CN116583532A - 靶向her-2的双特异性组合物以及其制造和使用方法 - Google Patents

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CN116583532A CN202180045251.XA CN202180045251A CN116583532A CN 116583532 A CN116583532 A CN 116583532A CN 202180045251 A CN202180045251 A CN 202180045251A CN 116583532 A CN116583532 A CN 116583532A
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V·舍伦伯格
E·约翰森
A·亨肯西夫肯
D·麦卡恩
J·麦克洛里
P·库恩
A·弗伦泽尔
M·图
M·福克斯
B·欧文
M·德兰克
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Amunix Pharmaceuticals Inc
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Abstract

本发明公开了多肽以及制造和使用所述多肽的方法，所述多肽包含共价连接至扩展型重组多肽的双特异性抗体构建体及可经蛋白质裂解的释放区段，所述扩展型重组多肽包含在蛋白酶消化后可自所述多肽释放的条形码片段，其中所述裂解将所述双特异性抗体构建体自所述扩展型重组多肽释放。

Description

靶向HER-2的双特异性组合物以及其制造和使用方法
序列表陈述
序列表的计算机可读形式为通过电子提交随本申请且以全文引用的方式并入本申请中。序列表含于2021年6月14日创建的文件中，所述文件的文件名为“789-601_20-1832-WO_ST25_FINAL.txt”且大小为1502kb。
参考陈述
本申请要求2020年6月25日申请的名为“BARCODED BISPECIFIC COMPOSITIONSAND METHODS FOR MAKING AND USING THE SAME”的美国临时专利申请第63/044,301号、2020年9月11日申请的名为“BARCODED BISPECIFIC COMPOSITIONS AND METHODS FORMAKING AND USING THE SAME”的美国临时专利申请第63/077,503号、2020年11月2日申请的名为“BARCODED BISPECIFIC COMPOSITIONS AND METHODS FOR MAKING AND USING THESAME”的美国临时专利申请第63/108,783号、2021年3月26日申请的名为“HER2 TARGETEDBISPECIFIC COMPOSITIONS AND METHODS FOR MAKING AND USING THE SAME”的美国临时专利申请第63/166,857号及2021年6月3日申请的名为“HER2 TARGETED BISPECIFICCOMPOSITIONS AND METHODS FOR MAKING AND USING THE SAME”的美国临时专利申请第63/196,408号的优先权，以上所有案全文并入本文中。
背景技术
双特异性T细胞接合子(TCE)对癌症疗法呈现高效模态，所述癌症疗法再导引针对表达所选肿瘤相关抗原的肿瘤的T细胞细胞毒性，略过对肿瘤抗原的T细胞辨识的要求。TCE的活性视其经由有效刺激T细胞受体(TCR)而活化T细胞的能力而定。TCE的极端效力来源于对少至3种TCR变得受刺激且聚结以在T细胞与靶细胞之间形成免疫突触以引发细胞毒性的最低要求。除TCE诱导细胞毒性之外，TCE的效力还涉及增强且扩增抗肿瘤免疫反应的T细胞活化下游的细胞因子驱动的作用。因此，TCE向肿瘤具有不充分突变或通过其他手段逃脱免疫监视的患者提供免疫疗法承诺。然而，此模态自身并非不具有挑战，且实体肿瘤中TCE的使用受到其于健康组织中的极端效力及正中目标、脱肿瘤毒性限制。
TCE高度有效地诱导患有血液癌的患者的缓解，但其在实体肿瘤中的使用受到其针对表达甚至低含量目标的正常组织的极端效力及正中目标毒性限制。针对通常难以用免疫疗法治疗的肿瘤(例如，微卫星稳定的结肠直肠癌及前列腺癌)已观测到令人印象深刻但罕见的临床反应，但在低剂量下诸如细胞因子释放综合征的毒性已防止剂量递增，以显露模态临床潜力。在经<1μg/kg剂量的Ichnos ISB 1302HER2 TCE治疗的患者中诱发的4级细胞因子释放综合征强调了即使在针对相对组织限制性目标时TCE所面临的挑战。
用博纳吐单抗(blinatumomab)(一种经过批准的CD3xCD19双特异性抗体)进行的临床试验显露，细胞因子释放综合征(CRS)为主要安全相关不良事件中之一者。在低药物剂量下的CRS及正中目标毒性显著损害了针对实体肿瘤的临床中的治疗指数及TCE模态潜力。举例而言，针对卡妥索单抗(catumaxomab)(CD3xEpCAM)的临床试验因在10μg剂量下的药物相关肝衰竭而终止。在另一试验中，靶向HER2的TCE(Glenmark GBR1302)药剂剂量因G4 CRS发作而限于少于1μg/kg。尽管帕妥昔珠单抗(pasotuxumab)(靶向PSMA的TCE)显示良好反应，但其在大于40μg/天的剂量下受到CRS妨碍。文献充满CRS及TCE所呈现的正中目标毒性挑战的其他实施例。
规避CRS的尝试包括复杂分子设计，但这些尝试由于毒性和/或经增强的免疫原性而不成功。此对可克服实体肿瘤中的治疗指数挑战的新策略呈现显著未满足的需要。若可利用TCE的效力且可控制CRS及正中目标毒性挑战，则生成可潜在地用于抵抗广谱癌症的强力治疗剂可为可能的。
诸如药物物质的治疗剂包括可以产生可影响药物物质活性的多肽混合物的方式产生的多肽。多肽混合物通常可包括全长多肽以及其尺寸变体(例如截短体)。尺寸不同于所需全长产物的变体的存在可能会影响药物物质的生物状态，从而可能会影响多肽药物物质的安全性和/或功效。举例而言，用于癌症疗法的基于蛋白质之前驱药可经靶向肿瘤的活化机制工程改造。更特别是，全长治疗蛋白可为非活性(非细胞毒性)前驱药形式，而全长构建体的截短变体可能会失去保护序列且变为细胞毒性(活性)的，因此“污染”前驱药组合物。在一些情况下，与全长蛋白相比，所述较短长度变体可能会造成较高的免疫原性风险，对肿瘤细胞具有较低的选择性毒性，或显示不太需要的药物动力学概况(例如造成治疗窗变窄)。因此，蛋白质结构变化的检测及定量可在生物治疗剂的生物特性(例如临床安全性及药理学功效)评估及新型生物治疗剂(例如具有经提高的功效及经减少的副作用)研发中具有重要性。用于标识及定量“污染”截短产物的量的现有技术及方法可包括一个或多个诸如具有有限敏感度、简易性、效率或有效性的缺点。
发明内容
本发明解决在提供具有增加的治疗指数的TCE癌症治疗剂中长期未满足的需求。由此，本发明通过提供XTEN化蛋白酶活化型双特异性T细胞接合子(XPAT)来利用TCE的治疗潜能。XPAT表示用于改善T细胞接合子的毒性概况、同时维持其针对实体肿瘤的效力的新颖策略，因此对于此强效模态，使得治疗指数能够显著增加且目标前景能够扩大。在某些特定实施方案中，本发明的XPAT靶向携有HER2的肿瘤。更特别是，AMX-818为靶向HER2的条件性活化前驱药TCE，所述TCE经设计以利用肿瘤中的调节异常蛋白酶活性，同时保留其中蛋白酶抑制占主导的健康组织，因此加宽安全边限及增大治疗指数。
本文提供具有N端氨基酸和C端氨基酸的多肽，所述多肽包含：(a)扩展型重组多肽(XTEN)，其包含在蛋白酶消化后可自所述多肽释放的条形码片段(BAR)；(b)双特异性抗体构建体(BsAb)，其包含特异性结合至分化簇3T细胞受体(CD3)的第一抗原结合片段(AF1)，所述AF1包含轻链互补决定区1(CDR-L1)、2(CDR-L2)和3(CDR-L3)以及重链互补决定区1(CDR-H1)、2(CDR-H2)和3(CDR-H3)，其中所述CDR-H3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；及特异性结合至人类表皮生长因子受体2(HER2)的第二抗原结合片段(AF2)；及(c)位于所述XTEN与所述双特异性抗体构建体之间的释放区段(RS)，其中所述XTEN的特征在于：(i)其包含至少100个或至少150个氨基酸；(ii)其氨基酸残基的至少90％为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)；(iii)其包含至少4种不同类型的氨基酸，所述氨基酸为G、A、S、T、E或P；及(iv)所述XTEN由复数个非重叠序列模体形成，所述模体的长度各自为9至14个氨基酸，其中所述复数个非重叠序列模体包含：(1)一组非重叠序列模体，其中所述组非重叠序列模体中的各非重叠序列模体在所述XTEN中重复至少两次；及(2)非重叠序列模体，其在所述XTEN内仅出现一次；其中所述条形码片段(BAR)包括在所述XTEN内仅出现一次的所述非重叠序列模体的至少一部分；其中所述条形码片段(BAR)与在所述蛋白酶完全消化所述多肽后可自所述多肽释放的所有其他肽片段的不同之处在于序列和分子量；且其中所述条形码片段(BAR)不包括所述多肽的所述N端氨基酸或所述C端氨基酸。
在某些实施方案中，所述组非重叠序列模体各自独立地包含在本文中通过SEQ IDNO:179-200和1715-1722加以标识的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述组非重叠序列模体各自独立地包含在本文中通过SEQ ID NO:186-189加以标识的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述组非重叠序列模体包含序列模体SEQ ID NO:186-189中的至少两个、至少三个或全部四个。在某些实施方案中，所述XTEN包含100至3,000、150至3,000、100至1,000或150至1,000个氨基酸残基的长度。在某些实施方案中，所述XTEN包含至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或至少500个氨基酸残基的长度。在某些实施方案中，所述XTEN的氨基酸残基的至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)。
在某些实施方案中，所述XTEN与表3a中所阐述的序列具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在某些实施方案中，所述条形码片段(BAR)不包括紧邻所述XTEN中的另一谷氨酸(若存在)的谷氨酸。在某些实施方案中，所述条形码片段(BAR)在其C端处具有谷氨酸。在某些实施方案中，所述条形码片段(BAR)具有紧随谷氨酸残基之后的N端氨基酸。在某些实施方案中，所述条形码片段(BAR)与所述多肽的所述N端或所述多肽的所述C端相距一定距离定位，其中所述距离为10至150个氨基酸或10至125个氨基酸长度。在某些实施方案中，所述条形码片段(BAR)的特征在于：(i)其不包括紧邻所述XTEN中的另一谷氨酸(若存在)的谷氨酸；(ii)其在其C端处具有谷氨酸；(iii)其具有紧随谷氨酸残基之后的N端氨基酸；及(iv)其与所述多肽的所述N端或所述多肽的所述C端相距一定距离定位，其中所述距离为10至150个氨基酸或10至125个氨基酸长度。在某些实施方案中，在所述条形码片段(BAR)的所述N端氨基酸之前的所述谷氨酸残基不紧邻另一谷氨酸残基。
在某些实施方案中，所述条形码片段(BAR)在除所述条形码片段的C端以外的位置处不包括第二谷氨酸残基，除非所述第二谷氨酸之后紧随脯氨酸。在某些实施方案中，所述XTEN位于所述双特异性抗体构建体(BsAb)的N端，其中所述条形码片段(BAR)位于所述多肽的所述N端200个、150个、100个或50个氨基酸内。在某些实施方案中，所述XTEN位于所述双特异性抗体构建体(BsAb)的N端，且其中所述条形码片段(BAR1)位于距所述蛋白质的所述N端10个与200个之间、30个与200个之间、40个与150个之间或50个与100个之间的氨基酸的位置处。在某些实施方案中，所述XTEN位于所述双特异性抗体构建体(BsAb)的C端，且其中所述条形码片段(BAR)位于所述多肽的所述C端200个、150个、100个或50个氨基酸内。在某些实施方案中，所述XTEN位于所述双特异性抗体构建体(BsAb)的C端，且所述条形码片段(BAR)位于距所述蛋白质的所述C端10个与200个之间、30个与200个之间、40个与150个之间或50个与100个之间的氨基酸的位置处。在某些实施方案中，所述条形码片段(BAR)的长度为至少4个氨基酸。在某些实施方案中，所述条形码片段(BAR)的长度为在4个与20个之间、在5个与15个之间、在6个与12个之间或在7个与10个之间的氨基酸。
在某些实施方案中，所述条形码片段(BAR)包含表2中所阐述的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述XTEN的长度为由近端和远端界定，其中(1)所述近端为相对于所述远端、更接近所述双特异性抗体构建体(BsAb)定位，且其中(2)所述条形码片段(BAR)位于如自所述远端开始量测在所述XTEN的所述长度的5％与50％之间、7％与40％之间或10％与30％之间延伸的所述XTEN的区域内。在某些实施方案中，所述XTEN进一步包含额外的一个或多个条形码片段，其中所述额外的一个或多个条形码片段各自与在所述蛋白酶完全消化所述多肽之后可自所述多肽释放的所有其他肽片段的不同之处在于序列和分子量。在某些实施方案中，所述释放区段(RS)包含与在本文中通过SEQ ID NO:7001-7626加以标识的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述蛋白酶在后面不跟随脯氨酸的谷氨酸残基的C端侧上裂解。在某些实施方案中，所述蛋白酶为Glu-C蛋白酶。
在某些实施方案中，多肽表达为融合蛋白，其中呈未裂解状态的所述融合蛋白自N端至C端具有AF1-AF2-RS-XTEN、AF2-AF1-RS-XTEN、XTEN-RS-AF1-AF2或XTEN-RS-AF2-AF1的结构布置。在某些实施方案中，所述释放区段(RS)通过间隔子与所述双特异性抗体构建体(BsAb)融合。在某些实施方案中，所述间隔子包含至少4种类型的氨基酸，所述氨基酸可为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)。在某些实施方案中，所述间隔子包含与表C中所阐述的序列具有至少80％、90％或100％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)的所述CDR-H1和所述CDR-H2分别包含SEQ ID NO:8和9的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述AF1的所述CDR-L1包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列；所述AF1的所述CDR-L2包含SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列；且所述AF1的所述CDR-L3包含SEQID NO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述AF1的所述CDR-L1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；所述AF1的所述CDR-L2包含SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列；且所述AF1的所述CDR-L3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述AF1的所述CDR-L1包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列；所述AF1的所述CDR-L2包含SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列；且所述AF1的所述CDR-L3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述AF1的所述CDR-L1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；所述AF1的所述CDR-L2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；且所述AF1的所述CDR-L3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述AF1的所述CDR-L1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；所述AF1的所述CDR-L2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；且所述AF1的所述CDR-L3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)包含四个链可变域构架区1(FR-H1)、2(FR-H2)、3(FR-H3)和4(FR-H4)，所述构架区各自分别与SEQ ID NO:60、64、65和67的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)包含四个链可变域构架区1(FR-H1)、2(FR-H2)、3(FR-H3)和4(FR-H4)，所述构架区各自分别与SEQ ID NO:61、64、65和67的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段进一步包含四个轻链可变域构架区(FR-L)：FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，所述构架区各自分别与SEQ ID NO:51、52、53和59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段进一步包含四个轻链可变域构架区(FR-L)：FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，所述构架区各自分别与SEQ ID NO:51、52、54和59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致。
在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段进一步包含四个轻链可变域构架区(FR-L)：FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，所述构架区各自分别与SEQ ID NO:51、52、55和59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段进一步包含四个轻链可变域构架区(FR-L)：FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，所述构架区各自分别与SEQ ID NO:51、52、56和59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)进一步包含轻链构架区1(FR-L1)、2(FR-L2)、3(FR-L3)和4(FR-L4)以及重链构架区1(FR-H1)、2(FR-H2)、3(FR-H3)和4(FR-H4)，其中：所述FR-L1包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；所述FR-L2包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；所述FR-L3包含SEQ ID NO:53、54、55或56的氨基酸序列；所述FR-L4包含SEQID NO:59的氨基酸序列；所述FR-H1包含SEQ ID NO:60或61的氨基酸序列；所述FR-H2包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；所述FR-H3包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；且所述FR-H4包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)进一步包含轻链构架区1(FR-L1)、2(FR-L2)、3(FR-L3)和4(FR-L4)以及重链构架区1(FR-H1)、2(FR-H2)、3(FR-H3)和4(FR-H4)，其中：所述FR-L1包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；所述FR-L2包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；所述FR-L3包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；所述FR-L4包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；所述FR-H1包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；所述FR-H2包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；所述FR-H3包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；且所述FR-H4包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)进一步包含轻链构架区1(FR-L1)、2(FR-L2)、3(FR-L3)和4(FR-L4)以及重链构架区1(FR-H1)、2(FR-H2)、3(FR-H3)和4(FR-H4)，其中：所述FR-L1包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；所述FR-L2包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；所述FR-L3包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；所述FR-L4包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；所述FR-H1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；所述FR-H2包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；所述FR-H3包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；且所述FR-H4包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)进一步包含轻链构架区1(FR-L1)、2(FR-L2)、3(FR-L3)和4(FR-L4)以及重链构架区1(FR-H1)、2(FR-H2)、3(FR-H3)和4(FR-H4)，其中：所述FR-L1包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；所述FR-L2包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；所述FR-L3包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；所述FR-L4包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；所述FR-H1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；所述FR-H2包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；所述FR-H3包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；且所述FR-H4包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)进一步包含轻链构架区1(FR-L1)、2(FR-L2)、3(FR-L3)和4(FR-L4)以及重链构架区1(FR-H1)、2(FR-H2)、3(FR-H3)和4(FR-H4)，其中：所述FR-L1包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；所述FR-L2包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；所述FR-L3包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；所述FR-L4包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；所述FR-H1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；所述FR-H2包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；所述FR-H3包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；且所述FR-H4包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)展现比具有SEQ ID NO:206中所阐述的序列的抗CD3结合片段高的热稳定性，如在体外分析中通过以下所证明：相对于所述抗CD3结合片段的熔融温度(Tm)而言更高的所述第一抗原结合片段的熔融温度(Tm)；或在将所述第一抗原结合片段并入测试双特异性抗原结合构建体中之后，相对于对照双特异性抗原结合构建体的Tm而言更高的所述测试双特异性抗原结合构建体的Tm，其中所述测试双特异性抗原结合构建体包含所述第一抗原结合片段和结合至除CD3以外的抗原的参考抗原结合片段；且其中所述对照双特异性抗原结合构建体由所述抗CD3结合片段和所述参考抗原结合片段组成，所述抗CD3结合片段由所述SEQ ID NO:206的序列组成。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段的所述Tm比由所述SEQ ID NO:206的序列组成的所述抗CD3结合片段的所述Tm高至少2℃、或高至少3℃、或高至少4℃、或高至少5℃。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)包含重链可变区(VHI)，其中所述VHI包含与SEQ ID NO:102或105的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)包含轻链可变区(VLI)，其中所述VLI包含与SEQ ID NO:101、103、104、106或107中任一者的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述VHI和所述VLI为通过接头连接，所述接头包含与表A中所阐述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)包含与SEQ ID NO:201-205中任一者的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)特异性结合人类或食蟹猕猴(cyno)CD3。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)特异性结合人类CD3。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)结合CD3复合物亚单元，所述亚单元为CD3的CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ单元。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)结合CD3的CD3ε片段。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)展现小于或等于6.6的等电点(pI)。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)展现在6.0与6.6之间(包括端值)的等电点(pI)。
在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)展现比具有SEQ ID NO:206中所示的序列的参考抗原结合片段的等电点(pI)低至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0个pH单位的pI。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)以在约在约10nM与约400nM之间之间的解离常数(Kd)常数特异性结合人类或cyno CD3，如在包含人类或cyno CD3抗原的体外抗原结合分析中所测定。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)以小于约10nM、或小于约50nM、或小于约100nM、或小于约150nM、或小于约200nM、或小于约250nM、或小于约300nM、或小于约350nM、或小于约400nM的解离常数(Kd)特异性结合人类或cyno CD3，如在体外抗原结合分析中所测定。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)展现相对于由SEQ ID NO:206的氨基酸序列组成的抗原结合片段的针对CD3的结合亲和力而言弱至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或至少10倍的针对CD3的结合亲和力，如通过体外抗原结合分析中的相应解离常数(Kd)所测定。
在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)为嵌合或人源化抗原结合片段。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段(AF1)为Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、线性抗体或单链可变片段(scFv)。在某些实施方案中，所述第二抗原结合片段(AF2)为Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、线性抗体、单域抗体或单链可变片段(scFv)。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段经构型为(Fab')2或单链双特异性抗体。在某些实施方案中，所述第二抗原结合片段(AF2)包含：重链可变区(VHII)，其包含在本文中通过SEQ ID NO:778-783加以标识的氨基酸序列；及轻链可变区(VLII)，其包含在本文中通过SEQ ID NO:878-883加以标识的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述VHII和所述VLII为通过接头连接，所述接头包含与表A中所阐述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段为通过肽接头融合在一起。在某些实施方案中，所述肽接头包含2种或3种类型的氨基酸，所述氨基酸为甘氨酸、丝氨酸或脯氨酸。在某些实施方案中，所述肽接头包含与表B中所阐述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述XTEN为第一扩展型重组多肽(XTEN1)；由复数个非重叠序列模体形成，所述复数个非重叠序列模体包含第一复数个非重叠序列模体；所述BAR为第一条形码片段(BAR1)；且所述RS为第一释放区段(RS1)；且所述多肽进一步包含：(d)第二扩展型重组多肽(XTEN2)，其包含在所述蛋白酶消化后可自所述多肽释放的第二条形码片段(BAR2)；及(e)第二释放区段(RS2)，其位于所述第二XTEN(XTEN2)与所述双特异性抗体构建体(BsAb)之间，其中所述XTEN2的特征在于：(i)其包含至少100个或至少150个氨基酸；(ii)其氨基酸残基的至少90％为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)；及(iii)其包含至少4种不同类型的氨基酸，所述氨基酸为G、A、S、T、E或P；其中所述第二条形码片段(BAR2)与在所述蛋白酶完全消化所述多肽之后可自所述多肽释放的所有其他肽片段的不同之处在于序列和分子量；且其中所述第二条形码片段(BAR2)不包括所述多肽的所述N端氨基酸或所述C端氨基酸。在某些实施方案中，所述XTEN1位于所述双特异性抗体构建体的N端，且所述XTEN2位于所述双特异性抗体构建体的C端。在某些实施方案中，所述XTEN1位于所述双特异性抗体构建体的C端，且所述XTEN2位于所述双特异性抗体构建体的N端。
在某些实施方案中，所述XTEN2由第二复数个非重叠序列模体形成，所述第二复数个非重叠序列模体的长度各自为9至14个氨基酸，其中所述第二复数个非重叠序列模体包含：(1)第二组非重叠序列模体，其在所述第二XTEN中重复至少两次；及(2)非重叠序列模体，其在所述第二XTEN内仅出现一次；且其中所述第二条形码片段(BAR2)包括在所述第二XTEN内仅出现一次的所述非重叠序列模体的至少一部分。在某些实施方案中，所述第二组非重叠序列模体各自独立地在本文中通过SEQ ID NO:179-200和1715-1722加以标识。在某些实施方案中，所述第二组非重叠序列模体各自独立地在本文中通过SEQ ID NO:186-189加以标识。在某些实施方案中，所述第二组非重叠序列模体包含序列模体SEQ ID NO:186-189中的至少两个、至少三个或全部四个。在某些实施方案中，所述XTEN2包含100至3,000、150至3,000、100至1,000或150至1,000个氨基酸残基的长度。在某些实施方案中，所述XTEN2包含至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个或至少500个氨基酸残基的长度。
在某些实施方案中，所述XTEN2的氨基酸残基的至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)。在某些实施方案中，所述XTEN2与表3a中所阐述的序列具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在某些实施方案中，所述第二条形码片段(BAR2)不包括紧邻所述XTEN2中的另一谷氨酸(若存在)的谷氨酸。在某些实施方案中，所述第二条形码片段(BAR2)在其C端处具有谷氨酸。在某些实施方案中，所述第二条形码片段(BAR2)具有紧随谷氨酸残基之后的N端氨基酸。在某些实施方案中，所述第二条形码片段(BAR2)与所述多肽的所述N端或所述多肽的所述C端相距一定距离定位，其中所述距离为10至150个氨基酸或10至125个氨基酸长度。在某些实施方案中，所述第二条形码片段(BAR2)的特征在于：(i)其不包括紧邻所述XTEN2中的另一谷氨酸(若存在)的谷氨酸；(ii)其在其C端处具有谷氨酸；(iii)其具有紧随谷氨酸残基之后的N端氨基酸；及(iv)其与所述多肽的所述N端或所述多肽的所述C端相距一定距离定位，其中所述距离为10至150个氨基酸或10至125个氨基酸长度。
在某些实施方案中，在所述BAR2的所述N端氨基酸之前的所述谷氨酸残基不紧邻另一谷氨酸残基。在某些实施方案中，所述第二条形码片段(BAR2)在除所述第二条形码片段(BAR2)的C端以外的位置处不包括第二谷氨酸残基，除非所述第二谷氨酸之后紧随脯氨酸。在某些实施方案中，所述XTEN2位于所述双特异性抗体构建体(BsAb)的N端，且其中所述第二条形码片段(BAR2)位于所述多肽的所述N端200个、150个、100个或50个氨基酸内。在某些实施方案中，所述XTEN2位于所述双特异性抗体构建体(BsAb)的N端，且其中所述第二条形码片段(BAR2)位于距所述蛋白质的所述N端10个与200个之间、30个与200个之间、40个与150个之间或50个与100个之间的氨基酸的位置处。在某些实施方案中，所述XTEN2位于所述双特异性抗体构建体(BsAb)的C端，且其中所述第二条形码片段(BAR2)位于所述多肽的所述C端200个、150个、100个或50个氨基酸内。在某些实施方案中，所述XTEN2位于所述双特异性抗体构建体(BsAb)的C端，且所述第二条形码片段(BAR2)位于距所述蛋白质的所述C端10个与200个之间、30个与200个之间、40个与150个之间或50个与100个之间的氨基酸的位置处。
在某些实施方案中，所述第二条形码片段(BAR2)的长度为至少4个氨基酸。在某些实施方案中，所述第二条形码片段(BAR2)的长度为在4个与20个之间、在5个与15个之间、在6个与12个之间或在7个与10个之间的氨基酸。在某些实施方案中，所述第二条形码片段(BAR2)包含如表2中所阐述的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述XTEN2的长度为由近端和远端界定，其中(1)所述XTEN2的所述近端为相对于所述远端、更接近所述双特异性抗体构建体(BsAb)定位，且其中(2)所述第二条形码片段(BAR2)位于如自所述XTEN2的所述远端开始量测在所述XTEN2的所述长度的5％与50％之间、7％与40％之间或10％与30％之间延伸的所述XTEN2的区域内。在某些实施方案中，所述XTEN2进一步包含额外的一个或多个条形码片段，其中所述XTEN2的所述额外的一个或多个条形码片段各自与在所述蛋白酶完全消化所述多肽之后可自所述多肽释放的所有其他肽片段的不同之处在于序列和分子量。在某些实施方案中，所述第一释放区段(RS1)与所述第二释放区段(RS2)的序列一致。在某些实施方案中，所述第一释放区段(RS1)与所述第二释放区段(RS2)的序列不一致。在某些实施方案中，所述第二释放区段(RS2)包含与在本文中通过SEQ ID NO:7001-7626加以标识的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第一释放区段(RS1)和所述第二释放区段(RS2)各自为用于在各释放区段序列内的一个、两个或三个裂解位点处由多种蛋白酶裂解的底物。
在某些实施方案中，多肽表达为融合蛋白，其中呈未裂解状态的所述融合蛋白自N端至C端具有在本文中通过XTEN1-RS1-AF1-AF2-RS2-XTEN2、XTEN1-RS1-AF2-AF1-RS2-XTEN2、XTEN2-RS2-AF1-AF2-RS1-XTEN1、XTEN2-RS2-AF2-AF1-RS1-XTEN1、XTEN1-RS1-双特异性抗体-RS2-XTEN2或XTEN2-RS2-双特异性抗体-RS1-XTEN1加以标识的结构布置，其中所述双特异性抗体包含所述AF1的轻链可变区(VLI)、所述AF1的重链可变区(VHI)、所述AF2的轻链可变区(VLII)和所述AF2的重链可变区(VHII)。在某些实施方案中，所述第一释放区段(RS1)的所述间隔子为第一间隔子，且其中所述第二释放区段(RS2)为通过第二间隔子与所述双特异性抗体构建体(BsAb)融合。在某些实施方案中，所述第二间隔子包含至少4种类型的氨基酸，所述氨基酸为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)。在某些实施方案中，所述第二间隔子包含与表C中所阐述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述XTEN1包含与表3a中所阐述的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列；所述BsAb包含：所述AF1，其包含轻链互补决定区1(CDR-L1)、2(CDR-L2)和3(CDR-L3)以及重链互补决定区1(CDR-H1)、2(CDR-H2)和3(CDR-H3)，其中所述CDR-H1、所述CDR-H2和所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:8、9和10的氨基酸序列；及所述AF2，其包含在本文中通过SEQ IDNO:778-783加以标识的轻链可变区(VLII)和在本文中通过SEQ ID NO:878-883加以标识的重链可变区(VHII)；所述RS1包含与在本文中通过SEQ ID NO:7001-7626加以标识的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列；所述XTEN2包含与表3a中所阐述的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列；且所述RS2包含与在本文中通过SEQ ID NO:7001-7626加以标识的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列，其中所述多肽自N端至C端具有在本文中经标识为XTEN1-RS1-AF2-AF1-RS2-XTEN2、XTEN1-RS1-AF1-AF2-RS2-XTEN2、XTEN2-RS2-AF2-AF1-RS1-XTEN1或XTEN2-RS2-AF1-AF2-RS1-XTEN1的结构布置。
在某些实施方案中，所述多肽具有与不连接至任何XTEN的双特异性抗体构建体相比长至少两倍的终末半衰期。在某些实施方案中，所述多肽具有与不连接至任何XTEN的双特异性抗体构建体相比低的免疫原性，如通过量测在向受试者施用相当剂量之后的选择性结合至所述双特异性抗体构建体的IgG抗体产生所确定。在某些实施方案中，所述多肽在生理条件下展现大于约3、大于约4、大于约5或大于约6的表观分子量因子。在某些实施方案中，所述多肽包含与在本文中经标识为表D中的序列的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，药物组合物包含上文多肽及一种或多种药学上适合的赋形剂。在某些实施方案中，所述药物组合物经调配用于通过任何临床上适当的途径及调配物施用人类或动物。在某些实施方案中，所述药物组合物呈液体形式或经冷冻。在某些实施方案中，所述药物组合物为处于用于单次注射的预填充注射器中。在某些实施方案中，所述药物组合物经调配为欲在施用之前复原的冻干粉末。
在某些实施方案中，所述组合物与选自由以下组成的群的至少一种额外治疗剂组成药物组合：抗体、抗体片段、抗体结合物、细胞毒性剂、毒素、放射性核素、免疫调节剂、光敏性治疗剂、辐射敏化剂、激素、抗血管生成剂及其组合。
额外治疗剂可为PD-1/PD-L1(2)抑制剂，其中PD-1/PD-L1(2)抑制剂为抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体。
在某些实施方案中，PD-1/PD-L1(2)抑制剂为选自包含以下的群的抗PD-1抗体：纳武单抗(nivolumab)(欧狄沃(Opdivo)，BMS-936558，MDX1106)、派姆单抗(pembrolizumab)(可瑞达(Keytruda)，MK-3475，兰利珠单抗(lambrolizumab))、皮立珠单抗(pidilizumab)(CT-011)、PDR-001、JS001、STI-A1110、AMP-224及AMP-514(MEDI0680)。
