JPH03117484A - ヒト血清アルブミンと結合した純粋なプロ‐ウロキナーゼのプラスミノーゲン活性化因子複合体 - Google Patents
ヒト血清アルブミンと結合した純粋なプロ‐ウロキナーゼのプラスミノーゲン活性化因子複合体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
（産業上の利用分野１
この発明はヒト患者における線維素凝塊を溶解する血栓
溶解剤とｊ−で使用するＩＩ７−ウ［７キナーゼのｆ重
用に関する。 ［従宋の技術］ プロウロキナーゼ（プ１７ＬＩＫ）は２本積ウロキナー
ゼ（Ｕ Ｋ ）の１本鎖、５５キ１７ダルトンの１１１
１駆物質（チモーゲン）である。プロ−Ｕ Ｋは、参考
文献として本明細書に包含させた米国再発行特許第３２
２２１号にフセイン□ （Ｈｕｓａｉｎ）らによって報
告されている。２本鎖ウロキナーゼ形態へ酵素転換によ
って変換する１本積プロ−ＵＫの活性化は、その酵素が
属するセリンアロテアーゼ族の特徴である。プロ−ＵＫ
は静脈内に注射すると血漿からの、急速なりリアランス
時間（約５〜８分間）を有４゛ることか分か−っている
。このクリアランス時間はその活性誘導体である高分子
櫨の２本願ＬＩＫよりも６Ｆ短い。 ［発明の構成］ この発明は血漿中力１０ ＩＪ Ｋのクリアランスを名
しく遅延させるが、同時にその線維累溶Ｍ特性を保持す
るヒト血清アルブミンｆ）ＩｓＡ）と共イｆ結ｒ７的に
結音した純粋なアロ １〜ＩＫのブラスミノーゲ〉話性
化因了複合体含特徴とする。本明細書で用いる［アロ
（ＩＫｌとは天然に存在し、または罰１換え体であるブ
１７−１．Ｉ Ｋ、プロ−ＬＩＫの任意のプ１７酵素欠
大突然変異体、または以１・゛さらに二Ｙｍに説明する
３Ｊ：っにＨＳ Ａの遊離システィンとめチオール シ
゛スルフィド交換を受ける利用し得るシスミーイン残ｉ
１５：含んでいるプｔ７ＬＪＫの／ＩＯ物活性を４１す
る任意Ｊ）１本鎖＝Ａ導体または断片をいう。 本明細書で用いるＩＨ８ＡＪとは天然じイｆ在し、また
は組換え体であるｌ−Ｉ Ｓ Ａをいう。ここで用いる
ｆ純粋Ｊの語は使用前の複合体が、例えば血２（ｋまた
は組織培養のその他の成分のような、他の物質を実質上
含有していない（９５重鼠％またはそれ以上）ことをい
う。 この発明の複合体は１Ｏ−ＬＩ Ｋそのものより遥かに
長い生体内半減期を有するので、治療的な血栓溶解にお
ける効用が改善される。そのうえ１〜の発明の複合体は
血栓症の予防にｌｌＬｍＬ得るばかりでなく、線維素溶
解活性の低下に伴って起こることがよく知られているア
テローム性動蕨硬化症のような心皿管系疾患の長期予ト
Ｊｊにも使用し得る７この発明のプロ ＵＫ ： Ｈ８
Ａ複合体は改憂されな生体内半減期の故に、治療（４４
用のために大晴静臓注射により投手できる。ア＋７１Ｊ
Ｋは生体内半減期が短いため、連続静脈内注入によって
投７ｊしなければならず、このことはｆｉｆを名しく複
雑にし、ことに病院外での治療を複雑にするから、これ
はアｏ −ＩＪ Ｋそのものの治療使用全般にわたる改
善を意味する、 この発明のその他の特徴および利点については以千の好
ましいｙＢ様の説明および請求の範囲から明らかにする
。 ［′Ａ、施引Ｅ （図面の説明） 第Ｈａ）［ａは完全な１重鎖プロ−ｔ、Ｊ Ｋ分子を示
した略図［ホルムズ（Ｈｏｌ＋ｎｅｓ）ら、バイオテク
ノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１ｏｇ！／）、（１９８
５年）、３巻、９２′３〜９２９１１￥１．第１（ｔＪ
）図は１重鎖プロ−ＵＫをアルブミンへ共有結合的に結
合する略図的な説明である。 第２図はインキュベーション混合物アロ ；ノに／Ｈ８
Ａ（３７℃、４時間）のｌ過りロマトグラフィーを示す
。分画を０．５ｍｌずつ採取し、タンパク質素１ｉ （
１）および線［素溶解活性（０）を検定した。 第３１Ｖは［Ｗｇ渣中（コース２）、ヒト血清アルブミ
ン（）Ｉ Ｓ Ａ ） （コース３）、ＣＢＳ血漿（コ
ース４）、ＣＢＳ血漿およびｌ８Ａ（コース５）および
血１１（コース６）中でインキュベートした１Ｏ−ＬＩ
Ｋのザイモグラムである。コース７〜１０はα（ＬＩＫ
）−セファデックスカラムを通したのちにｌ８Ａとイン
キュベ−１〜したプロ−ｊＪＫである。 第４図は精製した複合体（コース２．３）、α（ｌ３Ａ
）と１時間インキュベートした［１複り体（コース４）
８よびα（ｌ（Ｓ Ａ ）セファデックスカラムを通し
た精製複合体のザイモグラムである。 コース３の試料はＳＤＳ縛衝漬中、３７℃で３０分間イ
ンキュベートすることを含む標準的なｈ“法で処理する
代わりに、；気泳動前にＳＤＳ縛埼液中で２分間沸騰さ
せた。 第５図はＮ製Ｈ５Ａとインキノベートしたプ翫７ＬＩＫ
のザイモグラムである１インキユベ一ジ９ン条件：ｐＨ
５（２）、ｐＨ９（１、ｐＨ７，５（”（）。 およびｐＨ７，５でＺ ｎ ”（６）、Ｃａ ”（７）
、Ｚ、、＋＋、Ｃａ”（８）添加、およびプロＵＫ／Ｉ
ＳＡの１０倍高い割合〈９）１゜ 第６［Ｊは１Ｏ−ｔＪＫを縛！ｌｉ液中（コース２）、
血漿中、０時ｍ（コース３）、１時間（コース４）、２
時間（コース５）、６時間（コース６）、および１．Ｉ
Ｋを緩衝液中（コース７）、血漿中、０時間（コース
８）、６時間（コース９）および濃縮尿中（コース１０
）でインキュベートしたザイモグラムである。 第７［４はＤ Ｐ Ｉ）およびクロラミン−Ｔ−処理し
たｌ５Ａ（７１合化に影響せず）およびＤ′ｒ”Ｔ処理
したｌ５Ａ（プロ−Ｕ Ｋとの複合体形成能を回復する
ンの７ Ｄ 」Ｊにとの複合体のザイモグラムであ−）
て、ブ［）ＬＩＫの緩衝液中（コース１）、１０しＩＫ
ｉ（ＳＡ（コース２）、プｔ、ｒ−ｔＪＫ＋峰街液処理
したＨ Ｓ 、Ａ （コース３）、プロ−ｔＪＫ＋ＤＦ
Ｐ処理したｌ−Ｉ Ｓ Ａ （コース４）、プロ−ＬＪ
Ｋ＋緩衝液処理した）ｌ Ｓ Ａ （コース５）、プロ
−ｔＪＫ＋クロラミシ １゛処理したＨ Ｓ Ａ （コ
ース６）、緩衝液中、２に一体の存在を示したプロ−Ｕ
Ｋ （コース７）、同じブＬＩＵＫの２Ｍ体だけを示
したプロ−ＵＫ＋ＢＳＡ（コース８）、および２．４体
の事実上の消失とプロ Ｕ Ｋ・）３ Ｓ Ａ複合体の
存在を示したプロ−Ｌ、Ｉ Ｋ＋ＤＴＴ処理したＢＳＡ
（チオール形ｔぶを回復）でＪ）る（コース９）。 第８Ａおよび８Ｂ図は複合時間に及ぼすＰＤＩの効果を
示したザイモグラムであって、第８Ａ図は榎衝液中、プ
ロ−ＵＫ＊独（コースｌ）、メルカプトアルブミン（４
０ｍｇｚ’ｒｎｌ）とインキュベ−１〜した組攪え体プ
ロ−１ノＫ（０，’１μｇ ７ｍ ＋） ［イ〉キュベ
ーシヲン時間Ｏ分（コース２）、１５分（コース３）、
３０分（コース４）、１時１ゴ（コース５）、２時間（
コース６）および４時間（コース７）１の複合体のザイ
モグラム、第８Ｂ［４は同じ混合物をそれぞれＰ Ｉ）
ｌの存在（９２０ｉｔ ｇ／ｒｎｌ）でインキュベー
トした複合体のザイモグラムである。 第９図は複合化−用鰻反応に及ぼすＰ［）１の効果を示
したザイモグラノ、であって、プロ−Ｕ Ｋ ｌｒ−独
を緩衝液中（コース１）、およびメルカプトアルブミン
＜４０ｒｎｇ／ｍｌ）とプロ−（Ｊ Ｋ （１０Ｂ ｇ
／ｍ Ｉ）をＰＣＩ濃度［（〕１ｇ／ｍｌ）、０（コー
ス２）、２３（コース３）、２３０（コース４）、４６
０〈コース５）、６９０（コース６）および９ ”、２
０ （コース７）１で６時間インキノベート−した効果
を示した複合体のザイモグラムである。 第１０１４はエシェリキア・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）か
ら得られた！１１換え体）ＩＳＡで作成したプロ−１月
くとの複合体のザイモグラムである。 第１１図はプラスミノーゲンの影響を調べたザイモグラ
ムであって、プｏ−ＬＩ Ｋ （０、５１１ｇ ７ｍ
ｌ）を、緩衝液中で、０時間（コース１）および６時間
（コース、２）、および証票中、０時間（コース３）、
１時間（コース４）、４時間（コース５）および６時間
（コース６）、およびプラスミノーゲンを枯渇したアプ
ロチニン含有（２０ＫＴＬｌ／ｍｌ）血漿中、０時１ｍ
（コース７）、１時間（コース８）１．１時間（コース
≦９）お、Ｌび６時間（コース１０）インキＪべ一１・
した（３７℃）プロＵＫの３７℃のＳＤＳ中で調賛し５
た試料のザイモグラムである。 第１２１４はプロ−ＵＫにえ（するＨ Ｓ Ａの影響を
調べたザイモグラムであって、プロ−ＵＫ（０，５〕１
ｇ ７口１１）を３７℃で緩衝液中〈コース１）、お
よびＣＢＳ ト１ＳＡ（４０ｒｎｇ／ｍｌ）とインキ
」、ベー？−（コース２）、およびＨ８八枯渇血漿中（
コース３）、およびＨＳ Ａを補充したＩ Ｓ Ａ枯渇
血漿中（コース４）でインキュベート、およびＵＫ−Δ
ｂセフファースカラムを通ず前（コース５）およびカラ
ムを通した渣（４分画、コース６〜９）にプｔ７ｔＪ
Ｋとブレインキュベート（３７℃）した血漿中でインキ
ュベ−１〜した試料のザイモグラムである。 第１３図はメルカプ１〜アルブミン（４０ｍ ｇ ｌｎ
目）でアｌ／インキュベート（６時間）したさまざまな
形のｔＪＫ（０，５μｇ／ｎ１１）［績街液中、ＨＭＷ
、−Ｌ月（（コース１）、ＨＭＷ−ＵＫ＋Ｈ５Ａ（コー
ス２）、緩衝液中、 ｒ−Ｍｗ−ｔＪ Ｋ （コース３
）、ＬＭＷ−ＬＩＫ＋ＨＳ＾〈コース４）、組換え体プ
ロ−ＬＩ Ｋ −＋ ｌ−１ＳＡ（コース５）およびに
両液中、欠失変異体プロｔＪＫ（コース６）、欠失変異
体プロ−ＬＩＫ＋１ＩＳＡ（コース７）］のザイモグラ
ム（１０％５ｔ）Ｓｌ’ＡＧＥ）である。 第１４図は＆Ｗ街液中、７時間インキＪへ−１〜（３７
℃）したプロ−ＵＫ（０，３μｇ／ｍ１）（：７−ス１
）、未処理のＢＳＡ（４０μｇ／ｍｌ）とインキ７ベー
１〜 したプロ−ＩＪ Ｋ （コース２）、ＣＢＳ ）
ＩｓＡとインキュベートしたプロ−ＬＩ Ｋ （コース
３）、ＣＬ（Ｓ−Ｈ５Ａ単独（コース４）、および同一
混合物をそれぞれ還元条件下に行なった上記コース１〜
４と同一混合物（コース５〜８）のＵＫ ： Ａｂを用
いたウェスタン免疫ブ１７ツＩ・である。 Ｑ）＋ ５１”４！ｊ：［８ｉＭ中（コースｌ）、０．
５ｒｎＭｌｉ１２化望グルタチオン（ＧＳＳＧ）（コー
ス２）、５ｍＭＧ Ｓ Ｓ Ｇ （コース３）とインキ
ュベートしたプロ１１Ｋ、および血漿中（コース４）、
０．５ｍＭ Ｇ５５Ｇ （コース５）、５ｍＭ Ｇ５
５Ｇ（コース６ ）とインキ」べ−１・したプロＵ Ｋ
のザイモグラムである。 第１６１Ａは緩衝液中（１）、およびプロ−’ＭＤＴ’
ＮＨ（２）、３．プロ−’ Ｍ（３）、６．プロ−’Ｍ
（Ｍ）、１ ｏ−２Ｍ（５）−および血漿中（６）、お
よびプロ−’ Ｍ ＤＴＮＢ（７）、３．プロ−’ Ｍ
（８）、ｆ、１．プロ−’ Ｍ（９）およびプロ−”
Ｍ（１０）とイン４ｒべ−１〜シたプロ−ＬＩＫのザイ
モグラムである。 第１７図は複合化におけるｐ Ｈおよび）Ｉ Ｓ Ａ濃
度の効果を示ずザイ七グラムであって、Ｍｆｆｌ液中、
プｎ−ＬＩＫｍ独（コース１）、プロＬＩ Ｋ （５）
ｔ ｇｅｍ ｌ）をメルカプトアルブミン（４０ｍｇ／
ｍｌ）と、１）１１６（コース２）、ｐＨ７，ｏｆフコ
ース）、ｐ ＋１７ 、−１（コース４）、ｐＨ８，０
（コース５）、ｐＨ８，５（：Ｊ−ス６）で２４時間イ
ンキスベー１〜（３７℃）、および分子量マーカーを標
準（コース７）として、プｏ−ＵＫ（５μｇ／ｒｎｌ）
をＨＳ Ａ濃度８０ｍ）＜７ｍ〈コース８ ）、 ２０
ｍ ｇ／ｒｎ Ｉ（二１〜ス９）および１０ｍｇ／ｍ
ｌ（コース１０）と２４時間インＡ−，べ−１・（３７
℃）したザイモグラムである。コース５−ｉｏはｐＨ８
，０て゛イン’？ｒべ−１・した。 第１８図はＣＢＳＨ５Ａに随伴するＩＩＫ話性のザイモ
グラムであって、プロ−Ｕ Ｋ （０、５μｇ、／ｍｌ
）とブレインキュベートしたく２０時１ｍ）血漿からの
ＣＢ５−ＢＳＡ（コース１）、プロ−ＬＪＫ（（１，５
ｔｔｇ／口１１）をｆＡ厚にしたくただしプレインキュ
ベ−１・はしない）血漿からの（”ＢＳ ＢＳＡ＜コ
ースニジ）、および新軒血漿から噴離したＣＩ（Ｓ−Ｕ
ＳＡから免疫沈降させたＩＪ Ｋ複合体（コース３）に
随ｆ（４゛るＬＩ Ｋ活性のザイモグラムである。 第１９Ａ図は２組の成績のグラフである、Ｘ軸に校正し
たＧ−７５カラムによる血漿ゲルｒ通によ−）て採取し
た分画の分画数を２組双方の成績についてブロワｌ−Ｌ
、２８０ ｎｍにおける吸収をｙ軸に白丸でプロットし
、一方、Ｉｉ維素プｌ、−１〜での検定から溶解面積（
ｎ目１１！）をｙ軸１〜に黒丸でプＩ３−！／ ｌ−Ｌ
、 ｆ：。第１９Ｂｌ；Ｊｔｔ、Ｍｌ １Ａｅａ”ｒＡ
、Ｂ、Ｃおよび［）として同定して集めた分画からのＵ
Ｋ免疫沈降のザイモグラムである。 （特徴決定） この発明のプロ−ＵＫ、アルブミン複合体は次の特徴を
有する。（１）ドデシル硫酸すｌ−リウム（Ｓ Ｄ Ｓ
）中でｘｏｏ’ｃより３７℃で一層安定であるｉ２）
還元粂併下で不安定である。（３）千オール形を１１＋
１（ｋするため）ＩｓＡをジチオ１・レイｌ−−ル（Ｌ
） Ｔ ’丁）でＷｉｉ処理すると複合化は促進される
。 （４）Ｆ１合化はプ１７テインジスルフイドイソメラー
ゼ（ＰＤＩ）によって触媒される。（５）複合化はＩＪ
ＴＮ１３および酸化型グルタチオンによって抑制される
。、これらの特徴からアｌレブミンのｉ１！離システイ
ン残基とプロ−ＬＩＫのシスティン残基との間のジスル
フィド連鎖であることを示している。 複合化が１１〜１３５の残基を欠失し、たプ１７− Ｌ
ＩＫ欠失突然変胃体またはＬＭＷ−ＵＫのいずｉｌでも
起こらない実験に基づき、複合体でジスルフィド結合に
１１！１与しているアロ ＬＩＫのシステインはＡ＠に
あり、特にプロ［Ｊ ＫのＮ ）（、末端終末の一対の
システィンのうちの１つであるｉｊＪ能性が酎も高いと
信じられる。 精製したＢＳＡを長期間貯蔵すると５ジスルフイド交換
を防止す遊離システィンの酸化のため、結果的にプロ−
ｔＪ Ｋとの複合体形成能が失われる。 しかしプロＵＫとの複合体形成能はＤ Ｔ Ｔ処理ζこ
よって回Ｎできる。この処理は酸性ｐ Ｈで実施すると
、ＨＳ Ａの構造的なジスルフィド結合が無傷のまま残
存する。 〈方法論） 〈方法論の要約） この発明の血栓溶解剤組成物を製造するには、以Ｆ詳細
に説明する２つの方法がある。いずれの方法でも、まず
１Ｏ−ＵＫおよびアルブミンを側倒に精製し１、ついで
ジスルフィド連鎖にＪ、ってこれｌ、を結合させる（第
１Ａおよび１８図参照）。 第１のｈ法では、ビーターズ、Ｔ、の報告のよっに、ｐ
Ｈ６、０でアルブミンをＤＴ７７″処理し一ζ千オー
ル形態を修復するしアドバンシズ・インプ１７テイン
ケミストリー（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒ。 Ｌｃｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３７巻、１６１〜２
４５頁（１（１８５年）］、ついでプロ−ＵＫおよびア
ルブミンをＩ’ｍ）Ｎの存在で結合する前に、Ｄ Ｔ
Ｔを透析によって除去する。 第２のｈ゛法では、ｐ Ｈ８、０でインキュベージ＝１
ン（３７℃）の間に、精製したプロ−ＩＪ Ｋおよびメ
ルカプトアルブミンを結合する。 （物質および方法） （プロ ＬＩＫの精製） Ｆ記の第１の方法では、コラボラティブ リザーチｉｉ
（Ｃａｌ Ｉａｈｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
Ｉｎｃ、 ） ［ベー１ドホード（Ｂｅｄｇｏｒｄ）
、ＭＡＩより、ヒｌ−腎臓細胞系の培地から精製したプ
［７−ＬＩ Ｋを提供された。痕跡のＬＩＫの混入をｖ
Ｊ正するため、パネルらの報告［ブラッド（Ｂｌｏｏｄ
）、６９巻、２２〜２６頁（１９８７年）１のようにプ
ロ−ＵＫを０．ＩＭ ＨＥＰＥＳ、０．２ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ、０００１％ツイーン（ｐＨ７，４＞中で、
ダンシル−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−クロロメチルケト
ン（ＧＧＡｃ ｋ）２（１７℃Ｍと３７’Ｃで３０分間
インキコベートした。第２のｈ法では、プロ−ＵＫの２
量体を除去するため、プｒ７（、Ｉ Ｋ調製品をセファ
デックスＧ−７５カラム（＋、ｘ４５ｃｍ）に通し、１
０ｍＭ酢酸すトリウム、Ｏ，１ＭＮａＣｌ、０．００１
％ツイーン（ｐ）１４．８）でマ衡化して溶出した６つ
いでプロ ＵＫを前記と同様に処理して、痕跡のＬＩ
