TW202033550A - 用於治療病理性血栓的多肽 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容提出一種多肽，其包含抗纖維素抗體與人類組織性血漿蛋白原活化因子的絲胺酸蛋白酶部分。此處亦提出利用所述多肽來治療有需要個體體內血栓的方法。

Description

用於治療病理性血栓的多肽
本揭示內容是關於多肽領域；更明確地說，是關於一種具有抗纖維素抗體以及重組人類組織性血漿蛋白原活化因子(human tissue plasminogen activator；hu-tPA)之絲胺酸蛋白酶部位的多肽，以及其治療血栓的用途。
血栓形成(或凝血)是指血液形成血栓的複雜過程。凝血作用通常會涉及一系列依序強化的由蛋白質酶催化的事件。在較為後段的步驟中，第Xa型凝血因子可將前凝血酶(prothrombin)剪切為凝血酶(thrombin)，而凝血酶又可將纖維蛋白原(fibrinogen)剪切得到纖維素；纖維素和血小板可共同形成血塊的篩狀架構。血塊的溶解涉及了纖維蛋白溶酶(plasmin)，可透過多種酵素(包括組織性血漿蛋白原活化因子)其中一種，由血漿蛋白原(plasminogen)產生纖維蛋白溶酶。
血栓症是一種凝血性疾病，其中血塊(或血栓)將血管堵塞，因而妨礙受影響區域的血流。患有不同伴隨症狀的患者(如，患有心血管疾病、內分泌或其他涉及身體調控之疾病、手術、藥物使用等等)較容易發展出病理性血栓。這些血栓可能導致出血性中風、頭部創傷、心肌梗塞、肺栓塞或深層靜脈栓塞，而這通常會導致嚴重的，危及生命的臨床症狀。
在面對這種血栓形成的病理性問題時，有兩大藥物需求面向：第一種面向著重於防止或抑制病理性血栓的形成或在形成血栓核的時候防止或抑制其長成到相當的大小；另一種面向則是即時溶解已形成的病理性血栓。在以上兩種面向中，目前臨床上都已有適用的藥物產品。
目前已開發並使用了多種間接的第Xa型凝血因子抑制劑。在過去數十年間，最主要的抑制劑為肝素(heparin)、小分子量肝素與肝素類(heparinoid)化合物；肝素是一種天然存在多醣類混合物，其包含分子量介於5,000至30,000道耳頓不等的醣胺聚糖(glycosaminoglycan)。這些物質可結合至肝素-結合蛋白(包括抗凝血酶)，進而使得此類物質能夠抑制第Xa型凝血因子，並進一步抑制血栓形成。組織因子路徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)是一種單鏈血清蛋白，隨著蛋白溶解程度的不同，其分子量介於34,000至40,000道耳頓之間，TFPI能夠抑制第Xa型凝血因子。然而，目前並未利用重組DNA技術來生產此類因子做為藥物。
臨床上也開發並使用了多種凝血酶的直接抑制劑。由醫學用水蛭所取得的天然水蛭素(hirudin)以及重組水蛭素可以和凝血酶結合，過去臨床上曾使用此類物質，但由於相繼開發出更佳的藥品，近年來已不再使用。
近年來，開發出多種第Xa型凝血因子或凝血酶的小分子抑制劑，並已取得核准而可用於在多種臨床症狀中預防凝血。在某些臨床應用中，所用的小分子是第Xa型凝血因子的直接抑制劑，譬如：阿哌沙班(apixaban)、伊度沙班(edoxaban)與利伐沙班(rivaroxaban)。另外有些小分子屬於凝血酶的直接抑制劑，譬如：阿加曲班(argatroban)或達比加群(dabigatran)。希美加群(ximelagatran)也是一種直接凝血酶抑制劑，其具有較佳的藥動學特性，且施用劑量極低，但其會造成肝毒性，故已不再使用。希美加群是一種前驅藥物，口服的希美加群在肝臟中會被轉換成美拉加群(melagatran)，此一活性形式會和凝血酶結合並抑制其活性。因此，降低美拉加群相對於希美加群的劑量，以及避免希美加群在肝臟中的轉換，極有可能能夠避免使用希美加群時所發生的肝臟毒性副作用。
已開發出多種重組人類組織性血漿蛋白原活化因子(tissue plasminogen activator，tPA)，包括：阿替普酶(alteplase)、瑞替普酶(reteplase)、替奈普酶(tenecteplase)與拉諾普酶(lanoteplase)；這些重組tPA解決了血管栓塞問題的大部分問題。然而，在許多情形中，使用tPA不足以溶解血栓和/或可能會造成嚴重內出血。t
完整tPA的分子結構相當複雜，包含具備不同功能或活性的多個結構域，然而並非所有結構域都是用於溶解血栓的血栓溶解產品所必須的。全長tPA分子(阿替普酶)共有527個胺基酸殘基，其包括(i)纖維結合素手指區域(fibronectin finger domain)，其可和纖維素結合；(2)表皮生長因子區域，其可和肝細胞結合並有助於tPA廓清；(3) Kringle 1區域，其可和肝內皮細胞結合並有助於tPA廓清；(4) Kringle 2區域，其可和纖維素結合並可活化絲胺酸蛋白酶；以及(5) 蛋白酶區域，其可剪切血漿蛋白原並受到第I型血漿蛋白原活化物抑制劑(plasminogen activator inhibitor type 1，PAI-1)的抑制。可利用哺乳類細胞、CHO細胞來製備阿替普酶、替奈普酶與拉諾普酶，而瑞替普酶則是由細菌細胞所製備。
瑞替普酶全長共355個胺基酸殘基，不含纖維結合素手指區域、上皮生長因子區域、與Kringle 1區域。瑞替普酶是利用細菌系統所製備，且因此不含有轉譯後醣類修飾。雖然瑞替普酶對纖維素的親和力較低，且其蛋白質酶活性也比不上阿替普酶，但瑞替普酶的血漿半衰期為14至18分鐘；相較之下，阿替普酶在血漿中的半衰期只有3至4分鐘。瑞替普酶可採多次推注(boli)形式施用，而阿替普酶是在單次推注(bolus)後進行灌注(infusion)。
替奈普酶的全長和阿替普酶一樣是527個胺基酸殘基，但帶有三個突變位點。將第103位的蘇胺酸取代為天門冬醯胺酸，以利進行醣化修飾；將第117位的天門冬醯胺酸取代為麩醯胺酸，以避免該處的醣化。這些突變可抑制替奈普酶被肝細胞清除。此外，在第296至299位的離胺酸-組胺酸-精胺酸-精胺酸四個胺基酸殘基則被取代為4個丙胺酸殘基，此一突變使得其對PAI-1的抗性提升了80倍。替奈普酶的血漿半衰期為18分鐘。
在拉諾普酶中，刪除了纖維結合素手指區域與上皮生長因子區域，且在第117位的天門冬醯胺酸被取代為麩醯胺酸。拉諾普酶的血漿半衰期長達45分鐘，大幅改善了給藥方式的限制。
也有許多臨床研究著眼於比較不同重組tPA形式的藥效。多個臨床試驗顯示，四種tPA的整體療效不相上下，但其各自適用的特定適應症則有所不同。從與tPA、其變異株與醫療用途相關的大量文獻可以得知，tPA對纖維素的結合親和力、半衰期、肝細胞降解敏感性、對血漿蛋白原活化物抑制劑的抗性等各種性質和tPA在特定臨床症狀下的特定性質息息相關。
有鑑於此，本領域亟需一種更佳藥品，以治療病理性或堵塞性血栓。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。發明內容的目的在於以簡化的方式提出某些本案的技術構思，以作為下文實施方式的前序。
本發明的第一態樣是有關於一種對纖維素專一的抗體。根據本揭示內容多種實施例，所述抗纖維素抗體可對人類或小鼠纖維素專一結合。此外，此處提出的抗纖維素抗體對聚合後的不可溶纖維素的結合親和力，優於對可溶性纖維蛋白原的結合親和力。根據本揭示內容某些實施例，所述抗纖維素抗體對人類纖維素抗體的結合親和力，比其對於人類纖維蛋白原的結合親和力高了十倍。
於某些視需要而採用的實施例中，所述抗纖維素抗體包含一輕鏈可變區域，其具有序列編號：1、17、19或21所示的胺基酸序列，以及一重鏈可變區域，其具有序列編號：2、18、20或22所示的胺基酸序列。舉例來說，所述抗纖維素抗體可以是一種scFv，其具有序列編號：3或5所示的胺基酸序列。
根據本揭示內容一些實施例，所述抗纖維素抗體包含六個互補決定區(complementarity-determining region，CDR)，其分別具有對應於以下序列之胺基酸序列：序列編號：1的第30至32個胺基酸殘基(CDR-L1)、序列編號：1的第49至54個胺基酸殘基(CDR-L2)、序列編號：1的第91至96個胺基酸殘基(CDR-L3)、序列編號：2的第30至33個胺基酸殘基(CDR-H1)、序列編號：2的第50至59個胺基酸殘基(CDR-H2)以及序列編號2的第98至106個胺基酸殘基(CDR-H3)。
根據本揭示內容多種實施例，所述抗纖維素抗體是單鏈可變片段(scFv)或單域抗體(sdAb)。
在其他視需要而採用的實施例中，所述輕鏈可變區域以及重鏈可變區域可透過如序列編號：16所示之親水性連接物而連接。
在另一種態樣中，本揭示內容是關於一種多肽，其包含本揭示內容之上述態樣/實施例所述的抗纖維素抗體。當可理解，利用此種多肽來治療血栓的方法，亦屬於本揭示內容的態樣中。
根據本揭示內容的實施例，所述多肽包含一抗纖維素抗體與一人類組織性血漿蛋白原活化因子(hu-tPA)的絲胺酸蛋白酶部分，其中抗纖維素抗體與人類纖維素的結合親和力比其與人類纖維蛋白原的結合親和力高十倍。或者是或額外地，所述多肽與人類纖維素的結合親和力優於與人類纖維素的結合親和力hu-tPA與人類纖維素的結合親和力。又或者是或額外地，所述多肽與動物體內的血清半衰期比瑞替普酶長。
具體來說，tPA的絲胺酸蛋白酶部分可直接連接到抗纖維素抗體的N-或C-端，或透過兩者間的連接序列而間接連接。
根據本揭示內容視需要而採用的實施例，所述hu-tPA的絲胺酸蛋白酶部分為瑞替普酶。
於某些實施例中，所述抗纖維素抗體是人類抗體或人源化抗體。
根據本揭示內容一些實施例，所述多肽具有如序列編號：11或12或14所示的胺基酸序列。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
為了便於說明，此處整理了說明書、實施例與附隨申請專利範圍中所用的某些詞彙。除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙的含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。
