JP2000506854A - 標的化治療剤または診断剤ならびにその製造および使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、以下の１つに結合する治療的または診断的な機能的物質(a)を含む標的化治療剤または診断剤を提供する：選択された標的に特異的に結合する単離されたペプチド模倣物(a)；選択された標的に特異的に結合する単離され、最適化された高親和性ポリアミノ酸(b)；選択された標的に特異的に結合する単離されたタンパク質表面ループ(c)、ここで、タンパク質表面ループは、機能的物質に対して内因性ではない。本発明はさらに、標的に対して治療剤または診断剤を標的する方法を提供する。本発明の薬剤を用いる血小板に治療剤を標的化する方法および血餅に関する疾患および障害を処置する方法をさらに提供する。表面ループがモノクローナル抗体Fab-9のHCDR3であり、そして第２のタンパク質がヒト組織型プラスミノゲンアクチベーター（t-pA）であり、そして標的が血小板島タンパク質GPIIb/IIIa（インテグリンαIIbβ1）である組換え標的タンパク質を特に提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 標的化治療剤または診断剤ならびにその製造および使用方法 本発明は、National Institute of Healthにより授与されたGrant RO1 HL5247 5、PO1 HL31950、RO1 CA56483およびRO1 AR42750の下、政府支援により行われた 。政府は、本発明に特定の権利を有する。 発明の背景 発明の分野 本発明は、被験体中のある部位に対する標的治療物質または診断物質の分野に 関する。従って、本発明は、タンパク質および核酸のような治療剤の標的化送達 、および被験体中の有用な部位への診断剤を標的化することに関する。 背景技術 新規なタンパク質−タンパク質相互作用を作製する能力の発達は、重要な新し い治療剤、存在する治療剤または診断剤を特定の部位へ標的化するための新規な ストラテジー、および重要な生物学的プロセスを研究するための独特な手段およ び試薬を提供することを約束する。タンパク質操作におけるこのような進歩はま た、どのようにタンパク質が相互作用するかについて生産的な（seminal）情報 を提供し得る。タンパク質／タンパク質相互作用を操作するための一つのストラ テジーは、結合親和性および特異性のために重要なアミノ酸残基を同定するため に、ランダムまたはほぼランダムな（例えば、アラニンスキャニング）(1)部位 特異的変異誘発を用いた。個々の変異タンパク質の扱いにくい大規模変異誘発の 努力に続く、困難な時間のかかるアッセイは、時々このアプローチを拡大し、そ して新しい分子相互作用を作製し得る。例えば、ヒト増殖ホルモンにおける各残 基を、分子再操作の前にプロラクチンレセプター(2)に結合する活性についてス キャンし、そして同様のストラテジーが、IL-3αβレセプター(3)に結合するも のよりも高い親和性で単量体αレセプターに結合するIL-3の改変体の構築を容易 にした。従って、最近の重要な挑戦は、新しい結合特性を有するタンパク質を操 作するために、より迅速かつ効率的なストラテジーを作製することである。個々 の変異タンパク質を用いた多数の結合アッセイを行うための必要性を回避し得る 最近のアプローチは、ファージディスプレー系を用いるバイオパニングである。 元は大量のペプチドモチーフ(4)のスクリーニング手段として考案されたにも関 わらず、全タンパク質およびタンパク質中のドメインは、ファージ選択ストラテ ジー(5)を用いて操作され得ることが現在明白である。しかし、ファージディス プレーそれ自体がまた、しばしばそれが完全に一般的なアプローチであることを 妨げる厳しい制限を受ける；例えば、多くのタンパク質が生物学的に活性な形態 においてファージの表面上でディスプレーされ得ず、そしてファージ上にディス プレーされたタンパク質のタンパク質分解に伴う重大な問題がまた、頻繁に経験 されている。 タンパク質／タンパク質相互作用を改変するために使用されている別のストラ テジーは、付加、欠失、またはタンパク質中のドメイン全体の置換(6〜12)であ る。しばしば成功するにも関わらず、このストラテジーは、タンパク質／タンパ ク質相互作用の非常に低い解析像を提供する；従って、ドメイン全体の操作に、 しばしば上記のような多数の点変異体の構築および分析が続く。厳しい制限がま た、目的のタンパク質ドメインが一つ以上の重要な生物学的活性を有する場合に 生じる；別のもの（例えば、補因子またはレセプターへの高親和性結合）を改変 している間に、一つの活性（例えば、機能的に重要なドメイン／ドメイン相互作 用）を維持することは、問題であり得る。 本発明は、これらの制限の両方を克服するために設計された。本方法において 、生物学的活性構造は、ファージディスプレー研究において良好に機能する条件 で一つ以上のタンパク質状況において同定され、次いで目的の他のタンパク質に 接合される。このような系は、研究される各タンパク質のための新しいライブラ リーを作製する必要性を排除する。詳細には、本発明は、タンパク質ドメイン、 またはその模倣物で、ドメイン全体ではなくむしろ限定された構造的エレメント をタンパク質間で移動させる方法を提供する。本発明は、しばしばタンパク質結 合現象を誘導する可動性タンパク質ループ構造(13)の接合を示す。可動性ループ は、ほとんどのタンパク質モジュールの表面において見出され、そして限定され た２ 次構造の領域に連結する４〜20アミノ酸長として存在する。結晶学的およびNMR 研究はこれらのループが通常ヘリックスおよびβシートよりも良好に限定されな いことを示すにも関わらず、これらの形態的自由度は、遊離ペプチドと比較して 通常実質的に制限されている。従って、タンパク質における表面ループの結合活 性は、対応する直鎖アミノ酸配列(14)の結合活性とは通常有意に異なる。 タンパク質操作が選択されたタンパク質の新規な結合活性を与えるために使用 され得る速度および効率を実質的に増加するために、本方法は、ファージディス プレーおよびループ接合を組み合わせるストラテジーを適用する。本発明の一つ の実施態様において、組織型プラスミノーゲンアクチベーターの上皮増殖因子(E GF)ドメイン中の表面ループのアミノ酸が、接着性インテグリンレセプターα_IIb β₃に対して指向されるモノクローナル抗体の一つのCDRを形成する残基で置換さ れ、そして変異誘発およびファージディスプレー系を用いる「親和性成熟(affin ity maturation)」または「最適化」に供されている。得られたt-PA、LG-t-PAの 変異体は、ナノモルの親和性でα_IIbβ₃に結合し、合成および天然基質の両方に 対して完全な活性を有し、そして補因子フィブリンにより正常に刺激される。そ の新規なインテグリン結合能力により、この新しいt-PAの変異体は、急性心筋梗 塞に関与する血小板に富んだ血栓に対する増強された血栓溶解性能力を示し得る 。 得られたt-PA、LG-t-PAの変異体は、急性心筋梗塞および他の血栓塞栓疾患の 処置のための血栓溶解性薬剤を提供する。フィブリンまたは血小板インテグリン のいずれかに対して指向する抗体または抗体のFabフラグメントに酵素を結合す ることにより、血餅にプラスミノーゲンアクチベーターを標的させるための努力 は、以前報告されており、そしてしばしばこのストラテジーは、インビトロおよ びインビボの両方でプラスミノーゲンアクチベーターの血栓溶解能力を増強し得 ることが示されている。例えば、Mab 7E3(抗IIb-IIIa)とウロキナーゼとの化学 的結合は、血小板に富む血餅溶解において野生型ウロキナーゼ(36)より25倍以上 強力な分子を生じる。従って、LG-t-PAは、その新規な結合能力により、急性心 筋梗塞に関与する血小板に富む動脈血栓に対する増強した能力のために使用され 得る。 発明の要旨 本発明は、選択された標的に特異的に結合する単離されたペプチド模倣物(b) に結合する治療的または診断的な機能的物質(a)を含む標的化治療剤または診断 剤薬を提供する。本発明はさらに、選択された標的に特異的に結合する単離され 、最適化された、高親和性ポリアミノ酸(b)に結合する治療的または診断的な機 能的物質(a)を含む標的化治療剤または診断剤を提供する。本発明はさらに、選 択された標的に特異的に結合する単離されたタンパク質表面ループに結合する治 療的または診断的な機能的物質(a)（ここで、タンパク質表面ループは、機能的 物質に対して内因性、または天然ではない）を含む標的化治療剤または診断剤を 提供する。 本発明はさらに、(a)標的に特異的に結合する表面ループを有する第１のタン パク質由来の表面ループおよび(b)第２のタンパク質の機能的モチーフまたはド メインを含む組換え標的タンパク質を提供する。 本発明は、表面ループがモノクローナル抗体Fab-9のHCDR3であり、第２のタン パク質がヒト組織型プラスミノゲンアクチベーター（t-pA）であり、そして標的 が血小板糖タンパク質GPIIn/IIIa（インテグリンα_IIbβ₃）である組換え標的タ ンパク質を提供する。従って、本発明は、血小板標的組織プラスミノーゲンアク チベーターを提供する。 本発明は、以下の工程を包含する被験体における血餅を減少させる方法を提供 する：モノクローナル抗体Fab-9のHCDR3由来の表面ループ(a)、およびヒト組織 型プラスミノーゲンアクチベーター(t-pA)の機能的モチーフまたはドメイン(b) を含むタンパク質の治療的用量を被験体に投与する工程、それによりタンパク質 を被験体における血餅における血小板の糖タンパク質GPIIn/IIIa（インテグリン α_IIbβ₃）に結合させ、そして被験体における血餅を減少させる。 本発明はさらに、以下の工程を包含する被験体において血栓症を予防するかま たは血栓溶解を促進する方法を提供する：モノクローナル抗体Fab-9のHCDR3由来 の表面ループ(a)、およびヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター(t-pA)の 機能的モチーフまたはドメイン(b)を含むタンパク質の治療的用量を被験体に投 与する工程、それによりタンパク質を被験体における血餅における血小板当タン パク質GPIIb/IIIa（インテグリンα_IIbβ₃）結合させ、そして被験体における血 栓症を予防する。 本発明はさらに、以下の工程を包含する被験体における心筋梗塞を治療するか または予防する方法を提供する：モノクローナル抗体Fab-9のHCDR3由来の表面ル ープ(a)およびヒトプラスミノゲンアクチベーター（t-pA）の機能的モチーフま たはドメイン(b)を含むタンパク質の治療適用量を被験体に投与し、それにより タンパク質を被験体の血小板に結合し、そして被験体の心筋梗塞を治療または予 防する工程。 本発明はさらに、以下の工程を包含する治療化合物を被験体における腫瘍に標 的化する方法を提供する：モノクローナル抗体Fab-9の重鎖相補性決定領域３(HC DR3)に結合した標的化治療的または診断的な機能的物質（治療的または診断的物 質は、抗腫瘍治療化合物である）を含む治療剤を被験体に投与する工程。 本発明はまた、以下の工程を包含する治療タンパク質を被験体における腫瘍に 標的化する方法を提供する：モノクローナル抗体Fab-9のHCDR3に結合した抗腫瘍 治療タンパク質を含む組換え標的タンパク質を被験体に投与する工程。 図の簡単な説明 図１は、Kohdaら(28)より適用したマウス表皮増殖因子のNMR構造の図である。マ ウスタンパク質の残基23は、ヒトt-PAの残基65に対応する。マウスタンパク質の 残基23〜28により形成されるβターンは、t-PAにおいては、大きな矢印により示 した位置での３アミノ酸挿入(⁶⁷YFS⁶⁹)の発生により延長され得る。