CN101028275A - α－D－葡萄糖甘油二酯在制造溶血栓药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体为α－D－葡萄糖甘油二酯作为溶血栓药物的应用。本发明发现了α－D－葡萄糖甘油二脂的纤溶促进作用，提出α－D－葡萄糖甘油二脂作为血栓性疾病治疗药物的应用。将α－D－葡萄糖甘油二脂添加到纤溶酶原、尿激酶前体、SUK构成的模拟纤溶反应体系中，使用96孔圆底酶标板，连续测定游离硝基苯胺的生成引起的吸光度的增加，该吸光度的增加与α－D－葡萄糖甘油二脂浓度的增加相一致，表明α－D－葡萄糖甘油二脂促进了纤溶作用。在含有10％血浆的in vitro反应体系中，α－D－葡萄糖甘油二脂促进了血栓的溶解。α－D－葡萄糖甘油二脂作为溶血栓制剂能临床治疗慢性血栓、急性血栓症状的肺血栓、脑血栓和心肌梗塞等血栓性疾病，以及作为临床上广泛使用的链激酶、尿激酶(或尿激酶原)的协同或辅助治疗药物。

Description

α-D-葡萄糖甘油二酯在制造溶血栓药物中的应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及一种α-D-葡萄糖甘油二脂作为治疗血栓性疾病、作为心血管系统治疗药物的应用。

背景技术

心肌梗塞、脑栓塞、肺血栓等血栓性疾病造成的死亡数量已经超过了癌造成的死亡数量正成为死亡原因的首位。围绕着血栓溶解既纤溶作用，在临床上使用的药物如组织型纤溶酶原激活剂、尿激酶型纤溶酶原激活剂等会带来重大的出血危险性，只能用于重笃血栓患者，由于上述药物的安全问题，自20世纪90年代开始，一些研究者开始探索用组织型纤溶酶原激活剂变异体、脂质化合物用于血栓疾病的治疗。研究发现，相比组织型纤溶酶原激活剂分子量小的活性化血液蛋白质C具有抗凝血作用和促进纤溶作用；血小板膜特异性糖蛋白的抑制药物阿昔单抗作为小分子量的短肽抗凝血药物已经用于临床；血液凝固因子Xa的低分子抑制化合物作为药物正处于开发阶段。但已经用于临床或正在试验阶段的抗凝血药物除了都有程度不同的出血危险性以外，阿昔单抗的使用已经带来了像阿司匹林投与后的血小板减少的副作用。因此，在这一治疗领域正急待着出血危险性小、不损伤血液因子、活性能够简单调控的低分子化合物作为血栓治疗药物的出现。

到目前为止对α-D-葡萄糖甘油二脂的研究和发现是比较少的，而甘油二脂作为细胞信息传递的第二信使，发现它的合成开始于3-磷酸甘油，首先由3-磷酸甘油在转酰酶催化下接受2分子脂酰辅酶A生成磷脂酸，后者由磷酸酶催化脱磷酸生成1，2-甘油二脂，1，2-甘油二脂也是合成的重要中间物，已经发现甘油二脂在脂肪代谢、周细胞生长中的重要作用。最近发现葡萄糖甘油二脂被具有抑制癌细胞生长的作用。但是，没有关于α-D-葡萄糖甘油二脂具有纤溶促进作用的报道。本发明发现了α-D-葡萄糖甘油二脂的纤溶促进作用，首次发现了从海藻中分离的天然化合物α-D-葡萄糖甘油二脂在纤溶模拟反应体系和in vitro体系具有纤溶促进作用，该纤溶促进作用是α-D-葡萄糖甘油二脂作为溶血栓药物治疗各种血栓疾病的基础，推测α-D-葡萄糖甘油二脂的纤溶促进作用与甘油二脂的代谢作用相关。

