JP2017533961A - 安全かつ効果的な血栓溶解（Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ）のための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、安全かつ効果的な血栓溶解、例えば、潜在的な脳卒中または急性心筋梗塞（「ＡＭＩ」）の療法における、方法、組成物、およびキットを提供する。

Description

本発明は、安全かつ効果的な血栓溶解（Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ）のための方法および組成物に関する。

背景
血栓症は、血管内に血栓（血栓（ｔｈｒｏｍｂｕｓ））が生じ、その血栓が、循環系を通る血流を妨げる場合に発症する。血管が傷つけられると、身体は、血小板とフィブリンを使って血栓を形成して傷ついた血管をふさぎ、失血を防ぐ。この過程を止血と呼ぶ。血管が傷ついていない場合であっても、ある状況の下で、体内に血栓が生じることがある。血栓は、主として、凝集した血小板と架橋フィブリンのメッシュとからなり、フィブリンは、血液中のフィブリノーゲンの天然高分子である。血栓が、組織への血流を減少させるほど大きい場合、低酸素症または無酸素症を発症し、組織の損傷または組織の壊死につながる場合がある。動脈系の場所、すなわち、心臓、脳、または脚、に依存して、血栓は、心臓発作、脳卒中、または末梢性壊疽を誘発し得る。静脈循環において、同様の過程が、血栓静脈炎（深部静脈血栓症）または肺塞栓症の原因となり得る。同時に、これらの心血管系疾患は、先進諸国において、主要な死因および身体障害の原因となっている。

血栓溶解は、たいていの場合、血栓溶解薬を使用して、疾病を引き起こしている血栓を溶解し、血流を回復させることを必要とする。血栓溶解薬、例えば、現在用いられているｔＰＡおよびその誘導体は、プロ酵素であるプラスミノーゲンを活性化してプロテアーゼであるプラスミンにすることによって機能し、このプラスミンが、血栓中のフィブリンメッシュを分解して血栓を可溶化し、その結果、閉塞した血管を通る血流を回復させる。しかしながら、現在の血栓溶解薬は、傷口をふさぐ止血フィブリンの分解も引き起こし、また、血漿中に、３種の凝固因子、すなわちフィブリノーゲン、第５因子、および第７因子（血友病因子）、を分解するプラスミンも生じさせる。よって、現在の血栓溶解療法は、血友病様の副作用による出血または止血フィブリンの分解による出血を生じさせるリスクを抱えている。このことによって、治療に対する適格患者の数に重大な制約が課され、血栓溶解薬の使用可能用量が制限されている。その結果、脳卒中患者のうち治療を受けるのはわずか約５％だけであり、この治療の有効性は限定的である。

脳卒中は、脳内の血栓、または脳内の出血血管のいずれかによって引き起こされ得る。しかしながら、脳卒中の特異的原因を適切に診断するためには、ＣＴスキャンまたはＭＲＩが必要であり、これらがすぐに利用できない場合には、治療が遅れる可能性がある。このような適切な診断がない場合、組織プラスミノーゲン活性化因子（「ｔＰＡ」）などの血栓溶解剤の投与は、非常に危険である可能性がある。仮に、偶然、原因が血栓ではなく出血であった場合、脳出血を起こしている患者へのｔＰＡまたは他の血栓溶解性薬剤の投与は、致命的な結果となり得る。

概要
本開示は、少なくとも部分的には、ｔＰＡとプロウロキナーゼ変異体（「ｐｒｏＵＫ変異体」または「ｍｐｒｏＵＫ」）の特異性が異質で異なるということが、それぞれを少ない用量で併用すると、例えば、脳卒中（ｓｔｏｋｅ）または急性心筋梗塞（「ＡＭＩ」）の治療において、どちらか一方を単独で（単剤療法）、高用量（最大の血栓溶解速度が得られるが、出血性合併症のリスクが高い）で用いた場合に可能な速さと安全性に比べて、より速く、より安全な（すなわち、より特異的で、出血性合併症の発生率がより低い）血栓溶解が引き起こすことを意味する、という発見に基づく。

ＭｐｒｏＵＫは、プロウロキナーゼの３００番目のアミン酸位置における、リジンからヒスチジンへの置換（Ｌｙｓ３００→Ｈｉｓ）を含んでいてもよく、本明細書において「Ｍ５」と呼ばれる。ｍｐｒｏＵＫは、ｐｒｏＵＫと同様に、プロ酵素、すなわち、活性酵素の不活性な前駆体である。ｍｐｒｏＵＫは、その酵素形態である変異ウロキナーゼまたはｍＵＫが、ウロキナーゼ（ＵＫ）とは異なり、血漿インヒビター、すなわちＣ１インヒビターによって阻害されるという点でｐｒｏＵＫとは異なり、このことが、必要な用量がより低いことに加えて、ｐｒｏ−ＵＫで見られる出血性の副作用（これは、ＵＫに起因し、血漿中には、ＵＫに対する十分な量のインヒビター（プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１、別名ＰＡＩ−１）が存在しない）の低減を助長する。

脳卒中またはＡＭＩの患者にとって、血栓溶解および再灌流に要する時間は、臨床成績および生存率に重大な意味がある。このことは、治療には、予備的な診断試験を行うことなく、病院外で行うのに十分な安全性がなければならないことを意味する。しかしながら、これは、本明細書に記載されている新たな方法による場合のように、出血性のリスクが大幅に減少しているか、出血性のリスクが解消している場合にのみ可能であり、前記した本明細書に記載されている新たな方法には、低用量のｔＰＡ（例えば、５．０ｍｇ未満のボーラス、例えば、４．５ｍｇ以下、４．０ｍｇ以下、３．５ｍｇ以下、３．０ｍｇ以下、２．５ｍｇ以下、または２．０ｍｇ以下のボーラス）と、低用量のｍｐｒｏＵＫ（例えば、６０〜９０分間（例えば、６０分間、７０分間、８０分間、または９０分間）にわたる、６０〜１２０ｍｇ／時の速度での注入、例えば、６０〜９０ｍｇ／時、例えば、６０ｍｇ／時、６５ｍｇ／時、７０ｍｇ／時、７５ｍｇ／時、８０ｍｇ／時、８５ｍｇ／時、または９０ｍｇ／時の速度での注入）との併用投与が含まれる。

所与の患者において、内因性のＣ１インヒビター濃度が不十分である場合、Ｃ１インヒビターを、新たな方法において、有効量のＣ１インヒビター、例えば、ＣＩＮＲＹＺＥ（登録商標）、ＣＥＴＯＲ（登録商標）、ＢＥＲＩＮＥＲＴ（登録商標）、およびＲＵＣＯＮＥＳＴ（登録商標）などの市販のＣ１インヒビターを投与することによって補うことができる。Ｃ１インヒビターは、ｍｐｒｏＵＫから変異ＵＫへの何らかの程度の変換が起こる場合に備える追加的な予防措置であるが、必要とされるｍｐｒｏＵＫが低用量であること、およびＣ１インヒビターが急性期反応物質であり、心臓発作または脳卒中の直後に身体によって自発的に上昇することから、Ｃ１インヒビターは必須ではないことがあり得る。

第１の態様において、本発明は、対象の、例えば、脳卒中または急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の症状があるヒト患者の、付随する出血性副作用が最小であると同時に、血栓溶解速度が最大である処置方法を提供し、該方法は、（ａ）脳卒中の原因を決定することなしに、脳卒中またはＡＭＩの１つまたは複数の症状を観察することによって、脳卒中またはＡＭＩを起こしている可能性がある対象を特定すること、および（ｂ）小用量、すなわち、５ｍｇ未満の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）を含有する、例えば、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、３．５ｍｇ、４．０ｍｇ、または４．５ｍｇのｔＰＡを含有する第１の組成物のボーラスを対象に投与し、続いて、低用量のプロウロキナーゼ変異体（ｍｐｒｏＵＫ）を含有する第２の組成物を、６０〜９０分間にわたり、例えば、６０分間、６５分間、７０分間、７５分間、８０分間、８５分間、または９０分間にわたり、６０〜１２０ｍｇ／時の低投与速度で、例えば、６０ｍｇ／時、７０ｍｇ／時、７５ｍｇ／時、８０ｍｇ／時、８５ｍｇ／時、９０ｍｇ／時、１００ｍｇ／時、または１２０ｍｇ／時で注入することで、静脈内注入することを含み、該方法において、付随する出血性副作用が最小であることと同時に、最大の血栓溶解速度が達成される。

これらの方法のいくつかの実施形態において、付随する出血性副作用が最小であることは、対象の血液におけるフィブリノーゲンの分解度が約３０％未満であること、例えば、２７．５％未満、２５％未満、２２．５％未満、または２０％未満であること、として決定することができる（これに対して、いずれかの組成物単独による単剤療法では、フィブリノーゲンの分解度は、約５０〜約８０％である）。いくつかの実施形態において、最大の血栓溶解速度が達成されたことは、心筋梗塞における血栓溶解（ＴＩＭＩ）が２以上であることによって示される。他の実施形態において、最大の血栓溶解速度が達成されたことは、対象における少なくとも１つの血栓の質量の約５０％の溶解が、７５分以内、例えば、７０分以内、６０分以内、５０分以内、４０分以内、３０分以内に実現したことによって示される。

これらの方法において、プロウロキナーゼ変異体は、プロウロキナーゼの３００番目のアミン酸位置における、リジンからヒスチジンへの置換（Ｌｙｓ３００→Ｈｉｓ）を含んでいてもよい。本方法は、第１の組成物の投与後、５分間以内、１０分間以内、または１５分間以内に第２の組成物の投与を開始することを含んでもよい。いくつかの実施形態において、第１の組成物と第２の組成物とは、一緒になって、対象における少なくとも１つの血栓の質量の５０％を、１時間未満で溶解する。

ある実施形態において、本方法は、Ｃ１インヒビターのボーラスを含む第３の組成物を、対象に投与することをさらに含んでもよい。第３の組成物は、第２の組成物の投与前、または第２の組成物の投与とほぼ同時に、例えば、５分以内に、対象に投与してもよい。ある実施形態において、第３の組成物は、対象の血液中のＣ１インヒビター濃度が約５００〜約７５０μｇ／ｍｌに到達するのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態において、第３の組成物は、Ｃ１インヒビターの、５００〜１５００ｍｇのボーラスである。

これらのいくつかの方法において、第１の組成物と第２の組成物とは、一緒になって、Ｃ１インヒビター存在下、ｔＰＡ単独またはプロウロキナーゼ単独のいずれか一方の単剤療法と比較して、フィブリノーゲンの分解が３０％未満の状態で、血栓を溶解する。

別の態様において、本開示は、キットを提供し、該キットは、第１の容器に入った、２〜５ｍｇの組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）を含有する第１の組成物と、第２の容器に入った、６０〜１２０ｍｇのプロウロキナーゼの３００番目のアミン酸位置において、リジンからヒスチジンへの置換（Ｌｙｓ３００→Ｈｉｓ）を有するプロウロキナーゼ変異体（ｍｐｒｏＵＫ）を含有する第２の組成物とを含む。これらのキットにおいて、第１の組成物は、ボーラスとしての投与に適するように製剤化されていてもよく、および／または第２の組成物は、静脈内注入に適するように製剤化されていてもよい。ある実施形態において、キットは、５００〜１５００ｍｇのＣ１インヒビターを含有する、例えば、ボーラスとしての投与に適するように製剤化された、第３の組成物をさらに含んでもよい。

