CN1651077A

CN1651077A - 基因重组尿激酶原的新用途

Info

Publication number: CN1651077A
Application number: CNA2004100186539A
Authority: CN
Inventors: 姜燕
Original assignee: Tianjin Tasly Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI TASLY PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2004-02-04
Filing date: 2004-02-04
Publication date: 2005-08-10
Also published as: WO2005074979A1

Abstract

本发明涉及基因重组尿激酶原的用途，特别是涉及基因重组尿激酶原在制药领域中的应用。血栓性疾病，包括急性心肌梗塞(AMI)、脑梗塞、肺栓塞，下肢深静脉血栓形成、视网膜动、静脉栓塞形成等，是一类严重危及世界各国人民生命及健康的疾病。尿激酶是一个由411个氨基酸残基组成的溶栓剂。发明人发现尿激酶原能用于治疗肺栓塞和治疗视网膜动脉栓塞。

Description

基因重组尿激酶原的新用途

技术领域

本发明涉及基因重组尿激酶原的用途，特别是涉及基因重组尿激酶原在制药领域中的应用。

背景技术

血栓性疾病，包括急性心肌梗塞(AMI)、脑梗塞、肺栓塞，下肢深静脉血栓形成、视网膜动、静脉栓塞形成等，是一类严重危及世界各国人民生命及健康的疾病。在美国，35～50岁男性死亡者中，35％是由AMI所致。全球十大致死性疾病当中，冠心病(心绞痛、心肌梗塞及心源性猝死)排第一位，每年死于该病720万人，第三位是脑血管疾病，每年死亡人数达460万。心、脑血管疾病目前仍呈上升趋势。全世界每年约有1300万人患有各类血栓性疾病，需要使用溶栓药物治疗。近10年心血管病发病率一直上升，特别是冠心病在我国已成为内科常见病、多发病，并有由城市向农村发展，患者趋于年轻化的势头。

本病特征为血栓形成，阻塞局部血流或脱落成栓子堵塞下游血流(血栓栓塞)。血栓是血流在心血管系统血管内面剥落处或修补处的表面所形成的小块，在可变的流体依赖型中，血栓由不溶性纤维蛋白，沉积的血小板，积聚的白细胞和陷入的红细胞组成。血栓形成是一种涉及许多彼此相互作用的遗传和环境因素的多因素变化的过程，在临床上常见到血栓形成素质的患者。

血栓性疾病的主要治疗方法包括：人工机械方法如球囊导管术和外科栓子切除术和抗栓药物治疗(溶栓治疗和抗凝治疗)以及支持疗法。

尿激酶原(Prourokinase，Pro-uk)是一种糖蛋白，天然尿激酶原Asn³⁰²为糖基位点。糖基化位点Asn³⁰²上的寡糖链可影响Pro-uk在血液中的半衰期和活性。天然的或由哺乳动物细胞表达的糖基化的Pro-uk，和大肠杆菌表达的非糖基化的Pro-uk相比，二者对纤维蛋白的溶解都是血栓特异的，但由于糖基化的Pro-uk被纤溶酶活化的能力比非糖基化Pro-uk弱，因此其催化活性比非糖基化Pro-uk弱(文献1：Pannell R，et al.The relative and variable stabilities ofglycosylated and non-glycosylated pro-urokinase in plasma.Thromb Haemost，1997；Suppl：504)，但在血浆中稳定性好(文献2：Lenich C，et al.The influence of glycosylation on the catalytic andfibrinolytic properties of pro-UK.Thromb Haemost，1992；68：539)。

尿激酶原分子量54kDa，由411个氨基酸残基组成，氨基酸序列见Entrez Protein DatabaseBAA01919。Pro-uk含12对二硫键，具有三个蛋白结构域(文献3：Homes WE，et al.Cloningand expression of the gene for pro-urokinase in Escherichia coli.Biotechnology，1985；3：923)：(1)表皮生长因子类(EGF-like)结构域，由第5-49位氨基酸残基组成，与表皮生长因子高度同源，富含半胱氨酸，在氨基酸残基11和19、13和31、33和42间各有一对二硫键，该结构域功能不清。(2)kringle结构域。由第50-136位氨基酸组成，呈指形环状，有三对二硫键，其位置分别在第50-130、71和113、102和126残基间。推测该区可能参与蛋白与蛋白之间的相互作用，具体功能尚不清楚。(3)丝氨酸蛋白酶结构域：位于Pro-uk羧基端，其中His²⁰⁴，Asp²⁵⁵，与Ser³⁵⁶构成该酶活性中心(Flohe L，et al.single-chain urokinase-type plasminogen activator：New hopes for clot-specific lysis.Eur Heart，1985；11：851)，Asn³⁰²为糖基化位点，该区内共有5对二硫键。