在一个实施方案中，PD-1/PD-L1(2)抑制剂可为选自包含以下的群的抗PD-L1抗体：阿特珠单抗(atezolizumab)(泰圣奇(Tecentriq)，MPDL3280A)、德瓦鲁单抗(durvalumab)(MEDI4736)、阿维鲁单抗(avelumab)(MSB0010718C)、BMS-936559(MDX1105)及LY3300054。在另一实施方案中，PD1/PD-L1(2)抑制剂为抗PD-L2抗体。
在某些实施方案中，所述组合为含有彼此独立的组分的组合包。在某些实施方案中，所述组分为以单独剂型同时或依序施用以用于治疗相同疾病。
在某些实施方案中，本文所描述的多肽为用作用于治疗过度增生性障碍的药剂的药物组合的一部分。过度增生性障碍选自由以下组成的群：乳腺癌、呼吸道癌、脑癌、生殖器官癌、消化道癌、尿道癌、眼癌、肝癌、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、副甲状腺癌及其远端转移。
在某些实施方案中，如本文所描述的多肽为用于制备用以治疗受试者的疾病的药剂。在某些实施方案中，所述疾病为癌症。
在某些实施方案中，治疗受试者的疾病的方法包含向有需要的所述受试者施用一次或多次治疗有效剂量的药物组合物或药物组合。
在一个实施方案中，所述疾病为癌症。在某些实施方案中，癌症选自由以下组成的群：胶质母细胞瘤、黑色素瘤、胆管癌、小细胞肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、阴道癌、血管肉瘤、非小细胞肺癌、阑尾癌、鳞状细胞癌、唾腺管癌、腺样囊性癌、小肠癌及胆囊癌。
本文提供一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包含向有需要的所述受试者施用一次或多次治疗有效剂量的上文药物组合物。在某些实施方案中，药物组合物为以在治疗上有效的治疗过程期间施用之一次或多次治疗有效剂量形式施用受试者。在某些实施方案中，剂量为通过任何临床上适当的途径及调配物施用人类或动物。在某些实施方案中，受试者为小鼠、大鼠、猴或人类。
本文亦提供一种核酸，所述核酸包含编码如本文所描述的多肽的多核苷酸序列或其所述多核苷酸序列的反向互补序列。本文进一步提供一种表达载体，所述表达载体包含如本文所描述的所述多核苷酸序列及可操作地连接至所述多核苷酸序列的重组调节序列。本文提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含所述表达载体。在某些实施方案中，所述宿主细胞为原核细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)。在某些实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
根据以下实施方式，本发明的额外方面及优点将对本领域技术人员变得显而易见，其中仅展示且描述本发明的说明性实施方案。如将认识到，本发明能够具有其他及不同实施方案，且所述实施方案的若干细节能够全部在不脱离本发明的情况下在各种显而易见的方面中得到修改。因此，附图及实施方式在本质上应视为说明性而非限制性的。
以引用的方式并入
本说明书中所提及的全部公开物、专利及专利申请皆以引用的方式并入本文中，其引用程度如同特定地且单独地指示各个单独公开物、专利或专利申请以引用的方式并入一般。
附图说明
本发明的各种特点细致阐述于随附权利要求书中。参考以下实施方式及附图将获得对本发明的特点及优势的优选理解，以下实施方式阐述其中利用本发明原理的说明性实施方案，所述附图：
图1描绘具有不同长度的XTEN的XTEN化蛋白酶活化型T细胞接合子(“XPAT”)多肽的混合物。全长XPAT(顶部)在N端处包含288个氨基酸长度的XTEN且在C端处包含864个氨基酸长度的XTEN。各种截短体可存在于N端及C端XTEN中之一或两者中的XPAT中，例如在产物制备中的酦酵、纯化或其他步骤期间。尽管具有有限截短体(XTEN远端附近的截短体)的产物可以类似于全长构建体的方式起作用，但苛刻截短体(更接近XTEN近端的截短体)可具有与其全长对应物显著不同的药理学特性。截短体的存在对定量XPAT产物中的药理学上有效及无效的变体造成挑战。如使用全长XPAT的图1中所绘示，各XTEN具有近端和远端，其中近端为相对于远端、更接近生物活性多肽(例如T细胞接合子、细胞因子、单克隆抗体(mAb)、抗体片段或其他XTEN化蛋白质)定位。
图2描绘具有不同长度的带条形码XTEN的XPAT多肽的混合物。在全长XPAT(顶部)中，288个氨基酸长度的N端XTEN含有三个可裂解融合的条形码序列，亦即“NA”、“NB”及“NC”(自远端至近端)，且864个氨基酸长度的C端XTEN含有三个可裂解融合的条形码序列，亦即“CC”、“CB”及“CA”(自近端至远端)。各条形码经定位以指示对应XTEN的药理学上相关的长度。举例而言，不具有条形码“NA”(例如，归因于截短)但具有更近端条形码“NB”及“NC”的XPAT的次要N端截短产物可展示与全长构建体实质上相同的药理学特性。相比之下，例如在N端上不具有所有三个条形码(例如，归因于截短)的XPAT的主要N端截短产物可辨别地与全长构建体在药理学活性方面不同。自XPAT的生物活性多肽(此处为包含T细胞接合子的活性部分的串联scFv)标识独特的可蛋白水解裂解序列。由于独特的可蛋白水解裂解序列存在于XPAT的所有长度的变体(包括全长XPAT、其次要截短体及主要截短体)中，因此其可用作用于相对于生物活性蛋白的总量定量各种截短产物的量的参考物。
图3绘示带条形码XTEN的潜在设计，所述潜在设计利用将生成条形码的序列插入通用(或普通)XTEN中。例示性通用(或普通)XTEN(顶部)在序列“BCDABDCDABDCBDCDABDCB”中包含非重叠12聚体模体，其中序列模体“A”、“B”、“C”及“D”分别出现3、6、5及7次。例示性通用XTEN(上图)的Glu-C蛋白酶消化物不产生除两个末端(“NT”及“CT”)之外的独特肽。将生成条形码的序列“X”(例如，独特的12聚体)插入XTEN中产生不会在XTEN中的任何其他地方出现的独特的可蛋白水解裂解序列(或条形码序列)。生成条形码的序列“X”可经定位以使得所得条形码标记XTEN的药理学上相关的长度。举例而言，由于截短而不具有条形码的XTEN可在功能上与对应的具有条形码的XTEN不同。一般本领域技术人员应理解，生成条形码的序列(“X”)自身可为条形码序列。可替代地，生成条形码的序列(“X”)可与所得条形码序列不同。举例而言，条形码序列可与前面或后面的12聚体模体重叠且因此含有所述12聚体模体的一部分。
图4A-4B绘示N端XTEN的截短水平的定量。图4A表明带条形码XTEN(下图)可通过用生成条形码的模体“X”置换通用XTEN(上图)中的序列模体(例如，来自N端的第三序列模体，“D”)来构建；且在此实施例中，生成条形码的模体(“X”)自身为独特的可蛋白水解裂解条形码序列。如图4A中的下图中所示，条形码经定位以使得XTEN的所有苛刻截短形式不具有条形码，且XTEN的所有有限截短形式含有条形码。图4B绘示XPAT的两种不同混合物中各种裂解产物的相对丰度。在所述混合物中之一者中，条形码存在于99％含有生物活性蛋白的构建体中。在所述混合物中的另一者中，13％构建体不具有条形码(例如，归因于截短)。图4A-4B绘示带条形码XTEN区分具有实质上类似的平均分子量但具有可辨别地不同的药理学活性的两种多肽混合物的用途。
图5A-5B及6A-6C绘示针对具有各种水平的目标抗原表达的靶细胞的经遮蔽(XTEN化)双特异性T细胞接合子及未经遮蔽双特异性T细胞接合子的剂量依赖性细胞毒性。未经蛋白水解遮蔽(去XTEN化)双特异性体对各种肿瘤株展示强力细胞毒性，例如其中当使用SK-OV-3及BT-474细胞测试时，EC50为在单数位pM范围内。XTEN化进一步展现稳健的遮蔽能力，例如在防止双特异性T细胞接合子形成免疫突触时，由此引起毒性降低，如通过浓度-反应曲线中的向右偏移所指示。
图5A-5B绘示一般在XTEN化蛋白酶活化型T细胞接合子(“XPAT”)上及尤其在HER2-XPAT上的XTEN的有效遮蔽。举例而言，以剂量依赖性方式观测到针对两种不同的表达HER2的(例如，癌症)细胞株的XTEN化(经遮蔽)HER2-XPAT(例如表D中所阐述)及对应的去XTEN化(未经遮蔽、经活化)HER2-PAT的细胞毒性。未经遮蔽的去XTEN化PAT(经指示为实心圆)分别产生3.4皮摩尔(pM)(SKOV3细胞)(图5A)及4.8pM(BT474细胞)(图5B)的EC50值，而对应的经遮蔽的XTEN化PAT(经指示为实心正方形)产生44,474pM(SKOV3细胞)及49,370pM(BT474细胞)的EC50值，此指示至少104倍的遮蔽效应。
图6A描绘当接触非癌变组织(心肌细胞)时双特异性T细胞接合子上的XTEN的有效遮蔽。更特别是，图6A展示针对心肌细胞的XTEN化(经遮蔽)HER2-XPAT(例如表D中所阐述)及对应的去XTEN化(未经遮蔽、经活化)HER2-PAT的细胞毒性。观测到响应于未经遮蔽的去XTEN化PAT的T细胞引导的细胞溶解对心肌细胞的杀灭(其中EC50浓度大致为64pM)，而相比于肿瘤细胞，心肌细胞在高达1微摩尔浓度(μM)的浓度下仍难以用经遮蔽的XTEN化PAT杀灭进行治疗。
图6B-6C绘示在使靶细胞参与相对中等或低水平的目标抗原表达的情况下双特异性T细胞接合子上的XTEN的稳健遮蔽。举例而言，图6B绘示XTEN化及去XTEN化蛋白酶活化型T细胞接合子(PAT)对具有低水平的HER2表达的癌细胞株MCF-7的细胞毒性作用，其中用XTEN多肽遮蔽使测试HER2-XPAT的T细胞介导的细胞毒性降低大致104倍。作为另一实施例，测定针对具有中等水平的HER2表达的另一癌细胞株MDA-MB-453的XTEN化(经遮蔽)HER2-XPAT及对应的去XTEN化(未经遮蔽、经活化)HER2-PAT的细胞毒性(图6C)。
图7A-7D绘示受试者中的XTEN化双特异性体的蛋白水解活化及由此诱导的稳健肿瘤消退。图7A绘示在携带(例如，BT-474)肿瘤的小鼠中等摩尔给药可裂解XTEN化HER2 T细胞接合子(“HER2-XPAT”，经指示为六边形)及对应的未经遮蔽HER2 T细胞接合子(“HER2-PAT”，经指示为三角形)的情况下诱导的相当功效。(**指示p<0.01)。值得注意的是，在两种测试XTEN化双特异性体之间，在可裂解XTEN化构建体时(经指示为六边形)而非在不可裂解XTEN化对应物时(经指示为菱形)观测到肿瘤消退，此指示蛋白水解未遮蔽(去XTEN化)为获得功效的先决条件。图7B绘示在单次剂量(例如，2.1毫克/公斤(mpk))的情况下针对大型肿瘤的可裂解XTEN化双特异性体(例如，HER2-XPAT)的功效。实验中所使用的不可裂解构建体与对应的可裂解构建体相同，但释放位点已经由GASTEP氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸和/或脯氨酸)制造的类似长度的不可裂解序列置换。图7C展示与未经遮蔽HER2-PAT(实心正方形)及不可裂解XPAT(实心菱形)相比两种不同浓度(15nmol/Kg及36nmol/Kg)的经遮蔽HER2-XPAT(实心三角形)的功效。亦展示经媒剂及媒剂+PBMC治疗的肿瘤的资料。图7D展示在携带BT-474肿瘤的小鼠中体内HER2-PAT裂解百分比。
图8绘示受试者中通过施用XTEN化HER2-XPAT诱导的淋巴球着边(lymphocytemargination)。举例而言，在单次剂量的XTEN化HER2-XPAT(例如表D中所阐述)静脉内输注(例如，在10ml/kg的剂量体积下25mg/kg)之后，在雌性及雄性猴受试者两者中均观测到淋巴球计数减少(血液病)(分别如通过三角形及正方形所指示)，在给药后6小时开始且持续直至给药后至少24-72小时。
图9A-9B。图9A绘示在受试者(例如食蟹猕猴)中血浆循环中的XTEN化蛋白酶活化型T细胞接合子(PAT)的稳定性(例如在25mg/kg剂量下)。相对于XTEN化PAT的不可裂解形式，XTEN化PAT清除无显著增加指示周边中的最少裂解。在所测试的可裂解HER2-XPAT(实心三角形及实心正方形)与不可裂解对应物(未填充三角形及未填充正方形)之间观测到相当的药物动力学。实验中所使用的不可裂解构建体与对应的可裂解构建体相同，但释放位点已经由GASTEP氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸和/或脯氨酸)制造的类似长度的不可裂解序列置换。图9B展示即使在施用后96小时在循环中仍存在低频率的HER2-XPAT蛋白水解代谢物。
图10A-10C。图10A展示单次剂量的单一受试者HER2-XPAT剂量递增且表明耐受至多42mg/kg的全部剂量。图10B展示单一受试者HER2-PAT递减示意图，其中未经遮蔽HER2-PAT的最大耐受剂量为0.2mg/kg。图10C展示与未经遮蔽HER2-PAT相比经遮蔽HER2-PAT(在高450倍的耐受Cmax下)的血浆浓度。
图11A-11E。图11A及11B展示周边T细胞活化数据，所述数据展示与HER2-PAT相比不存在响应于HER2-XPAT的周边T细胞活化。图11C-11E展示经不同浓度的HER2-XPAT及HER2-PAT治疗的受试者的细胞因子IL-6(图11C)、TNF-α(图11D)及IFN-γ(图11E)含量，此表明即使50mg/kg的HER2-XPAT亦不诱导细胞因子释放。注意，细胞因子含量的正常范围：IL-6≤6pg/ml、TNFα1-10pg/ml、IFNγ≤10pg/ml。
图12.在来自NHP及人类的血浆样本中离体培育的AMX-818展示最少裂解成未经遮蔽TCE，即使在发炎性病况下。将具有连接至串联scFv的荧光标记(DyL650)的AMX-818在37℃下在指定血浆样本中培育七天。随后，在凝胶上运作样本且使用LI-COR检测器定量尺寸上类似于AMX-818的未经遮蔽活性形式的代谢物。发炎性疾病人类样本来源于患有类风湿性关节炎、狼疮、发炎性肠病及多发性硬化症的患者。癌症人类样本来源于患有肺肿瘤、乳肿瘤及结肠肿瘤的患者。样本尺寸：健康NHP N＝4，健康人类N＝4，“发炎”NHP N＝6，“发炎”人类N＝27，癌症人类N＝11。
图13A-图13B.提供支持本发明的优选HER2-XPAT的安全概况的额外数据。图13A中的数据展示HER2-XPAT与不可裂解HER2-PAT形式之间的相当PK，此表明即使在高剂量下，蛋白酶释放位点仍在食蟹猕猴循环中很大程度上稳定。图13B展示即使在高剂量HER2 XPAT下仍存在不具有一或两个XTEN屏蔽的代谢物的极有限全身性积聚。
图14A-14D.响应于SKOV3肿瘤细胞，AMX818及818-PAT在T细胞上诱导表面PD-1表达。在将PBMC及SKOV3细胞以5:1效应物:目标比率与指定浓度的测试物共培育48小时之后通过流动式细胞测量术评估CD4+T细胞及CD8+T细胞上的表面PD-1表达。图14A和图14C展示在存在AMX818及818-PAT的情况下CD4+T细胞上的表面PD1表达。图14B和图14D展示在存在AMX818及818-PAT的情况下CD8+T细胞上的表面PD1表达。
图15A-15C.响应于SKOV3肿瘤细胞，AMX818及818-PAT在T细胞上诱导表面PD-L1表达。图15A和图15B展示与指定浓度的测试物呈5:1效应物:目标比率的SKOV3细胞上的PD-L1表达。图15C展示SKOV3肿瘤细胞上的表面HER2表达。
图16A-16C.在植入活小鼠中的人类肿瘤中XPAT优先裂解成未经遮蔽TCE，其中在健康组织中观测到最少裂解。将1.8mg/kg(13nM)单次剂量的红色荧光团标记(Alexa)的XPAT注射至植入有人类肿瘤的小鼠中(图16A)。两天后，收取肿瘤及健康器官以量测体内蛋白酶裂解(结果示于图16B中)。在存在蛋白酶抑制剂的情况下收取组织后添加绿色荧光团标记(Dyl800)的XPAT以考虑可在加工期间由非相关胞内蛋白酶释放引起的人工裂解。通过比较红色荧光团标记的XPAT及绿色荧光团标记的XPAT两者的所生成的裂解产物，吾等可确定在组织加工期间体内相对于人工发生在各种组织中的裂解。截至注射至植入有肿瘤的小鼠中之后第2天，肿瘤中平均20％XPAT经活化(在9种肿瘤类型中n＝31；图16C)。
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具体实施方式
对癌症治疗剂存在显著未满足的需求。尽管已显示TCE有效诱导某些癌症的缓解，但其由于其在健康组织中的极端效力及正中目标、脱肿瘤毒性而尚未产生广泛治疗剂。借助于解释，TCE在T细胞与肿瘤细胞之间形成桥梁且活化T细胞介导的肿瘤细胞且进一步引发细胞因子扩增级联，从而促进进一步杀灭且可能提供长期免疫。TCE活化T细胞，以独立于抗原-MHC辨识的方式释放细胞溶解穿孔蛋白/颗粒酶。此产生双重反应：经由引发来自肿瘤细胞的强力细胞因子反应引起的直接肿瘤细胞死亡及肿瘤杀灭扩增。直接肿瘤细胞死亡引起肿瘤抗原释放。细胞因子反应尤其包括：增加的干扰素-γ反应，其刺激CD8 T细胞活性且刺激通过APC进行的抗原呈现；增加的IL2反应，其引起经活化T细胞增殖增加；以及增加的CXCL9及CXCL10反应，其增加T细胞募集。肿瘤抗原释放及细胞因子反应引发一起引起内源性T细胞反应的活化，此可能使抗原决定基铺展诱导长期免疫。
TCE的毒性攻击出现如下事实：大部分肿瘤目标在一定程度上亦表达于健康组织中，且正常细胞亦可产生细胞因子反应，从而导致细胞因子释放综合征(CRS)。健康组织对TCE活化T细胞的此两种强力反应产生这些药剂的总体缺乏治疗指数。
本发明通过提供条件性活化的TCE、XPAT或靶向HER2的XTEN化蛋白酶-活化型双特异性T细胞接合子(在本文中称为HER2-XPAT，且例示为AMX818)克服现存TCE的缺点。更特别是，本发明的XPAT利用肿瘤相对于健康组织中存在的调节异常蛋白酶活性，使得治疗指数能够扩大。XPAT核心由2个靶向CD3的单链抗体片段(scFv)及肿瘤目标(在例示性实施方案中，肿瘤目标为HER2)组成。两个非结构化多肽屏蔽(XTEN)连接至在空间上减少肿瘤目标和/或CD3的目标接合且延长蛋白质半衰期的核心。XTEN聚合物的特性亦使免疫原性潜在性降至最低，这是因为其不具有稳定三级结构对抗体结合不利，且不存在充当肽MHC II结合的锚残基的疏水性、芳族及带正电残基降低了T细胞抗原决定基的潜在性。在人类中，在人类生长激素及因子VIII的半衰期延长形式的情形下，在>200名经含有XTEN的药物治疗的患者中观测到XTEN聚合物的最低免疫原性。XTEN屏蔽碱基处的蛋白酶裂解位点使得肿瘤微环境中的XPAT能够蛋白水解活化，突然释放能够再导引细胞毒性T细胞杀灭表达目标的肿瘤细胞的小型高效TCE。在其中蛋白酶活性受到严格调节的健康组织中，XPAT应作为完整前驱药保持主要非活性，因此与未经遮蔽TCE相比扩大了治疗指数。
除局部活化以外，未经遮蔽PAT形式的短半衰期应进一步拓宽治疗指数，同时提供T细胞免疫改善实体肿瘤根除的效力。用于XPAT中的释放位点可通过集体地参与每一癌症标志的蛋白酶在广泛数组的肿瘤中经裂解(生长；存活及死亡；血管生成；侵袭及转移；发炎；及免疫逃避)。因此，通过采用在癌症及肿瘤发展的所有阶段中上调、但在健康组织中受到严格调节的经增强蛋白酶活性来将XPAT的TCE活性局限于肿瘤。
作为例示性HER2-XPAT的AMX-818的组分已经优化以达成在健康组织中提供充分保护、同时在广泛范围的癌症中的肿瘤中保持必需效力之间的所需平衡。为了降低前驱药活化T细胞的潜在性，除较长XTEN聚合物屏蔽(576个氨基酸屏蔽相对于HER2侧上的256个氨基酸)之外，选择较低结合亲和力用于a-CD3域。为了确保肿瘤中的AMX-818充分活化，XTEN屏蔽碱基处的蛋白酶释放位点经工程改造以经在已经报导在癌症中过度表达或调节异常的3种不同类别中的至少8种不同的蛋白酶裂解；这些蛋白酶包括若干基质金属蛋白酶(MMP)、间质蛋白酶、uPA及半胱氨酸蛋白酶、豆荚蛋白。作为安全检查点，AMX-818共接合CD3及HER2两者为T细胞活化所需的。若AMX-818在其中不存在HER2表达的发炎组织中未经遮蔽或若AMX-818遇到于其中蛋白酶受到严格控制的健康组织中表达的HER2，则T细胞活化不应发生。预期此AND-闸特点在肿瘤中提供优先活化，在所述肿瘤中存在高蛋白酶活性及高HER2表达两者。
因此，XTEN存在于XPAT上产生具有长半衰期、弱目标接合及可忽略的T细胞活化的药剂。一旦通过蛋白酶在肿瘤微环境中的作用移除XTEN，则此优先XPAT活化产生具有短半衰期、最佳目标接合及高效T细胞活化的经活化药物(PAT，不具有XTEN)，由此产生具有经增强治疗指数的强力经活化药物。本发明的HER2-XPAT能够改善T细胞接合子的毒性概况、同时维持其针对实体肿瘤的效力，因此对于此强效模态，使得治疗指数能够显著增加且目标前景能够扩大。
由作为例示性HER2-XPAT的AMX-818生成的资料概述
AMX-818的目标结合及体外生物活性已在多项研究中得到表征。利用表面等离子共振的平衡结合分析证实在人类与食蟹猕猴HER2及CD3之间对AMX-818及其代谢物的高度相当的亲和力，支持食蟹猕猴用作毒性及PK研究的物种。经蛋白水解活化的AMX-818(PAT)分别以2.4nM及2.0nM亲和力结合至人类及食蟹猕猴HER2，且分别以26.3nM及21.5nM亲和力结合至人类及食蟹猕猴CD3。对于两种物种，AMX-818遮蔽将其对HER2的亲和力降低10倍及对CD3的亲和力降低大致6倍。AMX-818分别以24.9nM及20.1nM亲和力结合至人类及食蟹猕猴HER2，而人类及食蟹猕猴的CD3亲和力分别为160nM及140.3nM。
TCE的活性视其经由有效刺激T细胞受体(TCR)活化T细胞的能力而定。TCE的极端效力来源于对少至3种TCR变得受刺激且聚结以在T细胞与靶细胞之间形成免疫突触以引发细胞毒性的最低要求。虽然T细胞接合子主要已知用于诱导细胞毒性，但其效力还涉及增强及扩增抗肿瘤免疫反应的T细胞活化下游的细胞因子驱动的作用。AMX-818、其原型AMX-818-P1及其蛋白水解代谢物对T细胞的活化为在存在高度表达HER2的肿瘤细胞BT-474(乳房)及SKOV-3(卵巢)的情况下利用Jurkat NFAT报导细胞及原代人类PBMC进行体外表征。亦通过流动式细胞测量术评估人类T细胞的表面活化标记物CD69及抑制性受体PD-1的上调。作为T细胞活化之间接量度，评估SKOV3肿瘤目标表面上的PD-1配位体PD-L1的上调，因为其响应于经活化T细胞分泌的IFN-γ受到诱导。
在存在BT-474细胞的情况下AMX-818(PAT)活化Jurkat NFAT-荧光素酶报导T细胞，其中EC50值在70pM范围内，而针对经遮蔽AMX-818及AMX-818-P1的反应与经活化AMX-818(PAT)的所述反应相比显著地减弱4个数量级，其中最大反应减少80％-90％。在不存在HER2+BT-474肿瘤细胞的情况下未观测到AMX-818(PAT)活化T细胞，此表明CD3的单价接合不足以进行活化且有效T细胞受体(TCR)刺激需要CD3及肿瘤目标两者的共接合。单独经遮蔽AMX-818代谢物AMX-818(1x-C)及AMX-818(1x-N)展现中度活性。AMX-818-不可裂解位点不诱导可检测的T细胞活化，此表明所观测到的AMX-818的最少反应可能由蛋白水解裂解驱动。
AMX-818(PAT)及前驱药AMX-818在CD4+T细胞及CD8+T细胞子集表面上诱导CD69及PD-1表达且在SKOV3肿瘤细胞上诱导PD-L1表达达至相当程度。然而，AMX-818的剂量-反应曲线偏移相对于AMX-818(PAT)的剂量-反应曲线偏移而言高平均400至650倍，此进一步证实AMX-818上的XTEN屏蔽的有效功能性遮蔽。
AMX-818及其代谢物的细胞毒性活性及发炎性细胞因子诱导经表征。周边血液单核细胞(PBMC)用作效应细胞且HER2-高BT-747乳肿瘤株经选择为肿瘤靶细胞。因为已知心脏组织表达HER2且尽管在经一些靶向HER2的疗法治疗的患者中已观测到稀少心脏毒性，因此选择原代心肌细胞(低至中等HER2)以表示AMX-818及其蛋白水解代谢物的更加生理学的细胞溶解目标。以1:1效应物:靶细胞比率进行基于发光的细胞毒性分析，且收集无细胞上清液用于量测TCE诱导的细胞因子。
AMX-818(PAT)对BT-474肿瘤细胞展现高度强效细胞毒性，展示几乎完全的靶细胞杀灭，其中半数最大抑制浓度(IC50)值在5-11pM范围内。随着较低的表达HER2的人类心肌细胞作为目标-预期不展现调节异常蛋白酶活性的细胞-细胞毒性反应减少大致13倍，且最大杀灭不完全，仅接近50％-60％。针对BT-474细胞及心肌细胞的AMX-818的细胞毒性反应强烈减弱，其中平均IC50值偏移了2500倍至3000倍，此表明前驱药的XTEN聚合物屏蔽对前驱药的有效功能性遮蔽。屏蔽通过阻碍引发靶细胞杀灭所需的功能性免疫突触形成而在细胞毒性方面提供远高于其对减少目标结合的组合影响的协同保护。AMX-818及其原型AMX-818-P1展示与其几乎相同的组合物一致的相当细胞毒性。单独经遮蔽蛋白水解代谢物AMX-818(1x-N)及AMX-818(1x-C)的细胞毒性在AMX-818(PAT)与AMX-818之间为中度的，此表明单一屏蔽的部分保护。所观测到的AMX-818的细胞毒性可能归因于基于AMX-818-不可裂解位点所提供的活性进一步降低的蛋白水解裂解，所述格式不具有两个蛋白酶裂解位点。
一般而言，根据细胞毒性分析AMX-818及其代谢物在上清液中诱导细胞因子分泌方面的相对效力与在针对BT-474及心肌细胞靶细胞两者的细胞毒性中观测到的所述相对效力成镜像(其中AMX-818(PAT)效力最高>单独经遮蔽形式>及AMX-818效力最低)。细胞因子IC50值平均高于细胞毒性反应的所述值，此表明细胞毒性为两者当中更敏感的分析。在存在BT-474及心肌细胞两者的情况下针对AMX-818的反应相对于针对AMX-818(PAT)的反应而言减少几个数量级，而单独经遮蔽代谢物AMX-818(1x-N)及AMX-818(1x-C)展示中度反应。
在存在心肌细胞的情况下，AMX-818在其最高测试浓度(300nM)下诱导的细胞因子最大含量相对于AMX-818(PAT)诱导的细胞因子最大含量而言明显地减少，IL-6除外。在存在BT-474及心肌细胞两者的情况下，在300nM浓度的AMX-818及AMX-818-不可裂解位点两者时检测到高IL-6含量，所述含量在大多数情况下超过AMX-818(PAT)产生的最大含量2倍至6倍。值得注意的是，此与在食蟹猕猴中体内观测到的情况形成对比，其中IL-6的峰值全身性含量在0.2mg/kg MTD的AMX-818(PAT)下比在42mg/kg MTD的AMX-818下高>9倍。
在评估不存在表达HER2的靶细胞的情况下的细胞因子诱导中，经悬浮液及涂布盘的AMX-818或AMX-818(PAT)处理的人类PBMC培养物中未诱导细胞因子IL-2、IL-4、TNF-α及IFN-γ。可溶性AMX-818在其最高测试浓度(500nM)下自所有PBMC供体诱导低含量IL-10。IL-6为值得注意的例外，其中500nM呈可溶性格式的AMX-818自所有供体诱导含量超过抗CD3抗体阳性对照诱导的含量的IL-6，以一定方式平均增加4.6倍。高含量IL-6亦由呈湿盘涂布格式的5个供体中的2个诱导，且亦在最高浓度的AMX-818(PAT)时看到较低含量IL-6。然而，重要的是，所述高IL-6含量不伴随作为通常与在CRS条件下的IL-6分泌共相关的细胞因子的TNF-α、IFN-γ及IL-2增加，其亦未在给药至多50mg/kg的AMX-818的食蟹猕猴中观测到。相比之下，经活化AMX-818(PAT)在cyno中在≤0.3mg/kg下诱导高含量IL-6，伴随额外发炎性细胞因子增多。
进行体内药理学、PK及毒理学研究以表征AMX-818及其代谢物的功效及安全性。除标准毒理学终点之外，在来自患有癌症或全身性自体免疫疾病的患者的血浆中长期培育之后，在施用高剂量的AMX-818或处于诱发型发炎的条件下的食蟹猕猴中及体外评估AMX-818在循环中的蛋白水解稳定性。AMX-818优先在肿瘤中裂解为显而易见的，产生蛋白酶依赖性功效，而其在NHP中的周边稳定性提供相对于预测增加的治疗指数的AMX-818(PAT)而言大的安全边限。这些数据一起支持AMX818的较强条件性遮蔽，使得循环及周边组织中能够具有局部肿瘤活性且同时具有稳定性及有效遮蔽。
进行几项体内功效研究以评估AMX-818在再导向T细胞杀灭表达HER2的肿瘤中的影响。因为AMX-818对小鼠HER2或CD3不具有交叉反应性，因此向免疫缺乏小鼠接种人类表达HER2的异种移植肿瘤且移植人类PBMC(hPBMC)作为效应T细胞来源。在高HER2 BT-474乳房模型(～975,000个HER2受体)及低HER2 HT-55结肠直肠模型(25,000个受体)中评估AMX-818的抗肿瘤活性。
在BT474模型中，施用2.1mg/kg等摩尔剂量的AMX-818及其原型AMX-818-P1或0.9mg/kg等摩尔剂量的未经遮蔽AMX-818(PAT)诱导稳健且完全的肿瘤消退。AMX-818的抗肿瘤功效视其屏蔽的蛋白酶裂解而定，如通过经不具有其蛋白酶释放位点的AMX-818形式(AMX-818-不可裂解位点)治疗的小鼠中不具有明显的肿瘤生长抑制所证实。AMX-818-P1及AMX-818(PAT)在肿瘤微环境中诱导相当的T细胞活化，如通过利用流动式细胞测量术的CD4+T细胞及CD8+T细胞上的活化标记物CD25及CD69上调所评估。重要的是，即使其中人类HER2未经表达的未经遮蔽AMX-818(PAT)亦不活化周边中的T细胞，此种情况与对HER2及CD3两者双重接合以活化T细胞及再导引其杀灭的要求一致。
单一2.1mg/kg剂量的AMX-818足以在给药4天内诱导携带较大已建立BT-474肿瘤(478mm3平均肿瘤体积)的小鼠的肿瘤消退。功效视HER2表达及T细胞两者而定，如通过在不具有hPBMC的携带肿瘤的小鼠中给药时不具有非肿瘤结合变体NB-XPAT(AMX-818之一型式，其中其HER2结合域经非HER2结合scFv置换)或AMX-818的活性所证实。这些发现进一步支持对AMX-818双重接合以获得其活性的要求且若AMX-818在其中不存在HER2的正常组织中变得裂解，则提供安全措施。
在携带低HER2 HT-55肿瘤的小鼠中，AMX-818亦诱导剂量依赖性及蛋白酶依赖性功效，其中5.1mg/kg在所有小鼠中诱导完全肿瘤消退(103％TGI，p<0.01)且2.1mg/kg诱导70％肿瘤生长抑制。AMX-818在表达25,000个HER2受体的模型中的功效提供治疗患有多种癌症类型的患者的潜能，所述癌症类型包括具有低水平HER2表达的肿瘤。最后，在携带BT-474肿瘤的小鼠中，培育2天之后，与心脏、脑及肝组织中的合并<2％相比，荧光团标记的AMX-818的未遮蔽优先于平均25.2％的AMX-818(PAT)在肿瘤中为显而易见的，此支持肿瘤中蛋白酶局部调节异常及正常组织中蛋白酶抑制显性的关键租户(tenant)。
术语
除非另外规定，否则如本文所使用的以下术语具有归属于所述术语的含义。
除非上下文另外清楚地指示，否则如说明书及权利要求书中所使用的单数形式“一个(a/an)”及“所述”包括复数个提及物。举例而言，术语“一个(a)细胞”包括复数个细胞，包括其混合物。
术语“多肽”、“肽”及“蛋白质”在本文中可互换用于指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可为直链或支链的，其可包含经修饰的氨基酸，且其可间杂有非氨基酸。所述术语亦涵盖已经修饰，例如通过双硫键形成、糖化、脂质化、乙酰化、磷酸化或诸如与标记组分结合的任何其他操纵经修饰的氨基酸聚合物。
如本文所使用的术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括但不限于甘氨酸以及D光学异构体或L光学异构体两者以及氨基酸类似物及肽模拟物。标准单字母或三字母代码用于指代氨基酸。
“宿主细胞”包括可为或已为本发明载体的受体的单独细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单一宿主细胞之后代。由于天然存在或经基因工程改造的变体，因此后代可能未必与原始母细胞完全相同(在形态或总DNA补体的基因组方面)。
“嵌合”蛋白含有至少一种在与天然存在的序列中的位置不同的序列中的位置中包含区域的融合多肽。所述区域可通常存在于独立蛋白质中且在融合多肽中结合在一起；或其可通常存在于相同蛋白质中，但在融合多肽中以新配置置放。嵌合蛋白可例如通过化学合成或通过产生及翻译其中肽区以所需关系经编码的多核苷酸而产生。
“结合(conjugated)”、“连接(linked)”、“融合(fused/fusion)”在本文中可互换使用。这些术语是指通过包括化学结合或重组手段的任何手段使超过两种化学元素或组分接合在一起。
术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”及“寡核苷酸”可互换使用。其是指聚合形式的任何长度的核苷酸，亦即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，且可执行已知或未知的任何功能。多核苷酸可包含诸如甲基化核苷酸及核苷酸类似物的经修饰的核苷酸。若存在，则可在装配聚合物之前或之后赋予核苷酸结构以修饰。核苷酸的序列可间杂有非核苷酸组分。可在诸如通过与标记组分结合进行聚合之后进一步修饰多核苷酸。
如本文所使用的具有“同源性”的多核苷酸或“同源”多核苷酸为在如本文所定义的严格条件下杂交且与那些序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、更优选地95％、更优选地97％、更优选地98％且甚至更优选地99％序列一致性的多核苷酸。
适用于多核苷酸序列的术语“一致性百分比”及“一致性％”是指使用标准化算法比对的至少两个多核苷酸序列之间的残基匹配百分比。此类算法可以标准化及可再现方式在所比较的序列中插入间隙以便使两个序列之间的比对优化，且因此达成两个序列的更有意义的比较。一致性百分比可在整个经定义多核苷酸序列的长度上量测，例如如由特定SEQID编号所定义的多核苷酸序列的长度上量测，或可在较短长度上量测，例如在获自较大经定义多核苷酸序列的片段，例如具有至少45、至少60、至少90、至少120、至少150、至少210或至少450个连续残基的片段的长度上量测。所述长度仅为例示性的，且应理解，由本文在表格、图式或序列表中显示的序列所支持的任何片段长度可用于描述可量测一致性百分比的长度。
关于在本文中得到标识的多肽序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”经定义为在比对序列且必要时引入间隙以达成最大序列一致性百分比且不将任何保守取代视为序列一致性的一部分之后，查询序列中的氨基酸残基与第二参考多肽序列或其部分的氨基酸残基之一致性百分比。出于测定氨基酸序列一致性百分比的目的而进行的比对可以此项技术内的各种方式，例如使用诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件的公开可用计算机软件来达成。本领域技术人员可确定适用于量测比对的参数，包括在所比较的序列全长内达成最大比对所需的任何算法。一致性百分比可在整个经定义多肽序列的长度上量测，例如如由特定SEQ ID编号所定义的多肽序列的长度上量测，或可在较短长度上量测，例如在获自较大经定义多肽序列的片段，例如具有至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段的长度上量测。所述长度仅为例示性的，且应理解，由本文在表格、图式或序列表中显示的序列所支持的任何片段长度可用于描述可量测一致性百分比的长度。
如本文所使用的XTEN序列的“重复性”是指3聚体重复性，且可通过计算机程序或算法或通过本领域已知的其他手段来量测。通过测定多肽内重叠3聚体序列的出现次数评估XTEN的3聚体重复性。举例而言，具有200个氨基酸残基的多肽具有198个重叠3-氨基酸序列(3聚体)，但独特3聚体序列的数目将视序列内的重复量而定。可生成评分(下文为“子序列评分”)，所述评分反映整个多肽序列中的3聚体的重复程度。在本发明的上下文中，“子序列评分”是指各独特3聚体构架在多肽的200个连续氨基酸序列中的出现率总和除以200个氨基酸序列内独特3聚体子序列的绝对数。来源于重复多肽及非重复多肽之前200个氨基酸的所述子序列评分的实施例呈现于国际专利申请公开案第WO 2010/091122 A1号的实施例73中，所述案以全文引用的方式并入。在一些实施方案中，本发明提供各自包含XTEN的BPXTEN，其中XTEN可具有小于16、或小于14、或小于12、或更优选小于10的子序列评分。
如本文所使用的术语“实质上非重复XTEN”是指XTEN，其中(1)XTEN序列中存在极少或不存在相同氨基酸类型的四个连续氨基酸的实施例，且其中(2)XTEN具有12或10或更低的子序列评分(在本文前一段落中定义)，或不存在按构成多肽序列的序列模体的自N端至C端次序的模式。
“载体”为优选在适当宿主中自主复制的核酸分子，其将所插入核酸分子传递至宿主细胞的中和/或之间。所述术语包括功能主要为将DNA或RNA插入细胞中的载体、功能主要为复制DNA或RNA的载体复制品及功能为转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。亦包括提供以上功能中超过一者的载体。“表达载体”为当引入适当宿主细胞中时可经转录及翻译成(多种)多肽的多核苷酸。“表达系统”通常是指由可用以产生所需表达产物的表达载体构成的适合的宿主细胞。
如本文所使用的术语“t1/2”是指经计算为ln(2)/Kel的终末半衰期。Kel为通过对数浓度相对于时间曲线的末端线性部分的线性回归计算的末端消除速率常数。半衰期通常指活机体中沉积的施用物质之一半数量将通过正常生物过程代谢或消除所需的时间。术语“t1/2”、“终末半衰期”、“消除半衰期”及“循环半衰期”在本文中可互换使用。
术语“抗原”、“目标抗原”或“免疫原”在本文中可互换用于指抗体片段或基于抗体片段的治疗剂所结合或具有特异性的结构或结合决定子。
如本文所用的术语“有效负载”是指具有生物或治疗活性的蛋白质或肽序列；小分子的药效团的对应物。有效负载物的实施例包括但不限于细胞因子、酶、激素及血液以及生长因子。有效负载物可进一步包含诸如化学治疗剂、抗病毒化合物、毒素或对比剂的遗传融合或化学结合部分。这些结合部分可经由可裂解或不可裂解的接头接合至多肽的其余部分。
如本文所使用的“治疗(treatment/treating)”、“缓和(palliating)”及“改善(ameliorating)”在本文中可互换使用。这些术语是指获得包括但不限于治疗效益和/或预防效益的有益或所需结果的方法。“治疗效益”是指根除或改善所治疗的潜在障碍。此外，治疗效益为在根除或改善与潜在疾病病况相关的生理症状中的一种或多种以使得在受试者中观测到好转的情况下达成，尽管如此，受试者仍可能罹患潜在障碍。为了预防效益，可向处于罹患特定疾病或病况的风险下的受试者施用组合物，或向报导疾病的生理症状中的一种或多种的受试者施用组合物，即使可能尚未对此疾病作出诊断。
如本文所使用的“治疗作用”是指生理作用，包括但不限于治愈、缓解、改善或预防人类或其他动物的疾病病况，或以其他方式增强人类或动物的身体或精神健康，这是由除诱导产生针对生物活性蛋白所具有的抗原决定基的抗体的能力以外的本发明融合多肽引起。治疗有效量的测定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其根据本文所提供的详细公开内容来进行。
如本文所使用的术语“治疗有效量”及“治疗有效剂量”是指当以一次剂量或重复剂量向受试者施用时能够对疾病状态或病况的任何症状、方面、量测参数或特征具有任何可检测的有益作用的单独或作为融合蛋白组合物的一部分的生物活性蛋白的量。所述作用不需要绝对有益。疾病病况可指障碍或疾病。
如本文所使用的术语“治疗有效剂量方案”是指单独或作为融合蛋白组合物的一部分的生物活性蛋白的连续施用剂量的排程，其中剂量为以治疗有效量给予以对疾病状态或病况的任何症状、方面、量测参数或特征产生持续有益作用。
融合多肽
本文所公开内容包括一种多肽(或融合多肽)，其包含一种或多种扩展型重组多肽(一种或多种XTEN)(如在下文更完整描述)、连接至(多种)XTEN的双特异性抗体构建体(BsAb)及一种或多种释放区段(RS)；释放区段位于XTEN与双特异性抗体构建体(BsAb)之间；且多肽(或融合多肽)具有N端氨基酸和C端氨基酸。
在一些实施方案中，多肽包含第一XTEN(诸如在下文“扩展型重组多肽(XTEN)”部分中所描述或在本文中任何其他地方所描述的XTEN)。在一些实施方案中，多肽进一步包含第二XTEN(诸如在下文“扩展型重组多肽(XTEN)”部分中所描述或在本文中任何其他地方所描述的XTEN)。在一些实施方案中，多肽在其N端处或附近包含XTEN(“N端XTEN”)。在一些实施方案中，多肽在其C端处或附近包含XTEN(“C端XTEN”)。在一些实施方案中，多肽包含N端XTEN及C端XTEN两者。在一些实施方案中，第一XTEN为N端XTEN且第二XTEN为C端XTEN。在一些实施方案中，第一XTEN为C端XTEN且第二XTEN为N端XTEN。
作为双特异性抗体(BsAb)，生物活性多肽(“BP”)连接至多肽内的一种或多种XTEN，所述多肽可称为含XTEN融合多肽：“BPXTEN”。
XTEN可包含在蛋白酶消化融合多肽(或BPXTEN)之后可自XTEN释放(经构型以释放)的一个或多个条形码片段(如下文更完整描述)。在一些实施方案中，各条形码片段与在蛋白酶完全消化多肽后可自多肽释放的所有其他肽片段(包括所有其他条形码片段(若存在))的不同之处在于序列和分子量。
(融合)多肽可包含例如在进行蛋白酶消化，从而自多肽释放(多个)条形码片段之后可自多肽释放(经构型以释放)的一个或多个参考片段(如下文更完整描述)。在一些实施方案中，各参考片段可为与在蛋白酶消化多肽后可自多肽释放的所有其他肽片段的不同之处在于序列和分子量的单一参考片段。
在一些实施方案中，多肽具有N端氨基酸和C端氨基酸。多肽可包含：(a)扩展型重组多肽(XTEN)，其包含在蛋白酶消化后可自多肽释放的条形码片段(BAR)；(b)双特异性抗体构建体(BsAb)，其包含特异性结合至分化簇3T细胞受体(CD3)的第一抗原结合片段(AF1)，所述AF1包含轻链互补决定区1(CDR-L1)、2(CDR-L2)和3(CDR-L3)以及重链互补决定区1(CDR-H1)、2(CDR-H2)和3(CDR-H3)，其中CDR-H3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；及特异性结合至人类表皮生长因子受体2(HER2)的第二抗原结合片段(AF2)；及(c)释放区段(RS)，其位于XTEN与双特异性抗体构建体之间，其中XTEN的特征在于：(i)其包含至少100个或至少150个氨基酸；(ii)其氨基酸残基的至少90％在本文中通过甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)加以标识；(iii)其包含至少4种不同类型的氨基酸，所述氨基酸在本文中通过G、A、S、T、E或P加以标识；及(iv)XTEN由复数个非重叠序列模体形成，所述复数个非重叠序列模体的长度各自为9至14个氨基酸，其中所述复数个非重叠序列模体包含：(1)一组非重叠序列模体，其中所述组非重叠序列模体中的各非重叠序列模体在XTEN中重复至少两次；及(2)非重叠序列模体，其在XTEN内仅出现一次；其中条形码片段(BAR)包括在XTEN内仅出现一次的非重叠序列模体的至少一部分；其中条形码片段(BAR)与在蛋白酶完全消化多肽后可自多肽释放的所有其他肽片段的不同之处在于序列和分子量；且其中条形码片段(BAR)不包括所述多肽的N端氨基酸或C端氨基酸。多肽可表达为融合蛋白。呈未裂解状态的融合蛋白自N端至C端可具有在本文中通过AF1-AF2-RS-XTEN、AF2-AF1-RS-XTEN、XTEN-RS-AF1-AF2或XTEN-RS-AF2-AF1加以标识的结构布置。
