CN107073292A - 用于安全和有效的溶栓的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于安全和有效溶栓的方法、组合物和试剂盒，例如用于治疗潜在的中风或急性心肌梗塞(AMI)。

Description

用于安全和有效的溶栓的方法和组合物

技术领域

本发明涉及安全和有效的溶栓的方法和组合物。

发明背景

当血管内形成血液凝块(血栓)并阻塞血液流动通过循环系统时，发生血栓形成。当血管受损时，身体使用血小板和纤维蛋白形成血液凝块，以密封受损的血管并防止失血。这个过程被称为止血。即使当血管没有受损时，在某些情况下也可能在体内形成血液凝块。血液凝块主要由聚集的血小板和交联的纤维蛋白网组成，其是血液中纤维蛋白原的天然聚合物。当血栓大到足以减少至组织的血流时，可能会发生缺氧(hypoxia/anoxia)，导致组织损伤甚至组织死亡。根据在动脉系统中的位置，即心脏、脑或腿，血栓可引发心脏病发作、中风或外周坏疽。在静脉循环中，相同的过程可引起血栓性静脉炎(深静脉血栓形成)或肺栓塞。总之，在工业化国家，这些心血管疾病构成了死亡和残疾的主要原因。

溶栓主要涉及使用溶栓药物来溶解引起疾病的血液凝块并恢复血流。当前使用的溶栓药物如tPA及其衍生物通过将酶原纤溶酶原激活为蛋白酶纤溶酶而起作用，所述蛋白酶纤溶酶降解血液凝块中的纤维蛋白网，使凝块溶解，从而使血流恢复通过闭塞的血管。然而，目前的溶栓药物也会引起密封伤口的止血纤维蛋白的降解，并在血浆中产生降解三种凝血因子即纤维蛋白原、因子V和因子VII(血友病因子)的纤溶酶。因此，目前的溶栓治疗具有由于血友病样副作用或止血纤维蛋白降解引起的出血的风险。这对符合治疗条件的患者的数目施加了严重限制，并限制了可使用的溶栓剂量。因此，只有约5％的中风患者接受治疗，且这种治疗的疗效有限。

中风可以由血液凝块或脑中血管出血引起。然而，正确诊断中风的具体原因需要CT扫描或MRI，如果不能立即获得，则可能会延迟治疗。在没有这样适当的诊断下，如果原因碰巧是出血而不是血液凝块，则施用凝块溶解剂如组织纤溶酶原激活物(“tPA”)可能是非常危险的，因为向脑出血患者施用tPA或其他溶栓剂可能是致命的。

发明概述

本公开至少部分地基于以下发现：tPA和尿激酶原突变体(“proUK突变体”或“mproUK”)的独特和不同的特异性意味着，例如对于治疗中风或急性心肌梗塞(“AMI”)，相比以高剂量使用单独的任一种(单一疗法)可能达到最大的血液凝块溶解速率，但伴随高的出血并发症风险，每一种均为小剂量的组合诱导更快且更安全，即更特异的且伴随更低的出血并发症发生率的溶栓。

mproUK可包含在尿激酶原的氨基酸位置300处的赖氨酸被组氨酸的替换(Lys300→His)，在本文称为“M5”。mproUK(与proUK一样)是一种酶原，即活性酶的无活性前体。它与proUK的不同之处在于，其酶形式的突变型尿激酶或mUK(与尿激酶(UK)不同)受到血浆抑制剂C1-抑制剂的抑制，C1-抑制剂除了较低的必要剂量之外还有助于减少利用pro-UK所观察到的出血性副作用，所述出血性副作用是由于在血浆中针对UK的抑制剂(纤溶酶原激活物抑制剂-1，PAI-1)不足。

对于中风或AMI患者，溶栓和再灌注所需的时间对临床结果和存活率至关重要。这意味着治疗必须足够安全，以便无需进行初步诊断测试即可在医院外进行。然而，只有在出血风险大大降低或消除时，这才是可能的，如本文所述新方法的情况，包括组合施用微量的tPA(例如，小于5.0mg的弹丸剂，例如小于或等于4.5mg、4.0mg、3.5mg、3.0mg、2.5mg或2.0mg)和低剂量的mproUK(例如以60-120mg/h的速率，例如60-90mg/h，如60、65、70、75、80、85或90mg/h，进行输注持续60-90min，如60、70、80或90min)。

如果在给定对象中内源性C1-抑制剂浓度不足，则可以在新方法中通过施用有效量的C1-抑制剂来补充，所述C1-抑制剂例如市售的C1-抑制剂，如和如果发生了mproUK至突变型UK的一些转化，则C1-抑制剂是一种额外的预防措施，但是由于所需要的是低剂量mproUK，以及C1-抑制剂是急性期反应物(在心脏病发作或中风之后身体会立即自动将其升高)的事实，所述C1-抑制剂可能不是必需的。

在第一方面，本文提供了以最大的血液凝块溶解速率和最小的相关出血性副作用来治疗具有中风或急性心肌梗塞(AMI)症状的对象(如人类患者)的方法，所述方法包括：(a)通过观察中风或AMI的一种或多种症状来鉴定潜在地患有中风或AMI的对象，而不确定中风的原因；和(b)向所述对象施用含有小剂量，即小于5mg组织纤溶酶原激活物(tPA)，例如2.0、2.5、3.0、3.5、4.0或4.5mg tPA的第一组合物的弹丸剂，然后以60-120mg(例如60、70、75、80、85、90、100或120mg/h)的低剂量速率，静脉内输注包含低剂量的尿激酶原突变体(mproUK)的第二组合物，输注60-90min，例如60、65、70、75、80、85或90min；其中以最小的相关出血性副作用实现最大的凝块溶解速率。

在这些方法的一些实施方案中，最小的相关出血性副作用可以被确定为对象血液中纤维蛋白原降解的水平低于约30％，例如小于27.5％、25％、22.5％或20％的纤维蛋白原降解(然而，在使用任一种单独的组合物进行的单一疗法中，纤维蛋白原降解为约50％-80％)。在一些实施方案中，最大的凝块溶解速率被表示为通过2或更高的心肌梗塞溶栓(TIMI)评分来实现的。在其他实施方案中，最大的凝块溶解速率被表示为通过在75min内，例如在70、60、50、40、04、30min内实现的溶解对象中至少一个凝块的约50％的质量来实现的。

在这些方法中，尿激酶原突变体可以包含在尿激酶原的氨基酸位置300处的赖氨酸被组氨酸的替换(Lys300→His)。所述方法可以包括在施用第一组合物后5、10或15min内开始施用第二组合物。在一些实施方案中，第一组合物和第二组合物在少于1h内共同溶解对象中至少一个血液凝块的50％的质量。

在某些实施方案中，所述方法可以进一步包括向对象施用包含C1-抑制剂的弹丸剂的第三组合物。第三组合物可以在施用第二组合物之前或大约同时(例如5min内)施用于对象。在某些实施方案中，以足以建立对象血液中约500-750μg/ml的C1-抑制剂浓度的量施用第三组合物。在一些实施方案中，第三组合物是500-1500mg C1-抑制剂的弹丸剂。

在这些方法的一些方法中，当与通过单独的tPA或尿激酶原进行的单一疗法相比时，在C1-抑制剂存在下，第一组合物和第二组合物共同溶解血液凝块并伴有小于30％的纤维蛋白原降解。

在另一方面，本公开提供了包括在第一容器中的第一组合物和在第二容器中的第二组合物的试剂盒；所述第一组合物包含2-5mg组织纤溶酶原激活物(tPA)，所述第二组合物包含60-120mg尿激酶原突变体(mproUK)，所述尿激酶原突变体含有在尿激酶原的氨基酸位置300处的赖氨酸被组氨酸的替换(Lys300→His)。在这些试剂盒中，第一组合物可以被配制成适于作为弹丸剂施用，和/或第二组合物可以被配制成适于静脉内输注。在某些实施方案中，试剂盒还包括包含500-1500mg C1-抑制剂的第三组合物，例如其被配制成适于作为弹丸剂施用。

在另一方面，本公开提供了用于本文所述方法中任何一种的组合物。在某些实施方案中，组合物用于以最大的凝块溶解速率和最小的相关出血性副作用治疗具有中风或急性心肌梗塞(AMI)症状的对象。这些组合物包括第一组合物和第二组合物；所述第一组合物包含小于5mg组织纤溶酶原激活物(tPA)，其中所述第一组合物被或被制备好以弹丸剂的剂量方案施用于对象；所述第二组合物包含尿激酶原突变体(mproUK)，其中在施用所述第一组合物后，所述第二组合物被或被制备好以60-120mg/h持续60-90min的剂量方案通过静脉内输注施用于对象；其中在施用第一组合物之前，通过观察中风或AMI的一种或多种症状将对象鉴定为潜在地患有中风或AMI，而不确定中风的原因；和其中以最小的相关出血性副作用实现最大的凝块溶解速率。这些组合物可以包括本文所述的所有特征和成分。

术语“治疗”或“治疗处理”是指向对象施用一种或多种药剂或者在对象的身体上实施医疗程序。术语治疗处理还包括对象可能在接受的一种或多种药剂的剂量或频率的调整(例如，增加或减少)，向对象施用一种或多种新的药剂，或者从对象的治疗计划中移除一种或多种药剂。

