JPH08509618A

JPH08509618A - フィブリンを標的とするトロンビン阻害剤

Info

Publication number: JPH08509618A
Application number: JP6524639A
Authority: JP
Inventors: エドガーハーバー; クリストフボーデ; マーシャルエス．ランジ
Original assignee: Harvard College; Emory University
Current assignee: Harvard College; Emory University
Priority date: 1993-05-03
Filing date: 1994-05-03
Publication date: 1996-10-15
Also published as: EP0713496A1; US5443827A; CA2161772A1; WO1994025491A1; EP0713496A4

Abstract

(57)【要約】血栓の形成と成長を防ぐために投与される、共有結合によりトロンビン阻害剤と結合した抗体のフィブリン結合性部位を含むキメラ分子。

Description

【発明の詳細な説明】フィブリンを標的とするトロンビン阻害剤産業上の利用分野本発明は、血塊形成の阻害に関する。発明の背景血塊の形成は、冠状大動脈を遮断し、産業化社会において最も多い死因の一つである心筋梗塞を引き起こしうる。ストレプトキナーゼや組織プラスミノーゲン活性化因子（tpa）のような薬剤で、閉塞した冠状動脈を酵素的に再疎通することにより、急性心筋梗塞に苦しむ患者の死亡率が有意に減少することが示されている（Gruppo Italiano per Io Studio della Streptochinasi nell'Infarto Mi ocardico(GISSI)Lancet 2:871-874,1987;Wilcox RG,Lancet 2:525-530,1988;ISI S-2 Collaborative Study Group,Lancet 2:349-360,1988）。しかし、血栓溶解による治療の限界として、再梗塞率が非常に高いということ（Gold et al.,Circ ulation 73:347-352,1986）、及び動脈の血栓は比較的溶解に対する抵抗性を有するということ（Jang et al.,Circulation 79:920-928,1989）がある。また別の経皮的血管内貫通冠状動脈形成（percutaneous transluminal coronary angio plasty)(PTCA)(Detre et al.,Circulation 80:421-428,1989）の成功後にも、急性再血栓梗塞が頻発し大きな障害となり、そして冠状動脈内のカテーテルの移植後にも難しい問題を作る（Roubin et al.,Circulation 85:916-927,1992）。現在入手できる、抗血小板剤（ISIS-2 supra）及び抗凝固剤（Hsia et al.,N Engl J Med 323:1433-1437,1990）の併用は、これらの問題を克服しそしてまた再狭窄を減少させるのに、いくらか有益であることが示されている（Hanke et al.,C irculation 85:1548-1556,1992）。トロンビンは、フィブリノーゲンからのフィブリンの形成を触媒することにより、そしておそらくより重要なのは、血小板の最も強力な活性化剤として働くことにより、血液凝固において中心的な役割を果たしている血中酵素である。抗凝固剤のヘパリンは、トロンビンの作用の阻害において、限定された効果しかもたないことが実験により示されている。多くの直接のトロンビン阻害剤は、血小板に依存する冠状動脈血栓症の阻害、及び血栓溶解による再灌流後の再血栓の阻害において有効であることが、実験動物で示されている（Haskel,Circulation 83: 1048-1056,1991;Jang e tal.,Circ.Res.67:1552-1561,1990;Heras et al.,Circu lation 82:1476-1484,1990;Kelly et al.,Blood 77:1006-1012,1991;Sitko et a l.,Circulation 85:805-815,1992）。これらのトロンビンアンタゴニストのひとつに、ヒルドメディシナリス（Hirudo medicinalis）というヒル由来の抗凝固剤、ヒルジンがある（Dout et al.,FEBS 165:180-184,1984）。ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼのようなプラスミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲンが、フィブリン溶解活性型プラスミンへ変換するのを触媒する。これらの試薬は、循環血中プラスミノーゲン及びフィブリン結合プラスミノーゲンを活性化し、それにより血栓中のフィブリン溶解に影響を与えるだけでなく、体内中のフィブリン溶解を促進する。組織型プラスミノーゲン活性化因子は、幾分特異性の問題が改善されているが、フィブリン溶解剤及びトロンビン阻害剤の治療のための投与にはいずれも、選択性及び潜在性を欠いているために広範な出血を引き起こすという問題が残される。発明の要約ここに述べる実験は、抗体が血栓部位のフィブリンに結合し、ヒルジンの局所濃度が増加することにより、フィブリン特異的抗体により指向化されたヒルジンが、ヒルジン単独の場合よりも強力に血栓の成長を阻害することを証明している。臨床適用には、全身的な抗凝血剤と対照的な、局所的な血栓症阻害が含まれる。トロンビン阻害剤の抗トロンビンによる指向化は、動脈カテーテル移植のような血栓の起こりやすい場合に特に有用であり、選択性の高い血栓溶解剤との併用剤としても用いることができる。 59D8と命名されたモノクローナル抗体のようなフィブリン特異的抗体と結合させることにより、トロンビンアンタゴニストの指向化も達成された。59D8抗体の結合するエピトープは、トロンビンがフィブリノペプチドBを切断した後にのみ結合可能になる。59D8は、未分解フィブリノーゲンとは交叉反応しないことが示されている。このように、抗トロンビン結合体は、トロンビン活性の現れる部位にのみ局所的に蓄積し、それ以上のトロンビン作用を阻害する。阻害に必要な分子そのものにより引き起こされる、このような阻害の選択性により、投与に必要な抗トロンビン活性の総量は相当減少する。阻害剤の濃度が血栓に集中するために、抗凝血に必要な阻害剤の血漿中濃度は減少し、広範な出血の可能性は減少する。本発明の特徴は、トロンビン活性のアンタゴニストが、抗体のフィブリン結合ドメインに結合したキメラタンパクである。好ましくは、キメラタンパクは、フィブリン特異的抗体、フィブリン特異的Fab'フラグメント、Fvフラグメントのいずれかに結合したトロンビンアンタゴニストを含む。抗体のフィブリン結合ドメインは、フィブリンの前駆体であるフィブリノーゲンには結合しないのが好ましい。フィブリン結合ドメインは、トロンビンがフィブリノペプチドBを切断した後に、新たに露出されるフィブリンβ鎖のアミノ末端に特異的であればより好ましい。このようなフィブリン結合ドメインの例としては、モノクローナル抗体59 D8のドメインがある。キメラのトロンビン活性を阻害する部分には、ヒルジン、又はヒルジンの活性フラグメント、又はヒルジンの誘導体が好ましい。「活性フラグメント」という用語は、以下に述べる、S-2238発色アッセイにおいて、天然ヒルジンのトロンビン阻害活性の少なくとも50％のトロンビン阻害能を有する、抗体に結合していないペプチドを意味する。「フラグメント」という用語は、ポリペプチドについて用いるとき、天然タンパク質からタンパク分解した、又は遺伝子組換えにより発現させた、又は合成された、全タンパクのペプチドを表し、そして最低６個の運続したアミノ酸である。