在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」與「一或更多」等表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。更有甚者，在本說明書與申請專利範圍中，「A、B及C其中至少一者」、「A、B或C其中至少一者」以及「A、B和/或C其中至少一者」係指涵蓋了僅有A、僅有B、僅有C、A與B兩者、B與C兩者、A與C兩者、以及A、B與C三者。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10％、5％、1％或0.5％之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。當可理解，除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一端點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點
本揭示內容一般係關於一種抗纖維素抗體以及包含此抗纖維素抗體的多肽。具體來說，上述抗纖維素抗體可作為所述多肽的標的元件(T)，而多肽更包括一效應元件(E)，因此，在本說明書中有時將此種多肽稱為「T-E分子」、「T-E藥物」或「T-E藥品」。
雖然在此處利用「第一」、「第二、「第三」等詞彙來描述多種元件、部件、區域和/或區段，這些元件(以及部件、區域和/或區段)不受上述修飾詞的限制。此外，除非上下文有明示的說明，使用這些序數並未隱含序列或順序。反之，這些詞彙僅是用來區分各元件。因此，亦可將下文所述的第一元件命名為第二元件，而不會悖離例示性實施方式所揭示的內容。
在此處，「連接(link)」、「耦接(couple)」以及「複合(conjugate)」等詞可互換使用，且都是用來指稱透過直接或間接的連接關係，將兩個元件連接在一起。
「多肽(polypeptide)」一詞在此係指具有至少兩個胺基酸殘基的聚合物。一般來說，多肽包含2到200個胺基酸殘基；在較佳的情形中，是2到50個殘基。在本說明書中所提及的胺基酸序列涵蓋了此種序列的L-、D-或β-胺基酸等形式。多肽亦包括胺基酸聚合物，其中有一或多個胺基酸殘基是與一天然胺基酸相應的人工化學類似物，當然也包括天然產生的胺基酸聚合物。此外，此一詞彙亦涵蓋以多肽鏈或其他方式連接的胺基酸，上述其他方式如經修飾的連接(modified linkage)，譬如以α-酯(α-ester)、β-酯(β-ester)、硫醯胺(thioamide)、磷醯胺(phosphoramide)、氨基甲酸酯(carbomate)、羥基酯(hydroxylate)鍵、以及與其相似者來取代多肽鍵。
於一些實施方式中，本發明範圍亦涵蓋了其他相較於所述序列具有保守性置換的蛋白。於多種實施方式中，有一、二、三、四或五個不同的殘基經過置換。在此處，「保守性置換(conservative substitution)」一詞是指所述胺基酸置換不會明顯地改變分子活性(譬如生物或功能活性和/或專一性)。一般來說，保守性胺基酸置換是利用另一種具有相似化學性質(如電荷或疏水性)的胺基酸來取代某一胺基酸。某些保守性置換包括「類似物置換」，亦即以非標準(如罕見或合成等)胺基酸來取代標準胺基酸，而上述非標準胺基酸和被取代的原有胺基酸之間的差異極小。可由標準胺基酸經人工修飾而在不會大幅改變原有胺基酸結構的前提下，得到所述的胺基酸類似物，譬如異構物或代謝前驅物等皆屬之。
於一些實施方式中，本案的範圍亦涵蓋和任何所述序列具有至少80％序列相似度的任何序列，上述序列相似度較佳為至少85％或90％、更佳為至少95％或98％。
此處針對多肽序列所述的「胺基酸序列相似度百分比(Percentage (％) amino acid sequence identity)」係指候選序列的胺基酸殘基與參考多肽序列的胺基酸殘基完全相同的百分比；於進行上述比對時，可將所述的候選多肽片段與所述的特定多肽片段並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在計算相似度時，保守性置換的胺基酸殘基視為不同的殘基。相關領域已有多種方法可用以進行上述並排，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行並排時，可選擇適當的參數與計算方式，以得到最佳的排列方式。在本說明書中，二多肽序列間的序列比較是採用美國國家生物科技資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information，NCBI)所提供的蛋白質-蛋白質BLAST分析資料庫Blastp來進行。候選多肽序列A相較於參考多肽序列B的胺基酸序列相似度(在本說明書中亦稱之為多肽序列A與多肽序列B具有特定百分比(％)的胺基酸序列相似度)的計算方式如下：
Figure 02_image001
％ 其中X是利用BLAST序列並排程式對序列A、B進行排列後所得到的相同胺基酸殘基數目(identical matches)，而Y是A、B二序列中較短者的胺基酸殘基總數。
「聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)」一詞在此係指帶有一個胺基(amino group)與一個羧基(carboxyl group)的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)鏈。一般來說，聚乙二醇化胺基酸的結構式為NH2 -(CH2 CH2 O)n -COOH。在本揭示內容中，n值介於1到20之間；較佳是介於2至12。
在此處一多肽的「端」係指位於該多肽N-或C-端點的胺基酸殘基。在描述一聚合物(譬如此處所述的聚乙二醇)的組成單元時時，「端」則是指在聚合物骨架末端的部分。在本說明書與申請專利範圍中，「自由端」一詞是用來指稱並未與另一個分子形成化學鍵結的末端胺基酸殘基或構成單元。
在本說明書與申請專利範圍中，「抗體(antibody)」一詞應以廣義方式解釋，且包含完整組裝的抗體、可和抗原結合的抗體片段，譬如抗原結合片段(Fab/Fab’)、F(ab’)2 片段(具有彼此以雙硫鍵連接的兩個Fab部分)、可變片段(variable fragment，Fv)、單鏈可變片段(scFv)、雙專一性單鏈可變片段(bi-scFv)、單域抗體(single-domain antibodies，sdAb),奈米抗體(nanobodies)、單抗體(unibodies)以及雙體抗體(diabodies)。「抗體片段」包含完整抗體的一部分，較佳為包括完整抗體的抗原結合區域或可變區域。在典型的例子中，「抗體」係指實質上由免疫球蛋白基因或其片段所編碼的一或多種多肽所組成的蛋白質。習知的免疫球蛋白基因包括κ (kappa)、λ (lambda)、α (alpha)、γ (gamma)、δ (gamma)、ε (epsilon)與μ (mu)等恆定區基因(constant region gene)、以及無數的免疫球蛋白可變域基因(variable domain genes)。輕鏈通常歸類為κ (kappa)或λ (lambda)。重鏈通常歸類為γ (gamma)、μ (mu)、α (alpha)、δ (gamma)或ε (epsilon)，基於這些結構，定義出了以下類型的免疫球蛋白：IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。典型的免疫球蛋白抗體結構是一種四聚物(tetramer)。每一個四聚物是由兩條相同的多肽鏈所組成，且每一對分別有一「輕」鏈(約25 kDa)與一「重」鏈(約50-70 kDa)。每一鏈的N-端界定了一個可變區域，包含約100至110個或更多的胺基酸，其主要負責抗原辨識。可變輕鏈區域(light-chain variable domain，VL )與可變重鏈區域(heavy-chain variable domain，VH )等詞就是分別指上述的輕鏈與重鏈。根據本揭示內容的實施方式，可藉由改變天然抗體或利用重組DNA方式重新合成上述抗體片段。於本揭示內容一些實施方式中，上述抗體和/或抗體片段可具有雙專一性，且可有多種不同的構形。舉例來說，雙專一性抗體可包含二個不同的抗原結合部位(可變區域)。於多種實施方式中，可利用融合瘤技術或重組DNA技術來製備雙專一性抗體。於一些實施方式中，雙專一性抗體對至少兩種不同的表位(epitope)有結合專一性。
「專一地結合(specifically bind)」一詞在此處係指抗體或其抗原結合片段能夠和抗原結合的能力，上述結合的解離常數(dissociation constant，Kd)小於約1×10-6 M、1×10-7 M、1×10-8 M、1×10-9 M、1×10-10 M、1×10-11 M或1×10-12 M；或者是或額外地，相較於其對於非專一性抗原的結合親和力，上述抗體或其抗原結合片段與抗原結合的親和力為兩倍以上。
「治療(treatment)」一詞係指預防性(如，預防用藥)、療癒性或緩和性的處置，藉以達到所欲的藥學和/或生理學效果；而治療的行為在此包括上述預防性、療癒性或緩和性的處置。具體來說，治療在此係指對於可能患有一醫療疾患(如，血栓)或與此疾患相關的症狀、由此疾患所生的疾病或異常、或易於罹患此疾患的個體施用或投予本發明提出的多肽或包含此多肽的藥學組合物，以期能部分地或完全地緩和、改善、減輕特定異常和/或病症的一或多種症狀或特徵，或是延緩其發生、阻礙其進展、減輕其嚴重性和/或減低發生率。亦可對尚未表出現疾病、異常和/或病症徵兆的個體和/或出現早期徵兆的個體進行治療，以期降低發展出與該疾病、異常和/或病症相關的病理變化的風險。
在此處，「有效量(effective amount)」一詞係指本發明分子多肽的用量足以招致所欲的治療反應。藥劑的有效量不必然能夠治癒疾病或病症，但能夠延緩、阻礙或防止該疾病或病症的發生，或是可緩減與疾病或病症相關的病徵。可將治療有效量可分成一、二或更多劑，而以適當的劑型在指定期間內施用一次、二次或更多次。具體的治療有效量取決於多種因素，例如欲治療的特定狀況、個體的生理條件(如，個體體重、年齡或性別)、接受治療的個體類型、治療持續時間、併行治療(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說，可將治療有效量表示成活性成分的總重量，譬如以克、毫克或微克來表示；或表示成活性成分重量相對於體重的比例，譬如表示為每公斤體重多少毫克(mg/kg)。