ＫのｉＪＪ人を防止した。 （アルブミンの精Ｗ） 保存血漿からのヒト血清アルブミン（ＩＩ Ｓ Ａ ）
の精製は公開されているｈ法に１〜ｔつで実施した。シ
バクロン・ブルー−セファロース（Ｃｉｂａｃｒｏｎ旧
ＬｌｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ）（ＣｒＪ Ｓ ）のカラム
＜１．５Ｘ２５ｃｍ）を０５６３％クエン酸三ナトリウ
ノ、および０．９％Ｎ ａ Ｃ，ｌで平衡化し、保イ４
＋１１１’！！１０ｍ１ をカラムへ通導した。２８０
ｒ目０における吸収が００２を超えなかったとき、０．
２Ｍチオシアン酸ナトウムで）（ＳＡを溶出し、蒸留水
に対して透析し、凍結莞燥した。 〈プラスミノーゲン無含有血漿の調製品）プラスミノー
ゲン無含有血漿を回分分離法によってＪ製した。あらか
じめ０．００５Ｍ ＨＥＰＥＳおよび０．１５Ｍ Ｎａ
ＣＩ（ｐＨ７，４）でｖ衡化した１ｙｓ−アガロース１
ｍｌをｌ１ＩＬ′ｌＩｉ５ｍｌと２時間、４℃で撹拌す
ることにより実施した。遠心ののち、上清を回収し、標
準的な血栓溶解法を用いてそのプラスミノーゲン含閂を
検定した。 （ザイモグラフィーおよびプロッティング）ラエムリの
報告のように、７．５％ポリアクリルアミドゲルを使用
し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＤＳＰＡａ Ｅ ）を実施した。特番こ記載
しない限り、試料は還元することなくＪｉｌ製し、電気
流ｌＩｌ前Ｃ試料緩衝渣（０，０６Ｍ）リス−ＨＣＩ（
ｐＨ６，８）、２％５Ｌ）Ｓ）中で３７℃で３７分間加
温した。ザイモグラフィーはランらの報告のように、ゲ
ルを２５％トリトンＸ１００で洗浄し、ついでゲルをプ
ラスミノーゲン・繊維素・寒天甲板上でオーバーレイす
ることにより実施した。ウェスタンプロッティングは５
−ウビンおよびプラスコールらの報告に基づき、これに
標準的な修飾を若干加えて実施した。ポリアクリルアミ
ドゲルおよび４枚の１紙をプロッティング１［ｉ液（３
９ｍＭグリシン、４８ｍＭ）リス、２０％メタノール、
０ 、０３７５ ％５ＤＳ）で平衡化した。′Ｌフッ化
ポリビニリデン（Ｐ Ｖ Ｄ Ｆ ）！Ｉをあらかじめ
メタノールで数秒間湿らし、ついで蒸留水で数分間乎衡
化した。プロッティング組立てはサンドイッチ配置法で
行ない、電気泳動はｉ−Ｋ Ｂマルチボア腿セミトライ
ブロッティング装置で、０．８ｍＡ／ｃｒ＋＋”の電流
を使用して１時間実施した。泳動後、ＰＶＤＦ膜をＴ′
ｒＥ３Ｓ（１００ｍＭ＋−リス、０ 、１５ Ｍ Ｎ
ａ ＣＩ、０ 、１ ％ツイーン８０（ｐｌ−（７，
５＞）で１０分間洗浄し、ＴＴＢＳ中、３％ＵＳＡで１
時間クラエンチングした。 第１の方法を用いて成績を得るには、ＴＴＢＳ（０２５
％ＢＳＡ添加）に希釈く３７℃）した家兎抗しＩＫ抗体
（１０μｇ／ｍ＋）またはＨ３Ａに対するモノクローナ
ルＡｂ（１： ５００希釈）で１回目のインキュベーシ
ョン、およびヤギ抗−家兎または家兎抗−マウスＩｇＧ
アルカリ性ホスファターゼ接合体くシグマ（Ｓｉｇｍａ
））のＴＴＢＳ（０，２５％［３８Ａ添加）希釈液（１
：１０００希釈）と２回１１のインキュベーション（３
７℃）を１時間行なったのち、免疫染色を実施した。第
２の方法を用いて成績を得るには、ＴＴＢＳ（０，２５
％ＢＳＡ添加）に希釈したｌ ３ｔｔｇ／ｍｌ ｎ＜Ｌ
ＪＫ）溶液を１回［１のインキュベーション（３７℃、
２時間）に使用し５アル力リ性ホスフアターゼ接合体の
ＴＴＢＳ（０，２’；％ＢＳＡ？ｔｉ加）希釈液（１：
５００）を２回目のインキュベーションく３７℃、２
時間）に使用した。 カラー反応には５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ルホスフェ−１〜１〜ルイジン塩（０，１５ｍｇ／ｍｌ
）およびρ−ニド１７・ブルー テ１〜ラゾリウ１１ク
ロリド（０，３ｎｉｇ／ｍｌ）の炭酸［液（（１，１Ｍ
炭酸すトリウム、１ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ１ａ（ｐ
Ｈ９，８））溶液を使用した。各インキュベージ３ンの
間にＰＶ Ｄ Ｆ ＭをＴＴＢＳで１０分間ずつ３回洗
浄した６力ラー反応の前に炭酸緩衝液でさらに１５分間
洗浄した。 〈酵素検定） プロＵＫ／ｌＪＫアミド分解活性はカビ（Ｋａｂｉ）騙
＊５２４４４で３７℃で行なう標準的な方法を用いて測
定した０反応Ｍ街液には０ 、１ Ｍ ＋−リス−［Ｉ
Ｃ１，０，１ＭＮａＣ＋、０．１ｍｇ／ｍｌ １３ｓＡ
、１００ｕ／ｍｌアプロチニン（１１１１８，８＞を使
用、基質は０−７５ｍＭで行なった。反応を大塩水７５
％酢＃（１：１）で停止し、４０５０ｍにおける吸収を
測定した。プラスミノーゲン活性化因子活性は標準的な
寒天・繊維素平板またはＧ１１ｌプラスミノーゲンおよ
びカビ（Ｋａｂｉ）基ｆＴｓ ２２５１ ノイずれかを
使用して測定した。 （プｔ″？ＵＫ／アルブミン複合体の作成およびＴ１ｉ
製） （方ｄ、１） １０ ｒ＋＋ Ｍジチオ１〜レイト−ル（ＤＴＴ）をｆ
受用してＰＨ６，（１（５０ｍＭ ＭＥＳ、０．１５Ｍ
ＮａＣ＋）で処理するビーターズの方法〈アドバンシズ
・イン プＩｌｌティン・ケミストリー、３７巻、１６
１〜２４５α（１９８５年）により、ＢＳＡまたは［（
Ｓ Ａ １分子当たり理論的にＩＳＨに近付くようにチ
オール形態（メルカプ１〜アルブミン）を再生した。構
造的なジスルフィド結合はｐＨ５〜７で保持される。透
析によってＤＴＴを除去した８プｏ １１Ｋ（５７℃
ｇ／ｍｌ）をＨ８Ａｊｌｉ製品（４０ｍｇ／ｍｌ）のう
ちの１種またはＢＳＡと０．ＩＭ ＨＥＰ ｌミＳ緩
衝１合（ｐＨ８，０１中、 ＰＤＩ（９２０μ ｇ／＋
ｎｌ）の存在で３７℃で少なくとも４時間インキュベー
トすることによりプロ ＵＫ：アルブミン複＆体を作成
した。ついで混合物２Ｑ Ｏ／４１をセファ・デソクス
Ｇ−７５カラム（ＩＸ４５ｃｍ＞に適用し、０．１ Ｍ
ＨＥＰＥＳ（ｐｌ＋７．５１．ｌ）、１５ＭＮ；ｉ
（−，１，０，００１％ツイーン８０．２０に１１、、
］ ／ｎｉ ｌアブ１７チニンで平衡化して溶出ｌまた
。 分画を０ 、５ ｍ Ｉずつ採取し、タンパク１ｆ含％
ｔ（２８０ｎ ｍにおける吸収）および繊維素溶解活性
を検定した。非還元条件下では、複Ｎ体は標準マーカー
に比較して”” １００ ｋ Ｄ ａの見掛番１の分子
Ｖで移動する。しかし用いた条件下では、複合体はプロ
−ＬＩＫの２Ｊｔ体のあとから移動する８プロ−［ＪＫ
： Ｈ３Ａ複合体の真の分子りは２１２０ ｋ Ｄ
ａであると信じられる。≧１２０ｋＤａ複合体に対応す
る３つの分画を集めた。 インキュベーシミ１ン段階ではＰＣＩ溶液の代わりに固
定化したＰＤＩを使用できることに注［１ずべきである
。 （方法２） １０ ＵＫ５μｇ／ｍｌ をＢＳＡ ４０＋＋＋ｇ／
ｎ目と緩衝液０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，−１）
中５３７℃で・１時間インキュベートし、ついで混合物
２００μｍをセファデックス６７５カラムに適用して、
０．１Ｍ ＨＥＰＥｓ（ｐ）１７．５）、（，１、１
５ＭＮａＣｌ、０．００１％ツイーン８０．２０ＫＩＬ
Ｉ／ｍｌアプロチニンで平衡化して溶出することによっ
て、プロ−ＩＪ Ｋ ： Ｉ Ｓ Ａ複合体を作成した
０分画を０．５ｍｌずつ採取し、タンパク質素す（標準
的なタンパク質検定）および繊維素溶解活性（線！［平
板）を検定した（第２図、分画３０−３１〜３２をプー
ルした）。 第３図の実験に示したように、プロ−ＵＫ：１ｌＳＡ複
合体は不溶化ポリクローナルＵＫ−抗体によって認識さ
れた。精製したプロ−ＵＫ：Ｈ３Δ複り体を抗−ＨＳ
Ａ抗体と３７℃で１時間インキュベー１・すると、ザイ
モグラフで見られた１２０ｋ Ｉｌ ａの溶解バンドは
高分子量バンドに１き代えられ、これに結合したＨ Ｓ
Ａ抗体との複合体を表していると信じられる（第４図
）、同様に精製した複合体はα（ＨＳ Ａ ）−セファ
ロースカラムへ結合した。これらの知見は複合体の組成
を確証している。 （ア１）ＬＩＫ：アルブミン複合体作成の好ましい粂件
） ＢＳＡまたはＦ３ Ｓ Ａを長期間貯蔵すると、ｉｕシ
、スティン・の酸化のためＢＳＡまたは）］ Ｓ Ａの
プ１７− Ｕ Ｋとの複合体形成能が低下する。入手可
能な遊離システィンの５．５′−ジチオビス （２−ニ
ド１７ベンゾアー１〜（ＤＴＮＢ）滴定によって新鮮で
ない商業的なＢＳＡを試験すると、商業的なＨＳ Ａで
はその約１０分子当たり１個の遊離システィンがあるこ
とが判明した。、：れに反して、前記の方法２に報告し
たように新たに精製したＢＳＡでは、ＨＳ Ａ約２分子
当たりに１ｆ［ｉＪの遊離システインを３んでいた。し
たがって複合体作成のｔ：めイシキュベーションする前
に）Ｉ Ｓ ＡまたはＢＳＡの［、Ｉ ＴＴ処ｆｌ［ｐ
Ｈ６，０］が推奨される。 第５図に示したように約８．０のｐＨが複合体作成に好
ましい。７Ｏ−ＵＫ：Ｈ３Ａ複合体の生成はｐＨ７，５
（コース３）で起こったが、ｐｌ（５（コース２）また
はｐＨ９（コース・１）では起こらない。Ｃａ＋＋（５
ｍＭ）（第５図、コース７）または７：ｎ”（５０μＭ
）（コース（））、およびＣａ”＋ＺｒＩ″（コース８
）では何ら効果がなか−）なか、Ｃｕ”（５〜１０μＭ
）は複自体の生成を抑制した。 （実験成績） （血漿内でのプロしＩＫ・アルブミン複合体の自然生成
） プロ−ＵＫ ： Ｈ８Ａ複合体が正常血漿内で自然に生
成することが分かり、また正常血漿から精製したＩ Ｓ
Ａがプロ−〇 Ｋと随伴していることが分かった。し
たがってプロ−ＵＫ ： Ｈ８Ａ複合体は天然に存在１
〜でいると信じられる。この実験ではプロ−ｔ、Ｊ Ｋ
を１ラスミノーゲン無含有血漿とインキユベートシ、プ
ラスミノーゲン活性化因ｆ−活性の分子すをザイモグラ
フイーによって測定した。 ブＩＶＬＩＫを血ｕ（５００ｎ ｇ／ｍ Ｉ）へ添加し
、３７℃で１〜６時間インキ、フベー１〜した。一部の
酵素活性は時間の経過に件ない、第６図のザイモグラム
に示したように約１００ ｋ Ｉ） ａの見掛けの分子
ｔ（実際の分子量は約］ ２０ｋＤａ）で移動した。こ
のザイモグラムはプロ−ＵＫ（コース２−〇）およびＬ
ＩＫ（コース８〜９）を絹ｔｉ液中および血漿中でイン
キュベ−１〜した０時間（コース３．８）、１時間（コ
ース４）、２時間（コース５）または６時間（コース６
．９）を示している。 血漿内でのこの新しい高分子１（ＨＷＭ）バンドの生成
は、ゆっくりした時間に依存する現象であった。ザイモ
グラフイーによる定置はせいぜい大まかな見積であるが
、酵素活性の約１０％は血漿内でインキュベーションの
６時間後に＝ １２０ ｋ Ｄａ（真の分子量と考えら
れる）で見いだされた。 プロｔ、Ｊ ＫをＩＩＩ液中でインキュベ−１〜Ｌなと
きＨＷ Ｍ分解バンドが存在しないことによって分かる
ように、１０〜ｔ、Ｉ Ｋの２破体の生成は除外しても
よい、そのうえプロ−ＵＫの２ｊＬ体が生成すると、２
Ｊｉ体は複合体の先頭を移動する（第７図、８Ｂ、９．
１０参照）、この知見はプロ−ｔＪ Ｋが＝６５にダル
トンの血漿タンパク質と結合して−１２０にダル■−ン
の化合物を形成したことを示している。 ２重鎖ＩＪ ＫおよびＬＪ Ｋ ｔｉｌｌ Ｗ因子、Ｆ
ＡＩ−３から作成されたこれと類似の分子量の複合体が
、以前尿および血漿の双方で観察された。しかしこの複
合体は上記知見に対する説明と１．て、（１）プＬ７Ｕ
にはＦＡＩ３と複合体を生成しない、（２）血漿内でプ
ロ−ｔＪＫは安定しており、実験に使用した濃度で２本
ｊｉ ＬＩ Ｋへ活性化されないという理由から除外す
ることができる。結局、複合体の生成はり、、ｌ Ｋに
対する阻害因子（Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−クロロメチ
ルゲトン）５プラスミノーゲンに対する阻害因１〜（ア
プロチニン２０ＫＩＵ／１１１１）の添加、もしくはｍ
ｕを１ラスミノーゲン無禽有にすることによって防止さ
れない。 しかもＩＪＫ ： ＰＡ Ｉ −１（アラスミノーゲン
活性化因子阻害囚−ｆ−１）複合体はユ９５ｋＤで移動
し、同時にユ１２５ｋＤおよび≧１５５ｋＤで移動する
他の阻害因Ｔ−［クルイトフ、Ｅ、に、Ｏ。 ら、ブラッド、６４巻、９０７〜９１３頁（１９８４年
）］および、］α２−マクログロブリンーＡと反応する
第４の複合体をゲルの鮪先端に随伴するから、インキュ
ベージ」ン中のプロ−Ｕ Ｋの活性化およびＵＫ ：
ＰＡ １１複自体生成はこれらの知見と合致しない。そ
れにもかかわらずインキュベーション中のプロ−ＵＫ活
性化の可能性を減少させるため、アブ１７チニン（２０
ＫＴＬＪ／ｒｎｌ）をプラスミ７−ゲン枯渇血漿へ添加
する追加実験を天施した。これらの方法では≧１２０ｋ
Ｄの複合体の生成は抑制されなかった（第１１図、コー
ス７〜１０）。 しかし第３図に示したようにプロ−ＵＫをＩ ＳＡ枯渇
血１ｍ（ＣＢＳＩｆｌ漿）とインキュベートすると高分
子墳の活性化因子複合体は生成しなかった。 これらの知見は血漿内で観察された複合体がＨ８Ａと複
合したプロ−ＵＫからなることを証明している。 （ＣＢＳ−Ｈ３Ａとプロ−ＵＫの複合体の生成）プロＵ
Ｋ（５μｓ／ｒｎｌ）を新たに精製したＣ Ｂ５−Ｈ８
Ａ （４０ｎｉｇ／ｍｌ、０．１Ｍ １〜ＩＥＰＥｓ
溶液（ｐＨ７，４））と少なくとも４時間インキュベー
ト（３７℃）し、混合物を５ｌ）Ｓ−ＰＡＧＥおよびザ
イモグラフィーによって測定すると、二１２０ ｋ ｌ
）バンドが一スして生成したく第１２１４、コース２）
、これに対して１Ｏ−ＩＪ ＫをＣＢＳ枯渇血漿とイン
キュベートすると、複合体は生成しなかった（第１２図
、コース３）、ＣＢＳ枯渇血漿にＣＢ５−１１５Ａを補
充すると複合体の形成が回復された（第２図、コース４
）。複合体を含貞しているｌｌ１ｌ漿（第２図、コース
５）をＵＫ−Ａｂセフファースカラムへ通導すると複合
体は除去された（第２図、コース６〜９）８ またＵＳＡおよび）３ Ｓ Ａの商業的な調製品のチオ
ール形態、を回復するため、これらをＤ Ｔ Ｔで前処
理してプロ ＵＫとインキュベ−１〜すると、複合体の
形成が２２ぬられた６ （Ｓ ［’） Ｓ中での解離に対する複合体の感受性）
Ｃ）３８ ）１ｓＡとプロ−ＵＫのインキュベーション
によって生成した複合体をセファデックスＧ７５による
ゲルｒ過によってｖ敲し、５ＤＳ−ＰＡ Ｇ ■・、で
これを分析した。試料を煮沸すると複合体の完全な解離
が起こったが、３７″（Ｘ″では部分的な解Ｍ（ぐ５〇
九）だけがゲルのザイモグラムで認められたく成赤責は
示さない）。 （種々の形態のＵ ＫのＢＳＡとの複合化お上びへ合化
に対するＬ）Ｆ Ｐおよびクロラミン−Ｔの効果） ＨＭＷ−ＬＪＫをＢＳＡとインキュベーｔ・すると、Ｈ
ＭＷ−ＵＫを＃１街液中でインキュベ−１〜１，たとき
（第１３図、コース１）にはｑられなかった複合体が生
成することが判明したので（コース２）、複合体が、実
際はＣＢＳカラムでＢＳＡと一緒に精製される１ｇｌ書
因子とｔ−Ｉ Ｋとから構成される＝ｒ能性を検討した
。複合体は、プロ−ＵＫを血漿中でイ〉キュベートした
とき形成された複合体に対応する”１２０ｋＤで移動し
た（第１３図、コース５）、しかしＬＭＷＵＫ（アポキ
ナーゼ（Ａｂｂ。 ｋｉｎａｓｅ））とＨＳ Ａとのインキュベーションで
は複合体を誘導できなかった（第１３図、コース３およ
び４）、さらにプロ−ｔｌＫの欠失変異体（１１〜１３
５残基を欠失）を１１８Ａとインキュベートしても複合
体は生成しなかった（第１３図、コース７）、これらの
観察から複合体はＵＫの阻害因子との複合体ではなく、
また複合化はＵＫのＡ鎖に関係するものであって、１毫
鎖の１０テア一ゼ部分を含むものではないことが分かる
。 さらにＵＫ：阻害因子洩合体を排除するなめ、セリンプ
ロテアーゼ混入物を抑制する目的でＣＢＳＨ５ＡをＤＦ
Ｐで＠処理した。この処理はプロ−ＵＫとの複合体形成
を抑制できなかった（第７［Ａ、コース４．コース２お
よび３と比較）９次にセルビン混入物を排除するため、
セルビンを不活化することが判っているクロラミン−Ｔ
［スティーフら、バイオロギッシェ・ヒエミー・デル
・ポッペーザイラー（Ｒｉｏｔ、 Ｃｈｅｍ、 Ｈｏｐ
ｐｅ−５ｅｙＩｅｒ＞、３６９巻、１３３７〜１３４８
頁（１９Ｆ１３年）］でＨＳ Ａ調製品を処理した。こ
の処理もまた複合化を抑制できず、したがって［ｌｌ察
されたプロ−（１ＫまたはＨＭＷＵＫＮ合体の形成は阻
害因子によるものではないことが確ケされた（第７図、