LG-t-PAの置 換された１次配列および野生型t-PAの対応する領域を、図の下方に示した。LG-t -PA配列におけるダッシュは、野生型酵素との同一性を示す。 図２は、緩衝液(□)、フィブリンモノマー(◇)、フィブリノゲン(△)、またはフ ィブリノゲンのシアノゲンブロマイドフラグメント(○)の存在下での野生型およ びLG-t-PAによるプラスミノーゲン活性化の標準的な間接的発色性アッセイを示 す。 図３は、方法に記載されたように精製したインテグリンを用いて計測したLG-t-P Aの血小板インテグリンαIIbβ3への結合を示す。非特異的結合を、10mM EDTA との平行したインキュベーションにより決定した。LG-t-PA結合の絶対量を、LG- t-PAの特異的活性に基づいて計算した。 図４は、RGD含有ペプチドがLG-t-PAの血小板インテグリンαIIbβ3への結合をブ ロックすることを示す。結合アッセイを、実施例に記載したように行った。LG-t -PAの血小板インテグリンαIIbβ3への結合を、配列GRGDSP(□)またはSPGDRG(◇ )の合成ペプチドを用いてチャレンジした。 発明の詳細な説明 本発明は、標的化治療剤または診断剤を提供する。本発明は、選択された標的 に特異的に結合し、かつ、タンパク質またはペプチド結合領域に由来するかまた はこれに基づく単離された標的化モチーフまたはドメイン(b)に結合した治療的 または診断的な機能的物質(a)を包含する。このような標的化モチーフまたはド メインは、ペプチド模倣物またはタンパク質の表面ループを含み得る。このよう な標的化モチーフまたはドメインは、タンパク質の結合領域由来のポリアミノ酸 を含み得る。この結合領域は、天然のタンパク質から単離され、そしてその天然 のタンパク質の元の結合領域よりも高い親和性に最適化されている。「標的化モ チーフまたはドメイン」は、モチーフまたはドメインを任意の特定の長さまたは サイズに制限することを意図せず、または示さない限り、任意の特定の２次構造 または任意の全ての２次構造を意味することを意図しない。 例えば、本発明は、タンパク質がその機能を保持し、そして表面ループがその 天然のタンパク質に与えた表面ループの標的化能力を獲得するように、表面ルー プが機能的タンパク質に接合されている組換えタンパク質を提供する。この組換 えタンパク質の特定の例は、変化させた組織型プラスミノーゲンアクチベーター (LG-t-PA)である。ここで、組織型プラスミノーゲンアクチベーターの上皮増殖 因子(EGF)ドメインが、接着性インテグリンレセプターα_IIbβ₃に対して指向す るモノクローナル抗体の一つのCDRを形成する残基で置換され、そして変異誘発 およびファージディスプレー系を用いる「親和性成熟」または「最適化」に供さ れている。本発明は、このような組換えタンパク質およびこれらの組換えタンパ ク質をコードする核酸を含む組成物をさらに提供する。さらに、本発明は、これ ら の組換えタンパク質の作製および使用方法を提供し、本方法は、血栓疾患の処置 および急性心筋梗塞の処置または予防の方法を含む。Ａ．一般的考察 多くの治療剤および診断剤の固有の制限は、これらの物質を特定の部位、組織 、または体内の病理学的病変に送達不可能なことである。従って、本発明のよう なこれらの物質の正確かつ選択的な送達を促進する進歩は、多くの治療レジメン および診断レジメンの効力の増強を約束する。特異的標的化は、タンパク質／タ ンパク質相互作用に関する詳細な情報の入手および活用により、本発明において 達成される。 タンパク質−タンパク質相互作用は、タンパク質の表面ループ間の接触により 導かれ得る。本発明は、新規なタンパク質−タンパク質相互作用が、一つのタン パク質上の生物学的に活性な可動性ループのアミノ酸配列を、関連しないタンパ ク質上に存在する表面ループを置換するのに用いる、「ループ接合」のストラテ ジーを用いて作製され得ることを実証する。 このストラテジーを実証するために、上皮増殖因子モジュール中の表面ループ がモノクローナル抗体の相補性決定領域(CDR)と置換された。詳細には、Fab-9（ β３インテグリンとナノモルの親和性で結合することで選択された抗体）(Smith ,J.W.，Hu，D.,Satterthwait，A.，Pinz-Sweeney,S.，およびBarbas，C.F.(1994 );J．Biol．Chem．269，32788-32795)由来のHCDR3が、ヒト組織型プラスミノー ゲンアクチベーター(t-pA)のEGF様モジュールへ接合された。生じたt-PAの改変 体は、ナノモルの親和性で血小板インテグリンα_IIbβ₃に結合し、完全な酵素活 性を保持し、そして正常に生理学的補因子フィブリンにより刺激された。新規な t-PAの改変体のインテグリンα_IIbβ₃への結合は、２価カチオンの存在に依存し 、そしてRGD含有ペプチドにより阻害され、ドナー抗体のように、新規t-pAがイ ンテグリンのリガンド結合部位に特異的に結合することを実証した。 これらの知見は、タンパク質モジュール中の表面ループが、互換可能であるこ と、およびファージディスプレーがループ接合に組み合わされ得て、選択された 標的に高い親和性でタンパク質を指向し得ることを実証する。これらの標的は、 他のタンパク質のみでなく、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、または特定の細 胞型、組織、またはウイルスの特徴付けられていないマーカーさえもを包含し得 る。 本実施例は、タンパク質ループ接合ストラテジーの実行可能性を実証する。t- PA、LG-t-PAの生じる改変体は、急性心筋梗塞および他の血栓塞栓性疾患の処置 のための改善された血栓溶解剤を提供する。プラスミノーゲンアクチベーターを 血餅へ標的化する以前の努力は、しばしばこのような標的化がインビトロおよび インビボの両方でプラスミノーゲンアクチベーターの血栓溶血能力を増強し得る ことを実証した。従って、LG-t-PAはまた、その新規な結合特性により、急性心 筋梗塞に関与する血小板に富む動脈血栓を溶解する組成物の能力の増強ために利 用され得る。Ｂ．定義 明細書および請求の範囲において使用されるように、「a」は、それが使用さ れる文脈に依存して、一つ以上を意味し得る。 アミノ酸残基は、そのペプチド結合でポリペプチドの化学的消化（加水分解） により形成されたアミノ酸である。本明細書に記載されるアミノ酸残基は、好ま しくは「Ｌ」異性体型である。しかし、「Ｄ」異性体型の残基が、所望の機能的 特性がポリペプチドにより保持される限り、任意のＬアミノ酸残基が置換され得 る。標準的なポリペプチドの学名(J ．Biol．Chem.，243:3552-59(1969)に記載さ れ、そして37CFR第１章、822(b)(2)に適用した)に従うために、アミノ酸残基に ついての記号を以下の表Ｉに示す。 表Ｉ 記号 アミノ酸 １文字 ３文字 Ｙ Tyr チロシン Ｇ Gly グリシン Ｆ Phe フェニルアラニン Ｍ Met メチオニン Ａ Ala アラニン Ｓ Ser セリン Ｉ Ile イソロイシン Ｌ Leu ロイシン Ｔ Thr トレオニン Ｖ Val バリン Ｐ Pro プロリン Ｋ Lys リジン Ｈ His ヒスチジン Ｑ Gln グルタミン Ｅ Glu グルタミン酸 Ｚ Glx Gluおよび／またはGln Ｗ Trp トリプトファン Ｒ Arg アルギニン Ｄ Asp アスパラギン酸 Ｎ Asn アスパラギン Ｂ Asx Asnおよび／またはAsp Ｃ Cys システイン Ｘ Xaa 未知またはその他 全てのアミノ酸残基配列は、本明細書において式により表され、その左右の方 向はアミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向である。さらに、アミノ酸残 基配列の最初または最後のダッシュは、一つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列 のペプチド結合を示すことに留意されるべきである。 「ポリペプチド」は、連続するアミノ酸残基のαアミノ基とカルボキシル基と の間でペプチド結合により互いに結合された一連の線状のアミノ酸残基をいい、 そしてタンパク質であり得る。 「ペプチド」は、ポリペプチドでそうであるように、互いに結合した、約50ア ミノ酸残基よりも少ないかまたは等しい一連の線状をいう。合成ペプチドは、化 学的に産生された、ペプチド結合により一緒に連結された、アミノ酸残基の鎖で ある。 「ポリアミノ酸」は、ポリペプチドにおいてそうであるように、互いに結合し た、一連の線状のアミノ酸残基をいう。 タンパク質は、ポリペプチドにおいてそうであるように、互いに結合した一連 の線状の約50よりも多いアミノ酸残基をいう。 「ペプチド模倣物」は、化学的化合物、または有機分子、または任意の他のペ プチド模倣物を含み、その構造は、タンパク質の結合領域に基づくかまたはそれ に由来すると定義される。例えば、予測される化学構造をモデリングして、タン パク質表面ループのような結合領域の構造を模倣し得る。このようなモデリング は、標準的な方法を用いて実施され得る。あるいは、ペプチド模倣物はまた、ペ プチドとほとんど同じ方法でコンビナトリアル化学ライブラリーから選択され得 る。(Ostresh，J.M.ら、Proc Natl Acad Sci USA 1994年11月、8;91(23):11138- 42;Dorner,B.ら、Bloorg Med Chem 1996年５月;4(5):709-15;Eichler，J.ら、Me d Res Rev 1995年11月;15(6):481-96;Blondelle，S.E.ら、Biochem J1996年１月 、1;313(第１部):141-7;Perez-Paya，E.ら、J Biol Chem 1996年２月、23;271(8 ):4120-6) 「表面ループ」は、タンパク質の結合（すなわち、標的化）エレメントとして 定義され、そのエレメントは天然のタンパク質における約２から約20アミノ酸の 可動性ループであり、天然のタンパク質の規定された２次構造の領域と結合する か、または２次構造のドメインおよび天然のタンパク質の末端とを結合するかの いずれかであり、そしてそのエレメントは一つ以上の部位への結合について選択 的である。請求の範囲において使用されるように、表面ループは、表面ループと して残存するような様式（例えば、表面ループが、非天然の機能的タンパク質の 除去された表面ループを置換するように、または非天然の機能的タンパク質の規 定された２次構造の２つの領域の間、もしくは２次構造のドメインと非天然の機 能的タンパク質の末端との間いずれかに、表面ループが挿入されるように）で、 非天然の機能的タンパク質への挿入の際その結合特徴を１つ以上保持している。 「治療的または診断的な機能的物質」は、被験体における標的された部位への 送達が、治療的利点および／または診断的価値を有し、そしてその物質はペプチ ド模倣物またはポリアミノ酸に結合され得る、任意の医学的、診断的、薬学的ま たは生物学的物質として定義される。治療的または診断的な機能的物質の例とし ては、以下が挙げられる。