別の態様において、本開示は、本明細書に記載されたいずれかの方法で使用するための組成物を提供する。ある実施形態において、該組成物は、脳卒中または急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の症状がある対象に、付随する出血性副作用が最小であると同時に、血栓溶解速度が最大である処置を施すために使用するためのものである。これらの組成物は、５ｍｇ未満の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）を含有する第１の組成物を含み、該第１の組成物は、ボーラスの投与レジメンで対象に投与され、または投与するために調製され、かつプロウロキナーゼ変異体（ｍｐｒｏＵＫ）を含有する第２の組成物を含み、前記第２の組成物は、第１の組成物の投与に続き、６０〜１２０ｍｇ／時で６０〜９０分間にわたる投与レジメンで、静脈内注入によって対象に投与され、または投与するために調製される。ここで、該対象は、第１の組成物の投与に先立って、脳卒中の原因を決定することなしに、脳卒中またはＡＭＩの１つまたは複数の症状を観察することによって、脳卒中またはＡＭＩを起こしている可能性があるものと特定され、付随する出血性副作用が最小であることと同時に、最大の血栓溶解速度が達成される。これらの組成物は、本明細書に記載された全ての特徴および要素を含み得る。

用語「処置」または「治療処置」は、１種または複数の医薬の対象への投与、または対象の身体に対する医学的処置の実行を意味する。用語「治療処置」には、対象が摂取していることができる１種または複数の医薬の用量または頻度の調整（例えば、増加または減少）、１種または複数の新たな医薬の対象への投与、または対象の治療計画からの１種または複数の医薬の除去も含まれる。

本明細書で用いられる場合、「対象」または「患者」は、ヒトである。
本明細書で用いられる「有効量」は、重大な出血性の副作用または血友病様の副作用を引き起こすことなく、血栓溶解を実現するのに十分な量をいう。有効量は、１もしくは複数の投与、１もしくは複数の適用、または１もしくは複数の用量で投与し得る。医薬組成物の治療有効量（すなわち、有効な用量）は、選択された医薬組成物に依存する。

血栓の「最大溶解速度」は、本明細書において、ｔＰＡ、ｐｒｏＵＫ、またはｍｐｒｏＵＫを最大有効用量（すなわち、追加薬を加えても、より速い血栓溶解が実現できない薬物の用量であり、例えば、最大有効用量では血栓溶解速度のプラトーが見られる）で用いた単剤療法によって実現し得る血栓溶解速度と少なくとも同等の速さであり、いかなる付随する出血性副作用も伴わない血栓溶解速度と定義される。例えば、ｔＰＡまたはＭ５を用いた単剤療法によって実現される最大溶解速度は、例えば、３０％を超えるフィブリノーゲンの分解度によって示されるように、患者に重大な出血を生じさせるであろうことに留意することが重要である。驚くべきことに、本治療方法は、出血性副作用を伴わずに（フィブリノーゲンの分解度が３０％未満であることによって示され得る）最大溶解速度を実現し、過剰な出血を伴わないであろうし、臨床上許容されるであろう。

別段の定めがないかぎり、本明細書で用いられる全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者が一般に理解している通りの意味を有する。本明細書に記載された方法および材料と類似または同等の方法および材料を、本発明の実施および試験に使用しうるが、適切な方法および材料を以下に説明する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、定義を含めて、本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。

本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかであろう。

図１Ａは、３つの用量（１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、または３μｇ／ｍｌ）のｔＰＡによる、フルオレセイン標識凝固血漿の溶解を示す折れ線グラフである。飽和用量において、ｔＰＡが５０％の凝固血漿を溶解するのに要した時間は、６０分間である。 図１Ｂは、血栓溶解終了時に残存したフィブリノーゲンを示す棒グラフであり、ベースライン（ＢＬ）に対する割合（パーセント）として表す。 図２Ａは、３つの用量（１０μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、または１５μｇ／ｍｌ）のｍｐｒｏＵＫ（Ｍ５）による、フルオレセイン標識凝固血漿の溶解を示す折れ線グラフである。飽和用量において、Ｍ５が５０％の凝固血漿を溶解するのに要した時間は、５０分間である。 図２Ｂは、血栓溶解終了時に残存したフィブリノーゲンを示す棒グラフであり、ベースライン（ＢＬ）に対する割合（パーセント）として表す。 図２Ｃは、ｍｐｒｏＵＫ（Ｍ５）がフルオレセイン標識凝固血漿を溶解するのに要する時間が、Ｃ１インヒビター（７５０μｇ／ｍｌ）の影響を受けなかったことを示す折れ線グラフである。 図２Ｄは、Ｍ５によるフィブリノーゲンの溶解が、Ｃ１インヒビター（７５０μｇ／ｍｌ）によって阻害されたことを示す棒グラフである。 図３は、ｔＰＡ（０．２μｇ／ｍｌ）と、Ｍ５（６μｇ／ｍｌ）との組み合わせ（丸）による最大の血栓溶解速度を示す折れ線グラフである。この組み合わせは、０．２μｇ／ｍｌのｔＰＡ（四角）単独、または６μｇ／ｍｌのＭ５（三角）単独の場合よりも、はるかに速い血栓溶解を引き起こした。結果は、３連で行った１回の実験の代表例である。 図４Ａは、ｔＰＡ（０．２μｇ／ｍｌ）と、Ｍ５（６μｇ／ｍｌ）との組み合わせ（丸）による血栓溶解を示す折れ線グラフである。この組み合わせは、０．２μｇ／ｍｌのｔＰＡ（四角）単独、または６μｇ／ｍｌのＭ５（三角）単独の場合よりも、はるかに速い血栓溶解を引き起こした。 図４Ｂは、血栓溶解終了時に残存した血漿フィブリノーゲンを示す棒グラフであり、ベースライン（ＢＬ）の血漿フィブリノーゲンに対する割合（パーセント）として表す。結果は、３連で行った１０回の実験の代表例である。 図５Ａは、Ｃ１インヒビター（７５０μｇ／ｍｌ）を加えた場合の、ｔＰＡ（０．２μｇ／ｍｌ）と、Ｍ５（６μｇ／ｍｌ）との組み合わせによる最大の血栓溶解速度を示す折れ線グラフである。前記の組み合わせにＣ１インヒビターを加えることによって、溶解は阻害されなかったが、ｔＰＡ単独による溶解は阻害された。 図５Ｂは、血栓溶解終了時に残存した血漿フィブリノーゲンを示す棒グラフであり、ベースライン（ＢＬ）の血漿フィブリノーゲンに対する割合（パーセント）として表す。Ｃ１インヒビターは、フィブリノーゲンの溶解を減衰させた。 図６は、０．２μｇ／ｍｌより高用量のｔＰＡが、６μｇ／ｍｌのＭ５と組み合わせた場合に、血栓溶解速度のさらなる促進をしないことを示す折れ線グラフである。 図７は、０．２μｇ／ｍｌのｔＰＡと、６μｇ／ｍｌのＭ５との組み合わせ（「ｔＰＡ＋Ｍ５」）、０．２μｇ／ｍｌのｔＰＡ（「ｔＰＡ ０．２」）、６μｇ／ｍｌのＭ５（「Ｍ５ ６」）、１５μｇ／ｍｌのＭ５（「Ｍ５ １５」）、および３μｇ／ｍｌのｔＰＡ（「ｔＰＡ ３」）によって、５０％の凝固血漿を溶解するために必要とされる時間（平均）を示す棒グラフである。データは、多数の実験（実験回数を、各バーの上に示す）から収集した。 図８は、異なる試験条件における、０．２μｇ／ｍｌのｔＰＡと、６μｇ／ｍｌのＭ５との組み合わせによる血栓溶解終了時に残存したフィブリノーゲン（％ＢＬ）を示す棒グラフであり、該試験条件は、（１）２ｍｌの血漿中、（２）２ｍｌの血漿＋Ｃ１インヒビター（５００μｇ／ｍｌ）、および（３）５ｍｌの血漿中、である。血漿量（体積）が増加すると、フィブリノーゲンの分解は自然に減少するため（ヒト対象中の血漿量（体積）は、平均約３０００ｍｌである）、ｉｎ ｖｉｖｏではＣ１インヒビターを使用する必要はないと思われるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験においては、ｉｎ ｖｉｖｏの条件により近似させるために、Ｃ１インヒビターの使用は有用である。 図９は、血栓が存在しない場合には、０．２μｇ／ｍｌのｔＰＡと、６μｇ／ｍｌのＭ５との組み合わせによるフィブリノーゲンの溶解が、少なくとも３時間は起こらないことを示す折れ線グラフであり、これは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、血栓が存在しない場合には、前記の組み合わせもまた不活性であろうことを示唆する。 図１０Ａは、ラットモデルにおける、脳内出血後の血腫量を示す棒グラフである。血腫量は、投薬後２時間におけるヘモグロビン量によって測定した。Ｃ１インヒビター／Ｍ５を投薬した動物と、生理食塩水／生理食塩水を投薬した動物との間に有意差がない（ｐ＝０．５１９４）ことが確認された。ラットが、Ｍ５／ＵＫのインヒビターであるＣ１インヒビターを欠いているため、Ｃ１インヒビターが加えられた。 図１０Ｂは、ラットモデルにおける、脳内出血後の出血量に関する組織学的な定量の棒グラフである。Ｃ１インヒビター／Ｍ５を投薬した動物と、生理食塩水／生理食塩水を投薬した動物との間に、出血量に関して有意差がない（ｐ＝０．６８９９）ことが確認された。

詳細な説明
本開示は、少なくとも部分的には、小用量の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）と、低用量のプロウロキナーゼ変異体（「ｐｒｏ−ＵＫ変異体」または「ｍｐｒｏＵＫ」）（例えば、プロウロキナーゼの３００番目のアミン酸位置において、リジンからヒスチジンへの置換（Ｌｙｓ３００→Ｈｉｓ）を含むｍｐｒｏＵＫであり、本明細書において「Ｍ５」と呼ばれる）との併用投与によって、最大の血栓溶解速度で血栓溶解（例えば、約７５分間以内に、心筋梗塞における血栓溶解（ＴＩＭＩ）スコアが２以上）を実現して血流増加を達成することができ、かつ予期される出血性のリスクを伴わないという発見に基づく。脳卒中または急性心筋梗塞の患者にとって、血栓溶解および再灌流に要する時間は、臨床成績および生存率に重大な意味がある。これを可能にするためには、処置には、患者が入院加療を受ける前に処置を受けられるように、十分な安全性もなければならない。本発明は、脳卒中または急性心筋梗塞を起こしている可能性がある対象の処置方法を提供する。