如本文所用，“对象”或“患者”是人。

本文使用的“有效量”是足以实现溶栓而不引起显著的出血性或血友病样副作用的量。有效量可以在一个或多个施用、应用或剂量中给予。药物组合物的治疗有效量(即有效剂量)取决于所选择的药物组合物。

血液凝块的“最大溶解速率”，在本文中被定义为这样的血液凝块溶解速率，其至少与利用tPA、proUK或mproUK进行单一疗法可以在最大有效剂量(即，此时通过添加额外的药物无法实现更快的凝块溶解的药物剂量，例如，在最大有效剂量下显示凝块溶解速率的稳定时期)时所达到的血液凝块溶解速率一样快，而没有任何相关的出血性副作用。重要的是要注意，使用单一疗法(例如用tPA或M5)实现的最大溶解速率将导致患者显著的出血，例如，通过大于30％的纤维蛋白原降解水平所示。令人惊奇的是，本发明的治疗方法达到最大溶解速率而无出血性副作用，其可以通过小于30％的纤维蛋白原降解水平所示，这不会与过量出血相关，并且为临床上可接受的。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但在下文描述合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入本文。在发生矛盾的情况下，本说明书(包括定义)将占据主导地位。此外，材料、方法和实施例仅为示例性的而非旨在限制性的。

从以下发明详述和权利要求书中，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。

附图简述

图1A是显示通过tPA在三个剂量(1、2或3μg/ml)下溶解荧光素标记的血浆凝块的曲线图。tPA以饱和剂量溶解50％的血浆凝块所用的时间为60min。图1B是显示在凝块溶解结束时以基线(BL)百分比表示的剩余的纤维蛋白原的柱状图。

图2A是显示通过mproUK(M5)在三种剂量(10、12.5或15μg/ml)下溶解荧光素标记的血浆凝块的曲线图。M5以饱和剂量溶解50％的血浆凝块所用的时间为50min。图2B是显示在凝块溶解结束时以基线(BL)百分比表示的剩余的纤维蛋白原的柱状图。图2C是显示mproUK(M5)溶解荧光素标记的血浆凝块所用的时间不受C1-抑制剂(750μg/ml)影响的曲线图。图2D是显示通过C1-抑制剂(750μg/ml)阻止了由M5引起的纤维蛋白原溶解的柱状图。

图3是显示通过tPA(0.2μg/ml)和M5(6μg/ml)组合(圆形)的最大的凝块溶解速率的曲线图。所述组合诱导的凝块溶解比单独的0.2μg/ml tPA(正方形)或6μg/ml M5(三角形)快得多。结果代表一式三份进行的一项实验。

图4A是显示通过tPA(0.2μg/ml)和M5(6μg/ml)组合(圆形)的凝块溶解的曲线图。所述组合诱导的凝块溶解比单独的0.2μg/ml tPA(正方形)或6μg/ml M5(三角形)快得多。图4B是显示在凝块溶解结束时以基线(BL)纤维蛋白原的百分比表示的剩余的血浆纤维蛋白原的柱状图。结果代表按一式三份进行的10个实验。

图5A是显示通过tPA(0.2μg/ml)和M6(6μg/ml)的组合以及C1-抑制剂(750μg/ml)的最大的凝块溶解速率的曲线图。向组合中加入C1-抑制剂没有抑制溶解，但是它抑制单独tPA引起的溶解。图5B是显示在凝块溶解结束时以基线(BL)纤维蛋白原的百分比表示的剩余的血浆纤维蛋白原的柱状图。C1-抑制剂减弱纤维蛋白原溶解。

图6是显示当与6μg/ml M5组合时，tPA剂量高于0.2μg/ml不再进一步增强凝块溶解速率的曲线图。

图7是显示通过0.2μg/ml tPA和6μg/ml M5(“tPA+M5”)的组合、0.2μg/ml tPA(“tPA 0.2”)、6μg/ml M5(“M5 6”)、15μg/ml M5(“M5 15”)、3μg/ml tPA(“tPA3”)，溶解50％的血浆凝块所需的平均时间的柱状图。数据从多个实验汇总(实验数量显示在每个柱上方)。

图8是显示在不同测试条件下，即：(1)在2ml血浆中；(2)在2ml血浆加C1-抑制剂(500μg/ml)中；和(3)在5ml血浆中；通过0.2μg/ml tPA和6μg/ml M5的组合，在凝块溶解结束时剩余的纤维蛋白原(％BL)的柱状图。血浆体积的增加自然地降低了纤维蛋白原降解(人类对象的血浆体积平均为约3000ml)，因此在体内不太可能需要使用C1-抑制剂，但可用于体外研究以更好地模拟体内条件。

图9是这样的曲线图，其显示在不存在血液凝块的情况下，通过0.2μg/ml tPA和6μg/ml M5的组合，至少3h不存在纤维蛋白原溶解，这表明在体内不存在凝块的情况下该组合也将是无活性的。

图10A是显示大鼠模型中脑内出血后血肿体积的柱状图。在给药后2h通过血红蛋白含量测量血肿体积。在给予C1-抑制剂/M5的动物和给予盐水/盐水的动物之间，没有测定出显著性差异(p＝0.5194)。因为大鼠缺少M5/UK抑制剂，所以将C1-抑制剂包括在内。

图10B是显示大鼠模型中脑内出血后出血体积的组织学测定的柱状图。在给予C1-抑制剂/M5的动物和给予盐水/盐水的动物之间的出血体积没有测定出显著差异(p＝0.6899)。

发明详述

本公开至少部分地基于以下发现：通过施用小剂量组织纤溶酶原激活物(tPA)和低剂量尿激酶原突变体(“pro-UK突变体”或“mproUK”)，例如，包含在尿激酶原的氨基酸位置300处的赖氨酸被组氨酸替换(Lys300→His)的mproUK(本文称为“M5”)的组合，可以以最大的凝块溶解速率实现溶栓以实现增加的血流量，例如在约75min内的心肌梗塞溶栓(TIMI)评分为2或更高，并且没有预期的出血风险。对于中风或急性心肌梗塞患者，溶栓和再灌注所需的时间对于临床结果和生存率至关重要。为使这成为可能，治疗也必须足够安全，以便能够在住院前对患者进行治疗。本文提供了治疗潜在地患有中风或急性心肌梗塞的对象的方法。

这些方法可以用于治疗具有中风或急性心肌梗塞症状的患者，而没有耗时的诊断程序引起的延迟，从而提高这些患者的更好临床结果和存活率的机会。由于可以利用小剂量tPA和低剂量mproUK的组合实现纤维蛋白溶解，与高剂量纤溶酶原激活物方案相关的纤溶酶原的非特异性激活和血友病样副作用可以降低到最低水平，同时仍然实现最大的凝块溶解速率。本文还提供了用于本文所述方法中的包含第一组合物和第二组合物的试剂盒，所述第一组合物包含tPA，且所述第二组合物包含mproUK。

通过蛋白酶纤溶酶(其是纤溶酶原的活化形式)在三个步骤中溶解血液凝块。步骤1：存在于血浆中的纤溶酶原在邻近tPA结合位点的D结构域上的特异性结合位点处与完整的纤维蛋白凝块结合。tPA激活在这种所谓的“三元复合物”中的纤溶酶原，该三元复合物由纤维蛋白、纤溶酶原和tPA组成并引发纤维蛋白溶解。步骤2：纤溶酶在赖氨酸残基之后优先切割纤维蛋白，产生代表新的纤溶酶原结合位点的羧基末端赖氨酸。这些新产生的结合位点之一是由纤维蛋白E结构域中三个C末端赖氨酸组成的高亲和力结合位点。当纤溶酶原结合纤维蛋白E结构域中的该位点时，其经历特殊的构象变化，使其能够通过pro-UK和mproUK的内在催化活性而被活化。步骤3：通过pro-UK/mproUK激活纤溶酶原，伴随着通过纤溶酶将pro-UK/mproUK相互激活为尿激酶(UK)/mUK。然后UK/mUK激活剩余的结合纤维蛋白的纤溶酶原，从而完成纤维蛋白溶解(参见，美国专利第5,055,295号；第5,472,692号；第5,626,841号；第5,759,542号；第7,074,401号；第7,837,992号；第8,187,592号；Pannell,J.Clin.Invest.81:853-859,1988；Zarich,J Am Coll Cardiol 1995；26:374-379；Lee,AJNR Am J Neuroradiol 25:1470-1475,2004)。