核酸；タンパク質；ペプチド；遺伝子送達ビヒクル（ 例えば、プラスミド、ウイルス、リポソーム複合体）；合成または天然に存在す る酵素（例えば、プロテアーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、P450、または他の 薬物代謝酵素、スーパーオキシドジスムターゼまたは酸化窒素合成酵素）；血栓 溶解剤（例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター、uPA、チスイコウモリt PA、スタフィロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アシル化ストレプトキナーゼー プラスミノーゲン複合体、または上記の任意の改変体）；抗凝固剤（例えば、血 液凝固カスケードのメンバーのインヒビター、インテグリン接着レセプターのア ンタゴニスト、プロテインＣまたは活性化プロテインＣ、組織因子経路インヒビ ター、または第VII因子、第Ｘ因子、もしくはトロンビンのような凝血酵素の改 変体、血小板機能のインヒビター、第XII因子のインヒビター、凝血に関与する タンパク質の活性を調節する化合物（例えば、ヘパリン）、または上記の任意の 改変体）；化学療法薬剤（例えば、ドキソルビシン（または等価物））；アポト ーシス剤；医薬；化学化合物；増殖因子；サイトカイン；細胞表面レセプターの ための他のリガンド；炭水化物、脂質、特徴付けられていないマーカーおよび標 的、薬物送達系（例えば、小型化浸透圧薬物送達ポンプ）、造影剤（例えば、外 部から検出し得る放射性化学薬品、蛍光性化学薬品、金属イオン）。 治療剤または診断剤の結合のための標的は、以下の任意の領域であり得る；組 織；器官；細胞；ウイルス；細胞内小器官；微生物；合成または天然に存在する 分子または高分子（例えば、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、核酸、な らびにそれらの修飾された改変体（例えば糖タンパク質、リン酸化タンパク質、 糖脂質、ホルモン））；タンパク質（例えば、酵素およびそのインヒビター、転 写因子、キナーゼ、ホスファターゼ、血中に見出される任意のタンパク質、接着 タンパク質、細胞外基質の成分、レセプターまたは他の細胞表面タンパク質、ア ルブミン、IgG様分子および抗体、増殖因子、サイトカインおよび血管形成の調 節因子）；細胞表面タンパク質（例えば、インテグリン、カドヘリン、増殖因子 レセプター、プロテオグリカン、イオンチャンネル、７回膜スパナータンパク質 ファミリーのメンバー（例えば、臭覚レセプターおよび味覚レセプター、アセチ ルコリンレセプター）；生物学的物質（例えば、細胞、ウイルス、血餅、腫瘍、 病原性病変部の成分（例えば、動脈瘤、アテローム性動脈硬化のプラーク）、ま たは天然に存在する分子または高分子）であり得る。例えば、標的は、α_IIbβ₃ インテグリン、α_Vβ₃インテグリン、または他の任意の細胞表面レセプターであ り得る。 タンパク質の機能的ドメイン（このドメインは、本発明の薬剤において治療的 または診断的な機能的物質であり得る）は、被験体中の標的へ標的化することが 所望される活性を有するタンパク質の領域またはタンパク質全体である。いくつ かの薬剤において、ある活性がその天然のタンパク質から単離されているか、ま たはその天然のタンパク質における活性から改変されている。さらに、一つ以上 の供給源に由来するかまたはそこから単離された機能的ドメインは、本発明の薬 剤において単数または複数の標的化エレメントと共に結合され得る。 請求の範囲において使用されるように、「最適化」は、ポリアミノ酸が操作さ れて標的結合部位に対するその天然の親和性が増加することを意味する。用語「 最適化」は、当該分野の種々の標準的なアプローチを用いて、ポリアミノ酸の親 和性およびおそらくは選択性が増加することを意味するために使用される。最適 化はまた、「親和性成熟」としていわれ得る。 「結合」は、機能的ドメインの機能が活性なままであり、そして標的化モチー フまたはドメインの標的化能力が薬剤を標的化するのに利用できるような様式で 接合することを意味する。例えば、表面ループが標的化モチーフまたはドメイン であり、そして機能的物質が別のタンパク質である場合、表面ループは、表面ル ープに一致するような様式（すなわち、非天然の機能的タンパク質の定義された ２次構造の２つの領域の間、または非天然の機能的タンパク質における２次構造 のドメインと末端との間のいずれか）で、タンパク質へ挿入され得る。結合はま た、任意のタイプの化学結合、またはペプチド結合を含み得る。結合は、共有結 合および／または非共有結合を含み得る。 任意の薬剤、組換えタンパク質、または核酸を含む組成物は、薬学的に受容可 能なキャリア、または例えば、薬剤、タンパク質、もしくは核酸の所望の機能を 妨害しない任意の他の選択された添加物を含み得る。 当業者には明らかであるように、薬剤、タンパク質、核酸、または組成物を投 与することは、選択された標的への送達に適切な様式で、薬剤、タンパク質、核 酸、または組成物を投与することを意味する。C ．治療剤または診断剤およびその組成物 本発明は、選択された標的に特異的に結合し、そしてタンパク質またはペプチ ド結合領域に由来するかあるいはタンパク質またはペプチド結合領域に基づく単 離された標的モチーフまたは標的ドメイン(b)に連結した治療的または診断的な 機能的物質(a)を含む標的化治療剤または診断剤を提供する。標的モチーフまた は標的ドメイン（治療剤または診断剤を形成するためにそれらが連結される機能 的物質以外の物質に由来）の少なくとも以下の３つのカテゴリーが、本発明にお いて利用され得る：（１）ペプチド模倣物（すなわち、ペプチド結合についてモ デリングされた物質）、（２）単離され至適化された高親和性ポリアミノ酸（任 意の選択されたタンパク質の結合部位由来）、および（３）タンパク質から単離 された表面ループ。 詳細には、本発明は、選択された標的に特異的に結合する単離されたペプチド 模倣物(b)に連結した治療的または診断的な機能的物質(a)を含む標的化治療剤ま たは診断剤を提供する。本発明はさらに、選択された標的に特異的に結合する単 離され至適化された高親和性のポリアミノ酸(b)に連結した治療的または診断的 な機能的物質(a)を含む標的化治療剤または診断剤を提供する。本発明はさらに 、選択された標的に特異的に結合する単離されたタンパク質表面ループ（ここで 、タンパク質表面ループは、機能的物質に対して天然／内因性でない）(b)に連 結した治療的または診断的な機能的物質(a)を含む標的化治療剤または診断剤を 提供する。 治療的または機能的物質は、所望の効果（治療的または診断的のいずれか）に 基づいて選択され、そして標的モチーフまたは標的ドメインは、標的化されるべ き部位に基づいて選択される。「特異的に結合する」は、標的モチーフまたは標 的ドメインが標的部位に主に結合し、他の標的には最小の非特異的結合（すなわ ち、最小のバックグラウンド）であることを意味する。特異的結合はさらに、標 的モチーフまたは標的ドメインが標的を含むサンプルから選択的に標的を取り出 すために使用され得ることを意味する。抗体CDRによる特異的結合は、抗体が血 清から選択的に因子を取り出すため、または因子の生物学的活性を阻害するため に使用され得ること、およびラジオイムノアッセイ(RIA)、バイオアッセイ、ま たは固相酵素免疫吸着(ELISA)技術により容易に測定され得ることを意味する。 多数の標的エレメントは公知であり、そして本発明において利用され得る。標的 エレメントがペプチド模倣物である場合、模倣物は、元の結合ペプチドのコンホ メーションについて模倣物をモデリングすることにより特定の部位に特異的に結 合するように設計され得る。これらの模倣物はさらに、所望であれば、任意の選 択された手段により高親和性結合のために至適化され得る。 標的エレメントが、単離され至適化された高親和性のポリアミノ酸であるエレ メントである場合、いくつかの標準的なアプローチは、ポリアミノ酸の結合親和 性および／または結合選択性を至適化することに有用である。例えば、ポリアミ ノ酸の多数の改変体を含む膨大なライブラリーは、当該分野で周知のいくつかの 技術により示され得る。これらは、以下を含むが、これらに限定されない；（１ ）ファージディスプレイ（総説については、Bradbury,A.,Cattaneo,A(1995)The use of phage display in neurobiology．Trends in Neuroscience 18:243-249; Barbas,C.F.(1993)Recent advances in phage display．Current Opinion in Bi otechnology 4:526-530を参照のこと）；（２）ポリソームディスプレイ（Matth eakis,L.C.,Bhatt,R.R.,Dower,W.J.(1994) An in vitro polysomedisplay syste m for identifying ligands from very large peptide libraries．Proc.Natl.A cad.Sci.U.S.A．91,9022-9026）；（３）プラスミドでのペプチドの表示(Cull,M .G.Miller,J.F.,Schatz,P.J.(1992)Screening for receptor ligands using la rge libraries of peptides linked to the C-terminus of the lacrepressor． Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．89:1865-1869）；（４）合成ペプチドまたはペプチ ドメティック(peptidmoetic)ライブラリー（Pinilla C;Appel JR;Houghten RA． Investigation of antigen-antibody interactions using a so ao luble,non-s upport-bound synthetic decapeptide library composed of fourtrillion(４× 10(12)sequences．Biochem J 1994 Aug 1;301(Pt3):847-53;Doole y CT;Chung NN;Wilkes BC;Schiller PW;Bidlack JM;Pasternak GW;Houghten RAA n all D-amino acid opioid peptide with central analgesic activity from a combinatorial library．Science 1994 Dec 23;266(5193):2019-22)。次いで、 至適なポリアミノ酸は、標準的な生化学的または生物学的選択によりこのライブ ラリーから得られ得る。あるいは、（５）単離されたポリアミノ酸は、化学的改 変により至適化され得る。例えば、その構造は、標準的な技術（例えば、コンビ ナトリアルケミストリーおよび医薬品化学）を使用して改変され得る。 標的エレメントが表面ループである場合、表面ループもまた、その標的に特異 的である。表面ループは、望ましい標的特性について選択され得る。タンパク質 の多数の表面ループ領域は、タンパク質の三次元構造を含むデータベースにより 既に公知であり、そしてこのような表面ループは、本発明において容易に使用さ れ得る。タンパク質内のタンパク質表面ループの位置もまた、構造アルゴリズム を使用して予測され得る。例えば、目的の標的分子に対する抗体（モノクローナ ルまたはポリクローナル）の相補性を決定する領域は、表面ループとして使用さ れ得る。さらに、目的の標的特性を有する任意のタンパク質は、表面ループおよ びこのように同定された表面ループを含む種々の領域を決定するための標準的な 手段により構造的に分析され得る。このような構造分析は、NMR、結晶構造解析 、または予測的なアルゴリズムを含む。さらに、所望であれば、その標的に対す る表面ループの親和性が標準的な手段により増大され得る。 さらなる標的モチーフまたは標的ドメイン（特に、核酸標的を標的する薬剤の ための）は、転写因子由来の結合ドメイン（例えば、ステロイドレセプター）、 基本転写因子（例えば、TFIIDなど）、および配列特異的DNA結合転写因子（例え ば、AP1．AP2、SP1、NF1など）である。