发明内容

本发明的目的在于提供一种α-D-葡萄糖甘油二脂在制备溶血栓药物中的应用。

α-D-葡萄糖甘油二脂能溶解于甲醇、氯仿、乙酸乙脂、正己烷，可溶于水，不溶于丙酮。α-D-葡萄糖甘油二脂一维碳谱的特征数据为¹³C NMR(DMSO-d₆)：δ62.5(C1)，69.7(C2)，64.7(C3)，98.3(C1)，71.6(C2)，72.8(C3)，74.4(C4)，68.4(C5)，54.9(C6)，172.2 and 172.4(C1’，C1”)，33.5 and 33.3(C2’，C2”)，24.3(C3’，C3”)，28.3-28.9(C4’-C7’，C12’-C15’，C4”-C13”)，26.5 and 26.4(C8’，C11”)，129.5 and 129.4(C9’，C10’)，31.2(C16’，C14”)，21.9(C17’，C15”)，13.7(C18’，C16”)，一维氢谱的特征数据为¹H NMR(DMSO-d₆)：δ4.34(1H，dd，J＝2.6，12.1) and 4.21(1H，dd，J＝2.6，12.1)(1-H₂)，5.12(1H，m)(2-H)，3.87(1H，dd，J＝5.8，10.6) and 3.41(1H，dd，J＝5.5，10.6)(3-H₂)，4.56(1H，d，J＝3.7)(1-H)，3.18(1H，dd，J＝4.4，9.2)(2-H)，3.36(1H，t，J＝9.2)(3-H)，2.94(1H，t，J＝9.2)(4-H)，3.78(1H，ddd，J＝5.1，5.5，9.5)(5-H)，2.88(1H，dd，J＝4.8，13.9)and 2.57(1H，dd，J＝6.2，13.9)(6-H)，2.26(4H，m)(2’-H₂，2”-H₂)，1.49(4H，m)(3’-H₂，3”-H₂)，1.2-1.3(m)(4’-H₂-7’-H₂，12’-H₂-17’-H₂，4”-H₂-15”-H₂)，1.97(4H，m)(8’-H₂，11’H₂)，5.04(2H，t，J＝4.8)(9’-H，10’-H)，0.84(6H，t，J＝6.8)(18’-H₃，16”-H₃)。以溴化钾法测得的红外光谱的特征吸收峰为IR(NaBr)：v_max(cm^-1)3400(br)，2920，2852，1742，1219，1171，1035，771。以甲醇为溶剂的该化合物具有末端吸收的紫外光谱特征。

本发明关于α-D-葡萄糖甘油二脂具有促进血栓溶解的药理试验研究如下：

使用96孔圆底酶标板，在5μmol纤溶酶原、20μmol尿激酶前体、100μg/ml SUK(spectrozyme UK^)构成的50μl[TBS(Tris-HCl Buffer Solution)/BSA(Bovine SerumAlbumin，50mM Tris-HCl，100mM NaCl，and 2mg/ml BAS，pH7.4)]反应体系中，添加α-D-葡萄糖甘油二脂，在405nm连续100分钟测定游离硝基苯胺的生成引起的吸光度的增加，与对照相比，用吸光度值体现的纤溶作用被提高了2.5倍以上，该吸光度值的增加与0.08-200μg/mlα-D-葡萄糖甘油二脂浓度的增加相一致。在该纤溶作用模拟反应体系体现出来的纤溶促进作用是基于尿激酶前体和纤溶酶原的相互活化作用，由于纤溶酶原其分子结构上的特性，在血液中循环的纤溶酶原具有闭合的紧密型结构，在血液中被纤溶酶原激活剂低效率的活化，纤溶酶原的这种空间构型被存在于其N末端80个残基(N-terminalpeptide)中的赖氨酸残基(Lys50或Lys60)与存在于第5个回环(K5)上的羰氨位点所形成的分子内结合键所维持，当第5个回环上的羰氨位点通过与纤维蛋白或细胞膜受体相结合时，NTP-K5的相互作用被解除，纤溶酶原分子被转变成开放型的结构，纤溶酶原分子在空间舒展，通过这样的变化，在纤维蛋白或细胞间质上纤溶酶原被高效率的转变成纤溶酶。具有和纤溶酶原羰氨位点竞争性结合的低分子化合物或者改变纤溶酶原的空间构型使纤溶酶原处于易于活化的构型，或者使纤溶酶原易于结合纤维蛋白(血栓)，其结果都会使纤溶酶大量产生，产生的纤溶酶切断尿激酶前体的Lys158-Ile159肽键，具有微弱内因性活性的尿激酶前体被转变成活性强烈的尿激酶，大量产生的尿激酶又切断纤溶酶原Arg561-Val562的肽键使纤溶酶原转变成纤溶酶，体系因这种活性化合物的存在而被加速了。另外，具有微弱内因性活性的尿激酶前体切断纤溶酶原Arg561-Val562的肽键，使纤溶酶原转变成纤溶酶，当低分子化合物提高了尿激酶前体的内因性活性或提高了上述体系产生的纤溶酶或尿激酶的活性，体现出体系的纤溶促进作用和对照相比被α-D-葡萄糖甘油二脂促进了。