本発明において、フラグメントの長さは、連続残基が約20個が普通で、最低40 個が好ましく、最低50個ならより好ましく、最低60個が最も好ましい。このようなペプチドは、タンパク質のタンパク分解、フラグメントのde novo合成、遺伝子工学などを含む、当業者に知られた方法により作成される。ペプチドは、D-アミノ酸、又はL-アミノ酸、又はその混合物として作られる。キメラタンパクのタンパク分解を防ぐため、アミノ末端又はカルボキシル末端アミノ酸としてD-アミノ酸をもつペプチドは、特に好ましい。また、上記のペプチドの化学誘導体も、本発明の範囲内である。化学誘導体とは、一つ又は複数の、負の電荷をもつ側鎖を加えたペプチドと定義する。誘導の方法は当業者によく知られているものであり、チロシンの水酸基のメチルスルホン化、リン酸化、炭化；又はチロシンのベンジルメタ炭素のスルホン化、リン酸化、炭化などが含まれるが、これに限定されない。キメラタンパクの片方又は両方の末端は、アルデヒドのような標準的な保護基の存在により、タンパク分解から保護するのが好ましい。t-ブチロキシカルボニル、アセチル、セイル、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリル、アジピル、アゼライル、ダンシル、ベンジロキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアゼライル、メトキシアジピル、メトキシスベリル、2,4-ジニトロフェニルのようなアミノ末端保護基も有用である。キメラタンパクの構成成分は、ジスルフィド結合のような共有結合により連結される。もう一つの例としては、遺伝子組換えにより、二つのキメラ構成成分がペプチド結合により連結したキメラタンパクが作られる。本発明の治療法には、薬剤学的に適した媒体中に入れたキメラタンパクの投与を含む。本発明においてはさらに、動物の循環系へのキメラの導入を含む。具体的には、キメラタンパクを、個体から採り出した血液に導入、又は接触させて、それから処理をした血液を動物に戻す。本発明は、本発明キメラタンパクと、抗体のフィブリン結合ドメインがフィブリン溶解剤に結合したもう一つのキメラタンパクとの混合物も含む。例えば、「米国特許第5,116,613号」に明らかにされており、これも参照として本発明に含む。第二のキメラのフィブリン特異的抗体部分は、第一のキメラのものと、同一でも異なっていてもよい。トロンビンアンタゴニストにはヒルジンが好ましいが、フィブリン溶解剤にはストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子のいずれかが好ましい。タンパク混合物は、動物の循環系に導入され、異常な凝血を溶解し、それ以上の形成を妨げる。別の例としては、治療のために動物から採り出した血液に、混合物を導入し、動物に戻す。血液凝固を妨げるために核酸を個体に投与することのみならず、キメラタンパクをコードする核酸、及びその核酸を含有しタンパク質を発現する細胞も、本発明の特徴である。例えば、トランスフェクトし、キメラタンパクを発現するようになった細胞を動物（例えばヒトの患者）に導入する治療法において、このような細胞は有用である。キメラタンパクをコードする核酸、及びフィブリン結合ドメインがフィブリン溶解剤に結合した、第二のキメラタンパクをコードする核酸を投与し、血塊を防止又は溶解する治療法もまた本発明に含まれる。本発明のキメラタンパクをコードする核酸を含有、発現する第一の細胞集団、及びフィブリン結合ドメインがフィブリン溶解剤に結合した、第二のキメラタンパクを生産する第二の細胞集団という、二つの細胞集団を投与する治療法は、より好ましい。本発明は、トロンビン活性のアンタゴニストがフィブリン特異的抗体に結合した組換えキメラタンパクをコードする核酸、及びその組換えキメラタンパクを発現する細胞も含む。また、このようなキメラタンパクをコードする核酸を、単独で、又はフィブリン結合ドメインがフィブリン溶解剤に結合したキメラタンパクをコードする核酸と共に、患者の血液に投与する方法、及び各々の組換えタンパクを発現する細胞を、別々に又は同時に投与する方法も本発明の範囲内である。図の簡単な説明図1A及び図1Bは、ヒルジン-59D8-Fab'結合体、及びその親分子を、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）（12.5％ゲル）により分離し、クーマシーブルーで染色した写真である。；電気泳動は、非還元（図1A）及び還元（図1B）条件下で行った。レーン1、分子量スタンダード；レーン2、59D8-Fab '；レーン3、ヒルジン-59D8-Fab'結合体の最終調製物；レーン4、ヒルジン。分子量スタンダードは、フォスフォリラーゼb（94kDa）、ウシ血清アルブミン（67 kDa）、オボアルブミン（43kDa）、炭酸デヒドラターゼ（30kDa）、大豆トリプシンインヒビター（20.1kDa）、ラクトアルブミン（14.4kDa）である。図2A及び図2Bは、固定化標的分子のβペプチドへの結合能としてのトロンビン阻害を表すグラフである。トロンビンによる発色基質S-2238分解の、ヒルジン依存性阻害を、405nmで記録し、添加総トロンビンの阻害％で表した。図2A：ヒルジン-59D8-IgG結合体（●−●）対ヒルジン（○−○）。図2B：ヒルジン-59D8-F ab'結合体（●−●）対ヒルジン（○−○）。各点は、３つの独立した実験を表す。図3A及び図3Bは、フィブリン−セファロースアッセイにおける、トロンビン阻害（全量に対する％）を、トロンビン阻害剤のアプライ濃度に対してプロットしたグラフである。各データの点は、３つの独立した実験を表す。図3Aのトロンビン阻害剤は、ヒルジン-59D8-IgG結合体（●−●）及びヒルジン（○−○）、図3 Bは、ヒルジン-59D8-Fab'結合体（●−●）及びヒルジン（○−○）である。図4A及び図4Bは、血漿塊の表面の、フィブリン沈殿を表すグラフである。図4A は、フィブリノーゲン溶液中に懸濁した血塊の表面の、ヒルジン又はヒルジン-5 9D8-IgG結合体による、フィブリン沈殿の時間経過を示している。：80ATU/ml（ □−□）、8ATU/ml（○−○）、2.4ATU/ml（◇−◇）のヒルジン、及び7.4ATU/m l（●−●）、1.2ATU/ml（◆−◆）のヒルジン-59D8-IgG結合体。図4Bは、フィブリノーゲン溶液中に懸濁した血塊の表面の、ヒルジン（○−○）又はヒルジン -59D8-IgG結合体（●−●）による、120分の、トロンビン阻害としての、フィブリン形成阻害を表すグラフである。図4Bにおける各点は、３つの同じ実験を表している。図5A及び図5Bは、フィブリノーゲン溶液中のフィブリン沈殿を示すグラフである。図5Aはフィブリノーゲン溶液中に懸濁した血塊の表面の、ヒルジン又はヒルジン-59D8-Fab'結合体によるフィブリン沈殿の時間経過である。：100ATU/ml（ □−□）、30ATU/ml（○−○）、10ATU/ml（◇−◇）のヒルジン、及び9.25ATU/ ml（■−■）、3ATU/ml（●−●）、0.1ATU/ml（◆−◆）のヒルジン-59D8-Fab' 結合体。図5Bは、フィブリノーゲン溶液中に懸濁した血塊の表面の、ヒルジン（ ○−○）又はヒルジン-59D8-Fab'結合体（●−●）による、180分の、トロンビン阻害としての、フィブリン形成阻害を表すグラフである。図5Bにおける各点は、３つの同じ実験を表している。図6A及び図6Bは、ヒト血漿中のフィブリン沈殿を示すグラフである。図6Aは、ヒト血漿中に懸濁した血塊の表面の、ヒルジン又はヒルジン-59D8-Fab'結合体によるフィブリン沈殿の時間経過である。：100ATU/ml（○−○）、10ATU/ml（◇ −◇）のヒルジン、及び10ATU/ml（●−●）、1ATU/ml（◆−◆）のヒルジン-59 D8-Fab'結合体及びNaClコントロール（x−x）。