Pro-uk属丝氨酸蛋白酶家族，是一溶栓剂，它通过将没有活性的纤溶酶原裂解，转变成有活性的纤溶酶(plasmin)，从而达到溶解血栓的效果。Pro-uk的溶栓作用是血栓特异性的，其机制主要有两种解释：一种解释是血浆中存在着一种Pro-uk的竞争性抑制因子，但纤维蛋白不存在时，Pro-uk与抑制因子结合而不能表现活性，当纤维蛋白与u-PA结合时，抑制因子被除去，Pro-uk活性恢复，进而激活与纤维蛋白结合的纤溶酶原，产生特异性溶栓作用；第二种解释是血浆中存在的plg主要是以氨基末端为Glu的Glu-plg形式存在，Glu-plg与纤维蛋白羧基端的某些氨基酸如Lys结合后，构型发生变化，u-PA能特异性地激活这种构型变化的plg，产生特异性溶栓作用。

1973年Bernik(文献4：Bernik MB.Increased plasminogen activaor(urokinase)in tissueculture after fiber deposition.J Clin Invest，1973；52：823)首先在组织培养液中发现尿激酶原，1979年Husain等(文献5：Husain SS，et al.Isolation of plaminogen activators useful as therapeuticand diagnostic agents(single-chain，hih-fibrin affinity urokinase).US Patent No.4381346(filed1979；issued 1983)，文献6：Husain SS，et al.Purifieation of a new，high molecular form ofurokinase from urine.Thromb Haemost，1981；46：11)^(2，3)从尿中纯化出尿激酶原。1981年Wun等(文献7：Wun TC，et al.Aproenzyme form of urokinase.J Biol Chem，1982；257：7262)证明它是尿激酶的前体，所以称它为尿激酶原(prourokinase)，1985年国际血栓形成和止血委员会(文献8：Report of the Subcommittee of Fibrinolysis，San Diego，CA，USA，July 13，1985.Thromb Haemost，1985；54：893)将其命名为单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(single-chainurokinase-type plasminogen activator(scu-PA))。继Husain之以后，人们又先后从人胎肾细胞(文献9：Nolan C，et al.Plasminogen activator from himan embryonic kidney cell culture：Evidence of a proactivator.Biochim Biophys Acta，1977；496：384)、恶性胶质瘤细胞(文献10：Nielsen LS，et al.Purification of zymogen to plasminogen activator from human glioblastoma cellsby affinity chromatographywith monoclonal antibody.Biochemistry，1982；21：6410)、肾腺癌细胞培养液(文献11：Stump DC，et al.Purification and characterization of single chain urokinase-typeplasinogen activator from human cell cultures.J Biol Chem，1986；261：1274)和人血浆中(文献12：Wun TC，et al.Isolation and characterization of urokinase from human plasma.J Biol Chem，1982；257：3276)纯化获得了Pro-uk。但由于天然材料中Pro-uk含量甚微，难以大量制备，于是人们开始采用基因工程来大量生产重组ProUK。1985年Homes等首先在大肠杆菌中获得了表达(文献13：Homes WE，et al.Cloning and expression of the gene for pro-urokinase inEscherichia coli.Biotechnology，1985；3：923)^〔13〕和纯化(文献14：Winkler ME，et al.Purificationand characterization of recombinant single-chain urokinase produced in Escherichea coli.Biochemistry，1986；25：4041)^〔14〕。1986年开始由德国的Grunenthal公司生产，称为saruplase。大肠杆菌表达的Pro-uk，由于产品呈不溶性的包含体，需要繁琐的变性和复性，从而导致产品的不均一性和产量较低，于是人们开始了用动物细胞来表达糖基化Pro-uk的研究，包括小鼠IC9细胞(文献15：Nolli ML，et al.Production and charaterisation of human recombinant singlechain urokinase-type plasminogen activator from mouse cells.Fibnrinolysis，1989：3：101)，CHO细胞(文献16：Nelles L，et al.Characterization of recombinant human single chain urokinase-typeplasminogen activator mutants produced by site-specific mutagenesis of Lysine.J Biol Chem，1987；262：5682；文献17：李风知等.人尿激酶原全长cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达.生物工程学报，1991；7：114)，Namalwa细胞(文献18：Satoh M，et al.Stable production ofrecombinant pro-urokinase by human lymphoblastoid Namalwa KJM-1 cells：Host-cell dependencyof the espressed-protein stability.Cytotechnology，1993；13：79；文献19：Satoh M，et al.Efficientexpression of pro-urokinase by human lymphoblastoid Namalwa KJM-1 cells using Moloneyretroviral promoter.Cytotechnology，1996；18：167)，昆虫细胞(文献20：徐杨等.人尿激酶原cDNA在昆虫杆状病毒真核表达系统中的高效表达.生物化学杂志，1993；6：709)，骨髓瘤细胞(文献21：Weaver WD，et al.New recombinant glycosylated prourokinase for treatment ofpatients with acute myocardial infarction.J Am Coll Cardiol，1994；24：1242)等，都已获得了很高的表达。