コース６：未処理ＵＳＡ対照（コース５）と比較）。 （複合体がジスルフィド連鎖であることの証拠）ボリク
Ｌ］−ナルＵＫ−ＡＩ）を使用したウェスタン免疫プロ
ッティングで、プロ−ＵＫをＣＢ５−ｌ５Ａとインキュ
ベートすると＝１２０ｋＤバンドが認められるが（第１
４ｒｍ、コース３）、プロしＩＫを榎ｉ＃ｉ渣中（第１
４図、コースｌ）またはＤＴＴで前処理しないＢＳＡ
（第５図、コース２）とインキュベートしてもこのバン
ドは認められない、ＣＢ５−Ｈ３Ａ対照は抗体と可視的
な反応を起こさない（第１４図、コース４および８）、
還元条件ドで＝１２０ｋＤ複合体が解離することは、そ
れがジスルフィド連鎖であることを示唆している（第１
４図、コース７）。 またプロ−ｔＪＫ：アルブミン複合体がジスルフィド連
鎖であることを示す追加的な証拠が肖られた。第１に酸
化型グルタチオンまたはＤＴＮＢのようなスルフヒドリ
ル試薬を方法２の反応混合物へ添加すると、下記のよう
に複合化が抑制された。 酸化型グルタチオンを血漿へ添加し、３７℃で２時間反
応させた。その結果を第１５図σ）ザイモグラムに示す
。このザイモグラムグ）コース１〜３は緩衝液中でイン
キュベートしたプロ−ＵＫを示す。 グルタチオンによってその濃度に依存するプロしＩＫ
： Ｈ３Ａ複合体の形成の低下が起こった。コース２お
よび５は０．５ｍＭグルタチオン添加、コース３および
６は５．０＋ｎＭグルタチオン添加でＪ〉る６ｔ＆初（
こ埴げｔ：３コース、に示したようにグルタチインはプ
ロ−ＩＩ Ｋの線維素溶解活イ１を抑制しない。グルタ
チインに対するこの反応がち、アルブミンの遊離システ
ィンが複合体に関与しており、したがってア［７−ＬＩ
ＫおよびＵＳＡはジスルフィド梁嬌によって連鎖してい
ることが分かる。 同様にｉ１！−システインと反応するＤＴＮＢを用いた
実験でＤ Ｔ Ｎ Ｂが複合体形成を抑制することがＰ
Ｉ明した。第１６図は緩衝液中（コース１〜５）および
ＵＳＡ（コース６”ＩＯ）と、ＤＴＮＢの０．０Ｍ（コ
ース１，６）、１ｍＭ（コース２゜７）、３ｒｎＭ（コ
ース３．８）、６ｒｎＭ （コース４．０）およびｌｏ
ｍＭ（コース５．１０）でイシＡユベ〜トシたアＴＶ−
ＬＩＫのザイモグラムである。 第２に商業的なＨＳ Ａまた（３ Ｓ ＡはアローＬＪ
Ｋと冶どまたは全く複合体を形成しない、これは第７
１４（コース８、ブｏ −Ｕ Ｋの２１体だけが示さ〕
じζいる）および第１４図（コース２）から明らかであ
る。また新たに調製したＣＢ５−ＵＳＡとの複合化は貯
蔵時間とともに減少した。しかしながらこれらすべての
調製品によるプロ−ＵＫとの複合体形成能は１、：れら
をＤＴＴで処理すると回復できた。商１的なりＳＡ調製
品に対するこの効果を第７図、コース９に示ず７ビータ
ー、′Ｉ゛、らの報告のように、ｐＨ５〜７におけるＤ
ＴＴ処理の効果はＩ造的ジスルフィド結合を解離するこ
となく、チオールｌｆ３！！ｌを回復するｊアドバンシ
ズイン′・プＬ７テイン・ケミストリー、３７巻、】６
１〜２４５頁（１９８５年）］。したがってこの知見は
Ｈ８ＡｔたはＢＳＡの有用なシスティンチオールがグロ
ーＬＪ Ｋの複合化にとって必要であることを示してい
る。 第３にＤＴＮＢによる滴定からＤＴＴ処理処理面業的な
Ｆ（ＳＡは＋ｑ用可能なシスティンを、処理後の０．６
と比較して０．またけイ■していることが判明した。新
たにｔｉ４製したＣＢＳ−ＵＳＡでも比較し得る像が得
られた。したがって）（ＳＡ調製品の利用可能なシステ
ィンとアロＵＫとの複合化の間には正の相間があった６ 第４にチオールジスルフィド交換を触媒するＰＤｒ［７
リードマン、Ｒ、Ｂ 、、セル（Ｃｅ ｌ ｌ ）、５
７巻、１０６９〜１０７２頁＜１９８９年）、ギルバー
ｌ−２Ｈ、Ｆ 、、バイオケミストリー（Ｂｊｏｃｈ
ｅｍ、 ）、２８巻、７２９８−・−７３０５頁（１９
８９年）］をインキ３．ベーショ〉・混合物に添加する
と、複合化が促進された。ＰＣＩを含有１２ない場合は
、複合体が出現するまでに４時間のインキュベーション
を曹したが（第８ＡＬ−５）、ＰＤ Ｉ （９２０μｇ
／ｍｌ＞をノフイｒさせると、複合化は１時間のインキ
ュベーション後に起こった（第８Ｂ図）。ＰＤＩ効果は
ブ１７−ＬＪＫ（１０）ｚｇ／ｍｌ）をメルカプｌ−ア
ルブミン、ｌｌ’ＦＪ品（４０ｒｎｇ／ｍｌ）と１．）
Ｄ Ｉの０．２３，２３０．４６０．６８０または９
２０μｇ／ｍｌとでインキ１．ベート１．た第９１４に
示したように１度依存性であった。Ｉ−” Ｉ） Ｉの
存在では、１０ＬＪＫの２１Ｔｔ休の生成もまた著しく
増強され（第８Ａ、８Ｂ、９［′！Ｉ）、これらの２駿
体はジスルフィド連鎖であることが示唆された。大暖の
ＰＣＩを必要とすることはこの酵素の低い効率と一致し
ている。 試料をＳＤＳ中で２分間煮沸すると複合化が抑制された
く第１４図、コース３）。この知見はまたジスルフィド
連鎖複合体が煮沸によって不安定化され得ることと一致
している。そのうえジスルフィド交換をＦｌｌｌｌする
ＣｕＣ１ｘ （１＋ｎＭ）の存在で複合体は煮沸に抵抗
した。ある種のジスルフィド連鎖接合体についてジスル
フィド連鎖の熱解離が以前に７オルキンおよびクリバッ
フによって報告された［フォルキンら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、
（ｊｌｅｖａ、 ）、２６２巻、２９４５〜２９５ｏ
頁（１９８７年）］。 プロ−〇にのシスティンとアルブミンの対にならないシ
スティンとの間のジスルフィド連鎖は、アルブミンの連
鎖したプロ−ＬＩ Ｋに遊離システィンを作り出すであ
ろう、この遊離システィンは別のプロ−ＬＪＫ分子のシ
スティンまたは別のアルブミン分子のシスティンと反応
できるであろう、そのような状況下では、プロ−ＬＪＫ
Ｉ分子とアルブミン１分子から作られた複合体の代わり
に、プロ
溶解剤とｊ−で使用するＩＩ７−ウ［７キナーゼのｆ重
用に関する。 ［従宋の技術］ プロウロキナーゼ（プ１７ＬＩＫ）は２本積ウロキナー
ゼ（Ｕ Ｋ ）の１本鎖、５５キ１７ダルトンの１１１
１駆物質（チモーゲン）である。プロ−Ｕ Ｋは、参考
文献として本明細書に包含させた米国再発行特許第３２
２２１号にフセイン□ （Ｈｕｓａｉｎ）らによって報
告されている。２本鎖ウロキナーゼ形態へ酵素転換によ
って変換する１本積プロ−ＵＫの活性化は、その酵素が
属するセリンアロテアーゼ族の特徴である。プロ−ＵＫ
は静脈内に注射すると血漿からの、急速なりリアランス
時間（約５〜８分間）を有４゛ることか分か−っている
。このクリアランス時間はその活性誘導体である高分子
櫨の２本願ＬＩＫよりも６Ｆ短い。 ［発明の構成］ この発明は血漿中力１０ ＩＪ Ｋのクリアランスを名
しく遅延させるが、同時にその線維累溶Ｍ特性を保持す
るヒト血清アルブミンｆ）ＩｓＡ）と共イｆ結ｒ７的に
結音した純粋なアロ １〜ＩＫのブラスミノーゲ〉話性
化因了複合体含特徴とする。本明細書で用いる［アロ
（ＩＫｌとは天然に存在し、または罰１換え体であるブ
１７−１．Ｉ Ｋ、プロ−ＬＩＫの任意のプ１７酵素欠
大突然変異体、または以１・゛さらに二Ｙｍに説明する
３Ｊ：っにＨＳ Ａの遊離システィンとめチオール シ
゛スルフィド交換を受ける利用し得るシスミーイン残ｉ
１５：含んでいるプｔ７ＬＪＫの／ＩＯ物活性を４１す
る任意Ｊ）１本鎖＝Ａ導体または断片をいう。 本明細書で用いるＩＨ８ＡＪとは天然じイｆ在し、また
は組換え体であるｌ−Ｉ Ｓ Ａをいう。ここで用いる
ｆ純粋Ｊの語は使用前の複合体が、例えば血２（ｋまた
は組織培養のその他の成分のような、他の物質を実質上
含有していない（９５重鼠％またはそれ以上）ことをい
う。 この発明の複合体は１Ｏ−ＬＩ Ｋそのものより遥かに
長い生体内半減期を有するので、治療的な血栓溶解にお
ける効用が改善される。そのうえ１〜の発明の複合体は
血栓症の予防にｌｌＬｍＬ得るばかりでなく、線維素溶
解活性の低下に伴って起こることがよく知られているア
テローム性動蕨硬化症のような心皿管系疾患の長期予ト
Ｊｊにも使用し得る７この発明のプロ ＵＫ ： Ｈ８
Ａ複合体は改憂されな生体内半減期の故に、治療（４４
用のために大晴静臓注射により投手できる。ア＋７１Ｊ
Ｋは生体内半減期が短いため、連続静脈内注入によって
投７ｊしなければならず、このことはｆｉｆを名しく複
雑にし、ことに病院外での治療を複雑にするから、これ
はアｏ −ＩＪ Ｋそのものの治療使用全般にわたる改
善を意味する、 この発明のその他の特徴および利点については以千の好
ましいｙＢ様の説明および請求の範囲から明らかにする
。 ［′Ａ、施引Ｅ （図面の説明） 第Ｈａ）［ａは完全な１重鎖プロ−ｔ、Ｊ Ｋ分子を示
した略図［ホルムズ（Ｈｏｌ＋ｎｅｓ）ら、バイオテク
ノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１ｏｇ！／）、（１９８
５年）、３巻、９２′３〜９２９１１￥１．第１（ｔＪ
）図は１重鎖プロ−ＵＫをアルブミンへ共有結合的に結
合する略図的な説明である。 第２図はインキュベーション混合物アロ ；ノに／Ｈ８
Ａ（３７℃、４時間）のｌ過りロマトグラフィーを示す
。分画を０．５ｍｌずつ採取し、タンパク質素１ｉ （
１）および線［素溶解活性（０）を検定した。 第３１Ｖは［Ｗｇ渣中（コース２）、ヒト血清アルブミ
ン（）Ｉ Ｓ Ａ ） （コース３）、ＣＢＳ血漿（コ
ース４）、ＣＢＳ血漿およびｌ８Ａ（コース５）および
血１１（コース６）中でインキュベートした１Ｏ−ＬＩ
Ｋのザイモグラムである。コース７〜１０はα（ＬＩＫ
）−セファデックスカラムを通したのちにｌ８Ａとイン
キュベ−１〜したプロ−ｊＪＫである。 第４図は精製した複合体（コース２．３）、α（ｌ３Ａ
）と１時間インキュベートした［１複り体（コース４）
８よびα（ｌ（Ｓ Ａ ）セファデックスカラムを通し
た精製複合体のザイモグラムである。 コース３の試料はＳＤＳ縛衝漬中、３７℃で３０分間イ
ンキュベートすることを含む標準的なｈ“法で処理する
代わりに、；気泳動前にＳＤＳ縛埼液中で２分間沸騰さ
せた。 第５図はＮ製Ｈ５Ａとインキノベートしたプ翫７ＬＩＫ
のザイモグラムである１インキユベ一ジ９ン条件：ｐＨ
５（２）、ｐＨ９（１、ｐＨ７，５（”（）。 およびｐＨ７，５でＺ ｎ ”（６）、Ｃａ ”（７）
、Ｚ、、＋＋、Ｃａ”（８）添加、およびプロＵＫ／Ｉ
ＳＡの１０倍高い割合〈９）１゜ 第６［Ｊは１Ｏ−ｔＪＫを縛！ｌｉ液中（コース２）、
血漿中、０時ｍ（コース３）、１時間（コース４）、２
時間（コース５）、６時間（コース６）、および１．Ｉ
Ｋを緩衝液中（コース７）、血漿中、０時間（コース
８）、６時間（コース９）および濃縮尿中（コース１０
）でインキュベートしたザイモグラムである。 第７［４はＤ Ｐ Ｉ）およびクロラミン−Ｔ−処理し
たｌ５Ａ（７１合化に影響せず）およびＤ′ｒ”Ｔ処理
したｌ５Ａ（プロ−Ｕ Ｋとの複合体形成能を回復する
ンの７ Ｄ 」Ｊにとの複合体のザイモグラムであ−）
て、ブ［）ＬＩＫの緩衝液中（コース１）、１０しＩＫ
ｉ（ＳＡ（コース２）、プｔ、ｒ−ｔＪＫ＋峰街液処理
したＨ Ｓ 、Ａ （コース３）、プロ−ｔＪＫ＋ＤＦ
Ｐ処理したｌ−Ｉ Ｓ Ａ （コース４）、プロ−ＬＪ
Ｋ＋緩衝液処理した）ｌ Ｓ Ａ （コース５）、プロ
−ｔＪＫ＋クロラミシ １゛処理したＨ Ｓ Ａ （コ
ース６）、緩衝液中、２に一体の存在を示したプロ−Ｕ
Ｋ （コース７）、同じブＬＩＵＫの２Ｍ体だけを示
したプロ−ＵＫ＋ＢＳＡ（コース８）、および２．４体
の事実上の消失とプロ Ｕ Ｋ・）３ Ｓ Ａ複合体の
存在を示したプロ−Ｌ、Ｉ Ｋ＋ＤＴＴ処理したＢＳＡ
（チオール形ｔぶを回復）でＪ）る（コース９）。 第８Ａおよび８Ｂ図は複合時間に及ぼすＰＤＩの効果を
示したザイモグラムであって、第８Ａ図は榎衝液中、プ
ロ−ＵＫ＊独（コースｌ）、メルカプトアルブミン（４
０ｍｇｚ’ｒｎｌ）とインキュベ−１〜した組攪え体プ
ロ−１ノＫ（０，’１μｇ ７ｍ ＋） ［イ〉キュベ
ーシヲン時間Ｏ分（コース２）、１５分（コース３）、
３０分（コース４）、１時１ゴ（コース５）、２時間（
コース６）および４時間（コース７）１の複合体のザイ
モグラム、第８Ｂ［４は同じ混合物をそれぞれＰ Ｉ）
ｌの存在（９２０ｉｔ ｇ／ｒｎｌ）でインキュベー
トした複合体のザイモグラムである。 第９図は複合化−用鰻反応に及ぼすＰ［）１の効果を示
したザイモグラノ、であって、プロ−Ｕ Ｋ ｌｒ−独
を緩衝液中（コース１）、およびメルカプトアルブミン
＜４０ｒｎｇ／ｍｌ）とプロ−（Ｊ Ｋ （１０Ｂ ｇ
／ｍ Ｉ）をＰＣＩ濃度［（〕１ｇ／ｍｌ）、０（コー
ス２）、２３（コース３）、２３０（コース４）、４６
０〈コース５）、６９０（コース６）および９ ”、２
０ （コース７）１で６時間インキノベート−した効果
を示した複合体のザイモグラムである。 第１０１４はエシェリキア・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）か
ら得られた！１１換え体）ＩＳＡで作成したプロ−１月
くとの複合体のザイモグラムである。 第１１図はプラスミノーゲンの影響を調べたザイモグラ
ムであって、プｏ−ＬＩ Ｋ （０、５１１ｇ ７ｍ
ｌ）を、緩衝液中で、０時間（コース１）および６時間
（コース、２）、および証票中、０時間（コース３）、
１時間（コース４）、４時間（コース５）および６時間
（コース６）、およびプラスミノーゲンを枯渇したアプ
ロチニン含有（２０ＫＴＬｌ／ｍｌ）血漿中、０時１ｍ
（コース７）、１時間（コース８）１．１時間（コース
≦９）お、Ｌび６時間（コース１０）インキＪべ一１・
した（３７℃）プロＵＫの３７℃のＳＤＳ中で調賛し５
た試料のザイモグラムである。 第１２１４はプロ−ＵＫにえ（するＨ Ｓ Ａの影響を
調べたザイモグラムであって、プロ−ＵＫ（０，５〕１
ｇ ７口１１）を３７℃で緩衝液中〈コース１）、お
よびＣＢＳ ト１ＳＡ（４０ｒｎｇ／ｍｌ）とインキ
」、ベー？−（コース２）、およびＨ８八枯渇血漿中（
コース３）、およびＨＳ Ａを補充したＩ Ｓ Ａ枯渇
血漿中（コース４）でインキュベート、およびＵＫ−Δ
ｂセフファースカラムを通ず前（コース５）およびカラ
ムを通した渣（４分画、コース６〜９）にプｔ７ｔＪ
Ｋとブレインキュベート（３７℃）した血漿中でインキ
ュベ−１〜した試料のザイモグラムである。 第１３図はメルカプ１〜アルブミン（４０ｍ ｇ ｌｎ
目）でアｌ／インキュベート（６時間）したさまざまな
形のｔＪＫ（０，５μｇ／ｎ１１）［績街液中、ＨＭＷ
、−Ｌ月（（コース１）、ＨＭＷ−ＵＫ＋Ｈ５Ａ（コー
ス２）、緩衝液中、 ｒ−Ｍｗ−ｔＪ Ｋ （コース３
）、ＬＭＷ−ＬＩＫ＋ＨＳ＾〈コース４）、組換え体プ
ロ−ＬＩ Ｋ −＋ ｌ−１ＳＡ（コース５）およびに
両液中、欠失変異体プロｔＪＫ（コース６）、欠失変異
体プロ−ＬＩＫ＋１ＩＳＡ（コース７）］のザイモグラ
ム（１０％５ｔ）Ｓｌ’ＡＧＥ）である。 第１４図は＆Ｗ街液中、７時間インキＪへ−１〜（３７
℃）したプロ−ＵＫ（０，３μｇ／ｍ１）（：７−ス１
）、未処理のＢＳＡ（４０μｇ／ｍｌ）とインキ７ベー
１〜 したプロ−ＩＪ Ｋ （コース２）、ＣＢＳ ）
ＩｓＡとインキュベートしたプロ−ＬＩ Ｋ （コース
３）、ＣＬ（Ｓ−Ｈ５Ａ単独（コース４）、および同一
混合物をそれぞれ還元条件下に行なった上記コース１〜
４と同一混合物（コース５〜８）のＵＫ ： Ａｂを用
いたウェスタン免疫ブ１７ツＩ・である。 Ｑ）＋ ５１”４！ｊ：［８ｉＭ中（コースｌ）、０．
５ｒｎＭｌｉ１２化望グルタチオン（ＧＳＳＧ）（コー
ス２）、５ｍＭＧ Ｓ Ｓ Ｇ （コース３）とインキ
ュベートしたプロ１１Ｋ、および血漿中（コース４）、
０．５ｍＭ Ｇ５５Ｇ （コース５）、５ｍＭ Ｇ５
５Ｇ（コース６ ）とインキ」べ−１・したプロＵ Ｋ
のザイモグラムである。 第１６１Ａは緩衝液中（１）、およびプロ−’ＭＤＴ’
ＮＨ（２）、３．プロ−’ Ｍ（３）、６．プロ−’Ｍ
（Ｍ）、１ ｏ−２Ｍ（５）−および血漿中（６）、お
よびプロ−’ Ｍ ＤＴＮＢ（７）、３．プロ−’ Ｍ
（８）、ｆ、１．プロ−’ Ｍ（９）およびプロ−”
Ｍ（１０）とイン４ｒべ−１〜シたプロ−ＬＩＫのザイ
モグラムである。 第１７図は複合化におけるｐ Ｈおよび）Ｉ Ｓ Ａ濃
度の効果を示ずザイ七グラムであって、Ｍｆｆｌ液中、
プｎ−ＬＩＫｍ独（コース１）、プロＬＩ Ｋ （５）
ｔ ｇｅｍ ｌ）をメルカプトアルブミン（４０ｍｇ／
ｍｌ）と、１）１１６（コース２）、ｐＨ７，ｏｆフコ
ース）、ｐ ＋１７ 、−１（コース４）、ｐＨ８，０