所述「施用(application)」與「投予(administration)」等詞在此可交替使用，其係指將本發明之多肽或藥學組合物提供給需要治療的個體。
「個體(subject)」或「患者(patient)」等詞在此可交互使用，且是指可接受本揭示內容之多肽、藥學組合物和/或方法處置的動物(包含人類)。除非另有指明，「個體」或「患者」一般包含雄性與雌性。「個體」或「患者」包含任何可因本揭示內容的處置而獲益的哺乳類動物。所述「個體」或「患者」的例示包含，但不限於：人類、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、豬、山羊、牛、馬、狗、貓、鳥和禽類。在一實例中，所述患者為人類。所述哺乳類動物涵蓋哺乳動物綱的所有成員，包括人類、靈長類動物、家畜和農畜(如兔子、豬、綿羊和牛)、動物園動物或競賽用動物、寵物，以及齧齒類動物(如，小鼠和大鼠)。「非人類哺乳動物」一詞則涵蓋除了人類以外的所有哺乳動物綱成員。
本揭示內容至少部分是基於鑑別出一種纖維素抗體，其與纖維素(特別是，纖維素血栓)的結合專一性優於與纖維蛋白原的結合專一性。根據本揭示內容某些實施例，所述抗纖維素抗體與人類纖維素的結合親和力比起與人類纖維蛋白原的結合親和力高了十倍。因此，此處提出的抗纖維素抗體可作為一種標的元件，來建構一種T-E分子，使其可聚集在纖維素血栓周圍的區域。另一方面，所述T-E分子可包含一或更多種效應元件，譬如能夠使病理性血栓溶解的元件。如此一來，所述T-E藥物可被遞送至目標細胞、目標組織或器官，且其在這些部位的比例相對高於在血液循環、淋巴系統以及其他細胞、組織和器官中的比例。當實現上述情境時，即可提升T-E藥物的療效，且其副作用與毒性的數目和嚴重性都會降低。相較於不含標的元件的藥物，以T-E分子的形式來投遞藥物時，發揮療效的效應物所用的濃度可能較低。因此，可在較低的劑量下施用治療用的效應物而不會減損其有效性，但卻能同時降低其副作用與毒性。
有鑑於此，本揭示內容的一態樣是關於一種抗纖維素抗體，其能夠鑑別纖維素血栓與纖維蛋白原。雖然先前已開發出其他的抗纖維素抗體，這些現有的抗纖維素抗體無法有效地鑑別纖維素血栓與纖維蛋白原，故不適用於臨床開發應用。因此，產製出能夠有效鑑別纖維素血栓與纖維蛋白原的單株抗體實乃開發治療病理性血栓之T-E藥物領域的重大突破。
根據本揭示內容的實施例，所述抗纖維素抗體包含一輕鏈可變區域(VL )及一重鏈可變區域(VH )，兩者分別具有如序列編號：1、2、序列編號：17、18、序列編號：19、20或序列編號：21、22所示的胺基酸序列。根據某些實施方式，VL 區域與VH 區域各自包含三個互補決定區(CDR)。具體來說，此處提出的抗纖維素抗體的CDR-L1、CDR-L2與CDR-L3的胺基酸序列分別對應至序列編號：1的第30至32個胺基酸殘基、第49至54個胺基酸殘基以及第91至96個胺基酸殘基；而此處提出的抗纖維素抗體的CDR-H1、CDR-H2與CDR-H3的胺基酸序列分別對應至序列編號：2的第30至33個胺基酸殘基、第50至59個胺基酸殘基以及第98至106個胺基酸殘基。
根據本揭示內容多種實施例，所述抗纖維素抗體可以是完整抗體或包含抗原結合區域或可變區域(如，上述CDR)的抗體片段。舉例來說，所述抗體可以是單鏈可變片段(scFv)或單域抗體(sdAb)。然而，本揭示內容不限於此。
於某些視需要而採用的實施例中，抗纖維素抗體包含如序列編號：1所示之輕鏈可變區域以及如序列編號：2所示的重鏈可變區域。
根據本揭示內容某些視需要而採用的實施例，可在VL 與VH 序列間或在VH 與VL 序列間加入一連接物序列，以提升所述scFv的半衰期及/或結合親和力。舉例來說，所述連接物序列可以是一親水性序列。於某些視需要而採用的實施例中，所述抗纖維素抗體可以是具有序列編號：3或5所示之胺基酸序列的scFv。
本揭示內容的另一態樣是關於一種多肽。具體來說，所述多肽為T-E藥物，其包含標的元件(如，本揭示內容上述態樣/實施例所述的抗纖維素抗體)以及用以治療血栓的效應元件(如，組織性血漿蛋白原活化因子)。因此，本揭示內容的範圍亦涵蓋利用所述多肽來治療血栓的方法。
根據本揭示內容多種實施例，所述多肽包含抗纖維素抗體與連接到抗纖維素抗體N-或C-端之人類組織性血漿蛋白原活化因子(hu-tPA)的絲胺酸蛋白酶部分，上述連接可以是直接連接或透過一連接物而間接連接。
hu-tPA之絲胺酸蛋白酶部分的一種例示為瑞替普酶。其他與瑞替普酶均等的多肽亦屬於本揭示內容之範圍。
於某些實施例中，抗纖維素抗體與hu-tPA的絲胺酸蛋白酶部分是直接連結，而在其他情形中，兩者透過一中間序列而鍵結連接。根據本揭示內容一些實施例，在抗纖維素抗體與hu-tPA的絲胺酸蛋白酶部分間加入一親水性連接物序列，以利多肽和血栓中的纖維素篩狀架構連接。舉例來說，當hu-tPA的絲胺酸蛋白酶部分連接到抗纖維素抗體的N-端時，所述多肽的胺基酸序列如序列編號：11或12所示。或者是，當hu-tPA的絲胺酸蛋白酶部分連接到抗纖維素抗體的C-端時，所述多肽的胺基酸序列如序列編號：14所示。
根據某些實施方式，此處提出之多肽和人類纖維素的結合能力優於hu-tPA。或者是或額外地，此處提出之多肽在動物體內的血清半衰期優於瑞替普酶。
實驗例
實驗例1：製備人類纖維素塗覆盤以進行噬菌體呈現篩選
製備塗覆纖維蛋白原的孔盤時，將人類纖維蛋白原(Sigma)的PBS溶液以10 μg/100 μL每孔的量加入至Maxi皂盤(Nunc)中，密封平底盤並在4°C下放置一晚。
每一纖維素盤的製備方式如下。將100 μL的Tris緩衝溶液(TBS，含最終濃度1.0 U/mL凝血酶(Sigma)、2 mM CaCl2 與7 mM L-半胱胺酸(Merck))加入纖維蛋白原盤的孔中，之後以TBS沖洗，再以5％脫脂牛奶的磷酸鹽緩衝溶液(PBST，含0.1％ tween-20)處理，以使反應中止。
實驗例2：構建與選擇對人類纖維素專一的噬菌體呈現scFv
經雙方協議，由中央研究院基因體研究中心(臺北，臺灣)楊安綏博士研究室取得帶有對人類纖維素專一的scFv之噬菌體株。此scFv抗體庫的框架序列(framework sequence)衍生自G6抗-VEGF Fab (蛋白庫編碼：2FJG)，將其選殖到噬質體載體pCANTAB5E (GE Healthcare)的限制位SfiI 與NotI 間，上述噬質體載體帶有胺苄青黴素(ampicillin)抗性基因、lacZ啟動子、有助於將scFv片段分泌至培養上清液中的pelB引導序列(leader sequence)以及用於偵測的E-標籤。基於寡核苷定點突變(oligonucleotide-directed mutagenesis)技術將scFv模板的VH 與VL 域多樣化；將每一可變區域中的三個CDR同時多樣化。使用帶有超過109 個選殖株的scFv抗體庫在人類纖維素上進行篩選。
利用塗覆有經經凝血酶處理的人類纖維素(每孔1 μg/100 μL PBS)之Maxisorp 96(Nunc)孔盤來淘選抗-纖維素抗體。簡言之，在室溫下將帶有塗覆溶液的孔盤搖晃2小時，以使人類纖維素塗覆於孔盤上。之後，在室溫下以阻隔緩衝液處理經纖維素塗覆的孔盤，阻隔緩衝液是以5％脫脂牛奶溶於PBST(帶有0.1％ tween-20)，處理時間1小時。將重組噬菌體以阻隔緩衝液稀釋到8x1011 菌落形成單元(colony-forming unit，CFU)/mL的濃度後，加入纖維素塗覆的孔盤中，並溫和搖晃1小時。接著以PBST劇烈地清洗孔盤十次，再以PBS沖洗六次，以移除未專一結合的噬菌體。利用0.1 M HCl/甘胺酸緩衝液(pH 2.2)來沖提結合的噬菌體，並立刻以2 M的Tris緩衝液(pH 9.0)中和沖提液。利用大腸桿菌品系ER2738 (OD600 = ~0.6)在37°C下進行噬菌體感染，處理時間30分鐘；利用胺苄青黴素處理30分鐘，以移除未受感染的大腸桿菌。在胺苄青黴素處理後，加入帶有康黴素抗性的輔助噬菌體M13KO7繼續培育1小時。從大腸桿菌培養物中選擇可被輔助噬菌體拯救的噬菌體，將其在帶有康黴素的環境中於37°C下劇烈搖晃一晚，以擴增所選的噬菌體。在PEG/NaCl中使擴增的噬菌體析出，之後再重新懸浮於PBS中，以用於下一次的選擇-擴增循環。重複上述選擇-擴增循環，以在纖維素上連續進行三次淘選。
經噬菌體感染的ER2738菌落盤於系列稀釋後，計算其數目與噬菌體效價，以得到每一淘選回合後每毫升的輸出效價(output titer/ml；CFU/ml)。經過三回合淘選後，噬菌體輸出效價由1.6E+04 CFU/孔提升了超過1千倍而達到3.2E+07 CFU/孔。圖1A顯示每一回合的噬菌體輸出/輸入效價比。Y軸顯示每一淘選回合的噬菌體輸出/輸入效價比。經過三回合的淘選後，陽性菌落的比例明顯提升。相較於第一回合，第三回合的輸出/輸入效價比提高了100倍，而結合的菌落也逐漸成為抗體庫中的優勢族群。
在一般的選擇程序中，於塗覆人類纖維素的ELISA孔盤上進行三回合的抗原淘選後，約有80％與纖維素結合的噬菌體粒子在ELISA分析中可專一地與所塗覆的纖維素結合。
實驗例3：對人類纖維素專一的噬菌體呈現人類scFv的單菌落ELISA分析
大腸桿菌品系ER2738經單一菌落噬菌體感染後，分別獲取了各噬菌體的噬質體內的所選scFv基因；在深孔中加入2YT培養液(含16 g/L胰化蛋白、10 g/L酵母抽出物以及5 g/L NaCl；pH 7.0)以及100 μg/mL胺苄青黴素，在37°C下搖晃，以將這些大腸桿菌培養到中對數期(mid-log phase)。當培養液的OD600 達到1.0後，加入IPTG，使其最終濃度為1 μg/mL。在劇烈搖晃、37°C下將孔盤培育一晚；其後，以4,000 g在4°C下將孔盤離心15分鐘。