これらの方法は、時間のかかる診断手順による遅れなしに、脳卒中または急性心筋梗塞の症状がある患者の処置に使用することができ、それによって、そのような患者の臨床成績および生存率が向上する可能性が増大する。小用量のｔＰＡと、低用量のｍｐｒｏＵＫとの併用によってフィブリン溶解を実現することができるため、高用量のプラスミノーゲン活性化因子レジメンに伴う非特異的なプラスミノーゲンの活性化および血友病様の副作用が最低レベルまで低減される一方で、なおも最大の血栓溶解速度が実現される。また、本発明は、ｔＰＡを含有する第１の組成物と、ｍｐｒｏＵＫを含有する第２の組成物とを含む、本明細書に記載された方法に使用するためのキットも提供する。

血栓は、プロテアーゼであるプラスミン（これは、プラスミノーゲンの活性化した形態である）によって、３つのステップで溶解される。ステップ１：血漿中に存在するプラスミノーゲンが、インタクトなフィブリン塊の、ｔＰＡ結合サイトに隣接するＤドメインにある、特異的な結合サイトに結合する。ｔＰＡが、いわゆる「三重複合体」（これは、フィブリン、プラスミノーゲン、およびｔＰＡから構成される）のプラスミノーゲンを活性化し、フィブリン溶解を惹起する。ステップ２：プラスミンが、フィブリンを、リジン残基の後ろで優先的に切断し、新たなプラスミノーゲン結合サイトであるカルボキシ末端リジンを生じさせる。これらの新たに生じた結合サイトの１つは、フィブリンのＥドメインにあるＣ末端の３個のリジンからなる高親和性の結合サイトである。プラスミノーゲンが、フィブリンのＥドメインにあるこのサイトに結合した場合、プラスミノーゲンは特別な立体構造変化を受け、それによってｐｒｏ−ＵＫおよびｍｐｒｏＵＫが有する固有の触媒活性による活性化を受けることが可能となる。ステップ３：ｐｒｏ−ＵＫ／ｍｐｒｏＵＫによるプラスミノーゲンの活性化は、プラスミンによる、互恵的な、ｐｒｏ−ＵＫ／ｍｐｒｏＵＫの、酵素であるウロキナーゼ（ＵＫ）／ｍＵＫへの活性化を伴う。ＵＫ／ｍＵＫは、次いで、残りのフィブリン結合プラスミノーゲンを活性化し、それによってフィブリン溶解を完了させる（米国特許第５，０５５，２９５号明細書；米国特許第５，４７２，６９２号明細書；米国特許第５，６２６，８４１号明細書；米国特許第５，７５９，５４２号明細書；米国特許第７，０７４，４０１号明細書；米国特許第７，８３７，９９２号明細書；米国特許第８，１８７，５９２号明細書；Ｐａｎｎｅｌｌ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１：８５３〜８５９、１９８８；Ｚａｒｉｃｈ、Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９５；２６：３７４〜３７９；Ｌｅｅ、ＡＪＮＲ Ａｍ Ｊ Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ ２５：１４７０〜１４７５、２００４、を参照のこと）。

本発明者は、本明細書に記載された新たな併用療法の方法が、どのようにして上記のフィブリン溶解ステップによって裏付けられるのかを発見した。フィブリンに結合するのはｔＰＡだけなので、ｔＰＡだけが、効率的にステップ１を遂行することができ、プラスミノーゲンと共に三重の複合体を形成し、これはインタクトなフィブリンによって、またはフィブリンフラグメントＤによって特異的に促進される。Ｐｒｏ−ＵＫ／ｍｐｒｏＵＫは、通常の条件下では、ｉｎ ｖｉｖｏでフィブリンに結合しない（すなわち、Ｐｒｏ−ＵＫ／ｍｐｒｏＵＫは、非常に高い、非特異的な用量においてのみフィブリンに結合できる）。よって、ステップ２は、ｐｒｏ−ＵＫ／ｍｐｒｏＵＫによってのみ効率的に遂行される。これは、ｐｒｏ−ＵＫ／ｍｐｒｏＵＫは、プラスミノーゲンが、分解されたフィブリンのフィブリンＥドメインに結合した場合に形成するプラスミノーゲンの立体構造（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）に対して、高い基質親和性を有するためである。フィブリンフラグメントＥは、ｔＰＡに対して作用を及ぼさず（ｔＰＡは、フィブリンＥドメインに結合しない）、ｐｒｏＵＫ／ｍｐｒｏＵＫによるプラスミノーゲンの活性化を促進するだけである。よって、ステップ３もまた、ｐｒｏ−ＵＫ／ｍｐｒｏＵＫによってのみ促進される。これは、ｐｒｏＵＫが、フィブリンのＥドメインに結合したプラスミノーゲンを活性化した場合、互恵的な、プラスミンによる、ｐｒｏＵＫのＵＫへの活性化が起こり、ＵＫが、残りのフィブリン結合プラスミノーゲンを活性化することによって、溶解を完了させるためである（対照的に、ｔＰＡは活性化を受けないが、これは、その１本鎖または２本鎖形態が同じ活性を有するためである）。ｔＰＡがステップ２および３を遂行し得る手段は、高い出血リスクを伴う、高くて非特異的な用量によるものだけである。

本発明者は、小用量のｔＰＡ（標準的な用量である１００ｍｇのわずか２〜５％）と、低用量のｍｐｒｏＵＫ、例えば、Ｍ５（単剤療法の用量の４０〜５０％）との組み合わせによって、最大の血栓溶解速度と、約３０％未満（例えば、約２５％未満または約２０％未満）という最小限のフィブリノーゲン分解度で、フィブリン溶解を達成することができることを発見した。このｔＰＡ−ｍｐｒｏＵＫの組み合わせは、ｔＰＡまたはｍｐｒｏＵＫの極量での単剤療法によって実現し得る溶解の最大速度と少なくとも同等の最大溶解速度で、しかしながら、安全で臨床上許容される、はるかに低いフィブリノーゲン分解度（このような低い分解度では出血のリスクが生じないためである）で、フィブリン溶解を実現し、これは知られている単剤療法では実現することができない。よって、本明細書に記載された本方法は、主張されているあらゆる相乗効果的な組み合わせ（それらは、新たに発見された、最大の血栓溶解速度と共に、患者にとって最大限の安全性、すなわち、付随する出血性副作用が最小である、という二重の利点を含まないであろう）よりも明らかに優れた血栓溶解を提供する。

血栓の「最大溶解速度」は、本明細書において、ｔＰＡ、ｐｒｏＵＫ、またはｍｐｒｏＵＫを最大有効用量（すなわち、追加薬を加えても、より速い血栓溶解が実現できない薬物の用量であり、例えば、最大有効用量では血栓溶解速度のプラトーが見られる）で用いた単剤療法によって実現し得る血栓溶解速度と少なくとも同等の速さである血栓溶解速度と定義される。しかしながら、例えば、ｔＰＡまたはＭ５を用いた単剤療法によって実現される最大溶解速度は、例えば、３０％を超えるフィブリノーゲンの分解度によって示されるように、患者に重大な出血を生じさせるであろうことに留意することが重要である。驚くべきことに、本明細書に記載された新たな方法によって実現される「最大限の安全性」は、フィブリノーゲンの分解度が３０％未満であることと定義され、それは過剰な出血を伴わないであろうし、臨床上許容されるであろう。

例えば、ｔＰＡ−ｍｐｒｏＵＫの組み合わせは、少なくとも１つの血栓、例えば複数の血栓の質量の５０％を、１時間未満、例えば、４８分間、５０分間、５５分間、６０分間、６５分間、７０分間、７５分間、または８０分間で溶解することができる。この組み合わせは、使用する用量を著しく低くすることも可能にし、はるかにフィブリン特異的であり、より安全で、かつより経済的である。ｍｐｒｏＵＫ、例えば、Ｍ５は、ネイティブのｐｒｏ−ＵＫ代わりに用いられる。なぜなら、ｍｐｒｏＵＫは、治療用量において血漿中でより安定であり、フィブリンに特異的なプロ酵素形態のまま残るのに対して、ネイティブのｐｒｏ−ＵＫは、自然発生的にウロキナーゼに変換する傾向があり、このウロキナーゼは、出血性合併症の原因となり得る非特異的なプラスミノーゲン活性化因子であるためである。これは、ｐｒｏ−ＵＫが，ヨーロッパでＥＭＥＡにより販売承認を拒絶された理由であり、その後、ｐｒｏ−ＵＫの開発は、米国でも中止された。

以下の実施例に示すように、血栓が存在しない血漿中でインキュベートした場合、ごく小用量で用いられたｔＰＡ−ｍｐｒｏＵＫの組み合わせにおいて、フィブリノーゲンの分解は、全く誘発されず、したがって、前記の組み合わせは、凝固または創傷の治癒に対して、影響がほとんど、または全くないであろうことが予期される。加えて、Ｍ５はプロ酵素であり、活性化にはフィブリンが必要であることから、出血がみられる場合であっても、例えば、出血性の脳卒中の間でも、安全であることが予期される。さらに、Ｃ１インヒビター（薬剤として入手可能である）は、必要であれば、フィブリン溶解の間（ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる試験中ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおける治療中）に形成され得るあらゆるｍＵＫの、あらゆる非特異的な活性をクエンチするために使用し得る（Ｐａｎｎｅｌｌ，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．５（５）：１０４７〜５４，２００７）。このＣ１インヒビターの効果は、ＵＫとは共通するものではなく、ｐｒｏＵＫ変異体に特有のものである。

臨床的に、前記のｔＰＡ−ｍｐｒｏＵＫ併用療法は、時間のかかる診断手順（これは、脳卒中の治療におけるｔＰＡの使用に伴う重大な出血のリスクために、現在では必須である）による遅れなしに、脳卒中または心臓発作の症状がある患者の処置に使用することができる。処置は、疑わしい状況、または救急車内で施すことができる。このような患者の生存および臨床成績において、時間には極めて高い重要性があるため、本併用療法は、現在承認されており利用できる唯一の療法である単剤療法としてのｔＰＡよりも、高い効力と予後をもたらす。脳卒中の治療におけるｔＰＡ単剤療法の有用性については、依然議論があり、その認可には近年疑問がだされている（Ｓａｎｄｅｒｃｏｃｋ Ｐ，Ｌａｎｃｅｔ．２０１４ Ａｕｇ ２３；３８４（９９４４）：６６０〜１）。ｍｐｒｏＵＫは、「悪性」の閉塞性の血栓におけるプラスミノーゲンを優先的に活性化する一方、「良性」の創傷をふさぐ血栓におけるプラスミノーゲンをスペアリングする。したがって、止血部位を開放してしまうリスクはほとんどない。対照的に、ｔＰＡは、上記のステップ１に記載されているフィブリン溶解のように、インタクトなフィブリンから作られているこのような部位を標的にする。血漿中のフリーなプラスミノーゲンは、Ｃ１インヒビターの作用によっても保護されているため、血友病様の状態を誘発するリスクはより小さい。