在本发明的多肽的一些实施方案中，XTEN为第一扩展型重组多肽(XTEN1)；形成XTEN1的复数个非重叠序列模体为第一复数个非重叠序列模体；BAR为第一条形码片段(BAR1)；且RS为第一释放区段(RS1)。在一些实施方案中，多肽可进一步包含：(d)第二扩展型重组多肽(XTEN2)，其包含：在蛋白酶消化后可自多肽释放的第二条形码片段(BAR2)；及(e)第二释放区段(RS2)，其位于第二XTEN(XTEN2)与双特异性抗体构建体(BsAb)之间，其中XTEN2的特征在于：(i)其包含至少100个或至少150个氨基酸；(ii)其氨基酸残基的至少90％在本文中通过甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)加以标识；及(iii)其包含至少4种不同类型的氨基酸，所述氨基酸在本文中通过G、A、S、T、E或P加以标识；其中第二条形码片段(BAR2)与在蛋白酶完全消化多肽后可自多肽释放的所有其他肽片段的不同之处在于序列和分子量；且其中第二条形码片段(BAR2)不包括所述多肽的N端氨基酸或C端氨基酸。XTEN1可位于双特异性抗体构建体(BsAb)的N端且XTEN2可位于双特异性抗体构建体(BsAb)的C端。可替代地，XTEN1可位于双特异性抗体构建体(BsAb)的C端且XTEN2可位于双特异性抗体构建体(BsAb)的N端。在多肽的一些实施方案中，其中(iv)XTEN2可由第二复数个非重叠序列模体形成，所述第二复数个非重叠序列模体的长度各自为9至14个氨基酸，其中第二复数个非重叠序列模体包含：(1)第二组非重叠序列模体，其中第二组非重叠序列模体中的各非重叠序列模体在第二XTEN中重复至少两次；及(2)非重叠序列模体，其在第二XTEN内仅出现一次；且其中第二条形码片段(BAR2)包括在第二XTEN内仅出现一次的非重叠序列模体的至少一部分。多肽可表达为融合蛋白，其中呈未裂解状态的融合蛋白可自N端至C端具有在本文中通过XTEN1-RS1-AF1-AF2-RS2-XTEN2、XTEN1-RS1-AF2-AF1-RS2-XTEN2、XTEN2-RS2-AF1-AF2-RS1-XTEN1、XTEN2-RS2-AF2-AF1-RS1-XTEN1、XTEN1-RS1-双特异性抗体-RS2-XTEN2或XTEN2-RS2-双特异性抗体-RS1-XTEN1加以标识的结构布置。所述双特异性抗体可包含所述AF1的轻链可变区(VLI)、所述AF1的重链可变区(VHI)、所述AF2的轻链可变区(VLII)和所述AF2的重链可变区(VHII)。
在本发明的多肽的一些实施方案中，(a)第一扩展型重组多肽(XTEN1)可包含与表3a中所阐述的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列；(b)双特异性抗体构建体(BsAb)可包含：(I)第一抗原结合片段(AF1)，其包含轻链互补决定区1(CDR-L1)、2(CDR-L2)和3(CDR-L3)以及重链互补决定区1(CDR-H1)、2(CDR-H2)和3(CDR-H3)，其中CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:8、9和10的氨基酸序列；及(II)第二抗原结合片段(AF2)，其包含在本文中通过SEQ ID NO:778-783加以标识的轻链可变区(VLII)和在本文中通过SEQ ID NO:878-883加以标识的重链可变区(VHII)；(c)第一释放区段(RS1)包含与在本文中通过SEQ ID NO:7001-7626加以标识的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列；(d)第二扩展型重组多肽(XTEN2)包含与表3a中所阐述的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列；及(e)第二释放区段(RS2)包含与在本文中通过SEQ ID NO:7001-7626加以标识的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列，其中多肽可自N端至C端具有在本文中通过以下加以标识的结构布置：XTEN1-RS1-AF2-AF1-RS2-XTEN2、XTEN1-RS1-AF1-AF2-RS2-XTEN2、XTEN2-RS2-AF2-AF1-RS1-XTEN1或XTEN2-RS2-AF1-AF2-RS1-XTEN1。
扩展型重组多肽(XTEN)
链长及氨基酸组成
在一些实施方案中，XTEN包含至少100个或至少150个氨基酸。在一些实施方案中，XTEN的长度为100至3,000个或150至3,000个氨基酸。在一些实施方案中，XTEN的长度为100至1,000个或150至1,000个氨基酸。在一些实施方案中，XTEN的长度为至少(约)100个、至少(约)150个、至少(约)200个、至少(约)250个、至少(约)300个、至少(约)350个、至少(约)400个、至少(约)450个、至少(约)500个、至少(约)550个、至少(约)600个、至少(约)650个、至少(约)700个、至少(约)750个、至少(约)800个、至少(约)850个、至少(约)900个、至少(约)950个、至少(约)1,000个、至少(约)1,100个、至少(约)1,200个、至少(约)1,300个、至少(约)1,400个、至少(约)1,500个、至少(约)1,600个、至少(约)1,700个、至少(约)1,800个、至少(约)1,900个或至少(约)2,000个氨基酸。在一些实施方案中，XTEN的长度为至多(约)100个、至多(约)150个、至多(约)200个、至多(约)250个、至多(约)300个、至多(约)350个、至多(约)400个、至多(约)450个、至多(约)500个、至多(约)550个、至多(约)600个、至多(约)650个、至多(约)700个、至多(约)750个、至多(约)800个、至多(约)850个、至多(约)900个、至多(约)950个、至多(约)1,000个、至多(约)1,100个、至多(约)1,200个、至多(约)1,300个、至多(约)1,400个、至多(约)1,500个、至多(约)1,600个、至多(约)1,700个、至多(约)1,800个、至多(约)1,900个或至多(约)2,000个氨基酸。在一些实施方案中，XTEN的长度为(约)100个、(约)150个、(约)200个、(约)250个、(约)300个、(约)350个、(约)400个、(约)450个、(约)500个、(约)550个、(约)600个、(约)650个、(约)700个、(约)750个、(约)800个、(约)850个、(约)900个、(约)950个、(约)1,000个、(约)1,100个、(约)1,200个、(约)1,300个、(约)1,400个、(约)1,500个、(约)1,600个、(约)1,700个、(约)1,800个、(约)1,900个或(约)2,000个氨基酸或前述中的任两者之间的范围。在一些实施方案中，XTEN的氨基酸残基的至少90％在本文中通过甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)加以标识。在一些实施方案中，XTEN的氨基酸残基的至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)。在一些实施方案中，XTEN包含至少4种不同类型的氨基酸，所述氨基酸为G、A、S、T、E或P，其相对于包含XTEN多肽的任何其他非重叠序列模体而言实质上随机化。在一些实施方案中，XTEN(例如，XTEN1、XTEN2等)的特征在于：(i)其包含至少100个或至少150个氨基酸；(ii)XTEN的氨基酸残基的至少90％为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)；及(iii)其包含至少4种不同类型的氨基酸，所述氨基酸来自G、A、S、T、E或P，其相对于包含XTEN多肽的任何其他非重叠序列模体而言实质上随机化。一般本领域技术人员应理解，如本文所使用的术语“谷氨酸(glutamate)”为“谷氨酸(glutamicacid)”的同义词，且是指谷氨酸残基，无论侧链羧基是否经去质子化。在一些实施方案中，含XTEN融合多肽包含第一XTEN及第二XTEN。在一些实施方案中，第一XTEN中的氨基酸总数与第二XTEN中的氨基酸总数的总和为至少300个、至少350个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个或至少800个氨基酸。
非重叠序列模体
在一些实施方案中，XTEN包含复数个非重叠序列模体或由复数个非重叠序列模体形成。在一些实施方案中，非重叠序列模体中的至少一者为循环的(或在XTEN中重复至少两次)，且其中非重叠序列模体中的至少另一者为非循环的(或在XTEN内仅存在一次)。在一些实施方案中，复数个非重叠序列模体包含(a)一组(循环)非重叠序列模体，其中所述组非重叠序列模体中的各非重叠序列模体在XTEN中重复至少两次；及(b)一非重叠(非循环)序列模体，其在XTEN内仅出现(或存在)一次。在一些实施方案中，各非重叠序列模体的长度为9至14个(或10至14个或11至13个)氨基酸。在一些实施方案中，各非重叠序列模体的长度为12个氨基酸。在一些实施方案中，复数个非重叠序列模体包含一组非重叠(循环)序列模体，其中所述组非重叠序列模体中的各非重叠序列模体(1)在XTEN中重复至少两次；及(2)长度在9个与14个氨基酸之间。在一些实施方案中，所述组(循环)非重叠序列模体包含在本文中通过表1中的SEQ ID NO:179-200和1715-1722加以标识的12聚体序列模体。在一些实施方案中，所述组(循环)非重叠序列模体包含在本文中通过表1中的SEQ ID NO:186-189加以标识的12聚体序列模体。在一些实施方案中，所述组(循环)非重叠序列模体包含表1中的SEQID NO:186-189的12聚体序列模体中的至少两个、至少三个或全部四个。
表1.用于构建XTEN的例示性12聚体序列模体
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*指示单独的模体序列，所述单独的模体序列在以各种排列一起使用时产生“家族序列”
条形码片段
在一些实施方案中，多肽包含在蛋白酶消化后可自多肽释放的条形码片段(例如XTEN的第一条形码片段、第二条形码片段或第三条形码片段)。在一些实施方案中，条形码片段(1)为包括在XTEN内仅出现(或存在)一次的(非循环、非重叠)序列模体的至少一部分的XTEN的一部分；及(2)与在蛋白酶完全消化多肽后可自多肽释放的所有其他肽片段的不同之处在于序列和分子量。一般本领域技术人员应理解，术语“条形码片段”(或“条形码”或“条形码序列”)可指在多肽内可裂解融合的XTEN的一部分或自多肽释放的所得肽片段。
在一些实施方案中，条形码片段不包括多肽的N端氨基酸或C端氨基酸。如下文更完整描述或本文任何地方所描述，在一些实施方案中，条形码片段在Glu-C消化融合多肽后可释放(经构型以释放)。在一些实施方案中，条形码片段不包括紧邻XTEN中的另一谷氨酸(若存在)的谷氨酸。在一些实施方案中，条形码片段在其C端处具有谷氨酸。一般本领域技术人员应了解，当于XTEN内可裂解地融合时，条形码片段的C端可指条形码片段内的“最后一个”(或最C端)氨基酸残基，即使其他“非条形码”氨基酸残基位于同一XTEN内的条形码片段的C端。在一些实施方案中，条形码片段具有紧随谷氨酸残基之后的N端氨基酸。在一些实施方案中，在N端氨基酸之前的谷氨酸残基不紧邻另一谷氨酸残基。在一些实施方案中，条形码片段在除条形码片段的C端以外的位置处不包括(第二)谷氨酸残基，除非所述谷氨酸之后紧随脯氨酸。在一些实施方案中，条形码片段与多肽的N端或多肽的C端相距一定距离定位，其中所述距离为10至150个或10至125个氨基酸。在一些实施方案中，条形码片段位于距多肽的N端300、280、260、250、240、220、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、48、40、36、30、24、20、12或10个氨基酸内或位置处或前述任一者之间的范围内的位置处。在一些实施方案中，条形码片段位于多肽的N端200个氨基酸内、150个氨基酸内、100个氨基酸内或50个氨基酸内。在一些实施方案中，条形码片段位于距多肽的N端10个与200个之间、30个与200个之间、40个与150个之间或50个与100个之间的氨基酸的位置处。在一些实施方案中，条形码片段位于距多肽的C端300、280、260、250、240、220、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、48、40、36、30、24、20、12或10个氨基酸内或位置处或前述任一者之间的范围内的位置处。在一些实施方案中，条形码片段位于多肽的C端200个氨基酸内、150个氨基酸内、100个氨基酸内或50个氨基酸内。在一些实施方案中，条形码片段位于距多肽的C端10个与200个之间、30个与200个之间、40个与150个之间或50个与100个之间的氨基酸的位置处。在一些实施方案中，条形码片段(BAR)的特征在于：(i)其不包括紧邻XTEN中的另一谷氨酸(若存在)的谷氨酸；(ii)其在其C端处具有谷氨酸；(iii)其具有紧随谷氨酸残基之后的N端氨基酸；及(iv)其与多肽的N端或多肽的C端相距一定距离定位，其中所述距离为10至150个氨基酸或10至125个氨基酸长度。在一些实施方案中，条形码片段(i)不包括多肽的N端氨基酸或C端氨基酸；(ii)不包括紧邻XTEN中的另一谷氨酸的谷氨酸；(iii)在其C端处具有谷氨酸；(iv)具有紧随谷氨酸残基之后的N端氨基酸；及(v)与多肽的N端或多肽的C端相距一定距离定位，其中所述距离为10至150个或10至125个氨基酸长度。在一些实施方案中，在N端氨基酸之前的谷氨酸残基不紧邻另一谷氨酸残基。在一些实施方案中，条形码片段在除条形码片段的C端以外的位置处不包括谷氨酸残基，除非所述谷氨酸之后紧随脯氨酸。一般本领域技术人员应理解，如本文所使用的术语“距离”可指距多肽的N端至条形码片段的最N端氨基酸残基或距多肽的C端至条形码片段的最C端氨基酸残基的氨基酸残基数目。在一些实施方案中，对于与生物活性多肽融合的带条形码的XTEN，带条形码的XTEN中所含的至少一个条形码片段(或至少两个条形码片段或三个条形码片段)距生物活性多肽至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300个氨基酸定位。在一些实施方案中，条形码片段的长度为至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个氨基酸。在一些实施方案中，条形码片段的长度为至少4个氨基酸。在一些实施方案中，条形码片段的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个氨基酸或前述值中的任一者之间的范围内的氨基酸。在一些实施方案中，条形码片段的长度为在4个与20个之间、在5个与15个之间、在6个与12个之间或在7个与10个之间的氨基酸。在一些实施方案中，条形码片段包含在本文中通过表2中的SEQ ID NO:68-77加以标识的氨基酸序列。
表2.在Glu-C消化物后可释放的例示性条形码片段
氨基酸序列 SEQ ID NO:
SPATSGSTPE 68(BAR001)
GSAPATSE 69(BAR002)
GSAPGTATE 70(BAR003)
GSAPGTE 71(BAR004)
PATSGPTE 72(BAR005)
SASPE 73(BAR006)
PATSGSTE 74(BAR007)
GSAPGTSAE 75(BAR008)
SATSGSE 76(BAR009)
SGPGSTPAE 77(BAR010)
在本发明的多肽的一些实施方案中，XTEN可具有由近端和远端界定的长度，其中(1)近端为相对于远端、更接近双特异性抗体构建体(BsAb)定位，且其中(2)条形码片段(BAR)可位于如自远端开始量测在XTEN的长度的5％与50％之间、7％与40％之间或10％与30％之间延伸的XTEN的区域内。
在本发明的多肽的一些实施方案中，XTEN进一步包含额外的一个或多个条形码片段，其中所述额外的一个或多个条形码片段各自与在所述蛋白酶完全消化所述多肽后可自所述多肽释放的所有其他肽片段的不同之处在于序列和分子量。在一些实施方案中，带条形码的XTEN仅包含一个条形码片段。在一些实施方案中，带条形码的XTEN包含一组条形码片段，所述组条形码片段包含第一条形码片段，诸如上文或本文任何其他地方所描述的条形码片段。在一些实施方案中，所述组条形码片段包含第二条形码片段(或另一条形码片段)，诸如上文或本文任何其他地方所描述的条形码片段。在一些实施方案中，所述组条形码片段包含第三条形码片段，诸如上文或本文任何其他地方所描述的条形码片段。在N端XTEN内融合的所述组条形码片段可称为N端组条形码(“N端组”)。在C端XTEN内融合的所述组条形码片段可称为C端组条形码(“C端组”)。在一些实施方案中，N端组包含第一条形码片段及第二条形码片段。在一些实施方案中，N端组进一步包含第三条形码片段。在一些实施方案中，C端组包含第一条形码片段及第二条形码片段。在一些实施方案中，C端组进一步包含第三条形码片段。在一些实施方案中，第二条形码片段位于同一组中的第一条形码片段的N端。在一些实施方案中，第二条形码片段位于同一组中的第一条形码片段的C端。在一些实施方案中，第三条形码片段位于第一条形码片段及第二条形码片段两者的N端。在一些实施方案中，第三条形码片段位于第一条形码片段及第二条形码片段两者的C端。在一些实施方案中，第三条形码片段位于第一条形码片段与第二条形码片段之间。在一些实施方案中，多肽包含一组条形码片段，所述组条形码片段包括第一条形码片段、另一(第二)条形码片段及至少一个额外条形码片段，其中所述组条形码片段中的各条形码片段(1)为第二XTEN的一部分且(2)与在蛋白酶完全消化多肽后可自多肽释放的所有其他肽片段的不同之处在于序列和分子量。
例示性带条形码的XTEN
13个含有一个条形码(例如，SEQ ID NO:8002-8003、8005-8009及8013)或两个条形码(例如，SEQ ID NO:8001、8004及8012)或三个条形码(例如，SEQ ID NO:8011)的例示性带条形码的XTEN的氨基酸序列说明于表3a中。在这些13个例示性带条形码的XTEN中，六个(SEQ ID NO:8001-8003、8008-8009及8011)在生物活性蛋白的C端处与生物活性蛋白融合，且七个(SEQ ID NO:8004-8007、8010及8012-8013)在生物活性蛋白的N端处融合。在一些实施方案中，XTEN与在本文中通过表3a中的SEQ ID NO:8001-8020加以标识的序列具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
表3a.例示性带条形码的XTEN
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在一些实施方案中，带条形码的XTEN可通过根据以下准则中之一或多者对通用XTEN作出一种或多种突变，诸如表3b中所列出的任何突变来获得：使XTEN中的序列变化减至最少，使XTEN中的氨基酸组成变化减至最少，实质上维持XTEN的净电荷，实质上维持(或改善)XTEN的低免疫原性，及实质上维持(或改善)XTEN的药物动力学特性。在一些实施方案中，XTEN序列与表3b中所列的SEQ ID NO:601-659中的任一者具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在一些实施方案中，与表3b中所列的SEQID NO:601-659中的任一者具有至少90％(例如，至少92％、至少95％、至少98％或至少99％)但小于100％序列一致性的XTEN序列为通过来自表3b的对应序列的一种或多种突变(例如，少于10种、少于8种、少于6种、少于5种、少于4种、少于3种、少于2种突变)来获得。在一些实施方案中，一种或多种突变包含谷氨酸残基缺失、谷氨酸残基插入、谷氨酸残基取代或取代谷氨酸残基或其任何组合。在一些实施方案中，其中XTEN序列不同于表3b中所列的SEQ ID NO:601-659中的任一者，但与其具有至少90％(例如，至少92％、至少95％、至少98％或至少99％)序列一致性，XTEN序列与表3b的对应序列之间的差异的至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或约100％涉及谷氨酸残基缺失、谷氨酸残基插入、谷氨酸残基取代或取代谷氨酸残基或其任何组合。在一些所述实施方案中，XTEN序列与表3b的对应序列之间的差异的至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或约100％涉及谷氨酸残基取代或取代谷氨酸残基或两者。如本文所使用的术语“第一氨基酸取代”是指用第一氨基酸置换第二氨基酸残基，引起第二氨基酸残基在所获得序列中的取代位置处被替换。举例而言，“谷氨酸取代”是指用谷氨酸(E)残基置换非谷氨酸残基(例如，丝氨酸(S))。如本文所使用的术语“取代第一氨基酸”是指用第二氨基酸残基置换第一氨基酸残基，引起第一氨基酸残基在所获得序列中的取代位置处经替换。举例而言，“取代谷氨酸”是指用非谷氨酸残基(例如，丝氨酸(S))置换谷氨酸残基。
表3b.用于工程改造成(多种)带条形码的XTEN的例示性通用XTEN
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在一些实施方案中，为了构建带条形码的XTEN的序列，对相对于表3b的XTEN而言中度长度的XTEN以及与表3b的XTEN相比更长长度的XTEN执行氨基酸突变，诸如其中将表1的一个或多个12聚体模体添加至表3b的通用XTEN的N端或C端的氨基酸突变。
可根据本发明使用的通用XTEN序列的额外实施例公开于美国专利公开案第2010/0239554 A1号、第2010/0323956 A1号、第2011/0046060 A1号、第2011/0046061 A1号、第2011/0077199 A1号或第2011/0172146 A1号或国际专利公开案第WO 2010091122 A1号、第WO 2010144502 A2号、第WO 2010144508 A1号、第WO 2011028228 A1号、第WO 2011028229A1号、第WO 2011028344 A2号、第WO 2014/011819 A2号或第WO 2015/023891号中。
在一些实施方案中，在多肽链内邻近于多肽链的N端的融合带条形码的XTEN(“N端XTEN”)可在N端处连接至HHHHHH(SEQ ID NO:48)或HHHHHHHH(SEQ ID NO:49)的His标签以便于纯化融合多肽。在一些实施方案中，在多肽链内在多肽链的C端处的融合带条形码的XTEN(“C端XTEN”)可在C端处包含或连接至序列EPEA以便于纯化融合多肽。在一些实施方案中，融合多肽包含N端带条形码的XTEN及C端带条形码的XTEN两者，其中N端带条形码的XTEN在N端处连接至HHHHHH(SEQ ID NO:48)或HHHHHHHH(SEQ ID NO:49)的His标签；且其中C端带条形码的XTEN在C端处连接至序列EPEA，由此便于通过本领域已知的色谱法纯化融合多肽，例如达到至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％纯度，所述色谱法包括但不限于IMAC色谱法、C-tagXL亲和矩阵及包括但不限于描述于下文实施例部分中的方法的其他所述方法。
蛋白酶消化
如上文或本文任何其他地方所描述的条形码片段可裂解地融合于XTEN内且在蛋白酶消化多肽后可自XTEN释放(经构型以释放)。在一些实施方案中，蛋白酶为Glu-C蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶在后面不跟随脯氨酸的谷氨酸残基的C端侧上裂解。一般本领域技术人员应理解，带条形码的XTEN(于其内含有(多个)条形码片段的XTEN)经设计以达成蛋白酶消化的高效率、精确度及准确度。举例而言，一般本领域技术人员应理解，XTEN序列中的相邻Glu-Glu(EE)残基可在Glu-C消化后产生不同裂解模式。因此，当Glu-C蛋白酶用于条形码释放时，带条形码的XTEN或(多个)条形码片段可不含有任何Glu-Glu(EE)序列。一般本领域技术人员亦应理解，若二肽Glu-Pro(EP)序列存在于融合多肽中，则其在条形码释放过程期间可不经Glu-C蛋白酶裂解。
BPXTEN的结构构型
在一些实施方案中，BPXTEN融合蛋白包含单一BP及单一XTEN。所述BPXTEN可具有至少以下构型排列，各构型排列为按N端至C端方向列出：BP-XTEN；XTEN-BP；BP-S-XTEN；及XTEN-S-BP。
在一些实施方案中，BPXTEN包含C端XTEN及任选选用的于XTEN与BP之间之间隔子序列(S)(诸如本文，例如表C中所描述之间隔子序列(S))。所述BPXTEN可由式I表示(N端至C端描绘)：
(BP)-(S)x-(XTEN) (I)，
其中BP为如下文中所描述的生物活性蛋白；S为可任选包括BP释放区段(如下文更完整描述)的具有1个至约50个之间的氨基酸残基之间隔子序列(诸如本文，例如表C中所描述之间隔子序列)；x为0或1；且XTEN可为如上文或本文任何其他地方所描述的任何XTEN。
在一些实施方案中，BPXTEN包含N端XTEN及任选选用的于XTEN与BP之间之间隔子序列(S)(诸如本文，例如表C中所描述之间隔子序列(S))。所述BPXTEN可由式II表示(N端至C端描绘)：
(XTEN)-(S)x-(BP) (II)，
其中BP为如下文中所描述的生物活性蛋白；S为可任选包括BP释放区段(如下文更完整描述)的具有1个至约50个之间的氨基酸残基之间隔子序列(诸如本文，例如表C中所描述之间隔子序列)；x为0或1；且XTEN可为如上文或本文任何其他地方所描述的任何XTEN。
在一些实施方案中，BPXTEN包含N端XTEN及C端XTEN两者。所述BPXTEN(例如，图1-2中的XPAT)可由式III表示：
(XTEN)-(S)y-(BP)-(S)z-(XTEN) (III)
其中BP为如下文中所描述的生物活性蛋白；S为可任选包括BP释放区段(如下文更完整描述)的具有1个至约50个之间的氨基酸残基之间隔子序列(诸如本文，例如表C中所描述之间隔子序列)；y为0或1；z为0或1；且XTEN可为如上文或本文任何其他地方所描述的任何XTEN。
生物活性多肽
包含在本文中通过表6a-6f的序列加以标识的序列的与XTEN(如本文在上文中所描述或本文任何其他地方所描述)融合的生物活性蛋白(BP)，尤其下文所公开的生物活性蛋白(BP)，以及其对应核酸及氨基酸序列为本领域熟知的。这些BP的描述及序列可在诸如化学摘要服务数据库(例如CAS注册管理机构)、基因库(GenBank)、通用蛋白质资源(UniProt)及诸如GenSeq(例如德文特(Derwent))的订阅提供数据库的公共数据库中获得。多核苷酸序列可为编码给定BP的野生型多核苷酸序列(例如全长或成熟)，或在一些情况下，所述序列可为野生型多核苷酸序列的变体(例如编码野生型生物活性蛋白的多核苷酸)，其中多核苷酸的DNA序列已经优化，例如以用于在特定物种中表达；或编码诸如定点突变体或对偶基因变体的野生型蛋白质变体的多核苷酸。使用本领域已知的方法和/或结合本文所提供的指南及方法使用野生型或共同cDNA序列或BP的密码子优化变体产生本发明所涵盖的BPXTEN构建体充分在本领域技术人员能力范围内。
用于包括于BPXTEN(包含至少一种BP及至少一种XTEN的融合多肽)中的BP可包括具有生物、治疗、预防或诊断利益或功能的任何蛋白质，或适用于在向受试者施用时介导生物活性或预防或改善疾病、障碍或病况的任何蛋白质。备受关注的为寻求药物动力学参数增加、溶解度增加、稳定性提高、活性遮蔽或某种其他药物特性增强的BP，或延长终末半衰期将提高功效、安全性或引起给药频率降低和/或改善患者顺应性的那些BP。因此，考虑到各种目标制备BPXTEN融合蛋白组合物，所述目标包括与不连接至XTEN的BP相比，通过例如当向受试者施用时增加体内暴露或延长将BPXTEN保持在治疗窗内的时长来改善生物活性化合物的治疗功效。
BP可为天然全长蛋白，或可为保留天然蛋白的生物活性的至少一部分的生物活性蛋白的片段或序列变体。
在一个实施方案中，并入本发明组合物中的BP可为具有与自然界中发现的蛋白质对应的序列的重组多肽。在一些实施方案中，BP可为保留天然BP的生物活性的至少一部分的天然序列的序列变体、片段、同源物及模拟物。在非限制性实施例中，BP可为与在本文中得到标识的蛋白质序列展现至少约80％序列一致性或可替代地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的序列。在另外的非限制性实施例中，BP可为包含第一结合域及第二结合域的双特异性序列，其中对肿瘤特异性标记物或靶细胞抗原具有特异性结合亲和力的第一结合域与在本文中通过表6f加以标识的抗CD3抗体的经配对VL和VH序列展现至少约80％序列一致性或可替代地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性；且其中对效应细胞具有特异性结合亲和力的第二结合域与在本文中通过表6a加以标识的抗靶细胞抗体的经配对VL和VH序列展现至少约80％序列一致性或可替代地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。在一个实施方案中，BPXTEN融合蛋白可包含连接至XTEN的单一BP分子。在一些实施方案中，BPXTEN可包含第一BP及第二相同BP分子，产生包含连接至一种或多种XTEN的两种BP(例如两个升糖素分子或两个hGH分子)的融合蛋白。
一般而言，当体内使用时或当用于体外分析中时，BP将对给定目标(或给定数目的目标)展现结合特异性或展现另一所需生物特征。举例而言，BP可为激动剂、受体、配位体、拮抗剂、酶、抗体(例如单特异性或双特异性)或激素。备受关注的为所使用或已知适用于疾病或障碍的BP，其中天然BP具有相对短的终末半衰期，及药物动力学参数增强(其任选可通过裂解间隔子序列自融合蛋白释放)将准许频率较低的给药或经增强的药理作用的BP。亦受关注的为在最小有效剂量或血液浓度(Cmin)与最大耐受剂量或血液浓度(Cmax)之间具有窄治疗窗的BP。在所述情况下，BP与包含(多个)选择XTEN序列的融合蛋白的连接可引起这些特性的改善，使得与不连接至XTEN的BP相比，其更适用作治疗剂或预防剂。
本发明组合物所涵盖的BP可在包括但不限于以下的各种治疗性类别或疾病类别的治疗中具有效用：葡萄糖及胰岛素障碍、代谢失调、心血管疾病、凝血及出血障碍、生长障碍或病况、内分泌障碍、眼病、肾病、肝病、致瘤病况、发炎性病况、自体免疫病况等。
“抗CD3”是指针对T细胞表面蛋白CD3的单克隆抗体、其物种及序列变体以及片段，包括OKT3(也称为莫罗莫那(muromonab))及人源化抗CD3单克隆抗体(hOKT31(Ala-Ala))(KC Herold等人,New England Journal of Medicine 346:1692-1698.2002)。抗CD3通过结合所有分化T细胞上存在的T细胞受体复合物而防止T细胞活化及增殖。本发明的含抗CD3的融合蛋白可特别地用于减缓新发作1型糖尿病，包括使用抗CD3作为治疗性效应物以及针对BPXTEN组合物中的第二治疗剂BP的靶向部分。可变区的序列及抗CD3的产生已描述于美国专利第5,885,573号及第6,491,916号中。
本发明组合物的BP不限于天然全长多肽，且亦包括重组型式以及生物和/或药理活性变体或其片段。举例而言，应了解，就BP的生物活性或药理学特性而言，可在不脱离本发明精神的情况下在GP中作出各种氨基酸取代以产生变体。针对多肽序列中的氨基酸的保守取代的实施例示于表5中。然而，在其中与本文所公开的特定序列相比BP的序列一致性小于100％的BPXTEN的实施方案中，本发明涵盖用其他19种天然L-氨基酸中的任一者取代给定BP的给定氨基酸残基，所述给定氨基酸残基可处于BP的序列内的任何位置处，包括相邻氨基酸残基。若任一个取代引起生物活性发生非所需变化，则可采用替代性氨基酸中之一者，且通过本文所描述的方法或使用阐述于例如其内容以全文引用的方式并入的美国专利第5,364,934号中的针对保守及非保守突变的技术及指南中的任一者或使用本领域技术人员一般已知的方法评估构建体。另外，变体亦可包括例如多肽，其中在保留天然肽的生物活性的至少一部分的BP的全长天然氨基酸序列的N端或C端处添加或缺失一个或多个氨基酸残基。
表5：例示性保守氨基酸取代
在一些实施方案中，并入BPXTEN融合蛋白中的BP可具有与一序列展现至少约80％序列一致性、可替代地至少约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％、或100％序列一致性的序列。在一些实施方案中，并入BPXTEN中的BP可为包含第一结合域及第二结合域的双特异性序列，其中对肿瘤特异性标记物或靶细胞抗原具有特异性结合亲和力的第一结合域与在本文中通过表6f加以标识的抗CD3抗体的经配对VL和VH序列展现至少约80％序列一致性或可替代地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性；且其中对效应细胞具有特异性结合亲和力的第二结合域与在本文中通过表6a加以标识的抗靶细胞抗体的经配对VL和VH序列展现至少约80％序列一致性或可替代地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。可使用如本文所描述的分析或量测或测定参数评估前述实施方案的BP的活性，且与对应天然BP序列相比保留至少约40％、或约50％、或约55％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％或更高活性的那些序列将视为适合于包括于本发明BPXTEN中。发现保留适合水平的活性的BP可连接至上文或本文任何其他地方所描述的一种或多种XTEN多肽。在一个实施方案中，发现保留适合水平的活性的BP可连接至与来自表3a-3b的序列具有至少约80％序列一致性(例如，至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列一致性)的一种或多种XTEN多肽，从而产生嵌合融合蛋白。
T细胞接合子
BPXTEN的额外结构构型式涉及XTEN化蛋白酶活化型T细胞接合子(“XPAT”)，其中BP为双特异性抗体(例如双特异性T细胞接合子)。在一些实施方案中，XPAT组合物包含(1)包含第一结合域及第二结合域的第一部分及(2)包含释放区段的第二部分以及(3)包含膨胀部分的第三部分。在一些实施方案中，XPAT组合物具有式Ia构型(N端至C端描绘)：
(第一部分)-(第二部分)-(第三部分)(Ia)
其中第一部分为包含两个scFv的双特异性体，其中第一结合域对肿瘤特异性标记物或靶细胞抗原具有特异性结合亲和力且第二结合域对效应细胞具有特异性结合亲和力；第二部分包含能够经哺乳动物蛋白酶(如下文更完整描述，蛋白酶可具有肿瘤特异性或抗原特异性，由此活化)裂解的释放区段(RS)；且第三部分为膨胀部分。在前述实施方案中，第一部分结合域可按以下次序：(VL-VH)1-(VL-VH)2，其中“1”及“2”分别表示第一结合域及第二结合域，或(VL-VH)1-(VH-VL)2或(VH-VL)1-(VL-VH)2或(VH-VL)1-(VH-VL)2，其中经配对结合域为通过多肽接头连接(如下文更完整描述)。在一个实施方案中，第一部分VL和VH阐述于表6a-6f中；RS在本文中通过表8a-8b中所阐述的序列群加以标识(如下文更完整描述)；且膨胀部分为XTEN；白蛋白结合域；白蛋白；IgG结合域；由脯氨酸、丝氨酸及丙氨酸组成的多肽；脂肪酸；Fc域；聚乙二醇(PEG)、PLGA；或羟乙基淀粉。需要时，膨胀部分为与包含表3a-3b中所阐述的序列群的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的XTEN。在前述实施方案中，组合物为重组融合蛋白。在一些实施方案中，所述部分为通过化学结合来连接。
在一些实施方案中，XPAT组合物具有式IIa构型(N端至C端描绘)：
(第三部分)-(第二部分)-(第一部分)(IIa)
其中第一部分为包含两个scFv的双特异性体，其中第一结合域对肿瘤特异性标记物或靶细胞抗原具有特异性结合亲和力且第二结合域对效应细胞具有特异性结合亲和力；第二部分包含能够经哺乳动物蛋白酶裂解的释放区段(RS)；且第三部分为膨胀部分。在前述实施方案中，第一部分结合域可按以下次序：(VL-VH)1-(VL-VH)2，其中“1”及“2”分别表示第一结合域及第二结合域，或(VL-VH)1-(VH-VL)2或(VH-VL)1-(VL-VH)2或(VH-VL)1-(VH-VL)2，其中经配对结合域为通过多肽接头连接，如本文在下文中所描述。在一个实施方案中，第一部分VL和VH标识于表6a-6f中；RS在本文中经标识为表8a-8b中所阐述的序列群；且膨胀部分为XTEN；白蛋白结合域；白蛋白；IgG结合域；由脯氨酸、丝氨酸及丙氨酸组成的多肽；脂肪酸；或Fc域。需要时，膨胀部分为与包含表3a-3b中所阐述的序列群的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的XTEN。在前述实施方案中，组合物为重组融合蛋白。在一些实施方案中，所述部分为通过化学结合来连接。
在一些实施方案中，XPAT组合物具有式IIIa构型(N端至C端描绘)：
(第五部分)-(第四部分)-(第一部分)-(第二部分)-(第三部分)(IIIa)
其中第一部分为包含两个scFv的双特异性体，其中第一结合域对肿瘤特异性标记物或靶细胞抗原具有特异性结合亲和力且第二结合域对效应细胞具有特异性结合亲和力；第二部分包含能够经哺乳动物蛋白酶裂解的释放区段(RS)；第三部分为膨胀部分；第四部分包含可与第二部分相同或不同的能够经哺乳动物蛋白酶裂解的释放区段(RS)；且第五部分为可与第三部分相同或可与第三部分不同的膨胀部分。在前述实施方案中，第一部分结合域可按以下次序：(VL-VH)1-(VL-VH)2，其中“1”及“2”分别表示第一结合域及第二结合域，或(VL-VH)1-(VH-VL)2或(VH-VL)1-(VL-VH)2或(VH-VL)1-(VH-VL)2，其中经配对结合域为通过多肽接头连接，如本文在下文中所描述。在前述实施方案中，RS经标识为表8a-8b中所阐述的序列。在前述实施方案中，膨胀部分为XTEN；白蛋白结合域；白蛋白；IgG结合域；由脯氨酸、丝氨酸及丙氨酸组成的多肽；脂肪酸；或Fc域。需要时，膨胀部分为与在本文中通过表3a-3b中所阐述的序列加以标识的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的XTEN。在前述实施方案中，组合物为重组融合蛋白。在一些实施方案中，所述部分为通过化学结合来连接。
本发明组合物基于其设计及特定组分而有利地提供双特异性治疗剂，所述双特异性治疗剂具有较多选择性、较长半衰期，且一旦其经发现为与因疾病呈现为不健康的一个或多个目标组织相关的蛋白酶裂解，则产生较低毒性及较少副作用，以使得本发明组合物具有与本领域已知的双特异性抗体组合物相比改善的治疗指数。所述组合物适用于治疗包括但不限于癌症的某些疾病。本领域技术人员应了解，本发明组合物通过机制组合达成此非特异性相互作用减少，所述机制组合包括：通过使结合域定位至大XTEN分子得到的位阻；可挠性非结构化特征的长可挠性XTEN多肽通过为拴至组合物而能够在结合域周围振荡且移动，从而在组合物与组织或细胞之间提供阻断得到的位阻；以及与单独结合域的尺寸相比完整组合物由于大分子质量而能够穿透细胞或组织的能力减弱(XTEN的实际分子量及由于非结构化XTEN的大流体动力学半径两者均有所贡献)。然而，组合物经设计以使得当接近携带或分泌能够裂解RS的蛋白酶的目标组织或细胞时，或当在结合域已结合配位体时内化至靶细胞或组织中时，双特异性结合域通过(多种)蛋白酶作用自XTEN主体释放，从而移除位阻障壁，且更自由地发挥其药理学作用。本发明组合物可用于治疗其中需要将治疗性双特异性抗体组合物选择性递送至细胞、组织或器官的多种病况。在一个实施方案中，目标组织为癌症，所述癌症可为白血病、淋巴瘤或器官或系统肿瘤。
结合域
本发明涵盖单链结合域的用途，所述单链结合域诸如但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、线性抗体、单域抗体、单域骆驼抗体、单链抗体分子(scFv)及能够结合与效应细胞及作为癌症、肿瘤或其他恶性组织的病变组织或细胞的抗原相关的配位体或受体的双特异性抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段(AF)(例如第一抗原结合片段(AF1)或第二抗原结合片段(AF2))可(各自独立地)为嵌合或人源化抗原结合片段。抗原结合片段(AF)(例如第一抗原结合片段(AF1)或第二抗原结合片段(AF2))可(各自独立地)为Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、线性抗体或单链可变片段(scFv)。两个抗原结合片段(例如第一抗原结合片段及第二抗原结合片段)可经构型为(Fab')2或单链双特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性体包含对靶细胞标记物具有结合特异性的第一结合域及对效应细胞抗原具有结合特异性的第二结合域。在一些实施方案中，第一结合域及第二结合域可为诸如抗运载蛋白、阿德奈汀(adnectin)、非诺莫(fynomer)、阿非林(affilin)、亲和抗体、辛替恩(centyrin)或达尔潘蛋白(DARPin)的非抗体骨架。在其他实施方案中，肿瘤细胞目标的结合域为已经工程改造以结合负载有肿瘤细胞所过度表达的蛋白质的肽片段的MHC的T细胞受体的可变域。在一些实施方案中，在考虑目标组织蛋白酶的位置以及不意欲靶向的健康组织中相同蛋白酶的存在以及健康组织中目标配位体的存在、但在不健康目标组织中配位体的更多存在以便提供宽治疗窗的情况下设计XPAT组合物。“治疗窗”是指给定治疗性组合物的最小有效剂量与最大耐受剂量之间的最大差值。为了帮助达成宽治疗窗，组合物的第一部分的结合域为通过接近膨胀部分(例如，XTEN)进行遮蔽，以使得与已经哺乳动物蛋白酶裂解的组合物相比，完整组合物针对配位体中之一或两者的结合亲和力降低，由此因膨胀部分的遮蔽作用而释放第一部分。
就单链结合域而言，如充分确立，Fv为含有完整抗原辨识及结合位点的最小抗体片段；由非共价缔合的一个重链可变域(VH)及一个轻链可变域(VL)的二聚体组成。各VH及VL链内为三个互补决定区(CDR)，所述CDR相互作用以在VH-VL二聚体的表面上界定抗原结合位点；结合域的六个CDR赋予抗体或单链结合域以抗原结合特异性。在一些情况下，产生scFv，其中各scFv在各结合域内具有3、4或5个CHR。侧接CDR的构架序列具有跨物种的天然免疫球蛋白中基本上保守的三级结构，且构架残基(FR)用于将CDR保持在其适当方向上。恒定域未非结合功能所需，但可帮助稳定VH-VL相互作用。在一些实施方案中，多肽的结合位点的域可为相同或不同免疫球蛋白之一对VH-VL、VH-VH或VL-VL域，然而，一般优选地使用来自亲本抗体的各自VH及VL链制造单链结合域。多肽链内的VH及VL域的次序对本发明不具限制性；给定域次序可通常在无任何功能丧失的情况下反转，但应理解VH及VL域经排列以使得抗原结合位点可适当地折叠。因此，本发明组合物的双特异性scFv实施方案的单链结合域可按以下次序：(VL-VH)1-(VL-VH)2，其中“1”及“2”分别表示第一结合域及第二结合域，或(VL-VH)1-(VH-VL)2或(VH-VL)1-(VL-VH)2或(VH-VL)1-(VH-VL)2，其中经配对结合域为通过多肽接头连接，如本文在下文中所描述。
因此，本文所公开的例示性双特异性单链抗体中的结合域排列可为第一结合域位于第二结合域的C端的排列。V链的排列可为VH(靶细胞表面抗原)-VL(靶细胞表面抗原)-VL(效应细胞抗原)-VH(效应细胞抗原)、VH(靶细胞表面抗原)-VL(靶细胞表面抗原)-VH(效应细胞抗原)-VL(效应细胞抗原)、VL(靶细胞表面抗原)-VH(靶细胞表面抗原)-VL(效应细胞抗原)-VH(效应细胞抗原)或VL(靶细胞表面抗原)-VH(靶细胞表面抗原)-VH(效应细胞抗原)-VL(效应细胞抗原)。对于第二结合域位于第一结合域的N端的排列，以下次序为可能的：VH(效应细胞抗原)-VL(效应细胞抗原)-VL(靶细胞表面抗原)-VH(靶细胞表面抗原)、VH(效应细胞抗原)-VL(效应细胞抗原)-VH(靶细胞表面抗原)-VL(靶细胞表面抗原)、VL(效应细胞抗原)-VH(效应细胞抗原)-VL(靶细胞表面抗原)-VH(靶细胞表面抗原)或VL(效应细胞抗原)-VH(效应细胞抗原)-VH(靶细胞表面抗原)-VL(靶细胞表面抗原)。如本文所使用的“的N端”或“的C端”及其文法变体指示一级氨基酸序列内的相对位置，而非于双特异性单链抗体的绝对N端或C端处的置放。因此，作为一非限制性实施例，“位于第二结合域的C端”的第一结合域指示第一结合域位于双特异性单链抗体内的第二结合域的羧基侧上，且不排除例如His标签的额外序列或诸如放射性同位素的另一化合物位于双特异性单链抗体的C端处的可能性。
