢＴ４７４）および３．４ｐＭ（ＳＫＯＶ３）のＥＣ５０値を示し、一方、ＸＴＥＮ化ＰＡＴは４９，３７０ｐＭ（ＢＴ４７４）および４４，４７４ｐＭ（ＳＫＯＶ３）のＥＣ５０値を示した。この観察により、脱ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＰＡＴはＨＥＲ２発現を有する細胞系に関して細胞傷害活性を有し、ＸＴＥＮ化により免疫シナプスを形成する能力がマスクされ（保護され）、細胞傷害性の低下がもたらされることが確証される。
（実施例１０）
低レベルの標的抗原を発現する標的細胞に対するＸＴＥＮ化（マスクされた）および脱ＸＴＥＮ化（マスクされていない、活性化）ＸＰＡＴのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性
実施例１０ａ：
正常なヒト心筋細胞は、低レベルのＨＥＲ２を発現し、その結果、いくつかのＨＥＲ２標的化治療で処置した患者において、まれに心毒性が観察される。ＨＥＲ２標的化剤の公知の可能な心毒性を考慮して、ＨＥＲ２を発現するヒト心筋細胞に対するＡＭＸ－８１８の毒性を評価した。非ヒト霊長類（ＮＨＰ）前臨床研究における心毒性の欠如と一致して、ＡＭＸ－８１８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏではマイクロモル用量であってもヒト心筋細胞に対する限定された細胞傷害性を示した。対照的に、マスクされていないＴＣＥの対応物では、有意に高い細胞傷害活性を実証した（ＥＣ５０ 約１００ｐＭ）。
この実施例は、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ（例えば、表Ｄに記載）およびその活性タンパク質分解産物である対応するＨＥＲ２－ＰＡＴの漸増濃度に応じて、Ｔ細胞誘導性細胞傷害に対する初代心筋細胞の感受性を例証する。
ＦｕｊｉＦｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓから購入した正常ヒト心筋細胞を使用した。心筋細胞（ｉＣｅｌｌ心筋細胞、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、液体窒素から蘇生させ、９６ウェル当たり２０，０００細胞で７日間プレーティングし、製造業者の使用説明書により処置した。ヒト末梢血リンパ球をｉＣｅｌｌ心筋細胞上に、ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＸＰＡＴまたは対応する脱ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＰＡＴの濃度を３倍増加させながら、エフェクター：標的比１：１で添加し、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。アッセイは、ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地と１０％熱不活性化ウシ胎仔血清中で実施した。心筋細胞生存率はＡＴＰ定量化により決定し、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施した。細胞上清を吸引し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、吸引し、続いてＰＢＳ（各ウェル１００μｌ）を添加した。自動プレート洗浄は、ＬＳ４０５マイクロプレートウォッシャーディスペンサー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して行った。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を添加し（ウェル当たり１００μｌ）、アッセイプレートを室温で５分間インキュベートした。発光は、発光検出器付きのマルチラベルリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて定量化した。細胞傷害性の分析のために、相対発光単位（ＲＬＵ）から、生細胞の％を算出した。生存の％＝（試験ウェルのＲＬＵ／標的細胞のみのＲＬＵ）＊１００。ＥＣ５０の決定のために、データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで変換し、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３．１ソフトウェア‘ｌｏｇ（アゴニスト）対応答－可変的傾き（４つのパラメーター）で分析した。
図６Ａに示されているように、心筋細胞は、約６４ｐＭのＥＣ５０濃度の脱ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＰＡＴに応答して、Ｔ細胞誘導性細胞溶解によって死滅したが、心筋細胞は、１μＭ程度の高濃度のＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＸＰＡＴによる死滅に対しては不応性のままであり、ＸＴＥＮ化ＰＡＴが、がん細胞系と比較して、心筋細胞における活性が低いことを示した。
実施例１０ｂ：この実施例は、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ（例えば、表Ｄに記載）およびその活性タンパク質分解産物である対応するＨＥＲ２－ＰＡＴの漸増濃度に応答した、Ｔ細胞誘導性細胞傷害に対する、比較的低レベルのＨＥＲ２発現しか有さない別の細胞系、ＭＣＦ－７の感受性を例証する。
ＭＣＦ－７細胞を確立されたプロトコールに従って培養した。濃度－応答曲線およびＥＣ５０値を測定し、実施例１０ａにおいて概説したプロセスに従って分析した。
図６Ｂに示されているように、ＭＣＦ－７細胞は、０．０１ｎＭから０．１ｎＭの間のＥＣ５０濃度のタンパク質分解により脱ＸＴＥＮ化されたＨＥＲ２－ＸＰＡＴ（塗りつぶした丸）に応答してＴ細胞誘導性細胞溶解によって効果的に死滅した。ＨＥＲ２－ＸＰＡＴでのＸＴＥＮ化（例えば、表Ｄに記載）によって、用量－応答曲線（塗りつぶした四角）の右方シフトによって示されているように、少なくとも１０４倍、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を低減した。
実施例１０ｃ：
この実施例は、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ（例えば、表Ｄに記載）およびその活性タンパク質分解産物である対応するＨＥＲ２－ＰＡＴの漸増濃度に応答した、Ｔ細胞誘導性細胞傷害に対する、中程度のレベルのＨＥＲ２を発現する別の細胞系、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３の感受性を例証する。ＭＤＡ－ＭＢ－４５３は、中程度のＨＥＲ２発現を有する乳がん細胞系である。
ＸＴＥＮ化ＰＡＴ（表Ｄに記載のように）および対応する脱ＸＴＥＮ化ＰＡＴ（プロテアーゼ処理済）の細胞傷害性を、処理後に溶解した標的細胞のウェルに存在するＡＴＰの量を細胞生存率の測定代理として利用するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを使用して決定した。ＨＥＲ２発現標的細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－４５３系）を白色不透明の底プレートに１０ｋ細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩（１８～２４時間）インキュベートさせた。一晩のインキュベーションの終了前に、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を解凍し、３７℃、５％ＣＯ２で３～４時間インキュベートした。ＰＢＭＣは、スクリーニングされた健康なドナーから、全血またはＢｉｏＩＶＴから入手したリンパ球濃縮バフィーコート調製物のいずれかからＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって単離された。１０ＸのＸＴＥＮ化および脱ＸＴＥＮ化ＰＡＴの滴定を、ＸＴＥＮ化ＰＡＴについては３０００ｎＭ、脱ＸＴＥＮ化ＰＡＴについては１０ｎＭの開始濃度で、７点５倍滴定を使用して調製した。ＰＢＭＣをウェルに１０：１のエフェクター：標的の比率で播種した。１０ＸのＸＴＥＮ化および脱ＸＴＥＮ化ＰＡＴの滴定を、それぞれ３００ｎＭおよび１ｎＭの開始濃度に対して、ウェル中に１０倍希釈した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベーション後に、プレートを１ＸのＰＢＳで３回洗浄し、１００μＬの１ＸのＰＢＳをすべてのウェルに添加した。１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光基質溶液をすべてのウェルに添加し、プレートを室温で１～５分間インキュベートした。次いで、３００～５００ｒｐｍで３０～６０秒間プレートをプレート振盪機で振盪して、ウェルの内容物を混合し、次いで、積分時間１００ｍｓを使用してルミノメータで読み取った。生じたシグナルの強度は、ウェル中に存在する生細胞の量に相関する。すべての非処置ウェルからのシグナルの平均を計算し、処置ウェルからの生細胞％を決定するために使用した（（処置シグナル／非処置シグナルの平均）＊１００＝生細胞％）。生存％を濃度別にプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用する４パラメーターロジスティック回帰式を用いて半数最大応答（ＥＣ５０）値を導出した。
脱ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ（塗りつぶした丸）およびＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＰＡＴ（塗りつぶした四角）に関する濃度－応答曲線を、それぞれ図６Ｃに示す。
本明細書において試験した細胞系のＨＥＲ２発現レベルは当技術分野において公知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｅｎｄｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ． （Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １， ２０１３；１２（９）：１８１６－１８２８）は、図１Ｅの様々な細胞の平均ＨＥＲ２レベルについて詳述する（Ｘ軸は、細胞当たりのＨＥＲ２受容体の数を示す）。ＢＴ－４７４は、「３＋」という比較的高いＨＥＲ２レベルを有する場合があり（免疫組織化学試験のスコア）、心筋細胞は、「２＋」というＨＥＲ２レベルを有する場合があり、ＭＣＦ－７は、「１＋／０」という比較的低いＨＥＲ２レベルを有する場合がある。
（実施例１１）
ＸＴＥＮ化ＸＰＡＴの投与によって対象において誘導される腫瘍退縮
この実施例は、ビヒクル、非切断性ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＰＡＴ、切断性ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＰＡＴ、およびマスクされていないＨＥＲ２－ＰＡＴの投与によって対象において誘導された腫瘍退縮を例証する。本実験において使用した非切断性構築物は、対応する切断性構築物と同一であるが、放出部位が、ＧＡＳＴＥＰアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタメート、および／またはプロリン）から作製される同様の長さの非切断性配列で置き換えられている。
実施例１１ａ：腫瘍接種の１日前に、マウスの右脇腹にエストロゲンペレット（１７β－エストラジオール、６０日放出）を移植した。ＢＴ－４７４腫瘍細胞を、２×１０７のＢＴ－４７４／２００ｕｌのＭａｔｒｉｇｅｌを含むＲＰＭＩ １６４０（１：１）／腫瘍形成に関するマウスの濃度で、各マウスの右脇腹領域に皮下接種した。腫瘍細胞接種の日を０日目（Ｄ０）として表示した。
Ｄ８に腫瘍が触知できるようになった場合（平均腫瘍体積（ＭＴＶ）＝１１７ｍｍ３）、ＰＢＭＣを１×１０７個のＰＢＭＣ／２００ｕｌのＲＰＭＩ １６４０／マウスで静脈内移植した。１群のマウスにはＰＢＭＣを注射せず（「ｈＰＢＭＣを含まない」群）、ＰＢＭＣを注射したマウスと並行して残りの実験処置を受けた。平均腫瘍体積が１４７ｍｍ３に達した場合に（Ｄ１０）、「ｈＰＢＭＣを含まない」群のマウスにビヒクル（希釈剤）を投与し（図７Ａの塗りつぶした四角）；ＰＢＭＣを注射したマウスを４つの群に無作為化し、それぞれ、ビヒクル（希釈剤）（図７Ａの塗りつぶした丸）、マスクされていない二重特異性（図７Ａの塗りつぶした三角）、切断性ＸＴＥＮ化二重特異性（図７Ａの六角形）、および非切断性ＸＴＥＮ化二重特異性（図７Ａの菱形）を投与した。５つの群はすべて、１５ｎｍｏｌ／Ｋｇの等モル用量を受けた。
図７Ａに例示されているように、研究の終わり、すなわちＤ３５までに、切断性ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＰＡＴ（例えば、表Ｄに記載）およびマスクされていない二重特異性の両方は、対照（ｈＰＢＭＣを含むかまたは含まないビヒクル）および非切断性ＸＴＥＮ化二重特異性対応物と比較した場合、有意な抗腫瘍効率を実証した。非切断性ＸＴＥＮ化二重特異性構築物のいずれかの腫瘍成長阻害の欠如は、ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２二重特異性で観察される抗腫瘍効率がタンパク質分解による切断によって駆動されることを裏付ける。