本发明人已经发现，如上所述的纤维蛋白溶解步骤如何支持本文所述的新的联合治疗方法。只有tPA可以有效地执行步骤1，因为只有tPA与纤维蛋白结合并与纤溶酶原形成三元复合物，并由完整的纤维蛋白或纤维蛋白片段D特异性地促进。在正常条件下Pro-UK/mproUK不与体内纤维蛋白结合(即它仅在非常高的非特异性剂量下可以与纤维蛋白结合)。因此，步骤2仅可以通过pro-UK/mproUK有效地进行，因为它对当其结合降解的纤维蛋白的纤维蛋白E结构域时形成的纤溶酶原构象具有高的底物亲和力。纤维蛋白片段E对tPA没有影响，tPA不与该结构域结合，并且仅通过proUK/mproUK促进纤溶酶原激活。因此，步骤3也仅由pro-UK/mproUK促进，因为当proUK激活与纤维蛋白E结构域结合的纤溶酶原时，通过纤溶酶将proUK相互激活为UK，UK通过激活剩余的结合纤维蛋白的纤溶酶原来完成溶解(相比之下，tPA未经历活化，因为其一链和双链形式具有相同的活性)。tPA可以执行步骤2和3的唯一方式是，处在与高出血风险相关的高的非特异性剂量。

本发明人已经发现，可以利用小剂量tPA(仅标准100mg剂量的2-5％)加上低剂量mproUK例如M5(单一疗法剂量的40-50％)的组合，以最大的凝块溶解速率并伴有小于约30％(例如，小于约25％或20％)的最小水平的纤维蛋白原降解来实现纤维蛋白溶解。该tPA-mproUK组合以最大溶解速率达到纤维蛋白溶解，该最大溶解速率至少与使用tPA或mproUK的单一疗法在最大剂量下可达到的最大溶解速率相同，但具有低得多的纤维蛋白原降解水平，其为安全和临床可接受的，因为在这些较低水平上不会出现出血风险，这对已知的单一疗法是不可能的。因此，本文所述的本发明方法提供明显优于任何已声称的协同组合的溶栓，其不包括新发现的针对患者的最大的血液凝块溶解速率和最大安全性，即最小的相关出血性副作用的双重益处。

血液凝块的“最大溶解速率”，在本文中被定义为至少与利用最大有效剂量(即通过添加额外的药物不能获得更快的凝块溶解的药物剂量，例如，在最大有效剂量显示凝块溶解速率的稳定时期)的tPA、proUK或mproUK的单一疗法能够达到的血液凝块溶解速率一样快的血液凝块溶解速率。然而，重要的是要注意，使用单一疗法(例如用tPA或M5)实现的最大溶解速率将导致患者显著的出血，例如，如通过大于30％的纤维蛋白原降解水平所示。令人惊奇的是，通过本文所述的新方法实现的“最大安全性”，被定义为小于30％的纤维蛋白原降解，其不会与过量出血相关并且为临床上可接受的。

例如，tPA-mproUK组合可以在少于1h的时间内，例如48、50、55、60、65、70、75、或80min的时间内，溶解至少一个血液凝块，例如多个血液凝块的50％的质量。该组合还允许显著降低使用的剂量，其纤维蛋白特异性更高、更安全和更经济。使用mproUK(例如M5)而不是天然的pro-UK，因为在治疗剂量下mproUK在血浆中更稳定，并保持其纤维蛋白特异性酶原形式，而天然的pro-UK倾向于自发转化为尿激酶，其为可引起出血并发症的非特异性纤溶酶原激活物。这就是为什么pro-UK在欧洲被EMEA否决了市场准入，随后在这些国家也停止了发展。

如以下实施例所示，当不存在血液凝块时在血浆中孵育时，tPA-mproUK组合中使用的非常低的剂量不会引起纤维蛋白原的任何降解，因此预期相同的组合将对凝血或伤口愈合具有很小或无影响。另外，由于M5是酶原并且需要纤维蛋白将其活化，预期即使在出血的情况下，例如在出血性中风期间，其也是安全的。此外，可用作药理学试剂的C1-抑制剂可用于猝灭，例如，在体外进行的测试以及在体内的治疗中，如果需要，纤维蛋白溶解期间可能形成的任何mUK的任何非特异性活性(Pannell，J Thromb Haemost.5(5)：1047-54,2007)。这种C1-抑制剂效应不是UK共享的，而是proUK突变体独有的。

临床上，tPA-mproUK联合治疗可用于治疗具有中风或心脏病发作症状的患者，而不会有因耗时的诊断程序造成的延迟，因治疗中风中的与tPA相关的明显出血风险而导致目前该联合治疗是强制性的。可以在怀疑发病时或在救护车中进行治疗。由于时间对这些患者的生存和临床结果非常重要，联合治疗提供比tPA作为单一疗法更好的疗效和结果，这是目前唯一批准且可用的治疗方案。tPA单一疗法治疗中风的治疗益处仍有争议，最近其获准受到质疑(Sandercock P,Lancet.2014Aug 23；384(9944):660-1)。mproUK优先激活“不良”闭塞凝块中的纤溶酶原，同时避免作用于“良好”伤口密封凝块中的纤溶酶原。因此，打开止血部位的风险很小。相比之下，tPA靶向由完整纤维蛋白组成的部位，如上述步骤1中的纤维蛋白溶解。血浆中的游离纤溶酶原也受到C1-抑制剂作用的保护，因此引起血友病样状态的风险较小。

可以通过例如用于评估血管再通的标准技术来确定本发明方法的最大的凝块溶解速率。例如，可以用类似于心肌梗塞溶栓(TIMI)评分来评估血管闭塞等级，其中TIMI评分为0是完全闭塞，TIMI为1是最小灌注，TIMI为2是部分流量(再通)，TIMI评分为3分是全部流量。根据对梗塞动脉造影剂混浊率的视觉评估，TIMI研究组开发了冠状动脉血流量的分级量表(参见，例如TIMI研究组，The Thrombolysis in Myocardial Infarction(TIMI)trial:phase I findings.N Engl J Med.1984；33:523-530；以及TIMI研究组，Comparisonof invasive and conservative strategies after treatment with intravenoustissue plasminogen activator in acute myocardial infarction:results of theThrombolysis in Myocardial Infarction(TIMI)phase II trial.N Engl J Med.1989；320:618-627，将其通过引用并入本文作为对TIMI分级量表的描述)。

TIMI流量等级已经成为冠状动脉再灌注治疗前后心肌灌注半定量评估以及确定中风治疗的标准。TIMI流量等级2和3均被认为是表明成功再灌注。因此，如本文所用，预期最大的凝块溶解速率与约75min或更短时间内(例如在70、65、60、55、50、45、40、35或30min内)在人对象或患者中达到2或更好的TIMI评分相关联。

“良好”和“不良”血液凝块之间的纤溶酶原构象和区别

在转化为活性纤溶酶之前，纤溶酶原可呈现至少三种不同的构象。第一构象是天然的“闭合”构象，即未结合任何纤维蛋白，并且纤溶酶原以该第一构象存在于血液中。尿激酶可以激活处于该第一构象的纤溶酶原，并且可引起非特异性的出血性素质，即血友病样状态。由于pro-UK在治疗剂量不稳定，易于在治疗浓度转化为尿激酶，因此pro-UK也可引起血友病样副作用。

当与纤维蛋白结合时，纤溶酶原可以采用两个或三个不同的“开放”构象，为区分良好的伤口愈合凝块和不良的闭塞凝块提供依据。这些中的第一个是当纤溶酶原与完整纤维蛋白的D-结构域中的内部赖氨酸结合时产生的纤溶酶原构象。这些中的第二个是当纤溶酶原与纤维蛋白片段E上的三个C-末端赖氨酸结合时出现的纤溶酶原构象，纤维蛋白片段E仅在如上述纤维蛋白溶解步骤2中描述的一些纤维蛋白降解之后暴露。

当止血纤维蛋白形成以密封伤口时，它的作用就像绷带，不会导致对血流的干扰。这种止血液凝块中的完整纤维蛋白仅具有位于D-结构域中的内部纤溶酶原结合位点，其诱导这些纤维蛋白结合构象中的第一个构象。在这种构象中，纤溶酶原易于通过tPA来激活，tPA的纤维蛋白结合位点相邻；但不能通过pro-UK来激活，因为由纤维蛋白E结构域诱导的第二构象导致pro-UK不结合纤维蛋白并具有底物结合。

当在血管中形成血栓时，其妨碍或阻止血液流动，触发从闭塞血管壁局部释放tPA，并导致纤维蛋白降解。纤维蛋白降解在纤维蛋白片段E上暴露新的纤溶酶原结合位点。纤溶酶原结合在纤维蛋白片段E上的这个新的结合位点。Pro-UK优先激活与纤维蛋白片段E结合的纤溶酶原。