在一个实施方案中，嵌合多肽总成组合物包含有包含第一结合域及第二结合域的第一部分，其中所述结合域中的各者为scFv且其中各scFv包含一个VL及一个VH。在一些实施方案中，嵌合多肽总成组合物包含有包含第一结合域及第二结合域的第一部分，其中所述结合域呈双特异性抗体构型且其中各域包含一个VL域及一个VH。
据设想，本发明的XPAT组合物的scFv实施方案包含第一结合域及第二结合域，其中VL和VH域分别来源于对肿瘤特异性标记物或靶细胞抗原及效应细胞抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在其他情况下，第一结合域及第二结合域各自包含六个来源于对靶细胞标记物具有结合特异性的单克隆抗体的CDR，所述靶细胞标记物分别诸如为肿瘤特异性标记物及效应细胞抗原。在其他实施方案中，本发明组合物的第一部分的第一结合域及第二结合域在各结合域内可具有3、4或5个CHR。在其他实施方案中，本发明的实施方案包含第一结合域及第二结合域，其中各结合域包含CDR-H1区、CDR-H2区、CDR-H3区、CDR-L1区、CDR-L2区及CDR-H3区，其中所述区中的各者来源于分别能够结合肿瘤特异性标记物或靶细胞抗原及效应细胞抗原的单克隆抗体。在一个实施方案中，本发明提供嵌合多肽总成组合物，其中第二结合域包含来源于能够结合人类CD3的单克隆抗体的VH及VL区。在一些实施方案中，本发明提供嵌合多肽总成组合物，其中scFv第二结合域包含VH及VL区，其中各VH及VL区与标识于表6a中的抗CD3抗体的经配对VL和VH序列展现至少约90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％一致性或与所述经配对VL和VH序列一致。在一些实施方案中，本发明的第二域实施方案包含CDR-H1区、CDR-H2区、CDR-H3区、CDR-L1区、CDR-L2区及CDR-H3区，其中所述区中的各者来源于在本文中经标识为表6a中所阐述的抗体的单克隆抗体。在前述实施方案中，VH和/或VL域可经构型为scFv、双特异性抗体、单域抗体或单域骆驼抗体。
在其他实施方案中，本发明组合物的第二域来源于在本文中经标识为表6a中所阐述的抗体的抗CD3抗体。在前述物质的一个实施方案中，本发明组合物的第二域包含在本文中经标识为表6a中所阐述的抗体群的抗CD3抗体的经配对VL和VH区序列。在一些实施方案中，本发明提供嵌合多肽总成组合物，其中第二结合域包含VH及VL区，其中各VH及VL区与表6a的huUCHT1抗CD3抗体的经配对VL和VH序列展现至少约90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％一致性或与所述经配对VL和VH序列一致。在前述实施方案中，VH和/或VL域可经构型为scFv、双特异性抗体的一部分、单域抗体或单域骆驼抗体。
在其他实施方案中，组合物的第一域的scFv来源于经标识为表6f中所阐述的抗体的抗肿瘤细胞抗体。在一些实施方案中，本发明提供嵌合多肽总成组合物，其中第一结合域包含VH及VL区，其中各VH及VL区与标识于表6f中的抗肿瘤细胞抗体的经配对VL和VH序列展现至少约90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％一致性或与所述经配对VL和VH序列一致。在前述物质的一个实施方案中，所叙述组合物的第一域包含本文所公开的抗肿瘤细胞抗体的经配对VL和VH区序列。在前述实施方案中，VH和/或VL域可经构型为scFv、双特异性抗体的一部分、单域抗体或单域骆驼抗体。
在一些实施方案中，嵌合多肽总成组合物包含有包含第一结合域及第二结合域的第一部分，其中所述结合域呈双特异性抗体构型且所述结合域中的各者包含一个VL域及一个VH域。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体实施方案包含第一结合域及第二结合域，其中VL和VH域来源于分别对肿瘤特异性标记物或靶细胞抗原及效应细胞抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体实施方案包含第一结合域及第二结合域，其中各结合域包含CDR-H1区、CDR-H2区、CDR-H3区、CDR-L1区、CDR-L2区及CDR-H3区，其中所述区中的各者来源于分别能够结合肿瘤特异性标记物或靶细胞抗原及效应细胞抗原的单克隆抗体。据设想，本发明的双特异性抗体实施方案包含第一结合域及第二结合域，其中VL和VH域来源于分别对肿瘤特异性标记物或靶细胞抗原及效应细胞抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体实施方案包含第一结合域及第二结合域，其中各结合域包含CDR-H1区、CDR-H2区、CDR-H3区、CDR-L1区、CDR-L2区及CDR-H3区，其中所述区中的各者来源于分别能够结合肿瘤特异性标记物或靶细胞抗原及效应细胞抗原的单克隆抗体。在一个实施方案中，本发明提供嵌合多肽总成组合物，其中双特异性抗体第二结合域包含来源于能够结合人类CD3的单克隆抗体的经配对VH及VL区。在一些实施方案中，本发明提供嵌合多肽总成组合物，其中双特异性抗体第二结合域包含VH及VL区，其中各VH及VL区与标识于表6a中的抗CD3抗体的经配对VL和VH序列展现至少约90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％一致性或与所述经配对VL和VH序列一致。在一些实施方案中，本发明提供嵌合多肽总成组合物，其中双特异性抗体第二结合域包含VH及VL区，其中各VH及VL区与表6a的huUCHT1抗体的VL和VH序列展现至少约90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％一致性或与所述VL和VH序列一致。在其他实施方案中，组合物的双特异性抗体第二域来源于本文所描述的抗CD3抗体。在一些实施方案中，本发明提供嵌合多肽总成组合物，其中双特异性抗体第一结合域包含VH及VL区，其中各VH及VL区与标识于表6f中的抗肿瘤细胞抗体的VL和VH序列展现至少约90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％一致性或与所述VL和VH序列一致。在其他实施方案中，组合物的双特异性抗体第一域来源于本文所描述的抗肿瘤细胞抗体。
本发明的量测本发明组合物的结合亲和力和/或其他生物活性的方法可为本文所公开的方法或本领域一般已知的方法。举例而言，表示为Kd的结合对(例如抗体及抗原)的结合亲和力可使用各种适合的分析或如实施例中所描述来加以测定，所述分析包括但不限于放射性结合分析；非放射性结合分析，诸如荧光共振能量转移及表面等离子共振(SPR，Biacore)；以及酶联免疫吸附分析(ELISA)、动力学排除分析(KinExA)。与同膨胀部分连接的嵌合多肽总成相比，例如已裂解以移除膨胀部分的嵌合多肽总成的结合亲和力增加或降低可通过量测嵌合多肽总成在具有及不具有膨胀部分的情况下与其目标结合搭配物的结合亲和力来测定。
本发明嵌合总成的半衰期量测可通过各种适合的方法来执行。举例而言，物质的半衰期可通过向受试者施用物质且周期性地取样生物样本(例如生物流体，诸如血液或血浆或腹水)以测定随时间推移的样本中所述物质的浓度和/或量来测定。生物样本中物质的浓度可使用各种适合的方法测定，所述方法包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫墨点及包括高压液相色谱法及快速蛋白质液相色谱法的色谱技术。在一些情况下，物质可经诸如放射性卷标或荧光卷标的可检测卷标标记，所述可检测卷标可用于测定样本(例如血液样本或血浆样本)中物质的浓度。随后，根据结果测定各种药物动力学参数，所述测定可使用诸如SoftMax Pro软件的软件包或通过本领域已知的手动计算来进行。
另外，可量测嵌合多肽总成组合物的物理化学特性以确定溶解程度、结构及稳定性保留。进行允许测定结合域针对配位体的结合特征的本发明组合物的分析，所述结合特征包括结合解离常数(Kd、Kon及Koff)、配位体-受体复合物的解离半衰期以及与自由配位体相比结合域抑制螯合配位体的生物活性的活性(IC50值)。术语“IC50”是指抑制配位体激动剂之一半最大生物反应所需的浓度，且一般通过竞争结合分析来测定。术语“EC50”是指达成活性物质之一半最大生物反应所需的浓度，且一般通过ELISA或基于细胞的分析来测定，所述分析包括本文所描述的实施例的方法。
抗CD3结合域
在一些实施方案中，本发明提供包含对T细胞具有结合亲和力的第一部分的结合域的嵌合多肽总成组合物。在一个实施方案中，第二部分的结合域包含来源于结合CD3的单克隆抗体的VL和VH。在一些实施方案中，结合域包含来源于针对CD3ε和/或CD3δ的单克隆抗体的VL和VH。针对CD3的单克隆抗体的VL和VH序列的例示性非限制性实施例呈现于表6a中。在一个实施方案中，本发明提供包含对CD3具有结合亲和力的结合域的嵌合多肽总成，所述结合域包含表6a中所阐述的抗CD3 VL和VH序列。在一些实施方案中，本发明提供包含对CD3ε具有结合亲和力的第一部分的结合域的嵌合多肽总成，所述结合域包含表6a中所阐述的抗CD3εVL和VH序列。在一些实施方案中，本发明提供嵌合多肽总成组合物，其中第一部分的scFv第二结合域包含VH及VL区，其中各VH及VL区与表6a的huUCHT1抗CD3抗体的经配对VL和VH序列展现至少约90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％一致性或与所述经配对VL和VH序列一致。在一些实施方案中，本发明提供包含对CD3具有结合亲和力的结合域的嵌合多肽总成组合物，所述结合域包含CDR-L1区、CDR-L2区、CDR-L3区、CDR-H1区、CDR-H2区及CDR-H3区，其中各区来源于表6a中所阐述的各自抗CD3 VL和VH序列。在一些实施方案中，本发明提供包含对CD3具有结合亲和力的结合域的嵌合多肽总成组合物，所述结合域包含CDR-L1区、CDR-L2区、CDR-L3区、CDR-H1区、CDR-H2区及CDR-H3区，其中CDR序列为RASQDIRNYLN(SEQ ID NO:50)、YTSRLESQQGNTLPWT(SEQ IDNO:78)、GYSFTGYTMN(SEQ ID NO:79)、LINPYKGVST(SEQ ID NO:80)及SGYYGDSDWYFDV(SEQ ID NO:81)。
CD3复合物为与T细胞抗原受体(TCR)缔合的细胞表面分子群且作用于TCR的细胞表面表达及在肽:MHC配位体结合至TCR时起源的信号传导转导级联。通常，当抗原结合至T细胞受体时，CD3经由细胞膜将信号发送至T细胞内部的细胞质。此引起T细胞活化，所述T细胞迅速分裂以产生对攻击TCR所暴露的特定抗原敏感的新T细胞。CD3复合物由CD3ε分子以及四种其他膜结合多肽(CD3-γ、CD3-δ和/或CD3-ζ)构成。在人类中，CD3-ε由染色体11上的CD3E基因编码。CD3链中的各者的胞内域含有基于免疫受体酪氨酸的活化模体(ITAM)，所述ITAM充当用于T细胞受体接合后胞内信号转导机制的成核点。
多种治疗性策略通过靶向TCR信号传导调节T细胞免疫，特别是临床上广泛用于免疫抑制方案的抗人类CD3单克隆抗体(MAb)。CD3特异性小鼠mAb OKT3为授权用于人类的第一mAb(Sgro,C.Side-effects of a monoclonal antibody,muromonab CD3/orthocloneOKT3:bibliographic review.Toxicology 105:23-29,1995)且临床上广泛用作移植(Chatenoud,Clin.Transplant 7:422-430,(1993)；Chatenoud,Nat.Rev.Immunol.3:123-132(2003)；Kumar,Transplant.Proc.30:1351-1352(1998))、1型糖尿病及牛皮癣的免疫抑制剂。重要的是，抗CD3 mAb可诱导部分T细胞信号传导及克隆失能(Smith,JA,Nonmitogenic Anti-CD3 Monoclonal Antibodies Deliver a Partial T Cell ReceptorSignal and Induce Clonal Anergy J.Exp.Med.185:1413-1422(1997))。OKT3已在文献中描述为T细胞促分裂原以及强效T细胞杀手(Wong,JT.The mechanism of anti-CD3monoclonal antibodies.Mediation of cytolysis by inter-T cellbridging.Transplantation 50:683-689(1990))。特别是，Wong的研究表明，通过桥接CD3T细胞及靶细胞，吾人可达成目标杀灭，且FcR介导的ADCC及补体结合两者均不为二价抗CD3MAB溶解靶细胞所必需。
OKT3以时间依赖性方式展现细胞分裂及T细胞杀灭活性两者；在T细胞早期活化之后引起细胞因子释放，在进一步施用后，OKT3稍后阻断所有已知T细胞功能。由于此T细胞功能的稍后阻断，因此发现OKT3作为减少或甚至消除同种异体移植组织排斥的疗法方案中的免疫抑制剂的此广泛应用。其他对CD3分子具有特异性的抗体公开于Tunnacliffe,Int.Immunol.1(1989),546-50中，WO2005/118635及WO2007/033230描述抗人类单克隆CD3ε抗体，美国专利5,821,337描述鼠类抗CD3单克隆Ab UCHT1的VL和VH序列(muxCD3,Shalaby等人，J.Exp.Med.175,217-225(1992)及此抗体的人源化变体(hu UCHT1)，以及美国专利申请20120034228公开能够结合至人类及非黑猩猩灵长类动物CD3ε链的抗原决定基的结合域。
表6a：抗CD3单克隆抗体及序列
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*若存在带下划线的序列，则其为VL和VH内的CDR
CD3细胞抗原结合片段
在一些实施方案中，本发明涉及对效应细胞抗原具有特异性结合亲和力的抗原结合片段(AF1)，所述AF1可并入本文所描述的本发明组合物实施方案中的任一者中。在一些情况下，效应细胞抗原为表达于以下效应细胞的表面上：浆细胞、T细胞、B细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)、肥大细胞、树突状细胞、调节性T细胞(RegT细胞)、辅助T细胞、骨髓细胞或NK细胞。
各种结合效应细胞抗原的AF1特别用于以针对HER2抗原的结合亲和力与呈组合物格式的同病变细胞或组织相关的抗原结合片段配对以便实现病变细胞或组织的细胞杀灭。结合特异性可通过互补决定区或CDR，诸如轻链CDR或重链CDR来测定。在许多情况下，结合特异性为通过轻链CDR及重链CDR来测定。重链CDR及轻链CDR的给定组合提供给定结合袋，与其他参考抗原相比，所述给定结合袋赋予更高的针对效应细胞抗原的亲和力和/或特异性。具有通过短可挠性肽接头连接至对效应细胞抗原具有结合特异性的第二抗原结合片段(AF2)的针对HER2的第一抗原结合片段(AF1)的所得双特异性组合物为双特异性的，其中各抗原结合片段对其各自配位体具有特异性结合亲和力。应理解，在所述组合物中，针对疾病组织的HER2的AF2与针对效应细胞标记物的AF1组合使用，以便使效应细胞非常接近疾病组织的细胞，以便实现病变组织的细胞的细胞溶解。此外，AF1及AF2并入包含可裂解释放区段及XTEN的经特定设计的多肽中以便赋予组合物以前驱药特征，所述组合物通过在接近具有能够在释放区段序列中的一个或多个位置中裂解释放区段的蛋白酶的疾病组织时裂解释放区段后释放融合AF1及AF2而活化。
在一个实施方案中，本发明组合物的AF1对在T细胞表面上表达的效应细胞抗原具有结合亲和力。在一些实施方案中，本发明组合物的AF1对CD3具有结合亲和力。在一些实施方案中，本发明组合物的AF1对CD3复合物的成员具有结合亲和力，所述成员包括呈单独形式或独立地组合形式的CD3复合物的所有已知CD3亚单元；例如CD3ε、CD3δ、CD3γ及CD3ζ。在一些实施方案中，AF1对CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ具有结合亲和力。
本发明涵盖的抗原结合片段的来源可来源于天然存在的抗体或其片段、非天然存在的抗体或其片段、人源化抗体或其片段、合成抗体或其片段、杂交抗体或其片段或经工程改造的抗体或其片段。生成针对给定目标标记物的抗体的方法为本领域熟知的。举例而言，单克隆抗体可使用首先由Kohler等人,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制造，或可通过重组DNA方法(美国专利第4,816,567号)来制造。抗体及其片段、抗体的重链及轻链可变区(VH及VL)、单链可变区(scFv)、互补决定区(CDR)及域抗体(dAb)的结构得到充分理解。生成具备对给定抗原具有结合亲和力的所需抗原结合片段的多肽的方法为本领域已知的。
应理解，用于本文所公开的组合物实施方案的术语“抗原结合片段”意欲包括保留结合作为对应完整抗体的配位体的抗原的能力的抗体的部分或片段。在所述实施方案中，抗原结合片段可为但不限于抗体的轻链和/或重链(VL、VH)的CDR及介入构架区、可变区或高变区、可变片段(Fv)、Fab'片段、F(ab')2片段、Fab片段、单链抗体(scAb)、VHH骆驼抗体、单链可变片段(scFv)、线性抗体、单域抗体、互补决定区(CDR)、域抗体(dAb)、BHH或BNAR类型的单域重链免疫球蛋白、单域轻链免疫球蛋白或本领域已知含有能够结合抗原的抗体的片段的其他多肽。具有CDR-H及CDR-L的抗原结合片段可在N端至C端的(CDR-H)-(CDR-L)或(CDR-H)-(CDR-L)方向上经构型。两个抗原结合片段的VL和VH亦可以单链双特异性抗体构型经构型；亦即，AF1及AF2的VL和VH经构型有适当长度的接头以准许排列为双特异性抗体。
本发明的各种CD3结合AF1已经特异性地修饰以增强其在本文所描述的多肽实施方案中的稳定性。抗体的蛋白质聚集继续为其可发展性中的显著问题且仍为抗体产生中的主要焦点区域。抗体聚集可通过以下触发：部分展开其域，从而引起单体-单体缔合，接着为成核及聚集生长。尽管抗体及基于抗体的蛋白质的聚集倾向可受外部实验条件影响，但其很大程度上视如通过其序列及结构测定的固有抗体特性而定。尽管熟知蛋白质仅在其折叠状态下略微稳定，但通常不太充分了解，大部分蛋白质在其展开或部分展开状态下固有地易于聚集，且所得聚集体可极其稳定且长生的。聚集倾向减少亦已展示为伴随表达力价增加，展示减少蛋白质聚集在整个发展过程中有益且可产生临床研究的更高效路径。对于治疗性蛋白，聚集体为患者中不利免疫反应的显著风险因素，且可经由多种机制形成。控制聚集可改善蛋白质稳定性、可制造性、耗损速率、安全性、调配、力价、免疫原性及溶解性。诸如尺寸、疏水性、静电及电荷分布的蛋白质固有特性在蛋白质溶解中起重要作用。已展示归因于表面疏水性的治疗性蛋白的低溶解性使得调配物研发更加困难且可导致不良的体内生物分布、非所需药物动力学行为及免疫原性。降低候选单克隆抗体的总体表面疏水性亦可提供与纯化及给药方案相关的效益及成本节约。单独氨基酸可通过结构分析标识为贡献于抗体中的聚集潜能，且可位于CDR以及构架区中。特别是，可预测残基处于在给定抗体中造成疏水性问题的高风险下。在一个实施方案中，本发明提供能够特异性结合CD3的AF1，其中AF1相对于亲本抗体或抗体片段而言在构架区中具有至少一个疏水性氨基酸的氨基酸取代，其中疏水性氨基酸为异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。在一些实施方案中，CD3 AF1在一个或多个构架区中具有至少两个疏水性氨基酸的氨基酸取代，其中疏水性氨基酸为异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。
等电点(pI)为抗体或抗体片段不具有净电荷的时的pH。若pH低于抗体或抗体片段的pI，则其将具有净正电荷。较大正电荷倾向于与血液清除及组织滞留增加相关，一般伴随较短的半衰期。若pH大于抗体或抗体片段的pI，则其将具有负电荷。负电荷一般引起经减少的组织吸收及较长的半衰期。经由构架残基突变操纵此电荷为可能的。这些考虑因素告知本文所描述的实施方案的AF1的序列设计，其中相对于用作起点的亲本抗体而言进行单独氨基酸取代。多肽的等电点可以数学方式(例如以计算方式)或在体外分析中以实验方式测定。等电点(pI)为蛋白质具有零净电荷的时的pH，且可使用蛋白质序列中特定氨基酸的电荷来计算。电荷的估计值称为酸解离常数或pKa值且用于计算pI。pI可通过诸如毛细管等电聚焦(参见Datta-Mannan,A.等人The interplay of non-specific binding,target-mediated clearance and FcRn interactions on the pharmacokinetics of humanizedantibodies.mAbs 7:1084(2015)；Li,B.等人Framework selection can influencepharmacokinetics of a humanized therapeutic antibody through differences inmolecule charge.mAbs 6,1255-1264(2014))或本领域已知的其他方法的方法来体外测定。在一些实施方案中，AF1及AF2的等电点经设计以在彼此的特定范围内，由此促进稳定性。
在一个实施方案中，本发明提供用于本文所描述的多肽实施方案中的任一者中的抗原结合片段(例如AF1或AF2)，所述抗原结合片段包含CDR-L及CDR-H(参见表6b)，其中抗原结合片段(例如AF1或AF2)(a)特异性结合至分化簇3T细胞受体(CD3)；及(b)包含分别具有SEQ ID NO:8、9和10的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。在一些实施方案中，抗原结合片段(AF)的CDR-H1及CDR-H2可分别包含SEQ ID NO:8和9的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供用于本文所描述的多肽实施方案中的任一者中的抗原结合片段(例如AF1或AF2)，所述抗原结合片段包含CDR-L及CDR-H，其中抗原结合片段(例如AF1或AF2)(a)特异性结合至分化簇3T细胞受体(CD3)；(b)包含分别具有SEQ ID NO:8、9和10的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。抗原结合片段(例如AF1或AF2)可包含CDR-L，其中CDR-L包含具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列的CDR-L2及具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，在所述肽包含有包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的抗原结合片段(AF)(例如AF1或AF2)的情况下，AF的所述CDR-L1可包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列；AF的所述CDR-L2可包含SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列；且AF的所述CDR-L3可包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，在所述肽包含有包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的抗原结合片段(AF)(例如AF1或AF2)的情况下，AF的所述CDR-L1可包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；AF的所述CDR-L2可包含SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列；且AF的所述CDR-L3可包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，在所述肽包含有包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的抗原结合片段(AF)(例如AF1或AF2)的情况下，AF的所述CDR-L1可包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；AF的所述CDR-L2可包含SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列；且AF的所述CDR-L3可包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，在所述肽包含有包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的抗原结合片段(AF)(例如AF1或AF2)的情况下，AF的所述CDR-L1可包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；AF的所述CDR-L2可包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；且AF的所述CDR-L3可包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，在所述肽包含有包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的抗原结合片段(AF)(例如AF1或AF2)的情况下，AF的所述CDR-L1可包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；AF的所述CDR-L2可包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；且AF的所述CDR-L3可包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一些实施方案中，前一段落之前述抗原结合片段(AF)(例如AF1或AF2)实施方案进一步包含轻链构架区(FR-L)及重链构架区(FR-H)(参见表6c)，其中抗原结合片段(AF)可包含：与SEQ ID NO:51的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L1、与SEQ ID NO:52的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L2、与SEQ ID NO:53-56中的任一者的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L3、与SEQ IDNO:59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L4。抗原结合片段(AF)可包含：与SEQ ID NO:51的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L1、与SEQ ID NO:52的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L2、与SEQ ID NO:53的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L3、与SEQ ID NO:59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L4。抗原结合片段(AF)可包含：与SEQIDNO:51的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L1、与SEQ IDNO:52的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L2、与SEQ ID NO:54的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L3、与SEQ ID NO:59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L4。抗原结合片段(AF)可包含：与SEQ ID NO:51的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L1、与SEQ ID NO:52的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L2、与SEQ ID NO:55的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L3、与SEQ ID NO:59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L4。抗原结合片段(AF)可包含：与SEQ ID NO:51的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L1、与SEQ ID NO:52的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L2、与SEQ ID NO:56的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L3、与SEQ ID NO:59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L4。抗原结合片段(AF)可包含：与SEQ ID NO:60-63中的任一者的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H1、与SEQ ID NO:64的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H2、与SEQ ID NO:65或66的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H3及与SEQ ID NO:67的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H4。抗原结合片段(AF)可包含：与SEQ ID NO:60的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H1、与SEQ ID NO:64的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H2、与SEQ ID NO:65的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H3及与SEQ ID NO:67的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H4。抗原结合片段(AF)可包含：与SEQ ID NO:61的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H1、与SEQ ID NO:64的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H2、与SEQ IDNO:65的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H3及与SEQ ID NO:67的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H4。用于本文所描述的多肽实施方案中的任一者中的抗原结合片段(AF)(例如，AF1或AF2)可包含轻链构架区(FR-L)及重链构架区(FR-H),其中AF可包含：与SEQ ID NO:51的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L1、与SEQ ID NO:52的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L2、与SEQ ID NO:53-56中的任一者的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L3、与SEQ ID NO:59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L4；与SEQ ID NO:60或61的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H1、与SEQ ID NO:64的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H2、与SEQ ID NO:65的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H3及与SEQ ID NO:67的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H4。AF可包含：与SEQ ID NO:51的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L1、与SEQ ID NO:52的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L2、与SEQ ID NO:53的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L3、与SEQ ID NO:59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L4；与SEQ ID NO:60的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H1、与SEQ ID NO:64的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H2、与SEQ ID NO:65的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H3及与SEQ ID NO:67的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H4。AF可包含：与SEQ ID NO:51的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L1、与SEQ ID NO:52的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L2、与SEQ ID NO:54的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L3、与SEQ ID NO:59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L4；与SEQ ID NO:61的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H1、与SEQ ID NO:64的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H2、与SEQ ID NO:65的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H3及与SEQ ID NO:67的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H4。AF可包含：与SEQ ID NO:51的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L1、与SEQ ID NO:52的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L2、与SEQ ID NO:55的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L3、与SEQ ID NO:59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L4；与SEQ ID NO:61的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H1、与SEQ ID NO:64的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H2、与SEQ ID NO:65的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H3及与SEQ ID NO:67的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H4。AF可包含：与SEQ ID NO:51的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L1、与SEQ ID NO:52的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L2、与SEQ IDNO:56的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L3、与SEQ ID NO:59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-L4；与SEQ ID NO:61的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H1、与SEQ ID NO:64的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H2、与SEQ ID NO:65的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H3及与SEQ ID NO:67的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的FR-H4。
在一些实施方案中，本发明提供用于本文所描述的多肽实施方案中的任一者中的抗原结合片段(AF)(例如AF1或AF2)，其中AF包含与表6d的SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:105的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的可变重链(VH)氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供用于本文所描述的多肽实施方案中的任一者中的AF，其中AF包含与表6d的SEQ ID NO:101、103、104、106或107中的任一者的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的可变轻链(VL)氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供用于本文所描述的多肽实施方案中的任一者中的抗原结合片段(例如AF1或AF2)，其中AF可包含与表6e的SEQ ID NO:201-205中的任一者的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供结合至CD3蛋白质复合物的抗原结合片段(例如AF1或AF2)，所述抗原结合片段与本领域已知的CD3结合抗体或抗原结合片段相比具有经增强的稳定性。另外，本发明的CD3抗原结合片段经设计以赋予其中整合了所述CD3抗原结合片段的嵌合双特异性抗原结合片段组合物以较高程度的稳定性，从而在施用受试者时引起融合蛋白的表达及回收改善、存放期延长及稳定性增强。在一种方法中，本发明的CD3 AF经设计以具有与本领域已知的某些CD3结合抗体及抗原结合片段相比更高程度的热稳定性。因此，用作其中整合了CD3 AF的嵌合双特异性抗原结合片段组合物的组分的CD3 AF展现有利的药物特性，所述特性包括高热稳定性及低聚集倾向，从而在制造及储存期间引起表达及回收改善以及促进长血清半衰期。诸如热稳定性的生物物理学特性常常受抗体可变域限制，所述抗体可变域在其固有特性方面大不相同。高热稳定性常常与高表达量及其他所需特性相关，所述其他所需特性包括不太容易发生聚集(Buchanan A等人Engineering atherapeutic IgG molecule to address cysteinylation,aggregation and enhancethermal stability and expression.MAbs 2013；5:255)。热稳定性为通过量测“熔化温度”(Tm)来测定，Tm经定义为一半分子变性的时的温度。各异二聚体的熔化温度指示其热稳定性。用于测定Tm的体外分析为本领域已知的，包括以下实施例中所描述的方法。异二聚体的熔点可使用诸如微差扫描热量测定法的技术来量测(Chen等人(2003)Pharm Res 20:1952-60；Ghirlando等人(1999)Immunol Lett 68:47-52)。可替代地，异二聚体的热稳定性可使用圆二色性(Murray等人(2002)J.Chromatogr Sci 40:343-9)或如以下实施例中所描述来量测。
在本发明的多肽的一些实施方案中，抗原结合片段(例如AF1或AF2)可展现比由SEQ ID NO:206的序列(参见表6e)组成的抗CD3结合片段高的热稳定性，如在体外分析中通过以下所证明：相对于抗CD3结合片段的熔化温度(Tm)而言第一抗原结合片段的较高熔化温度(Tm)；或在将第一抗原结合片段并入测试双特异性抗原结合构建体中后，相对于对照双特异性抗原结合构建体的Tm而言测试双特异性抗原结合构建体的较高Tm，其中测试双特异性抗原结合构建体包含第一抗原结合片段和结合至除CD3以外的抗原的参考抗原结合片段；且其中对照双特异性抗原结合构建体由抗CD3结合片段及参考抗原结合片段组成，抗CD3结合片段由SEQ ID NO:206的序列(参见表6e)组成。第一抗原结合片段的熔化温度(Tm)可比由SEQ ID NO:206的序列(参见表6e)组成的抗CD3结合片段的Tm高至少2℃、或高至少3℃、或高至少4℃、或高至少5℃。
本发明的CD3结合片段及包含抗CD3结合片段及参考结合片段的抗CD3双特异性抗体的热变性曲线表明，本发明的构建体比由SEQ ID NO:781中所示的序列(参见表6f)组成的抗原结合片段或对照双特异性抗体及结合至本文所描述的HER2实施方案的参考抗原结合片段更耐受热变性，其中对照双特异性抗原结合片段包含SEQ ID NO:781(参见表6f)。在一个实施方案中，本文所描述的本发明组合物实施方案中的任一者的多肽包含本文所描述的实施方案的抗CD3 AF，其中AF的Tm比由SEQ ID NO:781的序列(参见表6f)组成的抗原结合片段的Tm高至少2℃、或高至少3℃、或高至少4℃、或高至少5℃、或高至少6℃、或高至少7℃、或高至少8℃、或高至少9℃、或高至少10℃，如在体外分析中通过熔化温度增加所测定。