本方法の最大の血栓溶解速度は、ｉｎ ｖｉｖｏで決定することができ、例えば、血管の再開通を評価するための標準的な技法によって決定することができる。例えば、血管閉塞のグレードは、心筋梗塞における血栓溶解（ＴＩＭＩ）スコアの類推によって評価することができ、０というＴＩＭＩスコアは完全な閉塞であり、１というＴＩＭＩは最小限の血流であり、２というＴＩＭＩは部分的な血流（再開通）であり、３というＴＩＭＩスコアは完全な血流である。ＴＩＭＩ研究グループは、梗塞した動脈のコントラスト不透明化速度の視覚的な評価に基づいて、この冠動脈の血流に関するグレード付けスコアを開発した（例えば、Ｔｈｅ ＴＩＭＩ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ（ＴＩＭＩ）ｔｒｉａｌ：ｐｈａｓｅ Ｉ ｆｉｎｄｉｎｇｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９８４；３３：５２３〜５３０、およびＴｈｅ ＴＩＭＩ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ（ＴＩＭＩ）ｐｈａｓｅ ＩＩ ｔｒｉａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９８９；３２０：６１８〜６２７（これらは、ＴＩＭＩグレード付けスコアの説明に関して、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。

ＴＩＭＩフローグレードは、冠動脈再灌流療法の前後における心筋血流の半定量的評価のための、ならびに脳卒中の療法決定のための、標準となっている。ＴＩＭＩフローグレード２と３は、どちらも、再灌流が成功したことを示すと考えられている。よって、本明細書で用いられる場合、最大の血栓溶解速度は、ヒト対象または患者において、約７５分以内またはそれ未満で、例えば、７０分以内、６５分以内、６０分以内、５５分以内、５０分以内、４５分以内、４０分以内、３５分以内、または３０分以内に、２以上のＴＩＭＩスコアを実現することを伴うことが予期される。

プラスミノーゲンの立体構造、ならびに「良性」の血栓と「悪性」の血栓との差異
プラスミノーゲンは、活性なプラスミンに変換する前に、少なくとも３種の異なる立体構造を取り得る。第１の立体構造は、ネイティブな「閉構造」の立体構造であり、すなわち、フィブリンには全く結合しておらず、プラスミノーゲンは、血液中に、この第１の立体構造で存在する。ウロキナーゼは、この第１の立体構造を取っているプラスミノーゲンを活性化することができ、非特異的な出血性素因、すなわち、血友病様の状態を生じさせ得る。ｐｒｏ−ＵＫは治療用量で不安定であり、治療濃度で容易にウロキナーゼに変換するため、ｐｒｏ−ＵＫもまた、血友病様の副作用を生じさせ得る。

フィブリンに結合した場合、プラスミノーゲンは、２種または３種の異なる「開」構造の立体構造を取ることができ、良性の創傷治癒性の血栓と、悪性の閉塞性の血栓とを見分けるための基準をもたらす。これらの第１番目は、インタクトなフィブリンのＤドメイン内にある内部リジンにプラスミノーゲンが結合した場合に生じる、プラスミノーゲンの立体構造である。これらの第２番目は、ステップ２に記載されているフィブリン溶解のように、あるフィブリン分解の後にのみ露出するフィブリンフラグメントＥにある、Ｃ末端の３個のリジンにプラスミノーゲンが結合した場合に生じる、プラスミノーゲンの立体構造である。

止血フィブリンが形成されて負傷をふさぐ場合、止血フィブリンは、包帯のようにふるまい、血流の障害を引き起こすことはない。このような止血作用のある血栓中のインタクトなフィブリンは、Ｄドメイン内に位置する内部プラスミノーゲン結合サイトのみを有し、それによってフィブリンに結合したこれらの第１番目の立体構造が生じる。この立体構造において、プラスミノーゲンは、ｔＰＡ（そのフィブリン結合サイトは隣接している）による活性化を受けやすいが、ｐｒｏ−ＵＫでは活性化されず、このｐｒｏ−ＵＫは、フィブリンに結合せず、フィブリンのＥドメインによって生じる第２番目の立体構造によって基質に結合する。

血管内に血栓が形成された場合、血流を妨げ、または血流を止め、閉塞した血管壁からの局所的なｔＰＡ放出を誘発し、フィブリンの分解を引き起こす。フィブリンの分解によって、フィブリンフラグメントＥ上の、新たなプラスミノーゲン結合サイトが露出する。プラスミノーゲンが、フィブリンフラグメントＥ上の、この新たな結合サイトに結合する。Ｐｒｏ−ＵＫは、フィブリンフラグメントＥに結合したプラスミノーゲンを優先的に活性化する。

「良性」のフィブリン塊と、「悪性」のフィブリン塊との、この重要な差異を利用することによって、傷をふさぐ止血血栓を保護しながら、血栓溶解を効果的に実現することが可能となる。Ｐｒｏ−ＵＫ変異体は、ｐｒｏ−ＵＫと同様の作用様式を有している。

第３番目のフィブリン結合プラスミノーゲンの立体構造は、プラスミノーゲンが単一のＣ末端サイトに結合した場合に現れ、フィブリンのγ鎖上に存在すると考えられている。

組織プラスミノーゲン活性化因子
組織プラスミノーゲン活性化因子は、血管壁を覆う内皮細胞に蓄えられているセリンプロテアーゼである。血栓が血管をふさいだ場合、血管壁からｔＰＡが放出され、フィブリン塊を溶解する。

今日、ほとんどの治療的な血栓溶解は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）およびその誘導体を使用して行われているが、ｔＰＡは、出血性副作用を引き起こし得る。例えば、１５０ｍｇという用量の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）は、優れた冠動脈血栓溶解をもたらすことが示されているが、容認できない頭蓋内出血の発生を伴うことから、より効果の低い、１００ｍｇという用量の採用を余儀なくされている（Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，Ｊ Ａｍｅｒ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．９：４６７，１９８７；Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ，Ｊ Ａｍｅｒ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．９：４６７，１９８７）。急性心筋梗塞（ＡＭＩ）患者の比較臨床試験において、経皮冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）の結果は、ｔＰＡの静脈内投与よりも著しく優れていたが、ＰＣＩは、よりコストがかかり、技術的な要求が厳しく、多くの時間を必要とする。この臨床成績は驚くべきものであったが、以下に示すｔＰＡの特性によって説明することができる、（１）ｔＰＡの治療用量は、合併症である頭蓋内出血によって制限されている、および（２）ｔＰＡの効能は、比較的高い冠動脈再血栓率によって害されており、これにはトロンビン生成という血液学的な証拠がある（Ｖｅｒｈｅｕｇｔ，Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９６、２７：７６６〜７７３；Ｇｕｒｅｗｉｃｈ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９３、８７：１７５９−１７６１；Ｒａｐｏｌｄ、Ｂｌｏｏｄ １９９１、７８：１４９０〜１４９５；Ｇｕｌｂａ、Ｌａｎｃｅｔ １９８８、２：９７；Ｇｕｌｂａ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９１、８３：９３７〜９４４）。

虚血性脳卒中において、ＡＭＩにおいて用いられる用量（Ｈａｃｋｅ，ＪＡＭＡ １９９５，２７４：１０１７〜１０２５）と同等の用量のｔＰＡを投与した場合、合併症である頭蓋内出血が２０％発生するため、用量のさらなる減量が必要であった。ＡＭＩにおいてｔＰＡと共にヘパリンが使用されるが、脳卒中においては再閉塞率が１４〜３１％であると報告されているため、ヘパリンの使用は排除される（Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００２，５９：８６２〜８６７；Ｒｕｂｉｅｒａ、Ｓｔｒｏｋｅ ２００５、３６：１４５２〜１４５６；Ｓａｑｑｕｒ、Ｓｔｒｏｋｅ ２００７；３８：６９〜７４）。最終的には、アメリカ合衆国において、虚血性脳卒中患者のうち、ｔＰＡで治療を受けるのは、約２〜約５％だけである結果となっている（Ｋｌｅｉｎｄｏｒｆｅｒ、Ｓｔｒｏｋｅ ２００８；３９：９２４〜９２８）。

ｔＰＡによって引き起こされる出血は、第一に、血管壁の負傷部位の修復に必要な止血フィブリンの溶解に関係すると考えられており、この出血は、通常潜在性で予測できず、しかしｔＰＡ用量に依存的である。ｐｒｏＵＫ／Ｍ５は、上記したように、異なる作用様式に相応して、これらのサイトを温存する。

プロウロキナーゼおよびプロウロキナーゼ変異体
プロウロキナーゼ（ｐｒｏ−ＵＫ）は、血栓溶解薬としてはあまりよく知られていないが、急性心筋梗塞において、フェーズ３臨床試験が完了している（Ｍｉｃｈｅｌｓ Ｒ，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ １９９５，２：１１７〜１２４；ＰＲＩＭＩ Ｔｒｉａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｌａｎｃｅｔ １９８９，１：８６３〜８６７；Ｔｅｂｂｅ Ｕ，Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９８，３１：４８７〜４９３）。これらの試験において、Ｐｒｏ−ＵＫは、冠動脈再血栓症を、ほとんど（５％）または全く誘発せず、トロンビン生成という血液学的な証拠は得られなかった（ＰＲＩＭＩ Ｔｒｉａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、Ｌａｎｃｅｔ １９８９、１：８６３〜８６７；Ｗｅａｖｅｒ、Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９４、２４１：２４２〜１２４８）。残念なことに、ｐｒｏ−ＵＫは、治療用量において、血漿中で、自然発生的な活性化を受けて、酵素形態である２本鎖ウロキナーゼ（ｔｃＵＫ）になりやすい。これが起こると出血リスクを招くため、欧米において、販売承認は拒絶され、ｐｒｏ−ＵＫの開発は中止された。

ｐｒｏ−ＵＫが不安定なのは、ｐｒｏ−ＵＫがもつ、比較的高い内因性の触媒活性に関係がある。構造活性研究によって、触媒ドメインの２９７〜３１３番目のアミノ酸残基から構成される可動性ループ中にある荷電残基が、この活性に重要であることが明らかとなった。可動性ループ領域における変異原性により、ｐｒｏ−ＵＫの内在的な活性の変化が生じる。内因活性が少ないｐｒｏ−ＵＫ「可動性ループ」変異体の例は、米国特許第５，４７２，６９２号明細書に記載されており（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、例えば、Ｇｌｙ２９９→Ａｌａ変異体、Ｌｙｓ３００→Ｈｉｓ変異体（「Ｍ５」または「Ｍ５変異体」として知られる）、Ｌｙｓ３００→Ａｌａ変異体、およびＧｌｕ３０１→Ｈｉｓ変異体などである。