（コース５）、ｐＨ８，５（：Ｊ−ス６）で２４時間イ
ンキスベー１〜（３７℃）、および分子量マーカーを標
準（コース７）として、プｏ−ＵＫ（５μｇ／ｒｎｌ）
をＨＳ Ａ濃度８０ｍ）＜７ｍ〈コース８ ）、 ２０
ｍ ｇ／ｒｎ Ｉ（二１〜ス９）および１０ｍｇ／ｍ
ｌ（コース１０）と２４時間インＡ−，べ−１・（３７
℃）したザイモグラムである。コース５−ｉｏはｐＨ８
，０て゛イン’？ｒべ−１・した。 第１８図はＣＢＳＨ５Ａに随伴するＩＩＫ話性のザイモ
グラムであって、プロ−Ｕ Ｋ （０、５μｇ、／ｍｌ
）とブレインキュベートしたく２０時１ｍ）血漿からの
ＣＢ５−ＢＳＡ（コース１）、プロ−ＬＪＫ（（１，５
ｔｔｇ／口１１）をｆＡ厚にしたくただしプレインキュ
ベ−１・はしない）血漿からの（”ＢＳ ＢＳＡ＜コ
ースニジ）、および新軒血漿から噴離したＣＩ（Ｓ−Ｕ
ＳＡから免疫沈降させたＩＪ Ｋ複合体（コース３）に
随ｆ（４゛るＬＩ Ｋ活性のザイモグラムである。 第１９Ａ図は２組の成績のグラフである、Ｘ軸に校正し
たＧ−７５カラムによる血漿ゲルｒ通によ−）て採取し
た分画の分画数を２組双方の成績についてブロワｌ−Ｌ
、２８０ ｎｍにおける吸収をｙ軸に白丸でプロットし
、一方、Ｉｉ維素プｌ、−１〜での検定から溶解面積（
ｎ目１１！）をｙ軸１〜に黒丸でプＩ３−！／ ｌ−Ｌ
、 ｆ：。第１９Ｂｌ；Ｊｔｔ、Ｍｌ １Ａｅａ”ｒＡ
、Ｂ、Ｃおよび［）として同定して集めた分画からのＵ
Ｋ免疫沈降のザイモグラムである。 （特徴決定） この発明のプロ−ＵＫ、アルブミン複合体は次の特徴を
有する。（１）ドデシル硫酸すｌ−リウム（Ｓ Ｄ Ｓ
）中でｘｏｏ’ｃより３７℃で一層安定であるｉ２）
還元粂併下で不安定である。（３）千オール形を１１＋
１（ｋするため）ＩｓＡをジチオ１・レイｌ−−ル（Ｌ
） Ｔ ’丁）でＷｉｉ処理すると複合化は促進される
。 （４）Ｆ１合化はプ１７テインジスルフイドイソメラー
ゼ（ＰＤＩ）によって触媒される。（５）複合化はＩＪ
ＴＮ１３および酸化型グルタチオンによって抑制される
。、これらの特徴からアｌレブミンのｉ１！離システイ
ン残基とプロ−ＬＩＫのシスティン残基との間のジスル
フィド連鎖であることを示している。 複合化が１１〜１３５の残基を欠失し、たプ１７− Ｌ
ＩＫ欠失突然変胃体またはＬＭＷ−ＵＫのいずｉｌでも
起こらない実験に基づき、複合体でジスルフィド結合に
１１！１与しているアロ ＬＩＫのシステインはＡ＠に
あり、特にプロ［Ｊ ＫのＮ ）（、末端終末の一対の
システィンのうちの１つであるｉｊＪ能性が酎も高いと
信じられる。 精製したＢＳＡを長期間貯蔵すると５ジスルフイド交換
を防止す遊離システィンの酸化のため、結果的にプロ−
ｔＪ Ｋとの複合体形成能が失われる。 しかしプロＵＫとの複合体形成能はＤ Ｔ Ｔ処理ζこ
よって回Ｎできる。この処理は酸性ｐ Ｈで実施すると
、ＨＳ Ａの構造的なジスルフィド結合が無傷のまま残
存する。 〈方法論） 〈方法論の要約） この発明の血栓溶解剤組成物を製造するには、以Ｆ詳細
に説明する２つの方法がある。いずれの方法でも、まず
１Ｏ−ＵＫおよびアルブミンを側倒に精製し１、ついで
ジスルフィド連鎖にＪ、ってこれｌ、を結合させる（第
１Ａおよび１８図参照）。 第１のｈ法では、ビーターズ、Ｔ、の報告のよっに、ｐ
Ｈ６、０でアルブミンをＤＴ７７″処理し一ζ千オー
ル形態を修復するしアドバンシズ・インプ１７テイン
ケミストリー（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒ。 Ｌｃｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３７巻、１６１〜２
４５頁（１（１８５年）］、ついでプロ−ＵＫおよびア
ルブミンをＩ’ｍ）Ｎの存在で結合する前に、Ｄ Ｔ
Ｔを透析によって除去する。 第２のｈ゛法では、ｐ Ｈ８、０でインキュベージ＝１
ン（３７℃）の間に、精製したプロ−ＩＪ Ｋおよびメ
ルカプトアルブミンを結合する。 （物質および方法） （プロ ＬＩＫの精製） Ｆ記の第１の方法では、コラボラティブ リザーチｉｉ
（Ｃａｌ Ｉａｈｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
Ｉｎｃ、 ） ［ベー１ドホード（Ｂｅｄｇｏｒｄ）
、ＭＡＩより、ヒｌ−腎臓細胞系の培地から精製したプ
［７−ＬＩ Ｋを提供された。痕跡のＬＩＫの混入をｖ
Ｊ正するため、パネルらの報告［ブラッド（Ｂｌｏｏｄ
）、６９巻、２２〜２６頁（１９８７年）１のようにプ
ロ−ＵＫを０．ＩＭ ＨＥＰＥＳ、０．２ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ、０００１％ツイーン（ｐＨ７，４＞中で、
ダンシル−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−クロロメチルケト
ン（ＧＧＡｃ ｋ）２（１７℃Ｍと３７’Ｃで３０分間
インキコベートした。第２のｈ法では、プロ−ＵＫの２
量体を除去するため、プｒ７（、Ｉ Ｋ調製品をセファ
デックスＧ−７５カラム（＋、ｘ４５ｃｍ）に通し、１
０ｍＭ酢酸すトリウム、Ｏ，１ＭＮａＣｌ、０．００１
％ツイーン（ｐ）１４．８）でマ衡化して溶出した６つ
いでプロ ＵＫを前記と同様に処理して、痕跡のＬＩ
ＫのｉＪＪ人を防止した。 （アルブミンの精Ｗ） 保存血漿からのヒト血清アルブミン（ＩＩ Ｓ Ａ ）
の精製は公開されているｈ法に１〜ｔつで実施した。シ
バクロン・ブルー−セファロース（Ｃｉｂａｃｒｏｎ旧
ＬｌｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ）（ＣｒＪ Ｓ ）のカラム
＜１．５Ｘ２５ｃｍ）を０５６３％クエン酸三ナトリウ
ノ、および０．９％Ｎ ａ Ｃ，ｌで平衡化し、保イ４
＋１１１’！！１０ｍ１ をカラムへ通導した。２８０
ｒ目０における吸収が００２を超えなかったとき、０．
２Ｍチオシアン酸ナトウムで）（ＳＡを溶出し、蒸留水
に対して透析し、凍結莞燥した。 〈プラスミノーゲン無含有血漿の調製品）プラスミノー
ゲン無含有血漿を回分分離法によってＪ製した。あらか
じめ０．００５Ｍ ＨＥＰＥＳおよび０．１５Ｍ Ｎａ
ＣＩ（ｐＨ７，４）でｖ衡化した１ｙｓ−アガロース１
ｍｌをｌ１ＩＬ′ｌＩｉ５ｍｌと２時間、４℃で撹拌す
ることにより実施した。遠心ののち、上清を回収し、標
準的な血栓溶解法を用いてそのプラスミノーゲン含閂を
検定した。 （ザイモグラフィーおよびプロッティング）ラエムリの
報告のように、７．５％ポリアクリルアミドゲルを使用
し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＤＳＰＡａ Ｅ ）を実施した。特番こ記載
しない限り、試料は還元することなくＪｉｌ製し、電気
流ｌＩｌ前Ｃ試料緩衝渣（０，０６Ｍ）リス−ＨＣＩ（
ｐＨ６，８）、２％５Ｌ）Ｓ）中で３７℃で３７分間加
温した。ザイモグラフィーはランらの報告のように、ゲ
ルを２５％トリトンＸ１００で洗浄し、ついでゲルをプ
ラスミノーゲン・繊維素・寒天甲板上でオーバーレイす
ることにより実施した。ウェスタンプロッティングは５
−ウビンおよびプラスコールらの報告に基づき、これに
標準的な修飾を若干加えて実施した。ポリアクリルアミ
ドゲルおよび４枚の１紙をプロッティング１［ｉ液（３
９ｍＭグリシン、４８ｍＭ）リス、２０％メタノール、
０ 、０３７５ ％５ＤＳ）で平衡化した。′Ｌフッ化
ポリビニリデン（Ｐ Ｖ Ｄ Ｆ ）！Ｉをあらかじめ
メタノールで数秒間湿らし、ついで蒸留水で数分間乎衡
化した。プロッティング組立てはサンドイッチ配置法で
行ない、電気泳動はｉ−Ｋ Ｂマルチボア腿セミトライ
ブロッティング装置で、０．８ｍＡ／ｃｒ＋＋”の電流
を使用して１時間実施した。泳動後、ＰＶＤＦ膜をＴ′
ｒＥ３Ｓ（１００ｍＭ＋−リス、０ 、１５ Ｍ Ｎ
ａ ＣＩ、０ 、１ ％ツイーン８０（ｐｌ−（７，
５＞）で１０分間洗浄し、ＴＴＢＳ中、３％ＵＳＡで１
時間クラエンチングした。 第１の方法を用いて成績を得るには、ＴＴＢＳ（０２５
％ＢＳＡ添加）に希釈く３７℃）した家兎抗しＩＫ抗体
（１０μｇ／ｍ＋）またはＨ３Ａに対するモノクローナ
ルＡｂ（１： ５００希釈）で１回目のインキュベーシ
ョン、およびヤギ抗−家兎または家兎抗−マウスＩｇＧ
アルカリ性ホスファターゼ接合体くシグマ（Ｓｉｇｍａ
））のＴＴＢＳ（０，２５％［３８Ａ添加）希釈液（１
：１０００希釈）と２回１１のインキュベーション（３
７℃）を１時間行なったのち、免疫染色を実施した。第
２の方法を用いて成績を得るには、ＴＴＢＳ（０，２５
％ＢＳＡ添加）に希釈したｌ ３ｔｔｇ／ｍｌ ｎ＜Ｌ
ＪＫ）溶液を１回［１のインキュベーション（３７℃、
２時間）に使用し５アル力リ性ホスフアターゼ接合体の
ＴＴＢＳ（０，２’；％ＢＳＡ？ｔｉ加）希釈液（１：
５００）を２回目のインキュベーションく３７℃、２
時間）に使用した。 カラー反応には５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ルホスフェ−１〜１〜ルイジン塩（０，１５ｍｇ／ｍｌ
）およびρ−ニド１７・ブルー テ１〜ラゾリウ１１ク
ロリド（０，３ｎｉｇ／ｍｌ）の炭酸［液（（１，１Ｍ
炭酸すトリウム、１ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ１ａ（ｐ
Ｈ９，８））溶液を使用した。各インキュベージ３ンの
間にＰＶ Ｄ Ｆ ＭをＴＴＢＳで１０分間ずつ３回洗
浄した６力ラー反応の前に炭酸緩衝液でさらに１５分間
洗浄した。 〈酵素検定） プロＵＫ／ｌＪＫアミド分解活性はカビ（Ｋａｂｉ）騙
＊５２４４４で３７℃で行なう標準的な方法を用いて測
定した０反応Ｍ街液には０ 、１ Ｍ ＋−リス−［Ｉ
Ｃ１，０，１ＭＮａＣ＋、０．１ｍｇ／ｍｌ １３ｓＡ
、１００ｕ／ｍｌアプロチニン（１１１１８，８＞を使
用、基質は０−７５ｍＭで行なった。反応を大塩水７５
％酢＃（１：１）で停止し、４０５０ｍにおける吸収を
測定した。プラスミノーゲン活性化因子活性は標準的な
寒天・繊維素平板またはＧ１１ｌプラスミノーゲンおよ
びカビ（Ｋａｂｉ）基ｆＴｓ ２２５１ ノイずれかを
使用して測定した。 （プｔ″？ＵＫ／アルブミン複合体の作成およびＴ１ｉ
製） （方ｄ、１） １０ ｒ＋＋ Ｍジチオ１〜レイト−ル（ＤＴＴ）をｆ
受用してＰＨ６，（１（５０ｍＭ ＭＥＳ、０．１５Ｍ
ＮａＣ＋）で処理するビーターズの方法〈アドバンシズ
・イン プＩｌｌティン・ケミストリー、３７巻、１６
１〜２４５α（１９８５年）により、ＢＳＡまたは［（
Ｓ Ａ １分子当たり理論的にＩＳＨに近付くようにチ
オール形態（メルカプ１〜アルブミン）を再生した。構
造的なジスルフィド結合はｐＨ５〜７で保持される。透
析によってＤＴＴを除去した８プｏ １１Ｋ（５７℃
ｇ／ｍｌ）をＨ８Ａｊｌｉ製品（４０ｍｇ／ｍｌ）のう
ちの１種またはＢＳＡと０．ＩＭ ＨＥＰ ｌミＳ緩
衝１合（ｐＨ８，０１中、 ＰＤＩ（９２０μ ｇ／＋
ｎｌ）の存在で３７℃で少なくとも４時間インキュベー
トすることによりプロ ＵＫ：アルブミン複＆体を作成
した。ついで混合物２Ｑ Ｏ／４１をセファ・デソクス
Ｇ−７５カラム（ＩＸ４５ｃｍ＞に適用し、０．１ Ｍ
ＨＥＰＥＳ（ｐｌ＋７．５１．ｌ）、１５ＭＮ；ｉ
（−，１，０，００１％ツイーン８０．２０に１１、、
］ ／ｎｉ ｌアブ１７チニンで平衡化して溶出ｌまた
。 分画を０ 、５ ｍ Ｉずつ採取し、タンパク１ｆ含％
ｔ（２８０ｎ ｍにおける吸収）および繊維素溶解活性
を検定した。非還元条件下では、複Ｎ体は標準マーカー
に比較して”” １００ ｋ Ｄ ａの見掛番１の分子
Ｖで移動する。しかし用いた条件下では、複合体はプロ
−ＬＩＫの２Ｊｔ体のあとから移動する８プロ−［ＪＫ
： Ｈ３Ａ複合体の真の分子りは２１２０ ｋ Ｄ
ａであると信じられる。≧１２０ｋＤａ複合体に対応す
る３つの分画を集めた。 インキュベーシミ１ン段階ではＰＣＩ溶液の代わりに固
定化したＰＤＩを使用できることに注［１ずべきである
。 （方法２） １０ ＵＫ５μｇ／ｍｌ をＢＳＡ ４０＋＋＋ｇ／
ｎ目と緩衝液０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，−１）
中５３７℃で・１時間インキュベートし、ついで混合物
２００μｍをセファデックス６７５カラムに適用して、
０．１Ｍ ＨＥＰＥｓ（ｐ）１７．５）、（，１、１
５ＭＮａＣｌ、０．００１％ツイーン８０．２０ＫＩＬ
Ｉ／ｍｌアプロチニンで平衡化して溶出することによっ
て、プロ−ＩＪ Ｋ ： Ｉ Ｓ Ａ複合体を作成した
０分画を０．５ｍｌずつ採取し、タンパク質素す（標準
的なタンパク質検定）および繊維素溶解活性（線！［平
板）を検定した（第２図、分画３０−３１〜３２をプー
ルした）。 第３図の実験に示したように、プロ−ＵＫ：１ｌＳＡ複
合体は不溶化ポリクローナルＵＫ−抗体によって認識さ
れた。精製したプロ−ＵＫ：Ｈ３Δ複り体を抗−ＨＳ
Ａ抗体と３７℃で１時間インキュベー１・すると、ザイ
モグラフで見られた１２０ｋ Ｉｌ ａの溶解バンドは
高分子量バンドに１き代えられ、これに結合したＨ Ｓ
Ａ抗体との複合体を表していると信じられる（第４図
）、同様に精製した複合体はα（ＨＳ Ａ ）−セファ
ロースカラムへ結合した。これらの知見は複合体の組成
を確証している。 （ア１）ＬＩＫ：アルブミン複合体作成の好ましい粂件
） ＢＳＡまたはＦ３ Ｓ Ａを長期間貯蔵すると、ｉｕシ
、スティン・の酸化のためＢＳＡまたは）］ Ｓ Ａの
プ１７− Ｕ Ｋとの複合体形成能が低下する。入手可
能な遊離システィンの５．５′−ジチオビス （２−ニ
ド１７ベンゾアー１〜（ＤＴＮＢ）滴定によって新鮮で
ない商業的なＢＳＡを試験すると、商業的なＨＳ Ａで
はその約１０分子当たり１個の遊離システィンがあるこ
とが判明した。、：れに反して、前記の方法２に報告し
たように新たに精製したＢＳＡでは、ＨＳ Ａ約２分子
当たりに１ｆ［ｉＪの遊離システインを３んでいた。し
たがって複合体作成のｔ：めイシキュベーションする前
に）Ｉ Ｓ ＡまたはＢＳＡの［、Ｉ ＴＴ処ｆｌ［ｐ
Ｈ６，０］が推奨される。 第５図に示したように約８．０のｐＨが複合体作成に好
ましい。７Ｏ−ＵＫ：Ｈ３Ａ複合体の生成はｐＨ７，５
（コース３）で起こったが、ｐｌ（５（コース２）また
はｐＨ９（コース・１）では起こらない。Ｃａ＋＋（５
ｍＭ）（第５図、コース７）または７：ｎ”（５０μＭ
）（コース（））、およびＣａ”＋ＺｒＩ″（コース８
）では何ら効果がなか−）なか、Ｃｕ”（５〜１０μＭ
）は複自体の生成を抑制した。 （実験成績） （血漿内でのプロしＩＫ・アルブミン複合体の自然生成
） プロ−ＵＫ ： Ｈ８Ａ複合体が正常血漿内で自然に生
成することが分かり、また正常血漿から精製したＩ Ｓ
Ａがプロ−〇 Ｋと随伴していることが分かった。し
たがってプロ−ＵＫ ： Ｈ８Ａ複合体は天然に存在１
〜でいると信じられる。この実験ではプロ−ｔ、Ｊ Ｋ
を１ラスミノーゲン無含有血漿とインキユベートシ、プ
ラスミノーゲン活性化因ｆ−活性の分子すをザイモグラ
フイーによって測定した。 ブＩＶＬＩＫを血ｕ（５００ｎ ｇ／ｍ Ｉ）へ添加し
、３７℃で１〜６時間インキ、フベー１〜した。一部の
酵素活性は時間の経過に件ない、第６図のザイモグラム
に示したように約１００ ｋ Ｉ） ａの見掛けの分子
ｔ（実際の分子量は約］ ２０ｋＤａ）で移動した。こ
のザイモグラムはプロ−ＵＫ（コース２−〇）およびＬ
ＩＫ（コース８〜９）を絹ｔｉ液中および血漿中でイン
キュベ−１〜した０時間（コース３．８）、１時間（コ
ース４）、２時間（コース５）または６時間（コース６
．９）を示している。 血漿内でのこの新しい高分子１（ＨＷＭ）バンドの生成
は、ゆっくりした時間に依存する現象であった。ザイモ
グラフイーによる定置はせいぜい大まかな見積であるが
、酵素活性の約１０％は血漿内でインキュベーションの
６時間後に＝ １２０ ｋ Ｄａ（真の分子量と考えら
れる）で見いだされた。 プロｔ、Ｊ ＫをＩＩＩ液中でインキュベ−１〜Ｌなと
きＨＷ Ｍ分解バンドが存在しないことによって分かる
ように、１０〜ｔ、Ｉ Ｋの２破体の生成は除外しても
よい、そのうえプロ−ＵＫの２ｊＬ体が生成すると、２
Ｊｉ体は複合体の先頭を移動する（第７図、８Ｂ、９．
１０参照）、この知見はプロ−ｔＪ Ｋが＝６５にダル
トンの血漿タンパク質と結合して−１２０にダル■−ン