実施例１１ｂ：実施した実験設定は、実施例１１ａに記載したものと類似した。腫瘍接種の１日前に、マウスの右脇腹にエストロゲンペレット（１７β－エストラジオール、６０日放出）を移植した。ＢＴ－４７４腫瘍細胞を、２×１０７のＢＴ－４７４／Ｍａｔｒｉｇｅｌを含む２００ｕｌのＲＰＭＩ １６４０（１：１）／腫瘍形成に関するマウスの濃度で、各マウスの右脇腹領域に皮下接種した。腫瘍細胞接種の日を０日目（Ｄ０）として表示した。Ｄ８に腫瘍が触知できるようになった場合（ＭＴＶ＝９４ｍｍ３）、ＰＢＭＣを１×１０７個のＰＢＭＣ／２００ｕｌのＲＰＭＩ １６４０／マウスで静脈内移植した。１群のマウスにはＰＢＭＣを注射せず（「ｈＰＢＭＣを含まない」群）、ＰＢＭＣを注射したマウスと並行して残りの実験処置を受けた。ＭＴＶが４４４ｍｍ３に達した場合に（Ｄ２０）、ＰＢＭＣを注射したマウスを無作為化し、ビヒクル（希釈剤）および試験物による処置を、Ｄ２１にすべての群に対して単回用量として送達した。
図７Ｂは、対照および非切断性ＸＴＥＮ化二重特異性対応物と比較した場合に、単回用量後の大きな定着腫瘍（例えば、平均腫瘍体積（ＭＴＶ）＞４００ｍｍ３）においても、切断性ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ（例えば、表Ｄに記載）の有意な抗腫瘍効率を例証する。非切断性ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＰＡＴによって達成された適切なレベルの腫瘍成長阻害の欠如は、切断性ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＰＡＴの抗腫瘍効率がタンパク質分解による切断によって駆動されることを支持する。
実施例１１ｃ：実施例１１ａおよび１１ｂでは、本実施例において、比較的高レベルのＨＥＲ２を発現する乳がん細胞系から生成した異種移植片が使用され、腫瘍退縮研究は、低レベルのＨＥＲ２発現によって特徴付けられる結腸直腸異種移植片モデルを使用して実施された。マウスに、５×１０６個のＨＴ－５５／Ｍａｔｒｉｇｅｌを含む２００ｕｌのＲＰＭＩ １６４０（１：１）／腫瘍形成に関するマウスの濃度で、各マウスの右脇腹領域に皮下接種した。腫瘍細胞接種の日を０日目（Ｄ０）として表示した。
Ｄ６に腫瘍が触知できるようになった場合（平均腫瘍体積（ＭＴＶ）＝８２ｍｍ３）、ＰＢＭＣを１×１０７個のＰＢＭＣ／２００ｕｌのＲＰＭＩ １６４０／マウスで静脈内移植した。１群のマウスにはＰＢＭＣを注射せず（「ｈＰＢＭＣを含まない」群）、ＰＢＭＣを注射したマウスと並行して残りの実験処置を受けた。平均腫瘍体積が１３０ｍｍ３に達した場合に（Ｄ１０）、「ｈＰＢＭＣを含まない」群のマウスにビヒクル（希釈剤）を投与し（図７Ｃの塗りつぶした四角）；ＰＢＭＣを注射したマウスを５つの群に無作為化し、それぞれ、ビヒクル（希釈剤）（図７Ｃの塗りつぶした丸）、１５ｎｍｏｌ／Ｋｇのマスクされていない二重特異性（図７Ｃの塗りつぶした三角）、１５ｎｍｏｌ／Ｋｇの切断性ＸＴＥＮ化二重特異性（図７Ｃの三角）３６ｎｍｏｌ／Ｋｇの切断性ＸＴＥＮ化二重特異性（図７Ｃの菱形）、および非切断性ＸＴＥＮ化二重特異性（図７Ａの菱形）を投与した。
図７Ｃに例示されているように、研究の終わりまでに、切断性ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＰＡＴ（例えば、表Ｄに記載）およびマスクされていない二重特異性（両方において１５ｎｍｏｌ／Ｋｇおよび３６ｎｍｏｌ／Ｋｇ）は、対照（ｈＰＢＭＣを含むかまたは含まないビヒクル）および非切断性ＸＴＥＮ化二重特異性対応物と比較した場合、有意な抗腫瘍効率を実証した。非切断性ＸＴＥＮ化二重特異性構築物のいずれかの腫瘍成長阻害の欠如は、ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２二重特異性で観察される抗腫瘍効率がタンパク質分解による切断によって駆動されることを裏付ける。
追加のｉｎ ｖｉｖｏ実験では、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ（すなわち、ＸＴＥＮ化またはマスクされたＨＥＲ２－ＰＡＴ）が、腫瘍組織において優先的にマスクされず、正常組織と比較して、腫瘍において有意に大きな切断が見られることが実証された。ＢＴ－４７４腫瘍をＮＳＧマウスに定着させた。マウスに、ＩＲ染料で部位特異的に標識したＨＥＲ２－ＸＰＡＴを注射した。２日の期間後に、組織（腫瘍、脳、心臓および肝臓）を採取し、ホモジナイズし、ＢＴ－４７４の様々な組織中でマスクされていないＨＥＲ２－ＰＡＴの存在を評価した。さらに、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴが切断されること／マスクされないことが、腫瘍においてｉｎ ｖｉｖｏで起こったのか、または組織が採取された後の組織のホモジナイズのアーチファクトであるのかを決定するために、試料を、同じ調製の前に標識の異なるＨＥＲ２－ＸＰＡＴでスパイクした。図７Ｄは、脳、心臓、および肝臓の組織で見られた切断と比較して、腫瘍組織ではマスクされていないＰＡＴへのＨＥＲ２－ＸＰＡＴの優先的な切断があることを実証している。さらに、図７Ｄは、ホモジナイズまたは他の取扱いの結果としてのｅｘ ｖｉｖｏとは対照的に、組織内のｉｎ ｖｉｖｏで切断が生じたことも示す。さらに、新鮮な腫瘍試料におけるＸＰＡＴ切断の強力な証拠が存在する。
実施例１１ａ～１１ｃは、切断性ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＰＡＴが、高いＨＥＲ２発現により特徴付けられる腫瘍だけでなく、低レベルのＨＥＲ２しか発現しない腫瘍モデルにおいて強固な腫瘍退縮を誘導することを示す。このような腫瘍退縮は、非切断性ＸＰＡＴで処置した試験対象においては観察されない。さらに、ここで示されるデータは、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴが、腫瘍微小環境において、ｉｎ ｖｉｖｏで優先的にマスクされないことを示す。実施例１１ａ～１１ｃに関する実験設計については以下の実施例１７においてさらに議論されている。
（実施例１２）
ＸＴＥＮ化ＸＰＡＴの投与によって対象において誘導されるリンパ球辺縁趨向
この実施例は、ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＰＡＴ（例えば、表６に記載）の投与、例えば、単回用量静脈内（ＩＶ）注入（例えば、１０ｍｌ／ｋｇの用量体積で２５ｍｇ／ｋｇ）によって対象（例えば、雌性および雄性のサル）において誘導されるリンパ球辺縁趨向を例証する。
試験物投与製剤を、確立されたプロトコールに従って目的のＸＰＡＴを希釈して、用量レベルの要件を満たすことによって調製した。試験物（目的のＨＥＲ２－ＸＰＡＴ）および適切な希釈剤を単回使用のアリコートとして用意し、使用まで－８０℃を維持するよう設定された冷凍庫内で保存した。解凍したら、アリコートを２℃～８℃で保存し、再凍結させなかった。投与製剤は、投与の日に調製した。使用日に、ＸＰＡＴストック溶液と適切な希釈剤のアリコートを室温で解凍し、適切な量の試験物を希釈して適当な濃度を得た。投与製剤を、管を穏やかに数回反転させることによって混合した。ヒトへの曝露経路の候補として、ＩＶ曝露経路を選択した。
図８に示されているように、リンパ球の減少を含む（すぐ下の表にまとめた）、単回投与（２５ｍｇ／ｋｇ）後のＨＥＲ２－ＸＰＡＴに関連する血液学パラメーターの変化が、投与の６時間後から観察され（投与前レベルの０．５～０．２ｘ）、投与の２４時間後（投与前レベルの０．２７～０．１ｘ）および４８時間後（投与前レベルの０．０９～０．３６ｘ）も持続的に観察された。投与の７２時間後には、リンパ球レベルは低いままであった（投与前レベルの０．３～０．１ｘ）。
表１４． 血液学：ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ投与に関連するリンパ球の変化
Figure 2023531494000081
（実施例１３）
対象におけるＸＴＥＮ化ＰＡＴ（ＸＰＡＴ）の毒性および薬物動態の評価
ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＰＡＴ（例えば、表Ｄに記載）の毒性および薬物動態をカニクイザルにおいて評価した。動物に２５ｍｇ／ｋｇの切断性ＸＴＥＮ化ＨＥＲ２－ＰＡＴまたは対応する非切断性ＸＴＥＮ化対応物を１時間にわたり投与した。血漿用血液を投与前および注入終了後の以下の時間に回収した：５分、２時間、４時間、６時間、２４時間、４８時間、９６時間、１４４時間、１６８時間、および２４０時間。時間の＋／－２分以内にすべての血液を回収した。血漿試料を切断性および非切断性のＸＴＥＮ化二重特異性構築物の濃度について分析した。血漿中薬物濃度を、捕捉として組換えＨＥＲ２を、検出のためのＸＴＥＮマスクを対象とする抗体を使用するＥＣＬＩＡ（電気化学発光免疫測定法）によって測定した。図９に示されているように、カニクイザルでは、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ（例えば、表Ｄに記載）は、末梢組織におけるその安定性により、対応する非切断性バージョンに類似する薬物動態プロファイルを示した。本実験において使用した非切断性構築物は、対応する切断性構築物と同一であるが、放出部位が、ＧＡＳＴＥＰアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタメート、および／またはプロリン）から作製される同様の長さの非切断性配列で置き換えられている。２つの別々の投与後の循環中のタンパク質分解代謝物の存在もモニターし、図９Ｂに総ＨＥＲ２－ＸＰＡＴのパーセンテージとして示した。図９Ｂに示されているように、１ｘ－代謝物の存在は、総ＨＥＲ２－ＸＰＡＴの４％未満である。
（実施例１４）
ＸＴＥＮマスクによりＨＥＲ２－ＸＰＡＴ対ＨＥＲ２－ＰＡＴの安全性マージンを拡大する
追加データは、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴが、カニクイザルにおいて忍容性が高く、マスクされていないＰＡＴで見られるものと比較して４５０倍高い忍容Ｃｍａｘが存在することを示している。ＨＥＲ２－ＸＰＡＴを、単回用量／動物（用量は２．５～４２ｍｐｋ）および５０ｍｐｋで週に２回、ＩＶ投与した。＊２１ｍｐｋおよびそれを超える用量で、Ｃ末端のＸＴＥＮマスクが短いＨＥＲ２－ＸＰＡＴのバリアントを使用した。ＨＥＲ２－ＰＡＴは半減期が短いため、持続注入で投与した。ＨＥＲ２－ＸＰＡＴの血漿中濃度は、組換えＨＥＲ２を捕捉として、検出のためにはＸＴＥＮマスクを対象とする抗体を使用して、ＥＣＬＩＡ＊によって測定した。ＨＥＲ２ ＰＡＴのＣｍａｘ値は、ａ－ＣＤ３ ｓｃＦｖを対象とするａ－ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ Ａｂを捕捉として、組換えＨＥＲ２を検出として利用するＥＣＬＩＡによって決定した。＊ＥＣＬＩＡ＝電気化学発光免疫測定法。図１０Ａは、最大忍容量の４２ｍｇ／ｋｇを示し、実際、５０ｍｇ／ｋｇでも明白なＣＲＳは見られなかった。逆に、図１０Ｂにおいて、マスクされていないＨＥＲ２－ＰＡＴの最大忍容量は、０．２ｍｇ／ｋｇである。図１０Ｃは、マスクされたＨＥＲ２－ＰＡＴ（４５０倍高い忍容Ｃｍａｘで）の血漿中濃度を、マスクされていないＨＥＲ２－ＰＡＴと比較して示す。
図１３Ａ～図１３Ｂには、本発明の好ましいＨＥＲ２－ＸＰＡＴの安全性プロファイルを支持する追加の証拠が存在する。ＨＥＲ２－ＸＰＡＴまたはその非切断性の対応物である、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ－ＮｏＣｌｖＳｉｔｅを２５または４２ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ用量として投与した。用量に対して正規化した血漿中薬物濃度を、組換えＨＥＲ２を捕捉として、検出のためにはＸＴＥＮマスクを対象とする抗体を使用して、ＥＣＬＩＡ＊によって測定した。＊ＥＣＬＩＡ＝電気化学発光免疫測定法。図１２Ａにおけるデータは、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ形式と非切断性ＨＥＲ２－ＰＡＴ形式の間で同等のＰＫを示し、プロテアーゼ放出部位が、高用量であっても、カニクイザルの循環中でおおいに安定なままであることを実証している。図１２Ｂでは、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴを投与したカニクイザルの血漿において、一回切断されたＨＥＲ２－ＸＰＡＴ（１Ｘ－Ｃ）およびＨＥＲ２－ＸＰＡＴ（１Ｘ－Ｎ）の濃度を測定した。抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖを認識する抗体と、一回切断された分子の組換えバージョンにより調製した標準物質を使用して、定量的ウェスタンを実施した。結果は、上記のようにＥＣＬＩＡによって測定した場合、全ＸＴＥＮ化種のパーセンテージとして表されている。図１２Ｂは、高用量のＨＥＲ２ ＸＰＡＴであっても、一方または両方のＸＴＥＮマスクを欠く代謝物の全身蓄積は非常に限定されたものであることを示す。
（実施例１５）
ＨＥＲ２－ＸＰＡＴはサイトカイン放出症候群を誘導しない