これらのｐｒｏ−ＵＫ「可動性ループ」変異体の１種、すなわち、Ｍ５（Ｌｙｓ３００→Ｈｉｓ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で試験され、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫより著しく速く血栓を溶解することが示された（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９０：７５７〜７６３，２００２）。一本鎖Ｍ５変異体の内因活性は、ｐｒｏ−ＵＫの５の分の１であるため、Ｍ５は、血液中で、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫよりも安定であり、活性酵素形態へ自然発生的な変換が起こりにくく、血友病様の副作用を生じさせにくいと思われる（Ｌｉｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６，３５：１４０７０〜１４０７６）。２本鎖の酵素形態であるｍｐｒｏＵＫ、例えば、Ｍ５の活性、およびｍｐｒｏＵＫ、例えば、Ｍ５の作用様式は、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫと同等のままである（Ｓｕｎ Ｚ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９７，２７２：２３８１８〜２３８２３；Ｌｉｕ、Ｃｉｒｃｕ．Ｒｅｓ．２００２、９０：７５７〜７６３）。Ｍ５のようなｍｐｒｏＵＫは、別の優れた特性を有する、すなわちｍｐｒｏＵＫは、内因性の血漿Ｃ１インヒビターによって阻害され得、ｍｐｒｏＵＫによるフィブリン溶解を妨げることなく非特異的な副作用に対する保護をもたらす（Ｇｕｒｅｗｉｃｈ、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂｏｓ Ｈａｅｍｏｓｔ、２００６、４：１５５９〜１５６５；Ｐａｎｎｅｌｌ、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ、２００７、５：１０４７〜１０５４；Ｇｕｒｅｗｉｃｈ、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ、２００９、１０２：２７９〜２８６）。重要なのは、米国特許第７，０７４，４０１号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、Ｍ５のようなｍｐｒｏＵＫは、通常は血栓溶解性の薬剤に付随するどのような出血性副作用も示さないことである。加えて、Ｍ５のようなｍｐｒｏＵＫは、米国特許第７，０７０，９５８号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている方法に従って合成することができる。

Ｍ５および他のｍｐｒｏＵＫは、（１）基本的に天然のヒトタンパク質である（ネイティブなｐｒｏ−ＵＫに対する相同性が９９．８％である）、（２）抗原性（免疫原性）の反応がおこらない、および（３）天然に生じたヒトｐｒｏ−ＵＫおよびＥ． ｃｏｌｉによる遺伝子組換えヒトｐｒｏ−ＵＫが、フェーズ３臨床試験において、約５，０００人のヒト患者に対して既に安全に投与されていることから、ヒトへの投与に対して安全であることが期待される。

低用量のｔＰＡおよびｍｐｒｏＵＫの併用療法
プラスミノーゲンの作用に対するｔＰＡとｐｒｏ−ＵＫとの相補的な作用機序を利用することによって、本発明者は、小用量のｔＰＡ（標準的な用量である１００ｍｇの２〜５％、例えば、１．０ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、３．５ｍｇ、４．０ｍｇ、または４．５ｍｇのボーラス）と、ｍｐｒｏＵＫ、例えば、Ｍ５の注入（単剤療法の用量の４０〜５０％、例えば、６０〜１２０μｇ／ｍｌで、６０〜９０分間にわたる注入）との組み合わせによって、最大の血栓溶解速度でフィブリン溶解を実現でき、ｔＰＡ単独またはｍｐｒｏＵＫ単独のいずれか一方による、最大有効用量での単剤療法によって達成できる最大の血栓溶解速度と少なくとも同等の速さである最大の血栓溶解速度が得られることを実証した（図１Ａ〜５Ｂ）。例えば、ｔＰＡ−ｍｐｒｏＵＫの組み合わせは、血栓の質量の５０％を、１時間未満、例えば、平均４８分間で溶解することができる（図７、ｔＰＡ＋ＭＦ参照）。ｔＰＡ単独、およびｍｐｒｏＵＫ（Ｍ５）単独で、非常に高用量（例えば、３μｇ／ｍｌのｔＰＡまたは１５μｇ／ｍｌのｍｐｒｏＵＫ（Ｍ５））において同等の溶解時間を実現することができる（図７）が、それらの用量において、プラスミノーゲンの非特異的な活性化と、その結果として、Ｍ５において約７７％のフィブリノーゲン分解（図２Ｂ参照）、およびｔＰＡにおいて約８０％のフィブリノーゲン分解（図１Ｂ参照）が起こり、重大で臨床的に容認できない血友病様の副作用が生じる可能性がある。

ｍｐｒｏＵＫは、血漿中でより安定であり、プロ酵素形態のまま残るのに対して、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫは、自然発生的にウロキナーゼに変換し、血友病様の副作用を生じさせる傾向があるため、Ｍ５などのｍｐｒｏＵＫが、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫの代わりに用いられる。よって、最大の血栓溶解速度は、ｔＰＡおよびｍｐｒｏＵＫの単剤療法の用量に対してほんの僅かな用量のｔＰＡ−ｍｐｒｏＵＫの組み合わせによって実現することができる。

血栓が存在しない血漿中でインキュベートした場合、ｔＰＡ−ｍｐｒｏＵＫの組み合わせは、フィブリノーゲンの分解を全く誘発せず（図９）、よって、ｉｎ ｖｉｖｏで、凝固および創傷の治癒に対して全く影響しないことが予期される。さらに、Ｃ１インヒビターを、血漿中のｍＵＫ（ｍｐｒｏＵＫの酵素形態）が有するあらゆる非特異的な活性をクエンチするために用いて（図２Ｄおよび６）、出血性合併症に対するさらなる保護を追加することができる。

臨床的に、本ｔＰＡ−ｍｐｒｏＵＫ併用療法は、時間のかかる診断手順による遅れなしに、脳卒中または心臓発作の症状がある患者の処置に使用することができる。本明細書は、（ａ）脳卒中または急性心筋梗塞の基礎となる原因を決定することなしに、１つまたは複数の症状を観察することによって、脳卒中または急性心筋梗塞を起こしている可能性がある対象を特定すること、および（ｂ）５ｍｇ以下のｔＰＡを含有する第１の組成物のボーラスを対象に投与し、続いて、ｍｐｒｏＵＫの第２の組成物を、６０〜９０分間にわたり、６０〜１２０ｍｇ／時の投与速度の注入で対象に注入することによる、脳卒中または急性心筋梗塞の症状がある対象の処置方法を提供する。第２の組成物は、第１の組成物の投与の、約５分後、約１０分後または約１５分後に投与してもよい。第１の組成物と第２の組成物とは、脳卒中または急性心筋梗塞の症状を生じさせるあらゆる血栓を、最大溶解速度で溶解する量で投与する。第１の組成物は、２〜５ｍｇのｔＰＡ、例えば、約２ｍｇ、約２．５ｍｇ、約３ｍｇ、約３．５ｍｇ、約４ｍｇ、約４．５ｍｇ、約５ｍｇのｔＰＡを含有し得る。Ｍ５のようなｍｐｒｏＵＫを含有する第２の組成物は、静脈内注入によって投与してもよい。Ｍ５のようなｍｐｒｏＵＫの静脈内注入は、約６０〜約１２０ｍｇ／時（例えば、６０〜１００ｍｇ／時、７０〜９０ｍｇ／時、または７５〜８５ｍｇ／時）の用量で、６０分間、７０分間、８０分間、または９０分間にわたって行ってもよい。

本明細書に記載された方法は、脳卒中の処置に使用することができる。脳卒中は、虚血性または出血性であり得る。虚血性脳卒中は、血流を妨げる血栓によって引き起こされ、出血性脳卒中は、損傷した血管によって引き起こされる。約８５％の場合、脳卒中は、虚血性であり、例えば、血栓によって引き起こされ、したがって、血栓溶解性の薬剤による処置に適している。脳細胞に酸素を含んだ血液が欠乏している時間が長いほど、より多くの脳細胞が失われるため、虚血性脳卒中後の再灌流のタイミングは極めて重要である。しかしながら、脳卒中の原因を完全に診断することは困難で時間がかかることである。それでもなお、出血性副作用の高いリスクがあるため、現在利用できる血栓溶解性の薬剤による処置のためには、正確な診断は極めて重要である。虚血性脳卒中の患者に対する血栓溶解性の薬剤の投与は、適切な療法であろうが、同じ血栓溶解性の薬剤の出血性脳卒中の患者への投与は、問題をさらに悪化させるであろうし、患者を死に至らしめることがあり得る。診断の確定には時間がかかるが、個人が示す脳卒中の基本的な症状（突然発症する片側麻痺など）は、医学分野の当業者、例えば、救急救命士（ＥＭＴ）、看護師、もしくは医師、または最小限の訓練を受けた一般人によって、容易に確定され得る。

脳卒中の症状がある対象は、本明細書に記載された方法を使用して、低用量のｔＰＡからなるボーラスの投与と、それに続くｍｐｒｏＵＫの注入によって処置することができる。この組み合わせにおける、非常に低用量のｔＰＡは、潜在的な出血性のリスクを低減させる。この組み合わせにおけるｔＰＡは小用量であり、ｍｐｒｏＵＫは血栓を溶解しうるが止血フィブリンは温存するため、この組み合わせは、虚血性脳卒中の可能性がある患者の処置に、脳内出血を悪化させるリスクをほとんど伴わずに、安全に使用することができる。よって、診断における臨床上の疑いに基づいて、救急車内で、処置を開始することが可能である。

本明細書に記載された方法は、心臓発作、例えば、急性心筋梗塞の処置にも使用し得る。心臓発作は、冠動脈の１つが、例えば、血栓によって、閉塞した場合に発症する。心筋に酸素を含んだ血液が欠乏している時間が長いほど、より多くの心筋が損傷を受け、または失われるため、心臓発作後の再灌流のタイミングは極めて重要である。現在選択される処置は、カテーテル法および血管形成術によるものであり、入院加療、利用できるカテーテル処置室、および準備の整ったスタッフが必要である。このことは、処置を遅らせ、高いコストを伴う。冠動脈閉塞後の最初の１時間は、この時間が、心筋を最大限に救済し、死亡率を最大限に低減することが可能な時間であることから、「ゴールデンアワー」と呼ばれる。ｔＰＡは、カテーテル法に伴う合併症の発生率を顕著に増大させることが多数の研究によって示さているため、カテーテル法前の時間確保のためのｔＰＡによる前処置は、一般に行われなくなっている。

心臓発作の症状がある対象は、本明細書に記載されているように、低用量のｔＰＡからなるボーラスの投与と、それに続くＭ５などのｍｐｒｏＵＫの注入によって処置し得る。経験的に、ｐｒｏ−ＵＫによる前処置は、カテーテル法後の合併症を伴わないことが示されており、よって、この組み合わせによる前処置は耐容性が高いであろうし、それに続くカテーテル法の必要性も低減させ得る。

Ｃ１インヒビター
Ｃ１インヒビターは、１０４ＫＤのセリンプロテアーゼインヒビターであり、正常血漿中濃度は約２５０μｇ／ｍｌ、半減期は約２８時間である。このタンパク質の欠損は、遺伝性血管浮腫と呼ばれる疾患と関連している。Ｃ１インヒビターの投与は、遺伝性血管浮腫の処置のために、長い間臨床的に用いられてきた。市販のＣ１インヒビターとしては、ＣＩＮＲＹＺＥ（登録商標）、ＣＥＴＯＲ（登録商標）、ＢＥＲＩＮＥＲＴ（登録商標）、およびＲＵＣＯＮＥＳＴ（登録商標）があげられる。