继Van de WarfF等首次报道了proUK用于心梗病人的治疗(文献22Van de Warf F，et al.Coronary thrombolysis with human single-chain，urokinase-type plasminogen activaor(pro-urokinase)in patients with acute myocardial infarction.Ann Inter Med，1986；104：345)之后，人们采用天然的、基因重组非糖基化的和基因重组糖基化的pro-uk治疗心梗病人达数千人(文献23：俞炜源等，尿剂酶原的性质、结构、功能及其药代动力学和临床应用效果)。

del Zoppo GJ.等对20名脑血栓病人向脑血管直接输入6mg proUK(prolyse)，并静脉输入肝素(分高低两组)，结果高肝素组血管再通率高达81.8％，低肝素组40.0％(文献24：del ZoppoGJ.，et al.The prolyse in acute cerebral thromboembolism trial(PROACT)：Results of 6mg dosetier.Stroke，1996，27：164)。Furlan A等公开了pro-uk(prolyse)对于发病6小时之内的脑梗塞的溶栓作用，121位使用pro-uk的患者，血管再通率为66％(文献25：Furlan A et al，Intra-arterialprourokinase for acute ischemic stroke.The PROACT II study：a randomized controlled trial.Prolyse in Acute Cerebral Thromboembolism.JAMA.1999 Dec l；282(21)：2003-11.)。

Moia，-M等对Pro-uk在治疗下肢深静脉血栓(deep vein thrombosis，DVT)方面进行了初步研究，研究证实了Pro-uk对于DVT的安全、有效性(文献26：Moia，-M et al，A pilot studyof pro-urokinase in the treatment of deep vein thrombosis.Thromb Haemost，1994，72：430)。研究采用开放的、非对照研究，24h内给15位患者分别输注pro-UK 120mg(800.000IU(5mg)/h)和普通肝素，其中11条下肢的血液循环都有不同程度的改善。

肺栓塞(pulmonary thromboembolism，PTE)又称肺血栓性栓塞，是指静脉系统或右心内形成的血栓脱落堵塞于肺动脉而言，肺动脉内血栓形成叶可构成肺血栓性栓塞。肺栓塞发病率高，是肺部疾病中最常见的死亡原因。在美国每年死于PTE者超过50000。根据国外尸解报告的资料，PTE的发生率高达10％～25％。目前，肺栓塞的治疗除一般的支持疗法和对症治疗外，还可采取溶栓治疗，溶栓治疗可加速溶解血管腔内的纤维蛋白，消除或缩小血栓，尽快恢复阻塞的血流，纠正血液动力学紊乱，降低病死率。目前临床上常用的溶栓药物有：尿激酶、链激酶和组织型纤溶酶原激活剂。关于尿激酶原用于肺栓塞尚无报道。

视网膜中央动脉及其分支属于末梢动脉，除了视网膜睫状动脉以外，它是供应视网膜内层营养的唯一血管，血液供给障碍都可导致视网膜缺血缺氧，严重损害视功能，因此，视网膜中央动脉供血不足是一种严重的致盲性疾病，发病率随着年龄的增长而升高，常伴发于其它全身性血管疾病。该病常见的原因为视网膜中央动脉血栓形成，阻塞部位以筛板处或筛板以上的视网膜中央动脉为主。急性视网膜动脉梗塞(CRAO)传统的治疗方法常采用前房穿刺术、视觉按摩术、碳酸酐酶抑制剂等，但几乎不能改变其疾病的自发进程。目前国内外有采用溶栓剂治疗CRAO的文献报道，但尚无Pro-uk用于治疗CRAO的报道。