利用“良好”和“不良”纤维蛋白凝块之间这一重要区别可以有效地实现溶栓，同时保护密封伤口的止血塞。Pro-UK突变体与pro-UK具有相同的作用方式。

当纤溶酶原结合单个C-末端位点(被认为在纤维蛋白γ链上)时，存在第三种结合纤维蛋白的纤溶酶原构象。

组织纤溶酶原激活物

组织纤溶酶原激活物是一种丝氨酸蛋白酶，其储存在沿血管壁排列的内皮细胞中。当血栓堵塞血管时，tPA从血管壁释放并溶解纤维蛋白凝块。

目前大多数治疗性溶栓治疗是使用组织纤溶酶原激活物(tPA)及其衍生物进行的，但tPA可引起出血性副作用。例如，150mg剂量的组织纤溶酶原激活物(tPA)已经显示出诱导优异的冠状动脉溶栓，但伴随着不可接受的颅内出血发生率，从而迫使采用效果欠佳的100mg剂量(Braunwald,J Amer Coll Cardiol.9:467,1987；Grossbard,J Amer CollCardiol.9:467,1987)。在急性心肌梗塞(AMI)患者的比较临床试验中，经皮冠状动脉介入治疗(PCI)的结果明显优于静脉内施用tPA，尽管PCI费用更昂贵、技术要求高且耗时长。这种临床结果令人惊讶，但可以通过以下tPA特性来解释：(1)tPA的治疗剂量受颅内出血并发症的限制；和(2)tPA的功效被相对高的冠状动脉血栓再形成率破坏，这与凝血酶生成的血液学证据相关(Verheugt,J Am Coll Cardiol 1996,27:766-773；Gurewich,Circulation1993,87:1759-1761；Rapold,Blood 1991,78:1490-1495；Gulba,Lancet 1988,2:97；Gulba,Circulation 1991,83:937-944)。

在缺血性中风中，当以与AMI中使用的剂量相当的剂量施用tPA时，由于颅内出血并发症发生率为20％，需要进一步减少剂量(Hacke,JAMA 1995,274:1017-1025)。在AMI中使用与tPA一起使用的肝素在中风中被排除，因为报告了14-31％的再闭塞率(Alexandrov,Neurology2002,59:862-867；Rubiera,Stroke 2005,36:1452-1456；Saqqur,Stroke2007；38:69-74)。最终结果是，在美国只有约2-5％的缺血性中风患者用tPA治疗(Kleindorfer,Stroke 2008；39:924-928)。

据信tPA诱导的出血主要与修复血管壁中损伤部位所需的止血纤维蛋白的溶解有关，其通常是隐匿和不可预测的，但为tPA剂量依赖性的。如上所述，proUK/M5由于其不同的作用模式而避免了作用于这些部位。

尿激酶原和尿激酶原突变体

尿激酶原(pro-UK)作为溶栓药物不太为人所知，但急性心肌梗塞的3期临床研究已经完成(Michels R,J Thromb Thrombolysis 1995,2:117-124；PRIMI试验研究组。Lancet 1989,1:863-867；Tebbe U,J Am Coll Cardiol 1998,31:487-493)。Pro-UK在这些研究中引起了很少(5％)或没有引起冠状动脉血栓再形成，且没有凝血酶生成的血液学证据(PRIMI Trial Study Group.Lancet 1989,1:863-867；Weaver,J Am Coll Cardiol1994,241:242-1248)。不幸的是，在治疗剂量下，血浆中的pro-UK易于自发激活成其酶形式，双链尿激酶(tcUK)。发生这种情况时，会引发出血风险，因此市场准入被拒绝，在西方放弃了pro-UK的研发。

pro-UK的不稳定性与其相对高的内在催化活性有关。结构功能研究表明，由催化结构域中的氨基酸残基297-313组成的柔性环中的带电残基负责此活性。在柔性环区域中的诱变导致了pro-UK内在活性的调节。具有降低的内在催化活性的示例性pro-UK“柔性环”突变体描述于美国专利第5,472,692号(通过引用整体并入本文)，如Gly299→Ala突变体，Lys300→His突变体(称为“M5”或“M5突变体”)，Lys300→Ala突变体，和Glu301→His突变体。

这些pro-UK“柔性环”突变体之一M5(Lys300→His)，已经在体外和体内都被测试，并且显示出比天然pro-UK更快地溶解血液凝块(Liu et al.,Circulation Research,90:757-763,2002)。单链M5突变体的内在活性比pro-UK低5倍，所以在血液中M5比天然pro-UK更稳定，不太可能自发转化为活性酶形式并引起血友病样副作用(Liu,Biochemistry1996,35:14070-14076)。双链酶形式的mproUK(例如M5)的活性和mproUK(例如M5)的作用模式，与天然pro-UK保持相同(Sun Z,J Biol Chem 1997,272:23818-23823；Liu,Circu.Res.2002,90:757-763)。像M5这样的mproUK拥有另一个优越的特性；它们可以被内源性血浆C1-抑制剂抑制，提供针对非特异性副作用的保护，而不会干扰由mproUK引起的纤维蛋白溶解(Gurewich,J Thrombos Haemost,2006,4:1559-1565；Pannell,J ThrombHaemost,2007,5:1047-1054；Gurewich,Thromb Haemost,2009,102:279-286)。重要的是，诸如M5的mproUK不显示通常与溶栓剂相关的任何出血性副作用，如美国专利第7,074,401号所描述(将其通过引用整体并入本文)。此外，诸如M5的mproUK可以根据美国专利第7,070,958号来合成(将其通过引用整体并入本文)。

预期M5和其他mproUK对于人类给药是安全的，因为：(1)它们基本上是天然的人类蛋白质(与天然pro-UK具有99.8％的相似性)，(2)它们没有抗原性(免疫)反应，和3)在III期临床研究中，来自大肠杆菌的天然存在的人类pro-UK和重组人pro-UK已经被安全地施用于约5,000名患者。

低剂量tPA和mproUK的联合治疗

通过利用tPA和pro-UK对纤溶酶原作用的互补作用机理，本发明人已经证明，利用小剂量tPA(标准100mg剂量的2-5％，例如1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0或4.5mg的弹丸剂)加上mproUK如M5的输注(在40-50％的单一疗法剂量下，例如以60-120ug/ml输注60-90min)的组合，可以达到最大的凝块溶解速率的纤维蛋白溶解，该最大的凝块溶解速率至少与通过利用单独的tPA或mproUK的单一疗法在其最大有效剂量下可达到的最大的凝块溶解速率一样快(图1A-5B)。例如，tPA-mproUK组合可在少于1h(例如48min)内平均溶解血液凝块的50％质量(参见图7，tPa+MF)。尽管单独的tPA和mproUK(M5)以非常高的剂量可以实现类似的溶解时间，例如，3μg/ml tPA，或15μg/mlmproUK(M5)(图7)，但在那些剂量下可以发生纤溶酶原的非特异性活化，以及对于M5约77％的(参见图2B)和对于tPA约80％的(参见图1B)纤维蛋白原降解，并且引起显著的和临床上不可接受的血友病样副作用。

使用诸如M5的mproUK而非天然pro-UK，因为mproUK在血浆中更稳定并保持在酶原形式，而天然pro-UK倾向于自发转化为尿激酶并引起血友病样副作用。因此，通过tPA-mproUK组合使用tPA和mproUK单一疗法剂量的一部分，可以达到最大的凝块溶解速率。

当在没有血液凝块的血浆中孵育时，tPA-mproUK组合不诱导纤维蛋白原的任何降解(图9)，因此预期对体内凝血和伤口愈合没有影响。此外，C1-抑制剂可用于猝灭血浆中mUK(mproUK的酶形式)的任何非特异性活性(图2D和图6)，进一步增加了针对出血并发症的保护作用。

临床上，tPA-mproUK联合治疗可用于治疗具有中风或心脏病发作症状的患者，而没有因耗时的诊断程序引起的延迟。本文提供了通过以下方法治疗具有中风或急性心肌梗塞症状的对象的方法：(a)通过观察一种或多种症状来鉴定潜在地患有中风或急性心肌梗塞的对象，而不确定中风或急性心肌梗塞的根本原因；和(b)向所述对象施用含有5mg或更少tPA的第一组合物的弹丸剂，然后以60-120mg/h的速率输注包含mproUK的第二组合物，输注60-90min。可以在施用第一组合物后约5、10或15min施用第二组合物。以最大溶解速率溶解引起中风或急性心肌梗塞症状的任何血液凝块的量施用第一组合物和第二组合物。第一组合物可包含2-5mg tPA，例如约2mg、约2.5mg、约3mg、约3.5mg、约4mg、约4.5mg、约5mg。可通过静脉内输注来施用包含mproUK(如M5)的第二组合物。可以用约60-120mg/h(例如60-100、70-90或75-85mg/h)的剂量，进行mproUK(如M5)的静脉内输注，持续60、70、80或90min。

本文所述的方法可用于治疗中风。中风可能是缺血性或出血性的。缺血性中风是由阻塞血流的血栓引起的，而出血性中风是由血管破裂引起的。约85％的时间，中风是缺血性的，例如由血液凝块引起，因此易于通过溶栓剂治疗。缺血性中风后再灌注的时机至关重要，因为脑细胞没有氧合血液的时间越长，损失的脑细胞就越多。然而，完全诊断中风的原因是困难且耗时的，但是由于高的出血性副作用风险，准确的诊断对于采用目前可用的溶栓剂进行治疗至关重要。将溶栓剂施用于缺血性中风患者可能是适当的治疗方法，但对出血性中风患者施用相同的溶栓剂将加剧问题并且可能杀死患者。尽管确定诊断需要时间，但医疗领域的技术人员，例如EMT、护士、或医生、或甚至接受最低限度培训的外行人可以容易地确定人表现的中风基本症状(例如突发的单侧麻痹)。

