具体实施方式:
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1:尿激酶原及其变体
尿激酶原可以采用提取的天然尿激酶原或重组人尿激酶原,其氨基酸序列为SEQID NO.1)。
尿激酶原变体是尿激酶原氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有尿激酶原活性的蛋白质或多肽;或者是与天然尿激酶原蛋白质全序列有40%以上同源性的蛋白质;或者是与天然尿激酶原蛋白质B链序列有90%以上的同源性的蛋白质或多肽。
尿激酶原变体的一个特例是尿激酶原氨基酸序列(SEQ ID NO.1)的300位的赖氨酸(Lys)点突变为组氨酸(His)。
尿激酶原及尿激酶原变体的制备方法可采用本领域公知的基因工程方法。
实施例2:通过体内体外实验证明尿激酶原变体的一个特例(尿激酶原氨基酸序列SEQ ID NO.1的300位的赖氨酸点突变为组氨酸,Lys300->His,M5),具有至少与尿激酶原相当或优于尿激酶原的溶栓活性,可用于易化PCI的治疗。
(1)M5的体外试验结果
1.1内在催化活性测验
对于生色底物S2444(L-焦谷氨酸-L-甘氨酸-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐)的水解,1.0mol/L的尿激酶原或10.0mol/L的M5与一系列浓度(0到2.4mmol/L)的S2444在室温下于测试缓冲液(0.05mol/LTris-HCl,0.10mol/LNaCl,and 0.01%Tween 80,pH 7.4)中共孵育,反应速率由410nm处的光吸收增加值测定,并以Lineweaver-Burk图算得反应常数。结果显示,M5的迟滞相是尿激酶原的两倍,但随后速率的增加更快,这分别反映了M5相对较低的内在活性与较高的双链催化活性。
1.2辅因子对于尿激酶原或M5导致的纤溶酶原激活作用的促进
我们通过纤溶酶耐受的尿激酶原及M5变体(Lys158)来研究了纤维蛋白片段E对于尿激酶原或M5导致的纤溶酶原激活的作用。室温下测定反应混合物中(含1.5mmol/LS2251(D-缬氨酸-L-亮氨酸-L-赖氨酸对硝基苯胺二盐酸盐),2.0mol/L Glu-纤维蛋白原,1.0nmol/LAla158-proUK或Ala158-M5,并且含或不含5.0mol/L的片段E2)410nm的光吸收随时间的增加值。纤维蛋白原、可溶性的纤维蛋白单体、D-二聚体等纤维蛋白类似物对纤溶酶原激活作用也在被研究之列,因为它们不能促进尿激酶介导的纤溶酶原激活。实验结果显示,纤维蛋白片段E能选择性地促进尿激酶原的纤溶酶原激活作用,它对于M5也有着相似的作用,而D-二聚体和可溶性纤维蛋白或纤维蛋白原对之几乎没有促进。
1.3PAI-1的抑制作用
双链tc-M5可以被PAI-1抑制,K值约为1.3±0.3×107mol/L·s,与尿激酶的相当(1.7±0.4×107mol/L·s)。
1.4M5与尿激酶原在人血浆中的稳定性(惰性)
0-20μg/mL的M5或0-8μg/mL的尿激酶原在1mL枸橼酸抗凝的混合血浆中37℃孵育6小时后,加入0.2mL抑肽酶(每mL 10000激肽释放酶抑制单位)。以凝血酶可凝蛋白法测得血桨中剩余的纤维蛋白原量,并与基线水平相较。
在混合血浆中,M5保持惰性,在8μg/mL以下的剂量并不导致纤维蛋白原的降解。而在10μg/mL的剂量下,仍有30.6%的纤维蛋白原未降解。与之相反,尿激酶原在2μg/mL的剂量下就可导致纤维蛋白原的降解,而在4μg/mL时,只有32.7%的纤维蛋白原得以保持。
1.5人血浆尿激酶原与M5对于血凝块的体外溶解作用
I125标记的纤维蛋白原凝块由0.2mL血浆制得,并在4mL血浆中孵育。一系列的纤维蛋白特异性浓度的尿激酶原(0.5-1.5μg/mL)或M5(0.5-5.0μg/mL)被用来测试,血凝块溶解以完全溶解值对时间的百分比表示,纤维蛋白原在完全血凝块溶解后测定;若6小时时依然尚未完全溶解,则在6小时时测定.