ＨＥＲ２－ＸＰＡＴの忍容性と一致して、本実施例は、ＮＨＰ毒性パイロット研究におけるＨＥＲ２－ＸＰＡＴがＮＨＰの循環において最小限のＴ細胞活性化しかもたらさなかったのに対し、そのマスクされていない対応物がはるかに低い用量であっても有意なＴ細胞活性化をもたらしたことを実証する。Ｔ細胞活性化のこのマスクと一致して、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴを投与した際のサイトカイン放出も、そのマスクされていない対応物に関して観察されたものに対して強固に減弱された。ＨＥＲ２－ＸＰＡＴでは、４２ｍｇ／ｋｇのＭＴＤでも明らかなサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は存在しなかったが、マスクされていないＴＣＥ対応物は、０．３ｍｇ／ｋｇ程度の低用量でＣＲＳによる死亡をもたらした。全体として、ＡＭＸ－８１８は、期待された臨床的に関連する用量より有意に高い用量でＮＨＰ研究において十分に忍容性であり、他の承認されたＨＥＲ２標的化剤が臨床毒性を実証した心臓などのＨＥＲ２発現組織においても、肉眼または顕微鏡による所見は認められなかった。
よって、５０ｍｇ／ｋｇの投与でも、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴはサイトカイン放出や全身的Ｔ細胞活性化を誘導しなかった。このことは、標準的ＴＣＥに対するＸＰＡＴには最小限のＣＲＳリスクしか存在しないことを裏付ける。高用量のＨＥＲ２－ＸＰＡＴ（２５および４２ｍｇ／ｋｇ）を投与したＮＨＰ由来の血漿では、１～３％の一回切断されたＸＰＡＴ代謝物しか検出されなかった。この研究のために、末梢Ｔ細胞活性化（ＣＤ２５＋の％）を、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ処置の２４時間後にフローサイトメトリーによって評価した。図１１Ａおよび１１Ｂは、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ対ＨＥＲ２－ＰＡＴの存在下でのＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１１Ａ）およびＣＤ２５＋ＣＤ８＋（図１１Ｂ）Ｔ細胞を示す。
血漿試料に関してＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）サスペンションアレイシステムを用いてサイトカイン分析を実施した。図１１Ｃ～１１Ｅは、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴ対ＨＥＲ２－ＰＡＴに応じた血漿中のＩＬ－６（図１１Ｃ）、ＴＮＦ－ａ（図１１Ｄ）およびＩＦＮ－ｇ（図１１Ｅ）のレベルを示す。示したデータは、各評価用量で６～２４時間の間に測定した最大値である。追加のＧＬＰ毒性研究（データは示さず）では、ＮＨＰにＡＭＸ－８１８を３つの用量レベル（０．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇおよび６ｍｇ／ｋｇ）で３１日間にわたり毎週投与した。これらのＧＬＰ毒性研究の結果は、以前のパイロットＮＨＰ研究と一致しており、組織病理学的検査を含む標準的な毒性学エンドポイントに基づくＡＭＸ－８１８関連の有害所見はなく、すべての臨床病理所見は可逆的であった。
また、４２ｍｇ／ｋｇまでのＮＨＰにおけるＡＭＸ－８１８の安全性と一致して、ＡＭＸ－８１８は、活性代謝物の限定された全身蓄積によって証明されるように、プロテアーゼ阻害剤が豊富に存在する循環中でもほぼ安定である。健康なＮＨＰに投与され、ＡＭＸ－８１８で治療される対象も全身性炎症を有している可能性があるため、がんおよび炎症性疾患を有する患者、ならびに本発明者らが全身性炎症を誘導したＮＨＰから採取した血漿試料において、ＡＭＸ－８１８の安定性をｅｘ ｖｉｖｏで分析した。図１２に示されているように、本発明者らがＡＭＸ－８１８を血漿試料と共に３７℃で７日間インキュベートした安定性研究において、健康なＮＨＰ、炎症を起こしたＮＨＰ、健康なヒト、およびがんまたは炎症疾患を有するヒト患者由来の血漿試料において、同様のＡＭＸ－８１８の安定性が観察された。
この実験では、タンデムｓｃＦｖに結合した蛍光標識（ＤｙＬ６５０）を有するＡＭＸ－８１８を、指定の血漿試料中で３７℃で７日間インキュベートした。次いで、試料をゲル上にランし、マスクされていない活性型のＡＭＸ－８１８とサイズが類似する代謝物をＬＩ－ＣＯＲ検出器を使用して定量化した。炎症性疾患のヒト試料は、関節リウマチ、狼瘡、炎症性腸疾患、および多発性硬化症を有する患者に由来した。がんのヒト試料は、肺、乳房、および結腸の腫瘍を有する患者に由来した。試料サイズ：健康なＮＨＰ Ｎ＝４、健康なヒト Ｎ＝４、「炎症性の」ＮＨＰ Ｎ＝６、「炎症性の」ヒト Ｎ＝２７、がんのヒト Ｎ＝１１。
４つの血漿群すべてにわたり、活性な、マスクされていないＨＥＲ２ ＴＣＥとサイズの類似する生成物の範囲は、存在するＡＭＸ－８１８種全体のわずかおよそ２～４％であった。このパーセンテージの低さは、マスクされていないＴＣＥのｉｎ ｖｉｖｏでの蓄積の可能性の過大評価を反映しており、腎濾過によってこのような生成物は循環から速やかに排除される（ＮＨＰにおけるマスクされていない形態の半減期はおよそ７時間である）。これらのデータは、がん患者におけるＡＭＸ－８１８の活性な、マスクされていない形態の全身への有意な蓄積のリスクは限定的であることを示唆する。
（実施例１６）
ＡＭＸ－８１８および８１８－ＰＡＴは、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞に応答して、Ｔ細胞上でのＰＤ－１およびＣＤ６９の表面発現を誘導する
表面のＰＤ－１発現は、指定した濃度の試験物に関して、５：１のエフェクター：標的比でのＰＢＭＣおよびＳＫＯＶ３細胞の４８時間の同時インキュベーション後に、フローサイトメトリーによってＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上で評価した。ＣＤ４とＣＤ８の両方のＴ細胞サブセットに関して、８１８－ＰＡＴおよびＡＭＸ－８１８は、表面ＰＤ－１を発現するＴ細胞の出現頻度を増加させ、ＡＭＸ－８１８の曲線は８１８－ＰＡＴに対しておよそ２．５ｌｏｇシフトし、プロドラッグがその活性化対応物と比較して有意にマスクされていることを実証した。ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）によるＴ細胞の最大活性化は６２５ｐＭの濃度で達成され、ＡＭＸ－８１８による最大活性化は１５０～６００ｎＭの濃度で達成された。
指定した薬物濃度におけるＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞上のＰＤ－１の表面レベルを比較するヒストグラムプロットを図１４Ａ～１４Ｄに示す。
ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）とプロドラッグＡＭＸ－８１８は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞サブセットの表面でのＣＤ６９とＰＤ－１の発現を同程度に誘導した。しかし、ＡＭＸ－８１８の用量反応曲線は、活性化ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）のものに対して平均４００倍を超えて高くシフトし、ＡＭＸ－８１８の有効な機能的マスクを実証した（図１４Ａおよび図１４ＣにおいてＣＤ８ Ｔ細胞について示したデータ）。ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）による活性化マーカーＣＤ６９および阻害性受容体ＰＤ－１の最大上方調節が０．６２ｎＭ濃度で観察されたが、ＡＭＸ－８１８による同等の誘導には１５０～６００ｎＭの濃度が必要とされた（図１４Ｂおよび１４Ｄ）。
ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）はまた、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１の表面発現を強力に誘導し、ＥＣ５０値は１９．７ｐＭであったが、ＸＴＥＮ化ＡＭＸ－８１８は同等の出現頻度とレベルのＰＤ－Ｌ１を誘導する際に６５０分の１の効力しかなかった（図１５Ａ～１５Ｃを参照されたい）。ＡＭＸ－８１８によるＴ細胞上のＰＤ－１および標的腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１の誘導は、その活性を弱めることが予想され、今後の臨床調査においてＡＭＸ－８１８にＰＤ－１ブロッキング療法を併用する根拠をもたらす。
ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）とＡＭＸ－８１８は、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞サブセット内で、ＰＤ－１を同等レベルかつ最大パーセンテージで誘導した。しかし、ＡＭＸ－８１８はＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）より平均して４００分の１を超える低い効力であった。ＡＭＸ－８１８（ＰＡＴ）は、ＨＥＲ２高発現ＳＫＯＶ３腫瘍細胞のＰＤ－Ｌ１表面発現を強力に誘導し、ＥＣ５０値は１９．７ｐＭであったが、ＡＭＸ－８１８は同等の誘導に対して６５０分の１を超えて低い効力であった。ＡＭＸ－８１８によるＴ細胞上のＰＤ－１および標的腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１の誘導は、その活性を弱めることが予想され、ＰＤ－１ブロッキング療法をＡＭＸ－８１８と併用する根拠をもたらす。
（実施例１７）
ＸＰＡＴは、生きたマウスに移植したヒト腫瘍においてＴＣＥに対してマスクされておらず、健康な組織では最小限の切断しか観察されていない
本実施例は、本発明のＨＥＲ２－ＸＰＡＴの強力なｉｎ ｖｉｖｏ有効性をまとめたものである。抗腫瘍活性を評価するために、免疫不全マウスに、目的の標的を発現する腫瘍細胞を注射した。腫瘍が十分に大きくなり、十分に定着した（１００ｍｍ３を超えて）時点で、ヒトＰＢＭＣを注射し、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴおよび種々の対照分子の静脈内投与を開始した。これらの研究により、ＨＥＲ２を標的とするＸＰＡＴが腫瘍退縮といくつかの完全奏効を引き起こしたことが示された。プロテアーゼ切断性リンカーを欠くＡＭＸ－８１８バリアントは活性を有さず、リンカーのプロテアーゼによる切断が活性を誘導したことを示す。
さらに、ＨＥＲ２－ＸＰＡＴはｉｎ ｖｉｖｏでの安全性マージンを拡大する。ＨＥＲ２は、健康な組織での発現が比較的限定されている。ＮＨＰにＨＥＲ２－ＸＰＡＴと、それらのマスクされていないＴＣＥ対応物を注射し、忍容性を評価して、各分子の最大忍容量を決定した。ＸＰＡＴのＸＴＥＮマスクは、ＴＣＥの忍容性を有意に増加させ、マスクされていないＨＥＲ２ ＴＣＥで観察されるものよりＭＴＤで４００倍を超えて高いＣｍａｘを可能にした。プロテアーゼ切断性リンカーが幅広い範囲のヒト腫瘍にわたり切断され得ることを証明するために、新鮮なヒト腫瘍試料、ならびに患者由来の腫瘍および異種移植片腫瘍において、ＸＰＡＴ切断を分析した。新鮮なヒト腫瘍外植片において、ＸＰＡＴは、Ｔ細胞を直接活性化した陽性対照（抗ＣＤ３抗体）によって誘導されるサイトカイン放出と同様に、腫瘍に常在するＴ細胞からのプロテアーゼ切断性リンカー依存性のサイトカイン放出を誘導した。
腫瘍で起こるＸＰＡＴが優先的にマスクされない度合を定量化するために、ＸＰＡＴの切断を生きたマウスにおいて評価した。蛍光標識したＸＰＡＴをマウスに注射し、２日後に腫瘍と健康な組織を採取して、ＸＰＡＴと切断生成物のレベルを測定した。生きたマウスで起こる切断を明確に定量化し、組織が採取された後に起こるいずれの切断も制御するために、本発明者らは、組織処理中に添加された対照ＸＰＡＴの切断も分析した。９種類の異なる腫瘍を有する３１匹のマウスにわたり、平均して、生きたマウスの腫瘍中のＸＰＡＴの２０％がマスクされていないＴＣＥ形態へと切断されたが、健康な組織ではＸＰＡＴの最小限の切断しか観察されなかった。対照ＸＰＡＴの切断が限定的か全くないことの実証により、注射されたＸＰＡＴの切断が組織処理中ではなく、生きたマウスで起こったことが確認された。研究設計とデータを図１６Ａ～Ｃに示す。
本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、説明されてきたが、このような実施形態が例示としてのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。本発明が、本明細書内で提供される特定の例によって限定されることは意図されていない。本発明は、前述の明細書を参照して説明されてきたが、本明細書における実施形態の説明および例証は、限定的な意味で解釈されることを意味しない。多数の変形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者にとって今や生じるであろう。さらに、本発明のすべての態様は、種々の条件および変数に依存する本明細書において示された特定の描写、構成または相対的な割合に限定されないことが理解されるものとする。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替案が、本発明を実践する際に採用され得ることが理解されるべきである。したがって、本発明は、このような代替物、修正物、変形物または均等物も網羅することが企図される。以下の請求項が本発明の範囲を規定し、これらの請求項の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの均等物がそれによって網羅されることが意図される。