可以使用本文所述的方法，通过施用低剂量tPA的弹丸剂，然后输注mproUK来治疗具有中风症状的对象。组合中非常低的tPA剂量降低潜在的出血风险。由于组合中的tPA是小剂量，并且mproUK可以溶解血栓但避免作用于止血纤维蛋白，所以该组合可用于安全地治疗患有可能的缺血性中风的患者，并且几乎没有加重大脑出血的风险。因此，有可能在临床怀疑诊断的基础上在救护车中开始治疗。

本文所述的方法也可用于治疗心脏病发作，例如急性心肌梗塞。当冠状动脉之一例如被血液凝块阻塞时，发生心脏病发作。心脏病发作后再灌注的时机至关重要，因为心肌没有氧合血液的时间越长，损伤或损失的肌肉细胞越多。目前选择的治疗是通过导管插入术和血管成形术，其需要住院、可用的导管室和准备就绪的工作人员。这延迟了治疗并产生很高的费用。冠状动脉闭塞后的第一个小时被称为“黄金时段”，因为它是如下时间：在该时间中，心肌最大挽救和死亡率最大降低是可能的。由于多次研究显示tPA显著增加导管插入术并发症发生率，普遍放弃在导管插入术之前使用tPA进行预处理以获得时间。

如本文所述，具有心脏病发作症状的对象可以通过施用低剂量tPA的弹丸剂，然后输注诸如M5的mproUK来治疗。经验表明，用pro-UK预处理与导管插入术后并发症无关，因此用该组合的预处理应该具有良好的耐受性，并且还可以减少对于随后进行导管插入术的需要。

C1-抑制剂

C1-抑制剂是104KD丝氨酸蛋白酶抑制剂，正常血浆浓度为约250μg/ml，半衰期为约28h。这种蛋白质的缺乏与称为遗传性血管性水肿的疾病有关。C1-抑制剂早已被临床用于治疗遗传性血管性水肿。市售的C1-抑制剂包括和

纤维蛋白溶解期间产生的活性酶双链UK或mUK最终释放到血浆中，其中纤溶酶原激活成为一种累赘。猝灭该活性需要血浆抑制剂。如美国专利第7,837,992号(通过引用并入本文)所描述，C1-抑制剂的抑制剂复合物出现在酶mUK与人或犬血浆孵育几分钟内。C1-抑制剂在人体中内源性地存在，可以在药理学上进行补充。内源性C1-抑制剂显示在猝灭mUK例如tcM5活性(而不是UK活性)方面非常有效(Gurewich V,J Thrombos Haemost,2006；4:1559-1565；Pannell R,J Thromb Haemost,2007；5:1047-1054；Gurewich,ThrombHaemost,2009；102:279-286)。如美国专利第7,837,992号所示，C1-抑制剂通过抑制mUK可以有效地稳定血浆中的mproUK(如M5)，并允许更高浓度的mproUK(如M5)被耐受，而不会影响纤维蛋白特异性。

本文公开的治疗具有中风或急性心肌梗塞症状的对象的方法还可包括向对象施用包含C1-抑制剂的第三组合物。可将C1-抑制剂以足以在对象血浆中建立这样的C1-抑制剂浓度的量来施用弹丸剂，该浓度在C1-抑制剂的正常生理水平(约250μg/ml)之上2-3倍的范围，即约500-750μg/ml。例如，第三组合物可以包含500-1500mg C1-抑制剂。在一些实施方案中，可以在施用第二组合物之前，将第三组合物施用于对象。在一些实施方案中，可以将第三组合物与第二组合物同时施用于对象。

药物组合物、剂量方案和施用方法

本文提供的药物组合物可以包含特定剂量的tPA和pro-UK突变体如M5作为活性成分。药物组合物的活性成分，例如tPA或mproUK可以被配制成通过静脉内注射进行递送。

配制合适的药物组合物的方法是本领域已知的，参见例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy，第21版，2005；和Drugs and the PharmaceuticalSciences系列书：一系列教科书和专著(a Series of Textbooks and Monographs)”(Dekker,NY)。例如，用于肠胃外施用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节pH。肠胃外制剂可以包封在由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适用于注射的药物组合物可以包括无菌水溶液(其中为水溶性的)、分散体和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且应该是易于注射的程度的流体。它在制备和储存条件下应该是稳定的，并且必须保存防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质及其合适的混合物。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散体的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可以维持合适的流动性。

防止微生物的作用可以通过各种抗细菌和抗真菌剂来实现，所述抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨醇)和氯化钠。无菌注射溶液可以通过在具有上述列举的成分之一或其组合的适当溶剂中并入所需量的活性化合物，需要时然后过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物并入无菌媒介物中制备分散体，所述无菌媒介物含有基本分散介质和上述列举的所需的其它成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生来自其先前无菌过滤的溶液的活性成分以及任何另外的所需成分的粉末。

药物组合物可以与用于施用的说明书一起包含在容器、包装或分配器中。

可以调整剂量方案以提供最佳治疗反应。参见例如，Physicians'DeskReference,第63版,Thomson Reuters,2008年11月30日。例如，治疗化合物的剂量、毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定，例如用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，可以表示为LD50/ED50的比例。表现出高治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用表现出毒性副作用的化合物，但应注意设计将这些化合物靶向受影响组织的部位的递送系统，以便将对未感染细胞的潜在损伤最小化，从而减少副作用。

从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制用于人的一系列剂量。这些化合物的剂量优选位于包括ED50同时具有很少或没有毒性的循环浓度的范围内。根据所用剂型和使用的给药途径，所述剂量可以在该范围内变化。对于本发明方法中使用的任何化合物，最初可以从细胞培养测定估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制能实现包括在细胞培养物中测定的IC50(即，达到症状的最大抑制的50％的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围的剂量。这些信息可用于更精确地确定人体中的有用剂量。血浆水平可以例如通过高效液相色谱来测量。

tPA弹丸剂可以包括2-5mg tPA，例如约2mg、约2.5mg、约3mg、约3.5mg、约4mg、约4.5mg、或约5mg。mproUK(例如M5)的静脉内剂量可以为60-120mg/h(例如60-100、70-90、或75-85mg/h)持续60min、65min、70min、75min、80min、85min、或90min。可以以足以在对象血浆中建立约500-750μg/ml C1-抑制剂浓度的量以弹丸剂来施用C1-抑制剂。例如，C1-抑制剂的弹丸剂可以包括500-1500mg C1-抑制剂。

对于中风或急性心肌梗塞患者，再灌注所需的时间对于存活和临床结果至关重要。这些发现表明，小剂量tPA和M5的组合可以实现更安全和更有效方式的治疗性溶栓。因此，中风或急性心肌梗塞患者可以用tPA和M5的组合进行治疗，而几乎没有或没有延迟。

溶栓的功效由溶解速率定义。然而，临床效用需要将功效除以来自该速率的出血并发症的发生率。使用本文所述的联合治疗，证据表明没有最大的临床效用，因为最佳组合诱导了最大溶解速率而没有明显的纤维蛋白原降解(参见，Pannell et al.,PLOS ONE,DOI:10.1371/journal.pone.0122018，2015年3月26日，将其通过引用整体并入本文)。这产生了极为优异的临床效用指标，事实上它提供可能的最大效用指标，即针对纤溶酶原激活物可能的最大的凝块溶解速率而无副作用。

试剂盒

本文还提供试剂盒，其包括在一个容器中的至少一种包含组织纤溶酶原激活物(tPA)的组合物和在不同的容器中的包含mproUK(例如M5)的另一种组合物。所述试剂盒用于实施本文所述的治疗方法。第一组合物可以被配制成适于作为弹丸剂施用，并且可以包含2-5mg tPA。第二组合物可以被配制成适于静脉内输注。第二组合物可以包含60-120mg(例如，60、65、70、75、80、85或90mg)pro-UK突变体，用于在60-90min的时段内输注。所述试剂盒还可以包括包含C1-抑制剂的第三组合物。第三组合物可以被配制成适于作为弹丸剂施用，并且可以包含约500-1500mg C1-抑制剂。

试剂盒通常包括以下主要元件：包装、包含如上所述的结合组合物的试剂、任选的对照和说明书。包装可以是用于容纳包含组合物的小瓶和用于本文所述方法的说明书的盒状结构。本领域技术人员可以容易地调整该包装以适应个人需要。

本文提供的组合物和试剂盒可以根据上述任何方法(例如，治疗方法)使用。例如，组合物和试剂盒，其含有包含tPA的组合物和包含pro-UK突变体(例如M5突变体)的另一种组合物，可用于治疗由诸如外周坏疽的血栓引起的中风、心脏病发作或其它心血管疾病。本领域技术人员将意识到本文提供的组合物和试剂盒的其它合适用途，并且能够使用用于此类用途的组合物和试剂盒。

实施例

在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制在权利要求中描述的本发明范围。

实施例1.通过tPA/M5引起的体外溶栓的最大的凝块溶解速率

在体外的人血浆环境中，研究了tPA和M5的特异性组合的纤维蛋白溶解和纤维蛋白原溶解作用。

材料

由PxTherapeutics公司(Grenoble，France)从大肠杆菌制备包含在尿激酶原的氨基酸位置300处的赖氨酸被组氨酸替换(Lys300→His)的mproUK(M5)。组织纤溶酶原激活物(tPA)获自Genentech(South San Francisco，CA)。人纤维蛋白原(Kabi，L级)获自意大利米兰的Chromogenix。抑肽酶和异硫氰酸荧光素获自Sigma Chemicals(St.Louis，MO)。凝血酶(ThromboMax，100NIH U/ml)获自Sigma(St Louis，MO)。临床级别的C1-抑制剂获自德国马尔堡的CSL Behring。在实验中使用来自四个供体合并的人类过期的血库血浆。