利用ELISA來進行可溶性scFv結合試驗。簡言之，將Maxisorp 96-孔盤(Nunc)塗覆纖維素(每孔0.5 μg/100 μL PBS)或人類纖維蛋白原(作為陰性對照組)，在4°C下搖晃18小時。在以300 μL的阻隔緩衝液處理1小時後，將100 μL含可溶性scFv的上清液和100 μL的阻隔緩衝液混合，而後將此混和物加入經塗覆的孔盤再處理1小時。將山羊抗-E-標籤抗體(與HRP複合，1：4000，型錄編號AB19400，Abcam)加入孔盤處理1小時。將TMB基質(每孔50 μl)加入孔盤，並於加入1N HCl (每孔50 μL)使反應停止後，測量在450 nm下的吸光值。測量每孔的OD450 ，以決定每一scFv株對纖維素或纖維蛋白原的結合親和力。對於每一scFv株，將其對於纖維素的OD450 值除以其對於纖維蛋白原的OD450 值，以得到OD450 比，此一數值代表所述scFv對纖維素相對於纖維蛋白原的選擇結合。在單一菌落ELISA分析中，經三輪淘選後，共選出192株噬菌體株進行本實驗例的分析。其中有12株scFv對纖維素結合的OD450 比大於10，進一步對編碼這10株scFv的基因進行DNA定序，並識別出6種不同的DNA序列。圖1B是scFv株D10的ELISA分析結果。scFv株D10和人類纖維素結合的OD450 為1.3，其胺基酸序列如序列編號：4所示。
利用上文所述的方法，再額外進行了一輪選擇。本次實驗中，在經過三回合淘選後，噬菌體輸出效價由9.3E+04 CFU/孔提升了超過1千倍而達到4.5E+07 CFU/孔。相較於第一回合，第三回合的輸出/輸入效價比提高了130倍，而結合的菌落也逐漸成為抗體庫中的優勢族群。在第三輪逃選後，選出192株噬菌體株進行本實驗例的分析。其中有18株scFv對纖維素結合的OD450 比大於10，進一步對編碼這18株scFv的基因進行DNA定序，並識別出4種不同的DNA序列。這四株scFv的OD450 分析資料與序列摘要整理於下表1。 表1
3C2 8F2 3D5 7A3
OD450 _纖維素 0.7588 0.5273 0.8294 0.4285
OD450 _纖維蛋白原 0.0117 0.0366 0.0022 0.0209
OD450 比 64.8547 14.4071 377 20.50239
VL 序列編號：17 序列編號：19 序列編號：1 序列編號：21
VH 序列編號：18 序列編號：20 序列編號：2 序列編號：22
後續實驗分析中，使用了其中具有最高OD450 比的3D5 scFv，噬菌體呈現之3D5 scFv的胺基酸序列如序列編號：5所示。
實驗例4：重組抗纖維素102-10抗體與抗纖維素3D5抗體的製備
將對人類纖維素專一抗體3D5的VL 與VH 片段置於pG1K表現匣中，以進行表現。全長抗體的輕鏈與重鏈的胺基酸序列分別如序列編號：8、9所示。
將對人類纖維素專一抗體102-10 (日本專利申請公開案第2012-72號)的VL 與VH 片段置於pG1K表現匣中，以進行表現。全長抗體的輕鏈與重鏈的胺基酸序列分別如序列編號：6、7所示。
於利用哺乳類動物表現系統來製備重組抗體時，使用以Expi293F™細胞系為基礎的過度表現系統來製備。此系統使用ExpiFectamine™ 293轉染套組(Life Technologies, Carlsbad, USA)，其包含Expi293F™細胞株、陽離子脂質系ExpiFectamine™ 293試劑、ExpiFectamine™ 293轉染強化劑1與2、以及表現系統所用的培養基(Gibco, New York, USA)。
將Expi293F細胞以每毫升2.0 × 106 個活細胞的密度播於Expi293F表現培養基中，並維持18至24小時後進行轉染，以確保進行轉染時細胞處於分裂狀態。進行轉染時，將帶有7.5×108 個細胞的255毫升培養基置於2-L艾氏燒瓶中，並加入ExpiFectamine™ 293轉染試劑。將轉染細胞在37°C下以定軌搖動器(125 rpm)培育16至18小時；之後在燒瓶中加入ExpiFectamine™ 293轉染強化劑1與強化劑2，並繼續培育5到6天。收集培養上清液，並使用蛋白A親和力層析法純化培養基中的抗體。
實驗例5：102-10抗體與3D5抗體對人類纖維蛋白原、纖維素以及經人類第XIIIa型凝血因子處理之交聯纖維素的結合能力之ELISA分析
進行ELISA分析，以探討102-10抗體與3D5抗體對人類纖維蛋白原、纖維素以及交聯纖維素的結合能力。
於製備纖維素盤時，將人類纖維蛋白原(Sigma)的PBS溶液以100 μL/孔的量加入至96孔聚苯乙烯微孔盤中，密封孔盤並在4°C下放置一晚。
每一纖維素盤的製備方式如下。將100 μL的TBS (含1.0 U/ml凝血酶(Sigma)、2 mM CaCl2 與7 mM L-半胱胺酸(Sigma))加入纖維蛋白原孔盤的孔中，之後以TBS沖洗，再以5％脫脂牛奶的磷酸鹽緩衝溶液(PBST，含0.1％ tween-20)處理，以使反應中止。反應終止後，將100 μL抗體加入每一孔中，再將孔盤於室溫下培育1小時。之後將孔盤沖洗三次，將複合HRP的蛋白L稀釋至1/5000後加入每孔中，再次於室溫下培育1小時。接著將孔洞沖洗三次，並加入100 μL的TMB受質緩衝液。5分鐘後，以1 M HCl使顯色反應停止。以微量盤式分析儀測量在450 nm下的吸光值(OD)。
ELISA分析結果如圖2所示，由圖中可以看出，3D5抗體和人類纖維素或交聯纖維素的結合能力優於102-10抗體的結合能力。
實驗例6：帶有瑞替普酶與VL -218連接物-VH 配置之對人類纖維素專一的102-10 scFv之多肽的製備
透過彈性連接物(序列編號：15，下稱：彈性連接物)將瑞替普酶接合到102-10 scFv的N-端，以建構(瑞替普酶)-102-10 scFv多肽。102-10 scFv的配置為VL -連接物-VH ，其中兩個結構域透過親水性218連接物GSTSGSGKPGSGEGSTKG (序列編號：16)而結合。重組多肽的胺基酸序列如序列編號：10所示。
此處提出之(瑞替普酶)-(102-10 scFv α 纖維素)多肽的結構如下所示。
Figure 02_image003
實驗例7：利用Expi293F過表現系統製備與純化重組(瑞替普酶)-(scFv α 纖維素)
於本實驗例中，將編碼scFv的序列置於pcDNA3表現匣中。利用Expi293F胞系表現所建構的基因以及純化所表現之多肽的步驟，如上文實驗例所述。
利用SDS-PAGE來鑑定此一新的構建體。圖3的10％非還原SDA-PAGE分析結果顯示重組(瑞替普酶)-(102-10 scFv α 纖維素)蛋白(第2道)的主要條帶位於約71 kDa，與期望大小相符。
實驗例8：帶有瑞替普酶與VL -彈性連接物-VH 配置之對人類纖維素專一的3D5 scFv之多肽的製備
透過彈性連接物將瑞替普酶接合到對人類纖維素專一之3D5 scFv的N-端，以建構重組瑞替普酶-(3D5 VL -彈性連接物-VH scFv α 纖維素)蛋白。
所述scFv的配置為VL -連接物-VH ，其中兩個結構域透過彈性連接物而結合。重組多肽的胺基酸序列如序列編號：11所示。利用SDS-PAGE來鑑定此一新的構建體。圖3的10％非還原SDA-PAGE分析結果顯示樣本(第1道)的主要條帶的期望大小約為71 kDa；然而，在約55 kDa處亦發現預期外的降解產物。
實驗例9：帶有瑞替普酶與VL -218連接物-VH 配置之對人類纖維素專一的3D5 scFv之多肽的製備
透過彈性連接物將瑞替普酶接合到對人類纖維素專一之3D5 scFv的N-端，以建構重組瑞替普酶-(3D5 VL -218-VH scFv α 纖維素)蛋白(下稱：瑞替普酶-(3D5 scFv))。
所述scFv的配置為VL -連接物-VH ，其中兩個結構域透過親水性218連接物而結合。重組多肽的胺基酸序列如序列編號：12所示。利用SDS-PAGE來鑑定此一新的構建體。圖4的10％非還原SDA-PAGE分析結果顯示此一新穎構建體的重組鏈(第1、2道)的大小約為71 kDa，與期望大小相符。由於本實驗例製備之瑞替普酶-(3D5 scFv)比其先前實驗例所製備之瑞替普酶-(3D5 VL -彈性連接物-VH scFv α 纖維素)多肽更為安定，下文實驗例中利用本實驗例之瑞替普酶-(3D5 scFv)進行後續分析。
實驗例10：利用Expi293F過表現系統製備重組瑞替普酶-IgG4.Fc 蛋白
將瑞替普酶透過彈性絞鏈區域接合到IgG4.Fc的CH2結構域之N-端，以建構瑞替普酶-CH2-CH3 (人類γ4)重組鏈。所述IgG4.Fc多肽之重組鏈的胺基酸序列如序列編號：13所示。
利用Expi293F胞系表現所建構的基因的步驟，如上文實驗例所述。
實驗例11：利用SDS-PAGE分析瑞替普酶-(3D5 scFv)的安定性
為了評估瑞替普酶-(3D5 scFv)於儲存後的安定性，將瑞替普酶-(3D5 scFv)在4°C下儲存3、6與30天，之後進行SDS-PAGE與ELISA分析。
圖5A與5B為10％非還原SDS-PAGE分析結果，結果顯示重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽可穩定儲存至少一個月。
進行ELISA分析，以評估經儲存之瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽對人類纖維素的結合能力。
將96孔的聚苯乙烯微孔盤塗覆人類纖維蛋白原(Sigma) (20 μg/mL)的PBS緩衝液(100 μL/孔)。在4°C下培育一夜後，以PBS緩衝液沖洗塗覆的孔盤。為了引發人類纖維素的交聯，將Tris緩衝溶液(TBS，含最終濃度1 U/mL人類α-凝血酶(Sigma)、2 mM CaCl2 與7 mM L-半胱胺酸(Merck))加入經塗覆的孔中，於37°C下培育1小時。以阻斷緩衝液(5％ 脫脂奶粉/PBS)阻斷反應後，將最終濃度為0.1、1與10 μg/mL的100 μL瑞替普酶-(3D5-scFv)加入每一孔中，並於室溫下培育1小時。之後，沖洗孔盤三次，並將與HRP耦接的蛋白L稀釋至1/5000後加入孔中，再於室溫下培育1小時。沖洗孔盤三次，並加入100 μL的3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(Tetramethylbenzidine，TMB)受質緩衝液。分鐘後，以1 M HCl使顯色反應停止。以微量盤式分析儀(Molecular Devices)測量在450 nm下的吸光值(OD)，並以Graph Pad Prism軟體處理資料。