发明内容

发明人发现尿激酶原能用于治疗肺栓塞和治疗视网膜动脉栓塞。

尿激酶原存在于尿液、血浆、组织和细胞培养液中，可以利用本领域公知的技术从合适组织中。一般完成这一分离过程首先是制备无细胞成分的粗组织提取物和数种外源蛋白，然后利用如柱层析和/或本领域熟知的其它常规技术进一步纯化尿激酶原。

也可以利用本领域技术人员熟知的方法利用基因重组技术在原核细胞如大肠杆菌、真核细胞如酵母细胞、哺乳动物细胞(小鼠IC9细胞、CHO细胞、Namalwa细胞、昆虫细胞、骨髓瘤细胞)中表达尿激酶原，还可以由转基因动物如转基因小鼠获得表达。然后从中纯化出尿激酶原，一般完成这一分离过程首先是制备无细胞成分的粗组织提取物和数种外源蛋白，然后利用如柱层析和/或本领域熟知的其它常规技术进一步纯化尿激酶原。

可将尿激酶原用于被诊断为肺栓塞和治疗视网膜动脉栓塞的个体。尿激酶原可以单独或与药用可接受载体或赋形剂混合施用。

一般情况下，可将尿激酶原制备成为或者是液体溶液或者是悬浮液状的可注射形式。如上所述，活性成分通常与含有药用可接受并与活性成分相容的赋形剂的载体相混合。适宜的载体例如有：水、盐、多糖等及其组合。此外，如果需要的话，载体可含有小量的辅剂物质如保护剂和/或pH缓冲剂。

本领域的技术人员已知或者将容易了解到制备这类剂型的实际方法。将被施用的组合物或配方在任何情况下都会有数量足以溶解血栓的尿激酶原。

可注射的组合物最好是通过静脉途径结药，其优选的剂型是冻干粉针，冻干粉针配方应在载体中含有有效量的活性成分，而本领域的技术人员很容易确定所说的确切含量。活性成分的典型范围可以是组合物重量的约1％-95％(W/W)，其优选的范围是1.5％-4％(W/W)，更优选的范围是2％-3％(W/W)。用量有赖于诸如接受治疗者的年龄、体重和健康状况的这些因素。本领域的普通技术人员通常常规试验建立剂量反应曲线很容易确定其它的有效剂量。

为了更好地理解本发明的实质下面将用基因重组尿激酶原的药理试验及结果来说明其用途：

一、重组人尿激酶原对金黄地鼠肺栓塞的溶解作用

实验材料

受试物：

注射用重组人尿激酶原(pro-uk)天津天士力制药股份有限公司、军事医学科学院生物工程研究所提供，白色冻干粉，20×10⁴IU/瓶。临用前以注射用水溶解，并用生理盐水稀释至所需浓度供动物静脉给药用。