在含有10％血浆(不含有血小板)的in vitro反应体系中，α-D-葡萄糖甘油二脂促进了纤维蛋白的降解，纤维蛋白的降解被促进了1.8倍以上。溶解于0.1M碳酸氢钠(pH9.0)的360μl(10mg/ml)的纤维蛋白原和溶解于磷酸盐缓冲液的36μl(10mg/ml)FITC(fluorescein isothiocyanate isomer I)混合，在25℃下保温1小时，使用由磷酸盐缓冲液平衡的葡聚糖层析柱层析该混合液，得到了FITC-Fbg。

含有20μg FITC-Fbg的磷酸盐缓冲液100μl被分注到96孔平底酶标板的孔中，在37℃下保温24小时至干燥，向干燥的穴孔里添加75μl凝血酶[0.68U/ml in NaCl/NaPi(150mM NaCl and 20mM sodium phosphate，pH7.4)]，在37℃下维持3小时后，用含有0.1％Tween 80的NaCl/NaPi和不含有0.1％Tween 80的NaCl/NaPi分别洗净2次和1次，随后添加5mg/ml胎儿皮肤胶原蛋白的NaCl/NaPi溶液200μl，在37℃下保温1小时，弃除缓冲液后被用于纤溶活性的测定。

含有10％血浆(不含有血小板)的TBS/BSA 100μl、0.1nM尿激酶前体和样品(0-14μg/ml)被顺次添加到穴孔里，每一个样品重复3次，在37℃下保温1小时，使用荧光分光光度计在激发波长494nm和检测波长520nm测定了FITC-纤维蛋白的分解量，与对照相比，6.0μM以上α-D-葡萄糖甘油二脂提高FITC-Fibrin的降解1.8倍以上。

α-D-葡萄糖甘油二脂作为溶血栓制剂能临床治疗慢性血栓、急性血栓症状的肺血栓、脑血栓和心肌梗塞等血栓性疾病，以及作为临床上广泛使用的链激酶、尿激酶(或尿激酶原)的协同或辅助治疗药物。

α-D-葡萄糖甘油二脂具有能溶于水、易溶于多种有机溶剂的特点，针对临床上的急性血栓症状和慢性血栓症状，α-D-葡萄糖甘油二脂能被做成经胃肠道给药和非经胃肠道给药2种剂型，适宜于制作成溶液型或固体分散型，这两种剂型针对血栓症状，具有最大的有效性、充分的安全性、良好的可控性和优良的稳定性，能顺应病人和医护人员对这种血栓治疗药物的接受。α-D-葡萄糖甘油二脂的注射制剂以氯化钠为等渗调节剂溶于水中，溶液有效成分的浓度为1-2mg/ml，最大血药浓度应该在2-5mg/L的范围。固体分散型的片剂制作时以乳糖、糖粉、淀粉浆、海藻酸钠为赋型剂，每片含α-D-葡萄糖甘油二脂4-10mg。