Claims (142)

  1. Ｎ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸を有するポリペプチドであって、
    （ａ）伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）であって、
    プロテアーゼによる消化の際に前記ポリペプチドから放出可能であるバーコード断片（ＢＡＲ）を含む、ＸＴＥＮ；
    （ｂ）二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）であって、
    分化抗原群３Ｔ細胞受容体（ＣＤ３）に特異的に結合し、軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、２（ＣＤＲ－Ｌ２）および３（ＣＤＲ－Ｌ３）と重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、２（ＣＤＲ－Ｈ２）および３（ＣＤＲ－Ｈ３）とを含み、前記ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、第１の抗原結合断片（ＡＦ１）と、
    ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に特異的に結合する第２の抗原結合断片（ＡＦ２）と
    を含む、二重特異性抗体構築物；ならびに
    （ｃ）前記ＸＴＥＮと前記二重特異性抗体構築物との間に位置する放出セグメント（ＲＳ）
    を含み、
    前記ＸＴＥＮが、
    （ｉ）少なくとも１００、または少なくとも１５０アミノ酸を含むこと；
    （ｉｉ）そのアミノ酸残基の少なくとも９０％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）により本明細書において同定されること；
    （ｉｉｉ）Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、ＥまたはＰにより本明細書において同定される少なくとも４種の異なるアミノ酸を含むこと；および
    （ｉｖ）前記ＸＴＥＮが、各々長さ９～１４アミノ酸である複数の非オーバーラップ配列モチーフから形成されること
    を特徴とし、
    前記複数の非オーバーラップ配列モチーフが、
    （１）非オーバーラップ配列モチーフのセットであって、前記非オーバーラップ配列モチーフのセットの各非オーバーラップ配列モチーフが、前記ＸＴＥＮ中で少なくとも２回反復される、非オーバーラップ配列モチーフのセット；および
    （２）前記ＸＴＥＮ内に１回だけ出現する非オーバーラップ配列モチーフ
    を含み、
    前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、前記ＸＴＥＮ内に１回だけ出現する前記非オーバーラップ配列モチーフの少なくとも一部を含み、
    前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、前記プロテアーゼによる前記ポリペプチドの完全消化の際に前記ポリペプチドから放出可能であるすべての他のペプチド断片と、配列および分子量の点で異なり、
    前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、前記ポリペプチドの前記Ｎ末端アミノ酸も、前記Ｃ末端アミノ酸も含まない、ポリペプチド。
  2. 前記非オーバーラップ配列モチーフのセットが、各々独立して、配列番号１７９～２００および１７１５～１７２２により本明細書において同定される、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記非オーバーラップ配列モチーフのセットが、各々独立して、配列番号１８６～１８９により本明細書において同定される、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  4. 前記非オーバーラップ配列モチーフのセットが、前記配列モチーフの配列番号１８６～１８９のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つすべてを含む、請求項３に記載のポリペプチド。
  5. 前記ＸＴＥＮが、１００～３，０００、１５０～３，０００、１００～１，０００、または１５０～１，０００アミノ酸残基の長さを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. 前記ＸＴＥＮが、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、または少なくとも５００アミノ酸残基の長さを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  7. 前記ＸＴＥＮのアミノ酸残基の少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）である、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  8. 前記ＸＴＥＮが、表３ａに記載の配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. 前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、前記ＸＴＥＮ中に、存在する場合別のグルタミン酸に直接隣接しているグルタミン酸を含まない、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. 前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、そのＣ末端にグルタミン酸を有する、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. 前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、グルタミン酸残基がすぐ前にあるＮ末端アミノ酸を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  12. 前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、前記ポリペプチドの前記Ｎ末端または前記ポリペプチドの前記Ｃ末端のいずれかからある距離に位置し、前記距離が、長さ１０～１５０アミノ酸、または１０～１２５アミノ酸である、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  13. 前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、
    （ｉ）前記ＸＴＥＮ中に、存在する場合別のグルタミン酸に直接隣接しているグルタミン酸を含まないこと；
    （ｉｉ）そのＣ末端にグルタミン酸を有すること；
    （ｉｉｉ）グルタミン酸残基がすぐ前にあるＮ末端アミノ酸を有すること；および
    （ｉｖ）前記ポリペプチドの前記Ｎ末端または前記ポリペプチドの前記Ｃ末端のいずれかからある距離に位置し、前記距離が、長さ１０～１５０アミノ酸、または１０～１２５アミノ酸であること
    を特徴とする、請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  14. 前記バーコード断片（ＢＡＲ）の前記Ｎ末端アミノ酸の前にある前記グルタミン酸残基が、別のグルタミン酸残基に直接隣接していない、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  15. 前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、前記バーコード断片のＣ末端以外の位置に第２のグルタミン酸残基を、前記第２のグルタミン酸のすぐ後にプロリンが続かない限り、含まない、請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  16. 前記ＸＴＥＮが、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＮ末端に位置し、前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、前記ポリペプチドの前記Ｎ末端の２００アミノ酸以内、１５０アミノ酸以内、１００アミノ酸以内、または５０アミノ酸以内に位置する、請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  17. 前記ＸＴＥＮが、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＮ末端に位置し、前記バーコード断片（ＢＡＲ１）が、前記タンパク質の前記Ｎ末端から１０～２００アミノ酸の間、３０～２００アミノ酸の間、４０～１５０アミノ酸の間、または５０～１００アミノ酸の間にある場所に位置する、請求項１から１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  18. 前記ＸＴＥＮが、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＣ末端に位置し、前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、前記ポリペプチドの前記Ｃ末端の２００アミノ酸以内、１５０アミノ酸以内、１００アミノ酸以内、または５０アミノ酸以内に位置する、請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  19. 前記ＸＴＥＮが、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＣ末端に位置し、前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、前記タンパク質の前記Ｃ末端から１０～２００アミノ酸の間、３０～２００アミノ酸の間、４０～１５０アミノ酸の間、または５０～１００アミノ酸の間にある場所に位置する、請求項１から１５および１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  20. 前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、長さ少なくとも４アミノ酸である、請求項１から１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  21. 前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、長さ４～２０アミノ酸の間、５～１５アミノ酸の間、６～１２アミノ酸の間、または７～１０アミノ酸の間である、請求項２０に記載のポリペプチド。
  22. 前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、表２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  23. 前記ＸＴＥＮが、近位端および遠位端により定義される長さを有し、（１）前記近位端が、前記遠位端と比べて、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）の近くに位置し、（２）前記バーコード断片（ＢＡＲ）が、前記遠位端から測定して、前記ＸＴＥＮの前記長さの５％～５０％の間、７％～４０％の間、または１０％～３０％の間にわたる前記ＸＴＥＮの領域内に位置する、請求項１から２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  24. 前記ＸＴＥＮが、追加の１つまたは複数のバーコード断片をさらに含み、前記追加の１つまたは複数のバーコード断片各々が、前記プロテアーゼによる前記ポリペプチドの完全消化の際に前記ポリペプチドから放出可能であるすべての他のペプチド断片と、配列および分子量の点で異なる、請求項１から２３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  25. 前記放出セグメント（ＲＳ）が、配列番号７００１～７６２６により本明細書において同定される配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  26. 前記プロテアーゼが、プロリンが後に続かないグルタミン酸残基のＣ末端側で切断する、請求項１から２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  27. 前記プロテアーゼが、Ｇｌｕ－Ｃプロテアーゼである、請求項２６に記載のポリペプチド。