フィブリン溶解の間に生成される、活性酵素である２本鎖ＵＫまたはｍＵＫは、最終的に血漿中に放出され、プラスミノーゲンの活性化が起こりやすくなる。この活性をクエンチするためには、血漿インヒビターが必要である。米国特許第７，８３７，９９２号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、Ｃ１インヒビターのインヒビター複合体は、ヒトまたはイヌの血漿と、酵素であるｍＵＫとをインキュベーションすることにより、数分以内に出現した。Ｃ１インヒビターは、人体内に内因的に存在し、また薬理学的に補充することができる。内因性のＣ１インヒビターは、ｍＵＫの、例えば、ｔｃＭ５の活性を非常に効果的にクエンチするが、ＵＫの活性はクエンチしないことが示された（Ｇｕｒｅｗｉｃｈ Ｖ，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂｏｓ Ｈａｅｍｏｓｔ，２００６；４：１５５９〜１５６５；Ｐａｎｎｅｌｌ Ｒ，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ，２００７；５：１０４７〜１０５４；Ｇｕｒｅｗｉｃｈ，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ，２００９；１０２：２７９〜２８６）。米国特許第７，８３７，９９２号明細書に示されるように、Ｃ１インヒビターは、ｍＵＫを阻害することによって、血漿中で、Ｍ５のようなｍｐｒｏＵＫを効果的に安定化し、フィブリン特異性を弱めることなしに、より高濃度のＭ５のようなｍｐｒｏＵＫが耐容性になることを可能にした。

本明細書に開示された脳卒中または急性心筋梗塞の症状がある対象の処置方法は、さらに、Ｃ１インヒビターを含有する第３の組成物を対象に投与することを含み得る。Ｃ１インヒビターは、ボーラスとして、対象の血漿中において、Ｃ１インヒビターの通常の生理的濃度（約２５０μｇ／ｍｌ）より２〜３倍高い範囲内、すなわち、約５００〜約７５０μｇ／ｍｌのＣ１インヒビター濃度に到達するのに十分な量で投与し得る。例えば、第３の組成物は、５００〜１５００ｍｇのＣ１インヒビターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、第３の組成物は、第２の組成物の投与前に対象に投与し得る。いくつかの実施形態において、第３の組成物は、第２の組成物と同時に、対象に投与し得る。

医薬組成物、投薬レジメン、および投与方法
本発明が提供する医薬組成物は、特定の用量のｔＰＡと、ｐｒｏ−ＵＫ変異体、例えばＭ５とを、活性成分として含み得る。医薬組成物の活性成分、例えば、ｔＰＡまたはｍｐｒｏＵＫは、静脈内注射による送達用に製剤化され得る。

適切な医薬組成物の製剤化方法は、本技術分野で知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ ｅｄ．、２００５；ａｎｄ ｔｈｅ ｂｏｏｋｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ ａｎｄ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ（Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ）を参照のこと。例えば、非経口投与に用いるための溶液または懸濁液は、下記の成分を含み得る：無菌の賦形剤、例えば、注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩；および浸透圧調節剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムで調整することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製の、アンプル、使い捨て注射器、または多人数用バイアル内に封入することができる。

注射に適した医薬組成物は、無菌で注射可能な溶液または分散液を即時調製するための、滅菌水溶液（水溶性である場合）、分散液、および無菌粉末を含んでいてもよい。静脈内投与用の適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、クレモホールＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ＮＪ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）があげられる。全ての場合に、組成物は、無菌でなければならず、容易に注射可能である程度に流動性であるべきである。製造条件および保存条件において安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物による汚染活動に対して保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む、溶液または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合は必要な粒度を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。

微生物の活動は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、などによって阻止することができる。多くの場合、組成物に、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを含有させるのが好ましい。無菌の注射可能な溶液は、必要な量の活性化合物を、所望により上に列挙した成分の１種または組み合わせと共に、適切な溶媒に入れ、次いで滅菌濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒と、その他に、上記に列挙したもののうち必要な成分とを含む無菌の担体に入れることによって調製することができる。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それにより、活性成分に、前もって滅菌濾過した溶液に由来する、所望のあらゆる追加の成分が加えられた粉末がもたらされる。

医薬組成物は、投与のための指示書と共に、容器、パック、またはディスペンサーに入れられてもよい。

投薬レジメンは、最適な治療反応をもたらすように調節しうる。例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、６３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｒｅｕｔｅｒｓ、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ３０、２００８、を参照のこと。例えば、治療化合物の、用量、毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が死に至る用量）を決定するため、およびＥＤ５０（集団の５０％に治療効果が現れる用量）を決定するために、細胞培養または実験動物による標準的な医薬的手順によって決定することができる。毒性を示す用量と、治療効果を示す用量との用量比が、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０という比で表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物も使用され得るが、非感染細胞に対する潜在的な傷害を最小限にして、それによって副作用を低減させるために、そのような化合物が患部組織の部位を標的にする送達系を設計するように配慮すべきである。

細胞培養試験および動物実験から得られたデータは、ヒトに用いられる用量範囲を製剤化するために用いることができる。このような化合物の用量は、好ましくは、ＥＤ５０を含むと共に、毒性がほとんどないか、全くない血中濃度の範囲にあることが好ましい。用量は、使用する剤形、および利用する投与経路に依存して、前記範囲内で変わり得る。本発明の方法で使用するあらゆる化合物について、治療有効用量は、初めに、細胞培養試験から推定され得る。用量は、細胞培養で決定したように、動物モデルにおいて、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の抑制を実現する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を実現するように製剤化され得る。このような情報は、ヒトにおいて、より正確に有用な用量を決定するために使用し得る。血漿中の濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。

ｔＰＡのボーラスは、２〜５ｍｇのｔＰＡを含んでいてもよく、例えば、約２ｍｇ、約２．５ｍｇ、約３ｍｇ、約３．５ｍｇ、約４ｍｇ、約４．５ｍｇ、または約５ｍｇのｔＰＡを含んでいてもよい。ｍｐｒｏＵＫの、例えば、Ｍ５の静脈内投薬は、６０〜１２０ｍｇ／時（例えば、６０〜１００ｍｇ／時、７０〜９０ｍｇ／時、または７５〜８５ｍｇ／時）であってもよく、６０分間、６５分間、７０分間、７５分間、８０分間、８５分間、または９０分間にわたってもよい。Ｃ１インヒビターは、対象の血漿中のＣ１インヒビター濃度が約５００〜約７５０μｇ／ｍｌに到達するのに十分な量で、ボーラスとして投与してもよい。例えば、Ｃ１インヒビターのボーラスは、５００〜１５００ｍｇのＣ１インヒビターを含んでいてもよい。

脳卒中または急性心筋梗塞の患者にとって、再灌流に要する時間は、生存および臨床成績に重大な意味がある。これらの発見は、小用量のｔＰＡとＭ５との組み合わせが、より安全でより効果的な方法で、治療的な血栓溶解を実現し得ることを示唆している。よって、脳卒中または急性心筋梗塞の患者は、ほとんど遅れることなく、または全く遅れることなく、ｔＰＡとＭ５との組み合わせによる処置を受けることができる。

血栓溶解の効率は、溶解速度によって定義することができる。しかしながら、臨床的有用性は、前記の効率を、前記の溶解速度による出血性合併症の発生率で割ることを必要とする。本明細書に記載された併用療法を用いた場合、最適な組み合わせは、重大なフィブリノーゲン分解を生じることなく、溶解の最大速度を生じさせるため、証拠によれば、最大の臨床的有用性は存在しない（Ｐａｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、ＰＬＯＳ ＯＮＥ，ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１２２０１８ Ｍａｒｃｈ ２６、２０１５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。このことが、はるかに優れた臨床的有効率に寄与し、実際に、これによって最大の治療有効率が実現可能となり、すなわち、副作用を伴わずに、プラスミノーゲン活性化因子にとって最大の血栓溶解速度が可能となった。

キット
本発明は、少なくとも、１つの容器に入った、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）を含有する組成物と、別の容器に入った、ｍｐｒｏＵＫ、例えば、Ｍ５を含有する別の組成物とを含むキットを提供する。このキットは、本明細書に記載の治療方法を実施するために使用される。第１の組成物は、ボーラスとしての投与に適するように製剤化してもよく、２〜５ｍｇのｔＰＡを含有していてもよい。第２の組成物は、静脈内注入に適するように製剤化してもよい。第２の組成物は、６０〜９０分間の時間にわたる注入用に、６０〜１２０ｍｇ（例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０ｍｇ）のｐｒｏ−ＵＫ変異体を含んでいてもよい。キットは、Ｃ１インヒビターを含有する第３の組成物も含んでいてもよい。第３の組成物は、ボーラスとしての投与に適するように製剤化してもよく、約５００〜約１５００ｍｇのＣ１インヒビターを含んでいてもよい。

キットは、一般に、以下の主要な成分、すなわち容器、上記のひとまとまりの組成物、場合により対照、および指示書、を含む。包装は、組成物を含有するバイアル（または多数のバイアル）と、本明細書に記載された方法で使用する指示書とを保持する箱状の構造であってもよい。当業者は、個人の要求に合うように、包装を容易に改変することができる。

本発明が提供する組成物およびキットは、上記のあらゆる方法（例えば、治療方法）にしたがって使用することができる。例えば、組成物、ならびにｔＰＡを含有する組成物およびｐｒｏ−ＵＫ変異体、例えば、Ｍ５変異体を含有する別の組成物を含むキットは、脳卒中、心臓発作、または血栓によって生じる他の心血管系疾患、例えば末梢性壊疽の処置に使用することができる。当業者は、本明細書に記載の組成物およびキットのための他の適切な用途に気づくであろうし、組成物およびキットをそのような用途に使用することができるであろう。

実施例
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定するものではない。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ｔＰＡ／Ｍ５による、最大の血栓溶解速度での血栓溶解
ｔＰＡとＭ５との特定の組み合わせのフィブリン溶解効果およびフィブリノーゲン溶解効果を、ヒト血漿環境において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで検討した。

材料
プロウロキナーゼの３００位のアミノ酸における、リジンからヒスチジンへの置換（Ｌｙｓ３００→Ｈｉｓ）を含むｍｐｒｏＵＫ（Ｍ５）は、Ｅ．ｃｏｌｉから、ＰｘＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（グルノーブル、フランス）によって調製された。組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（サウスサンフランシスコ、ＣＡ）から入手した。ヒトフィブリノーゲン（Ｋａｂｉ、グレードＬ）は、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ（ミラノ、イタリア）から入手した。アプロチニンおよびイソチオシアン酸フルオレセインは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（セントルイス、ＭＯ）から入手した。トロンビン（ＴｈｒｏｍｂｏＭａｘ、１００ＮＩＨ Ｕ／ｍｌ）は、Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ＭＯ）から入手した。臨床グレードのＣ１インヒビターは、ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ（マールブルク、ドイツ）から入手した。４人のドナーからプールした、血液バンクの古くなったヒト血漿を実験に用いた。