の化合物を形成したことを示している。 ２重鎖ＩＪ ＫおよびＬＪ Ｋ ｔｉｌｌ Ｗ因子、Ｆ
ＡＩ−３から作成されたこれと類似の分子量の複合体が
、以前尿および血漿の双方で観察された。しかしこの複
合体は上記知見に対する説明と１．て、（１）プＬ７Ｕ
にはＦＡＩ３と複合体を生成しない、（２）血漿内でプ
ロ−ｔＪＫは安定しており、実験に使用した濃度で２本
ｊｉ ＬＩ Ｋへ活性化されないという理由から除外す
ることができる。結局、複合体の生成はり、、ｌ Ｋに
対する阻害因子（Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−クロロメチ
ルゲトン）５プラスミノーゲンに対する阻害因１〜（ア
プロチニン２０ＫＩＵ／１１１１）の添加、もしくはｍ
ｕを１ラスミノーゲン無禽有にすることによって防止さ
れない。 しかもＩＪＫ ： ＰＡ Ｉ −１（アラスミノーゲン
活性化因子阻害囚−ｆ−１）複合体はユ９５ｋＤで移動
し、同時にユ１２５ｋＤおよび≧１５５ｋＤで移動する
他の阻害因Ｔ−［クルイトフ、Ｅ、に、Ｏ。 ら、ブラッド、６４巻、９０７〜９１３頁（１９８４年
）］および、］α２−マクログロブリンーＡと反応する
第４の複合体をゲルの鮪先端に随伴するから、インキュ
ベージ」ン中のプロ−Ｕ Ｋの活性化およびＵＫ ：
ＰＡ １１複自体生成はこれらの知見と合致しない。そ
れにもかかわらずインキュベーション中のプロ−ＵＫ活
性化の可能性を減少させるため、アブ１７チニン（２０
ＫＴＬＪ／ｒｎｌ）をプラスミ７−ゲン枯渇血漿へ添加
する追加実験を天施した。これらの方法では≧１２０ｋ
Ｄの複合体の生成は抑制されなかった（第１１図、コー
ス７〜１０）。 しかし第３図に示したようにプロ−ＵＫをＩ ＳＡ枯渇
血１ｍ（ＣＢＳＩｆｌ漿）とインキュベートすると高分
子墳の活性化因子複合体は生成しなかった。 これらの知見は血漿内で観察された複合体がＨ８Ａと複
合したプロ−ＵＫからなることを証明している。 （ＣＢＳ−Ｈ３Ａとプロ−ＵＫの複合体の生成）プロＵ
Ｋ（５μｓ／ｒｎｌ）を新たに精製したＣ Ｂ５−Ｈ８
Ａ （４０ｎｉｇ／ｍｌ、０．１Ｍ １〜ＩＥＰＥｓ
溶液（ｐＨ７，４））と少なくとも４時間インキュベー
ト（３７℃）し、混合物を５ｌ）Ｓ−ＰＡＧＥおよびザ
イモグラフィーによって測定すると、二１２０ ｋ ｌ
）バンドが一スして生成したく第１２１４、コース２）
、これに対して１Ｏ−ＩＪ ＫをＣＢＳ枯渇血漿とイン
キュベートすると、複合体は生成しなかった（第１２図
、コース３）、ＣＢＳ枯渇血漿にＣＢ５−１１５Ａを補
充すると複合体の形成が回復された（第２図、コース４
）。複合体を含貞しているｌｌ１ｌ漿（第２図、コース
５）をＵＫ−Ａｂセフファースカラムへ通導すると複合
体は除去された（第２図、コース６〜９）８ またＵＳＡおよび）３ Ｓ Ａの商業的な調製品のチオ
ール形態、を回復するため、これらをＤ Ｔ Ｔで前処
理してプロ ＵＫとインキュベ−１〜すると、複合体の
形成が２２ぬられた６ （Ｓ ［’） Ｓ中での解離に対する複合体の感受性）
Ｃ）３８ ）１ｓＡとプロ−ＵＫのインキュベーション
によって生成した複合体をセファデックスＧ７５による
ゲルｒ過によってｖ敲し、５ＤＳ−ＰＡ Ｇ ■・、で
これを分析した。試料を煮沸すると複合体の完全な解離
が起こったが、３７″（Ｘ″では部分的な解Ｍ（ぐ５〇
九）だけがゲルのザイモグラムで認められたく成赤責は
示さない）。 （種々の形態のＵ ＫのＢＳＡとの複合化お上びへ合化
に対するＬ）Ｆ Ｐおよびクロラミン−Ｔの効果） ＨＭＷ−ＬＪＫをＢＳＡとインキュベーｔ・すると、Ｈ
ＭＷ−ＵＫを＃１街液中でインキュベ−１〜１，たとき
（第１３図、コース１）にはｑられなかった複合体が生
成することが判明したので（コース２）、複合体が、実
際はＣＢＳカラムでＢＳＡと一緒に精製される１ｇｌ書
因子とｔ−Ｉ Ｋとから構成される＝ｒ能性を検討した
。複合体は、プロ−ＵＫを血漿中でイ〉キュベートした
とき形成された複合体に対応する”１２０ｋＤで移動し
た（第１３図、コース５）、しかしＬＭＷＵＫ（アポキ
ナーゼ（Ａｂｂ。 ｋｉｎａｓｅ））とＨＳ Ａとのインキュベーションで
は複合体を誘導できなかった（第１３図、コース３およ
び４）、さらにプロ−ｔｌＫの欠失変異体（１１〜１３
５残基を欠失）を１１８Ａとインキュベートしても複合
体は生成しなかった（第１３図、コース７）、これらの
観察から複合体はＵＫの阻害因子との複合体ではなく、
また複合化はＵＫのＡ鎖に関係するものであって、１毫
鎖の１０テア一ゼ部分を含むものではないことが分かる
。 さらにＵＫ：阻害因子洩合体を排除するなめ、セリンプ
ロテアーゼ混入物を抑制する目的でＣＢＳＨ５ＡをＤＦ
Ｐで＠処理した。この処理はプロ−ＵＫとの複合体形成
を抑制できなかった（第７［Ａ、コース４．コース２お
よび３と比較）９次にセルビン混入物を排除するため、
セルビンを不活化することが判っているクロラミン−Ｔ
［スティーフら、バイオロギッシェ・ヒエミー・デル
・ポッペーザイラー（Ｒｉｏｔ、 Ｃｈｅｍ、 Ｈｏｐ
ｐｅ−５ｅｙＩｅｒ＞、３６９巻、１３３７〜１３４８
頁（１９Ｆ１３年）］でＨＳ Ａ調製品を処理した。こ
の処理もまた複合化を抑制できず、したがって［ｌｌ察
されたプロ−（１ＫまたはＨＭＷＵＫＮ合体の形成は阻
害因子によるものではないことが確ケされた（第７図、
コース６：未処理ＵＳＡ対照（コース５）と比較）。 （複合体がジスルフィド連鎖であることの証拠）ボリク
Ｌ］−ナルＵＫ−ＡＩ）を使用したウェスタン免疫プロ
ッティングで、プロ−ＵＫをＣＢ５−ｌ５Ａとインキュ
ベートすると＝１２０ｋＤバンドが認められるが（第１
４ｒｍ、コース３）、プロしＩＫを榎ｉ＃ｉ渣中（第１
４図、コースｌ）またはＤＴＴで前処理しないＢＳＡ
（第５図、コース２）とインキュベートしてもこのバン
ドは認められない、ＣＢ５−Ｈ３Ａ対照は抗体と可視的
な反応を起こさない（第１４図、コース４および８）、
還元条件ドで＝１２０ｋＤ複合体が解離することは、そ
れがジスルフィド連鎖であることを示唆している（第１
４図、コース７）。 またプロ−ｔＪＫ：アルブミン複合体がジスルフィド連
鎖であることを示す追加的な証拠が肖られた。第１に酸
化型グルタチオンまたはＤＴＮＢのようなスルフヒドリ
ル試薬を方法２の反応混合物へ添加すると、下記のよう
に複合化が抑制された。 酸化型グルタチオンを血漿へ添加し、３７℃で２時間反
応させた。その結果を第１５図σ）ザイモグラムに示す
。このザイモグラムグ）コース１〜３は緩衝液中でイン
キュベートしたプロ−ＵＫを示す。 グルタチオンによってその濃度に依存するプロしＩＫ
： Ｈ３Ａ複合体の形成の低下が起こった。コース２お
よび５は０．５ｍＭグルタチオン添加、コース３および
６は５．０＋ｎＭグルタチオン添加でＪ〉る６ｔ＆初（
こ埴げｔ：３コース、に示したようにグルタチインはプ
ロ−ＩＩ Ｋの線維素溶解活イ１を抑制しない。グルタ
チインに対するこの反応がち、アルブミンの遊離システ
ィンが複合体に関与しており、したがってア［７−ＬＩ
ＫおよびＵＳＡはジスルフィド梁嬌によって連鎖してい
ることが分かる。 同様にｉ１！−システインと反応するＤＴＮＢを用いた
実験でＤ Ｔ Ｎ Ｂが複合体形成を抑制することがＰ
Ｉ明した。第１６図は緩衝液中（コース１〜５）および
ＵＳＡ（コース６”ＩＯ）と、ＤＴＮＢの０．０Ｍ（コ
ース１，６）、１ｍＭ（コース２゜７）、３ｒｎＭ（コ
ース３．８）、６ｒｎＭ （コース４．０）およびｌｏ
ｍＭ（コース５．１０）でイシＡユベ〜トシたアＴＶ−
ＬＩＫのザイモグラムである。 第２に商業的なＨＳ Ａまた（３ Ｓ ＡはアローＬＪ
Ｋと冶どまたは全く複合体を形成しない、これは第７
１４（コース８、ブｏ −Ｕ Ｋの２１体だけが示さ〕
じζいる）および第１４図（コース２）から明らかであ
る。また新たに調製したＣＢ５−ＵＳＡとの複合化は貯
蔵時間とともに減少した。しかしながらこれらすべての
調製品によるプロ−ＵＫとの複合体形成能は１、：れら
をＤＴＴで処理すると回復できた。商１的なりＳＡ調製
品に対するこの効果を第７図、コース９に示ず７ビータ
ー、′Ｉ゛、らの報告のように、ｐＨ５〜７におけるＤ
ＴＴ処理の効果はＩ造的ジスルフィド結合を解離するこ
となく、チオールｌｆ３！！ｌを回復するｊアドバンシ
ズイン′・プＬ７テイン・ケミストリー、３７巻、】６
１〜２４５頁（１９８５年）］。したがってこの知見は
Ｈ８ＡｔたはＢＳＡの有用なシスティンチオールがグロ
ーＬＪ Ｋの複合化にとって必要であることを示してい
る。 第３にＤＴＮＢによる滴定からＤＴＴ処理処理面業的な
Ｆ（ＳＡは＋ｑ用可能なシスティンを、処理後の０．６
と比較して０．またけイ■していることが判明した。新
たにｔｉ４製したＣＢＳ−ＵＳＡでも比較し得る像が得
られた。したがって）（ＳＡ調製品の利用可能なシステ
ィンとアロＵＫとの複合化の間には正の相間があった６ 第４にチオールジスルフィド交換を触媒するＰＤｒ［７
リードマン、Ｒ、Ｂ 、、セル（Ｃｅ ｌ ｌ ）、５
７巻、１０６９〜１０７２頁＜１９８９年）、ギルバー
ｌ−２Ｈ、Ｆ 、、バイオケミストリー（Ｂｊｏｃｈ
ｅｍ、 ）、２８巻、７２９８−・−７３０５頁（１９
８９年）］をインキ３．ベーショ〉・混合物に添加する
と、複合化が促進された。ＰＣＩを含有１２ない場合は
、複合体が出現するまでに４時間のインキュベーション
を曹したが（第８ＡＬ−５）、ＰＤ Ｉ （９２０μｇ
／ｍｌ＞をノフイｒさせると、複合化は１時間のインキ
ュベーション後に起こった（第８Ｂ図）。ＰＤＩ効果は
ブ１７−ＬＪＫ（１０）ｚｇ／ｍｌ）をメルカプｌ−ア
ルブミン、ｌｌ’ＦＪ品（４０ｒｎｇ／ｍｌ）と１．）
Ｄ Ｉの０．２３，２３０．４６０．６８０または９
２０μｇ／ｍｌとでインキ１．ベート１．た第９１４に
示したように１度依存性であった。Ｉ−” Ｉ） Ｉの
存在では、１０ＬＪＫの２１Ｔｔ休の生成もまた著しく
増強され（第８Ａ、８Ｂ、９［′！Ｉ）、これらの２駿
体はジスルフィド連鎖であることが示唆された。大暖の
ＰＣＩを必要とすることはこの酵素の低い効率と一致し
ている。 試料をＳＤＳ中で２分間煮沸すると複合化が抑制された
く第１４図、コース３）。この知見はまたジスルフィド
連鎖複合体が煮沸によって不安定化され得ることと一致
している。そのうえジスルフィド交換をＦｌｌｌｌする
ＣｕＣ１ｘ （１＋ｎＭ）の存在で複合体は煮沸に抵抗
した。ある種のジスルフィド連鎖接合体についてジスル
フィド連鎖の熱解離が以前に７オルキンおよびクリバッ
フによって報告された［フォルキンら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、
（ｊｌｅｖａ、 ）、２６２巻、２９４５〜２９５ｏ
頁（１９８７年）］。 プロ−〇にのシスティンとアルブミンの対にならないシ
スティンとの間のジスルフィド連鎖は、アルブミンの連
鎖したプロ−ＬＩ Ｋに遊離システィンを作り出すであ
ろう、この遊離システィンは別のプロ−ＬＪＫ分子のシ
スティンまたは別のアルブミン分子のシスティンと反応
できるであろう、そのような状況下では、プロ−ＬＪＫ
Ｉ分子とアルブミン１分子から作られた複合体の代わり
に、プロ
【ＩＫ２分子がアルブミン１分子と連鎖するが
、またはアルブミン２分子がブローＩＪＫＩ分子と連鎖
した複合体のいずれかが形成されるであろう。 これらの３者間の複合体は同定されており、この発明の
範囲に含まれる。 （ｌ（Ｓ Ａのｐ ｌ（および濃度効果）インキュベー
ション′を６〜８．５のｐＨ範囲で実施すると、複合化
に最適なＰＨは約８＝８．５であるようである（第１７
図、コース１へ、６）やしたがって殆どの実験はｐＨ８
，０で実施した。 プロｔＪ Ｋに対するＢＳＡの広範囲の割合の実験から
複合化を決定する支配的な制限因子はＢＳＡの濃度であ
った。この実験はＤＴＴ処理した商業的な）４ Ｓ Ａ
の８０．２０および１０ｍｇ／ｍｌをプロ−Ｌ、Ｊ Ｋ
（５μｓ／ｒｎｌ）とインキュベートした第１７ｒ″
４（コース８−１０）に示した。アロー（ＪＫ４４度の
上昇は複合化を増強しない、そのうえこの■（ＳＡの過
剰の場合、複合化は約２４時閉までにプラトーに達する
傾向さえ見られた。 （ＢＳＡをさらに精製する効果） 上記の知見からプロ−ｔ＋ Ｋ Ｎ合体がＩ Ｓ Ａお
よびＢＳＡ調製品中に存在している微麓の混入物と複合
化する可能性が示唆される。Ｈ３Ａ調製品をＤＥＡＥセ
ルロースクロマトグラフィーまたはコンカナバリンＡセ
ファロースを通過することによりそのような混入物を除
去しようと試みたが、調製品のプロ−ＵＫに対する反応
性は変わらなかった。したがって機微のタンパク質混入
物が原因であるとすれば、それは非糖タンパク質ではな
いようである。僅かの例外（ＢＳＡ、トランスザイレチ
ン、レチノール結合タンパク質）を除いて、直販タンパ
ク質はすべて糖タンパク質であるＥビーターズ、Ｔｏ、
アドバンシズ・イン・プロティン・ゲミストリー、３７
巻、１６１〜２４５頁（１９８５年）］。 （複合体の抗体認識） 方法１により高度に精製されたＤＴＴ処理したＢＳＡで
作成した７Ｏ−ＵＫ複合体を５ＤＳ−ＰＡａ Ｅ ｔ＆
のゲル切片から電気泳動溶出し、ついでもう−度５ＤＳ
−ＰＡＧＥへ適用した。ＵＫＡｈを用いた免疫プロッテ
ィングによって≧１２ＯｋＤに複合体が現われた。しか
し複合体はボリク１１ ＝ナルＨ３Ａ−Ａｂによって認
識されることが多数の実験で判明したが、この実験では
モノクローナルｌ５Ａ−Ａｂによって認識されながった
く成績は示していない）、この矛盾に対する説明として
モノクローナル抗体によって認識されるＢＳＡの必須上
ζトープが複合体によってマスクされたことに関連する
のかも知れない。そうであるにしてもこの否定的な知見
は、１Ｏ−１Ｊ Ｋ複合体がＢＳＡまたはＢＳＡの微菫
の血漿タンパク質混入物と複りしている可能性を残して
いる。そこで血漿タンパク質混入物を全く含有していな
いエシェリキア・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）から得た組換
え体ＨＳ Ａで研究を行なった。 （プロ−ＬＪＫとｊｌｌ換え体）ＩＳＡとの複合化）組
換え体Ｈ５Ａおよび天然のＩＳＡ（４０ｍｇ／ｍｌ）を
Ｉ） Ｔ Ｔ処理前＜−）および処理後（＋）にそれぞ
れプロ−ＬＩＫ（５μｇ／ｒｎｌ）とインキュベート（
６時間）した、インキュベーション混合物のザイモグラ
フィーによる分析では、天然および組換え体ＨＳ Ａの
いずれの場合とも＝１２０ｋＤに複合体（Ｃ）が認めら
れ、その形成はＨ８Ａ調製品のＤＴＴ前処理（＋）Ｋよ
って有意に増強された、ＤＴＴ処理はまた高分子量複合
体（Ｃｏ）の形成も促進し、恐ら＜ＢＳＡと複合するプ
ロ−Ｕ Ｋに不対システィンが問与しているものとＷ、
われる７プロｔＪ Ｋの２１体（ｄ）が＝１２０ｋＤ複
合体のすぐ前を移動していることが認められた（第１０
図）。 ＜ＣＢＳアフィニティークロマトグラフィーによるａ＠
からのプロ−ｔＪＫ複合体の分岐）複合化されないプロ
−〇 Ｋを０．５Ｍ ＮａＣ１で４−分に洗浄したの
ち、それがＣＢＳアフィニティークロマトグラフィーに
よってＩＳＡと一緒に精製されないことを確定した。こ
れはＣＢＳアフィニティークロマトグラフィーの直前に
プロ−ｔＪＫ（５μｇ ／ｍ ｌ）を血漿へ添加する実
験により判明した。これらの条件下では溶出したＩ Ｓ
Ａはザイモグラフィーによって検出−■能な線＆Ｉ素
溶解活性を示さなかった（第１８図、コース２）、遊離
のプロ−ＬＩＫは０．５ＭＮａＣｌで徐々に洗い去りを
−６対照と１７て複合体形成を行なうｔ：め血漿をブｎ
−ＬＪＫ（５μｇ／口１１）と２０時間プレイ〉′ギュ
ベー１〜（３７℃）すると、Ｃ１ＩＳｒ精製したＩ Ｓ
Ａのザイモグラムはそねに伴なって線縛素溶解活性を
示した。これは工１２０ｋＤおよび＝ ５５ ｋ Ｄの
双方で移動するバンドを示ずＨＳ Ａのザイモグラフィ
ーによって示された（第１８図、コース１）、遊離のプ
ロ−Ｕ Ｋは一緒に精製されないことが判明しているか
ら１、二の＝５５ｋＤバンドは恐らくＳ Ｄ Ｓで試料
調製中にＨＳ Ａ複合体から解離したある種のプロ−ｔ
ｌＫを表わすものであろう、（血漿に本質的に備わるプ
ロ−ＵＫの研究）血漿に本質的に備わるプロ−ｔＪ Ｋ
もＨ５Ａと類似の複合体かもしれないことを検討するた
め、カジノ、を０．５ＭＮａＣ１で十分に洗浄したＣ
Ｂ Ｓり１７７１〜グラフィーにより新鮮血漿からＨＳ
Ａ約６００ ｍ ｇ ｔｌ−精製しｆ：：、この調製
品を以前に報告した荷電ブドウ球菌プロティンＡ抗−ｔ