さらなる転写因子は、例えば、National Center for Biotechnology Information(NCBI,Bethesda,MD)により維持されBLA STプログラム（転写因子についての項目19(TFD)；真核生物プロモーター配列に ついての項目20を参照のこと）を介してアクセス可能であるようなコンピュータ ーデータベースに列挙されている。 標的は、組織、器官、細胞、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、 病理学的病変の任意の成分、または特徴付けらていないマーカーおよび標的を含 み得る。例えば、組織または細胞に特異的な標的モチーフまたは標的ドメイン（ 例えば、器官または組織の細胞上に発現される細胞表面レセプターに特異的に結 合する標的モチーフまたは標的ドメイン）を選択することにより、腫瘍細胞、転 移性の細胞、脈管構造の細胞（例えば、内皮細胞および平滑筋細胞）、肺の細胞 、筋肉（例えば、平滑筋細胞、心筋など）、腎臓の細胞、血球（例えば、T細胞 ）、骨髄の細胞（例えば、幹細胞）、骨の細胞、神経細胞および関連する神経性 の細胞（例えば、グリア細胞）、脳細胞、肝細胞、または任意の選択された細胞 の前駆体などを標的し得る。例えば、標的レセプターは、インテグリン様のαv β3、αvβ5、αIIbβ3であり得る。標的レセプターは、成長因子レセプター、 ホルモンレセプター、サイトカインレセプターなどであり得る。標的レセプター は、成長因子依存性レセプター（例えば、表皮成長因子、神経成長因子など）で あり得る。標的レセプターはまた、リガンド依存性レセプター（例えば、ステロ イドレセプター、甲状腺ホルモンレセプター、レチノイン酸レセプター、レチノ イドXレセプター、TCCD（ダイオキシン）レセプター、脂肪酸活性化レセプター など）、また刺激依存性レセプター（例えば、ペルシオキソーム増殖活性化レセ プター）であり得る。これらのレセプターまたは因子の多くは、書籍[Parker,M. G.(1993)Steroid Hormone Action(Oxford University Press,New York,210頁)] 、最近の総説[Tsai,M.J.&O'Malley,B.W.(1994)Annu.Rev.Biochem．63,451-486] 、およびさらなるレセプターならびに遺伝子およびcDNAの完全なヌクレオチド配 列を含むGenBankデータベースに列挙されていることが見出され得る。標的はま た、抗体のような可溶性タンパク質、成長因子、または血清タンパク質であり得 る。核酸標的は、例えば、目的のタンパク質をコードする核酸を含み得、機能的 物質の調節配列または核酸によりコードされるRNAへの結合によりその発現を変 化させることが所望される。例えば、核酸の発現を増大もしくは阻害し得るか、 または核酸の発現時間を変化し得る。 機能的物質は、このような物質の広範なアレイから選択され得、そして標的お よび標的に送達される機能的物質の選択された効果に基づいて選択される。例え ば、血餅を溶解するように作用する酵素（t-pAのような）を血餅の領域に標的す ることを望み得る。同様に、止血性の凝固カスケード内で作用するタンパク質お よびそのインヒビターは、血餅へ標的化され得る。同様に、血小板機能を改変す るように作用する薬物およびタンパク質は、血餅内の血小板または血餅の成分に 最終的になり得る循環している血小板に標的化され得る。 機能的物質は、例えば、遺伝子治療のための核酸であり得る。このような核酸 は、例えば、治療的タンパク質またはペプチドをコードし得るか、またはアンチ センスRNAをコードし得る。機能的物質はまた、目的の遺伝子を有する遺伝子送 達ビヒクルを含み得る。例えば、遺伝子送達ビヒクルを内皮細胞、腫瘍細胞、ま たは破骨細胞（これらは全てα_Vβ₃インテグリンを発現する）に標的することを 望み得る。一つのこのような遺伝子送達ビヒクルはウイルスであり得、これは、 アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、弱毒化HIVウイルスおよび弱毒化レトロ ウイルス、または別の遺伝子送達ビヒクル（例えば、リポソームまたは脂質ベー スの送達ビヒクル）であり得るが、これらに限定されない。これらの部位に送達 され得る遺伝子のタイプは、腫瘍サプレッサー（細胞増殖および／もしくは細胞 転移を促進または妨げるように作用する分子）をコードする遺伝子を含む。これ らの遺伝子はまた、成長因子、サイトカイン、および標的のすぐ近くに存在する 細胞表面レセプターに対する他の種々のリガンドを含み得る。 機能的物質はさらに、例えば、特定の細胞型に対して、細胞に対する毒性物質 としてまたはアポトーシス薬剤として作用する薬物であり得る。例えば、化学療 法剤の活性を腫瘍の部位に焦点をあわせる意図で、ドキソルビシン（doxyrubici n）（または等価物）のような化学療法剤を、腫瘍に標的し得る。さらにまた、 毒性物質としてまたはアポトーシス薬剤として作用する薬物を、これらの毒性物 質が腫瘍の内皮細胞を死滅させるように内皮細胞に標的し得、それにより腫瘍へ の血液および栄養物の供給を排除し、そして内皮細胞を死滅させる。さらにまた 、例えば、免疫系の細胞（例えば、細胞傷害性T細胞またはナチュラルキラー細 胞）を腫瘍に標的し得、その結果細胞傷害性T細胞は腫瘍細胞を認識し、結合し 、そして腫瘍細胞を溶解することにより死滅させる。 別の例（骨髄移植）においてもまた、幹細胞（機能的物質）を骨髄（標的）に 標的し得、その結果幹細胞が骨髄へ「戻り」、そして滞留を確立し、それにより 移植の「生着」を増大する。別の例においてもまた、骨粗鬆症を予防するために 、 骨節約薬剤（bone sparing agent）として作用する薬物を骨に標的し得る。一つ のこのような例は、破骨細胞（主要な骨再吸収細胞）に毒性物質として作用する ビスホスホネートであり得る。 本方法により部位に標的化され得る機能的物質の別のタイプは、医療的デバイ スまたは診断的デバイスである。このようなデバイスは、薬物送達システム（例 えば、小型化された浸透圧性の薬物送達ポンプ）、造影剤（例えば、標準的な放 射線技術を使用して腫瘍または疾患の病変の造影を可能にする放射性化学物質） 、腫瘍および他の疾患の病変に標的化され得る薬剤を含み得、その結果、核磁気 共鳴法によりまたは磁気共鳴画像法（例えば、スピン標識されたプローブ（例え ば、マンガンのような金属イオン）により外部から検出される。 本発明はさらに、標的分子に特異的に結合する表面ループを有する第一のタン パク質からの表面ループ(a)、および第二のタンパク質の機能的ドメイン(b)を含 む組換え標的タンパク質を提供する。本明細書でさらに記載するように、本発明 の組換え標的タンパク質の機能的ドメインを供給する第二のタンパク質は、組換 えタンパク質に与えられることが所望される機能的特徴を有する任意の選択され たタンパク質であり得る。第二のタンパク質への表面ループの配置は、任意のい くつかの標準的な方法（例えば、表面ループを有する第一のタンパク質をコード する核酸から表面ループを単離するための、および単離された核酸を機能的タン パク質をコードする核酸へ挿入するための組換えサブクローニング技術）により 達成され得る。機能的タンパク質の天然の表面ループをコードするDNAの領域も また、非天然の表面ループの挿入の前またはその間に標準的なサブクローニング 技術および挿入された非天然の表面ループにより取り除かれ得る。次いで、組換 えDNAは、組換えタンパク質を産生するために発現され得る。あるいは、取り除 かれた機能的タンパク質の天然の表面ループは、表面ループを有する第一のタン パク質の標的表面ループに配列において対応する核酸フラグメントを作製するた めに変異され得、そしてこの変異された核酸は機能的タンパク質に再挿入される 。このような変異は、標準的な技術（例えば、部位特異的突然変異誘発）により 生成され得る。 本発明は特に、表面ループが標的に対して指向されたモノクローナル抗体の相 補性決定領域(CDR)である、組換え標的タンパク質を提供する。任意の所望のモ ノクローナル抗体が、このタンパク質のために利用され得る。抗体は、例えば、 細胞表面タンパク質に対して指向され得る。細胞表面タンパク質は、血小板糖タ ンパク質GPIIb/IIIa（インテグリンα_IIbβ₃）のようなインテグリンであり得る 。さらに、CDRは、所望される場合、例えば、本明細書に記載される方法により 、より高い親和性のために至適化され得る。本明細書中の特定の実施例において は、モノクローナル抗体Fab-9は、表面ループを含むように改変されたCDRを有し 、そしてさらに、表面ループは、ファージディスプレイにより至適化されている （モノクローナル抗体Fab-9のHCDR3内の表面ループ）。 本発明はさらに、機能的ドメインがヒト組織型プラスミノーゲンアクチベータ ー(t-pA)である、組換え標的タンパク質を提供する。アクチベーターのための有 用な標的モチーフまたは標的ドメインは、個体の血餅内のまたはその付近の細胞 のレセプターに結合するモチーフまたはドメインである。例えば、標的は、周囲 の血管内皮細胞および平滑筋細胞の血小板糖タンパク質GPIIb/IIIa（インテグリ ンα_IIbβ₃）またはα_Vβ₃であり得、従って、標的モチーフまたは標的ドメイン のために選択された表面ループは、レセプターに特異的に結合する表面ループで ある。例えば、本発明は、表面ループがモノクローナル抗体Fab-9のHCDR3であり 、第二のタンパク質がヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター(t-pA)であり 、そして標的化される分子が血小板糖タンパク質GPIIb/IIIa（インテグリンα_{II b} β₃）である組換え分子標的タンパク質を提供する。従って、本発明は、血小板 標的組織プラスミノーゲンアクチベーターを提供する。この標的タンパク質は、 血餅特異的血栓溶解剤であり、そして血餅の溶解が望ましい場合の治療において 使用され得る。 本発明の標的化される物質における使用のための表面ループを単離しそして（ 所望であれば）最適化することにおいて、選択されたループの領域をコードする 核酸は、天然タンパク質の核酸から取り出され得、そして遺伝子的足場（例えば 、ファージ、ポリソーム、またはプラスミド）に挿入され得る。表面ループは、 標的に対する結合親和性についてアッセイされ得る。所望であれば、表面ループ は、例えば変異誘発および親和性成熟により、例えば、ファージディスプレイ （例えば、Pharmacia Biotech,Inc.のRecombinant Phage Antibody System）、 ポリソームディスプレイを使用して、プラスミド上でペプチドをディスプレイし て、および合成ペプチドライブラリーを用いて、最適化され得る。次いで、これ らの最適化された生物学的に活性なモチーフは、標準的な方法によって、レシピ エント機能的ドメイン（例えば、タンパク質の機能的ドメイン）のいくつかの異 なる位置に接合され、改変した結合特性を有する新規な変異体を作製する。特に 、選択された表面ループは、規定された二次構造の２つの領域の間の、または二 次構造のドメインとタンパク質の終端との間の機能的ドメインを有するタンパク 質に挿入され得る。従って、本明細書に記載される方法は、前もって選択された タンパク質結合（すなわち、標的化）モチーフまたはドメインの表面ループを改 変して、高親和性標的化分子を形成するために用いられ得る。その後、標的化モ ジュールは、前もって選択されたタンパク質の機能的ドメインモジュールと融合 されて、標的化タンパク質を形成し得る。 本発明は、本発明の任意の治療的または診断剤、組換えタンパク質もしくは核 酸を含む組成物を提供する。