请注意，各种动物模型对人类pro-UK具有不同的敏感性(参见，例如Gurewich etal.,J.Clin.Invest.,73:1731-1739(1984)的表1，将其通过引用整体并入本文)。因此，动物剂量不能用于确定人的剂量，本文描述的剂量是基于在人体试验中使用各个组分的经验。在人血浆中的体外研究显示，相比针对同样溶解速率的proUK，需要2x的M5。proUK/M5的单一疗法剂量是从3-期研究中获知的，本文所述联合治疗方法中的新发现的小剂量tPA加上低剂量M5是基于该2x因子。

血液凝块溶解实验

在含抑制剂的血浆环境中研究了M5引起的纤维蛋白溶解。在痕量的凝血激酶和荧光纤维蛋白原的存在下，通过用35mM钙再钙化0.2ml合并的血库血浆来制备血液凝块(参见，Dmitry V,J Biol Chem,1996；271:2133-2138)。然后，将血液凝块在37℃下孵育1h，然后在室温下孵育过夜。第二天，将血液凝块置于2ml血库血浆中，然后加入tPA、M5、或tPA和M5的组合。通过在特定时间点取50μl血浆样品并测量荧光发射来监测凝块溶解。样品中的荧光发射表示从血液凝块释放的纤维蛋白降解产物的量。在一些实验中，将血浆体积增加至5ml，并加入未标记的纤维蛋白原，以补足荧光纤维蛋白原的稀释液。在这些实验中，目测确定血液凝块溶解的结束。

每次血液凝块溶解实验按一式三份进行。用Graph Pad Prism准备图表，并进行统计分析。

将溶解曲线绘制为血液凝块随时间变化的溶解百分比。100％的点是从最高读数的平均值得到的。通过减去血浆显示的荧光量(约15％的全信号)，在开始时得到基线读数以获得零点。从溶解图确定每个实验条件下50％溶解的时间，并将其用作主要终点。

测定血液凝块溶解后剩余的纤维蛋白原

血液凝块溶解完成后，得到最终的血浆样品(1.0ml)，用于测定剩余的纤维蛋白原。将抑肽酶(200KIU/ml)加入到样品中，以防止进一步的蛋白水解。将剩余的纤维蛋白原记录为基线(BL)纤维蛋白原的百分比。

将纤维蛋白原测量为凝血酶可凝结蛋白。用等量的磷酸盐缓冲盐水稀释血浆样品后，加入200μl凝血酶(1,000NIH单位/ml溶液)。将溶液轻轻混合，并在37℃下孵育1h，然后在室温下孵育过夜。第二天早晨，将每个血液凝块缠绕到一个细的长柄的塑料移液管尖端(其上粘附了凝胶)上，并且血清含量通过针对试管壁，然后是针对纸巾的压力表示。然后将移液管柄上的白色纤维蛋白置于至少5ml盐水中至少1h，以允许任何剩余的血清蛋白扩散。然后将纤维蛋白从尖端剥离并置于1ml 5％的NaOH中，煮沸1min，然后保持在室温直到所有纤维蛋白进入溶液。在280nm处用分光光度法测量溶液中的蛋白质。

通过单独的tPA或M5测定最短溶解时间

如上所述，在1、2或3μg/ml tPA存在下，进行血液凝块溶解实验。将溶解曲线绘制为血液凝块随时间变化的溶解百分比，并从溶解曲线确定每个实验条件下溶解50％的血液凝块所用的时间。溶解的最短时间(可以由其确定最大的凝块溶解速率)被定义为这样的时间，在该时间下不再有进一步的剂量依赖性的溶解时间的缩短。代表性实验的结果示于图1A，当使用3μg/ml tPA时，发现通过tPA溶解50％的血液凝块所用的最短时间为60min。因此，在1h时最大的凝块溶解率为50％的溶解。

图1B显示了每个测试的tPA剂量在溶解结束时19％-45％范围的基线水平的剩余纤维蛋白原的百分比。因此，单独的tPA引起55％-81％的纤维蛋白原降解。

对于M5，如上所述在10、12.5、15μg/ml M5存在下，进行血液凝块溶解实验。当使用15μg/ml mproUK时，通过M5溶解50％的血液凝块所用的最短时间被确定为50min(图2A)。因此，在50min时最大的凝块溶解速率为50％的凝块溶解。

针对每个M5剂量，在溶解结束时25％-55％范围的基线水平的剩余纤维蛋白原的百分比示于图2B。因此，单独的M5引起45％-75％的纤维蛋白原降解。

C1-抑制剂对M5引起的纤维蛋白原溶解的影响

在凝块溶解实验中，为了防止纤维蛋白原溶解，向血浆中加入750μg/ml C1-抑制剂，然后加入10、12.5、15μg/ml M5。750μg/ml C1-抑制剂的存在不影响M5溶解50％的血液凝块所用的时间，仍然是50min(图2C)。然而，如图2D所示，在C1-抑制剂存在下发生少量纤维蛋白原降解。

对于tPA，不再重复C1-抑制剂实验，因为已经显示C1-抑制剂通过tPA抑制血液凝块溶解(Tomasi S,PLos One.,2011；6:e21999)。

小剂量tPA和低剂量M5组合产生的最大的凝块溶解速率

为了确定在组合使用时达到最短溶解时间(和最大的凝块溶解速率)所需的最低剂量的tPA和M5，使用tPA和M5的各种组合以及比例进行血液凝块溶解实验。当组合使用以持续达到最大的凝块溶解速率时，最低剂量的tPA和mproUK被确定为0.2μg/ml tPA和6μg/ml M5。这些剂量对应于单独用于单一疗法时实现最短溶解时间所需的6％的tPA剂量加上实现最短溶解时间所需的40％的M5剂量。图3显示代表性凝块溶解实验的结果，其中通过0.2μg/ml tPA和6μg/ml M5组合来溶解50％的血液凝块所用的时间为53min，而单独使用6μg/ml M5来溶解50％的血液凝块的时间为135min，单独使用0.2μg/ml tPA来溶解50％的血液凝块的时间为225min。这些结果表明，小剂量tPA，例如0.2μg/ml，通过M5大大缩短了凝块溶解时间。该观察结果与在引发纤维蛋白溶解中的tPA功能一致。

使用组合(0.2μg/ml tPA+6μg/ml M5)(圆形)的10个代表性凝块溶解实验的结果示于图4A，其诱导约75min的平均50％溶解的时间。在该剂量的单独M5(三角形)下，溶解时间为135min，单独tPA(正方形)诱导的溶解时间为225min。该发现表明，小剂量tPA导致由M5引起的溶解缩短约45％。图4B显示溶解结束时以基线(BL)纤维蛋白原的百分比表示的血浆纤维蛋白原。所有实验按一式三份进行。

为了测试在组合中tPA的功能是否限于纤维蛋白溶解的起始，使用四种tPA-M5组合进行血液凝块溶解实验。每种tPA-M5组合包括固定剂量的6μg/ml M5和选自0.2、0.6、1.0和3.0μg/ml的不同tPA剂量。对于所有测试的四种组合，用于溶解50％的血液凝块的时间为约48-60min，并且高于0.2μg/ml的tPA剂量不会进一步缩短溶解50％的血液凝块所需的时间(图6)。这些发现与组合中tPA的功能是一致的，其对于起始纤维蛋白溶解是必不可少的，但不会引发超过起始的纤维蛋白溶解。

将来自多个血液凝块实验的在体外溶解50％的血液凝块所用的平均时间进行列表并比较。图7显示，通过0.2μg/ml tPA加上6μg/ml M5的组合溶解50％的血液凝块所用的平均时间为48(±2.5)min(n＝10)；通过单独的0.2μg/ml tPA溶解50％的血液凝块所用的时间为156(±5.3)min(n＝5)；对于单独的6μg/ml M5，其为118(±7.2)min(n＝7)；对于单独的15μg/ml M5，其为48(±1.6)min(n＝9)；对于单独的3μg/ml tPA，其为55(±5)min(n＝6)。通过0.2μg/ml tPA加上6μg/ml M5的组合溶解50％的血液凝块所用的时间显著小于采用单独的0.2μg/ml tPA或单独的6μg/ml M5进行单一疗法所用的时间(图7)。尽管单独的tPA和mproUK可以在非常高的剂量(例如3μg/ml tPA，或15μg/ml M5)下实现类似的凝血溶解时间(图7)，但是在这些剂量下可能发生纤溶酶原的非特异性活化，并导致血友病样副作用。