ＪＫ抗体吸着剤で処理しく第１２図−コース６−９）、
複合体中のプロ−ＵＫを認識させた。抗原−抗体複合体
を解離するため免疫沈降物をＳ Ｄ Ｓ試料縫隣液中で
煮沸した。これらの条件ではプロ−〇 Ｋ ： ＨＳＡ
の解離も起こる。引き続きザイモグラフィーを行なうと
ｌ５ＡＪｉｌ製品中にプロ−ＵＫの存在を示す！５５ｋ
Ｄの溶解バンドが現われた（第１８図、コース３）、遊
離のプロ−１．ＩＫはＣＢ Ｓアフィニティークロマト
グラフィーによって精製されないことが判明しているか
ら、この知見はＣ１３３カラムによって血漿から単離さ
れたプロ−ＵＫがＩ ＳＡとの複合体にあったこと示唆
している。したがって正常な血漿で得られた知見は、プ
ロ−ＬＩＫをｆ４厚にした血漿を５６時間インキュベー
トしたときの観察と一致した。ＵＫは阻害因子複合体を
形成しｒクルイトフ、ブラッド、（）４巻、９０７−９
１３頁（１９８４年）、チー１ラツクら、トロ〉′ボシ
ス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓ、 ｔｌ
ａｅｍ。 ５ｔａｓ、 ）、５３巻、３６〜４４ｓＴ（１９８５年
）、スタンプら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミスストリー、２６１巻、１２８３４〜１２８４１頁
（１９８６年）］、コれはＳＤＳ中１００”ｃで安定で
あり、したがって；９５ｋＤ’″Ｃ：５ｌ）ＳＰ Ａ
に Ｅを移動するから、ＣＢ Ｓアフィニティークロマ
１へグラフィーによりｖ、ＩＩｉされたｔＪ Ｋがプロ
ｔＪ Ｋ・ＨＳ Ａ複合体ではなくＵＫ二阻害因子であ
る■目止性はありそうにないと考える。 複合体とし２て存在する血漿に本質的に備わる１ｏ −
［Ｊ Ｋの割合を検討するため、新鮮血漿（アブ＋７１
一ニン２０ＫＩＵ／ｍｌ含有）２０ｍｌをセフアゾｌク
スＧ−７５カラムでクロマｌ−グラフィーに掛けた。血
漿タンパク質は２つの主要ピークに什かれた（第１９Ａ
図）。ゲル濾過の直前にプロ−ＵＫを濃厚にした血漿試
料で校正したカラムにより、複合体を作成するためプロ
−〇Ｋ（５）１ｇ／ｒｎｌ）とブトインキュベート（３
７℃、２０時間）した血漿試■で′ｉｎ離のプロ−ＩＪ
Ｋおよびプロ−ＵＫ：Ｈ８Ａ複合体の位置を決定した
。採取１〜た分画の線維素溶解活性を線維素平板で検定
した。遊離のプロ−Ｌｊ ＫはプールＤに対応する分画
１１２〜１１９で認められ、プロ−ＬＪＫ：ＩＳＡ複合
体はプール１３に対応する分画９５ ” １００で認め
られた（第１９Ａ図）。 その俺、正常血漿をこのカラムでゲル濾過によって検定
した。１１夢に本質的に備わる線維素溶解活性は免疫沈
降およびザイモグラフィーによって検定した。第１９Ａ
図に示したように分画を４０ツトにプールした。第１９
Ｂ図に示したように線維素溶解活性はプロ−ＬＪＫ複合
体が溶出されたことが判明した高分子量分画（第１９Ａ
図）に対応するプールＢＣ優勢に検出し得た。少量のＵ
Ｋ／ｌ！ｌ性が均一に一層高い分子蟻で認められた（プ
ールＡ）（第１９Ａ図、第１９Ｂ図）、またプロ−■−
】ＫＱ精製したＨ８Ａとインキュベートした幾つかの実
験で、恐らく１分子以上のｌｌ５Ａまたはプｔ７ｔＪ
Ｋとの複合体を表わしている一層高分子閂のプロ−ＵＫ
： Ｈ８Ａ複合体が形成された（第１０図参照）、遊
Ｍのプロ−ＵＫの分子獣に対応するプールした分画りに
はＬＩ Ｋ活性は認められなかった。したがって血漿中
の検出可能な［、Ｊ Ｋ活性はずべて複合体の形で存在
していることが分かった。 複合体はザイモグラムで＝５’５ｋＤバンドで示される
ように（第１（）８図）、試料調製中にＳＤＳ中で解層
するから、観察された複合体はＵＫ：阻害因子複合体ど
は一致しない。したがってこの知見はｉＥ常血漿に本質
的に備わるプロ−Ｕ Ｋの大部分がＨ８Ａと形成する複
合体に対応する複合体の形であることを示唆している。 （循環中の複合体の長い半減期ン 肝臓にあるＬＩＫ受容体によって同定されたプロｔｌＫ
分ｔ−Ｌの部位はこの発明の複合体でマスクされ、その
結果、結合したプロ−Ｕ Ｋは、遊離プロ ＬＩＫの゛
を囲器が５〜８分であるのに反して、長いｆ減量（数時
間ないし数日間）をもって提供されることが仮定される
。プロ〜ｔＪＫの１１！＃素溶解性が低Ｉ・するわけで
はないから、プロ−ＬＩＫ。 アルブミン氏合体は治療的な面栓溶解によく適している
ことが期待される。この発明は必要なプロ−ＵＫの投与
域を実質上減少し、連続注入の必要を解消するこによっ
て投与、を容易にするはずである。 〈用途） この発明のプロ−ＵＫ：アルブミン複合体は他のプラス
ミノーゲン活性化因子、例えばｔ−ＦＩＡ。 ＬＩＫおよびプロ−ｔＪＫと同一の適応症に治療的に使
用できる。目的は血管内の血液凝塊（血栓）を溶解する
ことである。現在の臨床的な適応症は心筋梗塞、深部静
脈血栓庁、肺塞栓などである。この発明の複合体は生物
学的に好適な担体物質１例えば食塩水と混合して、大量
注射によって静脈内に投与される。またこの複合体はプ
ロ−ＩＪ Ｋと相乗的であるｔ−ＰＡと都合よく混合し
得る９、ｔたこの混合物は治療を簡翳にし、家庭でも実
施することが可能な簡曝な大量注射として投与すること
ができる。ｔ−ＰＡは溶解を開始し、急速に浄化される
が、長時Ｅ作用性の１０ｔＪ Ｋは溶解経過を完成させ
得る。 さらにこの発明の複合体は血液に本質的に備わる線維Ｊ
：溶解活性を高める［１的のため投す・でき、それによ
って線維素溶解活性の低下に起因することが知られてい
る心血管疾患の長期予防に使用できる。血栓９はアテロ
ーム性動脈硬化症の病因の１・■でＩ）るとｋい間信じ
らｔｃてきたから、毎週または毎月の間隔をおいたこの
発明の複合体の定期的な注Ｉｔｔ投与、することにより
アテローム性動脈神化症をｆ ＩＩｈ Ｌ得る。 鮪擾に、この発明のｌ−ＩＭＷ−ＬＩＫとアルブミンと
の複合体の酵素的活性形態は、ある種の臨床適用を小し
得る。）ＩＭＷ−ｔＪＫはプロＵＫの酵素的ｔｔｓ ｔ
ＢであるかＸ、、この６のは数種の血漿床置因子と反応
する、その結果、この複合体はこれＩｉ、の阻′＾′因
ｆが消費し尽くされるまでの長い半減期は示さないで、
Ｐ）ろう。複合体はコ又ｌ・を低下し、投４を容鴫にす
る 層長い半減期によってＨＭＷまたはＬＭＷｔｌＫよ
り４ｒ利性をイ１する。 治療コ（画実施例］ ′（施（列１］ 人１を注射による血栓の救２９＆置のため、プロ１１Ｋ
アルブミ〉複合体の凍結乾燥品約５〜２０口’ ｇ
’ｉ−食塩水と混合し、注射筒へ加え、入ψを患名へ
静脈性ｑ（するの番こ使用する。 ［実施例２１ 冠動脈血栓を急速に溶解するため食塩水に溶解したプロ
−ＵＫ・アルブミン複合体の凍結乾燥品の約５〜２０ｍ
ｇをｌ−Ｉ Ｋ ２ ｍ ｇと一緒に静脈内に投与する
。ｔＪＫは溶解の開始を促進するの番、：役立つ。複合
体の長い半減期は血栓柾の再発を予ＩＩｊｊ ｌ。 存在する血栓の溶解を完成するのに役立つ６１実施例３
］ 深部静脈血栓および＃塞栓の処置のため、ｆｓＡＥＡ水
に溶解した凍結乾燥し、たプロＵＫ：アルブミン次合体
の約５〜２０ｍｇを静脈内に投す・する、必要であれば
注射を繰り返すことができる。１１′持−？的なアラス
ミノーゲン活性化はこの投与量では起こらない。 １実施例４］ ｔ−Ｔ’Ａと凍結乾燥したグ［７−１１に＋アルブミン
複合体の相乗的な組合わせの大量注射による血栓９ｊＬ
ｉ′ｎ＋７） タメ、ｔ −Ｐ Ａ 約５−２０ ＋
ｎ ｇラフｎ ［Ｊ Ｋニア゛ルブミン複合体約５〜２
０ Ｉｌｌ ｇと混合し、簡１ｉに大量注射として投与
する。ｔ、−ＰＡは急速に浄化されるが５複合体は循環
内に残留し、血栓の溶解を完成し、妥協的な特別措置な
しに血栓症の再発を予防する。 ［実施例５］ 別法とｊ−て、冠動脈血栓の急速な溶解のためプロ−し
ＩＫ＝アルブミン複合体の凍結乾燥品約５〜２ （ｌ
ｍ ｇを、食塩水に溶解したｔ、−ＰＡ凍結乾燥品の約
３０ｍｇ７時間の点滴と−・緒に注射する。 〔実施（＠６］ アロ ＵＫ：アルブミンの格別に長い半減期はこれを血
栓症予防に有用なものとする。この適用では少投手鰻、
即ち毎週的１〜５ｍｇを使用し得る。 ［実施例７］ 活性なＨＭＷ−ＵＫ：アルブミン複合体はＨＭＷＬＪＫ
またはＬ Ｍ Ｗ−Ｕ Ｋの・層経済的な代替品として
１重用し得る。 ［′Ｘ施例８］ 深部静脈血栓症の処置のために、凍結乾燥したア［７−
ＬＩＫ：Ｈ５Ａ複合体の約５〜２０ ｍ ｇを食塩水に
溶解し、囃独またはｔ−ＰＡと組合わせて投与する。 ［実施例９］ 不安定狭心症または切迫心筋梗塞の処１のなめプｏ−Ｕ
Ｋ ： Ｈ３Ａ複合体の大量（５〜１０ｍｇ）を静脈内
に注射する。この臨床状態が数日間続く傾向があるので
、この適応症のためには長い半減期を有するプラスミノ
ーゲン活性化因子が特に有用である。 ［実施例１０］ 血栓症の再発予防のため経皮経管血管拡張術または他の
プラスミノーゲン活性化因子による急性血栓溶解治療の
後、この発明のプロ−ｔＪＫ：Ｈ５Ａ複合体の比較的少
量投与、即ち１０ｍｇｔ−Ｍえない量で十分である。 ［実施例１１］ ｍ線素溶解活性の低下を伴うことが多い心血管疾患の予
防のため、複合体の定期的注射の投与は線謹素溶解活性
を増加する０例えばＨＳＡとの複合体の形のプロ−ＵＫ
の約１〜５ｍｇの注射を毎月投与し得る。 ［図面の簡単な説明］ 第１（ａ）図は完全な１本鎖プロ−Ｕ Ｋ分子を示した
略図、第１（ｂ）図はプロ−ＵＫ／アルブミン複合体の
作成を示した略図である。 第２図で（・）はタンパク質含量（タンパク質検定）、
（０）は線維素溶解活性（ＩＩ維素平板）、初はプール
した分画である。 第３図：分子量は１８０ｋＤ、１１６ｋＤ、８４ｋＤ（
１）、（２）は緩衝液中のプロ−ＵＫ、（３）はプロ−
ｔＪＫを精製したＨＳＡと４時間インキュベート、（４
）１．ｔｃＢｓ血禁中、（５）はＣＢＳＩａｌａｌｌ＋
ＨＳ Ａ中、（６）は血漿中でプロ−ＵＫを４時間イン
キュベート、試ｎ（３）をα（Ｕ Ｋ ）−ｓカラムを
通し、〈７）、（８）、（９）、（１ｏ）は最初の４分
画である。 第４１二分子量は１８０ｋＤ、１１６ｋＤ、８４ｋＤ、
５□１ｋＤ（１）、Ｇ−７５１１１１２複合体・・−・
−・・・〈２）、・・−・・く３）、（−α（ＩＩＳＡ
）（４）、複合体はα（Ｉ Ｓ Ａ ）−ｓカラムを通
し、（５）、（６）、（７）、く８）はれ初の４分画で
ある。プロ−ＵＫを血漿中で４時間インキュベート（５
）、 〃 ＋α（ＨＳＡ）（１０）、 試料調製：３７℃で３０分間試料Ｈ街液中でインキュベ
ート、ただしく３）はｉｏｏ”ｅで２分間。 第５図ニブロー〇に、榎ｆＩ液中（１）、プロ−（月く
を精製Ｈ３Ａとインキュベートした、ｐ Ｈ５（２＞。 ｐＨ７，５（３）、ｐ Ｈ９（４）、ｐＨ７，５（煮沸
試料）（５）、Ｚ ｎ ” ５０ ｔｔ Ｍ （６）、
Ｃａ＋＋５ｎｎＭ（７）、Ｚ ｎ”およびＣａ”（８）
、プロ−ＬＪ Ｋ ／１（ＳＡ１０倍（９）、７Ｏ−Ｕ
Ｋ、！樹液中ｃｉｏ＞。 第６１二分子量は１８０ｋＤ、１１６ｋＤ、８４ｋＤ（
１）、（２）は＄１１１液中のプロ−〇Ｋ、（３）は血
漿中で０時間インキュベート、（４）は１時間、〈５）
は２時間、（６）は６時間、（７）はＭ樹液中のＵＫ、
く８）は血漿中で０時間インキュベート、（９）は６時
間、（１０）は濃縮尿。 第７図： Ｄ Ｆ Ｐおよびクロラミン−Ｔ−処理した
ｌｌ５Ａ（復合化に影菅せず）およびＤＴＴ５３埋した
ＢＳＡ （プロ−ＵＫとの複合体形成能を回復する）ノ
フローＵＫとの複合体のザイモグラム、ブローＵにの［
樹液中（コース１）、プロ−ＵＫ＋Ｈ８Ａ（コース２）
、プロ−ＵＫ＋−緩衝液処理したＢＳＡ（コース３）、
プロ−Ｕ Ｋ ＋ Ｄ Ｆ Ｐ処理しなＢＳＡ（コース
４）、プロ−ＵＫ＋Ｎ［液処理したｉ（Ｓ Ａ （コー
ス５）、プロ−ＵＫ＋クロラミンーＴ処理したＩＳ Ａ
（コース６）、ｕｉ液液中２１体の存在を示したプロ
−ＵＫ（コース７）、同じプロ−ＵＫの２値体だけを示
したプロ−ＵＫ＋ＢＳＡ（コース８）、および２１体の
事実上の消失とプロ−Ｕ Ｋ ： Ｂ Ｓ Ａ複合体の
存在を示したプロ−〇に＋ＤＴＴ処理したＢＳＡ（チオ
ール形態を回０りである（コース９）。 第８Ａおよび８μ図：複合時間に対するＰＤＩの効果を
示したザイモグラム８組換え体プロ−ＵＫ（０，５μｇ
７ｍ ｌ）をメルカプ１〜アルブミン（４０ｍｇ／ｍ
ｌ）とインキュベーションた。コース１は緩衝液中、コ
ース２〜７はインキュベーション時間０分、１５分、３
０分、１時間、２時間および４時間をそれぞれ表わす、
ＡはＰＣＩを加えず、ＢはＰＤＩ （９２０ｕｇ／ｍｌ
）。 第９図：複合化−用量反応に及ぼすＰＤＩの効果を示し
たザイモグラム。コース１はプロ−ＵＫ単独を緩衝液中
（コースｌ）、コース２〜７はそれぞ１〜ＰＤＩ濃度０
．２３．２３０．４６０．６９０および９２０μｇ／ｒ
ｎ１．Ａはインキュベージ３７１１１間、６時間、Ｂは
インキュベーション時間、１２時間、複合体＜Ａ４〜７
）の前に移動している活性バンドはプロ−ＵＫの２量体
を表わす。 第１０１：エシェリキア・コリ（Ｅ、 ｅｏｌｉ）から
得られた組換え体Ｈ３Ａで作成したプロ−ｔ、Ｊ Ｋ複
合体のザイモグラム。商業的なＢＳＡおよび組換え体Ｈ
３Ａ（４０ｍｇ／ｍりをＨＳ ＡのＤＴＴ処理前（−）
および処理後（→−）にプロ−ＵＫ（５μｇ／ｍｌ）と
それぞれ６時間インキュベート（３７℃）した。 後者の方が複合体（Ｃ）形成を増強し、高分子量の複合
体（Ｃｏ）の形成を誘導した。プロ−Ｕ Ｋ ２−１ｉ
ｔ体（ｄ）および２ｋＤプロ−ＵＫバンド（ａ）も明ら
かである。 第１１図：緩衝液中でインキュベ−１〜＜３７℃）した
プロ−ＵＫ（０，５μｇ／ｍｌ）のザイモグラム、榎ｌ
ｉ液中、０時間（１）および６時間（２）、および血漿
中、０時間（３）、１時間（４）、４時間（５）、６時
間（６）、およびプラスミノーゲン枯渇アブロチ−ン含
有（２０Ｋ Ｉ Ｕ ７ｍ ＋）ｍＭ中、０時間〈７）
、１時間（８）、４時間（９）、６時間（１０）、試料
は３０３９３７℃で調製した。 第１２図ニブｏ−ＵＫ（０，５μｇ／ｍｌ）を３７℃で
［１液中（１）、およびＣＢＳ−）（ＳＡ（４０ｍｇ／
ｍｌ）とインキュベ−１〜（２＞、Ｈ３Ａ枯渇血漿中（
３）、ＨＳ Ａを補充したＨ Ｓ Ａ枯渇血漿中でイン
キュベート＜４）、ＵＫ−Ａｂセフファースカラムを通
す前（５）および後にプロ−ＵＫでブレインキュベート
した血漿（４分画、６〜９で示す）。 第１３１〜３：メルカプトアルブミン（４０ｍｇ／ｍｌ
＞とブレインキュベート（６時間）したさまざまな形の
ＵＫ（０，５μｓ／ｍｌ）［（１）［１１液中、）（Ｍ
Ｗｌ、Ｊ Ｋ、（２）ＨＭＷ−ＵＫ＋１（ＳＡ、（３）
緩衝液中、ＬＭＷ−ＵＫ、（４）ＬＭＷ−ＵＫ＋Ｈ５Ａ
、（５）組換え体プロ−Ｕ Ｋ ＋ ＨＳ Ａ、（６）
＆！街液液中欠失変異体プロ−ＬＩ Ｋ、（７）欠失変
異体プｏ−ＵＫ＋Ｈ８Ａ ］のザイモグラムｃｉｏ％５
ＤＳ−ＰＡＧＥ）である、 第１４図：ＵＫ：Ａｂを用いたウェスタン免疫プロット
、（１）ＩＩＩ液中、７時間インキュベート（３７℃）
したプロ−ＵＫ（０，３μｇ／ｍｌ）、（２）未処理の
ＢＳＡ（４０，ｕｇ／ｍｌ）とインキュベ−１〜したプ
ロ−ＵＫ、（３）ＣＢ Ｓ −ＨＳ Ａとインキュベー
トしたプロ−ＵＫ、（４）、ＣＢ５−Ｈ８ＡＩ＃独。 コース（５）〜（８）は同一混合物をそれぞれ還元条件
下に行なったものである。 第１５図：緩衝液中、プロ−ｔＪＫ（１）、０．５ｍＭ
Ｇ Ｓ Ｓ Ｇ ）（２）、５ ｍＭＧ Ｓ ５Ｇ（３
）、および血漿中（４）、０．５ｍＭ Ｇ５５Ｇ（５）
、５ ｒｎ Ｍ ＧＳ Ｓ Ｇ （６）。 第１６ｌ：Ｍ衝液（４０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中、４時
間インキュベートしたプロ−ＵＫ、０．ＯＭ ＤＴＮ
Ｂ（１）、プロ−’ Ｍ ＤＴＮＢ（２＞、３．プロ−
’Ｍ ＤＴＮＢ（３）、６．プロ−’ Ｍ ＤＴＮＢ
＜４＞、プロ−２Ｍ ＤＴＮＢ（５）。 緩衝液中、ＢＳＡ（４０ｍｇ／ｍｌ ）で４時間インキ
ュベートシたプロ−ＵＫ、０．０Ｍ ＤＴＮＢ（６）プ
ロ−’ Ｍ ＤＴＮＢ（７）、３．プロ−’ Ｍ
ＤＴＮＢ（８）、６．プロ−’ Ｍ ＤＴＮＢ
（９）、 プロ−２ ＭＤＴＮＢ（１０）、 第１７ＥＡ：複合化におけるｐＨ（コース１〜６）およ
びＩＳＡ濃度（コース８〜１０）の効果を示すザイモグ
ラム、プロ−Ｕ Ｋ （５μｓ／ｍｌ）をメルカプトア
ルブミン（４０ｍ ｇ／ｍ ｌ＞と２４時間インキュベ
ー１〜＜３７℃）ｉｌ）プロ−ＩＪＫ羊独、ＩＩ衝液液
中（２）ｐＨ６，３でインキュベーション、（３）ｐ
１〜１７．０、（４）ｐ Ｈ７゜４、（５）ｐＨ８，０