このような組成物は、薬学的に受容可能なキャリア （例えば、生理食塩水）、あるいは薬剤、タンパク質、または核酸の所望される 機能を干渉しない任意の他の選択された添加物を含み得る。核酸および細胞 本発明は、本発明の任意の組換えタンパク質を機能的にコードする単離された 核酸を提供する。本明細書中で用いられる「単離された」とは、他の核酸を実質 的に含まない、または他の核酸から分離されていることを意味する。状況に依存 して、この用語は、核酸を含む生物において天然に生じる他の核酸を実質的に含 まない、またはその核酸から分離されていることを意味し得る。核酸は、標準的 な組換え方法（Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual）第二版 、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York、1989;DNA cloning:A Practical Approach、第Ｉ巻および第II巻、Glover,D.M.編、IRL Pre ss Limited、Oxford、1985）ならびに／または他の標準的方法（例えば、化学合 成）によって作製され得る。核酸は、細胞から単離されることが所望される場合 には、細胞中で産生され、そしてそこから単離され得る。あるいは、細胞は、核 酸によってコードされる組換えタンパク質を産生するために用いられ得る。核酸 は、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド、酵母人工染色体、または任意 の他の便利なベクター中に存在し得る。 タンパク質を機能的にコードする（すなわち、核酸を発現させる）ためには、 核酸は、例えば、発現制御配列（例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサ ー、ならびに必要な情報処理部位（例えば、リボソーム結合部位、RNAスプライ ス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列））を含み得る。 核酸に選択的にハイブリダイズするために十分にストリンジェントな条件下で 、組換えタンパク質をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする核酸が、本 発明によってさらに提供される。従って、例えば、組換えタンパク質をコードす る核酸を検出または増幅するためのプライマーおよびプローブとしての使用のた めの核酸が、本明細書で意図される。代表的には、選択的ハイブリダイゼーショ ンを達成するためのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、Tm（半分 の分子がそのパートナーから解離する融解温度）の約５℃〜20℃下である。ハイ ブリダイゼーション温度は、代表的には、DNA-RNAおよびRNA-RNAハイブリダイゼ ーションについては、より高い。洗浄温度は、当該分野で公知のように、選択的 ストリンジェンシーを達成するために、同様に用いられ得る。（Sambrookら、Mo lecular Cloning:A Laboratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor Laborato ry、Cold Spring Harbor、New York、1989;Kunkelら、Methods Enzymol.1987:15 4:367、1987）。 本発明はさらに、本発明の任意の核酸を含む細胞を提供する。細胞は、標準的 な核酸移入方法（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リ ン酸カルシウム媒介性移入、直接注入など）によって生成され得る。細胞は、核 酸を含むベクターを含み得る。キメラタンパク質をコードする核酸を含む細胞は 、代表的にはDNAを複製し得、そしてさらに代表的にはコードタンパク質を発現 し得る。細胞は、原核生物細胞（特に、多量の核酸を産生する目的のために）ま たは真核生物細胞（特に、哺乳動物細胞）であり得る。細胞は、好ましくは、コ ードされるタンパク質を発現する目的のためには哺乳動物細胞であり、その結果 、得られる産生されるタンパク質は、哺乳動物タンパク質プロセシング修飾を有 す る。使用法 本発明は、被験体における血餅を減少する方法を提供し、その方法は、（a） モノクローナル抗体Fab-9のHCDR3由来の表面ループ、および（b）ヒト組織型プ ラスミノーゲンアクチベーター（t-pA）の機能的ドメイン、を含むタンパク質の 治療的な量を被験体に投与することを含み、それによって、被験体における血餅 中の血小板上の血小板糖タンパク質GPIIb/IIIa（インテグリンα_IIbβ₃）にタン パク質を結合させ、そして被験体における血餅を減少させる。投与されたタンパ ク質は、（１）インテグリンα_IIbβ₃をブロックし、（２）血小板に結合するこ とによってクロットにt-PAおよびその活性を局在化および濃縮させ、そして（３ ）クロットの近傍の血管内皮細胞および平滑筋細胞上に発現されるα_Vβ₃に結合 することによってクロットにt-PAを局在化するように機能し得る。このような方 法のために、タンパク質の静脈内および動脈内投与は、特に有益であり得る。心 臓血管系内の他の物質（例えば、血液の他の構成成分および血餅の他の構成成分 ）ならびに血小板、血管内皮細胞上の他の表面レセプターに特異的に結合する表 面ループを有するさらなる治療的タンパク質が作製され得る。 従って、本発明はさらに、被験体における血栓症を防止するかまたは血栓溶解 を促進する方法を提供し、その方法は（a）モノクローナル抗体Fab-9のHCDR3由 来の表面ループ、および（b）ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター（t-p A）の機能的ドメインを含むタンパク質の治療的な量を被験体に投与することを 含み、それによって、被験体における血餅中の血小板上の血小板糖タンパク質GP IIb/IIIa（インテグリンα_IIbβ₃）にタンパク質を結合させ、そして被験体にお ける血栓症を防止するかまたは血栓溶解を促進する。このような方法のために、 タンパク質の静脈内および動脈内投与は、特に有益であり得る。 本発明はさらに、被験体における心筋梗塞を処置するかまたは防止する方法を 提供し、その方法は、（a）モノクローナル抗体Fab-9のHCDR3由来の表面ループ 、および（b）ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター（t-pA）の機能的ド メインを含むタンパク質の治療的な量を被験体に投与することを含み、それによ って、被験体中の血小板にタンパク質を結合させ、そして被験体における心筋梗 塞 を処置するかまたは防止する。さらに、本発明は、被験体における心筋梗塞を処 置するかまたは防止する方法を提供し、その方法は、治療的機能的物質として任 意の抗血小板剤または抗凝集剤を有する本発明の標的化治療剤の治療的な量を被 験体に投与することを含む。抗血小板剤または抗凝集剤は、血餅の構成成分に選 択的である、または少なくとも部分的に選択的である任意の標的化薬剤（例えば 、α_IIbβ₃インテグリンを結合するタンパク質およびペプチド模倣物または血小 板を結合する任意の薬剤）に連結される。投与は、好ましくは、心筋梗塞のため の治療物の投与について代表的な方法によって、そして特にt-PAの投与について 代表的な方法によって（例えば、静脈内におよび動脈内に）実施される。 疾患または状態を「処置する」とは、疾患または状態の任意の臨床徴候を減少 させるかまたは防止することを意味する。例えば、心筋梗塞の処置については、 徴候は当該分野において公知であり、そして当業者に公知であるように、冠状動 脈の閉塞からの、胸痛、上昇した循環する心臓アイソザイム、心電図の変化、お よびその他を含む。疾患または状態の臨床徴候の任意の変化を、このような変化 を検出するための適切な手段（その多くは当該分野において公知である）によっ て検出および／または（可能であれば）測定することによって、処置される疾患 または状態に対する本発明の治療剤の効果をモニターし得る。 本発明はさらに、治療的化合物を被験体中の腫瘍に標的化する方法を提供し、 その方法は、モノクローナル抗体Fab-9のＨ鎖相補性決定領域３（HCDR3）に連結 された標的化される治療的または診断的な機能的物質を含む治療剤を被験体に投 与することを含む。ここで、治療的または診断的物質は、抗腫瘍治療的化合物で ある。抗腫瘍治療的化合物は、化学療法剤（例えば、ドキソルビシン（doxyrubi cin）のようなアポトーシス性薬剤または毒物；腫瘍サプレッサー（例えば、p53 ）；および核酸代謝のモジュレーターを含み得る。モノクローナル抗体Fab-9の Ｈ鎖相補性決定領域３（HCDR3）に連結された標的化される治療的または診断的 な機能的物質を含む治療剤は、いくつかの腫瘍細胞（黒色腫、乳ガン、卵巣ガン （ovarioan cancer）を含む）上に存在するα_Vβ₃を結合し得る。このような方 法は、腫瘍の成長および／または確立を減少させるかまたは停止させ、従ってガ ンを処置するために用いられ得る。 本発明はまた、被験体中の腫瘍に治療的タンパク質を標的化する方法を提供し 、その方法は、モノクローナル抗体Fab-9のHCDR3に連結された抗腫瘍治療的タン パク質を含む組換え腫瘍標的化タンパク質を被験体に投与することを含む。この ような方法は、腫瘍の成長および／または確立を減少させるかまたは停止させ、 従ってガンを処置するために用いられ得る。 本発明はまた、被験体中の破骨細胞に治療的化合物を標的化する方法を提供し 、その方法は、モノクローナル抗体Fab-9のＨ鎖相補性決定領域３（HCDR3）に連 結された治療的または診断的な機能的物質を含む標的化された治療剤を被験体に 投与することを含む。ここで、治療的または診断的物質は、抗破骨細胞治療的化 合物である。抗破骨細胞治療的化合物の例としては、ビス−ホスホン酸塩が挙げ られる。 本発明はさらに、被験体中の破骨細胞に治療的タンパク質を標的化する方法を 提供し、その方法は、モノクローナル抗体Fab-9のHCDR3に連結された抗破骨細胞 治療的タンパク質を含む組換え破骨細胞標的化タンパク質を被験体に投与するこ とを含む。 本発明はさらに、被験体中の脈管形成の過程中にある内皮細胞に治療的化合物 を標的化する方法を提供し、その方法は、標的化モチーフまたはドメイン（例え ば、ペプチド模倣物、最適化された高親和性ポリアミノ酸、または単離されたタ ンパク質表面ループ）に連結された治療物化合物を含む内皮細胞標的化薬剤を被 験体に投与することを含む。この標的化モチーフまたはドメインはα_Vβ₃インテ グリンに選択的であり、そしてここで治療的化合物は抗脈管形成因子または細胞 性毒物である。例えば、標的化モチーフまたはドメインは、モノクローナル抗体 Fab-9のHCDR3またはα_Vβ₃インテグリンを特異的に結合するモノクローナル抗体 の任意の他のCDRであり得る。 本発明はさらに、被験体中のα_Vβ₃インテグリンを発現する腫瘍または腫瘍細 胞に治療的化合物を標的化する方法を提供し、その方法は、標的化モチーフまた はドメイン（例えば、ペプチド模倣物、最適化された高親和性ポリアミノ酸、ま たは単離されたタンパク質表面ループ）に連結された治療的化合物を含む腫瘍標 的化薬剤を被験体に投与することを含む。この標的化モチーフまたはドメインは 、 α_Vβ₃インテグリンに選択的であり、そしてここで治療的化合物は抗腫瘍活性を 有する細胞であり、その細胞は標的化モチーフまたはドメインを有する（または その表面に提示する）。