在血浆环境中,M5在高达5μg/mL的浓度下依然保持着纤维蛋白特异性(25%纤维蛋白原降解),而尿激酶原对之的上限是1.5μg/mL。尿激酶原的血凝块溶解最大速率是每小时41%,而M5为每小时64%。当M5(2μg/mL)与少量tPA(30ng/mL)联用时,迟滞相缩短了一半,这与之前的tPA和尿激酶原联用的结果类似。
(2)M5的体内研究
2.1狗的血凝块溶解
10-15kg的雄性杂种狗以戊巴比妥钠麻醉。血凝块由1mL加入以碘125标记的纤维蛋白原(1.9Ci,0.75mCi/mg protein)与凝血酶(10单位)的狗全血制得。20分钟后,将血凝块以生理盐水冲洗三次后切成1mm小块以16号针头注入股静脉。15分钟后,经由另一侧股静脉外的插管取得血样,测定基线放射性。然后分别静脉给予生理盐水或尿激酶原或tPA,尿激酶原和tPA的输入速率分别为20μg/kg/min和10μg/kg/min,这些速度根据之前的文献报道在狗体内的溶栓有效且具有纤维蛋白特异性。tPA输入持续60分钟,尿激酶原和M5的输注持续90分种。M5的输入速率分别为20、40、60g/kg/min,间隔一定时间,取血样测定放射度与纤维蛋白原。
实验结果显示,M5导致的血凝块溶解是剂量依赖的。由于M5在血浆中的稳定性比尿激酶原高4倍,在以60μg/kg/min的速度输注时,M5引起了快速的血凝块溶解,45分钟内就达到了100%。M5引起血凝块溶解也更为有效,因为达到50%溶解只需要600μg/kg的M5,而此剂量对尿激酶原来说是1200μg/kg。在更低的剂量下(40或20μg/kg/min),M5引起的血凝块溶解相当或更少。这种低剂量下的相对低效反映了M5的更长的迟滞相。M5的最大输注剂量组的实验狗的血浆纤维蛋白原浓度在30、45、60min分别是基线水平的72%,65%和52%。
2.2狗止血测验
在剃去毛的腹部作一1cm标准化切口,剥去表皮。将一暴露的浅表血管以手术刀割开,出血点每三十秒以滤纸轻拍,直到血流停止。此即初始出血时间(BT),在相邻的1cm切口处0、20、60分种时各测定一次。全出血也以吸收伤口渗血所需要的标准纱布片(5×5cm)的数量记录,每张纱布垫吸足血后即行更换。这代表了二次出血,因为它主要来自两个之前测定初始出血时间后已止血的出血点。此实验于每次输注前60分钟进行。
实验结果(如图1)显示,在tPA输注组,初始出血时间从1.2分钟增加到输注20分钟时的2.4分钟,并在60分钟后进一步达到5分钟;尿激酶原组也增加到4分钟。对于M5剂量组,在20分钟时未见BT显著延长,在60分钟时BT增加为1.5分钟。反应了二次出血的、以吸血所需纱布片数表示的总出血量,在tPA组增加了8倍,尿激酶原组增加了5倍,而M5最大剂量组未见增加。
2.3恒河猴血凝块溶解与止血实验
恒河猴对于人尿激酶原/尿激酶有着与人相当的敏感度。5.8公斤至8.6公斤的六只恒河猴(三雌三雄)静脉给戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉,每侧上肢静脉中插入一聚乙烯导管分别用于取血与输注。2mL全血样与放射性碘标记的纤维蛋白原和凝血酶混合后在37度孵育20分钟。全血凝块切成1mm的小块,以生理盐水冲洗六次。血凝块(3.3-10cpm)悬于5mL生理盐水中,经由右上肢静脉注入。30分钟后,经对侧上肢静脉采得血样测定基线放射度。与此同时,开始输注生理盐水(2猴)或M5(4猴)。M5以60μg/kg/min输注60分钟,在输注的一定时间间隔取血样进行放射度与纤维蛋白原的测定。0、30、45、60分钟时在下腹部以5mm长,1mm深的切口测定初始出血时间;出血时间的测定采用以滤纸每隔三十秒轻拍的标准方法进行。初始出血点止血后的再出血也予以评价。
实验结果显示,以60μg/kg/min输注60min的M5在全部的四只实验猴中都引起了100%的血凝块溶解(对照组仅为8%)。输注30、45、60分钟时的纤维蛋白原浓度分别为基线水平的78%、66%和57%。初始出血时间(以基线水平百分比表示)在30分钟时减少为85%,45分钟时回到基线水平,而60分钟时显著增加到108%。BT在生理盐水对照组也显示了类似的结果。另外,与狗中的结果一致,给予M5的实验猴中再出血并没有发生。
实施例3、尿激酶原在易化PCI中的应用:
(1)入选标准
1.1缺血性胸痛持续≥30分钟,含服硝酸甘油无效;