人纤维蛋白原(fibrinogen，FG)标准品，Sigma公司产品，含量68％。

1，3，4，6-四氯-3α-6α二苯基甘脲(Iodogen)，Sigma公司产品。

Na¹²⁵I，Amersham International PIC产品，无还原剂，放化纯度99.4％，比活性577.2Tbq/μg。

交联葡聚糖凝胶SephadexG-150，Pharmacia公司产品。

牛凝血酶，中国医学科学院血液研究所科技公司生产。白色冻干粉，每瓶400IU，用生理盐水溶解并稀释至所需浓度。

肝素钠，中国惠兴生化试剂有限公司(上海)产品。1g/瓶，效价150U/mg。

戊巴比妥钠，SERVA公司产品，上海行知化工厂分装]，批号921019。

其它试剂均为市售。

实验动物

金黄地鼠140只，体重126.0±16.68，雌雄各半，卫生部北京生物制品研究所提供。

仪器

LKB-1282γ晶体闪烁计数仪，LKB公司产品。

JC-1000PC医用多探头γ计数器，西安凯普机电有限责任公司制造。

SJ-8900γ污染探测仪，三佳仪器公司产品。

BSJ-160部分收集仪，上海沪西仪器厂生产。

WZ-50C2微量输注泵，浙江大学医学仪器有限公司产品。

实验方法

¹²⁵I-标记人纤维蛋白原(¹²⁵I-hFG)的制备

采用Iodogen法，即20μg Iodogen用氯仿溶解后，平铺于1.5ml锥形具塞塑料管内，氮气吹干后，加入100μl 0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)、5mg人纤维蛋白原和0.5mCi Na¹²⁵I，室温振荡反应30分钟后，再加入50μl4％碘化钠(含5mg人纤维蛋白原)载体溶液终止反应。将反应化合物加至经预处理后的SephadexG-150凝胶柱去除游离放射性碘，柱体积1.2×12cm，洗脱液为0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)，流速为0.1ml/min。分别收集洗脱液，每200μl收集1管，以紫外监测仪描计蛋白质洗脱情况，留取层析行为与非标记纤维蛋白原相同的放射性峰洗脱液，合并混合后，分装，置-20℃保存备用。

对金黄地鼠肺栓塞模型的溶栓实验

¹²⁵I-标记人纤维蛋白标记的人血栓的制备

6名健康志愿者各取静脉血5ml，分别用3.8％枸橼酸钠抗凝(全血与抗凝剂之比为9∶1)，3000rpm离心10min制成贫血小板血浆(血小板计数＜5×10⁶/ml＝，混合6例志愿者的贫血小板血浆。取上述混合血浆0.6ml，冰浴(4℃)5min后，加入20μl¹²⁵I-hFG(约2μCi)，充分混匀，然后加入0.5mol/L氯化钙与凝血酶(20IU/ml)混合物50 μl，迅速混匀，吸入至内径为5mm聚乙烯管内，37℃温育30min形成血浆凝块，将血栓凝块慢慢推出至平皿中，均匀剪成6段，每段长约1.5cm，用30mlNS连续洗涤30min，每次5min，以除去游离¹²⁵I-标记物。

模型制备

金黄地鼠经腹腔注射3％巴比妥钠(60mg/kg)麻醉后，暴露右侧颈外静脉，近心端插入充满肝素生理盐水的聚乙烯导管，前端至头臂静脉，用于注入¹²⁵I-纤维蛋白标记的血浆凝块及给药用。将制备的¹²⁵I-纤维蛋白标记的血浆凝块用1.5ml生理盐水注入体内，并用γ探测仪探测动物胸前壁，确认已造成肺动脉¹²⁵I-血浆凝块栓塞。动物预先腹腔注射碘化钾(5mg)使甲状腺摄碘能力饱和。

分组与给药

动物分成4组，每组10只。于栓子注入体内形成肺栓塞后10min开始给药，采用先静脉推注总剂量的10％(体积0.1ml，推注时间1min)，剩余90％静脉恒速输注(体积0.9ml，输注时间1h)。对照组给予生理盐水，受试药3个剂量组给予注射用重组任尿激酶原(pro-uk)，剂量分别为1、3、10×10⁴IU/kg。上述各组每只动物给药总体积均为1ml。120min处死动物。

血栓溶解测定

实验结束后，取心、肺测量残存血凝块放射性，按下式计算溶栓百分数：

并同时取甲状腺、肝、肾、尿液、血液、肌肉等组织测定其放射性，计算回收率。以溶解率超过50％作为溶栓治疗有效至标准来判断各剂量组有效率。

实验结果

各实验组的放射性平均回收率为101.6±10.8％，甲状腺放射性为注入血栓总放射性0.22±0.31％，表明实验方法是可靠的。

对照组动物残存在肺内的放射性主要分布在肺门处，其血栓溶解百分数为15.4±3.5％，表明血栓有一定的自溶。与对照组相比，pro-uk低、中、高3个剂量组残存在肺内的放射性均明显减少，并且主要分布在肺叶边缘，其血栓溶解百分数分别为19.7±6.9％(P＞0.05)、42.9±15.2％(P＜0.001)、65.5±11.5％(P)0.001)，溶栓有效率分别为0％、30％、80％。

二、重组人尿激酶原对大鼠视网膜中央动脉血栓的溶解作用

实验材料

药品与试剂

受试物：注射用重组人尿激酶原(pro-uk)天津天士力制药股份有限公司、军事医学科学院生物工程研究所提供，白色冻干粉，20×10⁴IU/瓶。临用前以注射用水溶解，并用生理盐水稀释至所需浓度供动物静脉给药用。