  28. 融合タンパク質として発現され、前記融合タンパク質が、非切断状態で、Ｎ末端からＣ末端へＡＦ１－ＡＦ２－ＲＳ－ＸＴＥＮ、ＡＦ２－ＡＦ１－ＲＳ－ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ－ＲＳ－ＡＦ１－ＡＦ２、またはＸＴＥＮ－ＲＳ－ＡＦ２－ＡＦ１により本明細書において同定される構造配置を有する、請求項１から２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  29. 前記放出セグメント（ＲＳ）が、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）にスペーサーにより融合されている、請求項１から２８に記載のポリペプチド。
  30. 前記スペーサーが、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）である少なくとも４種のアミノ酸を含む、請求項２９に記載のポリペプチド。
  31. 前記スペーサーが、表Ｃに記載の配列に対して、少なくとも８０％、９０％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のポリペプチド。
  32. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）の前記ＣＤＲ－Ｈ１および前記ＣＤＲ－Ｈ２が、それぞれ、配列番号８および９のアミノ酸配列を含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  33. 前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号１または２のアミノ酸配列を含み、
    前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号４または５のアミノ酸配列を含み、
    前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、
    請求項１から３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  34. 前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号１のアミノ酸配列を含み、
    前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号４または５のアミノ酸配列を含み、
    前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、
    請求項１から３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  35. 前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号２のアミノ酸配列を含み、
    前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号４または５のアミノ酸配列を含み、
    前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、
    請求項１から３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  36. 前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号１のアミノ酸配列を含み、
    前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号４のアミノ酸配列を含み、
    前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、
    請求項１から３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  37. 前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号２のアミノ酸配列を含み、
    前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５のアミノ酸配列を含み、
    前記ＡＦ１の前記ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、
    請求項１から３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  38. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、４つの鎖可変ドメインフレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）、２（ＦＲ－Ｈ２）、３（ＦＲ－Ｈ３）および４（ＦＲ－Ｈ４）を含み、各々が、それぞれ配列番号６０、６４、６５および６７のアミノ酸配列に対して、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すか、またはそれと同一である、請求項１から３７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  39. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、４つの鎖可変ドメインフレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）、２（ＦＲ－Ｈ２）、３（ＦＲ－Ｈ３）および４（ＦＲ－Ｈ４）を含み、各々が、それぞれ配列番号６１、６４、６５および６７のアミノ酸配列に対して、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すか、またはそれと同一である、請求項１から３７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  40. 前記第１の抗原結合断片が、４つの軽鎖可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ－Ｌ）：ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３およびＦＲ－Ｌ４をさらに含み、各々が、それぞれ配列番号５１、５２、５３および５９のアミノ酸配列に対して、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すか、またはそれと同一である、請求項１から３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  41. 前記第１の抗原結合断片が、４つの軽鎖可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ－Ｌ）：ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３およびＦＲ－Ｌ４をさらに含み、各々が、それぞれ配列番号５１、５２、５４および５９のアミノ酸配列に対して、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すか、またはそれと同一である、請求項１から３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  42. 前記第１の抗原結合断片が、４つの軽鎖可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ－Ｌ）：ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３およびＦＲ－Ｌ４をさらに含み、各々が、それぞれ配列番号５１、５２、５５および５９のアミノ酸配列に対して、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すか、またはそれと同一である、請求項１から３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  43. 前記第１の抗原結合断片が、４つの軽鎖可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ－Ｌ）：ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３およびＦＲ－Ｌ４をさらに含み、各々が、それぞれ配列番号５１、５２、５６および５９のアミノ酸配列に対して、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すか、またはそれと同一である、請求項１から３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  44. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、軽鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｌ１）、２（ＦＲ－Ｌ２）、３（ＦＲ－Ｌ３）および４（ＦＲ－Ｌ４）と重鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）、２（ＦＲ－Ｈ２）、３（ＦＲ－Ｈ３）および４（ＦＲ－Ｈ４）とをさらに含み、
    前記ＦＲ－Ｌ１が、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｌ２が、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｌ３が、配列番号５３、５４、５５または５６のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｌ４が、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ１が、配列番号６０または６１のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ２が、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ３が、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ４が、配列番号６７のアミノ酸配列を含む、
    請求項１から３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  45. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、軽鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｌ１）、２（ＦＲ－Ｌ２）、３（ＦＲ－Ｌ３）および４（ＦＲ－Ｌ４）と重鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）、２（ＦＲ－Ｈ２）、３（ＦＲ－Ｈ３）および４（ＦＲ－Ｈ４）とをさらに含み、
    前記ＦＲ－Ｌ１が、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｌ２が、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｌ３が、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｌ４が、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ１が、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ２が、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ３が、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ４が、配列番号６７のアミノ酸配列を含む、
    請求項１から３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  46. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、軽鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｌ１）、２（ＦＲ－Ｌ２）、３（ＦＲ－Ｌ３）および４（ＦＲ－Ｌ４）と重鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）、２（ＦＲ－Ｈ２）、３（ＦＲ－Ｈ３）および４（ＦＲ－Ｈ４）とをさらに含み、
    前記ＦＲ－Ｌ１が、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｌ２が、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｌ３が、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｌ４が、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ１が、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ２が、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ３が、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ４が、配列番号６７のアミノ酸配列を含む、