図6Bは、ヒト血漿中に懸濁した血塊の表面の、ヒルジン（○−○）又はヒルジン-59D8-Fab'結合体（●−●）による、120分の、トロンビン阻害としての、フィブリン形成阻害を表すグラフである。図6Bにおける各点は、３つの同じ実験を表している。図7は、ヒト血漿中に懸濁した血塊の表面の、ヒルジン、及びヒルジンと59D8- Fab'の１：３モルの混合物によるフィブリン沈殿の時間経過である。：44ATU/ml の混合物、及びNaClコントロール（x−x）。詳細な説明本発明に従って、抗血栓剤の血塊表面への特異的指向化が研究された。フィブリン結合トロンビンを阻害することのできる、トロンビンアンタゴニストであるヒルジンを、抗フィブリン抗体59D8及び59D8のフィブリン特異的Fab'フラグメントに結合させた。凝血の初期にトロンビンがフィブリノペプチドBを切断した後に露出されるようになる、フィブリンβ鎖の新アミノ末端に、59D8は選択的に結合する（Hui et al.,Science 222:1129-1131,1983）。このようなヒルジンの指向化により、まさにトロンビン作用及び血栓成長の起こっている部位において、フィブリン沈殿が劇的に減少する。試薬発色基質、S-2238（H-Dフェニルアラニル-L-ピペコリル-L-アルギニン-p-ニトロアラニンジヒドロクロリド）は、「クロモジェニック、スウェーデン、メードリンダル」（Chromogenix,Modjndal,Sweden）より入手した。N-スクシニミジル3 -（2-ピリジルジチオ）プロピオン酸（SPDP）は、「ピアスケミカル」（イリノイ州ロックフォード）（PierceChemical(Rockford,Illinois)）より購入し、¹²⁵ Ｉ標識フィブリノーゲンは、「アマシャム」（イリノイ州アーリントンハイト） Amersham（Arlington Height,Illinois）より入手した。新鮮凍結血液は、「ハイデルベルグ大学血液バンク」（University of Heidelberg blood bank）及び「ドイツ赤十字」（German Red Cross）より購入した。その他の化学薬品はすべて、「シグマケミカル」（ミズーリ州セントルイス）（Sigma Chemical,St.Loui s,MO）より購入した。ヒルジン天然タンパク質の配列をもった組換えヒルジン（Dodt et al.,FEBS 1104 165: 180-184,1984,参照として本発明に含まれる。）（配列番号：１）［r-ヒルジン（r-H irudin）LU 52369,特異的活性：17,000抗トロンビンユニット（ATU）/mg］は、「クノール」（ドイツ、ルートヴィヒスハーフェン）（Knoll AG,Ludwigshafen, Germany）より入手した。以下のような、抗トロンビン及び抗凝血活性を有するヒルジンのフラグメント及び誘導体が、当業者に知られている。ヒルジンPA（配列番号：２）（Dodt,J.et al.,米国特許第4,767,742号）；配列X-AA₃-[AA₄-AA₆₂ ]-AA₆₃-Zのポリペプチド。ここでAA₃は、求電子化学修飾に非感受性の、チロシン以外の保存アミノ酸残基、AA₄-AA₆₂は、天然ヒルジン配列のアミノ酸4-62（Do dt et al.,FEBS 1104 165:180-184,1984）（配列番号：３）、AA₆₃は、チロシン残基、又はフェニル環の３位に、或いは３、５位に電子吸引性の置換基を含むように修飾を受けたチロシン残基、Xは、水素、又は天然ヒルジン配列のいくつか或いはすべてに相当する、N末端に続く配列、Zは、水酸基、又は天然ヒルジン配列のいくつか或いはすべてと等しい、C末端に続く配列である（Winant,R.C.et a l.,米国特許第5,118,790号）。；配列Asn-G1y-Asp-Phe-G1u-Glu-Ile-Pro-Glu-Gl u-Tyr-X（配列番号：４）のペプチド、及びそのD体。ここでXは、COOH、Leu、Le u-Glnのいずれかである。；配列Y-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Z（配列番号：５）のペプチド、及びそのD体。ここでZは、NH₂、アミノ保護基、アミノ酸配列：Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp（配列番号：６）の少なくともC末端部分、アミノ酸配列：Val-Thr-Gly-Glu-Gly-T hr-Pro-Asn-Pro-Glu-Ser-His-Asn-Asn-Gly-Asp（配列番号：７）の少なくともC 末端部分のいずれか、そしてzは、COOH，Leu、Leu-Glnのいずれかである。；またチロシン残基は、負に帯電した側鎖が存在するという特徴をもつ（Maranganor e,J.M.,European Patent Application 333356）。上記の各参照は、参考として本発明に含まれる。トロンビン阻害剤当業者に知られているその他のトロンビン阻害剤は、抗トロンビンIII（Sheff ield et al.,Blood 79:2330-2339,1992）；β，β’モノクロルメチレンジアデノシン5'5'''-P¹P⁴-四リン酸（Kim et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11056-1 1058,1992）；Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH、Boc-(D)Phe-Pro-boroArg-C₁₀H₁₆、H- (D)Phe-Pro-boroArg-OH、H-(D)Phe-Pro-boroArg-D₁₀H₁₆（Kettner et al.,J.Bio l.Chem.265:18289-18297,1990）のようなボロアルギニンペプチド；D-Phe-Pro-A rg(CSA P)、［Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(OSO₃)-Leu（配列番号：８）、スルホン化されたヒルジンC末端12ペプチド］（ESAP）、［D-Phe-Pro-Arg -Pro-(Gly)₄-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu］（配列番号：９）（BAP）（Kelly et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6040-6044,1992）のような合成ペプチド；3,4,-ジヒドロ-3-ベンジル-6-クロロメチルクマリン（Mor et al.,Biochim Biophys Acta 1038:119-124,1990）；D-フェニルアラニル-プロリル-アルギニンクロロメチルケトン-処理α-トロンビン（PPACK-IIa）（Sc hmaier et al.,Thromb.Res.67:479-489,1992）；D-Phe-Pro-Arg-H(ALD)及びD-Ph e-Pro-Arg-CH₂Cl(CMK)（Bagdy et al.,Thromb.Res.67:221-231,1992）のようなトリペプチド阻害剤；Nα-（β-ナフチルスルホニルグリシル）-4-アミジノフェニルアラニンピペリジド（NAPAP）（Sturzebecher et al.,Biol.Chem.Hoppe-Sey ler 373:491-496,1992）のようなベンズアミジンベースの阻害剤；（2R,4R）-4- メチル-1-［N^α-（3-メチル1,2,3,4-テトラヒドロ-8-キノリンスルホニル）-L- アルギニル］-2-ピペリジンカルボキシル酸（MQPA）（Bode et al.,Eur.J.Bioch em.193:175-182,1990）のようなアルギニンベースの阻害剤；N^α-アセチル［D-P he⁴⁵,Argφ(COCH₂)⁴⁷,Gly⁴⁸］デスルホヒルジン^45-65(P79)（DiMaio et al.,FEB S Lett.282:47-52,1991）のような、切れやすいペプチド結合を組み込んだトロンビン阻害剤；［アセチル-(D)-Phe⁴⁵,Pro⁴⁶,Argφ(COCH₂)CO^47.48,Gly⁴⁹］ヒルジン^45-65 （ヒルトニン-1）、［アセチル-(D)-Phe⁴⁵,Pro⁴⁶,Argφ(COCH₂)CH₂CO⁴⁷］ヒルジン^45-65 （ヒルトニン-2）、［アセチル-(D)-Phe⁴⁵,Pro⁴⁶,Argφ(COCH₂)CH₂CH₂CO^47.48］ヒルジン^45-65（ヒルトニン-3）、［アセチル-(D)-Phe⁴⁵,Pro⁴⁶,Argφ(COCH₂)CH₂CH₂CH₂CO^47.48］ヒルジン^45-65（ヒルトニン-4）（DiMaio et al.,J.Med.Chem.35:3331-3341,1992）のようなケトメチレン擬ペプチドなどがある。