在一些实施方案中，本文所描述的本发明组合物实施方案中的任一者的多肽包含特异性结合人类或食蟹猕猴(cyno)CD3的抗原结合片段(AF)。抗原结合片段(AF)可特异性结合人类CD3。抗原结合片段(AF)可结合CD3的在本文中经标识为CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ单元的CD3复合物亚单元。抗原结合片段(AF)可结合CD3的CD3ε片段。抗原结合片段(AF)可以在约10nM与约400nM之间、或在约50nM与约350nM之间、或在约100nM与300nM之间的解离常数(Kd)常数特异性结合人类或cyno CD3，如在包含人类或cyno CD3抗原的体外抗原结合分析中所测定。在一些实施方案中，本文所描述的本发明组合物实施方案中的任一者的多肽包含抗原结合片段(AF)，所述AF以弱于约10nM、或约50nM、或约100nM、或约150nM、或约200nM、或约250nM、或约300nM、或约350nM、或弱于约400nM的解离常数(Kd)特异性结合人类或cyno CD3，如在体外抗原结合分析中所测定。为了清楚起见，Kd为400的抗原结合片段(AF)比Kd为10nM的抗原结合片段(AF)更弱地结合其配位体。在一些实施方案中，本文所描述的本发明组合物实施方案中的任一者的多肽包含抗原结合片段(AF)，所述AF以比由SEQID NO:781的氨基酸序列(参见表6f)组成的抗原结合片段弱至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或至少10倍的结合亲和力特异性结合人类或cyno CD3，如在体外抗原结合分析中通过相应解离常数(Kd)所测定。在一些实施方案中，本发明提供包含抗原结合片段(AF)的双特异性多肽，所述AF对CD3展现结合亲和力(抗CD3 AF)，所述结合亲和力相对于并入本发明多肽中的本文所描述的抗HER2 AF实施方案的结合亲和力而言弱至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、100倍或至少1000倍，如在体外抗原结合分析中通过相应解离常数(Kd)所测定。本发明组合物对目标配位体的结合亲和力可使用结合或竞争性结合分析进行分析，所述分析诸如为用芯片结合受体或结合蛋白进行的Biacore分析或如美国专利5,534,617中所描述的ELISA分析、本文实施例中所描述的分析、放射性受体分析或本领域已知的其他分析。结合亲和力常数接着可使用标准方法来测定，所述方法诸如为如由van Zoelen等人,Trends Pharmacol Sciences(1998)19)12):487所描述的史卡查分析(Scatchard analysis)或本领域已知的其他方法。
在一相关方面中，本发明提供抗原结合片段(AF)，所述AF结合至CD3(抗CD3AF)且并入嵌合双特异性多肽组合物中，所述组合物经设计以具有等电点(pI)，此与包含本领域已知的CD3结合抗体或抗原结合片段的对应组合物相比赋予本发明组合物以经增强的稳定性。在一个实施方案中，本文所描述的本发明组合物实施方案中的任一者的多肽包含结合至CD3的AF(抗CD3 AF)，其中抗CD3 AF展现在6.0与6.6之间(包括端值)的pI。在一些实施方案中，本文所描述的本发明组合物实施方案中的任一者的多肽包含结合至CD3的AF(抗CD3AF)，其中抗CD3 AF所展现的pI比参考抗原结合片段(例如由SEQ ID NO:206中所示的序列(参见表6e)组成)的pI低至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0个pH单位。在一些实施方案中，本文所描述的本发明组合物实施方案中的任一者的多肽包含结合至CD3的AF(抗CD3 AF)，所述AF与另一结合至HER2抗原的AF(抗HER2AF)融合，其中抗CD3 AF所展现的pI为在结合HER2抗原或其抗原决定基的AF的pI的至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5个pH单位内。在一些实施方案中，本文所描述的本发明组合物实施方案中的任一者的多肽包含结合至CD3的AF(抗CD3 AF)，所述AF与结合至HER2抗原的AF(抗HER2 AF)融合，其中抗HER2AF所展现的pI为在抗CD3 AF的pI的至少约0.1至约1.5、或至少约0.3至约1.2、或至少约0.5至约1.0、或至少约0.7至约0.9个pH单位内。特别预期，通过其中两个抗原结合片段的pI在所述范围内的所述设计，所得融合抗原结合片段将赋予其中整合了所述融合抗原结合片段的嵌合双特异性抗原结合片段组合物以较高程度的稳定性，从而当将组合物施用受试者时引起呈可溶性非聚集形式的融合蛋白的表达改善及回收增强，所调配嵌合双特异性多肽组合物的存放期延长，及稳定性增强。状态不同、具有两个在相对窄的pI范围内的AF(抗CD3 AF及抗HER2 AF)可允许选择其中两个AF(抗CD3 AF及抗HER2 AF)均稳定的缓冲液或其他溶液，由此促进组合物的整体稳定性。抗原结合片段(AF)可展现小于或等于6.6的等电点(pI)。抗原结合片段(AF)可展现在6.0与6.6之间(包括端值)的等电点(pI)。抗原结合片段(AF)所展现的等电点(pI)可比由SEQ ID NO:206中所示的序列(参见表6e)组成的参考抗原结合片段的pI低至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0个pH单位。抗原结合片段(AF)可以在约在约10nM与约400nM之间之间的解离常数(Kd)常数(诸如在包含人类或cyno CD3抗原的体外抗原结合分析中所测定)特异性结合人类或cyno CD3。抗原结合片段(AF)可以小于约10nM、或小于约50nM、或小于约100nM、或小于约150nM、或小于约200nM、或小于约250nM、或小于约300nM、或小于约350nM、或小于约400nM的解离常数(Kd)(诸如在体外抗原结合分析中所测定)特异性结合人类或cyno CD3。抗原结合片段(AF)可对CD3展现结合亲和力，所述结合亲和力相对于由SEQ IDNO:206的氨基酸序列(参见表6e)组成的抗原结合片段的结合亲和力而言弱至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或至少10倍(诸如在体外抗原结合分析中通过相应解离常数(Kd)来测定)。
在某些实施方案中，抗原结合片段的VL和VH为通过相对长的接头融合，所述接头由25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个亲水性氨基酸组成，所述接头在接合在一起时具有可挠性特征。在一个实施方案中，本文所描述的scFv实施方案中的任一者的VL和VH为通过具有亲水性氨基酸的相对长的接头连接，所述亲水性氨基酸具有序列GSGEGSEGEGGGEGSEGEGSGEGGEGEGSG(SEQ ID NO:82)、TGSGEGSEGEGGGEGSEGEGSGEGGEGEGSGT(SEQ ID NO:83)、GATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEG(SEQ ID NO:84)或GSAAPTAGTTPSASPAPPTGGSSAAGSPST(SEQ ID NO:85)。在一些实施方案中，AF1及AF2为通过具有亲水性氨基酸的短接头连接在一起，所述亲水性氨基酸具有3、4、5、6或7个氨基酸。在一个实施方案中，短接头序列在本文中经标识为序列SGGGGS(SEQ ID NO:86)、GGGGS(SEQID NO:87)、GGSGGS(SEQ ID NO:88)、GGS或GSP。在一些实施方案中，本发明提供包含单链双特异性抗体的组合物，其中折叠后，第一域(VL或VH)与最后一个域(VH或VL)配对以形成一个scFv且中间的两个域配对以形成另一scFv，其中第一域及第二域以及第三域及最后一个域为通过前述短接头中之一者融合在一起，且第二可变域及第三可变域为通过前述相对长的接头中之一者融合。如本领域技术人员应了解，选择短接头及相对长的接头防止相邻可变域的不恰当配对，由此便于形成包含第一抗原结合片段及第二抗原结合片段的VL和VH的单链双特异性抗体构型。
表6b.例示性CD3 CDR序列
表6c.例示性CD3 FR序列
表6d：例示性CD3 VL和VH序列
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表6e：例示性CD3 scFv序列
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抗HER-2结合域
在一些实施方案中，本发明提供包含对肿瘤特异性标记物HER-2具有结合亲和力的第一部分结合域及结合至诸如CD3抗原的效应细胞抗原的第二结合域的嵌合多肽总成组合物。在一个实施方案中，结合域包含来源于针对HER-2的单克隆抗体的VL和VH。针对HER-2的单克隆抗体为本领域已知的。VL和VH序列的例示性非限制性实施例呈现于表6f中。在一个实施方案中，本发明提供包含对肿瘤特异性标记物HER-2具有结合亲和力的第一部分结合域的嵌合多肽总成组合物，所述第一部分结合域包含表6f中所阐述的抗HER2 VL和VH序列。在一些实施方案中，本发明提供包含对肿瘤特异性标记物具有结合亲和力的第一部分结合域的嵌合多肽总成组合物，所述第一部分结合域包含CDR-L1区、CDR-L2区、CDR-L3区、CDR-H1区、CDR-H2区及CDR-H3区，其中各区来源于表6f中所阐述的各自VL和VH序列。优选地，在实施方案中，结合的Kd值为大于10-10至10-7M，如在体外结合分析中所测定。在一些实施方案中，在多肽包含特异性结合至HER2的抗原结合片段(抗HER2 AF)的情况下，抗HER2AF(例如AF1或AF2)可包含：(1)包含阐述为表6f的SEQ ID NO:778-783的氨基酸序列的重链可变区(VHII)及(2)包含阐述为表6f的SEQ ID NO:878-883的氨基酸序列的轻链可变区(VLII)。经特别考虑，嵌合多肽总成组合物可包含前述结合域中的任一者或其序列变体，只要所述变体对所描述抗原展现结合特异性即可。在一个实施方案中，序列变体将通过用不同氨基酸取代VL或VH序列中的氨基酸而产生。在缺失变体中，如本文所描述的VL或VH序列中的一个或多个氨基酸残基经移除。因此，缺失变体包括结合域多肽序列的所有片段。在取代变体中，VL或VH(或CDR)多肽的一个或多个氨基酸残基经移除且经替代性残基置换。在一个方面中，取代在本质上为保守的，且此类型的保守取代为本领域熟知的。另外，经特别考虑，包含本文所公开的第一结合域及第二结合域的组合物可用于本文所公开的方法中的任一者中。
表6f.抗HER2单克隆抗体及序列
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*若存在带下划线及加粗的序列，则其为VL和VH内的CDR
表A：分子内长接头
表B：分子间短接头
名称 氨基酸序列
S-1 SGGGGS(SEQ ID NO:86)
S-2 GGGGS(SE ID NO:87)
S-3 GGS
S-4 GSP
在本发明的多肽的一些实施方案中，抗原结合片段之一对轻链可变区(VL)及重链可变区(VH)可通过接头或长接头(例如具有亲水性氨基酸)连接。连接抗原结合片段(例如第一抗原结合片段(AF1)、第二抗原结合片段(AF2))的轻链可变区(VL)及重链可变区(VH)的所述接头可(各自独立地)包含与表A中所阐述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。连接抗原结合片段(例如第一抗原结合片段(AF1)、第二抗原结合片段(AF2))的轻链可变区(VL)及重链可变区(VH)的所述接头可(各自独立地)包含与表A中所阐述的序列一致的氨基酸序列。在本发明的多肽的一些实施方案中，两个抗原结合片段(例如第一抗原结合片段及第二抗原结合片段)可通过肽接头或短接头融合在一起。连接两个抗原结合片段(例如第一抗原结合片段及第二抗原结合片段)的所述肽接头可包含与表B中所阐述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。连接两个抗原结合片段(例如第一抗原结合片段及第二抗原结合片段)的所述肽接头可包含与表B中所阐述的序列一致的氨基酸序列。在一些情况下，第一抗原结合片段为单链可变片段(scFv)。在一些情况下，第二抗原结合片段为单链可变片段(scFv)。第一抗原结合片段及第二抗原结合片段的两个单链可变片段可通过肽接头连接在一起。在本发明的多肽的一些实施方案中，用于连接第一抗原结合片段的VL和VH的接头或/及用于连接第二抗原结合片段的VL和VH的接头可为表A的L7。在所述实施方案中，用于连接两个抗原结合片段的肽接头可为表B的S-1或S-2。在一些实施方案中，本发明提供包含单链双特异性抗体的多肽，其中折叠后，第一域(VL或VH)与最后一个域(VH或VL)配对以形成一个scFv且中间的两个域配对以形成另一scFv，其中第一域及第二域以及第三域及最后一个域为通过具有亲水性氨基酸的短接头融合在一起，所述亲水性氨基酸在本文中通过表B中所阐述的序列加以标识，且第二可变域及第三可变域为通过标识于表A中的长接头融合。如本领域技术人员应了解，选择短接头及长接头防止相邻可变域的不恰当配对，由此便于形成包含第一结合部分及第二结合部分的VL和VH的单链双特异性抗体构型。
表C：释放区段与双特异性抗体构建体之间的例示性间隔子
氨基酸序列 SEQ ID NO:
STEPS 89
SATPESGPGT 90
ATSGSETPGT 91
GTAEAASASG 92
STEPSEGSAPGTS 93
SGPGTS 94
GTSTEPS 95
在本发明的多肽的一些实施方案中，释放区段(RS)(例如第一释放区段(RS1)、第二释放区段(RS2)等)可通过间隔子与双特异性抗体构建体(BsAb)融合。所述间隔子可(各自独立地)包含至少4种类型的氨基酸，所述氨基酸为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)。本发明的肽可包含经由第一间隔子与双特异性抗体构建体融合的第一释放区段及经由第二间隔子与双特异性抗体构建体融合的第二释放区段。间隔子(例如第一间隔子、第二间隔子等)可(各自独立地)包含与表C中所阐述的序列具有至少(约)80％、至少(约)90％或100％序列一致性的氨基酸序列。间隔子(例如第一间隔子、第二间隔子等)可(各自独立地)包含与表C中所阐述的序列一致的氨基酸序列。
非结构化构象
通常，融合蛋白的XTEN组分经设计以在生理条件下表达得类似变性肽序列，即使聚合物的长度延伸。变性描述特征在于肽骨干的较大构象自由的肽在溶液中的状态。大部分肽及蛋白质在存在高浓度变性剂的情况下或在高温下采用变性构象。如通过NMR所测定，呈变性构象的肽具有例如特征性圆二色性(CD)光谱且特征在于不具有远程相互作用。“变性构象”及“非结构化构象”在本文中同义地使用。在一些情况下，本发明提供在生理条件下可类似于主要不含于二级结构中的变性序列的XTEN序列。在其他情况下，XTEN序列在生理条件下可实质上不含二级结构。如此上下文中所使用的“很大程度上不含”是指XTEN序列的XTEN氨基酸残基的小于50％贡献于二级结构，如通过本文所描述的方式所量测或测定。如此上下文中所使用的“实质上不含”是指XTEN序列的XTEN氨基酸残基的至少约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或至少约99％不贡献于二级结构，如通过本文所描述的方式所量测或测定。
本领域已建立多种方法来辨别给定多肽中二级结构及三级结构的存在或不存在。特别是，XTEN二级结构可以分光亮度法，例如通过“远UV”光谱区(190-250nm)中的圆二色性光谱法来量测。诸如α-螺旋及β-折叠的二级结构组件各自产生CD光谱的特征性形状及量值。二级结构亦可经由某些计算机程序或算法针对多肽序列进行预测，所述算法诸如为熟知的Chou-Fasman算法(Chou,P.Y.等人(1974)Biochemistry,13:222-45)及Garnier-Osguthorpe-Robson(“GOR”)算法(Garnier J,Gibrat JF,Robson B.(1996),GOR methodfor predicting protein secondary structure from amino acid sequence.MethodsEnzymol 266:540-553)，如美国专利申请公开案第20030228309A1号中所描述。对于给定序列，算法可预测存在一些二级结构或根本不存在二级结构，此表示为形成例如α-螺旋或β-折叠的序列的残基的总数和/或百分比或预测引起无规卷曲形成的序列(其不具有二级结构)的残基的百分比。
在一些情况下，本发明融合蛋白组合物中所使用的XTEN序列可具有在0％至小于约5％范围内的α-螺旋百分比，如通过Chou-Fasman算法所测定。在其他情况下，融合蛋白组合物的XTEN序列可具有在0％至小于约5％范围内的β-折叠百分比，如通过Chou-Fasman算法所测定。在一些情况下，融合蛋白组合物的XTEN序列可具有在0％至小于约5％范围内的α-螺旋百分比及在0％至小于约5％范围内的β-折叠百分比，如通过Chou-Fasman算法所测定。在优选实施方案中，融合蛋白组合物的XTEN序列将具有小于约2％的α-螺旋百分比及小于约2％的β-折叠百分比。在其他情况下，融合蛋白组合物的XTEN序列可具有高程度的无规卷曲百分比，如通过GOR算法所测定。在一些实施方案中，XTEN序列可具有至少约80％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％且最佳至少约99％无规卷曲，如通过GOR算法所测定。
净电荷
在其他情况下，XTEN多肽可具有通过并入具有净电荷的氨基酸残基和/或减少XTEN序列中的疏水性氨基酸比例赋予的非结构化特征。总体净电荷及净电荷密度可通过调节XTEN序列中带电荷氨基酸的含量来控制。在一些情况下，组合物的XTEN的净电荷密度可高于+0.1或低于-0.1个电荷/残基。在其他情况下，XTEN的净电荷可为约0％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％或约20％或更多。
由于人类或动物中的大部分组织及表面具有净负电荷，因此XTEN序列可经设计以具有净负电荷以将含有XTEN的组合物与诸如血管、健康组织或各种受体的各种表面之间的非特异性相互作用减至最少。不受特定理论束缚，XTEN可由于XTEN多肽的各个氨基酸之间的静电推斥而采用开放构象，所述各个氨基酸独立地携带高净负电荷且分布在整个XTEN多肽序列中。XTEN的延伸序列长度中的净负电荷的此类分布可产生非结构化构象，其转而可引起流体动力学半径的有效增加。因此，在一个实施方案中，本发明提供XTEN，其中XTEN序列含有约8％、10％、15％、20％、25％或甚至约30％谷氨酸。本发明的组合物的XTEN一般不具有带正电荷氨基酸或具有低含量的带正电荷氨基酸。在一些情况下，XTEN可具有少于约10％带正电荷氨基酸残基或少于约7％、或少于约5％、或少于约2％带正电荷氨基酸残基。然而，本发明涵盖如下构建体：其中可将有限数目的诸如赖氨酸的带正电荷氨基酸并入XTEN中以准许赖氨酸的ε胺与肽上的反应性基团、接头桥或药物或小分子上的反应性基团之间发生结合，从而结合至XTEN骨干。在前述内容中，可构建包含XTEN、生物活性蛋白加适用于治疗代谢疾病或障碍的化学治疗剂的融合蛋白，其中并入XTEN组分中的药剂的分子的最大数目为通过并入XTEN中的赖氨酸或具有反应性侧链的其他氨基酸(例如半胱氨酸)的数目来测定。
在一些情况下，XTEN序列可包含通过诸如丝氨酸或甘氨酸的其他残基分离的带电荷残基，此可引起更好的表达或纯化行为。基于净电荷，本发明组合物的XTEN可具有1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或甚至6.5的等电点(pI)。在优选实施方案中，XTEN将具有在1.5与4.5之间的等电点。在这些实施方案中，并入本发明的BPXTEN融合蛋白组合物中的XTEN将在生理条件下携带净负电荷，此可贡献于非结构化构象及XTEN组分与哺乳动物蛋白质及组织的结合减少。
因为疏水性氨基酸可赋予多肽以结构，因此本发明提供XTEN中的疏水性氨基酸的含量通常将为小于5％、或小于2％、或小于1％疏水性氨基酸含量。在一个实施方案中，BPXTEN融合蛋白的XTEN组分中甲硫氨酸及色氨酸的氨基酸含量通常小于5％、或小于2％且最佳小于1％。在一些实施方案中，XTEN将具备具有少于10％带正电荷氨基酸残基、或少于约7％、或少于约5％、或少于约2％带正电荷氨基酸残基的序列，甲硫氨酸及色氨酸残基的总和将小于2％，且天冬酰胺酸及谷氨酰胺残基的总和将小于总XTEN序列的10％。
增加的流体动力学半径
在一些实施方案中，XTEN可具有高流体动力学半径，从而赋予并有XTEN的BPXTEN融合蛋白以对应的增加的表观分子量。与不连接至XTEN的BP相比，XTEN连接至BP序列可产生可具有增加的流体动力学半径、增加的表观分子量及增加的表观分子量因子的BPXTEN组合物。举例而言，在其中需要延长的半衰期的治疗应用中，其中具有高流体动力学半径的XTEN经并入包含一种或多种BP的融合蛋白中的组合物可有效地放大超过大致3-5nm的肾小球孔径(对应于约70kDa的表观分子量)的组合物的流体动力学半径(Caliceti.2003.Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates.Adv.Drug Deliv.Rev.55:1261-1277)，从而使得循环蛋白的肾清除作用减弱。蛋白质的流体动力学半径为通过其分子量以及其结构来测定，所述结构包括形状及紧密性。不受特定理论束缚，XTEN可由于肽的单独电荷之间的静电推斥或序列中特定氨基酸赋予的固有可挠性而采用开放构象，所述氨基酸不具有赋予二级结构的潜能。与诸如典型的球状蛋白的具有二级结构和/或三级结构的具有相当序列长度和/或分子量的多肽相比，XTEN多肽的开放、延伸及非结构化构象可具有更大的成比例流体动力学半径。测定流体动力学半径的方法为本领域熟知的，诸如通过使用粒径排阻色谱法(SEC)，如美国专利第6,406,632号及第7,294,513号中所描述。添加渐增长度的XTEN引起流体动力学半径、表观分子量及表观分子量因子的参数成比例地增加，从而准许将BPXTEN调适为具有所需特征性截止表观分子量或流体动力学半径。因此，在某些实施方案中，BPXTEN融合蛋白可经构型具有XTEN以使得融合蛋白可具有至少约5nm、或至少约8nm、或至少约10nm、或12nm、或至少约15nm的流体动力学半径。在前述实施方案中，XTEN在BPXTEN融合蛋白中赋予的大流体动力学半径可导致所得融合蛋白的肾清除作用减弱，从而导致终末半衰期对应地延长、平均保留时间延长和/或肾清除速率降低。
在一些实施方案中，具有所选长度及序列的XTEN可经选择性地并入BPXTEN中以产生在生理条件下将具有至少约150kDa、或至少约300kDa、或至少约400kDa、或至少约500kDa、或至少约600kDa、或至少约700kDa、或至少约800kDa、或至少约900kDa、或至少约1000kDa、或至少约1200kDa、或至少约1500kDa、或至少约1800kDa、或至少约2000kDa、或至少约2300kDa或更大的表观分子量的融合蛋白。在一些实施方案中，具有所选长度及序列的XTEN可选择性地连接至BP以产生在生理条件下具有至少三、可替代地至少四、可替代地至少五、可替代地至少六、可替代地至少七、可替代地至少八、可替代地至少九、可替代地至少10、可替代地至少15的表观分子量因子、或至少20或更大的表观分子量因子的BPXTEN融合蛋白。在一些实施方案中，相对于融合蛋白的实际分子量而言，BPXTEN融合蛋白在生理条件下具有约4至约20、或约6至约15、或约8至约12、或约9至约10的表观分子量因子。在一些实施方案中，(融合)多肽在生理条件下展现大于约6的表观分子量因子。
增加的终末半衰期
在一些实施方案中，(融合)多肽具有与不连接至任何XTEN的生物活性多肽相比长至少两倍、或长至少三倍、或长至少四倍、或长至少五倍的终末半衰期。在一些实施方案中，(融合)多肽具有与不连接至任何XTEN的生物活性多肽相比长至少两倍的终末半衰期。
向有需要的受试者施用治疗有效剂量的本文所描述的BPXTEN融合蛋白的实施方案中的任一者与不连接至XTEN且以相当剂量施用受试者的对应BP相比可引起在融合蛋白的治疗窗内所花费时间增加至少两倍、或至少三倍、或至少四倍、或至少五倍或更多倍。
低免疫原性
在一些实施方案中，本发明提供其中XTEN序列具有较低程度的免疫原性或实质上非免疫原性的组合物。若干因素可促成XTEN的低免疫原性，例如实质上非重复序列、非结构化构象、高程度的溶解性、低程度的自聚集或不具有自聚集、序列内低程度的蛋白水解位点或不具有蛋白水解位点及XTEN序列中低程度的抗原决定基或不具有抗原决定基。
一般本领域技术人员应理解，一般而言，具有高度重复短氨基酸序列(例如其中200个氨基酸长度的序列平均含有一组有限3聚体或4聚体的20个或更多个重复序列)和/或具有连续重复氨基酸残基(例如其中5聚体或6聚体序列具有相同氨基酸残基)的多肽倾向于聚集或形成高阶结构或形成接触，从而产生晶体或假晶体结构。
在一些实施方案中，XTEN序列为实质上非重复的，其中(1)XTEN序列不具有三个相同氨基酸类型的连续氨基酸，除非所述氨基酸为丝氨酸，在此情况下不超过三个连续氨基酸可为丝氨酸残基；且其中(2)XTEN不含有在XTEN的200个氨基酸长度的序列内出现超过16次、超过14次、超过12次或超过10次的3-氨基酸序列(3聚体)。一般本领域技术人员应理解，所述实质上非重复序列具有较低聚集倾向，且因此，使得能够设计具有相对低频率的带电荷氨基酸的长序列XTEN，若序列或氨基酸残基以其他方式更重复，则所述XTEN将可能聚集。
构象抗原决定基由蛋白质表面的区域形成，所述表面由蛋白质抗原的多个不连续氨基酸序列构成。蛋白质的精确折叠将这些序列带入明确界定的稳定空间构型或抗原决定基，所述构型或抗原决定基可经宿主体液免疫系统辨识为“外来的”，从而引起针对蛋白质的抗体产生或触发细胞介导的免疫反应。在后一情况中，个人的对蛋白质的免疫反应很大程度上受T细胞抗原决定基辨识影响，所述辨识随个人的HLA-DR异型的肽结合特异性而变。T细胞表面上的同源T细胞受体与II类MHC肽复合物的接合以及诸如CD4分子的某些其他辅受体的交叉结合可在T细胞内诱导活化状态。活化引起细胞因子释放，从而进一步活化诸如B细胞的其他淋巴球以产生抗体或活化T杀伤细胞作为完整细胞免疫反应。
肽结合给定II类MHC分子以呈现于APC(抗原呈现细胞)表面上的能力视多种因素而定；最值得注意的为其一级序列。在一个实施方案中，较低程度的免疫原性可通过设计抵抗在抗原呈现细胞中的抗原加工的XTEN序列和/或选择不充分结合MHC受体的序列来达成。本发明提供具有实质上非重复XTEN多肽的BPXTEN融合蛋白，所述BPXTEN融合蛋白经设计以减少与II MHC受体的结合以及避免形成针对T细胞受体的抗原决定基或抗体结合，从而产生较低程度的免疫原性。避免免疫原性部分为XTEN序列的构象可挠性的直接结果；亦即，由于氨基酸残基的选择及次序而不具有二级结构。举例而言，备受关注的为在水溶液中或在可产生构象抗原决定基的生理条件下具有适应紧密折叠的构象的低倾向性的序列。使用常规治疗规范及给药施用包含XTEN的融合蛋白一般不会引起针对XTEN序列的中和抗体形成，且亦可降低BPXTEN组合物中BP融合搭配物的免疫原性。
在一个实施方案中，用于本发明融合蛋白中的XTEN序列可实质上不含由人类T细胞辨识的抗原决定基。先前已公开出于生成较低免疫原性蛋白质的目的的所述抗原决定基的消除；参见例如WO 98/52976、WO 02/079232及WO 00/3317，所述案以引用的方式并入本文中。已描述针对人类T细胞抗原决定基的分析(Stickler,M.等人(2003)J ImmunolMethods,281:95-108)。备受关注的为可在不生成T细胞抗原决定基或非人类序列的情况下进行寡聚的肽序列。此可通过测试这些序列的直接重复序列的T细胞抗原决定基的存在以及6聚体至15聚体且特别是非人类9聚体序列的存在且随后改变XTEN序列的设计以消除或破坏抗原决定基序列来达成。在一些情况下，XTEN序列通过限制经预测结合MHC受体的XTEN的抗原决定基数目而为实质上非免疫原性的。随着能够结合至MHC受体的抗原决定基数目减少，T细胞活化潜能以及T细胞辅助功能同时减弱，B细胞活化或上调减少，及抗体产生减少。所预测T细胞抗原决定基的低程度可通过诸如TEPITOPE(Sturniolo,T.等人(1999)NatBiotechnol,17:555-61)的抗原决定基预测算法来测定，如国际专利申请公开案第WO2010/144502 A2号的实施例74中所示，所述案以全文引用的方式并入。蛋白质内给定肽构架的TEPITOPE评分为所述肽构架与多个最常见人类MHC对偶基因的结合的Kd(解离常数、亲和力、解离速率)的对数，如Sturniolo,T.等人(1999)Nature Biotechnology 17:555)中所公开。评分范围在至少20个对数内，为约10至约-10(对应于10e10Kd至10e-10Kd的结合限制)，且评分可通过避免疏水性氨基酸而减小，所述疏水性氨基酸可在肽展现于MHC上期间充当锚残基，诸如为M、I、L、V或F。在一些实施方案中，并入BPXTEN中的XTEN组分不具有TEPITOPE评分为约-5或更大、或-6或更大、或-7或更大、或-8或更大、或TEPITOPE评分为-9或更大的所预测T细胞抗原决定基。如本文所使用的““-9或更大”的评分将涵盖10至-9(包括端值)的TEPITOPE评分，但将不涵盖-10的评分，因为-10小于-9。
在一些实施方案中，包括并入本发明BPXTEN融合蛋白中的XTEN序列的本发明XTEN序列可通过限制来自XTEN序列的已知蛋白水解位点，从而减少XTEN加工成可结合至II MHC受体的小肽而呈现为实质上非免疫原性的。在一些实施方案中，XTEN序列可通过使用实质上不含二级结构的序列，从而因结构的高熵而赋予多种蛋白酶抗性而呈现为实质上非免疫原性的。因此，减小TEPITOPE评分及消除来自XTEN的已知蛋白水解位点可使得包括BPXTEN融合蛋白组合物的XTEN的XTEN组合物实质上不能与哺乳动物受体结合，所述受体包括免疫系统的受体。在一个实施方案中，BPXTEN融合蛋白的XTEN可具有>100nM Kd的与哺乳动物受体的结合，或大于500nM Kd或大于1μM Kd的与哺乳动物细胞表面或循环多肽受体的结合。
另外，所述XTEN实施方案的实质上非重复序列及对应的抗原决定基缺乏可能会限制B细胞结合至XTEN或经XTEN活化的能力。尽管XTEN可与其延伸序列上的许多不同B细胞接触，但各个单独B细胞仅可与单独XTEN一次接触或少量接触。因此，XTEN通常可具有低得多的刺激B细胞增殖且因此发生免疫反应的倾向。在一个实施方案中，与对应的未融合BP相比，BPXTEN可具有经降低的免疫原性。在一个实施方案中，向哺乳动物施用至多三次非经肠剂量的BPXTEN可产生血清稀释度为1:100而非稀释度为1:1000的可检测的抗BPXTEN IgG。在一些实施方案中，向哺乳动物施用至多三次非经肠剂量的BPXTEN可产生血清稀释度为1:100而非稀释度为1:1000的可检测的抗BP IgG。在一些实施方案中，向哺乳动物施用至多三次非经肠剂量的BPXTEN可产生血清稀释度为1:100而非稀释度为1:1000的可检测的抗XTENIgG。在前述实施方案中，哺乳动物可为小鼠、大鼠、兔或食蟹猕猴。
相对于那些不太非重复序列(诸如具有三个相同连续氨基酸的序列)而言，具有实质上非重复序列的XTEN的某些实施方案的额外特点可为：非重复XTEN与抗体形成较弱接触(例如单价相互作用)，由此使得免疫清除的可能性较小，以使得BPXTEN组合物可在循环中保持增加的时段。
在一些实施方案中，(融合)多肽与不连接至任何XTEN的生物活性多肽相比免疫原性较低，其中免疫原性为通过量测在向受试者施用相当剂量之后选择性结合至生物活性多肽的IgG抗体的产生来确定。
间隔子和BP释放区段
在一些实施方案中，相应BP的生物活性的至少一部分为由完整BPXTEN保留。在一些实施方案中，BP组分通过裂解在间隔子序列内并入BPXTEN中的任选选用的裂解序列而变得具有生物活性或在其自XTEN释放后具有增加的生物活性，如下文更完整描述。
本发明所涵盖的融合蛋白中任何间隔子序列群均为任选选用的。可提供间隔子以增强宿主细胞表达融合蛋白或降低位阻以使得BP组分可假定其所需三级结构和/或与其目标分子适当地相互作用。对于间隔子及标识所需间隔子的方法，参见例如George等人.(2003)Protein Engineering 15:871-879，所述文献特定地以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，间隔子包含一个或多个长度在1至50个氨基酸残基之间或长度在约1至25个残基之间或长度在约1至10个残基之间的肽序列。不包括裂解位点之间隔子序列可包含20种天然L氨基酸中的任一种，且将优选包含非位阻亲水性氨基酸，所述非位阻亲水性氨基酸可包括但不限于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)。在一些情况下，间隔子可为聚甘氨酸或聚丙氨酸，或主要为甘氨酸及丙氨酸残基的组合的混合物。不包括裂解序列之间隔子多肽很大程度上将实质上不含二级结构。在一个实施方案中，BPXTEN融合蛋白组合物中之一或两个间隔子序列可各自进一步含有可相同或可不同的裂解序列，其中裂解序列可通过蛋白酶作用于自融合蛋白释放BP。
在一些情况下，将裂解序列并入BPXTEN中经设计以准许释放在BP自XTEN释放后变得具有活性或更具有活性的BP。裂解序列足够接近BP序列进行定位，一般在BP序列末端18个氨基酸内、或12个氨基酸内、或6个氨基酸内、或2个氨基酸内定位，以使得裂解后连接至BP的任何剩余残基不会明显地干扰BP活性(例如与受体的结合)，但足以接近蛋白酶以能够实现裂解序列的裂解。在一些实施方案中，裂解位点为可经对于哺乳动物受试者而言为内源性的蛋白酶裂解以使得BPXTEN可在施用受试者之后裂解的序列。在所述情况下，BPXTEN可充当BP之前驱药或循环储存物(depot)。本发明所涵盖的裂解位点的实施例包括但不限于可经作为FXIa、FXIIa、胰舒血管素、FVIIa、FIXa、FXa、FIIa(凝血酶)、弹性蛋白酶-2、颗粒酶B、MMP-12、MMP-13、MMP-17或MMP-20的哺乳动物内源性蛋白酶裂解、或可经诸如TEV、肠激酶、PreScissionTM蛋白酶(鼻病毒3C蛋白酶)及转肽酶A的非哺乳动物蛋白酶裂解的多肽序列。已知将经前述蛋白酶裂解的序列为本领域已知的。例示性裂解序列及序列内的切割位点以及序列变体呈现于表7a中。举例而言，凝血酶(经活化凝血因子II)作用于序列LTPRSLLV(SEQ ID NO:222)[Rawlings N.D.等人(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]，其将在序列中的位置4处在精氨酸之后被切割。活性FIIa为通过在存在磷脂及钙的情况下FXa裂解FII而产生且在凝血路径中位于因子IX下游。一旦活化，则其在凝血中的天然作用将裂解纤维蛋白原，随后又开始形成凝块。FIIa活性严格受控且仅在凝血为适当止血所必需时出现。然而，由于凝血为哺乳动物中的持续过程，因此通过将LTPRSLLV(SEQ ID NO:222)序列并入BP与XTEN之间的BPXTEN中，XTEN域将自邻接BP移除，同时当在生理上需要凝血时活化外部或内部凝血路径，由此随时间推移而释放BP。类似地，将其他序列并入通过内源性蛋白酶起作用的BPXTEN中将提供BP的持续释放，此在某些情况下可由BPXTEN的““前驱药”形式为BP提供更高程度的活性。
在一些情况下，仅两个或三个侧接切割位点的两侧的氨基酸(总共四个至六个氨基酸)将并入裂解序列中。在其他情况下，已知裂解序列对于已知序列中的任一个或两个或三个氨基酸可具有一个或多个缺失或插入或一个或两个或三个氨基酸取代，其中缺失、插入或取代导致对蛋白酶的敏感性降低或增强，而非不存在敏感性，从而得到调适自XTEN释放BP的速率的能力。例示性取代示于表7a中。
表7a：用于BP释放的蛋白酶裂解序列
↓指示裂解位点；
NA：不适用；
*斜线之前、之间或之后的多个氨基酸的列表指示可在所述位置经取代的替代性氨基酸；
“-”指示任何氨基酸均可取代中间栏中指示的对应氨基酸。
在一些实施方案中，BXTEN融合蛋白可包含间隔子序列，所述间隔子序列可进一步包含一个或多个裂解序列，所述一个或多个裂解序列经构型以在通过蛋白酶起作用时自融合蛋白释放BP。在一些实施方案中，一个或多个裂解序列可为与来自表7a的序列具有至少约80％(例如至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％)序列一致性的序列。
在一些实施方案中，本发明提供BP释放区段肽(或释放区段(RS))，其为与疾病组织或接近疾病组织存在的细胞相关或由其产生的一种或多种哺乳动物蛋白酶的底物。所述蛋白酶可包括但不限于诸如金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶及丝氨酸蛋白酶的蛋白酶类别，包括但不限于表7b的蛋白酶。RS尤其适用于并入本发明重组多肽中，从而赋予可通过哺乳动物蛋白酶裂解RS而活化之前驱药格式。如本文所描述，RS经并入本发明重组多肽组合物中，连接所并入的结合部分与XTEN(其构型在下文更完整描述)，以使得在通过RS为底物的一种或多种蛋白酶的作用裂解RS后，结合部分及XTEN自组合物释放且不再经XTEN遮蔽的结合部分重新获得其结合其配位体的全部潜能。在包含第一抗体片段及第二抗体片段的那些重组多肽组合物中，所述组合物在本文中也称为可活化抗体组合物(AAC)。
表7b：目标组织蛋白酶
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在一个实施方案中，本发明提供包含第一释放区段(RS1)序列的可活化重组多肽，所述序列在经最佳比对时与在本文中通过表8a中所阐述的序列加以标识的序列具有至少88％、或至少94％、或100％序列一致性，其中RS1为一种或多种哺乳动物蛋白酶的底物。在其他实施方案中，本发明提供包含RS1及第二释放区段(RS2)序列的可活化重组多肽，RS1及RS2序列各自在经最佳比对时与在本文中通过表8a中所阐述的序列加以标识的序列具有至少88％、或至少94％、或100％序列一致性，其中RS1及RS2各自为一种或多种哺乳动物蛋白酶的底物。在一个实施方案中，本发明提供包含第一RS(RS1)序列的可活化重组多肽，所述序列在经最佳比对时与在本文中通过表8b中所阐述的序列加以标识的序列具有至少90％、至少93％、至少97％或100％一致性，其中所述RS为一种或多种哺乳动物蛋白酶的底物。在其他实施方案中，本发明提供包含RS1及第二释放区段(RS2)序列的可活化重组多肽，RS1及RS2序列各自在经最佳比对时与在本文中通过表8b中所阐述的序列加以标识的序列具有至少88％、或至少94％、或100％序列一致性，其中RS1及RS2各自为一种或多种哺乳动物蛋白酶的底物(例如，在各释放区段序列内的一个、两个或三个裂解位点处)。在包含RS1及RS2的可活化重组多肽的实施方案中，两个释放区段可相同或所述序列可不同。
本发明涵盖作为一种、两种或三种不同类别的蛋白酶的底物的释放区段，所述蛋白酶为金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶，包括表7b的蛋白酶。在特别特点中，RS充当与诸如但不限于肿瘤、癌细胞及发炎性组织的疾病组织或细胞紧密缔合或共定位而存在的蛋白酶的底物，且在RS裂解后，以其他方式经本发明重组多肽组合物的XTEN遮蔽(且因此对其各自配位体具有较低结合亲和力)的结合部分自组合物释放且重新获得其结合目标和/或效应细胞配位体的全部潜能。在一些实施方案中，本发明重组多肽组合物的RS包含作为位于靶细胞内的细胞蛋白酶的底物的氨基酸序列，所述细胞蛋白酶包括但不限于表7b的蛋白酶。在本发明重组多肽组合物的另一特别特点中，作为两种或三种类别的蛋白酶的底物的RS经设计成具有能够在RS序列的不同位置中经不同蛋白酶裂解的序列。因此，作为两种、三种或更多种类别的蛋白酶的底物的RS在RS序列中具有两个、三个或复数个不同裂解位点，但单一蛋白酶裂解仍会引起结合部分及XTEN自包含RS的重组多肽组合物释放。
在一个实施方案中，并入本发明重组多肽组合物中的本发明RS为一种或多种蛋白酶的底物，所述一种或多种蛋白酶包括但不限于穿膜肽酶、脑啡肽酶(CD10)、PSMA、BMP-1、去整合素及金属蛋白酶(ADAM)、ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17(TACE)、ADAM19、ADAM28(MDC-L)、具有血小板反应蛋白模体的ADAM(ADAMTS)、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、MMP-1(胶原酶1)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2，明胶酶A)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3，基质溶素1)、基质金属蛋白酶-7(MMP-7，基质溶素1)、基质金属蛋白酶-8(MMP-8，胶原酶2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9，明胶酶B)、基质金属蛋白酶-10(MMP-10，基质溶素2)、基质金属蛋白酶-11(MMP-11，基质溶素3)、基质金属蛋白酶-12(MMP-12，巨噬细胞弹性蛋白酶)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13，胶原酶3)、基质金属蛋白酶-14(MMP-14，MT1-MMP)、基质金属蛋白酶-15(MMP-15，MT2-MMP)、基质金属蛋白酶-19(MMP-19)、基质金属蛋白酶-23(MMP-23，CA-MMP)、基质金属蛋白酶-24(MMP-24，MT5-MMP)、基质金属蛋白酶-26(MMP-26，基质溶素2)、基质金属蛋白酶-27(MMP-27，CMMP)、豆荚蛋白、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶X、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、分泌酶、尿激酶(uPA)、组织型纤维蛋白溶酶原活化子(tPA)、纤维蛋白溶酶、凝血酶、前列腺特异性抗原(PSA、KLK3)、人类嗜中性球弹性蛋白酶(HNE)、弹性蛋白酶、类胰蛋白酶、II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)、DESC1、第二型穿膜丝氨酸蛋白酶(HPN)、间质蛋白酶、间质蛋白酶-2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4(CAP2)、纤维母细胞活化蛋白(FAP)、胰舒血管素相关肽酶(KLK家族)、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13及KLK14。在一个实施方案中，RS为ADAM17的底物。在一个实施方案中，RS为BMP-1的底物。在一个实施方案中，RS为组织蛋白酶的底物。在一个实施方案中，RS为HtrA1的底物。在一个实施方案中，RS为豆荚蛋白的底物。在一个实施方案中，RS为MMP-1的底物。在一个实施方案中，RS为MMP-2的底物。在一个实施方案中，RS为MMP-7的底物。在一个实施方案中，RS为MMP-9的底物。在一个实施方案中，RS为MMP-11的底物。在一个实施方案中，RS为MMP-14的底物。在一个实施方案中，RS为uPA的底物。在一个实施方案中，RS为间质蛋白酶的底物。在一个实施方案中，RS为MT-SP1的底物。在一个实施方案中，RS为嗜中性球弹性蛋白酶的底物。在一个实施方案中，RS为凝血酶的底物。在一个实施方案中，RS为TMPRSS3的底物。在一个实施方案中，RS为TMPRSS4的底物。在一个实施方案中，本发明重组多肽组合物的RS为至少两种蛋白酶的底物，所述蛋白酶包括但不限于豆荚蛋白、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA及间质蛋白酶。在一些实施方案中，本发明重组多肽组合物的RS为豆荚蛋白、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA及间质蛋白酶的底物。
表8a：BP释放区段序列.