1.2持续性缺血性胸痛发作≤12小时;
1.3心电图至少2个或2个以上肢体导联ST段抬高≥0.1mV,或在相邻2个或2个以上胸导联ST段抬高≥0.2mV;
1.4年龄≤85岁,性别不限。
(2)排除标准
2.1非ST段抬高性急性心肌梗死或不稳定型心绞痛;
2.2妊娠、哺乳期、月经期妇女;
2.3既往任何时间发生过出血性脑卒中,1年内发生过缺血性脑卒中或脑血管事件。
2.4严重进展性疾病(如恶性肿瘤)或预后不良使患者极度衰竭的疾病;
2.5四周内有活动性的内脏出血(如胃肠道、泌尿生殖系统出血,但月经除外),或有未治愈的消化道溃疡;
2.6颅内肿瘤、可疑主动脉夹层、动静脉畸形、动脉瘤;
2.7高血压患者经积极降压治疗后,血压仍≥170/110mmHg,(收缩压、舒张压其中一项达到此血压标准);
2.8目前正在使用治疗剂量的抗凝药,如华法林等;
2.9已知的出血倾向(止血或凝血功能障碍);
2.10新近(6个月内)颅脑或脊柱手术史;
2.11二个月内创伤史,包括创伤性心肺复苏或较长时间(>10min)的心肺复苏,或接受过外科大手术;6个月内头部外伤史;
2.12二周以内接受过在不能压迫部位的大血管穿刺;
2.13高度怀疑左心腔内血栓(如二尖瓣狭窄并房颤);
2.14糖尿病或其它疾病引起的眼底出血病史;
2.15严重肝、肾功能障碍史(ALT>正常上限3倍;肌酐>225μmol/L);
2.16休克;
2.17感染性心内膜炎、急性心肌炎、急性心包炎、脓毒性血栓性静脉炎、严重感染部位存在的动-静脉瘘;
2.18与以前部位相同的再梗死;
2.19正在参加其它同类药物临床试验。
2.20医师认为有不适合静脉溶栓的其它疾病、情况。
(3)临床应用方法(用法、用量、给药时间):
尿激酶原的易化PCI:首先采用重组人尿激酶原进行溶栓治疗,可以是静脉推注,剂量是每位病人50万单位~300万单位;可以是30~120分钟静脉点滴5万单位~20万单位/min/病人;可以是静脉推注与静脉点滴联合使用(每位病人首先静脉推注尿激酶原总剂量的20%,其余部分90分钟静脉点滴5万单位~20万单位/min),使用的尿激酶原的总剂量不超过600万单位。尿激酶原进行溶栓治疗,给药时间为5分钟~90分钟。接着进行经皮冠状动脉介入(PCI)手术治疗的时间是使用尿激酶原进行溶栓治疗后的半小时至24小时。在特殊情况下,经皮冠状动脉介入(PCI)手术治疗的时间可以是使用尿激酶原进行溶栓治疗后的1天至7天。
(4)心血管造影:
部分病人接受心血管造影检查,观察在静脉注射溶栓药物开始后90分钟时和实施PCI手术后冠状动脉造影所显示的梗死相关动脉的再通状况。
4.1冠状动脉造影:
先行梗死相关冠状动脉造影(根据心电图梗死部位推测),首次造影应采用大视野(小像),以便观察全部血管,曝光时间应一直持续到造影剂排空为止。左冠状动脉应至少投照3个体位,右冠状动脉应至少投照2个体位,且应用大像。在作梗死相关动脉造影前,不要经冠状动脉给硝酸甘油。造影结果依据TIMI血流灌注分级标准进行判定,达到2、3级者为血管再通。
TIMI血流灌注判定标准:
TIMI0级:闭塞冠状动脉无前向血流灌注;
TIMI1级:冠脉狭窄病变远端血管有前向血流灌注,但不能充盈远端血管床;
TIMI2级:冠脉狭窄病变远端血管有前向血流灌注,但远端血管床需经过3个以上心动周期才能缓慢基本充盈,且造影剂清除缓慢;
TIMI3级:冠脉狭窄病变远端血管有前向血流灌注,远端血管床造影剂充盈完全、迅速(小于3个心动周期),同时造影剂清除迅速。
4.2血管造影术后处理
冠状动脉造影完成后,若不需要PTCA和支架置入术等进一步治疗者,在APTT<80秒时方可拔除动脉鞘管,局部压迫止血至少半小时以上。按溶栓结束后48小时停止肝素静滴,以后低分子肝素皮下注射每12小时一次,共5天。
(5)临床和实验室观察指标:
5.1临床症状和体征:
5.1.1胸痛:有无减轻及减轻的程度;
按四级评定:无改变、轻度缓解(50%)、明显缓解(75%)、完全缓解;
5.1.2出血表现:皮肤、粘膜、咳痰、呕吐物及大小便中有无出血征象;
按以下标准分为轻、中、重度三级
轻度:轻度出血无需输血,不导致血流动力学改变。包括皮下出血、小血肿、针刺部位渗血等。
中度:中度出血需要输血,但不会引起需要治疗的血流动力学异常改变。包括大血肿、操作引起的出血(如心导管检查)、或通过临床检查或超声检查证实的腹膜后出血,未引起血液动力学的异常改变,但需要输血。