在製備經過第XIIIa型凝血因子處理的交聯纖維素盤時，採用與上文製備纖維素塗覆盤相似的方法進行塗覆。簡言之，人類纖維蛋白原(Sigma)以PBS稀釋後以每孔100 μL的量加入至96孔的聚苯乙烯微孔盤，之後將孔盤密封並於4°C下靜置一夜。
每一纖維素盤的製備方法如下。將100 μL的TBS (含最終濃度1.0 U/mL凝血酶(Sigma)、每孔0.55 μg第XIIIa型凝血因子(Zedira，Darmstadt，德國)、2 mM CaCl2 與7 mM L-半胱胺酸(Merck))加入纖維蛋白原盤的孔中，之後再以TBS沖洗並以阻斷緩衝液(5％脫脂奶粉/PBS)終止反應。
利用與HRP複合的蛋白L偵測重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽。圖5C的ELISA分析結果顯示，即使經過了指定的儲存時間，瑞替普酶-(3D5 scFv)仍能專一地和人類纖維素以及交聯纖維素結合。
實驗例12：(瑞替普酶)-(3D5 scFv)多肽對人類纖維素以及交聯纖維素之結合能力的ELISA分析
進行ELISA分析以探討重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽對人類纖維素結合能力的劑量依存關性。
ELISA分析的步驟與上文實驗例所述相似。簡言之，將小鼠纖維蛋白原(Sigma)經PBS稀釋後，以每孔100 μL的量加入96孔聚苯乙烯微孔盤中，之後將孔盤密封並在4°C下靜置一夜。
每一纖維素盤的製備方式如下。每一纖維素盤的製備方法如下。將100 μL的TBS (含最終濃度1.0 U/mL凝血酶(Sigma)、2 mM CaCl2 與7 mM L-半胱胺酸(Merck))加入纖維蛋白原盤的孔中，之後再以TBS沖洗並以阻斷緩衝液(5％脫脂奶粉/PBS)終止反應。接著，將不同濃度(600 nM、200 nM、66 nM、22 nM、7.4 nM、2.5 nM以及0.8 nM)的100 μL瑞替普酶-(3D5-scFv)加入每一孔中，並於室溫下培育1小時。接著將孔盤沖洗三次，並將與HPR複合的蛋白稀釋成1/5000後加入孔中，並於室溫下培育1小時。之後將孔沖洗三次，再加入100 μL的TMB受質緩衝液。5分鐘後，加入1 M HCl使顯色反應終止。以微量盤式分析儀測量在450 nm下的吸光值(OD)。
利用與HPR複合的蛋白L來偵測重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽。圖6所示的ELISA分析結果結果，瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽可專一地結合到人類纖維素以及交聯纖維素；然而，其對交聯纖維素的結合能力比對纖維素更強。
實驗例13：重組(瑞替普酶)-(3D5 scFv)多肽對小鼠纖維素之結合能力的ELISA分析
製備小鼠纖維素塗覆之ELISA盤，以透過ELISA分析探究重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽對小鼠纖維素的結合能力。
在製備小鼠纖維素盤時，採用與上文製備人類纖維素塗覆盤相似的方法進行塗覆。簡言之，小鼠纖維蛋白原(Sigma)以PBS稀釋後以每孔100 μL的量加入至96孔的聚苯乙烯微孔盤，之後將孔盤密封並於4°C下靜置一夜。
每一纖維素盤的製備方法如下。將100 μL的TBS (含最終濃度1.0 U/mL凝血酶(Sigma)、2 mM CaCl2 與7 mM L-半胱胺酸(Merck))加入纖維蛋白原盤的孔中，之後再以TBS沖洗並以阻斷緩衝液(5％脫脂奶粉/PBS)終止反應。接著，將最終濃度200 nM的100 μL瑞替普酶-(3D5-scFv)加入每一孔中，並於室溫下培育1小時。接著將孔盤沖洗三次，並將與HPR複合的蛋白稀釋成1/5000後加入孔中，並於室溫下培育1小時。之後將孔沖洗三次，再加入100 μL的TMB受質緩衝液。5分鐘後，加入1 M HCl使顯色反應終止。以微量盤式分析儀測量在450 nm下的吸光值(OD)。
樂無喘(Xolair)是一種抗IgE抗體，在此作為陰性對照。利用與HPR複合的蛋白L來偵測重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽與瑞替普酶。圖7摘要整理的ELISA結果顯示，瑞替普酶-(3D5 scFv)可專一地結合到小鼠纖維素，但不會結合到小鼠纖維蛋白原。
實驗例14：重組(瑞替普酶)-(3D5 scFv)多肽在有游離纖維蛋白原時對人類纖維素之結合能力的ELISA分析
利用與上文實驗例所述相似的方式來進行ELISA分析，以評估當環境中存有200 mg/dL或400 mg/dLl人類纖維蛋白原時，重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽對人類纖維素的結合能力。
簡言之，人類纖維蛋白原以PBS稀釋後以每孔100 μL的量加入至96孔的聚苯乙烯微孔盤，之後將孔盤密封並於4°C下靜置一夜。
每一纖維素盤的製備方法如下。將100 μL的TBS (含最終濃度1.0 U/mL凝血酶(Sigma)、2 mM CaCl2 與7 mM L-半胱胺酸(Merck))加入纖維蛋白原盤的孔中，之後再以TBS沖洗並以阻斷緩衝液(5％脫脂奶粉/PBS)終止反應。接著，將100 μL最終濃度200 nM瑞替普酶-(3D5-scFv)與最終濃度200 mg/dL或400 mg/dL的人類纖維蛋白原之混合物加入每一孔中，並於室溫下培育1小時。接著將孔盤沖洗三次，並將與HPR複合的蛋白稀釋成1/5000後加入孔中，並於室溫下培育1小時。之後將孔沖洗三次，再加入100 μL的TMB受質緩衝液。5分鐘後，加入1 M HCl使顯色反應終止。以微量盤式分析儀測量在450 nm下的吸光值(OD)。
利用與HPR複合的蛋白L偵測重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽與瑞替普酶。圖8摘要整理的ELISA分析結果指出，在存有最終濃度200 mg/dL或400 mg/dL的游離纖維蛋白原時，瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽仍可專一地結合到人類纖維素。
實驗例15：重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽在PBS或人類血清中的血栓溶解活性
進行全血血栓溶解盤分析，以探究血栓溶解活性。簡而言之，透過靜脈穿刺從健康志願者體內收集人類血液，並注入檸檬酸三鈉中，最終濃度為3.2％w / v。利用凝血酶誘導血栓形成。在HEPES緩衝液(25 mM HEPES、137 mM NaCl)中，加入凝血酶(最終濃度6.25×10－3U)和氯化鈣(最終濃度67 Mm)，以得到新鮮製備的凝血混合物。將5 μL的凝血混合物沉積到96孔微孔盤(Costar)的孔底邊緣，然後添加25 μL血液。接著將孔盤密封並在37℃下培育1小時，以使血栓形成於孔的邊緣。
將瑞替普酶-IgG4.Fc以及瑞替普酶-(3D5-scFv)稀釋成為70 μL的PBS溶液。利用多通道吸量管在室溫下同時將70-μL的樣本加入至含有人類血栓的孔中並反應3分鐘。在移除樣本後，於孔中加入70 μL的人類血清或PBS，並利用微量盤式分析儀(Molecular Devices)測量在510 nm下的吸光值，由於溶解的血栓會逐漸覆蓋孔的中心位置，可藉以決定人類血栓的溶解程度。利用Graph Pad Prism軟體處理資料。
圖9的血栓溶解分析結果指出，瑞替普酶-(3D5 scFv)在人類血清中的血栓溶解活性優於在PBS中的活性。
實驗例16：重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽在最終濃度1 mM時的血栓溶解活性
將瑞替普酶-IgG4.Fc以及瑞替普酶-(3D5-scFv)稀釋成為70 μL的PBS溶液，最終濃度1 nM。利用多通道吸量管在室溫下同時將70-μL的樣本加入至含有人類血栓的孔中並反應3分鐘。在移除樣本後，於孔中加入70 μL的人類血清或PBS，並利用微量盤式分析儀(Molecular Devices)測量在510 nm下的吸光值，由於溶解的血栓會逐漸覆蓋孔的中心位置，可藉以決定人類血栓的溶解程度。利用Graph Pad Prism軟體處理資料。
圖10的血栓溶解分析結果指出，在最終濃度1 mM下，瑞替普酶-(3D5 scFv)的血栓溶解活性優於瑞替普酶-IgG4.Fc的活性。
實驗例17：重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽的標的效果
將瑞替普酶-IgG4.Fc以及瑞替普酶-(3D5-scFv)稀釋成為70 μL的PBS溶液，最終濃度30 nM。利用多通道吸量管在室溫下同時將70-μL的樣本加入至含有人類血栓的孔中並反應3分鐘。在移除樣本後，以250 μL PBS沖洗血栓3次，之後在孔中加入70 μL的人類血清，並利用微量盤式分析儀(Molecular Devices)測量在510 nm下的吸光值，由於溶解的血栓會逐漸覆蓋孔的中心位置，可藉以決定人類血栓的溶解程度。利用Graph Pad Prism軟體處理資料。
圖11的分析結果指出，瑞替普酶-(3D5 scFv)可標的到人類血栓，且即使經過沖洗處理，仍能夠發揮所欲的血栓溶解活性。相反地，對照組蛋白瑞替普酶-IgG4.Fc沒有標的效果，且經過沖洗後，幾乎沒有血栓溶解活性。