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表8b：释放区段序列
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在一些实施方案中，并入本发明重组多肽中的RS可经设计以选择性地敏感以便对于其为底物的各种蛋白酶具有不同裂解速率及不同裂解效率。由于与健康组织或在循环中相比，给定蛋白酶可以不同浓度存在于包括但不限于肿瘤、血癌或发炎性组织或发炎部位的病变组织中，本发明提供如下RS：使单独氨基酸序列经工程改造以与RS在健康组织或循环中的裂解速率相比对于给定蛋白酶具有更高或更低的裂解效率以确保重组多肽在接近靶细胞或组织及其共定位的蛋白酶时优先自前驱药形式转化为活性形式(亦即，通过在RS裂解之后自重组多肽分离及释放结合部分及XTEN)，以使得所释放的抗体片段结合部分与在循环中保持之前驱药形式相比具有更大的结合至病变组织中的配位体的能力。通过所述选择性设计，所得组合物的治疗指数可经改善，从而相对于不并有所述位点特异性活化的常规治疗剂而言引起副作用减少。
如本文所使用的裂解效率经定义为当包含裂解RS的测试底物及对照底物裂解AC1611各自在进行反应的生物化学分析中经受蛋白酶(进一步详述于实施例中)时包含裂解RS的测试底物百分比与对照底物裂解AC1611百分比的比率的log2值，其中初始底物浓度为6μM，反应物在37℃下经培育2小时，之后通过添加EDTA停止，其中通过非还原SDS-PAGE分析消化产物及未裂解底物的量以确立裂解百分比的比率。裂解效率计算如下：因此，-1的裂解效率是指与对照底物的量相比，测试裂解底物的量为50％，而+1的裂解效率是指与对照底物的量相比，测试裂解底物的量为200％。测试蛋白酶相对于对照而言更高的裂解速率将引起更高的裂解效率，且测试蛋白酶相对于对照而言更慢的裂解速率将引起更低的裂解效率。如实施例中所详述，当在体外生物化学分析中测试单独蛋白酶的裂解速率时，具有氨基酸序列EAGRSANHEPLGLVAT(SEQ ID NO:7001)的对照RS序列AC1611(RSR-1517)经确立为具有适当基线的蛋白酶豆荚蛋白、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-14、uPA及间质蛋白酶裂解效率。通过RS肽中的单独位置处的选择性氨基酸取代，创建RS文库且针对7种蛋白酶组进行评估(更完整地详述于实施例中)，从而产生用于为适当氨基酸取代建立指南以便达成具有所需裂解效率的RS的概况。在制造具有所需裂解效率的RS中，使用亲水性氨基酸A、E、G、P、S及T进行的取代为优选的，然而，其他L-氨基酸可在给定位置经取代以调整裂解效率，只要RS对于蛋白酶裂解保留至少一些易感性即可。用于保留或实现活性的肽中的保守氨基酸取代完全在本领域技术人员的知识及能力内。在一个实施方案中，本发明提供RS，其中在体外生物化学竞争性分析中，与具备具有序列EAGRSANHEPLGLVAT(SEQ ID NO.7001)的对照序列RSR-1517的相同蛋白酶裂解相比，RS以高至少0.2log2或0.4log2或0.8log2或1.0log2的裂解效率经蛋白酶裂解，所述蛋白酶包括但不限于豆荚蛋白、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA或间质蛋白酶。在一些实施方案中，本发明提供RS，其中在体外生物化学竞争性分析中，与具备具有序列EAGRSANHEPLGLVAT(SEQ ID NO.7001)的对照序列RSR-1517的相同蛋白酶裂解相比，RS以低至少0.2log2或0.4log2或0.8log2或1.0log2的裂解效率经蛋白酶裂解，所述蛋白酶包括但不限于豆荚蛋白、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA或间质蛋白酶。在一个实施方案中，本发明提供RS，其中与具有序列EAGRSANHEPLGLVAT(SEQ ID NO.7001)的对照序列RSR-1517相比，RS的蛋白酶裂解速率快至少2倍、或至少4倍、或至少8倍、或至少16倍，所述蛋白酶包括但不限于豆荚蛋白、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA或间质蛋白酶。在一些实施方案中，本发明提供RS，其中与具有序列EAGRSANHEPLGLVAT(SEQ IDNO.7001)的对照序列RSR-1517相比，RS的蛋白酶裂解速率慢至少2倍、或至少4倍、或至少8倍、或至少16倍，所述蛋白酶包括但不限于豆荚蛋白、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA或间质蛋白酶。
在一些实施方案中，本发明提供包含多个RS的AAC，其中各RS序列在本文中通过表8a中所阐述的序列群加以标识且RS通过1至6个作为甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸及苏氨酸的氨基酸彼此连接。在一个实施方案中，AAC包含第一RS及不同于第一RS的第二RS，其中各RS序列在本文中通过表8a中所阐述的序列加以标识且RS通过1至6个作为甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸及苏氨酸的氨基酸彼此连接。在一些实施方案中，AAC包含第一RS、不同于第一RS的第二RS以及不同于第一RS及第二RS的第三RS，其中各序列在本文中通过表8a中所阐述的序列加以标识且第一RS及第二RS以及第三RS通过1至6个作为甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸及苏氨酸的氨基酸彼此连接。特定预期，AAC的多个RS可连结以形成可以不同裂解速率或效率经多种蛋白酶裂解的序列。在一些实施方案中，本发明提供AAC，所述AAC包含在本文中通过表8a-8b中所阐述的序列加以标识的RS1及RS2以及诸如上文所描述或本文其他地方所描述的XTEN1及XTEN 2的XTEN 1及XTEN 2，其中RS1在XTEN1与结合部分之间融合且RS2在XTEN2与结合部分之间融合。经考虑，与健康组织或在正常循环中时相比，所述组合物将更易于经表达多种蛋白酶的病变目标组织裂解，因此携带结合部分的所得片段将更易于穿透例如肿瘤的目标组织，且具有经增强的结合及连接靶细胞及效应细胞(或在设计成具有单一结合部分的AAC的情况下仅靶细胞)的能力。
本发明的RS适用于包括于重组多肽中作为治疗剂以用于治疗癌症、自体免疫疾病、发炎性疾病及需要重组多肽的局部活化的其他病况。本发明组合物解决未满足的需求且与注射后具活性的常规抗体治疗剂或双特异性抗体治疗剂相比在一个或多个方面中优异，所述一个或多个方面包括经增强的终末半衰期、靶向递送及经改善的治疗比以及经降低的对健康组织的毒性。
在一些实施方案中，(融合)多肽包含位于(第一)XTEN与生物活性多肽之间的第一释放区段(RS1)。在一些实施方案中，多肽进一步包含位于生物活性多肽与第二XTEN之间的第二释放区段(RS2)。在一些实施方案中，RS1及RS2的序列一致。在一些实施方案中，RS1及RS2的序列不一致。在一些实施方案中，RS1包含与在本文中通过表8a-8b中的序列或其子集加以标识的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，RS2包含与在本文中通过表8a-8b中的序列或其子集加以标识的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，RS1及RS2各自为用于在各释放区段序列内的一个、两个或三个裂解位点处由多种蛋白酶裂解的底物。
参考片段
在一些实施方案中，(融合)多肽进一步包含一个或多个在蛋白酶消化后可自多肽释放的参考片段。在一些实施方案中，一个或多个参考片段各自包含生物学活性多肽的一部分。在一些实施方案中，一个或多个参考片段为与在蛋白酶消化多肽后可自多肽释放的所有其他肽片段的不同之处在于序列和分子量的单一参考片段。
例示性多肽
在本发明的组合物的一些实施方案中，多肽为包含与表D中所阐述的序列(由SEQID NO:12-47组成)或其子集具有至少(约)80％序列一致性的氨基酸序列的重组多肽。多肽可包含与表D中所阐述的序列(SEQ ID NO:12-47)或其子集具有至少(约)81％、至少(约)82％、至少(约)83％、至少(约)84％、至少(约)85％、至少(约)86％、至少(约)87％、至少(约)88％、至少(约)89％、至少(约)90％、至少(约)91％、至少(约)92％、至少(约)93％、至少(约)94％、至少(约)95％、至少(约)96％、至少(约)97％、至少(约)98％、至少(约)99％或(约)100％序列一致性的氨基酸序列。多肽可包含与表D中所阐述的序列(SEQ ID NO:12-47)或其子集具有至少(约)90％、至少(约)91％、至少(约)92％、至少(约)93％、至少(约)94％、至少(约)95％、至少(约)96％、至少(约)97％、至少(约)98％、至少(约)99％或(约)100％序列一致性的氨基酸序列。多肽可包含与表D中所阐述的序列(SEQ ID NO:12-47)或其子集一致的氨基酸序列。经特定考虑，本发明的组合物可包含表D中所阐述的氨基酸序列的诸如具有(多个)所插入接头序列或具有(多个)与其连接的纯化标签序列的序列变体，只要所述变体展现一种或多种实质上类似或相同的生物活性和/或活化机制即可。
表D：多肽的例示性氨基酸序列
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多肽混合物
本文公开内容包括包含复数个不同长度的多肽的混合物；所述混合物包含第一组多肽及第二组多肽。在一些实施方案中，第一组多肽中的各多肽包含条形码片段，所述条形码片段(a)可通过用蛋白酶消化自多肽释放，及(b)具有不同于可自第一组多肽释放的所有其他片段的序列和分子量的序列和分子量。在一些实施方案中，第二组多肽不具有第一组多肽的条形码片段(例如，归因于截短)。在一些实施方案中，第一组多肽及第二组多肽两者各自包含参考片段，所述参考片段(a)为第一组多肽及第二组多肽所共享及(b)可通过用蛋白酶消化而释放。在一些实施方案中，第一组多肽与包含参考片段的多肽的比率大于0.70。在一些实施方案中，第一组多肽与包含参考片段的多肽的比率大于0.80、0.90、0.95或0.98。在一些实施方案中，参考片段在第一组多肽及第二组多肽中的各多肽中出现不超过一次。在一些实施方案中，蛋白酶为在谷氨酸残基的C端侧上裂解的蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶为Glu-C蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶不为胰蛋白酶。在一些实施方案中，不同长度的多肽包含有包含至少一种扩展型重组多肽(XTEN)，诸如上文所描述或本文任何其他地方所描述的任何XTEN的多肽。在一些实施方案中，第一组多肽包含全长多肽，其中条形码片段为全长多肽的一部分。在一些实施方案中，全长多肽为诸如上文所描述或本文任何其他地方所描述的任何(融合)多肽的(融合)多肽。在一些实施方案中，条形码片段不具有(不包含)全长多肽的N端氨基酸和C端氨基酸两者。在一些实施方案中，不同长度的多肽的混合物由于全长多肽的N端截短、C端截短或N端截短及C端截短两者而彼此不同。在一些实施方案中，第一组多肽与第二组多肽的不同之处可在于一种或多种药理学特性。包括非限制性例示性特性。
多肽表征方法
本文公开内容包括在包含不同长度的多肽的混合物中评估混合物中第一组多肽与混合物中第二组多肽的相对量的方法，其中(1)第一组多肽中的各多肽共享在多肽中出现一次且仅一次的条形码片段及(2)第二组多肽中的各多肽不具有第一组中的多肽所共享的条形码片段，其中第一多肽及第二组多肽两者中的各个多肽各自包含参考片段。所述方法可包含使所述混合物与蛋白酶接触以产生复数个蛋白水解片段，所述复数个蛋白水解片段由第一组多肽及第二组多肽的裂解产生，其中所述复数个蛋白水解片段包含复数个参考片段及复数个条形码片段。所述方法可进一步包含测定条形码片段的量与参考片段的量的比率，由此评估第一组多肽与第二组多肽的相对量。在一些实施方案中，条形码片段在第一组多肽中的各多肽中出现不超过一次。在一些实施方案中，参考片段在第一组多肽及第二组多肽中的各多肽中出现不超过一次。在一些实施方案中，所述复数个蛋白水解片段包含复数个参考片段及复数个条形码片段。在一些实施方案中，蛋白酶在后面不跟随脯氨酸残基的谷氨酸残基的C端侧上裂解第一组多肽及第二组多肽(或不同长度的多肽)。在一些实施方案中，蛋白酶为Glu-C蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶不为胰蛋白酶。在一些实施方案中，测定条形码片段的量与参考片段的量的比率的步骤包含在所述混合物已与蛋白酶接触之后标识来自所述混合物的条形码片段及参考片段。在一些实施方案中，条形码片段及参考片段为基于其各自质量进行标识。在一些实施方案中，条形码片段及参考片段为经由质谱法经标识。在一些实施方案中，条形码片段及参考片段为经由液相色谱-质谱法(LC-MS)经标识。在一些实施方案中，测定条形码片段与参考片段的比率的步骤包含等压标记。在一些实施方案中，测定条形码片段与参考片段的比率的步骤包含使所述混合物外加经同位素标记的参考片段及经同位素标记的条形码片段中之一或两者。在一些实施方案中，不同长度的多肽包含有包含至少一种如上文所描述或本文任何其他地方所描述的扩展型重组多肽(XTEN)的多肽。在一些实施方案中，XTEN的特征在于：(i)其包含至少100个或至少150个氨基酸；(ii)XTEN的氨基酸残基的至少90％为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)；及(iii)其包含至少4种不同类型的氨基酸，所述氨基酸为G、A、S、T、E或P。在一些实施方案中，当条形码片段存在时，其为XTEN的一部分。在一些实施方案中，不同长度的多肽的混合物包含作为上文所描述或本文任何其他地方所描述的任何多肽的多肽。在一些实施方案中，不同长度的多肽包含全长多肽及其截短片段。在一些实施方案中，不同长度的多肽基本上由全长多肽及其截短片段组成。在一些实施方案中，不同长度的多肽的混合物由于全长多肽的N端截短、C端截短或N端截短及C端截短两者而彼此不同。在一些实施方案中，全长多肽为如上文所描述或本文任何其他地方所描述的多肽。在一些实施方案中，条形码片段与参考片段的量比率大于0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、0.95、0.98或0.99。
基于等压标记的肽定量
在一些实施方案中，等压标记可用于测定条形码片段与参考片段的比率。一般技术者应理解，等压标记为用于定量蛋白质体学中的质谱策略，其中肽或蛋白质(或其部分)经各种化学基团标记，所述化学基团为等压的(质量相同)但就其结构周围的重同位素分布而言不同。通常称为串联质量卷标的这些卷标经设计以使得质量标签在串联质谱法期间在高能量碰撞诱导的解离(CID)后在特定接头区处裂解，由此产生不同质量的报导离子。一般技术者应理解，最常见的等压标签中之一者为胺反应性标签。
经增强的检测及定量截短产物的能力(例如经由等压标记)可生成知识，所述知识可有助于设计制造过程包括纯化步骤以使经纯化药物物质/产物中不合需要的变体的存在减至最少。
重组生产
本文公开内容包括核酸。核酸可包含编码诸如上文所描述或本文任何其他地方所描述的任何(融合)多肽的(融合)多肽的多核苷酸(或多核苷酸序列)；或核酸可包含此类多核苷酸(或多核苷酸序列)的反向互补序列。
本文公开内容包括表达载体，所述表达载体包含诸如前一段落中所描述的任何多核苷酸序列的多核苷酸序列及可操作地连接至多核苷酸序列的调节序列。
本文公开内容包括宿主细胞，所述宿主细胞包含诸如前一段落中所描述的任何表达载体的表达载体。在一些实施方案中，宿主细胞为原核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。在一些实施方案中，宿主细胞为哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，本发明提供制造本发明组合物的方法。在一个实施方案中，所述方法包含在促进多肽或BPXTEN融合多肽表达的条件下培养包含编码多肽或本文所描述实施方案中的任一者的含XTEN组合物的核酸构建体的宿主细胞，接着使用标准纯化方法(例如柱色谱法、HPLC及其类似方法)回收多肽或BPXTEN融合多肽，其中所述组合物经回收，其中经表达的多肽或BPXTEN融合多肽的结合片段的至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少99％经恰当地折叠。在制造方法的一些实施方案中，回收经表达的多肽或BPXTEN融合多肽，其中多肽或BPXTEN融合多肽的至少或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少99％为以单体可溶形式经回收。
在一些实施方案中，本发明涉及使用大肠杆菌或哺乳动物宿主细胞在功能蛋白的高酦酵表达量下制造多肽及BPXTEN融合多肽以及提供编码构建体的表达载体的方法，所述构建体适用于在高表达量下产生细胞毒性活性多肽构建体组合物的方法中。在一个实施方案中，所述方法包含以下步骤：1)制备编码本文所公开的实施方案中的任一者的多肽的多核苷酸；2)将所述多核苷酸克隆至表达载体中，所述表达载体可为处于适用于生物系统中的高水平蛋白质表达的转录及翻译序列控制下的质体或其他载体；3)用所述表达载体转型适当的宿主细胞；及4)在适用于表达多肽组合物的条件下在常规营养物培养基中培养宿主细胞。必要时，宿主细胞为大肠杆菌。通过所述方法表达多肽使得宿主细胞的表达产物具有至少0.05g/L、或至少0.1g/L、或至少0.2g/L、或至少0.3g/L、或至少0.5g/L、或至少0.6g/L、或至少0.7g/L、或至少0.8g/L、或至少0.9g/L、或至少1g/L、或至少2g/L、或至少3g/L、或至少4g/L、或至少5g/L的酦酵力价，且其中经表达的蛋白质的至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少99％经恰当地折叠。如本文所使用的术语“恰当地折叠””是指组合物的抗原结合片段组分能够特异性结合其目标配位体。在一些实施方案中，本发明提供产生多肽或BPXTEN融合多肽的方法，所述方法包含在酦酵反应中，当酦酵反应在600nm波长下达到至少130的光学密度时在有效表达呈超过约10毫克/公克宿主细胞干重(mg/g)、或至少约250mg/g、或约300mg/g、或约350mg/g、或约400mg/g、或约450mg/g、或约500mg/g多肽浓度的多肽产物的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码多肽的载体，所述多肽包含前述多肽或BPXTEN融合多肽；且其中经表达的蛋白质的抗原结合片段经恰当地折叠。在一些实施方案中，本发明提供产生多肽或BPXTEN融合多肽的方法，所述方法包含在酦酵反应中，当酦酵反应在600nm波长下达到至少130的光学密度时在有效表达呈超过约10毫克/公克宿主细胞干重(mg/g)、或至少约250mg/g、或约300mg/g、或约350mg/g、或约400mg/g、或约450mg/g、或约500mg/g多肽浓度的多肽产物的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码所述组合物的载体；且其中经表达的多肽产物为可溶的。
药物组合物
本文公开内容包括包含(融合)多肽及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，所述(融合)多肽诸如为上文所描述或本文任何其他地方所描述的任何(融合)多肽。在一些实施方案中，药物组合物经调配用于皮内、皮下、经口、静脉内、动脉内、腹内、腹膜内、玻璃体内、鞘内或肌内施用。在一些实施方案中，药物组合物呈液体形式或经冷冻。在一些实施方案中，药物组合物为处于经植入眼睛或另一身体部位中的装置中。在一些实施方案中，药物组合物为处于用于单次注射的预填充注射器中。在一些实施方案中，药物组合物经调配为欲在施用之前复原的冻干粉末。
在一些实施方案中，剂量为皮内、皮下、经口、静脉内、玻璃体内(或以其他方式注射至眼睛中)、动脉内、腹内、腹膜内、鞘内或肌内施用。在一些实施方案中，药物组合物为使用经植入眼睛或其他身体部位中的装置来施用。在一些实施方案中，受试者为小鼠、大鼠、猴或人类。
药物组合物可通过任何适合途径施用以用于治疗。另外，药物组合物亦可含有其他药学活性化合物或复数种本发明化合物。
在一些实施方案中，药物组合物可皮下、经口、肌内或静脉内施用。在一个实施方案中，药物组合物为以治疗有效剂量施用。在前述物质的一些情况下，与不连接至XTEN且以相当剂量施用受试者的具有融合蛋白的对应BP相比，治疗有效剂量引起在融合蛋白的治疗窗内所花费时间增加。在治疗窗内所花费时间的增加可比不连接至XTEN的对应BP大至少三倍，或可替代地，比不连接至XTEN的对应BP大至少四倍、或五倍、或六倍、或七倍、或八倍、或九倍、或至少10倍、或至少20倍。
在一些实施方案中，本发明提供治疗疾病、障碍或病况的方法，所述方法包含使用药物组合物的多次连续剂量向受试者施用上文所描述的药物组合物，所述剂量为使用治疗有效剂量方案来施用。在前述物质的一个实施方案中，与不连接至(多种)XTEN且以相当剂量方案施用受试者的具有融合蛋白的对应BP相比，治疗有效剂量方案可在融合蛋白的血液含量的至少两个连续Cmax峰和/或Cmm谷之间引起时间增加至少三倍、或可替代地至少四倍、或五倍、或六倍、或七倍、或八倍、或九倍、或至少10倍或至少20倍。在前述物质的一些实施方案中，与不连接至(多种)XTEN且使用针对受试者的治疗有效方案施用受试者的(多种)对应生物活性蛋白组分相比，使用频率较低的给药或较低总摩尔剂量的药物组合物的融合蛋白施用融合蛋白引起至少一个量测参数相当地改善。
在一个实施方案中，药物组合物为皮下施用。在此实施方案中，组合物可以欲在施用之前复原的冻干粉末形式供应。组合物亦可以可直接向患者施用的液体形式或冷冻形式供应。在一个实施方案中，组合物为以液体形式在预填充注射器中供应以使得患者可易于自行施用组合物。
适用于本发明的延长释放型调配物可为包含基质及包衣组合物的口服调配物。适合的基质材料可包括蜡(例如巴西棕榈蜡(camauba)、蜂蜡、石蜡、白地蜡(ceresine)、虫胶蜡、脂肪酸及脂肪醇)、油、硬化油或脂肪(例如硬化菜籽油、蓖麻油、牛脂、棕榈油及豆油)及聚合物(例如羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素及聚乙二醇)。其他适合的基质制片材料为微晶纤维素、粉末纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素以及其他载剂及填充剂。片剂亦可含有颗粒剂、包衣散剂或集结粒。片剂亦可为多层的。当活性成分具有明显不同的药物动力学概况时，多层片剂为尤其优选的。任选而言，成品片剂可经包覆或未经包覆。
包衣组合物可包含不可溶基质聚合物和/或水溶性材料。水溶性材料可为聚合物，诸如聚乙二醇、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇；或单体材料，诸如糖(例如乳糖、蔗糖、果糖、甘露糖醇及其类似糖)、盐(例如氯化钠、氯化钾及其类似盐)、有机酸(例如反丁烯二酸、丁二酸、乳酸及酒石酸)，及其混合物。任选而言，肠溶聚合物可经并入包衣组合物中。适合的肠溶聚合物包括羟丙基甲基纤维素、乙酸酯丁二酸酯、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯、邻苯二甲酸乙酸纤维素、偏苯三甲酸乙酸纤维素、虫胶、玉米蛋白及含有羧基的聚甲基丙烯酸酯。包衣组合物可通过添加适合的塑化剂进行塑化，所述塑化剂诸如为邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸酯、聚乙二醇、甘油、乙酰化甘油酯、乙酰化柠檬酸酯、癸二酸二丁酯及蓖麻油。包衣组合物亦可包括填充剂，所述填充剂可为诸如二氧化硅、二氧化钛、滑石、高岭土、氧化铝、淀粉、粉末纤维素、MCC或波拉克林钾(polacrilin potassium)的不溶性材料。包衣组合物可以溶液或乳胶形式在有机溶剂或水溶剂或其混合物中施用。可使用诸如水、低级醇、低级氯化烃、酮或其混合物的溶剂。
本发明的BPXTEN多肽可根据已知制备药学上适用的组合物的方法进行调配，从而使多肽与诸如水溶液或缓冲液、药学上可接受的悬浮液及乳液的药学上可接受的载剂媒剂混合组合。非水性溶剂的实施例包括丙基乙二醇、聚乙二醇及植物油。通过将具有所需纯度的活性成分与任选选用的生理学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合来制备呈冻干调配物或水溶液形式的治疗性调配物以用于储存，如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)中所描述。本发明的组合物可使用各种赋形剂来调配。适合的赋形剂包括微晶纤维素(例如Avicel PH 102、Avicel PHlOl)、聚甲基丙烯酸酯、聚(丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸三甲基铵乙酯氯化物)(诸如Eudragit RS-30D)、羟丙基甲基纤维素(Methocel KlOOM、Premium CR Methocel KlOOM、Methocel E5、Opadry)、硬脂酸镁、滑石、柠檬酸三乙酯、水性乙基纤维素分散液(Surelease/>)及硫酸鱼精蛋白。缓慢释放剂亦可包含载剂，所述载剂可包含例如溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂及吸收延迟剂。药学上可接受的盐亦可用于这些缓慢释放剂中，所述药学上可接受的盐例如为：无机盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐；以及有机酸的盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。组合物亦可含有诸如水、盐水、甘油及乙醇的液体以及诸如润湿剂、乳化剂或pH缓冲剂的物质。脂质体亦可用作载剂。
在一些实施方案中，本发明的组合物经囊封于脂质体中，所述脂质体在经延长时段以受控方式递送有益活性剂中展现效用。脂质体为含有陷入水性体积的闭合双层膜。脂质体亦可为具有单个膜双层的单层囊泡或具有多个膜双层的多层囊泡，各膜双层为通过水层与下一膜双层间隔开。所得膜双层的结构使得脂质的疏水性(非极性)尾朝向双层中心定向，而亲水性(极性)头朝向水相定向。在一个实施方案中，脂质体可包覆有可挠性水溶性聚合物，从而避免被主要为肝及脾的单核吞噬细胞系统器官吸收。适用于包围脂质体的亲水性聚合物包括但不限于PEG、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲基醚、聚甲基唑啉、聚乙基/>唑啉、聚羟丙基/>唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羟丙基甲基丙烯酸酯、聚羟乙基丙烯酸酯、羟甲基纤维素羟乙基纤维素、聚乙二醇、聚天冬酰胺及亲水性肽序列，如美国专利第6,316,024号；第6,126,966号；第6,056,973号；第6,043,094号中所描述，所述专利的内容以全文引用的方式并入。/>
脂质体可由本领域已知的任何脂质或脂质组合构成。举例而言，形成囊泡的脂质可为天然存在的脂质或合成脂质，包括诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇及神经鞘磷脂的磷脂，如美国专利第6,056,973号及第5,874,104号中所公开。形成囊泡的脂质亦可为糖脂、脑苷脂或阳离子脂质，诸如1,2-二油酰氧基-3-(三甲氨基)丙烷(DOTAP)；N-[1-(2,3,-二(十四基)氧基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)；N-[1[(2,3,-二油酰氧基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DORIE)；N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；3[N-(N',N'-二甲氨基乙烷)胺甲酰基]胆固醇(DC-Choi)；或二甲基二(十八基)铵(DDAB)，亦如美国专利第6,056,973号中所公开。胆固醇亦可以适当范围存在以赋予囊泡以稳定性，如美国专利第5,916,588号及第5,874,104号中所公开。
额外脂质体技术描述于美国专利第6,759,057号；第6,406,713号；第6,352,716号；第6,316,024号；第6,294,191号；第6,126,966号；第6,056,973号；第6,043,094号；第5,965,156号；第5,916,588号；第5,874,104号；第5,215,680号；及第4,684,479号中，所述专利的内容以引用的方式并入本文中。这些专利描述经脂质体及脂质包覆的微泡及其制造方法。因此，本领域技术人员考虑到，本发明的公开内容及这些其他专利的公开内容两者均可产生用于本发明多肽的延长释放的脂质体。对于液体调配物，所需特性为调配物为以可通过25、28、30、31、32号规格针以用于静脉内、肌内、关节内或皮下施用的形式供应。
经由经皮调配物的施用可使用本领域亦已知的方法执行，所述方法包括一般描述于例如美国专利第5,186,938号及第6,183,770号、第4,861,800号、第6,743,211号、第6,945,952号、第4,284,444号及WO 89/09051中的方法，所述专利以全文引用的方式并入本文中。经皮贴片为具有吸收问题的多肽的特别适用的实施方案。可制造贴片以控制皮肤可穿透活性成分在12小时、24小时、3天及7天时段内的释放。在一个实施例中，将每天2倍过量的本发明多肽置放于非挥发性流体中。本发明的组合物为以黏性非挥发性液体形式提供。特定调配物透过皮肤的穿透率可通过本领域的标准方法来量测(例如Franz等人,J.Invest.Derm.64:194-195(1975))。适合的贴片的实施例为被动转移皮肤贴片、离子导入皮肤贴片或诸如Nicoderm的具有微针的贴片。在其他实施方案中，组合物可经由鼻内、颊内或舌下途径递送至脑以使得活性剂能够经由嗅觉通道转移至CNS中且减少全身性施用。常用于此施用途径的装置包括于美国专利第6,715,485号中。经由此途径递送的组合物可使得CNS给药能够增加或整体全身负担能够降低，从而降低与某些药物相关的全身毒性风险。用于在真皮下可植入装置中递送的药物组合物的制备可使用本领域已知的方法来执行，所述方法诸如为描述于例如美国专利第3,992,518号；第5,660,848号；及第5,756,115号中的方法。
渗透泵可用作呈片剂、丸剂、胶囊或可植入装置形式的缓慢释放剂。渗透泵为本领域熟知的且可易于为一般本领域技术人员自有提供用于延长释放药物递送的渗透泵经验的公司获得。实施例为ALZA的DUROSTM；ALZA的OROSTM；Osmotica Pharmaceutical的OsmodexTM系统；Shire Laboratories的EnSoTrolTM系统；及AlzetTM。描述渗透泵技术的专利为美国专利第6,890,918号；第6,838,093号；第6,814,979号；第6,713,086号；第6,534,090号；第6,514,532号；第6,361,796号；第6,352,721号；第6,294,201号；第6,284,276号；第6,110,498号；第5,573,776号；第4,200,0984号；及第4,088,864号，所述专利的内容以引用的方式并入本文中。本领域技术人员考虑到，本发明的公开内容及这些其他专利的公开内容两者均可产生用于本发明多肽的延长释放的渗透泵。
注射泵亦可用作缓慢释放剂。所述装置描述于美国专利第4,976,696号；第4,933,185号；第5,017,378号；第6,309,370号；第6,254,573号；第4,435,173号；第4,398,908号；第6,572,585号；第5,298,022号；第5,176,502号；第5,492,534号；第5,318,540号；及第4,988,337号中，所述专利的内容以引用的方式并入本文中。本领域技术人员考虑到，本发明的公开内容及这些其他专利的公开内容两者均可产生用于本发明组合物的延长释放的注射泵。
药物试剂盒
在一些实施方案中，本发明提供便于使用BPXTEN多肽的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒在至少第一容器中包含：(a)一定量的BPXTEN融合蛋白组合物，其足以在向有需要的受试者施用后治疗疾病、病况或障碍；及(b)一定量的药学上可接受的载剂；一起组成准备用于注射或无菌水、缓冲液或右旋糖复原的调配物；以及标识BPXTEN药物以及储存及操作条件的标签以及所述药物的批准适应症表、用于预防和/或治疗批准适应症的BPXTEN药物复原和/或施用说明书、适当剂量及安全信息以及标识药物批次及有效期的信息。在前述物质的一些实施方案中，试剂盒可包含可携载适用于BPXTEN组合物的稀释剂的第二容器，所述第二容器将向使用者提供待递送至受试者的适当浓度的BPXTEN。
治疗方法
本文公开内容包括诸如上文所描述或本文任何其他地方所描述的任何多肽的多肽用于制备用以治疗受试者疾病的药剂的用途。在一些实施方案中，待治疗的特定疾病将视生物活性蛋白的选择而定。在一些实施方案中，疾病为癌症(包括其任何形式)。在一些情况下，癌症或肿瘤的特征可在于低、中等或高HER2表达量。
本文公开内容包括治疗受试者的疾病的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用一次或多次治疗有效剂量的诸如上文所描述或本文任何其他地方所描述的任何药物组合物的药物组合物。在一些实施方案中，疾病为癌症(包括其任何形式)。在一些实施方案中，受试者为小鼠、大鼠、猴及人类。在一些情况下，癌症或肿瘤的特征可在于低、中等或高HER2表达量。
在某些实施方案中，本发明的靶向HER-2的双特异性组合物(且特别是，AMX818)可有利地与有效治疗或改善癌症作用的第二治疗剂组合。额外治疗剂可选自由以下组成的群：抗体、抗体片段、抗体结合物、细胞毒性剂、毒素、放射性核素、免疫调节剂、光敏性治疗剂、辐射敏化剂、激素、抗血管生成剂及其组合。特别优选的第二或额外治疗剂包括其他HER2靶向剂、化学治疗剂、放射治疗剂以及靶向HER3及涉及对HER2驱动癌症治疗的抗性的其他目标的药剂。
可用于本发明中的治疗性抗体的实施例包括利妥昔单抗(rituximab)(美罗华(Rituxan))、本妥昔单抗维多汀(Brentuximab Vedotin)(雅诗力(Adcetriz))、曲妥珠单抗-美坦新(Ado-trastuzumab emtansine)(卡德克拉(Kadcyla))、西妥昔单抗(Cetuximab)(艾必妥(Erbitux))、贝伐单抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀(Avastin))、异贝莫单抗(Ibritumomab)(泽娃灵(Zevalin))、维多珠单抗(vedolizumab)(安吉优(Entyvio))、伊匹单抗(Ipilimumab)(易沃伊(Yervoy))、纳武单抗(Nivolumab)(欧狄沃(Opdivo))、派姆单抗(pembrolizumab)(可瑞达(Keytruda))、阿仑单抗阿特珠单抗(Alemtuzamabatezolizumab)(泰圣奇(Tecentriq))、阿维鲁单抗(avelumab)(巴文西亚(Bavencio))、德瓦鲁单抗(durvalumab)(英飞凡(Imfinzi))、B-701、奥伐木单抗(Ofatumumab)、阿托珠单抗(Obinutuzumab)(加泽瓦(Gazyva))帕尼单抗(Panitumumab)、普扎珠单抗(plozalizumab)、BI-754091、OREG-103、COM-701、BI-754111及其组合。
根据一些实施方案，抗体、其片段或其结合物选自由以下组成的群：利妥昔单抗(美罗华)、本妥昔单抗维多汀(雅诗力)、曲妥珠单抗-美坦新(卡德克拉)、伊匹单抗(易沃伊)、纳武单抗(欧狄沃)、派姆单抗(可瑞达)、阿仑单抗阿特珠单抗(泰圣奇)、德瓦鲁单抗(英飞凡)、奥伐木单抗、阿托珠单抗(加泽瓦)帕尼单抗及其组合。
在其他实施方案中，额外药剂可为DNA损伤剂、抗代谢物、抗微管剂、抗生素剂等。DNA损伤剂包括烷基化剂、基于铂的药剂、嵌入剂及DNA复制抑制剂。DNA烷基化剂的非限制性实施例包括环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、乌拉莫司汀(uramustine)、美法仑(melphalan)、氯芥苯丁酸、异环磷酰胺、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、链脲佐菌素、硫酸布他卡因(busulfan)、替莫唑胺(temozolomide)、其药学上可接受的盐、前驱药及其组合。基于铂的药剂的非限制性实施例包括顺铂、卡铂、奥沙利铂(oxaliplatin)、奈达铂(nedaplatin)、赛特铂(satraplatin)、四硝酸三铂、其药学上可接受的盐、前驱药及其组合。嵌入剂的非限制性实施例包括小红莓、道诺霉素(daunorubicin)、埃达霉素(idarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、其药学上可接受的盐、前驱药及其组合。DNA复制抑制剂的非限制性实施例包括伊立替康(irinotecan)、拓朴替康(topotecan)、安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷、替尼泊苷(teniposide)、其药学上可接受的盐、前驱药及其组合。抗代谢物包括：叶酸拮抗剂，诸如甲胺喋呤及培美曲塞(premetrexed)；嘌呤拮抗剂，诸如6-巯基嘌呤、达卡巴嗪(dacarbazine)及氟达拉滨(fludarabine)；及嘧啶拮抗剂，诸如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、地西他滨(decitabine)、其药学上可接受的盐、前驱药及其组合。抗微管剂包括但不限于长春花生物碱、太平洋紫杉醇(Taxol)、多西他赛(docetaxel)(Taxotere/>)及伊沙匹隆(ixabepilone)(Ixempra/>)。抗生素剂包括但不限于放线菌素、蒽环霉素、戊柔比星(valrubicin)、表柔比星(epirubicin)、博莱霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)、丝裂霉素、其药学上可接受的盐、前驱药及其组合。
例示性细胞毒性剂为本领域技术人员已知的，且可例如选自由以下组成的群：环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、乌拉莫司汀、美法仑、氯芥苯丁酸、异环磷酰胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲佐菌素、硫酸布他卡因、替莫唑胺、顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、赛特铂、四硝酸三铂、小红莓、道诺霉素、埃达霉素、米托蒽醌、甲胺喋呤、培美曲塞、6-巯基嘌呤、达卡巴嗪、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、卡培他滨、吉西他滨、地西他滨、长春花生物碱、太平洋紫杉醇(紫杉醇)、多西他赛(克癌易(Taxotere))、伊沙匹隆(艾克斯普拉(Ixempra))、放线菌素、蒽环霉素、戊柔比星、表柔比星、博莱霉素、普卡霉素、丝裂霉素、其药学上可接受的盐、前驱药及其组合。
本发明的细胞毒性剂亦包括PI3K/Akt路径抑制剂。PI3K/Akt路径抑制剂的非限制性实施例包括A-674563(CAS编号552325-73-2)、AGL 2263、AMG-319(Amgen,ThousandOaks,Calif.)、AS-041164(5-苯并[1,3]间二氧杂环戊烯-5-基亚甲基-噻唑烷-2,4-二酮)、AS-604850(5-(2,2-二氟-苯并[1,3]间二氧杂环戊烯-5-基亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮)、AS-605240(5-喹喔啉-6-亚甲基-1,3-噻唑烷-2,4-二酮)、AT7867(CAS编号857531-00-1)；苯并咪唑系列，Genentech(Roche Holdings公司,South San Francisco,Calif.)、BML-257(CAS编号32387-96-5)、BVD-723、CAL-120(Gilead Sciences,Foster City,Calif.)、CAL-129(Gilead Sciences)、CAL-130(Gilead Sciences)、CAL-253(Gilead Sciences)、CAL-263(Gilead Sciences)、CAS编号612847-09-3、CAS编号681281-88-9、CAS编号75747-14-7、CAS编号925681-41-0、CAS编号98510-80-6、CCT128930(CAS编号885499-61-6)、CH5132799(CAS编号1007207-67-1)、CHR-4432(Chroma Therapeutics有限公司,Abingdon,UK)、FPA124(CAS编号902779-59-3)、GS-1101(CAL-101)(Gilead Sciences)、GSK 690693(CAS编号937174-76-0)、H-89(CAS编号127243-85-0)、和厚朴酚、IC87114(Gilead Science)、IPI-145(Intellikine公司)、KAR-4139(Karus Therapeutics,Chilworth,UK)、KAR-4141(KarusTherapeutics)、KIN-1(Karus Therapeutics)、KT 5720(CAS编号108068-98-0)、米替福新(Miltefosine)、MK-2206二盐酸盐(CAS编号1032350-13-2)、ML-9(CAS编号105637-50-1)、纳曲吲哚盐酸盐(Naltrindole Hydrochloride)、OXY-111A(NormOxys公司,Brighton,Mass.)、哌立福新(perifosine)、PHT-427(CAS编号1191951-57-1)；PI3激酶δ抑制剂，MerckKGaA(Merck&Co.,Whitehouse Station,N.J.)；PI3激酶δ抑制剂，Genentech(RocheHoldings公司)；PI3激酶δ抑制剂，Incozen(Incozen Therapeutics,Pvt.有限公司,Hydrabad,India)；PI3激酶δ抑制剂-2，Incozen(Incozen Therapeutics)；PI3激酶抑制剂，Roche-4(Roche Holdings公司)；PI3激酶抑制剂，Roche(Roche Holdings公司)；PI3激酶抑制剂，Roche-5(Roche Holdings公司)；PI3-α/δ抑制剂，Pathway Therapeutics(PathwayTherapeutics有限公司,South San Francisco,Calif.)；PI3-δ抑制剂，Cellzome(Cellzome AG,Heidelberg,Germany)；PI3-δ抑制剂，Intellikine(Intellikine公司,LaJolla,Calif.)；PI3-δ抑制剂，Pathway Therapeutics-1(Pathway Therapeutics有限公司)；PI3-δ抑制剂，Pathway Therapeutics-2(Pathway Therapeutics有限公司)；PI3-δ/γ抑制剂，Cellzome(Cellzome AG)；PI3-δ/γ抑制剂，Cellzome(Cellzome AG)；PI3-δ/γ抑制剂，Intellikine(Intellikine公司)；PI3-δ/γ抑制剂，Intellikine(Intellikine公司)；PI3-δ/γ抑制剂，Pathway Therapeutics(Pathway Therapeutics有限公司)；PI3-δ/γ抑制剂，Pathway Therapeutics(Pathway Therapeutics有限公司)；PI3-γ抑制剂Evotec(Evotec)；PI3-γ抑制剂，Cellzome(Cellzome AG)；PI3-γ抑制剂，PathwayTherapeutics(Pathway Therapeutics有限公司)；PI3Kδ/γ抑制剂，Intellikine-1(Intellikine公司)；PI3Kδ/γ抑制剂，Intellikine-1(Intellikine公司)；皮克昔布(pictilisib)(Roche Holdings公司)、PIK-90(CAS编号677338-12-4)、SC-103980(Pfizer,New York,N.Y.)、SF-1126(Semafore Pharmaceuticals,Indianapolis,Ind.)、SH-5、SH-6、四氢姜黄素、TG100-115(Targegen公司,San Diego,Calif.)、曲西立滨(Triciribine)、X-339(Xcovery,West Palm Beach,Fla.)、XL-499(Evotech,Hamburg,Germany)、其药学上可接受的盐及其组合。
组合疗法中的额外药剂可为植物或动物来源的毒物或毒液。实施例为白喉毒素或其部分。在其他实施例中，额外药剂可为“放射性核素””，亦即例如静脉内或经口施用患者的放射性物质，之后其经由患者的正常代谢穿透至目标器官或组织中，在所述目标器官或组织中其短时间递送局部辐射。放射性核素的实施例包括但不限于I-125、At-211、Lu-177、Cu-67、I-131、Sm-153、Re-186、P-32、Re-188、In-114m及Y-90。
术语“免疫调节剂””是指通过加强或降低免疫系统产生抗体或致敏细胞的能力来改变免疫反应的物质，所述抗体或致敏细胞辨识引发其生产的抗原且与所述抗原反应。免疫调节剂可为重组制剂、合成制剂或天然制剂，且包括细胞因子、皮质类固醇、细胞毒性剂、胸腺素及免疫球蛋白。一些免疫调节剂天然存在于身体中，且这些免疫调节剂中的某些可用于药理学制剂中。免疫调节剂的实施例包括但不限于颗粒球群落刺激因子(G-CSF)、LAG-3、IMP-321、JCAR-014、ASLAN-002(BMS-777607)、干扰素、咪喹莫特(imiquimod)及来自细菌的细胞膜洗脱份、IL-2、IL-7、IL-12、CCL3、CCL26、CXCL7、合成磷酸胞嘧啶-鸟苷(CpG)、免疫检查点抑制剂及其组合。尤其靶向淋巴毒素及LiGHT的靶向细胞因子疗法亦可与本发明组合物组合使用。
在一些组合治疗中，额外药剂可为使肿瘤细胞对放射疗法更敏感的“辐射敏化剂”。辐射敏化剂的实施例包括米索硝唑、甲硝哒唑、替拉扎明(tirapazamine)及反式藏红花酸钠以及其组合。
在再其他实施方案中，额外药剂为诸如血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂及内皮细胞迁移抑制剂的减少或抑制新血管生长的“抗血管生成”剂。抗血管生成剂包括但不限于2-甲氧基雌二醇、血管抑制素、贝伐单抗、软骨源血管生成抑制因子、内皮抑制素、IFN-α、IL-12、伊曲康唑(itraconazole)、利诺胺(linomide)、血小板因子-4、泌乳素、SU5416、苏拉明(suramin)、他喹莫德(tasquinimod)、替康兰(tecogalan)、四硫钼酸盐、沙立度胺(thalidomide)、血小板反应蛋白、血小板反应蛋白、TNP-470、塞维-阿柏西普(ziv-aflibercept)、其药学上可接受的盐、前驱药及其组合。