重度:重度出血导致血流动力学改变并需要治疗及输血。包括急性胃肠道出血或腹膜后出血。颅内出血均属重度出血。
5.1.3血压、心率、心律、心音及心脏杂音的变化;
5.1.4其它并发症
5.2心电图记录:溶栓前应记录18导联心电图,溶栓开始后2小时内每半小时复查一次12导联心电图(正后壁、右室梗死仍记录18导联心电图)。3小时时复查全套标准心电图。此后7天内每天复查1次心电图,出院前复查1次心电图。导联电极位置应严格固定。
5.3血常规、尿常规、便潜血:入选前、溶栓开始后2、6、12、24、48(是否可以减少检查次数,在2期试验中都达不到此要求)小时、7天(住院少于7天者出院前测定),可视大小便情况调整便潜血检查时间点。
5.4心肌酶:入选前和发病后8、10、12、14、16、18、小时各查CK和CK-MB一次,以后根据情况而在必要时进行检查。
5.5肝功能、肾功能、血糖、电解质:在入选前、溶栓开始后第7天测定。
(6)疗效评定标准
以梗死相关冠状动脉的开通率作为有效性的评定标准。梗死相关动脉开通的诊断标准为:
6.1.冠状动脉造影:
溶栓开始后90分钟冠状动脉造影显示梗死相关血管的血流达到TIMI 2级或者3级,即判断为已再开通。
6.2.临床再通指标:
6.2.1抬高的ST段在输注溶栓剂开始后的2小时内迅速回降≥50%;
6.2.2胸痛自输入溶栓剂开始后的2小时内明显减轻,减轻程度≥75%;
6.2.3输入溶栓剂后2小时内,出现加速的室性自主心律、房室或束支阻滞突然改善或消失、或者下壁梗死患者出现一过性窦性心动过慢、窦房阻滞伴有或不伴有低血压。
6.2.4血清CK-MB酶峰提前到发病14小时以内或CK酶峰在16小时以内。
具备以上4项指标中2项或以上者考虑再通,但第2项与第3项组合不能判定为再通。
6.3.梗死相关动脉急性再闭塞的诊断标准:
6.3.1溶栓成功后48小时内再度发生胸痛,原梗死部位对应的心电图导联ST段再次抬高,胸痛持续时间≥30分钟且含服硝酸甘油不能缓解。
6.3.2血清CK-MB水平再度升高。
具备以上2项时,可临床诊断为梗死相关动脉急性再闭塞。
6.3.3急症冠状动脉造影证实为梗死相关动脉急性再闭塞。
(7)随访:
对每例受试病人随访30天内病死率和不良事件发生率。
(8)观察数据结果:
在重组人尿激酶原II期临床试验(国家食品药品监督管理局药物临床研究批件的批件号:2003L03626)研究中,发现造影组38例患者中,28例在溶栓结束后立即施行了PCI,其中1例接受了PTCA,其余27例在PTCA后置入了支架(即进行了PCI)。30天与半年的死亡率均为零,再闭塞、脑卒中、中度出血与重度出血的发生率也均为零,亦未见“无再流”发生。
参考文献
1、Antman EM,Anbe DT,Amstrong TW,et al.ACC/AHA guidelines for the management ofpatients with ST-elevation myocardial infarction-executive summary:a report of theAmerican College of Cardiology/American Heart Association Task Force on PracticeGuidelines(Writing Committee to Rivise the 1999 Guidelines for the Management ofPatients With Acute MyocardialInfarction).Circulation 2004;110:588-636.
2、Global Use of Strategies to Open Occluded Coronary Arteries in Acute CoronarySyndromes(GUSTO IIb)Agioplasty Substudy Investigators.A clinical trial comparingprimary coronary angioplasty with tissue plasminogen activator for acute myocardialinfarction.N Engl J Med 1997;336:1621-8