トロンビン阻害剤に関する上記の参照は、参考として本発明に含まれる。フィブリン特異的抗体モノクローナル抗フィブリン抗体59D8（ATCC Accession No.HB 8546）は、前述（Matsueda et al.,米国特許第4,916,070号,参照として本発明に含まれる）のように調製し、精製した。その他の、フィブリノーゲン交叉反応性のないフィブリン特異的モノクローナル抗体の製造方法は、「Matsueda et al.,米国特許第4,92 7,916号」に詳述されており、これも参照として本発明に含まれる。実施例１：化学的に結合したヒルジン-59D8 IgG及びヒルジン-59D8 Fab' 59D8-IgG結合体の調製ジスルフィド結合で連結した、ヒルジン-IgG結合体は、ヒルジンのN-スクシニミジル3-（2-ピリジルジチオ）プロピオン酸（SPDP）誘導体を、2-イミノチオレイン置換抗フィブリンモノクローナル抗体59D8と反応させることにより調製した。8mgのヒルジンを2mlの50mMカルボン酸ナトリウム緩衝液,（pH8.5）に溶解した。次に、2mlのn-プロパノールを加えた。ヒルジン溶液に、SPDPを３倍モル過剰（無水エタノール中に20mM）に滴下した。この混合液を室温で３分間穏やかに撹拌し、それからPBS（0.1M NaH₂PO₄,0.1MNaCl,pH:7.4）で平衡化しておいたセファデックス（Sephadex）G-25カラム（1.6X90cm）にかけた。ピークのタンパク画分を取集し、2-ピリジルジスルフィド量を分析する（Carlsson et al.,Biochem J.173:723-737,1978）と、典型的に、ヒルジン１分子につき0.6-1.5残基を示した。SPDP置換レベルは、ヒルジン活性の消失を制限し、そしてより高分子量の凝集物の生成を避ける目的で低く保った。SPDP修飾ヒルジンの特異的活性は、平均で非修飾ヒルジンの53％であった。その他のトロンビンアンタゴニストは、SPDP又はスクシニミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレイト（SMCC）のような試薬により修飾し、単一の末端チオール反応性基を加えることができる。このようにして修飾されたその他のアンタゴニストは、その後2-イミノチオレイン置換した抗フィブリン抗体、又はフィブリン特異的Fab'或いはFvに結合させることができる。抗フィブリンモノクローナル抗体59D8は、βペプチド、Gly-His-Arg-Pro-Leu- Asp-Lys（配列番号：10）に対して作成した。モノクローナル抗体59D8（0.14M N aCl,3.7mM Na₂PO4,1mM KCl,pH7.4中に4mg/ml）を等量（v/v）の1,000倍モル過剰の2-イミノチオレイン（25mMホウ酸ナトリウム,pH9.3中）と混合した。室温で、穏やかに撹拌しながら25分間反応させた。過剰のイミノチオレインを、PBS,pH6. 6で予め平衡化しておいたセファデックスG-25のゲル濾過により除去した。それから、10 倍モル過剰のSPDP修飾ヒルジンを、イミノチオール化した抗体と混合し、室温で５時間穏やかに撹拌した。反応は、0.1MNa₂HPO₄,pH8.0中のヨウ化アセトアミドをヒルジン濃度と比較して10倍モル過剰に加えることにより停止した。 59D8-Fab'結合体の調製抗体59D8の（Fab'）₂は、標準的な方法でペプシン切断することにより得た。マレイミドベンゾイルスクシニミドエステルを用いて、合成β-ペプチド、Gly-H is-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-(Cys)（配列番号：11）をシステイン残基を介してリジン−セファロースにカップリングさせることにより得られた、β-ペプチドセファロースアフィニティカラムで、抗体59D8の（Fab'）₂をアフィニティ精製した。このカラムからの溶出液（0.2Mグリシン,pH2.8）を、PBSに対して透析し、（F ab'）₂及び微量のFab'、又はFabのみが含まれていることを、SDS-PAGEにより確認した。59D8（Fab'）₂の還元は、1mM 2-メルカプトエチルアミン、1mM EDTA、10 mMヒ酸ナトリウム中で、室温で、18時間行い、固体Ellman試薬（シグマケミカル、ミズーリ州セントルイス）（SIGMA Chemical Company,St.Louis,MO）を5mMの濃度になるように添加した。室温で、３時間後、過剰の試薬を、0.1Mリン酸ナトリウム（pH,6.8）で平衡化したセファデックスG-25カラム（30X2cm）のゲル濾過によって除去した。このような保護をした状態では、59D8 Fab'は、無菌的条件下において、４℃で少なくとも１年間、構造的及び機能的に完全に保存される。 59D8 Fab'のチオール型は、室温で30分間、10mMの2-メルカプトエチルアミンで処理し、ゲル濾過を行うことにより容易に再生される。キメラタンパクは、フィブリン特異的Fvフラグメントを、トロンビンアンタゴニストに結合させることによっても作成される。Fvフラグメントは、当業者に知られた方法により作られ（Anthony et al.,Mol.Immunol.29:1237-1247,1992;Hus ton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 85:5879-5883,1988）、上記のような2-イミノチオレイン置換により修飾し、メルカプト基を導入できる。チオール型の59D8 Fab'（1mg/ml）をSPDP修飾ヒルジン（1mg/ml）と混合し、室温で16時間反応させた。最終調製物中の未反応59D8Fab'の量を最小限にするため、ヒルジンは、10倍モル過剰に混合液中に存在させた。反応は、上記のように、過剰のヨウ化アセトアミドを加えることによって停止した。 59D8 Fv、又はその他のフィブリン特異的Fab'或いはFvフラグメントのチオール型は、上記のように、ヒルジンと結合することができる。 59D8結合体の精製ヒルジン-59D8-IgG結合体及びヒルジン-59D8-Fab'結合体は、いずれも、βペプチド−セファロースカラムのアフィニテイクロマトグラフィにより、反応液から部分精製した。アフィニテイカラムは、59D8-IgG又は59D8-Fab'の、結合型及び非結合型を保持するが、カップリングしていないヒルジンは保持しない。このカラムからの溶出液（0.2Mグリシン,pH2.8）を、PBSに対して透析し、４℃、無菌状態で保存した。また、カップリングしていないヒルジンは、セファデックス G-100のゲル濾過によっても反応混合液から除去されるであろう。電気泳動及びデンシトメーターによるスキャン Laemmliの方法（Laemmli et al.,Nature 227:680-685,1970）に従って、SDS-P AGEを行い、タンパク質を、クーマシーブリリアントブルーG-250（Neuhoff et a l.,Electrophoresis 9:255-262,1988）により染色した。