實驗例18：重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽的血栓溶解活性的劑量相依性
將瑞替普酶-(3D5-scFv)稀釋成為70 μL的PBS溶液，最終濃度5 nM、10 nM、20 nM與30 nM，並將瑞替普酶-IgG4.Fc稀釋成為70 μL的PBS溶液，最終濃度30 nM。利用多通道吸量管在室溫下同時將70-μL的樣本加入至含有人類血栓的孔中並反應3分鐘。在移除樣本後，以250 μL PBS沖洗血栓3次，之後在孔中加入70 μL的人類血清，並利用微量盤式分析儀(Molecular Devices)測量在510 nm下的吸光值，由於溶解的血栓會逐漸覆蓋孔的中心位置，可藉以決定人類血栓的溶解程度。利用Graph Pad Prism軟體處理資料。
圖12的分析結果指出，瑞替普酶-(3D5 scFv)可標的到人類血栓，且經過沖洗處理，即使在5 nM的濃度下，仍能夠發揮所欲的血栓溶解活性。另一方面，瑞替普酶-IgG4.Fc即使在30 nM的濃度下，也沒有血栓溶解活性。
實驗例19：重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽與瑞替普酶對人類血栓的血栓溶解活性的劑量相依性
利用與上述實驗例相似的方法進行全血血栓溶解分析，以比較重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽與瑞替普酶(MIRel®，購自Reliance Life Science)對人類血栓的血栓溶解活性。
將瑞替普酶以及瑞替普酶-(3D5-scFv)多肽稀釋成為70 μL的PBS溶液，最終濃度5 nM、10 nM、20 nM與30 nM。利用多通道吸量管在室溫下同時將70-μL的樣本加入至含有人類血栓的孔中並反應3分鐘。在移除樣本後，以250 μL PBS沖洗血栓3次，之後在孔中加入70 μL的人類血清，並利用微量盤式分析儀(Molecular Devices)測量在510 nm下的吸光值，由於溶解的血栓會逐漸覆蓋孔的中心位置，可藉以決定人類血栓的溶解程度。利用Graph Pad Prism軟體處理資料。
圖13A與13B的分析結果指出，在人類血漿中，濃度10 nM、30 nM、90 nM的瑞替普酶(圖13A)以及瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽(圖13B)仍能夠發揮血栓溶解活性。
圖13C的分析結果指出，在人類血漿中，濃度10 nM、30 nM、90 nM的重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽的血栓溶解活性優於瑞替普酶。
實驗例20：重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽對猴子血栓的血栓溶解活性
猴子血液購自國防大學(台北，臺灣)。利用與上文實驗例所述類似的方法，以人類凝血酶誘發猴子血栓形成。簡言之，在HEPES緩衝液(25 mM HEPES、137 mM NaCl)中，加入凝血酶(最終濃度6.25×10－3U)和氯化鈣(最終濃度67 Mm)，以得到新鮮製備的凝血混合物。將5 μL的凝血混合物沉積到96孔微孔盤(Costar)的孔底邊緣，然後添加25 μL血液。接著將孔盤密封並在37℃下培育1小時，以使猴子血栓形成於孔的邊緣。
將瑞替普酶-(3D5-scFv)多肽稀釋成為70 μL的PBS溶液。利用多通道吸量管在室溫下同時將70-μL的樣本加入至含有猴子血栓的孔中並反應3分鐘。在移除樣本後，於孔中加入70 μL的人類血漿或PBS，並利用微量盤式分析儀(Molecular Devices)測量在510 nm下的吸光值，由於溶解的血栓會逐漸覆蓋孔的中心位置，可藉以決定猴子血栓的溶解程度。利用Graph Pad Prism軟體處理資料。
圖14A的分析結果指出，在PBS中，濃度10 nM、20 nM、30 nM的重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽可溶解猴子血栓。
圖14B的分析結果指出，在人類血漿中濃度10 nM、20 nM、30 nM的重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽可溶解猴子血栓。
實驗例21：重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽與阿替普酶對人類纖維素的結合活性
利用與上述實驗例相似的方法進行ELISA分析，以比較重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽與阿替普酶(ACTILYSE®，購自Boehringer Ingelheim)對人類纖維素的結合活性。簡言之，人類纖維蛋白原以PBS稀釋後以每孔100 μL的量加入至96孔的聚苯乙烯微孔盤，之後將孔盤密封並於4°C下靜置一夜。
每一纖維素盤的製備方法如下。將100 μL的TBS (含最終濃度1.0 U/mL凝血酶(Sigma)、2 mM CaCl2 與7 mM L-半胱胺酸(Merck))加入纖維蛋白原盤的孔中，之後再以TBS沖洗並以阻斷緩衝液(5％脫脂奶粉/PBS)終止反應。接著，將100 μL最終濃度2、20或200 nM的瑞替普酶-(3D5-scFv)或阿替普酶加入每一孔中，並於室溫下培育1小時。接著將孔盤沖洗三次，並將與HPR複合的多株兔-抗-瑞替普酶抗體稀釋成1/200後加入孔中，並於室溫下培育1小時。之後將孔沖洗三次，再加入100 μL的TMB受質緩衝液。5分鐘後，加入1 M HCl使顯色反應終止。以微量盤式分析儀測量在450 nm下的吸光值(OD)。
利用與HPR複合的多株兔-抗-瑞替普酶抗體來偵測重組(3D5 scFv)-瑞替普酶多肽與阿替普酶。圖15摘要整理的結果指出，瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽可專一地結合到人類纖維素，但阿替普酶對人類纖維素並無結合活性。
實驗例22：重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽、阿替普酶以及瑞替普酶對人類血栓的血栓溶解活性
利用與上述實驗例相似的方法進行全血血栓溶解分析，以比較重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽、阿替普酶以及瑞替普酶對人類血栓的血栓溶解活性。
將瑞替普酶-(3D5-scFv)多肽稀釋成為70 μL的PBS溶液。利用多通道吸量管在室溫下同時將70-μL的樣本加入至含有人類血栓的孔中並反應3分鐘。在移除樣本後，於孔中加入70 μL的人類血漿或PBS，並利用微量盤式分析儀(Molecular Devices)測量在510 nm下的吸光值，由於溶解的血栓會逐漸覆蓋孔的中心位置，可藉以決定人類血栓的溶解程度。利用Graph Pad Prism軟體處理資料。
圖16A與16B的分析結果分別指出，重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽PBS與人類血漿中可溶解人類血栓。
實驗例23：重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽與阿替普酶的蛋白分解活性動力學
透過顯色分析來探討瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽與阿替普酶的蛋白分解活性動力學，本分析利用重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽與阿替普酶催化引發之血漿蛋白原轉變為纖維蛋白溶酶。簡言之，在96孔平底孔盤(Nunc)中，將不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2以及6.4 mM)的顯色受質CH3SO2-D-六氫酪氨酸-Gly-Arg-對硝基苯胺(CH3SO2-D-hexahydrotyrosine-Gly-Arg-p-nitroanilide·AcOH，購自Sigma)和含有瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽或阿替普酶的樣本於25°C下培育15分鐘。瑞替普酶的蛋白分解活性會使得受質水解，進而釋放出黃色的對硝基苯胺，可利用盤式分析儀讀取在405 nm下的吸光值。
圖17A的折線圖整理了此處提出的重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽與阿替普酶在所述受質濃度下的蛋白分解活性。圖17B為利用圖17A之數據所得之雙倒數圖(double-reciprocal plot，又稱Lineweaver-Burk圖)，而之後可以由Lineweaver-Burk計算得到其蛋白酶活性的[Km ]、[Vmax ]以及[Kcat ]數值。重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽的[Km ]、[Vmax ]以及[Kcat ]值分別是0.41 mM、170 nM/min以及0.85，而阿替普酶的[Km ]、[Vmax ]以及[Kcat ]值則分別是0.36 mM、155 nM/min以及0.775。這些資料顯示，瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽與阿替普酶兩者對顯色受質有相似的蛋白分解活性。
實驗例24：重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽在人類血漿中的安定性分析
為了探討瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽在人類血漿中的安定性，將瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽和10％或20％人類血漿一起培育3、6或24小時，之後進行ELISA分析。