3、Keeley EC,Boura JA,Grines CL.Primary angioplasty versus intravenous thrombolytictherapy for acute myocardial infarction:a quantitative review of 23 randomised trials.Lancet 2003;361:13-20
4、Nallamothu BK,Bates ER,Herrin J,et al.Times to treatment in transfer patientsundergoing primary percutaneous coronary inervention in the United States:NationalRegistry of MyocardialInfarction(NRMI)-3/4 analysis.Circulation 2005;111:761-7
5、Steg PG,Bonnefoy E,Chabaud S,et al.Impact of time to treatment on mortality afterprehospital fibrinolysis or primary angioplasty:data from the CAPTIM randomizedclinical trial.Circulation 2003;108:2851-6
6、Widimsky P,Budesinsky T,Vorac D,et al.Long distance transport for primary angioplastyvs immediate thrombolysis in acute myocardial infarction.Final results of therandomezed national multicentre trial-PRAGUE-2.Eur Heart J 2003;24:94-104
7、Nallamothu BK,Bates ER.Percutaneous coronary intervention versus fibrinolytictherapy in acute myocardiial infarction:is timing(almost)everything?Am J Cardiol2003;92:824-6
8、Primary versus tenecteplase-facilitated percutaneous coronary intervention in patientswith st-segment elevation acute myocardial infarction(ASSENT-4 PCI):randomisedtrial.Lancet 2006;367:569-78
9、Keeley EC,Boura JA,Grines CL.Comparison of primary and faciliated percutaneouscoronary interventions for S-T elevation myocardial infarction:quantitative review ofrandomised trials.Lancet 2006;367:579-88
10、Weaver WD,Hartmann JR,Anderson JL,Reddy PS,Sobolski JC,Sasahara AA.Newrecombinant glycosylated prourokinase for treatment of patients with acute myocardialinfarction.J Am Coll Cardiol.1994;24:1242-8.
11、Zarich SW,Kowalchuk GJ,Weaver WD,Loscalzo J,Sassower M,Manzo K,ByrnesC,Muller JE,Gurewich V.Sequential combination thrombolytic therapy for acutemyocardial infarction:results of the Pro-Urokinase and t-PA Enhancement ofThrombolysis(PATENT)Trial.J Am Coll Cardiol.1995;26(2):374-9.