例えば、標的化モチーフまたはドメインは、Ｔ細胞レセ プターまたはIgGタンパク質ファミリーのメンバーである任意の細胞表面タンパ ク質に接合された標的化モチーフまたはドメイン、あるいは上皮増殖因子様モジ ュールを含む任意の細胞表面タンパク質、あるいはフィブロネクチンIII型モジ ュールを含む任意の細胞表面タンパク質であり得る。例えば、Fab-9のHCDR3は、 Ｔ細胞レセプターに接合され得る。このループ接合Ｔ細胞レセプターを発現する Ｔ細胞を用いて、α_Vβ₃インテグリンを発現する腫瘍細胞にＴ細胞を標的化し得 る。 本発明はさらに、被験体の血管狭窄に寄与する血管平滑筋細胞（SMC）に治療 的化合物を標的化する方法を提供し、その方法は、標的化モチーフまたはドメイ ン（例えば、ペプチド模倣物、最適化された高親和性ポリアミノ酸、または単離 されたタンパク質表面ループ）に連結された治療的化合物を含むSMC標的化薬剤 を被験体に投与することを含む。この標的化モチーフまたはドメインはα_Vβ₃イ ンテグリンに選択的であり、そしてここで治療的化合物は細胞増殖のモジュレー ターまたは細胞毒物である。 本発明の任意の方法のためには、被験体は任意の動物、好ましくは、ヒトのよ うな哺乳動物、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、またはウシのような獣 医動物、あるいはマウス、ラット、ウサギ、またはモルモットのような実験動物 であり得る。治療剤は、従って、処置される被験体のために処置を最適化するよ うに選択される。 本発明の診断的または治療剤は、選択された部位に治療物または診断物を投与 するための任意の多くの標準的な手段あるいは機能的物質の型を投与するための 標準によって、被験体または動物モデルに投与され得る。例えば、薬剤は、経口 的に、非経口的（例えば、静脈内）に、筋肉内注射により、腹腔内注射よって、 局所的に、経皮的になどで投与され得る。薬剤は、例えば、カチオン性リポソー ムとの複合体として、またはアニオン性リポソーム中にカプセル化されて投与さ れ得る。組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて種々の量の選択 された薬剤を含み得、そしてさらに、所望であれば、他の医学的薬剤、薬学的薬 剤、キャリア、アジュバント、希釈剤などを含み得る。用いられる場合、非経口 的（parental）投与は、一般的に注射によって特徴づけられる。注射物は、従来 の形態（液体溶液または懸濁液、注射の前の溶液または液体中懸濁液に適切な固 体形態、またはエマルジョンのいずれかとして調製され得る。投与の様式に依存 して、薬剤は、被験体中での分解を回避するように、例えば、カプセル化などに よって最適化され得る。 投与量は、投与の様式、処置されるべき疾患または症状、および個々の被験体 の症状に依存するが、機能的ドメインの投与について代表的であり、そして機能 的ドメインの投与において使用される投与量となる。例えば、血餅を減少させる 、または血栓症を防止するもしくは血栓溶解を促進する、または心筋梗塞を処置 もしくは防止するために、モノクローナル抗体Fab-9のHCDR3由来の表面ループ(a )およびヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター（t-pA）の機能的ドメイン( b)を含むタンパク質を投与するためには、タンパク質はt-PAについて代表的な投 与量で投与され得る。このような投与量は、当該分野で周知である。本発明の組 換えタンパク質の効率的な標的化のために、この投与量は減少され得そうである 。さらに、投与量は、処置されるべき特定の疾患または症状について代表的な投 与量に従って調整され得る。それゆえ、血餅を減少させるためには、代表的な投 与量は、t-PAが血餅を減少させるために投与される場合に投与される投与量と同 様であるか、またはそれより少ない投与量である。血栓症を防止するか、または 血栓溶解を防止するためには、代表的な投与量は、t-PAが血栓症を防止するか、 または血栓溶解を促進するために投与される場合に投与される投与量と同様であ るか、またはそれより少ない投与量である。心筋梗塞を処置または防止するため には、代表的な投与量は、t-PAが心筋梗塞を処置または防止ために投与される場 合に投与される投与量と同様であるか、またはそれより少ない投与量である。さ らに、プラスミドまたはウイルスの投与量は、他のプラスミドまたはウイルスベ クターの投与について代表的であり、そして他のプラスミドまたはウイルスベク ターの投与において使用される投与量であり得る（米国特許第4,897,355号を参 照のこと）。さらに、培養細胞または標的細胞型のバイオプシーが、インビボに おける標的細胞についての投与量を至適化するために使用され得る。しばしば、 単回用量が十分であり得る；しかし、用量は所望であれば反復され得る。投与量 は、有害な副作用を引き起こすほど高くあるべきでない。一般に、投与量は、患 者の年齢、症状、性別、および疾患の程度とともに変動し、そして当業者により 決定され得る。投与量はまた、任意の合併症の場合に個々の医師により調整され 得る。利用性に関する記述 本発明は、選択された標的を特異的に結合しそしてタンパク質もしくはペプチ ド結合領域に由来するかまたはタンパク質もしくはペプチド結合領域に基づく単 離された標的モチーフまたはドメイン(b)に連結する治療的または診断的な機能 的物質(a)を含む標的化された治療剤または診断剤を提供する。このような薬剤 は、治療または診断のための広範な有用性を有し得る。本発明は、被験体におい て本発明の方法により標的化され得る部位において機能する物質を投与すること を含む任意の公知の処置に適応されて、処置の有効性を改善し得る。 本発明の組成物および使用の例は、タンパク質モジュール内の表面ループが交 換可能であり得ること、およびファージディスプレイがループ接合化と組み合わ されて、タンパク質を、高親和性で、選択された標的に指向させ得ることを詳細 に実証する。この研究の主な知見は、１つのタンパク質上の生物学的に活性な、 可撓性の表面ループを形成しているアミノ酸が、別の、無関係なタンパク質に接 合され得、そしてなおそれらの最初の結合活性を維持し得るということであった 。接合されるループのタンパク質配列は、もとは、ファージディスプレイを使用 する、ドナータンパク質であるモノクローナル抗体Fab-9の変異誘発および親和 性成熟により至適化された。 本発明は、以前の方法（例えば、RGD配列が非接着性タンパク質（33-35）中に 挿入されて、RGDを結合するレセプターを発現している細胞を標的化した、以前 に報告された研究）とはアプローチおよび最終結果の両方において顕著に異なる 。これらの努力はレシピエントタンパク質をインテグリンに首尾良く標的化した が、結合親和性の実質的な定量はこれらのタンパク質について報告されておらず 、またインテグリンの標的も同定されていない。これらの研究において、これら の研 究において、RGD配列はリゾチームまたはカルパスタチンのいずれかの中に挿入 され、そして得られた変異されたタンパク質のインテグリンに対する見かけのk_D は、細胞接着または細胞拡張（cell spreading）アッセイに基づいて、それぞれ 約400nMまたは50nMであるようであった。本発明において、１nMに近づくk_Dを有 して、50〜400倍高い親和性を有するインテグリンに対する標的化分子が調製さ れる。本発明は、至適化された抗体のHCDR3のアミノ酸配列のEGF分子の延長ルー プ（extended loop）中への接合化が、インテグリンに対するナノモル濃度の親 和性をEGFドメインに移行させ得ることを示す。LG-t-PAのインテグリンに対する 高親和性は、ループの重要な生物物理的特性の維持にほぼ確かに依存し；Fab-9 HCDR3のアミノ酸配列を含む直鎖状および環状の両方の合成ペプチドは、LG-t-PA またはFab-9より約100倍低いインテグリンに対する親和性を示す。 選択されたレシピエントタンパク質またはその他の薬剤中に配置され得、そし て高親和性で選択された標的分子に結合するペプチドモチーフまたはその模倣物 の三次元構造および基礎をなすアミノ酸配列の最初の（ab initio）設計を達成 するための一般的な方法の開発は、大いに有益である。本発明の方法は、タンパ ク質に、新たな有用な結合特性を、非常に大規模な変異誘発プロトコル、および それに続く、目的のタンパク質の個々の改変体の、骨が折れそして時間のかかる スクリーニングへの依存なしに、提供することを可能にする。 本発明は、以下の実施例においてより特定して記載される。これらの実施例は 例証的のみであることが意図される。なぜなら、そこにおける多数の改変および 変形が当業者に明らかとなるからである。 実施例 部位特異的変異誘発およびt-PAの改変体をコードする発現ベクターの構築 オリゴヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発を、Kunkel（16）により改変さ れたZollerおよびSmithの方法（15）により実施した。後の操作を簡単にするた めに、本発明者らは、変異誘発のためのテンプレートとして、ヌクレオチド407 におけるサイレント変異（これは新たなKpnI部位を生成させた（17））を含むt- PAをコードするcDNA（Pennica，Dら（1983）Nature 310巻214-221頁；Sambrook ら（1986）Mol．Biol．& Medicine ３巻，459-481頁）を使用した。このcDNAの4 37 bp Hind III-Kpn IフラグメントをバクテリオファージM13mp18中にサブクロ ーン化し、そして部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー5'-CGGGGGCACCTGC TCATTCGGAAGGGGAGACATTAGGAATGTGTGCCAGTGCC-3'（配列番号１）を使用して実施 した。 変異誘発後、437 bp HindIII-Kpn Iフラグメント全体に対応するssDNAを完全 に配列決定して、所望の変異が存在することおよびいかなるさらなる変異も存在 しないことを確認した。複製型（RF）DNAを適切なファージについて調製し、そ してRF DNAのHind IIIおよびKpn Iでの消化ならびに消化産物のアガロースゲル での電気泳動後、変異された437 bpフラグメントを回収した。単離されたHind I II-Kpn Iフラグメントを使用して、LG-t-PAをコードする完全長cDNAを再構築し た。Fab-9のHCDR 3において生成される表面ループを、Ｔ細胞レセプター中に別 々に接合した。Cos 細胞の一過性トランスフェクションによる酵素の発現 t-PAおよびLG-t-PAをコードするcDNAを一過性発現ベクターpSVT7（18）中に連 結し、次いでCos 1細胞中にBio Rad Gene Pulserを使用するエレクトロポレーシ ョンにより導入した。20μgのcDNA、100μgのキャリアDNA、および約10⁷のCos細 胞を0.4cmキュベット中に入れ、そしてエレクトロポレーションを320V、960μFD 、およびΩ＝∞で実施した。エレクトロポレーション後、細胞を、一晩、37℃で 、10％ウシ胎児血清および５mM酪酸ナトリウムを含有するDMEM中でインキュベー トした。次いで、細胞を無血清培地で洗浄し、そしてDMEM中で48時間37℃でイン キュベートした。無血清培地とのインキュベーション後、馴化培地を採集し、そ して酵素濃度をELISAにより測定した。酵素の精製および定量 馴化培地を20mMリン酸ナトリウム（pH＝7.0）、100mM NaCl、20mMアルギニン 、および0.05％Tween 80に対して透析し、そしてリジン-Sepharose（Pharmacia ）カラムにロードした。