体积和C1-抑制剂对tPA和M5组合引起的纤维蛋白原溶解的影响

纤维蛋白溶解期间，mproUK被纤溶酶激活并转化为mUK，然后可以扩散到血浆中。将蛋白质水解限制在凝块上，成为血浆抑制剂例如C1-抑制剂的功能。在试管中，相对于体内的血浆体积，体外有限的血浆体积可能是有影响的。因此，在三个条件下进行凝块溶解实验：(1)2ml对照血浆体积，(2)5ml增加的血浆体积，(3)2ml血浆和500μg/ml C1-抑制剂。将未标记的血液凝块用于这些实验，并且在所有三个测试条件下测定的用于溶解100％的血液凝块的时间为75-80min。在标准的2ml血浆体积中，tPA-M5组合降解了70％的纤维蛋白原，反映了纤溶酶的快速tcM5产生率(图8)。当加入C1-抑制剂时，纤维蛋白原溶解降低至45％，剩余的纤维蛋白原为55％(图8)。在5ml血浆体积中观察到类似的效果，可能反映了在当时的凝块环境中tcM5的稀释(图8)。该体积效应表明，tPA-M5组合引起的纤维蛋白原溶解可在体内进一步减弱，其中血浆体积与凝块的比值相当大。

与图2D相比时C1-抑制剂的更适度作用与相比M5单一疗法由tPA-M5组合诱导的更快的纤维蛋白依赖性纤溶酶生成有关。通过其他研究证实，与C1-抑制剂通过单独的M5抑制纤维蛋白原溶解的能力相比，C1-抑制剂通过tPA-M5组合抑制纤维蛋白原溶解的能力降低。C1-抑制剂是相对缓慢的抑制剂，因此不太能猝灭由tPA-M5组合实现的更快速的纤维蛋白溶解中更快速产生的tcM5。可能需要更高浓度的C1-抑制剂来充分猝灭由tPA-M5组合产生的tcM5。

代表性凝块溶解实验的结果示于图5A，除了C1-抑制剂之外，还使用组合(0.2μg/ml tPA+6μg/ml M5)(圆形)。加入活化剂30min后，加入C1-抑制剂(750μg/ml)。如图5A所示，这不抑制溶解(圆形)，其平均缩短为约30min，但抑制单独的tPA引起的溶解(正方形)。图5B显示溶解结束时表示为基线(BL)纤维蛋白原的百分比的血浆纤维蛋白原。如图5B所示，C1-抑制剂减弱纤维蛋白原溶解。所有实验按一式三份进行。

在没有凝块存在下由tPA-M5组合引起的纤维蛋白原溶解

为了测试血液凝块不存在时tPA-M5组合对纤维蛋白原溶解的影响，将0.2μg/mltPA加上6μg/ml M5的组合与血浆在37℃温育，并在2-5h后取样用于纤维蛋白原测定。如图9所示，至少3h没有纤维蛋白原溶解，远远超过治疗性溶栓的持续时间。这些发现表明，由tPA-M5组合诱导的纤溶酶生成是纤维蛋白依赖性的，并且在没有血液凝块存在下，该纤维蛋白溶解组合不诱导纤溶酶原激活。

实施例2.通过tPA和M5组合进行体内溶栓

用戊巴比妥钠麻醉重量为10-15公斤的雄性杂种犬，并维持呼吸室空气。由1ml天然的全犬血形成血液凝块(如美国专利第7,074,401号所述)，向其加入放射性标记的纤维蛋白原(1.9μCi，0.75mCi/mg蛋白)和凝血酶(10单位)。20min后，将凝块用盐水洗涤3次，然后切成小块(约1mm³)并通过16G的针注入股静脉。15min后，从对侧股静脉的套管获得血液样本，用于测量基线放射性。

将犬分为四组注射：(1)盐水，(2)2-5mg tPA弹丸剂，(3)静脉内输注M5(20μg/kg/min)持续60min，或(4)2-5mg tPA弹丸剂，然后静脉内输注M5(20μg/kg/min)持续60min。在输注期间的间隔获得血液样本，并测量放射性和纤维蛋白原。在四组之间确定用于溶解血液凝块的时间，并进行比较。

实施例3.脑内出血(ICH)的大鼠模型中C1-抑制剂和M5的表征

本研究的目的是研究M5对脑内出血(ICH)体积的影响。

使用20只成年雄性Sprague-Dawley大鼠进行研究。随机选择用于手术日的大鼠。通过尾标记给予大鼠独特的识别号码。在紧邻手术开始之前，对动物进行头孢唑啉钠腹腔内注射(40mg/kg；Hospira101C049)和丁丙诺啡皮下注射(1mg/kg；Reckitt Benckiser，219202)。虽然在异氟烷麻醉(1.5％-2％)下的大鼠在一氧化二氮/氧气混合物(2：1)内自发呼吸，但钻了一个小钻孔，并将30G的10μL显微注射针(Hamilton，700系列)慢慢地降至在距离前囟的下列坐标处的右侧纹状体：前面0.0mm、侧面3mm和深6mm。在3min时间内，注入含有0.45U胶原酶VII-S(Sigma，St.Louis，MO)的3μL盐水。将针放置在适当位置2min，然后历经5min缓慢移除。之后，将头皮缝合成闭合，使大鼠恢复。对于每只大鼠，整个手术过程持续约20min。用加热垫(37±1℃)维持动物体温。

在给药前配制C1抑制剂和测试物(M5)。在日常使用过程中测试溶液保持在冰上。剩余的未使用的溶液保持在-20℃。在ICH后15min以4mL/kg开始，在以4mL/kg(IV)弹丸注射之后，立即通过静脉内输注(历经30min)对动物给药。在输注开始后2h，在100％N₂O吸入下，在异氟烷下人道地地杀死动物。移出脑，并根据2-mm大鼠脑基质进行切片。在标准条件下，用数码相机拍摄脑薄片的图像。由ImageJ软件(可在rsb.info.nih.gov/ij在线获取)计算血肿大小。

出血诱导2h后，在深度(5％)异氟烷麻醉(100％N2O)下处死大鼠。移出脑并置于在冰上的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。将脑切成7个切片，每个切片为2mm，并拍照以对血肿进行视觉评估。没有对各个切片进行组织学评估。将血红蛋白含量确定为出血体积的定量测量。将出血侧与正常侧分离(包括所有7个切片)，并置于1.5mL冷PBS中。匀浆30秒(用PolytronPT2100手动操作)后，应用超声1min以溶解红细胞膜。离心30min(13000rpm，4℃)后，向800μL Drabkins试剂(Sigma，St.Louis，MO)中加入200μL上清液，并在室温下静置10min。使用光度计，在540nm处测定吸收率，并根据标准曲线计算脑损伤一半的出血性血容量。标准曲线是通过使用来自年龄和体重匹配(一般研究对象)的八个初始脑半球产生的。这些初始脑半球掺有0到192μL的渐增体积的来自相同个体的合并的血液。通过方差分析(ANOVA)评估统计学显著性。

从之前在Biotrofix上优化的工作，确定所测量的出血大小的时间(出血诱导后2h)。

在ICH后15min，用媒介物(盐水)(4ml/kg)的弹丸剂(4ml/kg)，随后立即用30min的媒介物输注，或用C1-抑制剂(200U/4ml/kg)的弹丸剂，随后立即用30min的M5(10mg/4ml/kg)输注，如所述给药大鼠。

临床观察和生存

本研究的所有动物在研究期间幸存下来。动物#24不包括在分析中，因为在该动物中引起的出血不足。

出血量的组织学测定

在ICH的大鼠模型中研究了在C1-抑制剂弹丸注射之后(立即)施用M5。在该模型中，通过将胶原酶注射到大脑的右侧纹状体中诱导脑内出血。损伤后15min，在如上所述弹丸注射后，立即通过30min静脉内输注施用M5(剂量为10mg/4ml/kg)或媒介物。在用C1inh/M5给药的动物和用盐水/盐水给药的动物之间未测定出显著差异(p＝0.6899)(图1)。

直接血肿体积

与出血体积的组织学测定一样，在用C1inh/M5给药的动物和用盐水/盐水给药的动物之间未测定出显著差异(p＝0.5194)(图10A和10B)。图10A是显示大鼠模型中脑内出血后血肿体积的柱状图。通过立体定向注射胶原酶诱导脑内出血。在损伤后15min，利用C1-抑制剂的弹丸注射，随后立即利用30min的M5(剂量为10mg/4ml/kg)输注给药大鼠。在给药后2h，通过血红蛋白含量测量血肿体积。在用C1inh/M5给药的动物和用盐水/盐水给药的动物之间未测定出显著差异(p＝0.5194)。

图10B是显示大鼠模型中脑内出血后出血体积的组织学测定的柱状图。通过立体定向注射胶原酶诱导脑内出血。在损伤后15min，利用C1-抑制剂的弹丸注射，随后立即利用30min的M5(剂量为10mg/4ml/kg)输注给药大鼠。在用C1inh/M5给药的动物和用盐水/盐水给药的动物之间的出血体积未测定出显著差异(p＝0.6899)。

在这种胶原酶引起的脑内出血的大鼠模型中，相对于盐水/盐水处理的动物，ICH诱导后15min施用C1-抑制剂/M5在血肿体积或出血大小方面没有差异。因此，M5在该中风模型中并没有引起或增加出血，因此应该可以安全地用于出血事件如出血性中风。