四氯四碘荧光素二钠(Tetrachlorotetraiodo-fluorescein sodium salt，虎红)，上海试剂三厂产品。以生理盐水配制成4％溶液并经滤过膜(φ0.22μm，法国Millipore SA.)过滤，4℃保存备用。

其它试剂均为市售。

实验动物

Wistar大鼠，体重298.3±12.3(280～330)g，腹腔注射20％乌拉坦1g/kg麻醉后，右侧卧为固定于手术台上，左眼上下睑缝线，使眼睑张开。于球结膜靠近角膜缘的上、下、外三处，以6/0无损伤缝合丝线固定牵引，使眼球微凸出眶外。从眼球下侧入路、剪开球结膜、分离、结扎并切断下直肌，暴露出眼球缩肌，将眼球缩肌沿纤维方向钝性分开，即可暴露出视神经腹外侧面，仔细分离出视网膜中央动脉。眼底置多普勒流量计探头，测定视网膜中央动脉供血区的相对血流量值。

模型制备

动物经左股静脉给予4％四氯四碘荧光素二钠(虎红)40mg/kg，体积ml/kg(假手术组动物给等体积NS)，5min后，采用SQ-III型血栓形成实验装置(冷光源，λ560nm，Δλ60nm，光强度1W/cm²)特定波长的光束照射视网膜膜中央动脉15min，血管内的四氯四碘荧光素二钠可大量吸收能量，发生能级跃迁，并将能量传递给氧分子，使血液中的氧转变成氧自由基(单线态氧)，氧自由基再氧化破坏血管内皮细胞，使内皮细胞损伤和/或基底膜暴露，引起血小板粘附与聚集，从而激活内、外源性凝血系统，同时，氧自由基又能损伤血小板膜，由于损伤的血小板可释放一系列促凝血因子并为凝血提供磷脂表面，因而可大大加速血栓的形成。视网膜中央动脉血栓形成后，其支配区眼底视网膜的组织血流量出现下降。

分组与给药

动物按体重随机分为4组，每组10只。血栓形成并稳定45min后，经右股静脉开始给药，采用先静脉推注总剂量的10％(体积0.2ml，推注时间1min)，剩余90％静脉恒速输注(体积0.8ml，输注时间Ih)。假手术组和模型对照组给予生理盐水，受试药3个剂量组给予pro-uk，即量分别为2.5、5.0、10.0×10⁴IU/kg。上述各组每只动物给药总体积均为2.0ml。

测定指标

记录造型前正常视网膜多普勒相对流量值，及血栓形成(0min)、给药前后5、10、15、20、30、45、60、90、120min的相对流量值。以给药后相对流量值达到正常相对流量值30％以上所需时间作为血管再闭塞时间，并计算再通率、再闭塞率。

统计学处理

所有剂量资料均数±标准差( x±s)表示。剂量资料采用配对t-检验比较给药前后均数差异显著性，非配对t-检验比较不同组间均数差异显著性；计数资料采用精确Fisher检验进行统计学处理。

实验结果

对大鼠视网膜中央动脉血栓溶解的影响

模型对照组在120min内，10只动物栓塞的视网膜中央动脉未出现再通。静脉给予pro-uk2.5、5.0、10.0×10⁴IU/kg能明显溶解血栓，栓塞的血管分别有5/10(50％)、7/10(70％)、9/10(90％)出现血管再通，血管再通时间分别为34.6±33.4、38.8±28.6、11.5±7.0min。

对大鼠视网膜中央动脉支配区相对血流量的影响

假手术组120min内视网膜流量无明显变化，与手术前相比较无明显差异；模型对照组造型后流量明显降低，约占正常值的50％左右，与造型前比较差异有显著意义，造型后120min内流量基本保持稳定，与给药前比较无明显差异，各时间点与假手术组比较差异有显著意义；pro-uk2.5×10⁴IU/kg，静脉给药后可使90～120min血流量明显增加，与模型对照组比较差异有显著意义；pro-uk5.0×10⁴IU/kg，静脉给药后可使5、15、45、90min血流量与模型对照组比较显著增加；pro-uk10.0×10⁴IU/kg，静脉给药后可使5～120min血流量与模型对照组比较显著增加。