利用與上文實驗例似的方法製備纖維素塗覆盤。簡言之，將96孔微孔盤塗覆人類纖維蛋白原(Sigma) (20 μg/mL)的PBS緩衝液(100 μL/孔)。在4°C下培育一夜後，以PBS緩衝液沖洗塗覆的孔盤。為了引發人類纖維素的交聯，將TBS緩衝溶液(含最終濃度1 U/mL人類α-凝血酶(Sigma)、2 mM CaCl2 與7 mM L-半胱胺酸(Merck))加入經塗覆的孔中，於37°C下培育1小時。以阻斷緩衝液阻斷反應後，將已於10％或20％的人類血漿中培育3、6或24小時的100 μL瑞替普酶-(3D5-scFv)加入每一孔中，並於室溫下再培育1小時。接著，將孔盤沖洗三次，並將與HPR複合的多株兔-抗-瑞替普酶抗體稀釋成1/200後加入孔中，並於室溫下培育1小時。之後將孔沖洗三次，再加入100 μL的TMB受質緩衝液。5分鐘後，加入1 M HCl使顯色反應終止。以微量盤式分析儀(Molecular Devices)測量在450 nm下的吸光值(OD)，並以Graph Pad Prism軟體處理資料。
圖18摘要整理的ELISA分析結果顯示，瑞替普酶-(3D5 scFv)在10％或20％的人類血漿中可保持安定。
實驗例25：重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽在植入血栓的小鼠模型中的標的效果
進行IVIS影像分析，以探究重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽在植入血栓的小鼠模型中的標的效果。為了監控小鼠模型中植入的血栓，在將人類血栓植入小鼠血管前，根據製造商的建議步驟，利用FITC標誌套組(Thermo Scientific)來標誌人類血栓。在384孔微孔盤(Axygen)中製備FITC-標誌的人類血栓以得到大小適合植入小鼠下腔靜脈(inferior vena cava，IVC)的人類血栓。簡言之，以最終濃度1 mg/mL的FITC染料標誌人類纖維蛋白原。將FITC-標誌的纖維蛋白原和4 μL人血混合。接著，以帶有凝血酶(最終濃度6.25×10-3U)與氯化鈣(最終濃度67 Mm)的HEPES緩衝液(25 mM HEPES、137 mM NaCl)來處理混合的血液樣本。之後，將5 μL的混合血液樣本加入384孔微孔盤的每一孔中，並將孔盤在37°C下培育1小時，以使人類血栓形成。
為了監控注入脂蛋白的位置，在進行重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽與瑞替普酶治療前，根據製造商的建議步驟，使用Dylight 680抗體標誌套組(Thermo Scientific)來標誌重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽與瑞替普酶。
8到10週齡的NOD-SCID小鼠購自中央研究院細胞與個體生物學研究所的實驗動物中心(台北，臺灣)。將經FITC-標誌的人類血栓植入小鼠下腔靜脈(IVC)。簡言之，在氧氣環境下，以異氟烷麻醉小鼠，並將小鼠置於保溫燈下以維持其生理體溫。剔除小鼠腹部毛髮並以70％變性酒精消毒。進行中位剖腹手術，之後將FITC-標誌的人類血栓置入IVC中。利用IVIS體內光譜成像系統(PerkinElmer)來觀察曝光的IVC。利用Living Image Software V3.2軟體，在ex/em = 459/520 (偵測FITC)或ex/em = 675/720 (偵測Dylight680)的條件下擷取螢光影像。利用IVIS光譜成像系統在指定時間擷取影像，並以Living Image軟體分析。
將小鼠分為每組兩隻小鼠，且分別經由眼眶靜脈竇注入約50 μL的256 nM Dylight680-標誌瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽(A組)或Dylight680-標誌瑞替普酶(B組)。在投予DyLight 680-標誌蛋白後的第0、5、10、20與30分鐘，擷取經植入人類血栓小鼠的螢光影像。
圖18A顯示5張A組小鼠的IVIS影像，其中圖框#1、#2是以ex/em = 675/720條件擷取，圖框#3、#4是以ex/em = 495/520條件擷取，而圖框#2、#4中的螢光信號合併後得到圖框#5。圖框#3、#4中的綠色螢光指出小鼠體內帶有FITC-標誌的人類血栓。另一方面，在剛注射Dylight680-標誌的瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽時(0分鐘)，圖框#1中沒有明顯的紅色螢光，但在注射後30分鐘，可以在圖框#2中觀察到強烈的紅色螢光。在圖框#5的綜合影像中，重疊的紅色與綠色信號代表Dylight680-標記瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽會集中在植入的人類血栓附近。
圖18B顯示5張B組小鼠的IVIS影像，其中圖框#1、#2是以ex/em = 675/720條件擷取，圖框#3、#4是以ex/em = 495/520條件擷取，而圖框#2、#4中的螢光信號合併後得到圖框#5。與圖18A類似，圖框#3、#4中的綠色螢光指出小鼠體內帶有FITC-標誌的人類血栓。然而，不論是剛投予Dylight680-標誌的瑞替普酶(圖框#1)或經過30分鐘後(圖框#2)，都無法觀察到紅色螢光。在圖框#5的綜合影像中只能觀察到綠色信號，這代表Dylight680-標記瑞替普酶不會集中在植入的人類血栓附近。
將在指定時間點獲取的影像的螢光強度相對於在0分鐘時以ex/em = 675/720條件獲取的參考影像進行標準化，以便根據輻射效率(radiant efficiency，R.E.)來定量Dylight680-標誌樣本的螢光強度。分析結果摘要整理於圖18C，其指出在小鼠模型中，此處提出的瑞替普酶-(3D5 scFv)能夠標的到小鼠IVC中的人類血栓，而瑞替普酶則無法有效地標的到小鼠IVC中的人類血栓。
實驗例26：利用ELISA分析重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽在大鼠體內的半衰期
將阿替普酶、瑞替普酶以及重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽以靜脈內注射到大鼠體內後，進行ELISA分析，以測定其半衰期。利用ELISA分析法，定量血清樣本中，阿替普酶、瑞替普酶以及重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽的濃度。6-週齡的Wistar大鼠係購自BioLasco (台北，臺灣)。將大鼠分成每組3隻，並分別透過靜脈注射500 μL的0.364 mg/kg藥物分子。
利用以下方法製備塗覆孔盤，以進行ELISA分析。將帶有最終濃度1.0 μg/mL多株兔-抗-瑞替普酶抗體(購自LTK BioLaboratories Co., Ltd.，桃園，臺灣)的100 μL之TBS緩衝液加入孔盤的個別孔中，之後將孔盤在4°C下培育18小時，接著再以TBS沖洗並以緩衝液(5％脫脂奶粉/PBS)阻斷反應。
接著，所收集到的血液樣本稀釋成不同濃度後，將100 μL的稀釋樣本加入各孔中，並在室溫下培育1小時。之後將孔盤沖洗三次；將100 μL之1.65 μg/mL與HPR複合的多株兔-抗-瑞替普酶抗體加入孔中，並於室溫下培育1小時。之後將孔沖洗三次，再加入100 μL的TMB受質緩衝液。5分鐘後，加入1 M HCl使顯色反應終止。以微量盤式分析儀測量在450 nm下的吸光值(OD)。
圖19為阿替普酶、瑞替普酶以及重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽的藥動學圖譜。由圖19可以看處，相較於阿替普酶以及瑞替普酶，此處提出的瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽於不同時點在大鼠血清中的蛋白含量較高。這些資料顯示，此處提出的重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽比起阿替普酶或瑞替普酶有較長的半衰期。
實驗例27：重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽在大鼠體內的半衰期
為了進一步探究重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽的半衰期，在靜脈內投予後，進行額外的蛋白分解分析。以瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽的蛋白分解活性，來決定重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽的血清含量，其步驟與上文實驗例所述相似。
6-週齡的Wistar大鼠係購自BioLasco (台北，臺灣)。將大鼠分成每組3隻，並分別透過靜脈注射500 μL的0.364 mg/kg重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽或阿替普酶。在靜脈投予後10、20、40與120分鐘收集血液樣本。
在96孔平底孔盤(Nunc)中，將0.8 mM的顯色受質CH3SO2-D-六氫酪氨酸-Gly-Arg-對硝基苯胺(Sigma)和稀釋的血液樣本(1/10)於25°C下培育15分鐘。此處提出的瑞替普酶或阿替普酶的蛋白分解活性會使得受質水解，進而釋放出黃色的對硝基苯胺，可利用盤式分析儀讀取在405 nm下的吸光值。
圖20為重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽與阿替普酶的藥動學圖譜。由圖20可以看處，相較於阿替普酶，本案提出的瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽在大鼠血清中有較高的蛋白含量。有鑑於此，此處提出的重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽比起阿替普酶有較長的半衰期，此一結果亦與前述實驗例的結果相符。