それぞれ異なる動物モデルは、ヒトｐｒｏ−ＵＫに対する感受性が異なることに留意すべきである（例えば、Ｇｕｒｅｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７３：１７３１〜１７３９（１９８４）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の表１を参照のこと）。よって、動物の用量は、ヒトの用量決定に用いることはできず、ここに記載された用量は、ヒトの試験における個別の要素を用いた経験に基づくものである。ヒト血漿におけるＩｎ ｖｉｔｒｏ試験により、同じ溶解速度のためには、Ｍ５は、ｐｒｏＵＫに対して２倍の量が必要であることが示された。ｐｒｏＵＫ／Ｍ５に関する単剤療法の用量は、フェーズ３試験から分かっており、本明細書に記載された、新たに発見された併用療法の方法における、小用量のｔＰＡと低用量のＭ５とは、この２倍の係数に基づいている。

血栓溶解実験
Ｍ５によるフィブリン溶解は、インヒビターを含有する血漿環境で検討した。血栓は、痕跡量のトロンボプラスチンおよび蛍光標識フィブリノーゲン存在下、３５ｍＭのカルシウムによる、０．２ｍｌの血液バンクのプール血漿におけるカルシウム再沈着によって作成した（Ｄｍｉｔｒｙ Ｖ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９６；２７１：２１３３〜２１３８を参照のこと）。次いで、血栓を、１時間、３７℃でインキュベートし、続いて終夜、室温でインキュベートした。翌日、血栓を、２ｍｌの血液バンクの血漿中に入れ、次いで、ｔＰＡ、Ｍ５、またはｔＰＡとＭ５との組み合わせを加えた。血栓溶解を、５０μＬの血漿をある一定の時点に採取し、蛍光発光を測定することによってモニターした。試料の蛍光発光は、血栓から遊離したフィブリン分解産物の量を示す。いくつかの実験において、血漿量を５ｍｌに増量し、蛍光標識フィブリノーゲンの希釈を補うために、未標識のフィブリノーゲンを加えた。これらの実験において、血栓溶解の終了は、視覚的に判定した。

各血栓溶解実験は、３連で行った。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍを、グラフを作成し、統計解析を行うために使用した。

溶解曲線は、血栓の経時的な溶解率（パーセント）としてプロットした。１００％点は、最高読み取り値の平均から得た。ベースラインの読み取り値を、開始時に血漿が示す蛍光量（最大信号の約１５％）を差し引くことによって取得し、ゼロ点を得た。各実験条件において、５０％溶解時間は、溶解グラフから決定し、第一のエンドポイントとして用いた。

血栓溶解後に残存したフィブリノーゲンの決定
血栓溶解が完了した後、最終の血漿試料（１．０ｍｌ）を、残存したフィブリノーゲンを決定するために取得した。さらなるタンパク質分解を防ぐために、アプロチニン（２００ＫＩＵ／ｍｌ）を試料に加えた。残存したフィブリノーゲンは、フィブリノーゲンのベースライン（ＢＬ）に対する割合（パーセント）として記録した。

フィブリノーゲンは、トロンビンで凝固し得るタンパク質として測定した。血漿試料を同量のリン酸緩衝生理食塩水で希釈した後、２００μＬのトロンビン（１，０００ＮＩＨ 単位／ｍｌ溶液）を加えた。溶液を穏やかに混合し、１時間、３７℃でインキュベートした後、終夜、室温でインキュベートした。翌朝、各血栓を、細くて軸の長いプラスチック製ホールピペットの、ゲルを接着した先端に巻きつけ、そして試験管壁、次いでペーパータオルに押しつけることによって、血清部分を絞り出した。ピペット軸上の白色のフィブリンを、次いで少なくとも５ｍｌの生理食塩水中に、少なくとも１時間入れておき、残ったあらゆる血清タンパク質を拡散させた。次いで、フィブリンをピペットの先端からはがし、１ｍｌの５％ＮａＯＨに入れ、１分間煮沸し、次いで全てのフィブリンが溶液になるまで室温に置いた。溶液中のタンパク質は、２８０ｎｍの分光光度測定で測定した。

ｔＰＡ単独またはＭ５単独による、最短の溶解時間の決定
血栓溶解実験は、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、または３μｇ／ｍｌのｔＰＡ存在下、上述したように行った。溶解曲線は、血栓の経時的な溶解率（パーセント）としてプロットし、各実験条件において５０％の血栓を溶解するのに要する時間を溶解曲線から決定した。溶解の最短時間（そこから最大の血栓溶解速度を決定し得る）は、用量依存的な溶解時間のさらなる短縮が起こらない時間として決定した。代表的な実験の結果を図１Ａに示し、ｔＰＡによって５０％の血栓を溶解するのに要する最短時間は、３μｇ／ｍｌのｔＰＡを使用した場合、６０分間であることがわかった。よって、最大の血栓溶解速度は、１時間で５０％の血栓溶解である。

図１Ｂは、試験した各ｔＰＡ用量について、溶解終了時において残存したフィブリノーゲンのベースライン濃度に対する割合（パーセント）が、１９％〜４５％の範囲であることを示す。このように、ｔＰＡ単独で、５５％〜８１％のフィブリノーゲン分解を引き起こした。

Ｍ５について、血栓溶解実験を、１０μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、または１５μｇ／ｍｌのＭ５存在下、上述したように行った。Ｍ５によって５０％の血栓を溶解するのに要した最短の時間は、１５μｇ／ｍｌのｍｐｒｏＵＫを使用した場合、５０分間であると決定された（図２Ａ）。よって、最大の血栓溶解速度は、５０分間で５０％の血栓溶解である。

各Ｍ５用量について、溶解終了時において残存したフィブリノーゲンのベースライン濃度に対する割合（パーセント）は、２５％〜５５％の範囲であり、図２Ｂに示されている。このように、Ｍ５単独で、４５％〜７５％のフィブリノーゲン分解を引き起こした。

Ｍ５によるフィブリノーゲン溶解に対するＣ１インヒビターの効果
フィブリノーゲン溶解を防ぐために、血栓溶解実験において、１０μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、または１５μｇ／ｍｌのＭ５を添加する前に、血漿に、７５０μｇ／ｍｌのＣ１インヒビターを加えた。７５０μｇ／ｍｌのＣ１インヒビターの存在によって、Ｍ５によって５０％の血栓を溶解するのに要する時間は影響を受けず、依然として５０分間のままであった（図２Ｃ）。しかしながら、図２Ｄに示すように、Ｃ１インヒビターが存在する場合、フィブリノーゲン分解はほとんど起こらなかった。

Ｃ１インヒビター実験は、既に、ｔＰＡによる血栓（ｂｌｏｏｄ ｂｌｏｔ）溶解をＣ１インヒビターが阻害することが示されているため（Ｔｏｍａｓｉ Ｓ、ＰＬｏｓ Ｏｎｅ．、２０１１；６：ｅ２１９９９）、ｔＰＡについては繰り返さなかった。

小用量のｔＰＡと、低用量のＭ５との組み合わせによる最大の血栓溶解速度
最短の溶解時間（および最大の血栓溶解速度）を実現するために必要な、併用した場合の、ｔＰＡおよびＭ５の最低用量を決定するために、ｔＰＡとＭ５との種々の組み合わせおよび種々の比率を用いて、血栓溶解実験を行った。最大の血栓溶解速度を安定して実現するための、併用した場合の、ｔＰＡおよびｍｐｒｏＵＫの最低用量は、ｔＰＡが０．２μｇ／ｍｌ、およびのＭ５が６μｇ／ｍｌと決定された。これらの用量は、ｔＰＡとＭ５とを、単剤療法において単独で用いた場合に、最短の溶解時間を実現するために必要とされるｔＰＡ用量の６％と、最短の溶解時間を実現するために必要とされるＭ５用量の４０％とに相当する。図３は、代表的な血栓溶解実験の結果を示し、０．２μｇ／ｍｌのｔＰＡと、６μｇ／ｍｌのＭ５との組み合わせによって５０％の血栓を溶解するのに要する時間は、５３分間であったのに対し、６μｇ／ｍｌのＭ５単独で５０％の血栓を溶解するのに要した時間は、１３５分間であり、０．２μｇ／ｍｌのｔＰＡ単独で５０％の血栓を溶解するのに要した時間は、２２５分間であった。これらの結果は、小用量のｔＰＡ、例えば、０．２μｇ／ｍｌのｔＰＡによって、Ｍ５による血栓溶解時間が大幅に短縮されることを実証する。この観測結果は、フィブリン溶解の惹起におけるｔＰＡの機能と整合性がある。

図４Ａは、１０回の代表的な血栓溶解実験の結果を示し、前記の組み合わせ（０．２μｇ／ｍｌのｔＰＡ＋６μｇ／ｍｌのＭ５）（丸）を用いてもたらされた５０％溶解時間の平均は、ほぼ７５分間であった。この用量のＭ５単独（三角）では、溶解時間は、１３５分間であり、ｔＰＡ単独（四角）でもたらされた溶解時間は、２２５分間であった。これらの発見により、小用量のｔＰＡが、Ｍ５による溶解開始を約４５％短縮させることが示される。図４Ｂは、フィブリノーゲンのベースライン（ＢＬ）に対する割合（パーセント）として表した、溶解終了時における血漿フィブリノーゲンを示す。全ての実験は、３連で行った。

組み合わせにおけるｔＰＡの機能が、フィブリン溶解の惹起に限られるのかを試験するために、血栓溶解実験を４種類のｔＰＡ−Ｍ５の組み合わせを用いて実施した。各ｔＰＡ−Ｍ５の組みあわせは、固定された６μｇ／ｍｌの用量のＭ５と、０．２μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、および３．０μｇ／ｍｌから選択された異なる用量のｔＰＡとを含む。試験した４種全ての組み合わせについて、５０％の血栓を溶解するのに要した時間は、約４８〜約６０分間であり、用量が０．２μｇ／ｍｌを超えるｔＰＡ用量によって５０％の血栓を溶解するのに要する時間がさらに短縮することはなかった（図６）。これらの発見は、組み合わせにおけるｔＰＡの機能が、フィブリン溶解の惹起のために重要であるが、惹起を超えたフィブリン溶解には寄与しないということと整合性がある。

多数の血栓実験からの、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける５０％の血栓を溶解するのに要する時間の平均を、表にして比較した。図７は、０．２μｇ／ｍｌのｔＰＡと、６μｇ／ｍｌのＭ５との組み合わせによる、５０％の血栓を溶解するのに要する時間が、平均４８（±２．５）分間（ｎ＝１０）であり、０．２μｇ／ｍｌのｔＰＡ単独により、５０％の血栓を溶解するのに要する時間が、平均１５６（±５．３）分間（ｎ＝５）であり、６μｇ／ｍｌのＭ５単独については、平均１１８（±７．２）分間（ｎ＝７）であり、１５μｇ／ｍｌのＭ５単独については、平均４８（±１．６）分間（ｎ＝９）であり、３μｇ／ｍｌのｔＰＡ単独については、平均５５（±５）分間（ｎ＝６）であったことを示す。０．２μｇ／ｍｌのｔＰＡと、６μｇ／ｍｌのＭ５との組み合わせによる、５０％の血栓を溶解するのに要した時間は、０．２μｇ／ｍｌのｔＰＡ単独、または６μｇ／ｍｌのＭ５単独よりも、著しく短い（図７）。ｔＰＡ単独およびｍｐｒｏＵＫ単独で、非常に高用量において、例えば、３μｇ／ｍｌのｔＰＡで、または１５μｇ／ｍｌのＭ５で、同様の血栓溶解時間を実現できるが、そのような用量においては、プラスミノーゲンの非特異的な活性化と、その結果として、血友病様の副作用が生じる可能性がある。