    請求項１から３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  47. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、軽鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｌ１）、２（ＦＲ－Ｌ２）、３（ＦＲ－Ｌ３）および４（ＦＲ－Ｌ４）と重鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）、２（ＦＲ－Ｈ２）、３（ＦＲ－Ｈ３）および４（ＦＲ－Ｈ４）とをさらに含み、
    前記ＦＲ－Ｌ１が、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｌ２が、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｌ３が、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｌ４が、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ１が、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ２が、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ３が、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ４が、配列番号６７のアミノ酸配列を含む、
    請求項１から３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  48. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、軽鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｌ１）、２（ＦＲ－Ｌ２）、３（ＦＲ－Ｌ３）および４（ＦＲ－Ｌ４）と重鎖フレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）、２（ＦＲ－Ｈ２）、３（ＦＲ－Ｈ３）および４（ＦＲ－Ｈ４）とをさらに含み、
    前記ＦＲ－Ｌ１が、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｌ２が、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｌ３が、配列番号５６のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｌ４が、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ１が、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ２が、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ３が、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、
    前記ＦＲ－Ｈ４が、配列番号６７のアミノ酸配列を含む、
    請求項１から３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  49. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、
    前記第１の抗原結合断片の、抗ＣＤ３結合断片の融解温度と比べて高い融解温度（Ｔｍ）；または
    前記第１の抗原結合断片を試験二重特異性抗原結合構築物に組み込んだときの、前記試験二重特異性抗原結合構築物の、対照二重特異性抗原結合構築物のＴｍと比較して高いＴｍ
    によって明らかなように、配列番号２０６に記載の配列からなる前記抗ＣＤ３結合断片より高い熱安定性を示し、前記試験二重特異性抗原結合構築物が、前記第１の抗原結合断片と、ＣＤ３以外の抗原に結合する参照抗原結合断片とを含み、前記対照二重特異性抗原結合構築物が、配列番号２０６の前記配列からなる前記抗ＣＤ３結合断片と、前記参照抗原結合断片とからなる、請求項１から４８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  50. 前記第１の抗原結合断片の前記Ｔｍが、配列番号２０６の前記配列からなる前記抗ＣＤ３結合断片の前記Ｔｍより少なくとも２℃高い、または少なくとも３℃高い、または少なくとも４℃高い、または少なくとも５℃高い、請求項４９に記載のポリペプチド。
  51. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、重鎖可変領域（ＶＨＩ）を含み、前記ＶＨＩが、配列番号１０２または１０５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するかまたはそれと同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から５０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  52. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、軽鎖可変領域（ＶＬＩ）を含み、前記ＶＬＩが、配列番号１０１、１０３、１０４、１０６または１０７のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれと同一である、請求項１から５１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  53. 前記ＶＨＩおよび前記ＶＬＩが、表Ａに記載の配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むリンカーにより連結されている、請求項５１または５２に記載のポリペプチド。
  54. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、配列番号２０１～２０５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するかまたはそれと同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から５３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  55. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、ヒトまたはカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ３に特異的に結合する、請求項１から５３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  56. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、ヒトＣＤ３に特異的に結合する、請求項５５に記載のポリペプチド。
  57. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、ＣＤ３のＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマまたはＣＤ３ゼータユニットにより本明細書において同定されるＣＤ３複合体サブユニットに結合する、請求項１から５６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  58. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、ＣＤ３のＣＤ３イプシロン断片に結合する、請求項５７に記載のポリペプチド。
  59. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、６．６未満であるかそれに等しい等電点（ｐＩ）を示す、請求項１から５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  60. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、両端を含めて６．０～６．６の間の等電点（ｐＩ）を示す、請求項５９に記載のポリペプチド。
  61. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、配列番号２０６で示される配列からなる参照抗原結合断片の等電点（ｐＩ）より少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｐＨ単位低いｐＩを示す、請求項１から６０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  62. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、ヒトまたはｃｙｎｏ ＣＤ３抗原を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原結合アッセイで決定して、約１０ｎＭ～約４００ｎＭの間の解離定数（Ｋｄ）定数でヒトまたはｃｙｎｏ ＣＤ３に特異的に結合する、請求項１から６１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  63. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原結合アッセイで決定して、約１０ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満、または約１００ｎＭ未満、または約１５０ｎＭ未満、または約２００ｎＭ未満、または約２５０ｎＭ未満、または約３００ｎＭ未満、または約３５０ｎＭ未満、または約４００ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でヒトまたはｃｙｎｏ ＣＤ３に特異的に結合する、請求項１から６２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  64. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原結合アッセイでのそれぞれの解離定数（Ｋｄ）により決定して、配列番号２０６のアミノ酸配列からなる抗原結合断片の結合親和性と比べて、２分の１以下、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、または１０分の１以下の弱いＣＤ３に対する結合親和性を示す、請求項１から６３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  65. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、キメラまたはヒト化抗原結合断片である、請求項１から６４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  66. 前記第１の抗原結合断片（ＡＦ１）が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、線状抗体、または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１から６５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  67. 前記第２の抗原結合断片（ＡＦ２）が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、線状抗体、単一ドメイン抗体、または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１から６６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  68. 前記第１および第２の抗原結合断片が、（Ｆａｂ’）２または一本鎖ダイアボディとして構成されている、請求項１から６６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  69. 前記第２の抗原結合断片（ＡＦ２）が、
    配列番号７７８～７８３により本明細書において同定されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＩ）；および
    配列番号８７８～８８３により本明細書において同定されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＩ）
    を含む、請求項１から６８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  70. 前記ＶＨＩＩおよび前記ＶＬＩＩが、表Ａに記載の配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むリンカーにより連結されている、請求項６９に記載のポリペプチド。