カラムを20容積のローディング緩衝液で洗浄し、そし てt-PAを20mMリン酸ナトリウム（pH＝7.0）、100mM NaCl、200mMアルギニン、お よび0.05％Tween80を含有する緩衝液で溶出した。酵素濃度をELISAにより測定し た。間接的色素原アッセイを使用するプラスミノーゲン活性化の反応速度分析 t-PAの間接的色素原アッセイは基質lys-プラスミノーゲン（American Diagnos tica）およびSpectrozyme PL（American Diagnostica）を利用し、そして以前に 記載のように実施した（18〜20）。アッセイを補因子DESAFIB（American Diagno stica）の存在下で実施した。DESAFIB（可溶性フィブリンモノマーの調製物）を 、高度に精製されたヒトフィブリノゲンをプロテアーゼバトロキソビンで消化す ることにより産生した。バトロキソビンはフィブリノゲンのAα鎖中のArg 16-Gl y17結合を切断し、その結果フィブリノペプチドＡを遊離させた。生じたdes-AA フィブリノゲンまたはフィブリンＩモノマーは、ペプチドGly-Pro-Arg-Proの存 在下において可溶性である。lys-プラスミノーゲンの濃度は0.0125〜0.2μMで変 動した。種々の刺激因子（stimulator）の存在下における間接的色素原アッセイ 標準的間接的色素原アッセイを、以前に記載のように実施した（18〜20）。簡 潔に記載すると、0.25〜１ngの酵素、0.2μM lys-プラスミノーゲン、および0.6 2mM Spectrozyme PLが100μlの全容積中に存在した。アッセイを、緩衝液、25μ g/ml DESAFIB、100μg/mlのフィブリノゲンの臭化シアンフラグメント（America n Diagnostica）、または100μg/mlフィブリノゲンのいずれかの存在下で実施し た。アッセイをマイクロタイタープレート中で実施し、そして405nmにおける吸 光度を30秒毎に１時間Molecular Devices Thermomax中で読みとった。反応を37 ℃で実施した。活性化基質を使用するt-PA活性の直接的色素原アッセイ t-PA活性の直接的アッセイは、基質Spec t-PA（American Diagnostica）を利 用し、そして0.02％Tween 80をアッセイ中に含めた以外は、以前に記載のように 実施した（21）。インテグリン精製およびインテグリン結合測定 インテグリンα_IIbβ₃をヒト血小板からRGDペプチドアフィニティーカラムで 以前に記載されたように精製した（22、23）。インテグリンα_Vβ₃を、以前に記 載のように（24）、Sepharoseに結合したLM-609を用いる抗体アフィニティーク ロマトグラフィーを使用して精製した。両方のインテグリンは、アクリルアミド ゲルのクーマシーブルー染色により判定した場合、90％より高い純度であった。 新規なt-PAの各インテグリンへの結合を、以前に報告されたリガンドレセプター 結合アッセイ（25、26）から適応させたアッセイを用いて測定した。精製インテ グリンをTitertek 96ウェルプレート中に、１mM CaCl₂および１mM MgCl₂を含有 する20 mM Tris-HCl（pH7.4）、150mM NaCl中で固定化した。コーティングのた めに、インテグリンを５μg/mlの濃度まで希釈した。インテグリンにより18時間 ４℃でプラスチックプレートをコートさせた。コーティング後、プレート上の非 特異的タンパク質結合部位を、20mg/mlのBSAを含有する50mM Tris-HCl（pH7.4） 、100mM NaClとのインキュベーションによりブロックした。結合測定のために、 野生型または改変t-PAを含有する馴化培地を、結合緩衝液（１mg/mlのBSAを含有 する50mM Tris-HCl（pH7.4）、100mM NaCl、0.5mM CaCl₂）中で適切な酵素濃度 まで希釈した。t-PAをマイクロタイターウェル中に固定化されたインテグリンに アプライし、そして２時間37℃で結合させた。結合後、遊離t-PAを、プレートか ら、結合緩衝液での３回の迅速な洗浄により除去し、そして結合t-PAを以前に記 載のようにt-PAについての活性アッセイを使用して検出した（21）。t-PAの非特 異的結合を、インテグリンリガンド結合機能のために必要とされる２価カチオン をキレート化するための５mM EDTAの添加により測定した（23）。いくつかの場 合において、ペプチドGRGDSP（Coast Scientificにより合成された）を競合物（ competitor）として使用した。精製t-PAを使用して遭遇する技術的制限のために 、この間接的アッセイを、インテグリンへのt-PA結合の測定のために使用した。 精製後、t-PAを200mMアルギニンを含む溶液中に維持した。本発明者らは、アル ギニンのこの濃度が全てのインテグリン結合アッセイを干渉し、そして 結合親和性の直接的測定方法を使用する試みを排除したことを見出した。従って 、間接的結合アッセイを選択した。このタイプの測定は、ループ接合化t-PAの結 合の、インテグリンに対する過小評価を与えることが予想される。なぜなら、CO S細胞はインテグリンへの結合についてLG-t-PAと競合する他のインテグリン結合 タンパク質を分泌するからである。ループ接合化における、抗体CDRのドナーとしての使用およびEGFモジュールのレ シピエントとしての使用 この研究の目的は、生物学的に活性な表面ループ（少なくともいくつかの場合 において）が異なる骨格構造のタンパク質間で接合され得るという概念を試験す ることであった。本発明者らのドナーとして、本発明者らは、本発明者らが最近 β3-インテグリンのリガンド結合ポケットを結合するように操作したヒト抗体で あるFab-9（27）由来のCDRを選択した。この抗体由来のHCDR3ループは、活性配 列SFGRGDIRNを含み、そして２つのシステイン残基により境界付けられている。F ab-9はβ3-インテグリンにナノモル濃度の親和性で結合するが、Fab-9のHCDR3配 列を有する合成ペプチドは、インテグリンに対する少なくとも100倍低い親和性 を示す（14）。それゆえ、成功したループの接合化についての規準は、インテグ リンに対する高親和性の保持である。EGFモジュールをレシピエントとして選択 した。なぜなら、このモジュールを含むいくつかのタンパク質の構造が利用可能 であり、そしてEGFがβ-ターン構造を含む大きな露出されたループを含むことを 示すからである。このループは、２つのジスルフィド対により境界付けられてい る（28）。オリゴヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発および従来のクローニ ング技術を使用して、本発明者らは、EGFドメインの表面上の露出されたループ を形成する残基をFab-9の活性ループ中に見出されるアミノ酸により置換したt-p Aの改変体をコードするcDNAを構築した（図１）。RGDモチーフのArgをt-PAの残 基66に配置した。これは、EGFモジュールのNMR構造に基づいて（28）、このジス ルフィドで境界付けられたループの頂点の付近である。Fab-9のCDR配列はEGFル ープより１残基短いので、本発明者らは、EGFループ内のカルボキシ末端残基をV al（t-PA中のこの位置における天然の残基）として維持した。t-PAの新たな改変 体をループ接合化t-PAまたはLG-t-PAという。改変t-PAは完全な酵素活性を維持し、そして生理学的補因子フィブリンにより刺 激される 小さい色素原基質であるSpec t-PAに対する野生型およびLG-t-PAの活性の反応 速度分析を表IIaに要約する。このアッセイにおける２つの酵素についてのKm、k_cat 、およびk_cat/Kmの間の密接な対応は、LG-t-PAが合成基質に対する完全な活 性を維持していることを明らかに実証する。表IIa．色素原基質Spec t-PAの切断についての反応速度定数 表IIbは、補因子フィブリンの存在下における、t-PAおよびLG-t-PAによる、プ ラスミノーゲン活性化の反応速度アッセイの結果を示す。LG-t-PAのプラスミノ ーゲン活性化についての反応速度定数は、野生型t-PAのそれに非常に類似してい る；２つの酵素についてのk_cat/Km値は、このアッセイにおいて約10％変動する 。それゆえ、LG-t-PAは、小さい合成基質に対してだけでなく、天然のタンパク 質基質プラスミノーゲンに対しても完全な酵素活性を維持していた。 表IIb．フィブリンの存在下におけるプラスミノーゲンの活性化 野生型t-PAの活性は、フィブリン、フィブリノゲン、およびフィブリノゲンの 臭化シアンフラグメントにより刺激され、そして本発明者らおよび他者らは、酵 素の少なくとも５つの異なる領域にマップされる変異が、これらの異なる補因子 によりt-PAの刺激に差別的に（differentially）影響し得ることを報告した（29 、30）。LG-t-PA中に存在する変異が、任意のこれら３つの補因子により酵素の 刺激に影響するかどうかを検討するために、本発明者らは、補因子の各々の存在 下において、２つの酵素の標準的な間接的色素原アッセイを実施した。これらの アッセイの結果を図２に示し、そしてこの結果はLG-t-PA中に存在する変異が酵 素と任意の他の補因子との相互作用を有意には弱めなかったことを示す。 フィブリンによる酵素の刺激を媒介することにおけるt-PAのEGFドメインの役 割（もしあれば）は、論議および対立する報告を生じた（９、12、31）。この研 究は論点を解決しないが、本発明者らの結果は、残基63〜71（これは、EGFドメ インの表面上の逆平行β-シートおよびβ-ターンの一部を形成する）がフィブリ ンまたはフィブリノゲンによる酵素の刺激における役割を担わないことを強く主 張する。LG-t-PA はβ3-インテグリンにナノモル濃度の親和性を有して結合する β3サブユニットを含む２つのインテグリンが記載されている。これらは血小 板インテグリンα_IIbβ3およびインテグリンα_Vβ3である。これらのインテグリ ンの両方は、抗体Fab-9をナノモル濃度の親和性を有して結合する（14、27）。 改変t-PAであるLG-t-PAの２つのβ3-インテグリンを結合する能力を、精製イン テグリンおよびLG-t-PAをコードするcDNAでトランスフェクトした細胞由来の培 養上清を使用して試験した。間接結合アッセイを使用して、インテグリンに対す るLG-t-PAの結合親和性を測定した。なぜなら、精製t-PAは、インテグリン結合 アッセイに適合性である緩衝液中で高濃度では維持され得ないからである（未発 表の観察）。その結果、インテグリンへのt-PA結合を、トランスフェクトしたCO S細胞由来の馴化培地中に存在するt-PAの量を測定し、そしてこの培地をt-PAの 供給源として使用することにより、測定した。精製インテグリンに結合したt-PA をt-PA活性として報告し、そして標準的な間接的色素原アッセイを使用して測定 した。図３に示す結合曲線（binding isotherm）は、LG-t-PAが精製インテグリ ンα_IIbβ₃を結合することを示す。非特異的結合を、EDTAを結合研究中に含める ことにより評価した。なぜなら、インテグリンへのリガンド結合は２価カチオン に依存するからである（23、32）。LG-t-PAのα_IIbβ₃への結合は特異的かつ飽 和可能であり、約0.9nMのK_Dを示す。このk_Dは解離定数が0.5〜1.3nMの範囲であ る４回の同様の実験の平均である。図３に示す実験において、見かけのk_Dは0.5n Mである。この相互作用についての平均k_Dは、このインテグリンに対するFab-9の ５nMのk_Dに良好に匹敵する（14）。親ループを含むタンパク質（Fab-9）と同様 に、改変t-PAもまたインテグリンα_Vβ₃に結合した。