具体实施方式

以下是实施本发明的具体实施方案的例证。实施例仅用于说明目的，并非意在以任何方式限制本发明的范围。

实施例

尿激酶原基因的克隆和表达载体的构建

(1)人尿激酶原全长cDNA基因的构建和克隆：采用肉豆寇酯(PMA)诱导Detroit 562细胞，用酸性硫氰胍-酚-氯仿法提取细胞总RNA，Oligo(dT)-纤维素柱层析法分离poly(A⁺)RNA，通过反转录和dG·dC接尾重组技术构建Detroit 562细胞的cDNA文库，通过筛选获得了含有编码尿激酶基因片段的阳性克隆株。再采用人工合成寡核苷酸片段和DNA重组技术，构建了人尿激酶原全长cDNA基因并克隆至pUC19质粒，获得了PMM-UK重组质粒，测序确认无误。该基因5’端含有Hind III和EcoR1单一酶切位点，3’端含有Sal I，Xba I，Sma I，KPn I和Sac I五个单一酶切位点，便于尿激原基因的克隆和表达。

(2)中间载体lpSV2-pro-UK的构建：将pSV2-dhfr载体用Bgl II酶切后用Klenow F酶补平，再用Hind III酶切，分离回收载体大片段；从pMM-UK质粒DNA中，用Hind III和和Sma I双酶切，分离pro-UK cDNA；将载体大片段与pro-UK cDNA连接形成可表达pro-UK的重组质粒pSV2-pro-UK。

(3)中间载体2 pMTSV-dhfr的构建：将pSV2-dhfr载体用Bgl II酶切后用Klenow F酶补平，再通过T4 DNA连接酶将质粒重新环化并消除了质粒中的Bgl II酶切位点。然后将该质粒经BamH I和pVU II双酶切及Klenow F酶将末端补平，通过电泳回收1.9Kb DNA片段(内含SV40增强子和二氢叶酸还原酶基因)。将此片段插入经EcoR1酶切，Klenow F酶末端补平的pXMT载体中，从而获得了长度为8.25Kb的中间载体pMTSV-dhfr。

(4)表达载体pMTSV-du的构建：将pSV₂-pro-UK重组质粒经Sal I酶切，Klenow F酶末端补平，再通过T4 DNA连接酶将质粒重新环化并消除了质粒中的Sal I酶切位点。然后将该质粒经pVU I和EcoR V双酶切及Klenow F酶将末端补平，通过电泳回收3.8Kb片段(含全长尿激酶原cDNA)，并将该片段插入经Bgl II酶切，Klenow F酶末端补平的PMTSV-dhfr中间载体，从而获得长度为12Kb，可表达尿激酶原的载体pMTsv-du。

实施例二

转染和筛选高效表达的CHO工程细胞

将20-40μg pMTSV-du质粒DNA通过磷酸钙共沉淀法转染CHO-dhfr-细胞，先用HAT选择培基筛选，10大后换成含1-3×10^-8M MTX的选择培基进行dhfr和MTX双重筛选，并对表达有尿激酶原活性的阳性转化细胞经多次亚克隆和MTX加压扩增基因，锌离子诱导，最终筛选到能高效表达尿激酶原的细胞株。

实施例三

CHO工程细胞的培养和放大

CHO工程细胞由方瓶(单层贴壁培养)一转瓶(单层贴壁培养)一搅拌瓶(多孔微载体培养)一5L Celligen反应器(多孔微载体培养)一30L Biostat UC反应器(多孔微载体培养)逐级放大培养。由于细胞能在长满细胞的载体和空载体之间自动转移，每级放大培养时，先在更大规模的反应器中预先加入适量培养基和经过处理的多孔微载体，长满细胞的多孔微载体通过管道直接近人下一级反应器中。控制pH为7.0±0.5，DO为7％-40％，温度为37.0±0.1℃，搅拌转速为70r/min-90r/min.多孔微载体的浓度为2g/L-g/L培养基。采用批式换液连续培养方式，每天通过细胚截留系统换液1-1.2个工作体积，将微载体截留在反应器中，收获含产品的上清并加入新鲜培养基。

实施例四

四步法纯化尿激酶原

第一步，cM-径向离子交换法：先用0.15mol/L，pH5.7的磷酸缓冲液平衡。尿激酶原原液经3000Xg，4℃离心后用6mol/L HCl调pH至5.7后上柱，流速为12-15ml/分(柱床体积250ml)或25-30ml/分(柱体体积700ml)。当洗液中蛋白吸收峰值低于0.005以下时改用0025mol/L，pH6.8的醋酸缓冲液(含0.75mol/L硫酸按)，0.005％Tween-80)洗脱，收集活性蛋白峰流出液。