タンパクの相対定量をするため、ゲルをLKBウルトラスキャンXLレーザーデンシトメーターにより633nm でスキャンした。定量は、ヒルジン結合59D8-IgGと非結合59D8-IgG、又はヒルジン結合59D9-Fab'と非結合Fab'のバンドが分離した非還元ゲルで行った。タンパク質の定量タンパク質の濃度は、ローリー法（ウシ血清アルブミンをスタンダードとした）（Lowry,J.Biol Chem 193:265-275,1951）により、又は280nmにおける光学濃度を測定することによりアッセイした。ヒルジン活性の定量（S-2238アッセイ） S-2238アッセイは、トロンビン活性、及びその抗トロンビンによる阻害を測定するものである。アッセイ用緩衝液（20mM炭酸二水素ナトリウム，0.15M NaCl,0 .1％ BSA,pH7.4）中の、試料のヒルジン又はヒルジン-59D8結合体100μlにトロンビン溶液（2.5U/ml水）を20μl加え、室温で10分間インキュベートした。それから50μl（0.833mg/ml）の発色基質S-2238（H-Dフェニルアラニル-L-ピペコリル-L-アルギニン-p-ニトロアニリンジヒドロクロリド）を加えた。正確に５分間インキュベートした後、50μlの20％酢酸を加えて反応を停止させ、テスト結果を、405nmで測定した。定量は、テスト試料中のトロンビン活性阻害を、別の非結合ヒルジンの既知濃度と比較することにより行った。ヒルジン活性が0-0.6U/mlの領域では、抗トロンビン濃度が確実に直線関係となり、試料が高活性である場合は、適宜希釈をした。 β-ペプチドアッセイ 96ウェルの微量力価プレートを、４℃で一晩、β-ペプチドでコートした。0.0 05mgのβ-ペプチドを含む100μlのコーテイング用緩衝液（20mM トリス,50mM Na Cl,1mMCaCl₂,1mM MgCl₂,pH7.4）を、各ウェルに滴下した。コーテイング後、微量力価プレートを、まず0.05％ Tween20を加えたコーテイング用緩衝液で５回洗浄し、それから水で３回洗浄した。未反応の結合部位は、各ウェルに250μlのウシ血清アルブミン（コーテイング用緩衝液中に２％w/v）を加えることにより、４℃で一晩ブロックした。洗浄作業を繰り返し、S-2238アッセイによる一定量のヒルジン、又はヒルジン-59D8結合体（0.1M NaCl,0.1M NaPO₄,pH7.4中のヒルジン-59D8 IgG或いはヒルジン-59D8 Fab'）を、各ウェル中に100μlの緩衝液に滴下し、室温で２時間インキュベートした。３つの同じ試料を、同時にアッセイした。修飾コーテイング用緩衝液（20mMトリス,0.5M NaCl,1mM CaCl₂,1mM MgCl₂,0.2 ％ Tween20,pH7.4）で７回、水で３回洗浄した後、各ウェルに、100μlのアッセイ用緩衝液（20mM NaHPO₄,0.15M NaCl,0.1％ BSA,pH7.4）を滴下し、続いて20μ l（1.25U/ml）のトロンビン溶液を滴下して室温で１時間インキュベートした。それから、50μlの発色基質（0.83mg/mlのS-2238）を滴下して、20分後、50μl の20％酢酸を添加して反応を停止させ、反応を405nmの吸光度で測定した。ヒルジン活性をトロンビン活性阻害として検出し、滴下した総トロンビン活性の％阻害として表した。フィブリン−セファロースアッセイこのアッセイは、「Bode et al.,J.Biol.Chem.262:10819-10823,1987,参照として本発明に含まれる。」に記述された方法に、以下の修飾を加えて行った。指向化抗トロンビン活性をアッセイするには、フィブリンモノマーの微量標識は必要ない。200μlのフィブリン−セファロースを、100μlの緩衝液中の一定量（S- 2238アッセイによる）のヒルジン、又はヒルジン-59D8結合体（ヒルジン-59D8-I gG或いはヒルジン-59D8-Fab'）と共に、室温で2.5時間インキュベートした。フィブリン−セファロースを、3mlの0.15M NaClで３回洗浄後、200μlのS-2238アッセイ用緩衝液と40μl（0.05U）のトロンビン溶液（1.25U/ml）を添加し、室温で１時間インキュベートした。続いて、100μlの発色基質S-2238を加え、25分後、10 0μlの20％酢酸を加えて反応を停止した。遠心分離（５分間,1,000xg）後、上清の吸光度を405nmで測定した。再び、ヒルジン活性をトロンビン活性阻害として検出し、滴下した総トロンビン活性の％阻害として表した。フィブリノーゲン溶液中の血栓成長の阻害 Runge（Runge et al.,Biochemistry 27:1153-1157,1988,参照として本発明に含まれる。）の方法に、以下の修飾を加えた。５人の提供者から得た、新鮮凍結血漿をまとめて集め、等分して再冷凍した。各実験の前に、血小板を含まない血漿を得るために（血小板数は1,000血小板/μl以下）、Beckmann SW 40ローターで、血漿を30,000rpm、60分間の超遠心にかけた。各実験の直前に、ヒルジン及びヒルジン結合体の抗トロンビン活性をS-2238アッセイにより測定した（例えば、ヒルジン及びその結合体によるトロンビンペプチダーゼ活性阻害を決定し、トロンビンペプチダーゼ活性の阻害が各サンプルについて等しくなるよう適宜希釈した）。血小板を含まない血漿塊は、血漿に、順に¹²⁵Ｉ-標識ヒトフィブリノーゲン（20,000cpm/ml血漿）、0.5M CaCl₂（最終濃度0.05M）、トロンビン（0.5NI Hユニット/ml血漿）を加えることにより作った。トロンビン添加直後に、溶液をシラステイックチューブ（内径4mm）に吹い込み、37℃で２時間、血塊を作成した。それからチューブを1.8cm片に切断し、約0.2mlの血塊を得た。血塊をチューブから取り出し、各々をプラスチックバイアルに入れ、2mlの0.15MNaClで３回洗浄した。それから、各々の放射能レベルを測定し、平均値の５％範囲内の血塊のみを実験に用いた。測定後、血塊を100μlのTBS（0.1M Tris,0.1M NaCl,pH7.4）に再懸濁した。実験は、一定量の抗トロンビン活性を含む、100μlのヒルジン又は結合体溶液を添加することにより開始した。それから、¹²⁵Ｉ-フィブリノーゲン（250,000cpm/m l）で標識した200μlのフィブリノーゲン溶液（8mg/ml）を血塊に加えた。アッセイ中のフィブリノーゲンの最終濃度は、このように生理学的範囲内（4mg/ml）にした。あらかじめ決めた間隔を置いて、テストチューブから血塊を取り出し、 2mlの0.15M NaClで３回洗浄し、放射活性を測定した。トロンビン阻害剤を含まずにインキュベートした血塊（NaClコントロール）は、アッセイ混合液が、完全に凝固してしまうため、インキュベーションバイアルから定量的に取り出せないことが多かった。ヒト結晶中の血栓成長阻害これらのアッセイは上記のように行った。血塊を200μlの血小板を含まない血漿（200μlのフィブリノーゲン溶液の代わり）と共にインキュベートし、¹²⁵Ｉ- フィブリノーゲン（250,000cpm/ml）の標識により追跡した。統計解析図２と図３の用量−反応曲線を、各々を真数機能（antilogit function）での各曲線と相応させることにより比較した（各アッセイにおけるヒルジン-59D8結合体対非結合ヒルジンコントロール）。ここで、B1は、阻害剤の無限濃度における最大トロンビン阻害、B2は、阻害剤濃度（ATU）の上昇に伴う阻害の増加に関する速度定数、ATU_oは、最大（B1）阻害が1/2となる阻害剤の濃度（ATU/ml）である。各々の曲線についての３つのパラメーターB1、B2、ATU_o、及び各パラメーターの変動は、RS/1データ解析ソフトウェア（BBN Software Products,マサチューセッツ州ケンブリッジ（Cambridge, MA））のフィットファンクション（FIT FUNCTION）処置を用いて推計した。各曲線に対応するパラメーター（B1、B2、ATU_o）は、ｔ検定により比較した。