  71. 前記第１および第２の抗原結合断片が、ペプチドリンカーにより一緒に融合されている、請求項１から７０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  72. 前記ペプチドリンカーが、グリシン、セリン、またはプロリンである２または３種のアミノ酸を含む、請求項７０に記載のポリペプチド。
  73. 前記ペプチドリンカーが、表Ｂに記載の配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７０または７２に記載のポリペプチド。
  74. 前記ＸＴＥＮが、第１の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ１）であり；
    前記ＸＴＥＮ１が形成される前記複数の非オーバーラップ配列モチーフが、第１の複数の非オーバーラップ配列モチーフであり；
    前記ＢＡＲが、第１のバーコード断片（ＢＡＲ１）であり；
    前記ＲＳが、第１の放出セグメント（ＲＳ１）であり；
    前記ポリペプチドが、
    （ｄ）第２の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ２）であって、
    前記プロテアーゼによる消化の際に前記ポリペプチドから放出可能である第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）を含む、ＸＴＥＮ２；および
    （ｅ）前記第２のＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ２）と前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）との間に位置する第２の放出セグメント（ＲＳ２）
    をさらに含み；
    前記ＸＴＥＮ２が、
    （ｉ）少なくとも１００、または少なくとも１５０アミノ酸を含むこと；
    （ｉｉ）そのアミノ酸残基の少なくとも９０％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）であること；および
    （ｉｉｉ）Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、またはＰである少なくとも４種の異なるアミノ酸を含むこと
    を特徴とし、
    前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、前記プロテアーゼによる前記ポリペプチドの完全消化の際に前記ポリペプチドから放出可能であるすべての他のペプチド断片と、配列および分子量の点で異なり；
    前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、前記ポリペプチドの前記Ｎ末端アミノ酸も、前記Ｃ末端アミノ酸も含まない、請求項１から７３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  75. 前記ＸＴＥＮ１が、前記二重特異性抗体構築物のＮ末端に位置し、前記ＸＴＥＮ２が、前記二重特異性抗体構築物のＣ末端に位置する、請求項７４に記載のポリペプチド。
  76. 前記ＸＴＥＮ１が、前記二重特異性抗体構築物のＣ末端に位置し、前記ＸＴＥＮ２が、前記二重特異性抗体構築物のＮ末端に位置する、請求項７４に記載のポリペプチド。
  77. （ｉｖ）前記ＸＴＥＮ２が、各々長さ９～１４アミノ酸である第２の複数の非オーバーラップ配列モチーフから形成され、前記第２の複数の非オーバーラップ配列モチーフが、
    （１）非オーバーラップ配列モチーフの第２のセットであって、非オーバーラップ配列モチーフの前記第２のセットの各非オーバーラップ配列モチーフが、前記第２のＸＴＥＮ中で少なくとも２回反復される、非オーバーラップ配列モチーフの第２のセット；および
    （２）前記第２のＸＴＥＮ内に１回だけ出現する非オーバーラップ配列モチーフ
    を含み、
    前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、前記第２のＸＴＥＮ内に１回だけ出現する前記非オーバーラップ配列モチーフの少なくとも一部を含む、請求項７４から７６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  78. 非オーバーラップ配列モチーフの前記第２のセットが、各々独立して、配列番号１７９～２００および１７１５～１７２２により本明細書において同定される、請求項７７に記載のポリペプチド。
  79. 非オーバーラップ配列モチーフの前記第２のセットが、各々独立して、配列番号１８６～１８９により本明細書において同定される、請求項７８に記載のポリペプチド。
  80. 非オーバーラップ配列モチーフの前記第２のセットが、前記配列モチーフの配列番号１８６～１８９のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つすべてを含む、請求項７９に記載のポリペプチド。
  81. 前記ＸＴＥＮ２が、１００～３，０００、１５０～３，０００、１００～１，０００、または１５０～１，０００アミノ酸残基の長さを含む、請求項７４から８０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  82. 前記ＸＴＥＮ２が、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、または少なくとも５００アミノ酸残基の長さを含む、請求項７４から８１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  83. 前記ＸＴＥＮ２のアミノ酸残基の少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）である、請求項７４から８２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  84. 前記ＸＴＥＮ２が、表３ａに記載の配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項７４から８３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  85. 前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、前記ＸＴＥＮ２中に、存在する場合別のグルタミン酸に直接隣接しているグルタミン酸を含まない、請求項７４から８４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  86. 前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、そのＣ末端にグルタミン酸を有する、請求項７４から８５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  87. 前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、グルタミン酸残基がすぐ前にあるＮ末端アミノ酸を有する、請求項７４から８６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  88. 前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、前記ポリペプチドの前記Ｎ末端または前記ポリペプチドの前記Ｃ末端のいずれかからある距離に位置し、前記距離が、長さ１０～１５０アミノ酸、または１０～１２５アミノ酸である、請求項７４から８７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  89. 前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、
    （ｉ）前記ＸＴＥＮ２中に、存在する場合別のグルタミン酸に直接隣接しているグルタミン酸を含まないこと；
    （ｉｉ）そのＣ末端にグルタミン酸を有すること；
    （ｉｉｉ）グルタミン酸残基がすぐ前にあるＮ末端アミノ酸を有すること；および
    （ｉｖ）前記ポリペプチドの前記Ｎ末端または前記ポリペプチドの前記Ｃ末端のいずれかからある距離に位置し、前記距離が、長さ１０～１５０アミノ酸、または１０～１２５アミノ酸であること
    を特徴とする、請求項７４から８８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  90. 前記ＢＡＲ２の前記Ｎ末端アミノ酸の前にある前記グルタミン酸残基が、別のグルタミン酸残基に直接隣接していない、請求項８７から８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  91. 前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）のＣ末端以外の位置に第２のグルタミン酸残基を、前記第２のグルタミン酸のすぐ後にプロリンが続かない限り、含まない、請求項７４から９０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  92. 前記ＸＴＥＮ２が、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＮ末端に位置し、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、前記ポリペプチドの前記Ｎ末端の２００アミノ酸以内、１５０アミノ酸以内、１００アミノ酸以内、または５０アミノ酸以内に位置する、請求項７４から９１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  93. 前記ＸＴＥＮ２が、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＮ末端に位置し、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、前記タンパク質の前記Ｎ末端から１０～２００アミノ酸の間、３０～２００アミノ酸の間、４０～１５０アミノ酸の間、または５０～１００アミノ酸の間にある場所に位置する、請求項７４から９２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  94. 前記ＸＴＥＮ２が、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＣ末端に位置し、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、前記ポリペプチドの前記Ｃ末端の２００アミノ酸以内、１５０アミノ酸以内、１００アミノ酸以内、または５０アミノ酸以内に位置する、請求項７４から９３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  95. 前記ＸＴＥＮ２が、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）のＣ末端に位置し、前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、前記タンパク質の前記Ｃ末端から１０～２００アミノ酸の間、３０～２００アミノ酸の間、４０～１５０アミノ酸の間、または５０～１００アミノ酸の間にある場所に位置する、請求項７４から９４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  96. 前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、長さ少なくとも４アミノ酸である、請求項７４から９５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  97. 前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、長さ４～２０アミノ酸の間、５～１５アミノ酸の間、６～１２アミノ酸の間、または７～１０アミノ酸の間である、請求項９６に記載のポリペプチド。