第二步，MPG吸附色谱法：它是由微孔高硅玻璃珠组成的色谱柱。将第一步的收集液直接上柱，用0.5mol/L Tris-HCl，pH9.5的缓冲液洗去杂蛋白，再用0.02mol/L，pH8.0的磷酸缓冲液(含0.1mol/L NaCl)沉至吸收峰值低于0.005以下后，分别用含1mol/L和2mol/L硫酸铵的0.5mol/L，pH9.25的Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱并收集蛋白吸收峰流山液。

第三步，凝肢色诺Sephacryl S-200 HR高效凝胺色谱先用0.092mol/L，pH5.3(含0.1mol/LNaCl)醋酸缓冲液平衡，然后将第二步的收集液上柱，继续用该缓冲液沉柱并收集第二蛋白峰组分。

第四步，对氨基苯甲脒亲和色谱：先用0.092mol/L，pH5.3(含0.2mol/L NaCl)的醋酸缓冲液平衡，然后将第三步收集液上柱，继续用该缓冲液洗柱并收集穿过蛋白流出液。

实施例五

重组人尿激酶原的纯化

将连续换液培养收获的无血清细胞培养上清，经沉降虹吸，去掉少量细胞及细胞碎片后，用稀盐酸调pH值至5.8，过Streamline-SP扩张床，用洗脱缓冲液洗脱后收集洗脱蜂；用微孔滤膜过滤后，过Sephacryl S-200凝胶色谱，收集活性蛋白峰；收集峰用Benzamidine Sepharose4Flow亲和层析除去部分双链UK，收集穿透液，穿透液调pH后过Streamline-DEAE，除去DNA、热源等杂质，收集穿透液，得到纯品尿激酶原。

实施例六

采用免疫亲和层析法纯化重组人尿激酶原

用99％纯度的尿激酶原经腹腔、皮下注射免疫6～8周龄BALB/c小鼠，取其脾细胞，采用常规方法进行细胞融合、筛选与克隆化，并制备McAb腹水。用ELISA方法从融合细胞中，经有限稀释克隆筛选出对尿激酶原有明显结合力的细胞株；

制备抗尿激酶原的杂交瘤细胞株：用蛋白G-Sepharose 4B直接纯化杂交瘤细胞培养上清，平衡液0.02mol/L P.B 0.2mol/L NaCl pH8.0，洗脱液0.1mol/L Gly-HCI pH2.0；

制备抗尿激酶原单克隆抗体亲和层析柱：将1.5g CNBr活化的Sepharose 4B胶与10ml上述纯化后蛋白浓度为5.7mg/L IgG交联，制备免疫亲和柱；用此柱直接纯化工程细胞培液上清，即得到尿激酶原。

实施例七

尿激酶原制剂制备

选用L-精氨酸作为赋形剂，将尿激酶原冻干粉溶于赋形剂溶液(每升溶液中含L-精氨酸87g，磷酸39.96g，Tween-20 0.01％，pH6.0)中，配成22万IU/mL浓度，过滤除菌后，每瓶分装5mL，送入冷冻室冷冻干燥。

Claims

1.尿激酶原在制备治疗肺栓塞的药物中的应用。

2.权利要求1所述的用途，其中尿激酶原为基因重组尿激酶原。

3.权利要求1所述的用途，其中所说的药物为注射剂型。

4.权利要求3所述的用途，其中所说的注射剂型是是冻干粉针。

5.权利要求4所述的用途，其中尿激酶原在药物中的含量为1％-95％。

6.权利要求5所述的用途，其中尿激酶原在药物中的含量为1.5％-4％(W/W)。

7.权利要求6所述的用途，其中尿激酶原在药物中的含量为2％-3％(W/W)。

8.尿激酶原在制备治疗视网膜动脉栓塞的药物中的应用。

9.权力要求8所述的用途，其中尿激酶原为基因重组尿激酶原。

10.权利要求8所述的用途，其中所说的药物为注射剂型。

11.权利要求10所述的用途，其中所说的注射剂型是冻干粉针。

12.权利要求10所述的用途，其中尿激酶原在药物中的含量为1％-95％。

13.权利要求12所述的用途，其中尿激酶原在药物中的含量为1.5％-4％(W/W)。

14.权利要求13所述的用途，其中尿激酶原在药物中的含量为2％-3％(W/W)。