フィブリン値を、３時点すべてを通る各曲線にバッチし、それからいくつかの曲線の間に有意差が存在することを一方向変動解析（ANOVA ONEWAY処置、RS/1ソフトウェア）により確認した後、各曲線の平均フィブリン沈殿値（μg）についてｔ検定を行うことにより、図４、５、６におけるフィブリン沈殿を表す時間経過曲線を比較した。この処置は、複数の比較をすることにより、過度の差を検出することを防ぐための手段として行った。まず各阻害剤ごとに、フィブリン沈殿対阻害剤用量の直線回帰分析をし、それから、傾きと回帰直線の切片をｔ検定で比較することにより、図４、５、６における用量−反応曲線を比較した。フィットファンクション処置（RS/1ソフトウェア）を、直線回帰パラメーターの変動を推測するために用いた。図７の時間経過曲線は、時間を共変体として、共分散の解析をするのに充分な程度に直線であった。この分析により、フィブリン沈殿の時間経過が、様々な阻害剤間で同一であるという仮定をNaClコントロールの有無両方でテストした。共分散の分析の後には、様々な阻害剤曲線（P4V操作、BMPD統計ソフトウェア、Uni versity of California Press,バークレイ、ロサンジェルス（Berkeley and Los Angeles）,1990）を対にして直線対照比較した。引用したエラー推計はすべて、推計の標準的な導出である。有効性の違いは、推計ATU_oパラメーターの比により表される。ヒルジン-59D8-IgG及びヒルジン-59D8-Fab'結合体の特徴決定 SPDP修飾ヒルジンを、イミノチオレイン修飾抗体或いはFab'とカップリングさせることにより得られた、ジスルフィド結合した結合体の性質は、カップリング条件、及び精製過程により一部決定された。完全な、修飾されていないリジン-47が、抗トロンビン効果に必須であるため、ヒルジンの生化学的活性は、SPDP修飾の影響を受ける。従って、タンパク質のアミノ末端の好ましい修飾が行われるような、基本的な反応条件が選択された。さらに、二つ以上の反応基にヒルジン分子が導入されないように、SPDPは低濃度で用いた。しかしながら、上記のような条件下で調製した際にも、トロンビン阻害のS-2238アッセイによると、SPDP-ヒルジンは修飾していないヒルジンの平均5 3％の活性しかもたなかった。結合体を、βペプチド−セファロースカラムにより部分的にアフィニテイ精製した。溶出液は、目的のヒルジン-59D8-IgG或いはヒルジン-59D8-Fab'結合体、及び未結合の59D8-IgG或いは59D8-Fab'を含んでいた。未結合IgG或いはFab'の量を最少限にするため、10倍モル過剰の修飾ヒルジンを反応液中に用いた。親分子及び結合体は、還元条件下及び非還元条件下（図1A及び図1B）でSDS-PA GEにより分析した。非還元条件下（図1A）で電気泳動すると、ヒルジン-59D8-Fa b'結合体（レーン３）は57kDaに現れた。ヒルジンと59D8-Fab'は各々一つの反応性メルカプト基しか含まないので、１：１のモル比であると考えられる。しかしながら、ヒルジン-59D8-Fab'結合体を精製するときに使った過程と方法では、50 kDa（レーン2:59D8-Fab'と比較せよ）に現れる、非結合59D8-Fab'を完全に除去することはできなかった。還元条件下（図1b）で電気泳動すると、ヒルジンと59D8 -Fab'を結合させていたジスルフィドが壊れ、59D8-Fab'の二本鎖が現れた。（レーン２が59D8-Fab'、レーン３がヒルジン-59D8-Fab'）ヒルジンは、この条件化ではあまり染色されなかった。以下のアッセイのために最終調製した59D8-Fab'結合体と非結合59D8-Fab'のモル比は約１：１であることが、バンドのデンシトメーターによる定量で明らかになった。フィブリン（標的分子）非存在化でのトロンビン阻害標的分子フィブリン非存在化における、ヒルジンのトロンビン阻害活性を、トロンビンペプチダーゼ活性の阻害を測定することにより、ヒルジン-59D8-IgG結合体或いはヒルジン-59D8-Fab'結合体と比較した。発色基質S-2238のトロンビン依存分解を、405nmで記録した。ヒルジン、及びヒルジン-59D8-IgG結合体或いはヒルジン-59D8-Fab'結合体の阻害活性を、テストしたすべての濃度で、記録したすべての時間で、適当な計算により比較できるようにした。続く実験で、トロンビンペプチダーゼ活性阻害が各々の実験ポイントに一致するように、ヒルジン-5 9D8-IgG及びヒルジン-59D8-Fab'を適宜希釈した。ヒルジンのβペプチドへの結合能としてのトロンビン阻害ヒルジン、及びヒルジン-59D8-IgG結合体或いはヒルジン-59D8-Fab'結合体のトロンビン阻害活性を、その抗体に対する抗原、固定化したβペプチドへの結合能で比較した。このアッセイは、テストした分子の機能的な違いが最大限になるよう設定した。各々の種のトロンビン阻害活性を、まずβペプチド非存在化で調べた後、同じトロンビン阻害活性をもつ試料を、標的分子としてβペプチドを用いてアッセイした。図2Aは、βペプチドへの結合によりアッセイしたとき、ヒルジン-59D8-IgG結合体がヒルジンよりも12倍強力であることを示している（B₁=55 ±2％対4.3±0.5％、p<0.0001）。ヒルジン-59D8-Fab'は、IgG結合体と同程度であった（図2B）。Fab'結合体による最大阻害は32.5±3.5％で、非結合ヒルジンよりも有意に大きかった（0％；p<0.0001）。この差は、抗体の一つの抗体結合部位が、指向化にとって充分有効であるということを示している。いずれの結合体も、ヒルジンより有意に機能が高かった。このように差が大きい理由は、結合体が、59 D8-IgG或いは59D8-Fab'の抗原結合部位を介して固定化標的分子に特異的に結合するのに対し、非結合ヒルジンは、標的分子に特異的に結合することができず洗い流されてしまうことによる。ヒルジンの固定化フィブリンへの結合能としてのトロンビン阻害ヒルジン、ヒルジン-59D8-IgG結合体、ヒルジン-59D8-Fab'結合体を、以下のようなフィブリン−セファロースアッセイにより比較した。：各々の種のトロンビン阻害活性を、まずフィブリン非存在化で調べた後、同じトロンビン阻害活性をもつ試料を、標的分子としてフィブリンを用いてアッセイした。図３は、トロンビン阻害の最高レベルにおいて、ヒルジン-59D8-IgGが1100倍（p<0.0001）、ヒルジン-59D8-Fab'が1900倍（p<0.0001）、非結合ヒルジンより強力であることを示している。32.3％のトロンビン阻害を達成するには、800ユニットのヒルジンが必要であったのに対し、１ユニットのヒルジン-59D8-IgG結合体で39.9％、0 .5ユニットのヒルジン-59D8-Fab'結合体で37.2％、トロンビンが阻害された。フィブリノーゲン溶液中の血栓成長の阻害生理的濃度のフィブリノーゲンを含むトリス緩衝液に懸濁した血漿塊の表面における、フィブリン形成の阻害を図４に示した。フィブリン形成の完全な阻害は、7.4ATU/mlのヒルジン-59D8-IgG結合体を用いることにより、３時間で達成されるが、ヒルジンでは80ATU/ml必要である（図4A）。7.4ATU/mlの結合体は、8ATU/ mlのヒルジン（233μg少、p=0.0002）、及び2.4ATU/mlのヒルジン（252μg少、p =0.0001）よりもフィブリンの沈殿が有意に少なかった。1.2ATU/mlの結合体は、 80ATU/mlのヒルジンよりフィブリンの沈殿が有意に多かった（113μg多,p=0.01 ）。フィブリン沈殿をトロンビンペプチダーゼ活性の阻害に対してプロットすると、ヒルジン-59D8-IgG結合体は、ヒルジンよりも約10倍効果が高かった（図4B）。ヒルジン-59D8-IgGに対するフィブリン沈殿切片は、非結合ヒルジンより有意に低かった（p=0.003）。傾きは同じであった。ヒルジン-59D8-Fab'についての結果も似ていた（図５）。