具体实施方式

α-D-葡萄糖甘油二酯的分子量为756、分子式是C₄₃H₈₀O₁₀，标准命名是1-棕榈酰-2-亚油酰-3-O-α-D-葡萄糖甘油酯或1-亚油酰-2-棕榈酰-3-O-α-D-葡萄糖甘油酯，其结构见下述(I)、(II)所示。该化合物微黄色粉末，能溶解于甲醇、氯仿、乙酸乙脂、正己烷，微溶于水，不溶于丙酮。在紫外光谱扫描上呈现末端吸收，在红外吸收上呈现2920、2852、1742、1219、1171、1035、771cm^-1的特征吸收峰。一维碳谱的特征数据为¹³C NMR(DMSO-d₆)：δ62.5(C1)，69.7(C2)，64.7(C3)，98.3(C1)，71.6(C2)，72.8(C3)，74.4(C4)，68.4(C5)，54.9(C6)，172.2 and 172.4(C1’，C1”)，33.5 and 33.3(C2’，C2”)，24.3(C3’，C3”)，28.3-28.9(C4’-C7’，C12’-C15’，C4”-C13”)，26.5 and 26.4(C8’，C11”)，129.5 and 129.4(C9’，C10’)，31.2(C16’，C14”)，21.9(C17’，C15”)，13.7(C18’，C16”)，一维氢谱的特征数据为¹H NMR(DMSO-d₆)：δ4.34(1H，dd，J＝2.6，12.1)and4.21(1H，dd，J＝2.6，12.1)(1-H₂)，5.12(1H，m)(2-H)，3.87(1H，dd，J＝5.8，10.6)and3.41(1H，dd，J＝5.5，10.6)(3-H₂)，4.56(1H，d，J＝3.7)(1-H)，3.18(1H，dd，J＝4.4，9.2)(2-H)，3.36(1H，t，J＝9.2)(3-H)，2.94(1H，t，J＝9.2)(4-H)，3.78(1H，ddd，J＝5.1，5.5，9.5)(5-H)，2.88(1H，dd，J＝4.8，13.9)and 2.57(1H，dd，J＝6.2，13.9)(6-H)，2.26(4H，m)(2’-H₂，2”-H₂)，1.49(4H，m)(3’-H₂，3”-H₂)，1.2-1.3(m)(4’-H₂-7’-H₂，12’-H₂-17’-H₂，4”-H₂-15”-H₂)，1.97(4H，m)(8’-H₂，11’-H₂)，5.04(2H，t，J＝4.8)(9’-H，10’-H)，0.84(6H，t，J＝6.8)(18’-H₃，16”-H₃)。

从谷物分离到的具有和1-棕榈酰-2-亚油酰-α-D-葡萄糖甘油酯相似结构的化合物1-棕榈酰-2-亚油酰-α-D半乳糖甘油酯不具有纤溶促进作用，其构成糖的一维碳谱的特征数据为¹³C NMR(DMSO-d₆)：103.6(C1)，67.7(C2)，68.2(C3)，99.4(C4)，66.3(C5)，60.4(C6)。

使用96孔圆底酶标板，在5μM纤溶酶原、20μM尿激酶前体、100μg/ml SUK(spectrozyme UK^)构成的50μl[TBS(Tris-HCl Buffer Solution)/BSA(Bovine SerumAlbumin，50mM Tris-HCl，100mM NaCl，and 2mg/ml BAS，pH7.4)]反应体系中，添加0.08-200μg/ml α-D-葡萄糖甘油二脂，使用酶标仪以605nm为参照，在405nm、37℃连续100分钟测定游离硝基苯胺的生成引起的吸光度的增加，与对照相比，用吸光度值体现的纤溶作用被提高了2.5倍以上，该吸光度的增加与α-D-葡萄糖甘油二脂浓度的增加相一致。在同样条件下，添加从谷物分离到的1-棕榈酰-2-亚油酰-α-D半乳糖甘油酯，α-D半乳糖甘油二酯不会使该纤溶模拟体系的吸光度值升高，不像α-D-葡萄糖甘油二脂那样促进纤溶作用。将上述纤溶酶原-尿激酶前体-SUK调整成纤溶酶原-尿激酶前体-S2255的的模拟纤溶反应体系，在调整的纤溶模拟反应体系中加入从海藻分离的α-D-葡萄糖甘油二脂或从谷物中分离的α-D半乳糖甘油二酯，仍然表现出α-D-葡萄糖甘油二脂促进了纤溶作用，而α-D半乳糖甘油二酯则对纤溶作用没有影响。