  98. 前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、表２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７４から９７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  99. 前記ＸＴＥＮ２が、近位端および遠位端により定義される長さを有し、（１）前記ＸＴＥＮ２の前記近位端が、前記遠位端と比べて、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）の近くに位置し、（２）前記第２のバーコード断片（ＢＡＲ２）が、前記ＸＴＥＮ２の前記遠位端から測定して、前記ＸＴＥＮ２の前記長さの５％～５０％の間、７％～４０％の間、または１０％～３０％の間にわたる前記ＸＴＥＮ２の領域内に位置する、請求項７４から９８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  100. 前記ＸＴＥＮ２が、追加の１つまたは複数のバーコード断片をさらに含み、前記ＸＴＥＮ２の前記追加の１つまたは複数のバーコード断片各々が、前記プロテアーゼによる前記ポリペプチドの完全消化の際に前記ポリペプチドから放出可能であるすべての他のペプチド断片と、配列および分子量の点で異なる、請求項７４から９９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  101. 前記第１の放出セグメント（ＲＳ１）および前記第２の放出セグメント（ＲＳ２）が、配列の点で同一である、請求項７４から１００のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  102. 前記第１の放出セグメント（ＲＳ１）および前記第２の放出セグメント（ＲＳ２）が、配列の点で同一ではない、請求項７４から１００のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  103. 前記第２の放出セグメント（ＲＳ２）が、配列番号７００１～７６２６により本明細書において同定される配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７４から１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  104. 前記第１の放出セグメント（ＲＳ１）および前記第２の放出セグメント（ＲＳ２）が各々、各放出セグメント配列内の１、２または３カ所の切断部位での複数のプロテアーゼによる切断のための基質である、請求項７４から１０３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  105. 融合タンパク質として発現され、前記融合タンパク質が、非切断状態で、Ｎ末端からＣ末端へＸＴＥＮ１－ＲＳ１－ＡＦ１－ＡＦ２－ＲＳ２－ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ１－ＲＳ１－ＡＦ２－ＡＦ１－ＲＳ２－ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ２－ＲＳ２－ＡＦ１－ＡＦ２－ＲＳ１－ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２－ＲＳ２－ＡＦ２－ＡＦ１－ＲＳ１－ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ１－ＲＳ１－ダイアボディＲＳ２－ＸＴＥＮ２、またはＸＴＥＮ２－ＲＳ２－ダイアボディＲＳ１－ＸＴＥＮ１により本明細書において同定される構造配置を有し、
    前記ダイアボディが、前記ＡＦ１の軽鎖可変領域（ＶＬＩ）、前記ＡＦ１の重鎖可変領域（ＶＨＩ）、前記ＡＦ２の軽鎖可変領域（ＶＬＩＩ）、および前記ＡＦ２の重鎖可変領域（ＶＨＩＩ）を含む、請求項７４から１０４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  106. 前記第１の放出セグメント（ＲＳ１）の前記スペーサーが、第１のスペーサーであり、前記第２の放出セグメント（ＲＳ２）が、前記二重特異性抗体構築物（ＢｓＡｂ）に第２のスペーサーにより融合されている、請求項７４から１０５に記載のポリペプチド。
  107. 前記第２のスペーサーが、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）である少なくとも４種のアミノ酸を含む、請求項１０６に記載のポリペプチド。
  108. 前記第２のスペーサーが、表Ｃに記載の配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０６に記載のポリペプチド。
  109. （ａ）前記ＸＴＥＮ１が、表３ａに記載の配列に対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    （ｂ）前記ＢｓＡｂが、
    （Ｉ）軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、２（ＣＤＲ－Ｌ２）および３（ＣＤＲ－Ｌ３）と重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、２（ＣＤＲ－Ｈ２）および３（ＣＤＲ－Ｈ３）とを含み、前記ＣＤＲ－Ｈ１、前記ＣＤＲ－Ｈ２、および前記ＣＤＲ－Ｈ３が、それぞれ配列番号８、９、および１０のアミノ酸配列を含む、前記ＡＦ１と、
    （ＩＩ）配列番号７７８～７８３により本明細書において同定される軽鎖可変領域（ＶＬＩＩ）および配列番号８７８～８８３により本明細書において同定される重鎖可変領域（ＶＨＩＩ）を含む前記ＡＦ２と
    を含み；
    （ｃ）前記ＲＳ１が、配列番号７００１～７６２６により本明細書において同定される配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
    （ｄ）前記ＸＴＥＮ２が、表３ａに記載の配列に対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
    （ｅ）前記ＲＳ２が、配列番号７００１～７６２６により本明細書において同定される配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    前記ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へＸＴＥＮ１－ＲＳ１－ＡＦ２－ＡＦ１－ＲＳ２－ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ１－ＲＳ１－ＡＦ１－ＡＦ２－ＲＳ２－ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ２－ＲＳ２－ＡＦ２－ＡＦ１－ＲＳ１－ＸＴＥＮ１、またはＸＴＥＮ２－ＲＳ２－ＡＦ１－ＡＦ２－ＲＳ１－ＸＴＥＮ１により本明細書において同定される構造配置を有する、請求項７４に記載のポリペプチド。
  110. いずれのＸＴＥＮにも連結されていない前記二重特異性抗体構築物と比較して、少なくとも２倍長い終末相半減期を有する、請求項１から１０９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  111. 対象への同等用量の投与後に前記二重特異性抗体構築物に選択的に結合するＩｇＧ抗体の産生を測定することにより確認したときに、いずれのＸＴＥＮにも連結されていない前記二重特異性抗体構築物と比較して免疫原性が低い、請求項１から１１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  112. 生理条件下で、約３より大きい、約４より大きい、約５より大きい、または約６より大きい見かけの分子量係数を示す、請求項１から１１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  113. 表Ｄに記載の配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  114. 請求項１から１１３のいずれか一項に記載のポリペプチドと１つまたは複数の薬学的に好適な賦形剤とを含む、医薬組成物。
  115. 皮内、皮下、経口、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、髄腔内または筋肉内投与用に製剤化される、請求項１１４に記載の医薬組成物。
  116. 液体形態であるかまたは凍結されている、請求項１１４または１１５に記載の医薬組成物。
  117. 単回注射用のプレフィルドシリンジ内にある、請求項１１４から１１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  118. 投与前に再構成される凍結乾燥粉末として製剤化される、請求項１１７に記載の医薬組成物。
  119. 医薬品組合せにおける、抗体、抗体断片、抗体コンジュゲート、細胞傷害剤、毒素、放射性核種、免疫調節薬、光活性治療剤、放射線増感剤、ホルモン剤、抗血管新生剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの追加の治療剤である、請求項１１４に記載の医薬組成物。
  120. 前記追加の治療剤が、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１（２）阻害剤である、請求項１１９に記載の医薬組成物。
  121. 前記ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１（２）阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－Ｌ２抗体である、請求項１２０に記載の医薬品組合せ。
  122. 前記ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１（２）阻害剤が、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１１０６）、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ、ＭＫ－３４７５、ラムブロリズマブ）、ピジリズマブ（ＣＴ－０１１）、ＰＤＲ－００１、ＪＳ００１、ＳＴＩ－Ａ１１１０、ＡＭＰ－２２４およびＡＭＰ－５１４（ＭＥＤＩ０６８０）を含む群から選択される抗ＰＤ－１抗体である、請求項１２１に記載の医薬品組合せ。
  123. 前記ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１（２）阻害剤が、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ１１０５）およびＬＹ３３０００５４を含む群から選択される抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１２１に記載の医薬品組合せ。
  124. 前記ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１（２）阻害剤阻害剤が、抗ＰＤ－Ｌ２抗体である、請求項１２１に記載の医薬品組合せ。
  125. 互いに別々の前記成分を含有するコンビネーションパックである、請求項１１９に記載の医薬品組合せ。
  126. 前記成分が、別々の剤形で同じ疾患の処置における使用のために同時にまたは逐次的に投与される、請求項１１９に記載の医薬品組合せ。
  127. 過剰増殖性障害を処置するための医薬として使用するための、請求項１１９に記載の医薬品組合せ。
  128. 前記過剰増殖性障害が、乳がん、気道がん、脳がん、生殖器がん、消化管がん、尿路がん、眼がん、肝臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、甲状腺がん、副甲状腺がんおよびそれらの遠隔転移からなる群から選択される、請求項１２７に記載の医薬品組合せ。
  129. 対象の疾患を処置するための医薬の調製における、請求項１から１１２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１１９から１２８のいずれかに記載の医薬品組合せの使用。
  130. 前記疾患が、がんである、請求項１２９に記載の使用。
  131. 対象の疾患を処置する方法であって、それを必要とする前記対象に、請求項１１４から１１８のいずれか一項に記載の医薬組成物または請求項１１９から１２８のいずれか一項に記載の医薬品組合せの１または複数の治療有効用量を投与するステップを含む方法。
  132. 前記疾患が、がんである、請求項１３１に記載の方法。
  133. 前記がんが、膠芽細胞腫、黒色腫、胆管癌、小細胞肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膣がん、血管肉腫、非小細胞肺がん、虫垂がん、扁平上皮がん、唾液腺導管癌、腺様嚢胞癌、小腸がん、および胆嚢がんからなる群から選択される、請求項１３２に記載の方法。
  134. 前記医薬組成物が、前記対象に１または複数の治療有効用量として投与される、請求項１３１から１３３のいずれか一項に記載の方法。
  135. 前記医薬組成物が、前記対象に１または複数の治療有効用量として有効投与期間にわたって投与される、請求項１３１から１３４のいずれか一項に記載の方法。
  136. 前記対象が、マウス、ラット、サル、またはヒトである、請求項１３１から１３４のいずれか一項に記載の方法。
  137. （ａ）請求項１から１１２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；または（ｂ）（ａ）の前記ポリヌクレオチド配列の逆相補体を含む、核酸。
  138. 請求項１から１１２に記載のポリヌクレオチド配列と、前記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された組換え調節配列とを含む、発現ベクター。
  139. 請求項１３８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  140. 原核生物である、請求項１３９に記載の宿主細胞。
  141. Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１４０に記載の宿主細胞。
  142. 哺乳動物細胞である、請求項１３９に記載の宿主細胞。
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