实施例4.tPA和M5组合的临床试验

将年龄为18-35岁(包含)，体重至少为60公斤，身体质量指数(BMI)为18.5-25kg/m²(包含)的健康男性对象登记至本临床试验中。在筛查和研究的第1天，对象具有正常的内源性C1-抑制剂，α2-抗纤溶酶和纤维蛋白原水平，针对HIV、HBsAg和HCV的阴性血清学，以及针对酒精和滥用药物的阴性检测。对象不能有临床上的显著异常。

如果对象符合以下一个或多个标准，则不包括该对象：(1)对象具有影响止血或凝血途径或与增加的出血倾向相关的已知或怀疑的遗传性、先天性或获得性疾病或病况；(2)对象有合理的机会发展临床上显著的出血事件或这样的出血事件，其可能在研究期间相当多的时间未被检测到，例如，对象(a)在预期给药日的近三个月内经历了大的(内部)手术或创伤，(b)具有肠或脑血管畸形，或(c)在预期给药日的两周内参与高撞击性接触运动，例如自由搏击；(3)在给药前，对象接受了本方案不允许的任何全身吸收性药物或物质(包括处方、非处方药或其他补救措施)，而没有经历该产品的消除半衰期的至少7倍的清除期；(4)对象在给药三个月内以任何形式吸烟，或曾经平均每天吸烟超过5支(或同等)；(5)对象在施用日的前一年接受了血液或血浆衍生物；(6)给药前3个月，对象已经失去当地献血服务(i.c.Sanquin)的限制之外的血液或血浆；(7)对象对任何研究材料或相关化合物具有已知的超敏反应；(8)对象具有严重的超敏反应史或严重反应的过敏史；(9)对象有滥用药物的历史，包括咖啡因、烟草和酒精；(10)对象患有病况或表现出调查人员认为可能危及对象的健康或福祉、或研究成果的科学完整性的态度；(11)对象在精神上或法律上无行为能力提供知情同意书。

入选的对象被随机分配到以下治疗组之一：

(1)注射2.5mg的tPA弹丸剂，然后以约80mg/h(单一疗法剂量的50％)静脉内输注mproUK(例如M5)持续60-90min；

(2)注射2.5mg的tPA弹丸剂，然后静脉内输注安慰剂持续60-90min；

(3)注射安慰剂弹丸剂，然后以约160mg/h静脉内输注mproUK(例如M5)持续60-90min；或

(4)注射2.5mg的tPA弹丸剂，然后注射C1-抑制剂的弹丸剂(例如1000EU(2小瓶))，并以约80mg/h(单一疗法剂量的50％)静脉内输注mproUK(例如M5)持续60-90min。

mproUK的剂量范围为60-120mg/h。C1-抑制剂的弹丸剂由25-100U/kg的组成(基于对象的体重)。当出现纤溶酶血症或收集足够的数据时，本研究结束。

基于本研究收集的数据，评估了tPA和mproUK(如M5)组合的总体安全性和耐受性。评估了小剂量tPA对mproUK诱导的凝血变化的影响。评估了单剂量C1-抑制剂对tPA-mproUK组合的总体安全性和耐受性的影响，及其对tPA-mproUK诱导的凝血变化的影响。

其他实施方案

应当理解，尽管已经结合其发明详述描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制由所附权利要求的范围限定的本发明范围。其他的方面、优点和修改也在所附权利要求的范围内。

Claims (38)

1.以最大的血液凝块溶解速率和最小的相关出血性副作用治疗具有中风或急性心肌梗塞(AMI)症状的对象的方法，所述方法包括：

(a)通过观察中风或AMI的一种或多种症状来鉴定潜在地患有中风或AMI的对象，而不确定所述中风的原因；和

(b)向所述对象施用包含小于5mg组织纤溶酶原激活物(tPA)的第一组合物的弹丸剂，然后以60-120mg的速率静脉内输注包含尿激酶原突变体(mproUK)的第二组合物，输注60-90min；

其中以最小的相关出血性副作用实现最大的凝块溶解速率。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述对象具有中风症状。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述最小的相关出血性副作用被确定为所述对象血液中纤维蛋白原降解的水平低于约30％。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述最大的凝块溶解速率被表示为通过2或更高的心肌梗塞溶栓(TIMI)评分来实现的。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述最大的凝块溶解速率被表示为通过在75min内实现的溶解所述对象中至少一个凝块的约50％的质量来实现的。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述尿激酶原突变体包含在尿激酶原的氨基酸位置300处的赖氨酸被组氨酸的替换(Lys300→His)。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述弹丸剂包含2-4.5mg tPA。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述弹丸剂包含2-4.0mg tPA。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述弹丸剂包含2mg tPA。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中以60-90mg/h的速率静脉内输注mproUK60-90min来施用所述第二组合物。

11.如权利要求10所述的方法，其中以60-80mg/h的速率静脉内输注mproUK 60min来施用所述第二组合物。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在施用所述第一组合物后5min内开始施用所述第二组合物。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述第一组合物和所述第二组合物在少于1h内共同溶解所述对象中至少一个血液凝块的50％的质量。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其还包括向所述对象施用包含C1-抑制剂的弹丸剂的第三组合物。

15.如权利要求14所述的方法，其中在施用所述第二组合物之前向所述对象施用所述第三组合物。

16.如权利要求14所述的方法，其中在与所述第二组合物大约相同的时间向所述对象施用所述第三组合物。

17.如权利要求14所述的方法，其中以足以建立对象血液中约500-750μg/ml的C1-抑制剂浓度的量施用所述第三组合物。

18.如权利要求14所述的方法，其中所述第三组合物包含500-1500mg C1-抑制剂的弹丸剂。

19.如权利要求14所述的方法，其中当与通过单独的tPA或尿激酶原进行的单一疗法相比时，在所述C1-抑制剂存在下，所述第一组合物和所述第二组合物共同溶解所述血液凝块并伴有小于30％的纤维蛋白原降解。

20.试剂盒，其包括：

在第一容器中的第一组合物，其包含2-5mg组织纤溶酶原激活物(tPA)；和

在第二容器中的第二组合物，其包含60-120mg尿激酶原突变体(mproUK)，所述尿激酶原突变体包含在尿激酶原的氨基酸位置300处的赖氨酸被组氨酸的替换(Lys300→His)。

21.如权利要求20所述的试剂盒，其中所述第一组合物被配制成适于作为弹丸剂施用。

22.如权利要求20所述的试剂盒，其中所述第二组合物被配制成适于静脉内输注。

23.如权利要求20所述的试剂盒，其还包括包含500-1500mg C1-抑制剂的第三组合物。

24.如权利要求23所述的试剂盒，其中所述第三组合物被配制成适于作为弹丸剂施用。

25.组合物，其用于以最大的凝块溶解速率和最小的相关出血性副作用治疗具有中风或急性心肌梗塞(AMI)症状的对象，所述组合物包含：

第一组合物，其包含小于5mg组织纤溶酶原激活物(tPA)，其中所述第一组合物被或被制备好以弹丸剂的剂量方案施用于对象；和

第二组合物，其包含尿激酶原突变体(mproUK)，其中在施用所述第一组合物后，所述第二组合物被或被制备好以60-120mg/h持续60-90min的剂量方案通过静脉内输注施用于对象；

其中在施用所述第一组合物之前，通过观察中风或AMI的一种或多种症状将所述对象鉴定为潜在地患有中风或AMI，而不确定所述中风的原因；和

其中以最小的相关出血性副作用实现最大的凝块溶解速率。

26.如权利要求25所述的组合物，其用于治疗具有中风症状的对象。

27.如权利要求25或26所述的组合物，其中所述最小的相关出血性副作用被确定为所述对象血液中纤维蛋白原降解的水平低于约30％。

28.如权利要求25或26所述的组合物，其中所述最大的凝块溶解速率被表示为通过2或更高的心肌梗塞溶栓(TIMI)评分来实现的。

29.如权利要求25或26所述的组合物，其中所述最大的凝块溶解速率被表示为通过在75min内实现的溶解所述对象中至少一个凝块的约50％的质量来实现的。

30.如权利要求25-29中任一项所述的组合物，其中所述尿激酶原突变体包含在尿激酶原的氨基酸位置300处的赖氨酸被组氨酸的替换(Lys300→His)。

31.如权利要求25-30中任一项所述的组合物，其中所述弹丸剂包含2-4.5mg tPA。

32.如权利要求25-30中任一项所述的组合物，其中所述弹丸剂包含2-4.0mg tPA。

33.如权利要求32所述的组合物，其中所述弹丸剂包含2mg tPA。

34.如权利要求25-33中任一项所述的组合物，其中所述第二组合物被制备为以60-90mg/h的速率静脉内输注mproUK 60-90min来施用。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述第二组合物被制备为以60-80mg/h的速率静脉内输注mproUK 60min来施用。

36.如权利要求25-35中任一项所述的组合物，其还包含含有C1-抑制剂的弹丸剂的第三组合物。

37.如权利要求36所述的组合物，其中所述第三组合物包含500-1500mg C1-抑制剂的弹丸剂。

38.用于权利要求1-19的方法中的组合物。