、（６）ｐＨ８，５、く７）分子量マーカー、（８）Ｈ
Ｓ Ａ濃度８０ｒｎｇ／ｍｌ、（９）、２０ｍｇ／ｍｌ
、（１０）１０ ｎｎ ｇ ７ｍ ｌ、コース８〜１０
はｐＨ８，０でインキ□べ−１〜した。 第１８ｔＪ：ＣＢ５−１〜ＩＳＡに随伴するＵＫ活性の
ザイモグラム、〈コース１）プロ−ｔＪＫ（０，５μｇ
／＋ｎｌ）とブレインキュベートしたく２０時間）ｉｌ
ｌ漿からのＣＢＳ−）（ＳＡ、＝５５ｋＤバ〉・ドは試
料調製中（３０分間、３７℃、ＳＤＳ試料績衝液中）に
複合体から解離したある種のプロ−ｔＪ Ｋを表わす、
（コース２）プロ−ＵＫ（０，５μｇ／ｍｌ＞で濃厚に
したくただしプレインキュベートはしない）ＩＩＩＬ５
ｉ１からのＣＢ５−ＨＳＡ、ＣＢＳクロマトグラフィー
によってプロ−ＵＫがＨＳＡと一緒にＮ製されないこと
を示している。（コース３）新鮮血漿から単離されたＣ
Ｂ５−ｌ５Ａから免疫沈降させたＵＫ１合体、試料を煮
沸してＡｂを解離したので、＝５５ｋＤの位置は複合体
の解離の結果である。 第１９Ａ図：ｌ１ｌｌ漿（０−＝−−０）ノゲ／Ｌ４’
過（Ｇ−７５カラム）、カラムはプロ−〇Ｋ（０，５μ
ｇ／ｍｌ＞でプレインキュベー１〜（１８時間）した血
漿で校正し、分画９４〜１００（Ｂ）に認められるシ１
２０ｋＤ複合体に対応するもの、およびプロ−ＩＪ Ｋ
″ＣＣ濃厚た血漿でプレインキュベーｌ〜し、分画１１
２〜１１８（Ｄ）に認められる＝５５ｋＤ活性化因子に
対応するものである９分画は線維素子板で検定した（・
・）。 第１９Ｂ図：校正したＧ−７５カラムに掛けて新軒血漿
のＡ、Ｂ、ＣおよびＤとして同定ｌ−て集めた分画（上
記参照）からのＵＫ免疫沈降のザイモグラム。すべてＵ
Ｋ活性は」−記の＝１２０ｋＤに対応する分画（Ａおよ
びＢ）から沈降させたが、＝５５ｋＤで移動し、Ｓ Ｄ
Ｓ中における複合体の解離を示している。
、またはアルブミン２分子がブローＩＪＫＩ分子と連鎖
した複合体のいずれかが形成されるであろう。 これらの３者間の複合体は同定されており、この発明の
範囲に含まれる。 （ｌ（Ｓ Ａのｐ ｌ（および濃度効果）インキュベー
ション′を６〜８．５のｐＨ範囲で実施すると、複合化
に最適なＰＨは約８＝８．５であるようである（第１７
図、コース１へ、６）やしたがって殆どの実験はｐＨ８
，０で実施した。 プロｔＪ Ｋに対するＢＳＡの広範囲の割合の実験から
複合化を決定する支配的な制限因子はＢＳＡの濃度であ
った。この実験はＤＴＴ処理した商業的な）４ Ｓ Ａ
の８０．２０および１０ｍｇ／ｍｌをプロ−Ｌ、Ｊ Ｋ
（５μｓ／ｒｎｌ）とインキュベートした第１７ｒ″
４（コース８−１０）に示した。アロー（ＪＫ４４度の
上昇は複合化を増強しない、そのうえこの■（ＳＡの過
剰の場合、複合化は約２４時閉までにプラトーに達する
傾向さえ見られた。 （ＢＳＡをさらに精製する効果） 上記の知見からプロ−ｔ＋ Ｋ Ｎ合体がＩ Ｓ Ａお
よびＢＳＡ調製品中に存在している微麓の混入物と複合
化する可能性が示唆される。Ｈ３Ａ調製品をＤＥＡＥセ
ルロースクロマトグラフィーまたはコンカナバリンＡセ
ファロースを通過することによりそのような混入物を除
去しようと試みたが、調製品のプロ−ＵＫに対する反応
性は変わらなかった。したがって機微のタンパク質混入
物が原因であるとすれば、それは非糖タンパク質ではな
いようである。僅かの例外（ＢＳＡ、トランスザイレチ
ン、レチノール結合タンパク質）を除いて、直販タンパ
ク質はすべて糖タンパク質であるＥビーターズ、Ｔｏ、
アドバンシズ・イン・プロティン・ゲミストリー、３７
巻、１６１〜２４５頁（１９８５年）］。 （複合体の抗体認識） 方法１により高度に精製されたＤＴＴ処理したＢＳＡで
作成した７Ｏ−ＵＫ複合体を５ＤＳ−ＰＡａ Ｅ ｔ＆
のゲル切片から電気泳動溶出し、ついでもう−度５ＤＳ
−ＰＡＧＥへ適用した。ＵＫＡｈを用いた免疫プロッテ
ィングによって≧１２ＯｋＤに複合体が現われた。しか
し複合体はボリク１１ ＝ナルＨ３Ａ−Ａｂによって認
識されることが多数の実験で判明したが、この実験では
モノクローナルｌ５Ａ−Ａｂによって認識されながった
く成績は示していない）、この矛盾に対する説明として
モノクローナル抗体によって認識されるＢＳＡの必須上
ζトープが複合体によってマスクされたことに関連する
のかも知れない。そうであるにしてもこの否定的な知見
は、１Ｏ−１Ｊ Ｋ複合体がＢＳＡまたはＢＳＡの微菫
の血漿タンパク質混入物と複りしている可能性を残して
いる。そこで血漿タンパク質混入物を全く含有していな
いエシェリキア・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）から得た組換
え体ＨＳ Ａで研究を行なった。 （プロ−ＬＪＫとｊｌｌ換え体）ＩＳＡとの複合化）組
換え体Ｈ５Ａおよび天然のＩＳＡ（４０ｍｇ／ｍｌ）を
Ｉ） Ｔ Ｔ処理前＜−）および処理後（＋）にそれぞ
れプロ−ＬＩＫ（５μｇ／ｒｎｌ）とインキュベート（
６時間）した、インキュベーション混合物のザイモグラ
フィーによる分析では、天然および組換え体ＨＳ Ａの
いずれの場合とも＝１２０ｋＤに複合体（Ｃ）が認めら
れ、その形成はＨ８Ａ調製品のＤＴＴ前処理（＋）Ｋよ
って有意に増強された、ＤＴＴ処理はまた高分子量複合
体（Ｃｏ）の形成も促進し、恐ら＜ＢＳＡと複合するプ
ロ−Ｕ Ｋに不対システィンが問与しているものとＷ、
われる７プロｔＪ Ｋの２１体（ｄ）が＝１２０ｋＤ複
合体のすぐ前を移動していることが認められた（第１０
図）。 ＜ＣＢＳアフィニティークロマトグラフィーによるａ＠
からのプロ−ｔＪＫ複合体の分岐）複合化されないプロ
−〇 Ｋを０．５Ｍ ＮａＣ１で４−分に洗浄したの
ち、それがＣＢＳアフィニティークロマトグラフィーに
よってＩＳＡと一緒に精製されないことを確定した。こ
れはＣＢＳアフィニティークロマトグラフィーの直前に
プロ−ｔＪＫ（５μｇ ／ｍ ｌ）を血漿へ添加する実
験により判明した。これらの条件下では溶出したＩ Ｓ
Ａはザイモグラフィーによって検出−■能な線＆Ｉ素
溶解活性を示さなかった（第１８図、コース２）、遊離
のプロ−ＬＩＫは０．５ＭＮａＣｌで徐々に洗い去りを
−６対照と１７て複合体形成を行なうｔ：め血漿をブｎ
−ＬＪＫ（５μｇ／口１１）と２０時間プレイ〉′ギュ
ベー１〜（３７℃）すると、Ｃ１ＩＳｒ精製したＩ Ｓ
Ａのザイモグラムはそねに伴なって線縛素溶解活性を
示した。これは工１２０ｋＤおよび＝ ５５ ｋ Ｄの
双方で移動するバンドを示ずＨＳ Ａのザイモグラフィ
ーによって示された（第１８図、コース１）、遊離のプ
ロ−Ｕ Ｋは一緒に精製されないことが判明しているか
ら１、二の＝５５ｋＤバンドは恐らくＳ Ｄ Ｓで試料
調製中にＨＳ Ａ複合体から解離したある種のプロ−ｔ
ｌＫを表わすものであろう、（血漿に本質的に備わるプ
ロ−ＵＫの研究）血漿に本質的に備わるプロ−ｔＪ Ｋ
もＨ５Ａと類似の複合体かもしれないことを検討するた
め、カジノ、を０．５ＭＮａＣ１で十分に洗浄したＣ
Ｂ Ｓり１７７１〜グラフィーにより新鮮血漿からＨＳ
Ａ約６００ ｍ ｇ ｔｌ−精製しｆ：：、この調製
品を以前に報告した荷電ブドウ球菌プロティンＡ抗−ｔ
ＪＫ抗体吸着剤で処理しく第１２図−コース６−９）、
複合体中のプロ−ＵＫを認識させた。抗原−抗体複合体
を解離するため免疫沈降物をＳ Ｄ Ｓ試料縫隣液中で
煮沸した。これらの条件ではプロ−〇 Ｋ ： ＨＳＡ
の解離も起こる。引き続きザイモグラフィーを行なうと
ｌ５ＡＪｉｌ製品中にプロ−ＵＫの存在を示す！５５ｋ
Ｄの溶解バンドが現われた（第１８図、コース３）、遊
離のプロ−１．ＩＫはＣＢ Ｓアフィニティークロマト
グラフィーによって精製されないことが判明しているか
ら、この知見はＣ１３３カラムによって血漿から単離さ
れたプロ−ＵＫがＩ ＳＡとの複合体にあったこと示唆
している。したがって正常な血漿で得られた知見は、プ
ロ−ＬＩＫをｆ４厚にした血漿を５６時間インキュベー
トしたときの観察と一致した。ＵＫは阻害因子複合体を
形成しｒクルイトフ、ブラッド、（）４巻、９０７−９
１３頁（１９８４年）、チー１ラツクら、トロ〉′ボシ
ス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓ、 ｔｌ
ａｅｍ。 ５ｔａｓ、 ）、５３巻、３６〜４４ｓＴ（１９８５年
）、スタンプら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミスストリー、２６１巻、１２８３４〜１２８４１頁
（１９８６年）］、コれはＳＤＳ中１００”ｃで安定で
あり、したがって；９５ｋＤ’″Ｃ：５ｌ）ＳＰ Ａ
に Ｅを移動するから、ＣＢ Ｓアフィニティークロマ
１へグラフィーによりｖ、ＩＩｉされたｔＪ Ｋがプロ
ｔＪ Ｋ・ＨＳ Ａ複合体ではなくＵＫ二阻害因子であ
る■目止性はありそうにないと考える。 複合体とし２て存在する血漿に本質的に備わる１ｏ −
［Ｊ Ｋの割合を検討するため、新鮮血漿（アブ＋７１
一ニン２０ＫＩＵ／ｍｌ含有）２０ｍｌをセフアゾｌク
スＧ−７５カラムでクロマｌ−グラフィーに掛けた。血
漿タンパク質は２つの主要ピークに什かれた（第１９Ａ
図）。ゲル濾過の直前にプロ−ＵＫを濃厚にした血漿試
料で校正したカラムにより、複合体を作成するためプロ
−〇Ｋ（５）１ｇ／ｒｎｌ）とブトインキュベート（３
７℃、２０時間）した血漿試■で′ｉｎ離のプロ−ＩＪ
Ｋおよびプロ−ＵＫ：Ｈ８Ａ複合体の位置を決定した
。採取１〜た分画の線維素溶解活性を線維素平板で検定
した。遊離のプロ−Ｌｊ ＫはプールＤに対応する分画
１１２〜１１９で認められ、プロ−ＬＪＫ：ＩＳＡ複合
体はプール１３に対応する分画９５ ” １００で認め
られた（第１９Ａ図）。 その俺、正常血漿をこのカラムでゲル濾過によって検定
した。１１夢に本質的に備わる線維素溶解活性は免疫沈
降およびザイモグラフィーによって検定した。第１９Ａ
図に示したように分画を４０ツトにプールした。第１９
Ｂ図に示したように線維素溶解活性はプロ−ＬＪＫ複合
体が溶出されたことが判明した高分子量分画（第１９Ａ
図）に対応するプールＢＣ優勢に検出し得た。少量のＵ
Ｋ／ｌ！ｌ性が均一に一層高い分子蟻で認められた（プ
ールＡ）（第１９Ａ図、第１９Ｂ図）、またプロ−■−
】ＫＱ精製したＨ８Ａとインキュベートした幾つかの実
験で、恐らく１分子以上のｌｌ５Ａまたはプｔ７ｔＪ
Ｋとの複合体を表わしている一層高分子閂のプロ−ＵＫ
： Ｈ８Ａ複合体が形成された（第１０図参照）、遊
Ｍのプロ−ＵＫの分子獣に対応するプールした分画りに
はＬＩ Ｋ活性は認められなかった。したがって血漿中
の検出可能な［、Ｊ Ｋ活性はずべて複合体の形で存在
していることが分かった。 複合体はザイモグラムで＝５’５ｋＤバンドで示される
ように（第１（）８図）、試料調製中にＳＤＳ中で解層
するから、観察された複合体はＵＫ：阻害因子複合体ど
は一致しない。したがってこの知見はｉＥ常血漿に本質
的に備わるプロ−Ｕ Ｋの大部分がＨ８Ａと形成する複
合体に対応する複合体の形であることを示唆している。 （循環中の複合体の長い半減期ン 肝臓にあるＬＩＫ受容体によって同定されたプロｔｌＫ
分ｔ−Ｌの部位はこの発明の複合体でマスクされ、その
結果、結合したプロ−Ｕ Ｋは、遊離プロ ＬＩＫの゛
を囲器が５〜８分であるのに反して、長いｆ減量（数時
間ないし数日間）をもって提供されることが仮定される
。プロ〜ｔＪＫの１１！＃素溶解性が低Ｉ・するわけで
はないから、プロ−ＬＩＫ。 アルブミン氏合体は治療的な面栓溶解によく適している
ことが期待される。この発明は必要なプロ−ＵＫの投与
域を実質上減少し、連続注入の必要を解消するこによっ
て投与、を容易にするはずである。 〈用途） この発明のプロ−ＵＫ：アルブミン複合体は他のプラス
ミノーゲン活性化因子、例えばｔ−ＦＩＡ。 ＬＩＫおよびプロ−ｔＪＫと同一の適応症に治療的に使
用できる。目的は血管内の血液凝塊（血栓）を溶解する
ことである。現在の臨床的な適応症は心筋梗塞、深部静
脈血栓庁、肺塞栓などである。この発明の複合体は生物
学的に好適な担体物質１例えば食塩水と混合して、大量
注射によって静脈内に投与される。またこの複合体はプ
ロ−ＩＪ Ｋと相乗的であるｔ−ＰＡと都合よく混合し
得る９、ｔたこの混合物は治療を簡翳にし、家庭でも実
施することが可能な簡曝な大量注射として投与すること
ができる。ｔ−ＰＡは溶解を開始し、急速に浄化される
が、長時Ｅ作用性の１０ｔＪ Ｋは溶解経過を完成させ
得る。 さらにこの発明の複合体は血液に本質的に備わる線維Ｊ
：溶解活性を高める［１的のため投す・でき、それによ
って線維素溶解活性の低下に起因することが知られてい
る心血管疾患の長期予防に使用できる。血栓９はアテロ
ーム性動脈硬化症の病因の１・■でＩ）るとｋい間信じ
らｔｃてきたから、毎週または毎月の間隔をおいたこの
発明の複合体の定期的な注Ｉｔｔ投与、することにより
アテローム性動脈神化症をｆ ＩＩｈ Ｌ得る。 鮪擾に、この発明のｌ−ＩＭＷ−ＬＩＫとアルブミンと
の複合体の酵素的活性形態は、ある種の臨床適用を小し
得る。）ＩＭＷ−ｔＪＫはプロＵＫの酵素的ｔｔｓ ｔ
ＢであるかＸ、、この６のは数種の血漿床置因子と反応
する、その結果、この複合体はこれＩｉ、の阻′＾′因
ｆが消費し尽くされるまでの長い半減期は示さないで、
Ｐ）ろう。複合体はコ又ｌ・を低下し、投４を容鴫にす
る 層長い半減期によってＨＭＷまたはＬＭＷｔｌＫよ
り４ｒ利性をイ１する。 治療コ（画実施例］ ′（施（列１］ 人１を注射による血栓の救２９＆置のため、プロ１１Ｋ
アルブミ〉複合体の凍結乾燥品約５〜２０口’ ｇ
’ｉ−食塩水と混合し、注射筒へ加え、入ψを患名へ
静脈性ｑ（するの番こ使用する。 ［実施例２１ 冠動脈血栓を急速に溶解するため食塩水に溶解したプロ
−ＵＫ・アルブミン複合体の凍結乾燥品の約５〜２０ｍ
ｇをｌ−Ｉ Ｋ ２ ｍ ｇと一緒に静脈内に投与する
。ｔＪＫは溶解の開始を促進するの番、：役立つ。複合
体の長い半減期は血栓柾の再発を予ＩＩｊｊ ｌ。 存在する血栓の溶解を完成するのに役立つ６１実施例３
］ 深部静脈血栓および＃塞栓の処置のため、ｆｓＡＥＡ水
に溶解した凍結乾燥し、たプロＵＫ：アルブミン次合体
の約５〜２０ｍｇを静脈内に投す・する、必要であれば
注射を繰り返すことができる。１１′持−？的なアラス
ミノーゲン活性化はこの投与量では起こらない。 １実施例４］ ｔ−Ｔ’Ａと凍結乾燥したグ［７−１１に＋アルブミン
複合体の相乗的な組合わせの大量注射による血栓９ｊＬ
ｉ′ｎ＋７） タメ、ｔ −Ｐ Ａ 約５−２０ ＋
ｎ ｇラフｎ ［Ｊ Ｋニア゛ルブミン複合体約５〜２
０ Ｉｌｌ ｇと混合し、簡１ｉに大量注射として投与
する。ｔ、−ＰＡは急速に浄化されるが５複合体は循環
内に残留し、血栓の溶解を完成し、妥協的な特別措置な
しに血栓症の再発を予防する。 ［実施例５］ 別法とｊ−て、冠動脈血栓の急速な溶解のためプロ−し
ＩＫ＝アルブミン複合体の凍結乾燥品約５〜２ （ｌ
ｍ ｇを、食塩水に溶解したｔ、−ＰＡ凍結乾燥品の約
３０ｍｇ７時間の点滴と−・緒に注射する。 〔実施（＠６］ アロ ＵＫ：アルブミンの格別に長い半減期はこれを血
栓症予防に有用なものとする。この適用では少投手鰻、
即ち毎週的１〜５ｍｇを使用し得る。 ［実施例７］ 活性なＨＭＷ−ＵＫ：アルブミン複合体はＨＭＷＬＪＫ
またはＬ Ｍ Ｗ−Ｕ Ｋの・層経済的な代替品として
１重用し得る。 ［′Ｘ施例８］ 深部静脈血栓症の処置のために、凍結乾燥したア［７−
ＬＩＫ：Ｈ５Ａ複合体の約５〜２０ ｍ ｇを食塩水に
溶解し、囃独またはｔ−ＰＡと組合わせて投与する。 ［実施例９］ 不安定狭心症または切迫心筋梗塞の処１のなめプｏ−Ｕ
Ｋ ： Ｈ３Ａ複合体の大量（５〜１０ｍｇ）を静脈内
に注射する。この臨床状態が数日間続く傾向があるので
、この適応症のためには長い半減期を有するプラスミノ
ーゲン活性化因子が特に有用である。 ［実施例１０］ 血栓症の再発予防のため経皮経管血管拡張術または他の
プラスミノーゲン活性化因子による急性血栓溶解治療の
後、この発明のプロ−ｔＪＫ：Ｈ５Ａ複合体の比較的少
量投与、即ち１０ｍｇｔ−Ｍえない量で十分である。 ［実施例１１］ ｍ線素溶解活性の低下を伴うことが多い心血管疾患の予
防のため、複合体の定期的注射の投与は線謹素溶解活性
を増加する０例えばＨＳＡとの複合体の形のプロ−ＵＫ
の約１〜５ｍｇの注射を毎月投与し得る。 ［図面の簡単な説明］ 第１（ａ）図は完全な１本鎖プロ−Ｕ Ｋ分子を示した
略図、第１（ｂ）図はプロ−ＵＫ／アルブミン複合体の
作成を示した略図である。 第２図で（・）はタンパク質含量（タンパク質検定）、