實驗例28：重組(3D5 scFv)-瑞替普酶多肽的製備
將對人類纖維素專一的3D5 scFv透過一彈性連接物接合到瑞替普酶的N-端，以建構重組(3D5 VL -(G4S)3-VH scFv α 纖維素)-瑞替普酶多肽。利用Expi293F胞系表現所建構的基因以及純化所表現之多肽的步驟，如上文實驗例所述。。
所述scFv的配置為VL -連接物-VH ，其中兩個結構域透過彈性連接物而結合。重組多肽的胺基酸序列如序列編號：14所示。利用SDS-PAGE來鑑定此一新的構建體。圖21A的10％非還原SDA-PAGE分析結果顯示樣本(第2道)中含有分子量約71 kDa的期望產物。
為了比較重組(3D5 scFv)-瑞替普酶多肽對人類纖維蛋白原以及纖維素結合能力，進行ELISA分析，其步驟與上文實驗例所述相似。
利用與HPR複合的多株兔-抗-瑞替普酶抗體來偵測重組(3D5 scFv)-瑞替普酶多肽。圖21B摘要整理的結果指出，本案的(3D5 scFv)-瑞替普酶多肽可專一地結合到人類纖維素而不是人類纖維蛋白原。
實驗例29：重組(3D5 scFv)-瑞替普酶多肽對人類血栓之血栓溶解活性的劑量依存性
為了評估重組(3D5 scFv)-瑞替普酶多肽對人類血栓的血栓溶解活性，採用與上文實驗例相似的步驟進行全血血栓溶解分析。
將重組(3D5 scFv)-瑞替普酶多肽在70 μL的PBS中稀釋為最終濃度12.5 nM、25 nM與50 nM。利用多通道吸量管在室溫下同時將70-μL的樣本加入至含有人類血栓的孔中並反應3分鐘。在移除樣本後，以250 μL的PBS沖洗血栓三次，之後在孔中加入70 μL的人類血清，並利用微量盤式分析儀(Molecular Devices)測量在510 nm下的吸光值，由於溶解的血栓會逐漸覆蓋孔的中心位置，可藉以決定人類血栓的溶解程度。利用Graph Pad Prism軟體處理資料。
圖22摘要整理的分析結果顯示，在12.5 nM、25 nM與50 nM的濃度下，(3D5 scFv)-瑞替普酶多肽可標的到人類血栓，並可發揮血栓溶解活性。
當可理解，上文實施方式的說明僅為例示，且本發明所屬技術領域具有通常知識者可對其進行各種修飾。上文的說明、實驗例與資料完整地說明了本發明例示性實施方式的結構與用途。雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下。
圖1A是對人類纖維素專一的噬菌體呈現scFv的病毒效價分析結果；圖1B是對人類纖維素專一的噬菌體呈現之D10 scFv的單菌落ELISA分析結果。
圖2是純化的對人類纖維素專一抗體102-10以及3D5的ELISA分析結果。
圖3是純化的重組瑞替普酶-(3D5 VL -彈性連接物-VH scFv α 纖維素)以及瑞替普酶-(102-10 scFv α 纖維素)的SDS-PAGE分析結果。
圖4是純化的重組瑞替普酶-(3D5 VL -218-VH scFv α 纖維素)的SDS-PAGE分析結果。
圖5A是儲存三天或六天後之純化的重組瑞替普酶-(3D5 scFv)的SDS-PAGE分析結果；圖5B是儲存一個月後之純化的重組瑞替普酶-(3D5 scFv)的SDS-PAGE分析結果；圖5C是儲存三天或六天後之純化的重組瑞替普酶-(3D5 scFv)的ELISA分析結果。
圖6是瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽對人類纖維素以及對經人類第XIIIa型凝血因子處理的交聯纖維素的ELISA分析結果。
圖7是重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽對小鼠纖維素結合能力的ELISA分析結果。
圖8是重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽在存有游離纖維蛋白原時，對人類纖維素的結合能力的ELISA分析結果。
圖9顯示重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽在PBS或人類血清中的血栓溶解活性。
圖10顯示重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽在最終濃度1 mM時的血栓溶解活性。
圖11顯示重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽的標的效果。
圖12顯示重組瑞替普酶-(3D5 scFv)的劑量相依血栓溶解活性。
圖13A至13C顯示瑞替普酶-(3D5 scFv)對人類血栓的血栓溶解活性。
圖14A以及14B顯示瑞替普酶-(3D5 scFv)對猴子血栓的血栓溶解活性。
圖15的柱狀圖顯示瑞替普酶-(3D5 scFv)與阿替普酶對人類纖維素的結合親和力。
圖16A以及16B顯示瑞替普酶-(3D5 scFv)、瑞替普酶與阿替普酶對人類血栓的血栓溶解活性。
圖17A以及17B顯示瑞替普酶-(3D5 scFv)與阿替普酶的蛋白分解活性。
圖18A以及18B為經瑞替普酶-(3D5 scFv)或瑞替普酶處理之小鼠的IVIS影像圖；圖18C的折線圖顯示瑞替普酶-(3D5 scFv)的標的效果。
圖19顯示阿替普酶、瑞替普酶與重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽的藥動學圖譜。
圖20顯示阿替普酶與重組瑞替普酶-(3D5 scFv)多肽的藥動學圖譜。
圖21A是純化的重組(3D5 VL -(G4S)3-VH scFv α 纖維素)-瑞替普酶多肽的SDS-PAGE分析結果；圖21B顯示重組3D5 VL -(G4S)3-VH scFv α 纖維素)-瑞替普酶多肽對人類纖維素的結合力之ELISA分析結果。
圖22顯示重組(3D5 scFv)-瑞替普酶多肽對人類血栓的劑量相依血栓溶解活性。
根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。此外，在不同圖式間，以相同或相似的元件符號來指稱相似的元件/部件。
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Claims (20)

  1. 一種多肽，包含一抗纖維素抗體與一人類組織性血漿蛋白原活化因子的絲胺酸蛋白酶部分，其中該抗纖維素抗體與人類纖維素的結合親和力比其與人類纖維蛋白原的結合親和力高十倍。
  2. 如請求項1所述之多肽，其中該多肽與人類纖維素的結合親和力比該人類組織性血漿蛋白原活化因子與人類纖維素的結合親和力高。
  3. 如請求項1所述之多肽，其中該抗纖維素抗體為一單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)或單域抗體(single-domain抗體，sdAb)。
  4. 如請求項1所述之多肽，其中該抗纖維素抗體為人類抗體或人源化(humanized)抗體。
  5. 如請求項1所述之多肽，其中該人類組織性血漿蛋白原活化因子的絲胺酸蛋白酶部分為瑞替普酶。
  6. 如請求項1所述之多肽，其中該抗纖維素抗體有一輕鏈可變區域以及一重鏈可變區域，其分別具有如序列編號：1、2、序列編號：17、18、序列編號：19、20或序列編號：21、22所示的胺基酸序列。
  7. 如請求項6所述之多肽，更包含一連接物，其具有如序列編號：16所示之序列，用以連接該抗纖維素抗體的該輕鏈可變區域與該重鏈可變區域。
  8. 如請求項1所述之多肽，其中該多肽於動物體內的血清半衰期比瑞替普酶長。
  9. 如請求項1所述之多肽，其中該多肽與人類纖維素的結合親和力比該人類組織性血漿蛋白原活化因子與人類纖維素的結合親和力高，且於於動物體內的血清半衰期比瑞替普酶長。
  10. 如請求項1所述之多肽，更包含一連接物，位於人類組織性血漿蛋白原活化因子的絲胺酸蛋白酶部分以及該抗纖維素抗體之間。
  11. 如請求項1所述之多肽，其中該人類組織性血漿蛋白原活化因子的絲胺酸蛋白酶部分連接至該抗纖維素抗體的N-端。
  12. 如請求項11所述之多肽，其中該多肽的胺基酸序列如序列編號：11或12所示。
  13. 如請求項1所述之多肽，其中該人類組織性血漿蛋白原活化因子的絲胺酸蛋白酶部分連接至該抗纖維素抗體的C-端。
  14. 如請求項13所述之多肽，其中該多肽的胺基酸序列如序列編號：14所示。
  15. 請求項1至14任一項所述之該多肽於製備用以治療一有需要個體之血栓之藥物的用途。
  16. 一種抗纖維素抗體，其中該抗纖維素抗體與人類纖維素的結合親和力比其與人類纖維蛋白原的結合親和力高十倍。
  17. 如請求項16所述的抗纖維素抗體，其中該抗纖維素抗體有一輕鏈可變區域以及一重鏈可變區域，其分別具有如序列編號：1、2、序列編號：17、18、序列編號：19、20或序列編號：21、22所示的胺基酸序列。
  18. 如請求項16所述的抗纖維素抗體，更包含一連接物，其具有如序列編號：16所示之序列，用以連接 該抗纖維素抗體的該輕鏈可變區域與該重鏈可變區域。
  19. 如請求項16所述的抗纖維素抗體，其中該抗纖維素抗體包含六個互補決定區(complementarity-determining region，CDR)，其分別具有對應於以下序列之胺基酸序列：序列編號：1的第30至32個胺基酸殘基(CDR-L1)、序列編號：1的第49至54個胺基酸殘基(CDR-L2)、序列編號：1的第91至96個胺基酸殘基(CDR-L3)、序列編號：2的第30至33個胺基酸殘基(CDR-H1)、序列編號：2的第50至59個胺基酸殘基(CDR-H2)以及序列編號2的第98至106個胺基酸殘基(CDR-H3)。
  20. 如請求項16所述的抗纖維素抗體，其中該抗纖維素抗體為一單鏈可變片段(scFv)或單域抗體(sdAb)。
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