在尤其优选实施方案中，本发明的靶向HER2的双特异性组合物可与诸如抗PD-1/抗PD-L1组合物、CTLA-4、OX40及其类似物的检查点抑制剂组合。在所述组合疗法的特定实施方案中，本发明的组合物可与细胞表面受体计划性细胞死亡蛋白1(也称为PD-1)拮抗剂以及PD-L1拮抗剂组合。
PD-1通过抑制T细胞发炎活性而在下调免疫系统及促进自体耐受性中起重要作用。存在于T细胞中的PD-1配位体PD-L1及PD-L2与PD-1受体的结合抑制T细胞增殖及细胞因子生产。PD-1配位体上调在一些肿瘤中发生，且经由此路径进行的信号传导可促进对肿瘤的活性T细胞免疫监视的抑制。抗PD-1抗体结合至PD-1受体且阻断其与PD-L1及PD-L3的相互作用，从而释放PD-1路径介导的对免疫反应的抑制，所述免疫反应包括抗肿瘤免疫反应。
本领域技术人员了解可使用的各种抗PD-1抗体。在一些实施方案中，与本发明化合物组合使用的例示性抗PD-1抗体为派姆单抗(Keytruda)。在其他实施方案中，与上文所描述的化合物组合使用的抗PD-1抗体为纳武单抗(Opdivo/>)。在其他实施方案中，与上文所描述的化合物组合使用的抗PD-1抗体为皮立珠单抗(Medivation)。
本领域技术人员已知的额外PD-1抗体包括AGEN-2034(Agenus)、AMP-224(Medimmune)、BCD-100(Biocad)、BGBA-317(Beigene)、BI-754091(BoehringerIngelheim)、CBT-501(Genor Biopharma)、CC-90006(Celgene)、赛咪单抗(cemiplimab)(Regeneron Pharmaceuticals)、德瓦鲁单抗+MEDI-0680(Medimmune)、GLS-010(HarbinGloria Pharmaceuticals)、IBI-308(Eli Lilly)、JNJ-3283(Johnson&Johnson)、JS-001(Shanghai Junshi Bioscience公司)、MEDI-0680(Medimmune)、MGA-012(MacroGenics)、MGD-013(Marcogenics)、帕唑帕尼(pazopanib)盐酸盐+派姆单抗(Novartis)、PDR-001(Novartis)、PF-06801591(Pfizer)、REGN-2810(Regeneron)、SHR-1210(Jiangsu HengruiMedicine公司)、TSR-042(Tesaro公司)、LZM-009(Livzon Pharmaceutical Group公司)及ABBV-181(AbbVie公司)。各种可能性表示本发明的独立实施方案。
在一个优选实施方案中，对于本发明的组合疗法，抗PD-1抗体为派姆单抗(Keytruda)。
在其他实施方案中，本发明的组合物与抗PD-L1抗体组合。用于本发明的组合中的例示性所述抗PD-L1抗体可选自由以下组成的群：德瓦鲁单抗(MedImmune有限责任公司)、阿特珠单抗(Hoffmann-La Roche有限公司、Chugai Pharmaceutical有限公司)、阿维鲁单抗(Merck KGaA)、CX-072(CytomX Therapeutics公司)、BMS-936559(ViiV Healthcare有限公司)、SHR-1316(Jiangsu Hengrui Medicine有限公司)、M-7824(Merck KGaA)、LY-3300054(Eli Lilly and Co)、FAZ-053(Novartis AG)、KN-035(AlphaMab有限公司)、CA-170(Curis公司)、CK-301(TG Therapeutics公司)、CS-1001(CStone Pharmaceuticals有限公司)、HLX-10(Shanghai Henlius Biotech有限公司)、MCLA-145(Merus NV)、MSB-2311(MabSpace Biosciences(Suzhou)有限公司)及MEDI-4736(Medimmune)。
在某些其他实施方案中，本发明的组合疗法可包括其他导向HER2的疗法。举例而言，将本发明的组合物与以下组合可是有利的：曲妥珠单抗及相关基于HER2的疗法(亦即靶向曲妥珠单抗抗原决定基的疗法)，诸如曲妥珠单抗、基于曲妥珠单抗的ADC、卡德克拉、恩赫图(Enhertu)；HER2酪氨酸激酶抑制剂，诸如拉帕替尼(lapatinib)、来那替尼(neratinib)、图卡替尼(tucatinib)；靶向HER2的免疫结合物，诸如TLR；及细胞因子。可与本发明的组合物组合使用的其他免疫疗法及基于检查点抑制剂的疗法包括基于CTLA4、TIGIT、OX40、PD1、PDL1、TIM3的疗法。本发明的组合物可进一步与基于CAR-T、NK或T细胞的疗法以及免疫疗法疫苗组合。亦考虑与细胞因子及靶向细胞因子的疗法的组合。备受关注的可为TGFb、VEGF及VEGFR1-3以及诸如阿瓦斯汀(Avastin)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)的抗血管生成靶向疗法或诸如阿西替尼(axitinib)、乐伐替尼(lenvatinib)、卡博替尼(cabozantinib)、瑞格非尼(regorafenib)、舒尼替尼(sunitib)、索拉非尼(sorafenib)的酪氨酸激酶抑制剂的使用。在其他实施方案中，可使用诸如帕博昔布及其类似物的CDK4/6抑制剂。诸如西妥昔单抗、帕尼单抗(panitumumab)、埃罗替尼(erlotinib)及奥希替尼(Osimertinib)的EGFR抑制剂亦可用于组合疗法中。
以下为组合物的实施例及本发明组合物的评估。应理解，在上文所提供的一般描述的情况下，可实践各种其他实施方案。
实施例
实施例1.通过最少突变由通用XTEN设计带条形码的XTEN
此实施例说明利用对通用XTEN的氨基酸序列(诸如上文表3b中之一者)作出(多个)最少突变的针对带条形码的XTEN的例示性设计方式。用于执行(多个)最少突变的相关准则包括以下中之一或多者：(a)将对应XTEN的序列变化减至最少；(b)将对应XTEN的氨基酸组成变化减至最少；(c)实质上维持对应XTEN的净电荷；(d)实质上维持对应XTEN的低免疫原性；(e)实质上维持XTEN提供的药物动力学特性。
举例而言，通过对表9中的通用XTEN执行一个或多个突变来构建带条形码的XTEN，所述一个或多个突变包含谷氨酸残基缺失、谷氨酸残基插入、谷氨酸残基取代或取代谷氨酸残基或其任何组合。
表9.四种用于工程改造带条形码的XTEN的通用XTEN
实施例2.带条形码的XTEN及其选择以与生物活性多肽(“BP”)融合的序列分析
此实施例说明用于与生物活性多肽融合的带条形码的XTEN的设计及选择(及超过一个带条形码的XTEN变成一组的装配)。视(多种)XTEN内(多个)条形码片段的位置及(多种)XTEN与生物活性蛋白融合以形成含XTEN构建体(例如XTEN化蛋白酶活化型T细胞接合子(XPAT))的方式而定，(多个)条形码片段可指示XTEN的(多个)截短体。
对两种例示性XTEN(XTEN864及XTEN288_1)执行计算机仿真GluC消化分析以标识在GluC完全消化XTEN后的可释放肽片段。计算机仿真分析将考虑，就具有连续谷氨酸残基(例如“EE”)的XTEN而言，GluC可在谷氨酸残基中的任一者之后裂解。如下表10中概述的结果中所示，10聚体肽序列“TPGTSTEPSE”(SEQ ID NO:96)及14聚体肽序列“GSAPGSEPATSGSE”(SEQ ID NO:97)各自在较长XTEN864中出现一次且仅一次，而所有其他肽序列在XTEN864中出现两次或更多次。且14聚体肽序列“GSAPGSEPATSGSE”(SEQ ID NO:97)亦在较短XTEN288_1中出现一次且仅一次。
相对于可自含XTEN构建体释放的所有其他肽片段而言评估候选条形码的独特性。因此，一种XTEN中的条形码序列无法在含XTEN构建体中的任何其他位置出现，所述构建体包括其内所含的任何其他XTEN、其内所含的任何生物活性蛋白或其邻近组分之间的任何连接部。举例而言，表11展示所述组两种XTEN的肽“独特性”表。由于14聚体肽序列“GSAPGSEPATSGSE”(SEQ ID NO:97)存在于XTEN864及XTEN288两者中，因此其对于所述组包含XTEN864及XTEN288两者的XTEN而言并不独特，且因此，可不用作用于检测含有两个XTEN序列两者的多肽产物中的截短的条形码。
选择一条形码(或一组条形码)可进一步涉及标识及确定XTEN内(多个)候选条形码的(多个)适当位置。候选条形码的位置可与XTEN(及作为整体的含XTEN构建体)的药理学上相关的信息相关，所述信息诸如为超过XTEN序列中的关键长度和/或(多个)缺失的XTEN的截短。若将XTEN864置放于含XTEN产物的N端处及若距产物的N端的238个氨基酸的截短不显著影响产物的药理学特性，则10聚体肽“TPGTSTEPSE”(SEQ ID NO:96)可充当适合的条形码片段。
表10.用于计算机仿真GluC消化分析的代表性XTEN序列
表11.肽“独特性”分析
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所有带下划线的序列皆产生独特的GluC肽
非XTEN核心带下划线且斜体
条形码肽加粗
例示性条形码肽序列绘示于下表12中。这些条形码序列应根据结构式(I)侧接：
AAA-Glu-条形码肽-BBB，
其中“AAA”表示Gly、Ala、Ser、Thr或Pro且“BBB”表示Gly、Ala、Ser或Thr，其经构型以便于通过GluC消化有效释放条形码肽。值得注意的是，在XTEN中插入各条形码肽可产生直接在所插入条形码肽之前或之后的额外独特序列。
表12.条形码肽的非限制性实施例的列表
(多种)候选条形码肽 SEQ ID NO:
SPATSGSTPE 140
GSAPATSE 141
GSAPGTATE 142
GSAPGTE 143
PATSGPTE 144
SASPE 145
PATSGSTE 146
GSAPGTSAE 147
SATSGSE 148
SGPGSTPAE 149
实施例3：设计及选择全序列XTEN化多肽构建体中的(多种)XTEN
此实施例说明含有两种XTEN的全序列多肽构建体的设计，一种XTEN为在N端处且另一XTEN为在C端处。
下表13说明用于代表性带条形码的BPXTEN(在N端及C端两者处含有带条形码的XTEN)及参考BPXTEN(在N端及C端两者处含有通用XTEN)中的XTEN序列。在代表性带条形码的BPXTEN中，带条形码的XTEN(SEQ ID No.8014)在BP的N端处融合，且另一带条形码的XTEN(SEQ ID No.8015)在BP的C端处融合。在参考BPXTEN中，“Ref-N”XTEN在BP的N端处融合，且“Ref-C”XTEN在BP的C端处融合。“Ref-N”XTEN的长度与带条形码的XTEN SEQ ID No.8014的长度相当；且“Ref-C”XTEN的长度与带条形码的XTEN SEQ ID No.8015的长度相当。带条形码的BPXTEN及参考BPXTEN各自含有于BP组分中的参考序列。参考序列为独特的且与在GluC蛋白酶完全消化后可自对应BPXTEN释放的所有其他肽片段的不同之处在于分子量(例如根据实施例5)。相对于可自BPXTEN构建体释放的所有其他肽片段而言评估参考序列的独特性。
表13.用于全长BPXTEN构建体中的代表性N端XTEN及C端XTEN组
*条形码肽加粗
所有带下划线的序列皆产生独特的GluC肽；
实施例4：带条形码的XTEN化融合多肽的重组构建及生产
实施例4说明使用本文所公开的方法进行的在C端处含有带条形码的XTEN且在N端处含有另一带条形码的XTEN的XTEN化融合多肽的重组构建、生产及纯化。
表达：编码含有抗CD3序列(例如阐述于表6a-6e中)、抗HER2序列(例如阐述于表6f中)、在C端处的带条形码的XTEN(例如阐述于表3a中)及在N端处的带条形码的XTEN(例如阐述于表3a中)的XTEN化融合多肽的构建体为在专用的大肠杆菌AmE098菌株中经表达且经由N端分泌性前导序列(MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA)(SEQ ID NO:100)分配于周质中，所述周质在易位期间裂解。将酦酵培养物在37℃下用无动物复合培养基生长且在磷酸盐耗乏之前将温度转变成26℃。在收取期间，使酦酵全培养液离心以将细胞制成集结粒。在收取时，记录总体积及细胞湿重(WCW；集结粒与上清液的比)，且收集集结细胞且将其在-80℃下冷冻。
回收：将经冷冻的细胞集结粒再悬浮于溶解缓冲液(100mM柠檬酸)中，目标为30％细胞湿重。使再悬浮液在pH 4.4下平衡，接着在17,000±200巴下均质化，同时监测输出温度且将输出温度维持在15±5℃下。均质物的pH经证实在规定范围内(pH 4.4±0.1)。
澄清：为了减少内毒素及宿主细胞杂质，使均质物经历低温(10±5℃)、酸性(pH4.4±0.1)絮凝隔夜(15-20小时)。为了移除不溶性部分，使絮凝均质物在8,000RCF及2-8℃下离心40分钟，且保留上清液。为了移除核酸、脂质及内毒素且充当助滤剂，将上清液调节至0.1％(m/m)硅藻土。为了使助滤剂保持悬浮，经由叶轮混合上清液且使其平衡30分钟。装配由深度过滤器、接着为0.22μm过滤器组成的滤器系列，接着用MQ冲洗。将上清液泵送通过滤器系列，同时调节流量以维持25±5psig的压降。
纯化
蛋白质-L捕获：为了移除宿主细胞蛋白质、内毒素及核酸，使用蛋白质-L来捕获存在于BPXTEN分子的aHER2 scFv内的κ域。本文使用蛋白质-L固定相(Tosoh TP AF-rProteinL-650F)、蛋白质-L移动相A(11.5mM柠檬酸、24.5mM Na2HPO4、125mM NaCl、0.005％聚山梨醇酯80，pH 5.0)及蛋白质-L移动相B(11mM磷酸、0.005％聚山梨醇酯80，pH 2.0)。用蛋白质-L移动相A平衡柱。将滤液调节至pH 5.5±0.2且装载至目标为2-4g/L-树脂的蛋白质-L柱上，接着追加蛋白质-L移动相A直至280nm处的吸亮度(A280)返回至(局部)基线。用移动相B洗脱结合物质且以预外加0.4CV的0.5M Na2HPO4的2CV洗脱份形式收集，且通过SDS-PAGE进行分析。
C-标签中度纯化：为了确保C端完整性，使用C-标签亲和色谱法捕获C端-EPEA标签。本文使用C-卷标固定相(Thermo C-tagXL)、C-标签移动相A(50mM组氨酸、200mM NaCl、0.005％聚山梨醇酯80，pH 6.5)及C-标签移动相B(20mM Tris、0.6M MgCl2、0.005％聚山梨醇酯80，pH 7.0)。用C-标签移动相A平衡柱。将IMAC洗脱液装载至目标为2g/L-树脂的C-标签柱上，且追加C-标签移动相A直至280nm处的吸亮度(A280)返回至(局部)基线。用C-标签移动相B洗脱结合物质。将C-标签洗脱液以2CV洗脱份形式收集且通过SDS-PAGE进行分析。
AEX抛光：为了自单体产物分离二聚体及聚集体，利用阴离子交换(AEX)色谱法捕获负电性N端及C端XTEN域。本文使用AEX1固定相(BIA QA-80)、AEX1移动相A(50mM组氨酸、200mM NaCl、0.005％聚山梨醇酯80，pH 6.5)及AEX1移动相B(50mM组氨酸、500mM NaCl、0.005％聚山梨醇酯80，pH 6.5)。用AEX移动相A平衡柱。将C-标签洗脱液用MQ稀释至10mS/cm，以2g/L-树脂为目标进行装载，且接着追加AEX移动相A直至280nm处的吸亮度返回至(局部)基线。在60CV上用0％B至100％B的梯度洗脱结合物质。当A280高于(局部)基线≥2mAU时，以1CV等分试样收集洗脱份。通过SDS-PAGE及SE-HPLC分析洗脱份，且发现为≥98％单体的洗脱份经汇集(AEX池)以供进一步加工。
调配：为了将产物交换至调配缓冲液中且使产物达到目标浓度(0.5g/L)，使用超过滤/透滤(UF/DF)。使用具有0.1m2的面积及15psi的TMP目标的10kDa膜，将AEX池浓缩至0.5g/L，接着用调配缓冲液(50mM组氨酸、200mM NaCl、0.005％聚山梨醇酯80，pH 6.5)稀释10倍。将AEX池浓缩10倍且再稀释10倍两次。所回收的调配产物在BSC内经0.22μm过滤、等分、标记且以散装药物物质(BDS)形式储存于-80℃下。通过各种分析方法确认BDS以满足所有批次释放准则。通过SDS-PAGE分析总体质量，通过SE-HPLC分析单体与二聚体及聚集物的比率，且通过HI-HPLC分析N端质量及产物均质性。通过ESI-MS证实身分。
实施例5.通过蛋白酶消化释放条形码肽
此实施例说明使用本文所公开的方法自含有不同长度或截短形式的含XTEN构建体的多肽混合物释放(多个)条形码片段及(多个)参考片段。
经由依序在DTT中且接着在碘乙酰胺中培育来还原及烷基化含XTEN构建体的样本。随后，使用尺寸排阻旋转滤筒对样本进行缓冲更换且去盐。以1:5的酶:底物比将Glu-C蛋白酶添加至样本中且在37℃下培育样本以用于消化。随后，将样本移动至4℃以停止蛋白水解反应且置放于自动取样器小瓶中以用于分析。
实施例6.检测和定量(多种)条形码肽和(多种)参考肽
此实施例说明用于生成单个条形码肽的定量量测结果的质谱法。LC-平行反应监测(PRM)法经程序化为高分辨率精确质量(HRAM)质谱仪。不同于传统数据相关获得(DDA)质谱法，PRM法在一次运作中聚焦于一组特定的15-30种肽，每次工作循环各肽通过MS-MS定序一次。因此，此方法生成完整肽的未片段化前驱体离子以及肽的各片段离子的萃取离子色谱图(XIC)以证实其序列。片段离子XIC常常比前驱体离子片段更敏感且更选择性地定量。所使用的LC-PRM法包括七种条形码肽的轻链及重链型式。在获得后量测此14种肽的所有片段离子的色谱峰面积且使用最强片段离子用于定量量测。接着，针对XTEN分子中各个点处的相对XTEN:PAT丰度计算XTEN条形码肽与PAT条形码肽的峰面积比率。
实施例7.用于通过质谱法(MS)定量肽的稳定同位素标记
此实施例说明使得能够对来自含XTEN多肽的条形码肽进行绝对(而非相对)定量的稳定同位素标记方案。将采用标准重链标记氨基酸定量方案，其中C端谷氨酸经(13C)5H7(15N)O3重链标记类似物置换的条形码肽的合成类似物获自特殊供货商。将制备校准曲线，其中将含有已知量的XTEN条形码的多肽连续稀释至基质中，在基质中重链标记合成肽保持在恒定浓度下。精确定量可通过针对含有相同棘含量的重链标记肽的研究样本校准曲线的色谱峰面积重链:轻链比来执行。
实施例8.定量含XTEN多肽的截短
此实施例说明含XTEN多肽的混合物中的长度变体或截短变体的定量。
举例而言，条形码肽“SGPGSTPAESGSE”(SEQ ID NO:150)以76个氨基酸位于描述于实施例3中且获自实施例3的代表性带条形码的BPXTEN序列中以指示XTEN在BPXTEN的N端处的苛刻截短。亦考虑潜在条形码片段“SPAGSPTSTESGTSE”(SEQ IDNO:151)，其位于N端处。遵循实施例6的程序，各条形码肽相对于来自生物活性蛋白(例如scFv片段)序列的独特参考肽序列的丰度量测结果比指示全长多肽及具有可能会影响样本混合物中的药理学功效的截短的变体的总量。至少一个参考片段的丰度量测结果为用于指示样本混合物中的多肽的所有变体的总量。因此，参考片段与条形码片段之间的差异丰度告知截短多肽变体的量。分析LC-MS资料以测定条形码片段与参考片段的量比率，此指示多肽混合物中药理学上有效的变体的相对量。
一组两个(或三个)条形码为用于指示不同水平的多肽截短。LC-MS数据为用于测定各条形码片段的量与参考片段的量的比率，由此定量多肽混合物中截短变体的分布。
实施例9.针对靶细胞的XTEN化(经遮蔽)XPAT和去XTEN化(未经遮蔽、经活化)XPAT(蛋白酶活化型T细胞接合子)的体外细胞毒性
此实施例说明一般在XTEN化蛋白酶活化型T细胞接合子(“XPAT”)上及尤其在HER2-XPAT上的XTEN的遮蔽。此实施例说明XTEN化(经遮蔽)HER2-XPAT(例如如表D中所阐述)及对应的去XTEN化(未经遮蔽)HER2-PAT的细胞毒性差异。
使用体外细胞毒性分析测定XTEN化PAT(如表D中所阐述)及对应的去XTEN化PAT(经蛋白酶处理)的细胞毒性，所述分析利用在处理后溶解的靶细胞的孔中存在的ATP的量作为细胞活力量测代表。将表达HER2的靶细胞以不同密度(BT474:20k个细胞/孔及SKOV3:10k个细胞/孔)接种于白色不透明底盘上且使其在37℃、5％CO2下培育隔夜(18-24小时)。在隔夜培育结束之前，将周边血液单核细胞(PBMC)解冻且在37℃、5％CO2下培育隔夜。PBMC为通过自获自BioIVT的全血或富集淋巴球的肤色血球层制剂进行Ficoll密度梯度离心而自所筛选的健康供体分离。使用9点、3倍滴定(第10点为非处理)制备10×XTEN化及去XTEN化PAT滴定，其中XTEN化PAT的起始浓度为2400nM且去XTEN化PAT的起始浓度为10nM。将PBMC以1:1效应物:目标比率接种于孔中。将10×XTEN化PAT及去XTEN化PAT滴定10倍稀释至孔中，起始浓度分别为240nM及1nM。将盘在37℃、5％CO2下培育48小时。在48小时培育之后，用1×PBS洗涤盘3次，且将100μL 1×PBS添加至所有孔中。将100μL CellTiter-Glo荧光底物溶液添加至所有孔中，且使盘在室温下培育1-5分钟。随后，在盘振荡器上在300-500rpm下振荡盘30-60秒以混合孔的内容物且接着使用100ms的积分时间以亮度计读取。所产生的信号的强度与存在于孔中的活细胞的量相关。计算所有非处理孔的信号平均值且将其用于测定处理孔的活细胞％((处理信号/非处理信号的平均值)×100＝存活％)。通过浓度绘制存活％，且使用GraphPad Prism软件用4参数逻辑回归方程式推导半最大反应(EC50)值。
XTEN化PAT及对应的去XTEN化PAT在所测试的所有表达HER2的细胞株上展现较大细胞毒性差异，此证实XTEN化引起经遮蔽双特异性抗体的细胞溶解活性降低(失活状态)。如图5A-5B中所示，以剂量依赖性方式观测到BT-474及SK-OV-3细胞上去XTEN化(未经遮蔽、经活化)PAT的细胞毒性，其中在0.3nM下观测到～80％的最大杀灭。如图5A-5B中所示，去XTEN化PAT展现4.8pM(BT474)及3.4pM(SKOV3)的EC50值，而XTEN化PAT展现49,370pM(BT474)及44,474pM(SKOV3)的EC50值。观测结果证实去XTEN化HER2-PAT在具有HER2表达的细胞株上具有细胞毒性活性，且XTEN化屏蔽(或护罩)能够形成免疫突触，从而引起细胞毒性降低。
实施例10.针对表达低含量目标抗原的靶细胞的XTEN化(经遮蔽)XPAT和去XTEN化(未经遮蔽、经活化)XPAT的体外细胞毒性
实施例10a：
正常人类心肌细胞表达低含量的HER2，且因此，已在经一些靶向HER2的疗法治疗的患者中观测到罕见心脏毒性病例。鉴于靶向HER2的药剂的已知潜在的心脏毒性，评估针对表达HER2的人类心肌细胞的AMX-818毒性。与非人类灵长类动物(NHP)临床前研究中不具有心脏毒性一致，AMX-818对人类心肌细胞展示体外有限细胞毒性，即使在微摩尔剂量下。相比之下，未经遮蔽TCE对应物展现显著较大的细胞毒性活性(～100pM的EC50)
此实施例说明响应于HER2-XPAT(例如阐述于表D中)及其活性蛋白水解产物，亦即对应的HER2-PAT的浓度增加，原代心肌细胞对T细胞导向的细胞毒性的敏感度。
使用购自FujiFilm Cellular Dynamics的正常人类心肌细胞。自液氮复活心肌细胞(iCell心肌细胞，Cellular Dynamics International)且将其以20,000个细胞/96孔涂铺7天，且根据制造商说明书进行处理。将人类周边血液淋巴球以1:1效应物:目标比添加至iCell心肌细胞上，其中XTEN化HER2-XPAT或对应的去XTEN化HER2-PAT的浓度增加3倍且在37℃、5％CO2下培育48小时。在RPMI(洛斯维·帕克纪念研究所(Roswell Park MemorialInstitute))培养基及10％加热失活胎牛血清中执行分析。经由ATP定量测定心肌细胞细胞活力且用Cell Titer-Glo发光细胞活力分析系统(Promega)执行。抽吸细胞上清液，且用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次，抽吸且接着添加PBS(100μl/孔)。使用LS405微定量盘式洗涤器分配器(BioTek)进行自动化盘洗涤。添加Cell Titer-Glo试剂(100μl/孔)，且在室温下培育分析盘5分钟。用多标签读取器(Molecular Devices)及发光检测器定量发光。对于细胞毒性分析，自相对发光单位(RLU)计算活细胞％。存活％＝(测试孔RLU/仅靶细胞RLU)×100。对于EC50测定，在Microsoft Excel中转换数据且用Graph Pad Prism 8.3.1软件'log(激动剂)相对于反应可变斜率(四个参数)进行分析。
如图6A中所示，响应于EC50浓度大致为64pM的去XTEN化HER2-PAT，通过T细胞导向的细胞溶解杀灭心肌细胞，而心肌细胞仍难以用高达1μM的浓度的XTEN化HER2-XPAT杀灭进行治疗，此说明XTEN化PAT在心肌细胞中的活性与癌细胞株相比较低。
实施例10b：此实施例说明响应于HER2-XPAT(例如阐述于表D中)及其活性蛋白水解产物，亦即对应的HER2-PAT的浓度增加，具有相对低水平的HER2表达的另一细胞株MCF7对T细胞导向的细胞毒性的敏感度。
根据已确立方案培养MCF-7细胞。根据实施例10a中所概述的方法量测且分析浓度-反应曲线及EC50值。
如图6B中所示，响应于EC50浓度在0.01nM与0.1nM之间的以蛋白水解方式去XTEN化HER2-XPAT(实心圆)，通过T细胞导向的细胞溶解有效杀灭MCF-7细胞。HER2-XPAT上的XTEN化(例如阐述于表D中)使T细胞介导的细胞毒性降低至少104倍，如通过剂量-反应曲线的向右偏移(实心正方形)所指示。
实施例10c：
此实施例说明响应于HER2-XPAT(例如阐述于表D中)及其活性蛋白水解产物，亦即对应的HER2-PAT的浓度增加，表达中等含量的HER2的另一细胞株MDA-MB-453对T细胞导向的细胞毒性的敏感度。MDA-MB-453为具有中等HER2表达的乳腺癌细胞株。
使用体外细胞毒性分析测定XTEN化PAT(如表D中所阐述)及对应的去XTEN化PAT(经蛋白酶处理)的细胞毒性，所述分析利用在处理后溶解的靶细胞的孔中存在的ATP的量作为细胞活力量测代表。将表达HER2的靶细胞(MDA-MB-453株)以10k个细胞/孔接种于白色不透明底盘上且使其在37℃、5％CO2下培育隔夜(18-24小时)。在隔夜培育结束之前，将周边血液单核细胞(PBMC)解冻且在37℃、5％CO2下培育3-4小时。PBMC为通过自获自BioIVT的全血或富集淋巴球的肤色血球层制剂进行Ficoll密度梯度离心而自所筛选的健康供体分离。使用7点、5倍滴定制备10×XTEN化及去XTEN化PAT滴定，其中XTEN化PAT的起始浓度为3000nM且去XTEN化PAT的起始浓度为10nM。将PBMC以10:1效应物:目标比率接种于孔中。将10×XTEN化PAT及去XTEN化PAT滴定10倍稀释至孔中，起始浓度分别为300nM及1nM。将盘在37℃、5％CO2下培育48小时。在48小时培育之后，用1×PBS洗涤盘3次，且将100μL 1×PBS添加至所有孔中。将100μL CellTiter-Glo荧光底物溶液添加至所有孔中，且使盘在室温下培育1-5分钟。随后，在盘振荡器上在300-500rpm下振荡盘30-60秒以混合孔的内容物且接着使用100ms的积分时间以亮度计读取。所产生的信号的强度与存在于孔中的活细胞的量相关。计算所有非处理孔的信号平均值且将其用于测定处理孔的活细胞％((处理信号/非处理信号的平均值)×100＝存活％)。通过浓度绘制存活％，且使用GraphPad Prism软件用4参数逻辑回归方程式推导半最大反应(EC50)值。
在图6C中分别展示去XTEN化HER2-XPAT(实心圆)及XTEN化HER2-PAT(实心正方形)的浓度-反应曲线。
本文所测试的细胞株的HER2表达量为本领域已知的。举例而言，Hendriks等人(Mol.Cancer Ther.2013年9月1日；12(9):1816-1828)，所述文献以全文引用的方式并入本文中，细节是指图1E中的各种细胞的HER2含量(X轴指示每细胞的HER2受体数目)。BT-474可具有“3+”的相对高的HER2含量(免疫组织化学测试评分)；心肌细胞可具有“2+”的HER2含量；且MCF-7可具有“1+/0”的相对低的HER2含量。
实施例11.通过施用XTEN化XPAT而在受试者中诱导的肿瘤消退
此实施例说明通过施用媒剂、不可裂解XTEN化HER2-PAT、可裂解XTEN化HER2-PAT及未经遮蔽HER2-PAT而在受试者中诱导的肿瘤消退。实验中所使用的不可裂解构建体与对应的可裂解构建体相同，但释放位点已经由GASTEP氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸和/或脯氨酸)制造的类似长度的不可裂解序列置换。
实施例11a：在肿瘤接种前一天，向小鼠右侧腹植入雌激素集结粒(17β-雌二醇，60天释放)。将BT-474肿瘤细胞以2×107BT-474/200μl RPMI 1640及基质胶(1:1)/小鼠的浓度皮下接种于各小鼠的右侧腹区域以用于肿瘤发展。肿瘤细胞接种日期表示为第0天(D0)。
当肿瘤在D8时变得可触知(平均肿瘤体积(MTV)＝117mm3)时，以1×107PBMC/200μlRPMI 1640/小鼠静脉内植入PBMC。未向一组小鼠注射PBMC(“无hPBMC”组)且所述组小鼠与注射PBMC的小鼠同时经历剩余实验治疗。当平均肿瘤体积达到147mm3时(D10)，向“无hPBMC”小鼠组施用媒剂(稀释剂)(在图7A中为实心正方形)；且将注射PBMC的小鼠随机分为四个组且分别施用媒剂(稀释剂)(在图7A中为实心圆)、未经遮蔽双特异性体(在图7A中为实心三角形)、可裂解XTEN化双特异性体(在图7A中为六角形)及不可裂解XTEN化双特异性体(在图7A中为菱形)。所有五个组皆接受15nmol/Kg的等摩尔剂量。
如图7A中所绘示，到研究结束时，亦即D35，可裂解XTEN化HER2-PAT(例如阐述于表D中)及未经遮蔽双特异性体两者均在与对照(具有或不具有hPBMC的媒剂)及不可裂解XTEN化双特异性对应物相比时展现显著的抗肿瘤功效。不可裂解XTEN化双特异性构建体不具有任何肿瘤生长抑制支持以下：在XTEN化HER2双特异性体上所观测到的抗肿瘤功效为由蛋白水解裂解驱动。
实施例11b：所实施的实验设置类似于实施例11a中所描述的实验设置。在肿瘤接种前一天，向小鼠右侧腹植入雌激素集结粒(17β-雌二醇，60天释放)。将BT-474肿瘤细胞以2×107BT-474/200μl RPMI 1640及基质胶(1:1)/小鼠的浓度皮下接种于各小鼠的右侧腹区域以用于肿瘤发展。肿瘤细胞接种日期表示为第0天(D0)。当肿瘤在D8时变得可触知(MTV＝94mm3)时，以1×107PBMC/200μl RPMI 1640/小鼠静脉内植入PBMC。未向一组小鼠注射PBMC(“无hPBMC”组)且所述组小鼠与注射PBMC的小鼠同时经历剩余实验治疗。当MTV达到444mm3时(D20)，将注射PBMC的小鼠随机分组，且在D21时将媒剂(稀释剂)及测试物治疗以单次剂量形式递送至所有组。
图7B绘示当与对照及不可裂解XTEN化双特异性对应物相比时，可裂解XTEN化HER2-XPAT(例如阐述于表D中)在单次剂量之后即使在较大已确立肿瘤(例如平均肿瘤体积(MTV)>400mm3)中的显著抗肿瘤功效。不具有通过不可裂解XTEN化HER2-PAT达成的可观水平的肿瘤生长抑制支持以下：可裂解XTEN化HER2-PAT的抗肿瘤功效为由蛋白水解裂解驱动。
实施例11c：实施例11a及11b使用由表达相对高含量的HER2的乳腺癌细胞株生成的异种移植物，在本实施例中，使用特征在于低水平的HER2表达的结肠直肠异种移植模型执行肿瘤消退研究。以5×106HT-55/200μl RPMI 1640及基质胶(1:1)/小鼠的浓度在各小鼠的右侧腹区域处对小鼠进行皮下接种以用于肿瘤发展。肿瘤细胞接种日期表示为第0天(D0)。
当肿瘤在D6时变得可触知(平均肿瘤体积(MTV)＝82mm3)时，以1×107PBMC/200μlRPMI 1640/小鼠静脉内植入PBMC。未向一组小鼠注射PBMC(“无hPBMC”组)且所述组小鼠与注射PBMC的小鼠同时经历剩余实验治疗。当平均肿瘤体积达到130mm3时(D10)，向“无hPBMC”小鼠组施用媒剂(稀释剂)(在图7C中为实心正方形)；且将注射PBMC的小鼠随机分为五个组且施用媒剂(稀释剂)(在图7C中为实心圆)、15nmol/Kg未经遮蔽双特异性体(在图7C中为实心三角形)、15nmol/Kg可裂解XTEN化双特异性体(在图7C中为三角形)、36nmol/Kg可裂解XTEN化双特异性体(在图7C中为六角形)及不可裂解XTEN化双特异性体(在图7A中为菱形)。
如图7C中所绘示，到研究结束时，可裂解XTEN化HER2-PAT(例如阐述于表D中)及未经遮蔽双特异性体(在15nmol/Kg及36nmol/Kg两者下)在与对照(具有或不具有hPBMC的媒剂)及不可裂解XTEN化双特异性对应物相比时展现显著的抗肿瘤功效。不可裂解XTEN化双特异性构建体不具有任何肿瘤生长抑制支持以下：在XTEN化HER2双特异性体上所观测到的抗肿瘤功效为由蛋白水解裂解驱动。
在额外体内实验中，表明与正常组织相比，HER2-XPAT(亦即，XTEN化或经遮蔽HER2-PAT)优先在肿瘤组织中未经遮蔽且伴随在肿瘤中见到显著较大的裂解。在NSG小鼠中建立BT-474肿瘤。向小鼠注射经IR染料位点特异性标记的HER2-XPAT。在2天时段之后，收取组织(肿瘤、脑、心脏及肝)，均质化，且评估BT-474的各种组织中未经遮蔽HER2-PAT的存在。此外，为了判定HER2-XPAT的裂解/未遮蔽是否体内发生在肿瘤中或其在已收取组织时是否为组织均质化的假影，在样本制备之前向样本外加以不同方式标记的HER2-XPAT。图7D表明与脑、心脏及肝组织中所见的裂解相比，HER2-XPAT优先于未经遮蔽PAT在肿瘤组织中裂解。此外，图7D亦展示，由于均质化或其他操作，与离体相反，裂解体内发生在组织中。另外，新鲜肿瘤样本中存在较强XPAT裂解证据。
实施例11a-11c表明，可裂解XTEN化HER2-PAT在表达低含量的HER2的肿瘤模型以及表征为具有高HER2表达的肿瘤中诱导稳健的肿瘤消退。因此，在经不可裂解XPAT治疗的测试受试者中未观测到肿瘤消退。此外，本文中呈现的数据展示，在肿瘤微环境中，HER2-XPAT优先体内未经遮蔽。实施例11a-11c的实验设计进一步论述于下文实施例17中。
实施例12.通过施用XTEN化XPAT而在受试者中诱导的淋巴球着边
此实施例说明通过施用XTEN化HER2-PAT(例如如表6中所阐述)，例如静脉内(IV)输注单次剂量(例如在10ml/kg的剂量体积下在25mg/kg下)在受试者(例如雌性猴及雄性猴)中诱导的淋巴球着边。
通过根据已确立方案稀释所关注的XPAT以满足剂量水平要求来制备测试物给药调配物。测试物(所关注的HER2-XPAT)及适当稀释剂为作为单次用等分试样提供且储存于设定成维持-80℃的冷冻器中直至使用。一旦解冻，则将等分试样储存于2℃-8℃下且不重新冷冻。在给药日制备给药调配物。在使用当天，将XPAT储备溶液及适当稀释剂的等分试样在室温下解冻且稀释适当量的测试物以获得适当浓度。通过轻柔地倒置试管若干次来混合给药调配物。选择IV暴露途径作为候选人类暴露途径。
如图8中所示，观测到在单次剂量(25mg/kg)之后包括淋巴球减少(紧接着概述于下表中)的血液学参数的HER2-XPAT相关变化为在给药后6小时开始(0.5-0.2×给药前含量)且在给药后24小时持续(0.27-0.1×给药前含量)及48小时持续(0.09-0.36×给药前含量)。在给药后72小时，淋巴球含量保持较低(0.3-0.1×剂量前含量)。
表14.血液学：与HER2-XPAT施用相关的淋巴球变化
实施例13.评估受试者的XTEN化PAT(XPAT)的毒性和药物动力学
评估食蟹猕猴中的XTEN化HER2-PAT(例如阐述于表D中)的毒性和药物动力学。经1小时向动物给药25mg/kg可裂解XTEN化HER2-PAT或对应的不可裂解XTEN化对应物。在给药前及输注结束后在5分钟、2小时、4小时、6小时、24小时、48小时、96小时、144小时、168小时及240小时收集血浆用血液。所有血液均在时间+/-2分钟时收集。分析血浆样本的可裂解及不可裂解XTEN化双特异性构建体的浓度。通过ECLIA(电化学发光免疫分析)，使用作为捕获物的重组HER2及用于检测的针对XTEN屏蔽的抗体来量测血浆药物浓度。如图9中所示，在食蟹猕猴中，HER2-XPAT(例如阐述于表D中)由于其在周边组织中的稳定性而展示类似于对应不可裂解型式的药物动力学概况。若非释放位点已经由GASTEP氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸和/或脯氨酸)制造的类似长度的不可裂解序列置换的事实，实验中所使用的不可裂解构建体与对应的可裂解构建体相同。亦监测两次独立剂量后循环中的蛋白水解代谢物的存在且以总HER2-XPAT的百分比形式示于图9B中。如图9B中所示，1×代谢物的存在小于总HER2-XPAT的4％。
实施例14.HER2-XPAT相对于HER2-PAT的XTEN遮蔽扩增安全边限
额外数据展示，与未经遮蔽PAT所见情况相比，HER2-XPAT在食蟹猕猴中具有良好耐受性且存在提供高450倍的耐受Cmax。IV、单次剂量/动物(2.5-42mpk的剂量)及以50mpk每周2次施用HER2-XPAT。*在21mpk及更高的剂量下，使用具有较短C端XTEN屏蔽的HER2-XPAT的变体。HER2-PAT由于其短半衰期而通过连续输注来施用。HER2-XPAT的血浆浓度为通过ECLIA*使用重组HER2捕获物及用于检测的针对XTEN屏蔽的抗体来量测。HER2 PAT的Cmax值为通过ECLIA，利用作为捕获物的针对a-CD3 scFv的a-受试者基因型Ab及作为检测物的重组HER2来测定。*ECLIA＝电化学发光免疫分析。图10A展示42mg/kg的最大耐受剂量，即使在50mg/kg下亦实际上未见到明显CRS。相反地，在图10B中，未经遮蔽HER2-PAT的最大耐受剂量为0.2mg/kg。图10C展示与未经遮蔽HER2-PAT相比经遮蔽HER2-PAT(在高450倍的耐受Cmax下)的血浆浓度。
在图13A-图13B中，存在支持本发明的优选HER2-XPAT的安全概况的额外证据。HER2-XPAT或其不可裂解对应物HER2-XPAT-不可裂解位点为以25或42mg/kg的单次IV剂量施用。剂量标准化血浆药物浓度为通过ECLIA*使用作为捕获物的重组HER2及用于检测的针对XTEN屏蔽的抗体来量测。*ECLIA＝电化学发光免疫分析。图12A中的数据展示HER2-XPAT与不可裂解HER2-PAT格式之间的相当PK，此表明即使在高剂量下，蛋白酶释放位点仍在食蟹猕猴循环中很大程度上稳定。在图12B中，在来自施用HER2-XPAT的食蟹猕猴的血浆中量测经单独裂解的HER2-XPAT(1X-C)及HER2-XPAT(1X-N)的浓度。使用辨识抗HER2 scFv的抗体，利用用重组型式的经单独裂解的分子制备的标准物执行西方定量。结果表示为如上文所描述如通过ECLIA所量测的总XTEN化物种百分比。图12B展示即使在高剂量HER2 XPAT下仍存在不具有一或两个XTEN屏蔽的代谢物的极有限全身性积聚。
实施例15.HER2-XPAT不诱发细胞因子释放综合征
与HER2-XPAT的耐受性一致，本发明实施例表明，在先导NHP毒理学研究中，HER2-XPAT使得NHP中循环中的T细胞活化最少，而其未经遮蔽对应物即使在低得多的剂量下亦引起显著的T细胞活化。与此T细胞活化的遮蔽一致，施用HER2-XPAT后的细胞因子释放相对于在其未经遮蔽对应物情况下所观测到的细胞因子释放而言亦稳健地减少。HER2-XPAT情况下不存在明显的细胞因子释放综合征(CRS)，即使在42mg/kg的MTD下，但其未经遮蔽TCE对应物在低至0.3mg/kg的剂量下导致因CRS所致的死亡。总体而言，AMX-818在NHP研究中在将显著高于预期临床上相关剂量的剂量下具有良好耐受性，且在诸如心脏的表达HER2的组织中不存在显而易见的发现或显微镜发现，其中其他经批准靶向HER2的药剂已展现临床毒性。
因此，即使在50mg/kg下，施用HER2-XPAT亦不诱导细胞因子释放或全身性T细胞活化。此支持以下：XPAT相对于标准TCE存在最低CRS风险。在来自施用高剂量HER2-XPAT(25及42mg/kg)的NHP的血浆中仅检测到1-3％经单独裂解的XPAT代谢物。对于此研究，在HER2-XPAT治疗后24小时通过流动式细胞测量术评估周边T细胞活化(CD25+％)。图11A及11B展示在存在HER2-XPAT相对于HER2-PAT的情况下的CD25+CD4+T细胞(图11A)及CD25+CD8+(图11B)T细胞。
用Luminex悬浮阵列系统对血浆样本执行细胞因子分析。图11C-11E展示响应于HER2-XPAT相对于HER2-PAT，血浆中的IL-6(图11C)、TNF-a(图11D)及IFN-g(图11E)含量。所呈现的数据为在各评估剂量下6-24小时之间的最大量测值。在额外GLP毒理学研究(资料未示出)中，经31天时段以3次剂量(0.5mg/kg、2mg/kg及6mg/kg)每周向NHP给与AMX-818。这些GLP毒理学研究的结果与先前前导NHP研究一致，且基于包括组织病理学检查的标准毒理学终点，不存在AMX-818相关不良发现，且所有临床病理学发现皆为可逆的。
亦与高达42mg/kg的AMX-818在NHP中的安全性一致，AMX-818在蛋白酶抑制剂充足的循环中很大程度上稳定，如通过活性代谢物的有限全身积聚所证明。因为向健康NHP给药且待经AMX-818治疗的受试者亦可能患有全身性发炎，因此AMX-818的稳定性为在获自患有癌症及发炎性疾病的患者的血浆样本以及吾等诱发全身性发炎的NHP中离体分析。如图12中所示，在稳定性研究中在来自健康NHP、发炎NHP、健康人类及患有癌症或发炎性疾病的人类患者的血浆样本中观测到类似AMX-818稳定性，在所述研究中吾等将AMX-818与血浆样本一起在37℃下培育七天。
对于此实验，将具有连接至串联scFv的荧光标记(DyL650)的AMX-818在37℃下在指定血浆样本中培育七天。随后，在凝胶上运作样本且使用LI-COR检测器定量尺寸上类似于AMX-818的未经遮蔽活性形式的代谢物。发炎性疾病人类样本来源于患有类风湿性关节炎、狼疮、发炎性肠病及多发性硬化症的患者。癌症人类样本来源于患有肺肿瘤、乳肿瘤及结肠肿瘤的患者。样本尺寸：健康NHP N＝4，健康人类N＝4，“发炎”NHP N＝6，“发炎”人类N＝27，癌症人类N＝11。
在所有四个血浆组中，尺寸上类似于活性未经遮蔽HER2 TCE的产物范围仅为所存在的总AMX-818物种的大致2％至4％。此小百分比反映未经遮蔽TCE体内潜在积聚的过度估计，这是因为肾过滤将自循环快速消除所述产物(NHP中的未经遮蔽形式的半衰期为大致七小时)。这些数据表明，AMX-818的活性未经遮蔽形式在癌症患者中显著全身积聚的风险是有限的。
实施例16.响应于SKOV3肿瘤细胞，AMX-818及818-PAT在T细胞上诱导PD-1和CD69表面表达
在以5:1效应物:目标比率将PBMC及SKOV3细胞与指定浓度的测试物共培育48小时之后通过流动式细胞测量术评估CD4+T细胞及CD8+T细胞上的表面PD-1表达。在CD4 T细胞及CD8 T细胞子集上，818-PAT及AMX-818使表达表面PD-1的T细胞的频率增加，其中AMX-818曲线相对于818-PAT偏移大致2.5个对数，此表明前驱药相对于其经活化对应物而言有明显遮蔽。在625pM浓度下达成AMX-818(PAT)对T细胞的最大活化，而在150-600nM浓度下达成AMX-818的最大活化。
比较在指定药物浓度下CD4 T细胞及CD8 T细胞上的PD-1的表面含量的直方图示于图14A-14D中。
AMX-818(PAT)及前驱药AMX-818在CD4+T细胞及CD8+T细胞子集的表面上诱导的CD69及PD-1表达程度为相当的。然而，AMX-818的剂量-反应曲线相对于经活化AMX-818(PAT)的剂量-反应曲线平均偏移高于>400倍，此表明AMX-818的有效功能性遮蔽(图14A和图14C中针对CD8 T细胞所示的资料)。在0.62nM浓度下观测到AMX-818(PAT)对活化标记物CD69及抑制性受体PD-1的最大上调，而AMX-818的相当诱导要求150-600nM浓度(图14B及14D)。
AMX-818(PAT)亦强效诱导PD-L1于SKOV3肿瘤细胞上的表面表达，其中EC50值为19.7pM，而XTEN化AMX-818在诱导相当频率及含量的PD-L1中效力低于650倍(参见图15A-15C)。在未来临床研究中，预期AMX-818在T细胞上对PD-1的诱导及在目标肿瘤细胞上对PD-L1的诱导减弱其活性且为PD-1阻断疗法与AMX-818组合提供基本原理。
AMX-818(PAT)及AMX-818在人类CD4+T细胞及CD8+T细胞子集内诱导PD-1达到相当含量及最大百分比。然而，AMX-818的效力比AMX-818(PAT)的效力平均低>400倍。AMX-818(PAT)强效诱导PD-L1于高度表达HER2的SKOV3肿瘤细胞上的表面表达，其中EC50值为19.7pM，而AMX-818的相当诱导的效力低>650倍。预期AMX-818在T细胞上对PD-1的诱导及在目标肿瘤细胞上对PD-L1的诱导减弱其活性且为PD-1阻断疗法与AMX-818组合提供基本原理。
实施例17.在植入活小鼠中的人类肿瘤中XPAT对于TCE而言未经遮蔽，其中在健康组织中观测到最少裂解。
本发明实施例概述本发明的HER2-XPAT的强效体内功效。为了评估抗肿瘤活性，向免疫功能不全小鼠注射表达所关注目标的肿瘤细胞。当肿瘤足够大且经充分建立(超过100mm3)时，注射人类PBMC且开始静脉内给药HER2-XPAT及各种对照分子。这些研究展示，靶向HER2的XPAT驱动肿瘤消退及许多完全反应。不具有蛋白酶可裂解接头的AMX-818变体不具有活性，此指示接头的蛋白酶裂解驱动活性。
此外，HER2-XPAT体内扩增安全边限。HER2在健康组织中具有相对有限的表达。当向NHP注射HER2-XPAT以及其未经遮蔽TCE对应物时，且评估耐受性以确定各分子的最大耐受剂量。XPAT上的XTEN屏蔽显著提高TCE的耐受性，使得相对于在未经遮蔽HER2 TCE的情况下观测到的Cmax而言能够在MTD下有高超过400倍的Cmax。为了证明蛋白酶可裂解接头可在宽范围的人类肿瘤中裂解，在新鲜人类肿瘤样本以及患者源及异种移植肿瘤中分析XPAT裂解。在新鲜人类肿瘤外植体中，XPAT诱导自肿瘤驻存T细胞进行的蛋白酶可裂解接头依赖性细胞因子释放，此类似于由直接活化T细胞的阳性对照(抗CD3抗体)诱导的细胞因子释放。
为了定量肿瘤中出现的XPAT的优先未遮蔽程度，评估活小鼠中的XPAT裂解。将荧光团标记的XPAT注射至小鼠中，且两天后收取肿瘤及健康组织以量测XPAT及裂解产物的含量。为了特定定量在活小鼠中发生的裂解及收取组织之后发生的任何裂解的对照，吾等亦分析在组织加工期间添加的对照XPAT的裂解。在31只具有九种不同肿瘤类型的小鼠中，活小鼠的肿瘤中平均20％XPAT裂解成未经遮蔽TCE形式，而在健康组织中观测到XPAT的最少裂解。对照XPAT存在有限裂解至不存在裂解的论证证实，所注射XPAT的裂解并非在组织加工期间发生于活小鼠中。研究设计及资料示于图16A-C中。