このインテグリンに対する 改変t-PAの親和性もまた高く、1.8nMの見かけのk_Dを有して、Fab-9により示され る1.7nMのk_Dに類似していた。従って、Fab-9のHCDR3と同一である配列を有する 直鎖状および環状合成ペプチドと対照して、LG-t-PAはFab-9により示されるイン テグリンに対する高親和性を維持した。ループ接合化t-PAはβ3-インテグリンのリガンド結合部位に結合する β3-インテグリンへのリガンド結合の品質証明（hallmark）の１つは、RGD配 列を有する小さい合成ペプチドがその結合をブロックし得ることである。RGDペ プチドがLG-t-PAをブロックする能力を、単純な競合アッセイにより試験した。 ある濃度範囲のRGDペプチドを、改変t-PAとの結合反応の間に含めた。コントロ ールとして、同一の組成ではあるがランダムな配列を有する合成ペプチドもまた 競合物として使用した。結合したt-PAを、方法に記載の間接的活性アッセイを用 いて検出した。図４に示すように、配列GRGDSPを有するペプチドは、LG-t-PAの インテグリンへの結合をブロックしたが、ランダムな配列を有するペプチドは結 合に対して効果を有しなかった。示すデータはインテグリンα_IIbβ₃についてで あり、そしてほぼ同一のデータが、RGDペプチドを使用してLG-t-PAの精製インテ グリンα_Vβ₃への結合をブロックした場合に、得られた。これらのデータは、Fa b-9と同様に、LG-t-PAがβ3-インテグリンのリガンド結合部位に結合することを 示す。 本出願を通して、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、その 全体が、本発明が関与する技術の状態をより完全に記載するために、本明細書に より参考として本出願に援用される。 本発明のプロセスはその特定の実施態様の特定の詳細を参照して記載されてい るが、そのような詳細が、それらが添付の請求の範囲に含まれない限り、そして それらが添付の請求の範囲に含まれる程度まで、本発明の範囲に対する限定であ るとみなされるべきであるとは意図されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/745 Ｃ０７Ｋ 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/02 21/08 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．標的化治療剤または診断剤であって、選択された標的に特異的に結合する単 離されたペプチド模倣物（ｂ）に連結された治療剤または診断剤の機能的物質（ ａ）を含む、標的化治療剤または診断剤。 ２．標的化治療剤または診断剤であって、選択された標的に特異的に結合する単 離された、最適化された、高親和性ポリアミノ酸（ｂ）に連結された治療剤また は診断剤の機能的部分（ａ）を含む、標的化治療剤または診断剤。 ３．標的化治療剤または診断剤であって、選択された標的に特異的に結合する単 離された天然に存在するかまたは最適化されたタンパク質表面ループ（ｂ）に連 結された治療剤または診断剤の機能的物質（ａ）を含み、ここで、該タンパク質 表面ループが機能的部分に対して内因性ではない、標的化治療剤または診断剤。 ４．前記機能的物質が、医薬用デバイスまたは診断用デバイスである、請求項１ 、２、または３のいずれかに記載の標的化薬剤。 ５．前記物質が、細胞、ウイルス、遺伝子送達ビヒクル、または生物学的分子で ある、請求項１、２、または３のいずれかに記載の標的化薬剤。 ６．前記物質が、合成または天然に存在する巨大分子である、請求項１、２、ま たは３のいずれかに記載の標的化薬剤。 ７．前記物質が、合成または天然に存在するペプチドまたはタンパク質である、 請求項１、２、または３のいずれかに記載の標的化薬剤。 ８．前記物質が、合成または天然に存在する酵素である、請求項１、２、または ３のいずれかに記載の標的化薬剤。 ９．前記物質が、抗血栓剤または抗凝固剤である、請求項１、２、または３のい ずれかに記載の標的化薬剤。 １０．前記物質が、プラスミノーゲンアクチベーターである、請求項１、２、ま たは３のいずれかに記載の標的化薬剤。 １１．前記物質が、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（tpA）、または組 織型プラスミノーゲンアクチベーターの改変体である、請求項１、２、または３ のいずれかに記載の標的化薬剤。 １２．前記物質が、ループを接合された組織型プラスミノーゲンアクチベーター （LG-tPA）である、請求項１、２、または３のいずれかに記載の標的化薬剤。 １３．前記標的が、生物学的物質である、請求項１、２、または３のいずれかに 記載の標的化薬剤。 １４．前記標的が、器官、腫瘍、組織、細胞、ウイルス、または微小組織である 、請求項１、２、または３のいずれかに記載の標的化薬剤。 １５．前記標的が、合成または天然に存在する巨大分子である、請求項１、２、 または３のいずれかに記載の標的化薬剤。 １６．前記標的が、タンパク質である、請求項１、２、または３のいずれかに記 載の標的化薬剤。 １７．前記標的が、細胞表面タンパク質である、請求項１、２、または３のいず れかに記載の標的化薬剤。 １８．前記標的が、インテグリンである、請求項１、２、または３のいずれかに 記載の標的化薬剤。 １９．前記標的が、Arg-Gly-Asp（RGD）トリペプチドモチーフに結合するインテ グリンである、請求項１、２、または３のいずれかに記載の標的化薬剤。 ２０．前記標的が、α_IIβ_Iインテグリンである、請求項１、２、または３のい ずれかに記載の標的化薬剤。 ２１．前記標的が、α_Vβ_Iインテグリンである、請求項１、２、または３のいず れかに記載の標的化薬剤。 ２２．前記最適化された高親和性ポリアミノ酸が、IgG様分子の相補性決定領域 である、請求項２に記載の標的化薬剤。 ２３．前記最適化された高親和性ポリアミノ酸が、抗体分子の相補性決定領域で ある、請求項２に記載の標的化薬剤。 ２４．前記相補性決定領域が、モノクローナル抗体Fab-9の重鎖相補性決定領域 ３（HCDR3）である、請求項２３に記載の標的化薬剤。 ２５．標的および第２のタンパク質の機能的ドメイン（ｂ）に特異的に結合する 表面ループを有する第１のタンパク質由来の表面ループ（ａ）を含む、組換え標 的タンパク質。 ２６．前記表面ループが、標的に対して指向するモノクローナル抗体の相補性決 定領域である、請求項２５に記載の組換え標的タンパク質。 ２７．前記抗体が、細胞表面タンパク質に対して指向される、請求項２６に記載 の組換え標的タンパク質。 ２８．前記細胞表面タンパク質がインテグリンである、請求項２７に記載の組換 え標的タンパク質。 ２９．前記インテグリンが、血小板糖タンパク質GPIIb/IIIa（インテグリンα_{II b} β_I）である、請求項２８に記載の組換え標的タンパク質。 ３０．前記インテグリンがα_VβIである、請求項２８に記載の組換え標的タンパ ク質。 ３１．前記表面ループが、モノクローナル抗体Fab-9のHCRD3である、請求項２９ または３０に記載の組換え標的タンパク質。 ３２．前記第２のタンパク質がヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター（t- PA）である、請求項２５に記載の組換え標的タンパク質。 ３３．前記表面ループがモノクローナル抗体Fab-9のHCRD3であり、前記第２のタ ンパク質がヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター（t-pA）であり、そして 前記標的が血小板糖タンパク質GPIIb/IIIa（インテグリンα_IIbβ_I）である、請 求項２５に記載の組換え標的タンパク質。 ３４．請求項２５に記載の組換え標的タンパク質を含む、組成物。 ３５．薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項３４に記載の組成物。 ３６．請求項３３に記載の組換え標的タンパク質を含む、組成物。 ３７．薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項３６に記載の組成物。 ３８．請求項２５に記載の組換え標的タンパク質をコードする、単離された核酸 。 ３９．請求項３３に記載の組換えタンパク質をコードする、単離された核酸。 ４０．請求項３８に記載の核酸に特異的にハイブリダイズする、単離された核酸 。 ４１．請求項３９に記載の核酸に特異的にハイブリダイズする、単離された核酸 。 ４２．請求項３８に記載の核酸を含む、組成物。 ４３．薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項４２に記載の組成物。 ４４．請求項３９に記載の核酸を含む、組成物。 ４５．薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項４４に記載の組成物。 ４６．被験体において血餅を縮小させる方法であって、請求項３３に記載のタン パク質の治療量を該被験体に投与する工程を包含し、それにより該被験体の血餅 中の血小板上の血小板糖タンパク質GPIIb/IIIa（インテグリンα_IIbβ_I）にタン パク質を結合させ、そして該被験体において血餅を縮小させる、方法。 ４７．被験体において血栓症を予防するか、血栓溶解を促進する方法であって、 請求項３３に記載のタンパク質の治療量を該被験体に投与する工程を包含し、そ れにより該被験体の血餅中の血小板上の血小板糖タンパク質GPIIb/IIIa（インテ グリンα_IIbβ_I）にタンパク質を結合させ、そして該被験体において血栓症を予 防するかまたは血栓溶解を促進する、方法。 ４８．被験体において心筋の梗栓形成を処置または予防する方法であって、請求 項３３に記載のタンパク質の治療量を該被験体に投与する工程を包含し、それに より該被験体の血小板にタンパク質を結合させ、そして該被験体において心筋の 梗栓形成を処置または予防する、方法。 ４９．治療用化合物を被験体中の腫瘍に標的化する方法であって、請求項２４に 記載の標的化薬剤を該被験体に投与する工程を包含し、ここで、前記治療物質ま たは前記診断物質が抗腫瘍治療用化合物である、方法。 ５０．治療用タンパク質を被験体中の腫瘍に標的化する方法であって、請求項３ １に記載のタンパク質を該被験体に投与する工程を包含し、ここで、前記第２の タンパク質が抗腫瘍治療用タンパク質である、方法。 ５１．治療用化合物を被験体中の破骨細胞に標的化する方法であって、請求項２ ４に記載の標的化薬剤を該被験体に投与する工程を包含し、ここで、前記治療物 質または前記診断物質が抗骨粗鬆症治療用化合物である、方法。 ５２．治療用タンパク質を被験体中の破骨細胞に標的化する方法であって、請求 項３１に記載のタンパク質を該被験体に投与する工程を包含し、ここで、前記第 ２のタンパク質が抗骨粗鬆症治療用タンパク質である、方法。 ５３．治療用化合物を被験体中の新脈管形成のプロセス中である内皮細胞に標的 化する方法であって、請求項２４に記載の標的化薬剤を該被験体に投与する工程 を包含し、ここで、前記治療物質または前記診断物質が抗新脈管形成因子または 細胞性毒素である、方法。 ５４．治療用化合物を被験体中のα_Vβ_Iインテグリンを発現する腫瘍または腫瘍 細胞に標的化する方法であって、請求項２４に記載の標的化薬剤を該被験体に投 与する工程を包含し、ここで、前記治療物質または前記診断物質が抗腫瘍活性を 有する細胞である、方法。 ５５．治療用化合物を被験体中の血管狭窄に寄与している血管平滑筋細胞（SMC ）に標的化する方法であって、請求項２４に記載の標的化薬剤を該被験体に投与 する工程を包含し、ここで、前記治療物質または前記診断物質が細胞増殖のモデ ュレーターまたは細胞性毒素である、方法。