（０）は線維素溶解活性（ＩＩ維素平板）、初はプール
した分画である。 第３図：分子量は１８０ｋＤ、１１６ｋＤ、８４ｋＤ（
１）、（２）は緩衝液中のプロ−ＵＫ、（３）はプロ−
ｔＪＫを精製したＨＳＡと４時間インキュベート、（４
）１．ｔｃＢｓ血禁中、（５）はＣＢＳＩａｌａｌｌ＋
ＨＳ Ａ中、（６）は血漿中でプロ−ＵＫを４時間イン
キュベート、試ｎ（３）をα（Ｕ Ｋ ）−ｓカラムを
通し、〈７）、（８）、（９）、（１ｏ）は最初の４分
画である。 第４１二分子量は１８０ｋＤ、１１６ｋＤ、８４ｋＤ、
５□１ｋＤ（１）、Ｇ−７５１１１１２複合体・・−・
−・・・〈２）、・・−・・く３）、（−α（ＩＩＳＡ
）（４）、複合体はα（Ｉ Ｓ Ａ ）−ｓカラムを通
し、（５）、（６）、（７）、く８）はれ初の４分画で
ある。プロ−ＵＫを血漿中で４時間インキュベート（５
）、 〃 ＋α（ＨＳＡ）（１０）、 試料調製：３７℃で３０分間試料Ｈ街液中でインキュベ
ート、ただしく３）はｉｏｏ”ｅで２分間。 第５図ニブロー〇に、榎ｆＩ液中（１）、プロ−（月く
を精製Ｈ３Ａとインキュベートした、ｐ Ｈ５（２＞。 ｐＨ７，５（３）、ｐ Ｈ９（４）、ｐＨ７，５（煮沸
試料）（５）、Ｚ ｎ ” ５０ ｔｔ Ｍ （６）、
Ｃａ＋＋５ｎｎＭ（７）、Ｚ ｎ”およびＣａ”（８）
、プロ−ＬＪ Ｋ ／１（ＳＡ１０倍（９）、７Ｏ−Ｕ
Ｋ、！樹液中ｃｉｏ＞。 第６１二分子量は１８０ｋＤ、１１６ｋＤ、８４ｋＤ（
１）、（２）は＄１１１液中のプロ−〇Ｋ、（３）は血
漿中で０時間インキュベート、（４）は１時間、〈５）
は２時間、（６）は６時間、（７）はＭ樹液中のＵＫ、
く８）は血漿中で０時間インキュベート、（９）は６時
間、（１０）は濃縮尿。 第７図： Ｄ Ｆ Ｐおよびクロラミン−Ｔ−処理した
ｌｌ５Ａ（復合化に影菅せず）およびＤＴＴ５３埋した
ＢＳＡ （プロ−ＵＫとの複合体形成能を回復する）ノ
フローＵＫとの複合体のザイモグラム、ブローＵにの［
樹液中（コース１）、プロ−ＵＫ＋Ｈ８Ａ（コース２）
、プロ−ＵＫ＋−緩衝液処理したＢＳＡ（コース３）、
プロ−Ｕ Ｋ ＋ Ｄ Ｆ Ｐ処理しなＢＳＡ（コース
４）、プロ−ＵＫ＋Ｎ［液処理したｉ（Ｓ Ａ （コー
ス５）、プロ−ＵＫ＋クロラミンーＴ処理したＩＳ Ａ
（コース６）、ｕｉ液液中２１体の存在を示したプロ
−ＵＫ（コース７）、同じプロ−ＵＫの２値体だけを示
したプロ−ＵＫ＋ＢＳＡ（コース８）、および２１体の
事実上の消失とプロ−Ｕ Ｋ ： Ｂ Ｓ Ａ複合体の
存在を示したプロ−〇に＋ＤＴＴ処理したＢＳＡ（チオ
ール形態を回０りである（コース９）。 第８Ａおよび８μ図：複合時間に対するＰＤＩの効果を
示したザイモグラム８組換え体プロ−ＵＫ（０，５μｇ
７ｍ ｌ）をメルカプ１〜アルブミン（４０ｍｇ／ｍ
ｌ）とインキュベーションた。コース１は緩衝液中、コ
ース２〜７はインキュベーション時間０分、１５分、３
０分、１時間、２時間および４時間をそれぞれ表わす、
ＡはＰＣＩを加えず、ＢはＰＤＩ （９２０ｕｇ／ｍｌ
）。 第９図：複合化−用量反応に及ぼすＰＤＩの効果を示し
たザイモグラム。コース１はプロ−ＵＫ単独を緩衝液中
（コースｌ）、コース２〜７はそれぞ１〜ＰＤＩ濃度０
．２３．２３０．４６０．６９０および９２０μｇ／ｒ
ｎ１．Ａはインキュベージ３７１１１間、６時間、Ｂは
インキュベーション時間、１２時間、複合体＜Ａ４〜７
）の前に移動している活性バンドはプロ−ＵＫの２量体
を表わす。 第１０１：エシェリキア・コリ（Ｅ、 ｅｏｌｉ）から
得られた組換え体Ｈ３Ａで作成したプロ−ｔ、Ｊ Ｋ複
合体のザイモグラム。商業的なＢＳＡおよび組換え体Ｈ
３Ａ（４０ｍｇ／ｍりをＨＳ ＡのＤＴＴ処理前（−）
および処理後（→−）にプロ−ＵＫ（５μｇ／ｍｌ）と
それぞれ６時間インキュベート（３７℃）した。 後者の方が複合体（Ｃ）形成を増強し、高分子量の複合
体（Ｃｏ）の形成を誘導した。プロ−Ｕ Ｋ ２−１ｉ
ｔ体（ｄ）および２ｋＤプロ−ＵＫバンド（ａ）も明ら
かである。 第１１図：緩衝液中でインキュベ−１〜＜３７℃）した
プロ−ＵＫ（０，５μｇ／ｍｌ）のザイモグラム、榎ｌ
ｉ液中、０時間（１）および６時間（２）、および血漿
中、０時間（３）、１時間（４）、４時間（５）、６時
間（６）、およびプラスミノーゲン枯渇アブロチ−ン含
有（２０Ｋ Ｉ Ｕ ７ｍ ＋）ｍＭ中、０時間〈７）
、１時間（８）、４時間（９）、６時間（１０）、試料
は３０３９３７℃で調製した。 第１２図ニブｏ−ＵＫ（０，５μｇ／ｍｌ）を３７℃で
［１液中（１）、およびＣＢＳ−）（ＳＡ（４０ｍｇ／
ｍｌ）とインキュベ−１〜（２＞、Ｈ３Ａ枯渇血漿中（
３）、ＨＳ Ａを補充したＨ Ｓ Ａ枯渇血漿中でイン
キュベート＜４）、ＵＫ−Ａｂセフファースカラムを通
す前（５）および後にプロ−ＵＫでブレインキュベート
した血漿（４分画、６〜９で示す）。 第１３１〜３：メルカプトアルブミン（４０ｍｇ／ｍｌ
＞とブレインキュベート（６時間）したさまざまな形の
ＵＫ（０，５μｓ／ｍｌ）［（１）［１１液中、）（Ｍ
Ｗｌ、Ｊ Ｋ、（２）ＨＭＷ−ＵＫ＋１（ＳＡ、（３）
緩衝液中、ＬＭＷ−ＵＫ、（４）ＬＭＷ−ＵＫ＋Ｈ５Ａ
、（５）組換え体プロ−Ｕ Ｋ ＋ ＨＳ Ａ、（６）
＆！街液液中欠失変異体プロ−ＬＩ Ｋ、（７）欠失変
異体プｏ−ＵＫ＋Ｈ８Ａ ］のザイモグラムｃｉｏ％５
ＤＳ−ＰＡＧＥ）である、 第１４図：ＵＫ：Ａｂを用いたウェスタン免疫プロット
、（１）ＩＩＩ液中、７時間インキュベート（３７℃）
したプロ−ＵＫ（０，３μｇ／ｍｌ）、（２）未処理の
ＢＳＡ（４０，ｕｇ／ｍｌ）とインキュベ−１〜したプ
ロ−ＵＫ、（３）ＣＢ Ｓ −ＨＳ Ａとインキュベー
トしたプロ−ＵＫ、（４）、ＣＢ５−Ｈ８ＡＩ＃独。 コース（５）〜（８）は同一混合物をそれぞれ還元条件
下に行なったものである。 第１５図：緩衝液中、プロ−ｔＪＫ（１）、０．５ｍＭ
Ｇ Ｓ Ｓ Ｇ ）（２）、５ ｍＭＧ Ｓ ５Ｇ（３
）、および血漿中（４）、０．５ｍＭ Ｇ５５Ｇ（５）
、５ ｒｎ Ｍ ＧＳ Ｓ Ｇ （６）。 第１６ｌ：Ｍ衝液（４０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中、４時
間インキュベートしたプロ−ＵＫ、０．ＯＭ ＤＴＮ
Ｂ（１）、プロ−’ Ｍ ＤＴＮＢ（２＞、３．プロ−
’Ｍ ＤＴＮＢ（３）、６．プロ−’ Ｍ ＤＴＮＢ
＜４＞、プロ−２Ｍ ＤＴＮＢ（５）。 緩衝液中、ＢＳＡ（４０ｍｇ／ｍｌ ）で４時間インキ
ュベートシたプロ−ＵＫ、０．０Ｍ ＤＴＮＢ（６）プ
ロ−’ Ｍ ＤＴＮＢ（７）、３．プロ−’ Ｍ
ＤＴＮＢ（８）、６．プロ−’ Ｍ ＤＴＮＢ
（９）、 プロ−２ ＭＤＴＮＢ（１０）、 第１７ＥＡ：複合化におけるｐＨ（コース１〜６）およ
びＩＳＡ濃度（コース８〜１０）の効果を示すザイモグ
ラム、プロ−Ｕ Ｋ （５μｓ／ｍｌ）をメルカプトア
ルブミン（４０ｍ ｇ／ｍ ｌ＞と２４時間インキュベ
ー１〜＜３７℃）ｉｌ）プロ−ＩＪＫ羊独、ＩＩ衝液液
中（２）ｐＨ６，３でインキュベーション、（３）ｐ
１〜１７．０、（４）ｐ Ｈ７゜４、（５）ｐＨ８，０
、（６）ｐＨ８，５、く７）分子量マーカー、（８）Ｈ
Ｓ Ａ濃度８０ｒｎｇ／ｍｌ、（９）、２０ｍｇ／ｍｌ
、（１０）１０ ｎｎ ｇ ７ｍ ｌ、コース８〜１０
はｐＨ８，０でインキ□べ−１〜した。 第１８ｔＪ：ＣＢ５−１〜ＩＳＡに随伴するＵＫ活性の
ザイモグラム、〈コース１）プロ−ｔＪＫ（０，５μｇ
／＋ｎｌ）とブレインキュベートしたく２０時間）ｉｌ
ｌ漿からのＣＢＳ−）（ＳＡ、＝５５ｋＤバ〉・ドは試
料調製中（３０分間、３７℃、ＳＤＳ試料績衝液中）に
複合体から解離したある種のプロ−ｔＪ Ｋを表わす、
（コース２）プロ−ＵＫ（０，５μｇ／ｍｌ＞で濃厚に
したくただしプレインキュベートはしない）ＩＩＩＬ５
ｉ１からのＣＢ５−ＨＳＡ、ＣＢＳクロマトグラフィー
によってプロ−ＵＫがＨＳＡと一緒にＮ製されないこと
を示している。（コース３）新鮮血漿から単離されたＣ
Ｂ５−ｌ５Ａから免疫沈降させたＵＫ１合体、試料を煮
沸してＡｂを解離したので、＝５５ｋＤの位置は複合体
の解離の結果である。 第１９Ａ図：ｌ１ｌｌ漿（０−＝−−０）ノゲ／Ｌ４’
過（Ｇ−７５カラム）、カラムはプロ−〇Ｋ（０，５μ
ｇ／ｍｌ＞でプレインキュベー１〜（１８時間）した血
漿で校正し、分画９４〜１００（Ｂ）に認められるシ１
２０ｋＤ複合体に対応するもの、およびプロ−ＩＪ Ｋ
″ＣＣ濃厚た血漿でプレインキュベーｌ〜し、分画１１
２〜１１８（Ｄ）に認められる＝５５ｋＤ活性化因子に
対応するものである９分画は線維素子板で検定した（・
・）。 第１９Ｂ図：校正したＧ−７５カラムに掛けて新軒血漿
のＡ、Ｂ、ＣおよびＤとして同定ｌ−て集めた分画（上
記参照）からのＵＫ免疫沈降のザイモグラム。すべてＵ
Ｋ活性は」−記の＝１２０ｋＤに対応する分画（Ａおよ
びＢ）から沈降させたが、＝５５ｋＤで移動し、Ｓ Ｄ
Ｓ中における複合体の解離を示している。
第１ａ図は、完全な１重鎖ブローＵＫ分子を示した略図
である。 第１ｂ図は、１重鎖ブロー〇Ｋをアルブミンへ共有結合
的に結合する略図である。 第２図は、インキュベーンヨン混合物ブローＵＫ：ＨＳ
Ａの濾過クロマトグラフィー分画の検定グラフである。 第３図は、インキュベートしたプロ−ｔＪＫのザイモグ
ラムである。 第４図は、精製した複合体のザイモグラムである。 第５図は、精製Ｈ８Ａとインキュベートしたプロ−ＵＫ
のザイモグラムである。 第６図は、プロ−ＵＫおよびＩＪＫを緩衝液、血漿中、
または尿中でインキュベートしたザイモグラムである。 第７図は、ＤＦＰおよびクロラミン−Ｔ−処理したＨＳ
Ａ（プロ−ＵＫとの複合体形成能を回復する）およびＤ
ＴＴ処理した１３ＳＡ（プロ−ＩＪＫとの複合体形成能
を回復する）のプロ−ＵＫとの複合体のザイモグラムで
ある。 第８Ａ図および第８Ｂ図は、複合化時間に及ぼすＰＤＩ
の効果を示したザイモグラムである。 第９図は、複合化−用量反応に及ぼすＰＤＩの効果を示
したザイモグラムである。 第１０図は、エシェリキア・コリから得られた組換え体
ＩＳＡで作成したブローＵＫ複合体のザイモグラムであ
る。 第１１図は、プラスミノーゲンの影響を調べたザイモグ
ラムである。 第１２図は、ＨＳ Ａの影響を調べたザイモグラムであ
る。 第１３図は、メルカプトアルブミンとブレインキュベー
トしたさまざまな形のＵＫのザイモグラムである。 第１４図は、還元条件による複合化への影響を調べたＵ
Ｋ：Ａｂを用いたウェスタン免疫プロットである。 第１５図は、ブローＵＫを酸化型グルタチオンとインキ
ュベートシた試料のザイモグラムである。 第１６図は、ブローＵＫをＤＴＮＩ３インキュベートし
た試料のザイモグラムである。 第１７図は、複合化におけるｐｉ−（および濃度の効果
を示すザイモグラムである。 第１８図は、ＣＢ Ｓ−１〜（Ｓ Ａに随伴したＵＫ活
性のザイモグラムである。 第１９Ａ図は、校正したＧ−７５カラムで血漿をゲル濾
過によ−て採取した分画を２組の成績についてブ〔Ｊッ
トしたグラフである。 第１９Ｂ図は、第１１Ａ図でＡ、ＢＳＣおよびＤと同定
しプールした分画からのＵＫ免疫沈降のザイモグラムで
ある。 １゜ ＦＩＧ。 ８ａ ＦＩＧ。 ｂ 今
である。 第１ｂ図は、１重鎖ブロー〇Ｋをアルブミンへ共有結合
的に結合する略図である。 第２図は、インキュベーンヨン混合物ブローＵＫ：ＨＳ
Ａの濾過クロマトグラフィー分画の検定グラフである。 第３図は、インキュベートしたプロ−ｔＪＫのザイモグ
ラムである。 第４図は、精製した複合体のザイモグラムである。 第５図は、精製Ｈ８Ａとインキュベートしたプロ−ＵＫ
のザイモグラムである。 第６図は、プロ−ＵＫおよびＩＪＫを緩衝液、血漿中、
または尿中でインキュベートしたザイモグラムである。 第７図は、ＤＦＰおよびクロラミン−Ｔ−処理したＨＳ
Ａ（プロ−ＵＫとの複合体形成能を回復する）およびＤ
ＴＴ処理した１３ＳＡ（プロ−ＩＪＫとの複合体形成能
を回復する）のプロ−ＵＫとの複合体のザイモグラムで
ある。 第８Ａ図および第８Ｂ図は、複合化時間に及ぼすＰＤＩ
の効果を示したザイモグラムである。 第９図は、複合化−用量反応に及ぼすＰＤＩの効果を示
したザイモグラムである。 第１０図は、エシェリキア・コリから得られた組換え体
ＩＳＡで作成したブローＵＫ複合体のザイモグラムであ
る。 第１１図は、プラスミノーゲンの影響を調べたザイモグ
ラムである。 第１２図は、ＨＳ Ａの影響を調べたザイモグラムであ
る。 第１３図は、メルカプトアルブミンとブレインキュベー
トしたさまざまな形のＵＫのザイモグラムである。 第１４図は、還元条件による複合化への影響を調べたＵ
Ｋ：Ａｂを用いたウェスタン免疫プロットである。 第１５図は、ブローＵＫを酸化型グルタチオンとインキ
ュベートシた試料のザイモグラムである。 第１６図は、ブローＵＫをＤＴＮＩ３インキュベートし
た試料のザイモグラムである。 第１７図は、複合化におけるｐｉ−（および濃度の効果
を示すザイモグラムである。 第１８図は、ＣＢ Ｓ−１〜（Ｓ Ａに随伴したＵＫ活
性のザイモグラムである。 第１９Ａ図は、校正したＧ−７５カラムで血漿をゲル濾
過によ−て採取した分画を２組の成績についてブ〔Ｊッ
トしたグラフである。 第１９Ｂ図は、第１１Ａ図でＡ、ＢＳＣおよびＤと同定
しプールした分画からのＵＫ免疫沈降のザイモグラムで
ある。 １゜ ＦＩＧ。 ８ａ ＦＩＧ。 ｂ 今
Claims (16)
- （１）プロ−ウロキナーゼ（プロ−ＵＫ）のアミノ酸残
基にある硫黄原子とヒト血清アルブミンのアミノ酸残基
にある硫黄原子との間のジスルフィド連鎖によってヒト
血清アルブミンと共有結合的に結合した純粋なプロ−Ｕ
Ｋを含有する精製されたプラスミノーゲン活性化因子複
合体。 - （２）ヒト血清アルブミンのシステイン残基とプロ−Ｕ
Ｋのシステイン残基との間にジスルフィド連鎖がある請
求項１記載の活性化因子複合体。 - （３）請求項２記載のプロ−ＵＫのシステイン残基がＡ
鎖のプロ−ＵＫアミノ末端にある請求項１記載の活性化
因子複合体。 - （４）ジスルフィド連鎖の形成がプロテインジスルフィ
ドイソメラーゼの存在で起こる請求項１記載の活性化因
子複合体。 - （５）複合体が健康なヒト個体の血中に存在しているプ
ロ−ＵＫと血清アルブミン（ＨＳＡ）との複合体と同一
の分子構造を有している請求項１記載の活性化因子複合
体。 - （６）健康なヒト個体の血中に存在しているプロ−ＵＫ
とＨＳＡとの複合体の場合と同様にヒト血清アルブミン
の同じシステイン残基とプロ−ＵＫの同じシステイン残
基との間にジスルフィド連鎖がある請求項２記載の活性
化因子複合体。 - （７）プロ−ＵＫが組換え技術によって作成されたプロ
−ＵＫである請求項１または６記載の活性化因子複合体
。 - （８）プロ−ＵＫおよびヒト血清アルブミンが組換え技
術によって作成された請求項１記載の活性化因子複合体
。 - （９）プロ−ＵＫがプロ−ＵＫペプチド鎖のアミノ酸位
置１１、３１、３３、３９、５１、５３または６３の任
意の１ケ所でアミノ末端にシステイン残基を有するプロ
−ＵＫの線維素溶解活性断片である請求項１記載の活性
化因子複合体。 - （１０）プロ−ＵＫがウロキナーゼのアミノ酸残基の１
〜４５位と同一のアミノ酸鎖を含んでいるウロキナーゼ
の線維素溶解活性チモーゲンである請求項１記載の活性
化因子複合体。 - （１１）請求項１記載の活性化因子複合体を製薬上 許
容し得る担体物質と混合して含有している治療用組成物
。 - （１２）請求項１１記載の治療用組成物の血栓溶解量を
ヒト患者に投与することを含んだヒト患者の血栓溶解治
療を実施する方法。 - （１３）請求項１１記載の治療用組成物の患者の線維素
溶解活性水準を増大させる十分量を患者に投与すること
を含んだヒト患者におけるアテローム性動脈硬化症のよ
うな心血管疾患の治療または予防方法。 - （１４）複合体を形成できる十分な条件および十分な時
間、純粋なヒト血清アルブミンおよび純粋なプロウロキ
ナーゼをインキュベートすることを含んだ請求項１記載
の線維素溶解活性化因子複合体の製造方法。 - （１５）ヒト血清アルブミンのチオール形態を回復する
ためヒト血清アルブミンをジチオトレイトールで前処理
するこをさらに含んでいる請求項１４記載の方法。 - （１６）上記のインキュベーション期間中、プロテイン
ジスルフィドイソメラーゼを添加することをさらに含ん
でいる請求項１４または１５記載の方
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