9.25ATU/mlのヒルジン-59D8-Fab'のフィブリン沈殿は、I00ATU/mlのヒルジンよりも21μg少なく（p= 0.001）、30ATU/mlのヒルジンより71μg少なく（p=0.0001）、10ATU/mlのヒルジンより129μg低かった（p=0.0001）（図5A）。また、3ATU/mlのヒルジン-59D8-F ab'のフィブリン沈殿は、10ATU/mlのヒルジンより有意に、74μg少なかった（p=0.01）。他のすべてのフィブリン沈殿曲線には、差がなかった。用量−反応曲線（図5B）において、ヒルジン-59D8-Fab'のフィブリン沈殿切片は、非結合ヒルジンより有意に低かった（p=0.003）。；傾きは同じであった。ヒト血漿中の血栓成長の阻害ヒルジン-59D8-Fab'の効果の増強は、ヒト血漿中でも証明された。図6Aは、10 ATU/mlの結合体のフィブリン沈殿の方が、10ATU/mlのヒルジンより84μg少なく（p=0.0001）、NaClコントロールより101μg少なかった（p=0.0001）ことを示している。しかし100ATU/mlのヒルジンとは、差がなかった。1ATU/mlの結合体のフィブリン沈殿の方が、100ATU/mlのヒルジンより90μg多く（p=0.0001）、10ATU/ mlのヒルジン又はNaClコントロールとは差がなかった。100ATU/mlのヒルジンのフィブリン沈殿は、NaClコントロールより112μg少なかった（p=0.0001）。全時間の平均フィブリン沈殿は17μg低く、10ATU/mlヒルジンにはNaClとの差はなかった。図6Bの用量−反応曲線で、ヒルジン-59D8-Fab'に対するフィブリン沈殿切片は、ヒルジンより有意に低かった。血漿中のこれらの結果は、フィブリノーゲン溶液中の結果と似ていた（図5Bと図6Bを比較せよ）。；両方の系において、フィブリン指向性ヒルジン結合体は、ヒルジンよりも10倍強力である。ヒルジンの、ヒルジン及び抗体混合物との比較非結合抗体又はFab'の、ヒルジン活性に対する影響を排除するため、二成分の等モル混合物を、ヒルジン単独の場合と比較した。図７は、成分の混合物が、ヒルジン単独より有意に強力ではないことを示している。44ATU/mlのヒルジンと43 ATU/mlの混合物のフィブリン−沈殿曲線には、差がなかった。10ATU/mlのヒルジンと9ATU/mlの混合物にも、差がなかった。阻害活性を表す曲線はすべて、NaCl コントロールとは有意に（p<0.00005）違っていた。44ATU/mlのヒルジンのフィブリン沈殿は、9ATU/mlの混合物より少なかった（p=0.003）。43ATU/mlの混合物の沈殿は、10ATU/mlのヒルジンより少なかった（p=0.01）。ヒルジン-58D8-Fab'結合体は、１:１のモル比のヒルジンと59D8-Fab'に相当する、57kDaの分子量をもつことが示された。デンシトメーターによる定量では、最終調製物中には結合体１モルにつき、１モルの非結合59D8-Fab'が存在した。抗トロンビンのβペプチド（フィブリンベータ鎖のアミノ末端の代用として）又は固定化フィブリンへの結合能を測定する定量（トロンビン阻害の反映として）において、非結合ヒルジンと比較すると、ヒルジン-59D8-Fab'結合体は、標的分子、フィブリンの存在化でヒルジンよりも多く抗トロンビン活性を輸送した。ヒルジン-59D 8-Fab'結合体は、フィブリノーゲン溶液中、ヒト血漿中いずれにおいても、ヒルジン、或いはヒルジンと59D8-Fab'の混合物よりも血栓成長の阻害について強力であることが示された。ヒルジンの局所濃度が増加することと、ヒルジン-59D8-Fab'結合体による血栓成長阻害が優れていることは、抗体によるキメラ分子の指向化に起因する。トロンビン阻害の増強は、結合体でのみ示された。；ヒルジンと59D8-Fab'のカップリングしていない混合物には、ヒルジンとの差がなかった。このように、結合体について証明された抗トロンビン活性の増強は、最終的な結合体調製物中に残った遊離の59D8-Fab'によるものではあり得ない。ヒルジン-59D8-Fab'結合体及びヒルジン-59D8-IgG結合体の間に、明らかな差が見られないのは重要である。両者は、非結合ヒルジンより、同等に優れており、このことは、一つの抗体結合部位が、完全な指向化効果を達成するのに充分であることを示している。このことは、59D8-Fab'とヒルジンを含む、遺伝子工学により作成したハイブリッド分子を臨床的に使用する場合に特に重要である。実施例２：組換えハイブリッド抗血栓剤組換えヒルジン−59D8抗体組換えヒルジン−抗体ハイブリッド発現ベクターの作成は、EcoR1-PstI部位に pUC12ポリリンカーが挿入されている、ベクターpSV2gptを使って達成された。マウスγ-2b重鎖保存領域を含むXbaIフラグメントを、そのポリリンカーに挿入した。抗体59D8配列を含む構造物は、特有の5'EcoR1部位に挿入した59D8を保存領域配列に換えたクローン重鎖をもつ。元の構造のγ-2b保存部分は、「Runge et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10337-10341,1991,参照として本発明に含まれる。」に従って除去し、プラスミノーゲン活性化因子をコードする配列に置き換えた。ヒルジン−抗体ハイブリッドを作るために、当業者によく知られた組換えクローニング法により、プラスミノーゲン活性化因子配列を、ヒルジンをコードするcD NA配列（Harvey et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:1084-1088,1986）に換えた。いくつかの構造物は、59D8重鎖とヒルジンcDNAの間にXa因子認識配列（5'ATAG AA GGA CGA AGC3'）（配列番号：12）を含み、組換えタンパク質がXa因子により、二つの機能ユニットへとタンパク分解され、その各々の活性を研究できる。組換えヒルジン−抗体ハイブリッドを発現させるために、エレクトロポレーションにより、重鎖を欠損した変異59D8重鎖ハイブリドーマ細胞にそのベクターをトランスフェクトし、組換えハイブリッドタンパクの発現を選択した。ハイブリッド分子は、アフィニテイクロマトグラフィの２ステップにより培養液から精製することができる。培養液上清を、βペプチド-セファロースカラムでクロマトグラフする。59D8部分が機能している組換えハイブリッド分子を含む βペプチド-セファロースカラムからの溶出液を、トロンビン−セファロースカラムを使ってクトマトグラフする。この精製操作により、確実にハイブリッド分子の両成分が正しい機能を持つようにする。実施例３：化学的に結合した、或いは組換えにより作られた、指向化抗トロンビンタンパク製剤の医学的利用血栓症動脈カテーテル移植やPTCAなどを含むがこれに限定されない処置を受けた患者を治療するために、化学的結合或いは組換えハイブリッドタンパクの発現により作られた本発明のキメラタンパクは、ストレプトキナーゼやtpaの投与に現在用いられているのと似たような方法で、生理的食塩水のような医薬として容認される媒体に入れて投与できる。キメラタンパクは、腹腔内、筋肉、皮下、静脈などに投与できる。一日につき体重に対して0.001-0.5mg/kgの投与量を、静脈に投与するのが望ましい投与経路であると考えられる。；本発明のキメラは、血栓が形成されていると考えられる部位の血管内に、局所的に投与すると有利である。本発明には、ex vivoの治療法も含まれる。本発明のこの方法は、患者の血液を濾過（例えば腎臓透析）或いはガス交換するために取り出す場合に、又は患者が輸血を必要としているときに特に有益である。血液を体外で処理するために、静脈穿剌のような、当業者に知られた方法により血液を個体から取り出すことができる。それから、生理学的に受容可能な媒体中に入れたキメラタンパクを血液に混合し、次に静脈点滴のような、当業者に知られた方法により個体に戻す。