虽然本文已展示且描述本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是所述实施方案仅借助于实施例来提供。预期本发明不受本说明书中所提供的具体实施例的限制。尽管已参考前述说明书描述本发明，但本文实施方案的描述及说明并不意欲以限制性意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变及取代。此外，应理解，本发明的所有方面皆不限于本文所阐述的视各种条件及变量而定的具体描绘、构型或相对比例。应理解，本文所描述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实践本发明。因此，经考虑，本发明亦应涵盖任何所述替代方案、修改、变化或等效方案。预期以下权利要求书界定本发明的范畴，且由此覆盖在这些权利要求书及其等效物的范畴内的方法及结构。

Claims (142)

1.一种具有N端氨基酸和C端氨基酸的多肽，所述多肽包含：
(a)扩展型重组多肽(XTEN)，其包含：
在蛋白酶消化后可自所述多肽释放的条形码片段(BAR)；
(b)双特异性抗体构建体(BsAb)，其包含：
特异性结合至分化簇3T细胞受体(CD3)的第一抗原结合片段(AF1)，所述AF1包含轻链互补决定区1(CDR-L1)、2(CDR-L2)和3(CDR-L3)以及重链互补决定区1(CDR-H1)、2(CDR-H2)和3(CDR-H3)，其中所述CDR-H3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；及
特异性结合至人类表皮生长因子受体2(HER2)的第二抗原结合片段(AF2)；及
(c)位于所述XTEN与所述双特异性抗体构建体之间的释放区段(RS)，
其中所述XTEN的特征在于：
(i)其包含至少100个或至少150个氨基酸；
(ii)其氨基酸残基的至少90％在本文中通过甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)加以标识；
(iii)其包含至少4种不同类型的在本文中通过G、A、S、T、E或P加以标识的氨基酸；及
(iv)所述XTEN由长度各自为9至14个氨基酸的复数个非重叠序列模体形成，其中所述复数个非重叠序列模体包含：
(1)一组非重叠序列模体，其中所述组非重叠序列模体中的各非重叠序列模体在所述XTEN中重复至少两次；及
(2)非重叠序列模体，其在所述XTEN内仅出现一次；
其中所述条形码片段(BAR)包括在所述XTEN内仅出现一次的所述非重叠序列模体的至少一部分；
其中所述条形码片段(BAR)与在所述蛋白酶完全消化所述多肽后可自所述多肽释放的所有其他肽片段的不同之处在于序列和分子量；且
其中所述条形码片段(BAR)不包括所述多肽的所述N端氨基酸或所述C端氨基酸。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述组非重叠序列模体各自独立地在本文中通过SEQ ID NO:179-200和1715-1722加以标识。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述组非重叠序列模体各自独立地在本文中通过SEQ ID NO:186-189加以标识。
4.根据权利要求3所述的多肽，其中所述组非重叠序列模体包含所述序列模体SEQIDNO:186-189中的至少两个、至少三个或全部四个。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述XTEN包含100至3,000个、150至3,000个、100至1,000个或150至1,000个氨基酸残基的长度。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述XTEN包含至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或至少500个氨基酸残基的长度。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述XTEN的所述氨基酸残基的至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中所述XTEN与表3a中所阐述的序列具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的多肽，其中所述条形码片段(BAR)不包括紧邻所述XTEN中的另一谷氨酸(若存在)的谷氨酸。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的多肽，其中所述条形码片段(BAR)在其C端处具有谷氨酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的多肽，其中所述条形码片段(BAR)具有紧随谷氨酸残基之后的N端氨基酸。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的多肽，其中所述条形码片段(BAR)与所述多肽的所述N端或所述多肽的所述C端相距一定距离定位，其中所述距离为10至150个氨基酸或10至125个氨基酸长度。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的多肽，其中所述条形码片段(BAR)的特征在于：
(i)其不包括紧邻所述XTEN中的另一谷氨酸(若存在)的谷氨酸；
(ii)其在其C端处具有谷氨酸；
(iii)其具有紧随谷氨酸残基之后的N端氨基酸；及
(iv)其与所述多肽的所述N端或所述多肽的所述C端相距一定距离定位，其中所述距离为10至150个氨基酸或10至125个氨基酸长度。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的多肽，其中在所述条形码片段(BAR)的所述N端氨基酸之前的所述谷氨酸残基不紧邻另一谷氨酸残基。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的多肽，其中所述条形码片段(BAR)在除所述条形码片段的所述C端以外的位置处不包括第二谷氨酸残基，除非所述第二谷氨酸之后紧随脯氨酸。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的多肽，其中所述XTEN位于所述双特异性抗体构建体(BsAb)的N端，且其中所述条形码片段(BAR)位于所述多肽的所述N端200个、150个、100个或50个氨基酸内。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的多肽，其中所述XTEN位于所述双特异性抗体构建体(BsAb)的N端，且其中所述条形码片段(BAR1)位于距所述蛋白质的所述N端10个与200个之间、30个与200个之间、40个与150个之间或50个与100个之间的氨基酸的位置处。
18.根据权利要求1至15中任一项所述的多肽，其中所述XTEN位于所述双特异性抗体构建体(BsAb)的C端，且其中所述条形码片段(BAR)位于所述多肽的所述C端200个、150个、100个或50个氨基酸内。
19.根据权利要求1至15和18中任一项所述的多肽，其中所述XTEN位于所述双特异性抗体构建体(BsAb)的C端，且所述条形码片段(BAR)位于距所述蛋白质的所述C端10个与200个之间、30个与200个之间、40个与150个之间或50个与100个之间的氨基酸的位置处。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的多肽，其中所述条形码片段(BAR)长度为至少4个氨基酸。
21.根据权利要求20所述的多肽，其中所述条形码片段(BAR)长度为在4个与20个之间、在5个与15个之间、在6个与12个之间或在7个与10个之间的氨基酸。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的多肽，其中所述条形码片段(BAR)包含表2中所阐述的氨基酸序列。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的多肽，其中所述XTEN的长度为由近端和远端界定，其中(1)所述近端为相对于所述远端、更接近所述双特异性抗体构建体(BsAb)定位，且其中(2)所述条形码片段(BAR)位于如自所述远端开始量测在所述XTEN的所述长度的5％与50％之间、7％与40％之间或10％与30％之间延伸的所述XTEN的区域内。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的多肽，其中所述XTEN进一步包含额外的一个或多个条形码片段，其中所述额外的一个或多个条形码片段各自与在所述蛋白酶完全消化所述多肽之后可自所述多肽释放的所有其他肽片段的不同之处在于序列和分子量。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的多肽，其中所述释放区段(RS)包含与在本文中通过SEQ ID NO:7001-7626加以标识的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的多肽，其中所述蛋白酶在后面不跟随脯氨酸的谷氨酸残基的C端侧上裂解。
27.根据权利要求26所述的多肽，其中所述蛋白酶为Glu-C蛋白酶。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的多肽，其表达为融合蛋白，其中呈未裂解状态的所述融合蛋白自N端至C端具有在本文中通过AF1-AF2-RS-XTEN、AF2-AF1-RS-XTEN、XTEN-RS-AF1-AF2或XTEN-RS-AF2-AF1加以标识的结构布置。
29.根据权利要求1至28所述的多肽，其中所述释放区段(RS)通过间隔子与所述双特异性抗体构建体(BsAb)融合。
30.根据权利要求29所述的多肽，其中所述间隔子包含至少4种类型的氨基酸，所述氨基酸为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)。
31.根据权利要求29所述的多肽，其中所述间隔子包含与表C中所阐述的序列具有至少80％、90％或100％序列一致性的氨基酸序列。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)的所述CDR-H1和所述CDR-H2分别包含SEQ ID NO:8和9的氨基酸序列。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的多肽，其中：
所述AF1的所述CDR-L1包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列；
所述AF1的所述CDR-L2包含SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列；且
所述AF1的所述CDR-L3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
34.根据权利要求1至32中任一项所述的多肽，其中：
所述AF1的所述CDR-L1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
所述AF1的所述CDR-L2包含SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列；且
所述AF1的所述CDR-L3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
35.根据权利要求1至32中任一项所述的多肽，其中：
所述AF1的所述CDR-L1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
所述AF1的所述CDR-L2包含SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列；且
所述AF1的所述CDR-L3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
36.根据权利要求1至32中任一项所述的多肽，其中：
所述AF1的所述CDR-L1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
所述AF1的所述CDR-L2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；且
所述AF1的所述CDR-L3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
37.根据权利要求1至32中任一项所述的多肽，其中：
所述AF1的所述CDR-L1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
所述AF1的所述CDR-L2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；且
所述AF1的所述CDR-L3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)包含四个链可变域构架区1(FR-H1)、2(FR-H2)、3(FR-H3)和4(FR-H4)，所述构架区各自分别与SEQ ID NO:60、64、65和67的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致。
39.根据权利要求1至37中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)包含四个链可变域构架区1(FR-H1)、2(FR-H2)、3(FR-H3)和4(FR-H4)，所述构架区各自分别与SEQ ID NO:61、64、65和67的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段进一步包含四个轻链可变域构架区(FR-L)：FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，所述构架区各自分别与SEQID NO:51、52、53和59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致。
41.根据权利要求1至39中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段进一步包含四个轻链可变域构架区(FR-L)：FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，所述构架区各自分别与SEQID NO:51、52、54和59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致。
42.根据权利要求1至39中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段进一步包含四个轻链可变域构架区(FR-L)：FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，所述构架区各自分别与SEQID NO:51、52、55和59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致。
43.根据权利要求1至39中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段进一步包含四个轻链可变域构架区(FR-L)：FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，所述构架区各自分别与SEQID NO:51、52、56和59的氨基酸序列展现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致。
44.根据权利要求1至39中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)进一步包含轻链构架区1(FR-L1)、2(FR-L2)、3(FR-L3)和4(FR-L4)以及重链构架区1(FR-H1)、2(FR-H2)、3(FR-H3)和4(FR-H4)，其中：
所述FR-L1包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；
所述FR-L2包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；
所述FR-L3包含SEQ ID NO:53、54、55或56的氨基酸序列；
所述FR-L4包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；
所述FR-H1包含SEQ ID NO:60或61的氨基酸序列；
所述FR-H2包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；
所述FR-H3包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；且
所述FR-H4包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
45.根据权利要求1至39中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)进一步包含轻链构架区1(FR-L1)、2(FR-L2)、3(FR-L3)和4(FR-L4)以及重链构架区1(FR-H1)、2(FR-H2)、3(FR-H3)和4(FR-H4)，其中：
所述FR-L1包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；
所述FR-L2包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；
所述FR-L3包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；
所述FR-L4包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；
所述FR-H1包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；
所述FR-H2包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；
所述FR-H3包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；且
所述FR-H4包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
46.根据权利要求1至39中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)进一步包含轻链构架区1(FR-L1)、2(FR-L2)、3(FR-L3)和4(FR-L4)以及重链构架区1(FR-H1)、2(FR-H2)、3(FR-H3)和4(FR-H4)，其中：
所述FR-L1包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；
所述FR-L2包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；
所述FR-L3包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；
所述FR-L4包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；
所述FR-H1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；
所述FR-H2包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；
所述FR-H3包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；且
所述FR-H4包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
47.根据权利要求1至39中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)进一步包含轻链构架区1(FR-L1)、2(FR-L2)、3(FR-L3)和4(FR-L4)以及重链构架区1(FR-H1)、2(FR-H2)、3(FR-H3)和4(FR-H4)，其中：
所述FR-L1包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；
所述FR-L2包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；
所述FR-L3包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；
所述FR-L4包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；
所述FR-H1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；
所述FR-H2包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；
所述FR-H3包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；且
所述FR-H4包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
48.根据权利要求1至39中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)进一步包含轻链构架区1(FR-L1)、2(FR-L2)、3(FR-L3)和4(FR-L4)以及重链构架区1(FR-H1)、2(FR-H2)、3(FR-H3)和4(FR-H4)，其中：
所述FR-L1包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；
所述FR-L2包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；
所述FR-L3包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；
所述FR-L4包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；
所述FR-H1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；
所述FR-H2包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；
所述FR-H3包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；且
所述FR-H4包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)展现比由SEQ ID NO:206中所阐述的序列组成的抗CD3结合片段高的热稳定性，如在体外分析中通过以下所证明：
所述第一抗原结合片段的熔融温度(Tm)相对于所述抗CD3结合片段的熔融温度(Tm)而言较高；或
在将所述第一抗原结合片段并入测试双特异性抗原结合构建体中之后，所述测试双特异性抗原结合构建体的Tm相对于对照双特异性抗原结合构建体的Tm而言较高，其中所述测试双特异性抗原结合构建体包含所述第一抗原结合片段和结合至除CD3以外的抗原的参考抗原结合片段；且其中所述对照双特异性抗原结合构建体由所述抗CD3结合片段和所述参考抗原结合片段组成，所述抗CD3结合片段由所述SEQ ID NO:206的序列组成。
50.根据权利要求49所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段的Tm比由所述SEQ IDNO:206的序列组成的所述抗CD3结合片段的Tm高至少2℃或至少3℃或至少4℃或至少5℃。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)包含重链可变区(VHI)，其中所述VHI包含与SEQ ID NO:102或105的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的氨基酸序列。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)包含轻链可变区(VLI)，其中所述VLI包含与SEQ ID NO:101、103、104、106或107中任一者的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的氨基酸序列。
53.根据权利要求51或52所述的多肽，其中所述VHI和所述VLI为通过接头连接，所述接头包含与表A中所阐述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)包含与SEQ ID NO:201-205中任一者的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％序列一致性或与所述氨基酸序列一致的氨基酸序列。
55.根据权利要求1至53中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)特异性结合人类或食蟹猕猴(cyno)CD3。
56.根据权利要求55所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)特异性结合人类CD3。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)结合在本文中通过CD3的CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ单元加以标识的CD3复合物亚单元。
58.根据权利要求57所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)结合CD3的CD3ε片段。
59.根据权利要求1至58中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)展现小于或等于6.6的等电点(pI)。
60.根据权利要求59所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)展现在6.0与6.6之间包括端值在内的等电点(pI)。
61.根据权利要求1至60中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)展现比参考抗原结合片段的等电点(pI)低至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0个pH单位的pI，所述参考抗原结合片段由SEQ ID NO:206中所示的序列组成。
62.根据权利要求1至61中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)以在约在约10nM与约400nM之间之间的解离常数(Kd)常数特异性结合人类或cyno CD3，如在包含人类或cyno CD3抗原的体外抗原结合分析中所测定。
63.根据权利要求1至62中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)以小于约10nM、或小于约50nM、或小于约100nM、或小于约150nM、或小于约200nM、或小于约250nM、或小于约300nM、或小于约350nM、或小于约400nM的解离常数(Kd)特异性结合人类或cyno CD3，如在体外抗原结合分析中所测定。
64.根据权利要求1至63中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)展现相对于由SEQ ID NO:206的氨基酸序列组成的抗原结合片段的针对CD3的结合亲和力而言弱至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或至少10倍的针对CD3的结合亲和力，如通过在体外抗原结合分析中的相应解离常数(Kd)所测定。
65.根据权利要求1至64中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)为嵌合或人源化抗原结合片段。
66.根据权利要求1至65中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段(AF1)为Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、线性抗体或单链可变片段(scFv)。
67.根据权利要求1至66中任一项所述的多肽，其中所述第二抗原结合片段(AF2)为Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、线性抗体、单域抗体或单链可变片段(scFv)。
68.根据权利要求1至66中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段经构型为(Fab')2或单链双特异性抗体。
69.根据权利要求1至68中任一项所述的多肽，其中所述第二抗原结合片段(AF2)包含：
重链可变区(VHII)，其包含在本文中通过SEQ ID NO:778-783加以标识的氨基酸序列；及
轻链可变区(VLII)，其包含在本文中通过SEQ ID NO:878-883加以标识的氨基酸序列。
70.根据权利要求69所述的多肽，其中所述VHII和所述VLII为通过接头连接，所述接头包含与表A中所阐述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。
71.根据权利要求1至70中任一项所述的多肽，其中所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段为通过肽接头融合在一起。
72.根据权利要求70所述的多肽，其中所述肽接头包含2种或3种类型的氨基酸，所述氨基酸为甘氨酸、丝氨酸或脯氨酸。
73.根据权利要求70或72所述的多肽，其中所述肽接头包含与表B中所阐述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。
74.根据权利要求1至73中任一项所述的多肽，其中：
所述XTEN为第一扩展型重组多肽(XTEN1)；
形成所述XTEN1的所述复数个非重叠序列模体为第一复数个非重叠序列模体；
所述BAR为第一条形码片段(BAR1)；且
所述RS为第一释放区段(RS1)；且
所述多肽进一步包含：
(d)第二扩展型重组多肽(XTEN2)，其包含：
在所述蛋白酶消化后可自所述多肽释放的第二条形码片段(BAR2)；及
(e)第二释放区段(RS2)，其位于所述第二XTEN(XTEN2)与所述双特异性抗体构建体(BsAb)之间，
其中所述XTEN2的特征在于：
(i)其包含至少100个或至少150个氨基酸；
(ii)其氨基酸残基的至少90％为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)；及
(iii)其包含至少4种不同类型的氨基酸，所述氨基酸为G、A、S、T、E或P；
其中所述第二条形码片段(BAR2)与在所述蛋白酶完全消化所述多肽后可自所述多肽释放的所有其他肽片段的不同之处在于序列和分子量；且
其中所述第二条形码片段(BAR2)不包括所述多肽的所述N端氨基酸或所述C端氨基酸。
75.根据权利要求74所述的多肽，其中所述XTEN1位于所述双特异性抗体构建体的N端，且所述XTEN2位于所述双特异性抗体构建体的C端。
76.根据权利要求74所述的多肽，其中所述XTEN1位于所述双特异性抗体构建体的C端，且所述XTEN2位于所述双特异性抗体构建体的N端。
77.根据权利要求74至76中任一项所述的多肽，其中：
(iv)所述XTEN2由第二复数个非重叠序列模体形成，所述第二复数个非重叠序列模体的长度各自为9至14个氨基酸，其中所述第二复数个非重叠序列模体包含：
(1)第二组非重叠序列模体，其中所述第二组非重叠序列模体中的各非重叠序列模体在所述第二XTEN中重复至少两次；及
(2)非重叠序列模体，其在所述第二XTEN内仅出现一次；且
其中所述第二条形码片段(BAR2)包括在所述第二XTEN内仅出现一次的所述非重叠序列模体的至少一部分。
78.根据权利要求77所述的多肽，其中所述第二组非重叠序列模体各自独立地在本文中通过SEQ ID NO:179-200和1715-1722加以标识。
79.根据权利要求78所述的多肽，其中所述第二组非重叠序列模体各自独立地在本文中通过SEQ ID NO:186-189加以标识。
80.根据权利要求79所述的多肽，其中所述第二组非重叠序列模体包含所述序列模体SEQ ID NO:186-189中的至少两个、至少三个或全部四个。
81.根据权利要求74至80中任一项所述的多肽，其中所述XTEN2包含100至3,000、150至3,000、100至1,000或150至1,000个氨基酸残基的长度。
82.根据权利要求74至81中任一项所述的多肽，其中所述XTEN2包含至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个或至少500个氨基酸残基的长度。
83.根据权利要求74至82中任一项所述的多肽，其中所述XTEN2的所述氨基酸残基的至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)。
84.根据权利要求74至83中任一项所述的多肽，其中所述XTEN2与表3a中所阐述的序列具有至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
85.根据权利要求74至84中任一项所述的多肽，其中所述第二条形码片段(BAR2)不包括紧邻所述XTEN2中的另一谷氨酸(若存在)的谷氨酸。
86.根据权利要求74至85中任一项所述的多肽，其中所述第二条形码片段(BAR2)在其C端处具有谷氨酸。
87.根据权利要求74至86中任一项所述的多肽，其中所述第二条形码片段(BAR2)具有紧随谷氨酸残基之后的N端氨基酸。
88.根据权利要求74至87中任一项所述的多肽，其中所述第二条形码片段(BAR2)与所述多肽的所述N端或所述多肽的所述C端相距一定距离定位，其中所述距离为10至150个氨基酸或10至125个氨基酸长度。
89.根据权利要求74至88中任一项所述的多肽，其中所述第二条形码片段(BAR2)的特征在于：
(i)其不包括紧邻所述XTEN2中的另一谷氨酸(若存在)的谷氨酸；
(ii)其在其C端处具有谷氨酸；
(iii)其具有紧随谷氨酸残基之后的N端氨基酸；及
(iv)其与所述多肽的所述N端或所述多肽的所述C端相距一定距离定位，其中所述距离为10至150个氨基酸或10至125个氨基酸长度。
90.根据权利要求87至89中任一项所述的多肽，其中在所述BAR2的所述N端氨基酸之前的所述谷氨酸残基不紧邻另一谷氨酸残基。
91.根据权利要求74至90中任一项所述的多肽，其中所述第二条形码片段(BAR2)在除所述第二条形码片段(BAR2)的所述C端以外的位置处不包括第二谷氨酸残基，除非所述第二谷氨酸之后紧随脯氨酸。
92.根据权利要求74至91中任一项所述的多肽，其中所述XTEN2位于所述双特异性抗体构建体(BsAb)的N端，且其中所述第二条形码片段(BAR2)位于所述多肽的所述N端200个、150个、100个或50个氨基酸内。
93.根据权利要求74至92中任一项所述的多肽，其中所述XTEN2位于所述双特异性抗体构建体(BsAb)的N端，且其中所述第二条形码片段(BAR2)位于距所述蛋白质的所述N端10个与200个之间、30个与200个之间、40个与150个之间或50个与100个之间的氨基酸的位置处。
94.根据权利要求74至93中任一项所述的多肽，其中所述XTEN2位于所述双特异性抗体构建体(BsAb)的C端，且其中所述第二条形码片段(BAR2)位于所述多肽的所述C端200个、150个、100个或50个氨基酸内。
95.根据权利要求74至94中任一项所述的多肽，其中所述XTEN2位于所述双特异性抗体构建体(BsAb)的C端，且所述第二条形码片段(BAR2)位于距所述蛋白质的所述C端10个与200个之间、30个与200个之间、40个与150个之间或50个与100个之间的氨基酸的位置处。
96.根据权利要求74至95中任一项所述的多肽，其中所述第二条形码片段(BAR2)的长度为至少4个氨基酸。
97.根据权利要求96所述的多肽，其中所述第二条形码片段(BAR2)的长度为在4个与20个之间、在5个与15个之间、在6个与12个之间或在7个与10个之间的氨基酸。
98.根据权利要求74至97中任一项所述的多肽，其中所述第二条形码片段(BAR2)包含表2中所阐述的氨基酸序列。
99.根据权利要求74至98中任一项所述的多肽，其中所述XTEN2的长度为由近端和远端界定，其中(1)所述XTEN2的所述近端为相对于所述远端、更接近所述双特异性抗体构建体(BsAb)定位，且其中(2)所述第二条形码片段(BAR2)位于如自所述XTEN2的所述远端开始量测在所述XTEN2的所述长度的5％与50％之间、7％与40％之间或10％与30％之间延伸的所述XTEN2的区域内。
100.根据权利要求74至99中任一项所述的多肽，其中所述XTEN2进一步包含额外的一个或多个条形码片段，其中所述XTEN2的所述额外的一个或多个条形码片段各自与在所述蛋白酶完全消化所述多肽之后可自所述多肽释放的所有其他肽片段的不同之处在于序列和分子量。
101.根据权利要求74至100中任一项所述的多肽，其中所述第一释放区段(RS1)与所述第二释放区段(RS2)的序列相同。
102.根据权利要求74至100中任一项所述的多肽，其中所述第一释放区段(RS1)与所述第二释放区段(RS2)的序列不相同。
103.根据权利要求74至102中任一项所述的多肽，其中所述第二释放区段(RS2)包含与在本文中通过SEQ ID NO:7001-7626加以标识的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。
104.根据权利要求74至103中任一项所述的多肽，其中所述第一释放区段(RS1)和所述第二释放区段(RS2)各自为用于在各释放区段序列内的一个、两个或三个裂解位点处由多种蛋白酶裂解的底物。
105.根据权利要求74至104中任一项所述的多肽，其表达为融合蛋白，其中呈未裂解状态的所述融合蛋白自N端至C端具有在本文中通过XTEN1-RS1-AF1-AF2-RS2-XTEN2、XTEN1-RS1-AF2-AF1-RS2-XTEN2、XTEN2-RS2-AF1-AF2-RS1-XTEN1、XTEN2-RS2-AF2-AF1-RS1-XTEN1、XTEN1-RS1-双特异性抗体-RS2-XTEN2或XTEN2-RS2-双特异性抗体-RS1-XTEN1加以标识的结构布置，其中
所述双特异性抗体包含所述AF1的轻链可变区(VLI)、所述AF1的重链可变区(VHI)、所述AF2的轻链可变区(VLII)和所述AF2的重链可变区(VHII)。
106.根据权利要求74至105所述的多肽，其中所述第一释放区段(RS1)的所述间隔子为第一间隔子，且其中所述第二释放区段(RS2)为通过第二间隔子与所述双特异性抗体构建体(BsAb)融合。
107.根据权利要求106所述的多肽，其中所述第二间隔子包含至少4种类型的氨基酸，所述氨基酸为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)。
108.根据权利要求106所述的多肽，其中所述第二间隔子包含与表C中所阐述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。
109.根据权利要求74所述的多肽，其中：
(a)所述XTEN1包含与表3a中所阐述的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列；
(b)所述BsAb包含：
(I)所述AF1，其包含轻链互补决定区1(CDR-L1)、2(CDR-L2)和3(CDR-L3)以及重链互补决定区1(CDR-H1)、2(CDR-H2)和3(CDR-H3)，其中所述CDR-H1、所述CDR-H2和所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:8、9和10的氨基酸序列；及
(II)所述AF2，其包含在本文中通过SEQ ID NO:778-783加以标识的轻链可变区(VLII)和在本文中通过SEQ ID NO:878-883加以标识的重链可变区(VHII)；
(c)所述RS1包含与在本文中通过SEQ ID NO:7001-7626加以标识的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列；
(d)所述XTEN2包含与表3a中所阐述的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列；及
(e)所述RS2包含与在本文中通过SEQ ID NOS:7001-7626加以标识的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列,
其中所述多肽自N端至C端具有在本文中通过以下加以标识的结构布置：XTEN1-RS1-AF2-AF1-RS2-XTEN2、XTEN1-RS1-AF1-AF2-RS2-XTEN2、XTEN2-RS2-AF2-AF1-RS1-XTEN1或XTEN2-RS2-AF1-AF2-RS1-XTEN1。
110.根据权利要求1至109中任一项所述的多肽，其中所述多肽的终末半衰期与未连接至任何XTEN的所述双特异性抗体构建体的终末半衰期相比长至少两倍。
111.根据权利要求1至110中任一项所述的多肽，其中如通过量测在向受试者施用相当剂量之后选择性结合至所述双特异性抗体构建体的IgG抗体的生产所确定，所述多肽的免疫原性与未连接至任何XTEN的所述双特异性抗体构建体的免疫原性相比较低。
112.根据权利要求1至111中任一项所述的多肽，其中所述多肽在生理条件下展现大于约3、大于约4、大于约5或大于约6的表观分子量因子。
113.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含与表D中所阐述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。
114.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至113中任一项所述的多肽和一种或多种药学上适合的赋形剂。
115.根据权利要求114所述的药物组合物，其中所述药物组合物经调配用于皮内、皮下、经口、静脉内、动脉内、腹内、腹膜内、鞘内或肌内施用。
116.根据权利要求114或115所述的药物组合物，其中所述药物组合物呈液体形式或经冷冻。
117.根据权利要求114至116中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物为在用于单次注射的预填充注射器中。
118.根据权利要求117所述的药物组合物，其中所述药物组合物经调配为欲在施用之前复原的冻干粉末。
119.根据权利要求114所述的药物组合物，其中所述组合物、至少一种额外治疗剂组成药物组合，所述至少一种额外治疗剂选自由以下组成的群：抗体、抗体片段、抗体结合物、细胞毒性剂、毒素、放射性核素、免疫调节剂、光敏性治疗剂、辐射敏化剂、激素、抗血管生成剂及其组合。
120.根据权利要求119所述的药物组合物，其中所述额外治疗剂为PD-1/PD-L1(2)抑制剂。
121.根据权利要求120所述的药物组合，其中所述PD-1/PD-L1(2)抑制剂为抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体。
122.根据权利要求121所述的药物组合，其中所述PD-1/PD-L1(2)抑制剂为选自包含以下的群的抗PD-1抗体：纳武单抗(nivolumab)(欧狄沃(Opdivo)，BMS-936558，MDX1106)、派姆单抗(pembrolizumab)(可瑞达(Keytruda)，MK-3475，兰利珠单抗(lambrolizumab))、皮立珠单抗(pidilizumab)(CT-011)、PDR-001、JS001、STI-A1110、AMP-224及AMP-514(MEDI0680)。
123.根据权利要求121所述的药物组合，其中所述PD-1/PD-L1(2)抑制剂为选自包含以下的群的抗PD-L1抗体：阿特珠单抗(atezolizumab)(泰圣奇(Tecentriq)，MPDL3280A)、德瓦鲁单抗(durvalumab)(MEDI4736)、阿维鲁单抗(avelumab)(MSB0010718C)、BMS-936559(MDX1105)及LY3300054。
124.根据权利要求121所述的药物组合，其中所述PD-1/PD-L1(2)抑制剂为抗PD-L2抗体。
125.根据权利要求119所述的药物组合，其中所述组合为含有彼此独立的组分的组合包。
126.根据权利要求119所述的药物组合，其中所述组分以独立剂型同时或依序施用以用于治疗相同疾病。
127.根据权利要求119所述的药物组合，其用作用于治疗过度增生性障碍的药剂。
128.根据权利要求127所述的药物组合，其中所述过度增生性障碍选自由以下组成的群：乳腺癌、呼吸道癌、脑癌、生殖器官癌、消化道癌、尿道癌、眼癌、肝癌、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、副甲状腺癌及其远端转移。
129.一种根据权利要求1至112中任一项所述的多肽或根据权利要求119至128中任一项所述的药物组合用于制备用以治疗受试者疾病的药剂的用途。
130.根据权利要求129所述的用途，其中所述疾病为癌症。
131.一种治疗受试者的疾病的方法，其包含向有需要的所述受试者施用一次或多次治疗有效剂量的根据权利要求114至118中任一项所述的药物组合物或根据权利要求119至128中任一项所述的药物组合。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述疾病为癌症。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群：胶质母细胞瘤、黑色素瘤、胆管癌、小细胞肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、阴道癌、血管肉瘤、非小细胞肺癌、阑尾癌、鳞状细胞癌、唾腺管癌、腺样囊性癌、小肠癌及胆囊癌。
134.根据权利要求131至133中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以一次或多次治疗有效剂量施用于所述受试者。
135.根据权利要求131至134中任一项所述的方法，其中所述药物组合物在有效给药期内以一次或多次治疗有效剂量施用于所述受试者。
136.根据权利要求131至134中任一项所述的方法，其中所述受试者为小鼠、大鼠、猴或人类。
137.一种核酸，其包含(a)编码根据权利要求1至112中任一项所述的多肽的多核苷酸序列；或(b)所述(a)多核苷酸序列的反向互补序列。
138.一种表达载体，其包含根据权利要求1至112所述的多核苷酸序列和可操作地连接至所述多核苷酸序列的重组调节序列。
139.一种宿主细胞，其包含根据权利要求138所述的表达载体。
140.根据权利要求139所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为原核细胞。
141.根据权利要求140所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)。
142.根据权利要求139所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
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