在含有10％血浆(不含有血小板)的in vitro反应体系中，α-D-葡萄糖甘油二脂促进了纤维蛋白的降解，纤维蛋白的降解被促进了1.8倍以上。

首先，获得异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate isomer I，FITC)标记的纤维蛋白原。溶解于0.1M碳酸氢钠(pH9.0)的360μl(10mg/ml)的纤维蛋白原和溶解于磷酸盐缓冲液的36μl(10mg/ml)FITC混合，在25℃下保温1小时，使用由磷酸盐缓冲液平衡的葡聚糖层析柱层析该混合液，得到FITC-纤维蛋白原。

其次，制作荧光标记的血栓。含有20μg FITC-Fbg的磷酸盐缓冲液100μl被分注到96孔平底酶标板的孔中，在37℃下保温24小时至干燥，向干燥的穴孔里添加75μl凝血酶[0.68U/ml in NaCl/NaPi(150mM NaCl and 20mM sodium phosphate，pH7.4)]，在37℃下维持3小时后，用含有0.1％Tween 80的NaCl/NaPi和不含有0.1％Tween 80的NaCl/NaPi分别洗净2次和1次，随后添加5mg/ml胎儿皮肤胶原蛋白的NaCl/NaPi溶液200μl，在37℃下保温1小时，弃除缓冲液后被用于纤溶活性的测定。

最后，检测α-D-葡萄糖甘油二脂促进体外血栓的溶解作用。含有10％血浆(不含有血小板)的TBS/BSA 100μl、0.1nM尿激酶前体和样品(0-14μg/ml)被顺次添加到穴孔里，每一个样品重复3次，在37℃下保温1小时，使用荧光分光光度计在激发波长494nm和检测波长520nm测定了FITC-纤维蛋白的分解量，与对照相比，6.0μM以上α-D-葡萄糖甘油二脂提高FITC-Fibrin的降解1.8倍以上。如果用α-D半乳糖甘油二酯代替从海藻中分离的α-D-葡萄糖甘油二脂，FITC-Fibrin的降解不体现出促进作用。在同样的invitro反应体系，如果尿激酶前体被尿激酶替换，添加α-D-葡萄糖甘油二脂或α-D半乳糖甘油二酯，FITC-Fibrin的降解能被α-D-葡萄糖甘油二脂所促进，但α-D半乳糖甘油二酯不能促进该in vitro反应体系的纤溶作用。还是在该in vitro反应体系，如果尿激酶前体被组织型纤溶酶原激活剂替换，无论是α-D-葡萄糖甘油二脂还是α-D半乳糖甘油二酯都不能促进纤溶作用。

α-D-葡萄糖甘油二脂在模拟纤溶反应体系和in vitro纤溶反应体系的特异性纤溶促进作用，并且模拟纤溶反应体系对纤溶作用的代表性和in vitro纤溶反应体系作为体内纤溶作用的真实性，表明α-D-葡萄糖甘油酯作为溶血栓药物能临床治疗慢性血栓、急性血栓的肺血栓、脑血栓和心肌梗塞等血栓疾病，以及作为临床上广泛使用的链激酶、尿激酶(或尿激酶原)的协同或辅助治疗药物。

关于药物制剂的制备

液体制剂的制备过程是：取处方总量1/2-3/4量的水500-750ml，加入称量的α-D-葡萄糖甘油二脂1000-2000mg，加入等渗调节剂氯化钠5-9g，过滤，通过过滤器加水至1000ml，灌封于5ml的安瓿中，在100℃流通蒸汽中灭菌30min。

固体分散剂的片剂制备过程是：将乳糖88.8g、糖粉38.0g和适量的17％淀粉糖浆制成空白颗粒，将α-D-葡萄糖甘油二脂制成10-20％的乙醇溶液，拌于空白颗粒的细粉中，于30-40℃干燥50-60min，在与事先制成的空白颗粒及海藻酸钠混匀，压片，得到α-D-葡萄糖甘油二脂的药物片剂。

Claims (3)

1、α-D-葡萄糖甘油二酯作为制备溶血栓药物的应用。

2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物剂型为注射制剂，以氯化钠作为渗调节剂，溶于水中，溶液的有效成分的浓度为1-2mg/ml，最大血药浓度为2-5mg/L。

3、根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述剂型为固体分散型，以乳糖、糖粉、淀粉浆、海藻酸钠为赋型剂，每片含有效成分4-10mg。