それは、新たな血塊の形成を防止するだけでなく、存在している血塊を溶解するのにも有効である場合がある。本発明キメラタンパクを、（1）ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、ウロキナーゼ、tpa又は（2）フィブリン結合ドメインがフィブリン溶解剤に結合した第二のキメラタンパクと共に投与することも適宜行われる。フィブリン結合ドメインがフィブリン溶解剤に結合したキメラタンパクの作成は、すでに示されている（Haber et al.,米国特許第5,116,613号。これは参照として本発明に含まれる）。これらの剤は、上記のように、連続的又は同時に、患者に投与できる。例４：組換えハイブリッドDNA製剤の医学的利用キメラタンパクの発現及び分泌が、患者の赤血球のような細胞内で行われるように、血栓症の患者に本発明の核酸を投与するという治療もできる。本発明の核酸は、標準的なベクター及び／又は遺伝子輸送系により、患者の標的細胞中に導入できる。好適な遺伝子輸送系には、リポソーム、レセプターによる輸送系、裸のDNA、及ぴヘルペスウィルス、レトロウィルス、アデノウィルスのような細菌ベクターなどが含まれる。本発明には、本発明のDNAをトランスフェクトした細胞も含まれる。単離した核酸を細胞にトランスフェクトする標準的な方法は、分子生物学の当業者によく知られている。細胞には、抗体産生B細胞のような血液細胞が好ましく、それらは、本発明の核酸によりコードされた本発明のキメラタンパクを発現する。医薬として容認される媒体、及び本発明の組換えキメラタンパクをコードする配列が結合している核酸を治療に有効な量含み、その核酸をトランスフェクトされた細胞がキメラタンパクを高レベルに発現するようになる治療用組成物が供給されている。治療用組成物には、上記のような遺伝子輸送系も含まれ得る。薬剤的に受容可能な媒体とは、動物への投与に適した生物学的に適合する媒体；例えば生理的食塩水などである。治療に有効な本発明の核酸の量は、治療を受けた動物内に医学的に望ましい結果を与える量である。医学においてはよく知られているように、ある患者の投与量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与の時間と経路、一般的な健康、それから併用する他の薬剤などの多くの要因に依存する。本発明のハイブリッド核酸の投与量は、様々であるが、静脈投与に適当な量は、約10⁶から10²²コピーの核酸分子である。他の態様術後の血栓形成の防止のために、本発明のキメラタンパクが徐放されるように設計された生物学的ポリマー輸送系は、動脈バイパス手術や動脈カテーテル移植の際の血管のように、損傷を受けた血管の近くに移植することができる。このようなバイオポリマー輸送系は、当業者によく知られている（例えば、Folkman et al.,米国特許第4,164,560号を参照のこと。これも参照として本発明に含まれる）。カテーテル自体は、本発明のキメラタンパクを含有し、そしてそれによりタンパク質を局所的に徐放して血管の再閉塞を予防するバイオポリマーから作成できる。その他の例は、以下の請求の範囲に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/815 Ｃ０７Ｋ 16/36 16/36 8517−4Ｈ 19/00 19/00 9452−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/10 9358−4Ｂ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ 21/08 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/64 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ハーバーエドガーアメリカ合衆国ニューハンプシャー州サリスバリーサウスロードピー．オー．ボックス 161 (72)発明者ボーデクリストフドイツ連邦共和国デー―6900 ハイデルベルグアルバート―フリッツストラッセ 47エー (72)発明者ランジマーシャルエス. アメリカ合衆国ジョージア州アトランタセダーキャニオンコート 2870

Claims

【特許請求の範囲】１．共有結合によりトロンビン阻害剤と結合したフィブリン結合性抗体のフィブリン結合性部位を含むキメラ分子。２．抗体がフィブリンβ鎖のアミノ末端に特異的な抗体である、請求の範囲１の分子。３．抗体がモノクローナル抗体59D8（ATCC受け入れ番号HB 8546）である、請求の範囲１の分子。４．トロンビンの阻害剤がヒルジンである、請求の範囲１の分子。５．トロンビンの阻害剤がヒルジンのトロンビン阻害性断片である、請求の範囲１の分子。６．断片が硫酸基、カルボキシル基、スルホン基、リン酸基、炭酸基、メチルスルホン基、又はメチルリン酸基を含むように化学的修飾を受けた、請求の範囲５の分子。７．トロンビンの阻害剤が抗トロンビンIII；β，β’モノクロルメチレンジアデノシン5'5'''-P¹P⁴-四リン酸；Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH、Boc-(D)Phe-Pro-b oroArg-C₁₀H₁₆、H-(D)Phe-Pro-boroArg-OH、H-(D)Phe-Pro-boroArg-D₁₀H₁₆；D-P he-Pro-Arg；[Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(OSO₃)]-Leu;[D-P he-Pro-Arg-Pro-(Gly)₄-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu]； 2,3-ジアルキルインドールス3,4,-ジヒドロ-3-ベンジル-6-クロロメチルクマリン；D-フェニルアラニル-プロリル-アルギニンクロロメチルケトン-処理α-トロンビン；D-Phe-Pro-Arg-H;D-Phe-Pro-Arg-CH₂Cl；Nα-(β-ナフチルスルホニルグリシル)-4-アミジノフェニルアラニンピペリジド；(2R,4R)-4-メチル-1-[N^α -(3-メチル1,2,3,4-テトラヒドロ-8-キノリンスルホニル)-L-アルギニル]-2- ピペリジンカルボキシル酸;N^α-アセチル[D-Phe⁴⁵,Argφ(COCH₂)⁴⁷,Gly⁴⁸]デスルホヒルジン^45-65；ヒルトニン-1;ヒルトニン-2;ヒルトニン-3;又はヒルトニン -4である、請求の範囲１の分子。８．結合性部分がフィブリン特異的Fab'フラグメントである、請求の範囲１の分子。９．結合性部分がフィブリン特異的Fvフラグメントである、請求の範囲１の分子。１０．共有結合によりトロンビンの阻害剤と結合したフィブリン特異的抗体を含む、請求の範囲１の分子。１１．医薬として容認される媒体中に請求の範囲１の分子を含む、トロンビン活性を阻害するのに有用な薬学的組成物。１２．血液中に請求の範囲１の分子を導入することを含む、血液凝固を防ぐ方法。１３．「（a）請求の範囲１の分子」及び「（b）第二の共有結合によりトロンビン溶解剤と結合したフィブリン結合部分を含むキメラ分子」とを含む混合物。１４．さらに、血液中に、第二の共有結合によりトロンビン溶解剤と結合したフィブリン結合部分を含むキメラ分子を導入することを含む、請求の範囲１２の方法。１５．第一の抗体が第二の抗体と同一である、請求の範囲１３の混合物。１６．トロンビン溶解剤がストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、又は組織型プラスミノーゲンアクチベーターである、請求の範囲１３の混合物。１７．分子がタンパク質である、請求の範囲１の分子をコードする核酸。１８．請求の範囲１の分子を発現する細胞。１９．血液中に請求の範囲１７の核酸を導入することを含む、血液凝固を防ぐ方法。２０．血液中に請求の範囲１８の細胞を導入することを含む、血液凝固を防ぐ方法。