ｔＰＡとＭ５との組み合わせによるフィブリノーゲン溶解に対する、量（体積）およびＣ１インヒビターの効果
フィブリン溶解の間に、ｍｐｒｏＵＫはプラスミンによって活性化されて、ｍＵＫに変換され、次いで、それが血漿中に拡散し得る。血栓に対するタンパク質分解の確認は、血漿インヒビター、例えば、Ｃ１インヒビターの機能となる。試験管内では、ｉｎ ｖｉｖｏにおける体積と比べて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて血漿の体積が限られていることによる影響が生じ得る。したがって、血栓溶解実験は、以下の３種の条件、すなわち（１）２ｍｌという対照の血漿量、（２）５ｍｌという増やした血漿量、および（３）５００μｇ／ｍｌのＣ１インヒビターを加えた、２ｍｌの血漿、で行った。これらの実験には、未標識の血栓を用い、試験した３種全ての条件において、１００％の血栓を溶解するのに要した時間は、７５〜８０分間であることが確認された。標準的な２ｍｌの血漿量において、ｔＰＡ−Ｍ５の組み合わせは、７０％のフィブリノーゲンを分解し、これはプラスミンによる急速なｔｃＭ５生成速度を反映している（図８）。Ｃ１インヒビターを加えた場合、フィブリノーゲン溶解は４５％に低下し、残存したフィブリノーゲンは５５％であった（図８）。５ｍｌの血漿量においても同様の効果が観察され、これは、おそらく血栓に近接する環境におけるｔｃＭ５の希釈を反映するものである（図８）。この体積効果は、ｔＰＡ−Ｍ５の組み合わせによるフィブリノーゲン溶解が、血栓に対する血漿の体積比がかなり大きいｉｎ ｖｉｖｏにおいて、さらに減衰するであろうことを示唆している。

Ｃ１インヒビターの、図２Ｄと比較した場合の、より小さな効果は、ｔＰＡ−Ｍ５の組み合わせによって引き起こされる、Ｍ５の単剤療法と比較して、より速い、フィブリン依存性のプラスミン生成に関連している。このことは、Ｍ５単独によるフィブリノーゲン溶解を阻害するＣ１インヒビターの能力と比較した場合、ｔＰＡ−Ｍ５の組み合わせによるフィブリノーゲン溶解を阻害するＣ１インヒビターの能力は低下している、という追加の研究によって確認されている。Ｃ１インヒビターは、比較的低速なインヒビターであり、よって、ｔＰＡ−Ｍ５の組み合わせによって実現されるより急速なフィブリン溶解のために、より急速に生成されるｔｃＭ５をクエンチする能力がより低い。ｔＰＡ−Ｍ５の組み合わせによって生成されるｔｃＭ５を十分にクエンチするためには、より高濃度のＣ１インヒビターが必要とされるであろう。

図５Ａは、Ｃ１インヒビターと共に、前記の組み合わせ（０．２μｇ／ｍｌのｔＰＡ＋６μｇ／ｍｌのＭ５）（丸）を使用した、代表的な血栓溶解実験の結果を示す。Ｃ１インヒビター（７５０μｇ／ｍｌ）を、活性化因子を添加した３０分後に加えた。図５Ａに示すように、これによって溶解は阻害されず（丸）、平均でほぼ３０分に短縮されたが、ｔＰＡ単独による溶解は阻害した（四角）。図５Ｂは、フィブリノーゲンのベースライン（ＢＬ）に対する割合（パーセント）として表した、溶解終了時の血漿フィブリノーゲンを示す。図５Ｂに示すように、Ｃ１インヒビターは、フィブリノーゲン溶解を減衰させた。全ての実験は３連で行った。

血栓が存在しない場合におけるｔＰＡ−Ｍ５の組み合わせによるフィブリノーゲン溶解
血栓が存在しない場合の、ｔＰＡ−Ｍ５の組み合わせのフィブリノーゲン溶解に対する効果を試験するために、０．２μｇ／ｍｌのｔＰＡと、６μｇ／ｍｌのＭ５との組み合わせを、血漿と共に、３７℃でインキュベートし、２〜５時間後にフィブリノーゲンの測定のために試料を採取した。図９に示すように、少なくとも３時間、すなわち治療的な血栓溶解の持続時間を十分に超えて、フィブリノーゲン溶解は起こらなかった。これらの発見は、ｔＰＡ−Ｍ５の組み合わせによって引き起こされるプラスミン生成は、フィブリン依存性であり、血栓が存在しない場合、このフィブリン溶解性の組み合わせは、プラスミノーゲンの活性化を引き起こさないことを示す。

ｔＰＡとＭ５との組み合わせによる、Ｉｎ Ｖｉｖｏにおける血栓溶解
雄の雑種犬（１０〜１５ｋｇ）をペントバルビタールナトリウムで麻酔し、室内気を吸わせておいた。米国特許第７，０７４，４０１号明細書に記載されているように、１ｍｌのネイティブのイヌ全血から血栓を形成させ、そこに放射性標識フィブリノーゲン（１．９μＣｉ、０．７５ｍＣｉ／ｍｇタンパク質）およびトロンビン（１０単位）を加えた。２０分後、血栓を生理食塩水で３回洗浄し、次いで小片（約１ｍｍ^３）に切断し、１６ゲージの注射針で大腿静脈内に注射した。１５分後、ベースラインの放射能を測定するために、対側の大腿静脈内のカニューレで血液試料を取得した。

イヌを４つのグループに分け、（１）生理食塩水、（２）２〜５ｍｇのｔＰＡのボーラス、（３）Ｍ５の静脈内注入（２０μｇ／ｋｇ／分）を６０分間、または（４）２〜５ｍｇのｔＰＡのボーラス後、Ｍ５の静脈内注入（２０μｇ／ｋｇ／分）を６０分間、の注入を行う。注入間のインターバルの間に、血液試料を取得し、放射能およびフィブリノーゲンを測定した。血栓を溶解するのに要する時間を決定し、４グループ間で比較する。

脳内出血（ＩＣＨ）ラットモデルにおけるＣ１インヒビターおよびＭ５の特性
本試験の目的は、脳内出血（ＩＣＨ）量（体積）に対するＭ５の効果を研究することである。

２０匹の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ成体ラットを、試験に用いた。ラットは、手術当日に、無作為に選択して用いた。ラットには、テールマーキングによって固有の識別番号を付けた。手術開始の直前に、セファゾリンナトリウム腹腔内注射液（４０ｍｇ／ｋｇ、Ｈｏｓｐｉｒａ １０１Ｃ０４９）およびブプレノルフィン皮下注（１ｍｇ／ｋｇ、Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ、２１９２０２）を、動物に投与した。ラットが、イソフルラン麻酔（１．５％〜２％）下、亜酸化窒素・酸素混合ガス（２：１）中で自発呼吸している間に、小さな穿頭孔をあけ、３０ゲージの１０μｌ顕微注射用注射針（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、７００シリーズ）をゆっくりと右線条体中に下降させ、続いて調整し、ブレグマから、前方０．０ｍｍ、側方３ｍｍ、および深さ６ｍｍにした。３分間の間、０．４５ＵコラゲナーゼＶＩＩ−Ｓ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）を含む生理食塩水３μｌを注射した。注射針を２分間その位置においておき、次いで、５分間かけてゆっくりと抜いた。その後、頭皮をステープルで閉じ、ラットを回復させた。全ての外科的処置は、各ラットにつき約２０分間かかった。動物の体温を維持するために、温熱パッド（３７±１℃）を使用する。

Ｃ１インヒビターおよび被験物質（Ｍ５）は、投与前に製剤化した。試験溶液は、毎日の使用の間、氷上で保存した。使用せずに残った溶液は、−２０℃で保存した。４ｍｌ／ｋｇでのボーラス（ＩＶ）直後、動物に、４ｍｌ／ｋｇで、（３０分間にわたり）静脈内注入によって投薬した（ＩＣＨの１５分後に開始した）。注入開始から２時間後に、動物を、イソフルラン下、１００％のＮ_２Ｏ吸入で人道的に殺した。脳を取り出し、ラット用の２ｍｍブレインマトリックスによって切片を作成した。標準化された条件で、デジタルカメラを用いて、脳切片の画像を取得した。血腫のサイズは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで算出した（オンラインで、ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊで利用できる。）。

出血誘発から２時間後、ラットを深い（５％）イソフルラン麻酔（１００％ Ｎ_２Ｏ）下で屠殺した。脳を取り出し、氷上のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に入れた。脳を、それぞれ２ｍｍの７枚の切片にスライスし、血腫を視覚的に評価するために撮影した。個々の切片について、組織学的な評価は行わなかった。ヘモグロビン量は、出血量（体積）の定量的な測定によって決定した。出血側（７つの全ての切片が含まれる）を正常側と分けて、１．５ｍｌの冷ＰＢＳ中においた。３０秒間ホモジナイズ（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ２１００を用いて手動で実施）した後、１分間超音波にかけて赤血球膜を溶解させた。３０分間遠心（１３０００ｒｐｍ、４℃）した後、２００μＬの上清を８００μＬのＤｒａｂｋｉｎ試薬（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）に加え、１０分間、室温で放置した。光度計を使用して、５４０ｎｍで吸収率を決定し、標準曲線に基づいて、傷害を受けた大脳半球について、出血した血液量（体積）を算出した。標準曲線は、年齢および重量が（試験対象の平均に）合致した、８個のナイーブな大脳半球を使用して作成した。これらのナイーブな大脳半球に、同じ個体からのプール血液を、体積を増やしながら（０〜１９２μＬ）スパイクした。統計的有意性は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって評価した。

出血のサイズを測定したタイミング（出血誘発から２時間後）は、Ｂｉｏｔｒｏｆｉｘにおいて最適化された、先行研究に基づいて決定した。

ラットに、上記したように、ＩＣＨの１５分後に、ビヒクル（生理食塩水）（４ｍｌ／ｋｇ）のボーラス（４ｍｌ／ｋｇ）を投与し、続けて、直ちにビヒクルまたはＣ１インヒビター（２００Ｕ／４ｍｌ／ｋｇ）のボーラスを３０分間注入し、続けて、直ちにＭ５（１０ｍｇ／４ｍｌ／ｋｇ）を３０分間注入した。

臨床観察および生存
全ての動物は、この試験の試験期間を生き延びた。番号２４の動物は、この動物で引き起こされた出血は、解析に含めるには不十分だったため、解析から除外した。

出血量の組織学的な決定
Ｍ５（直ちに）と、それに続くＣ１インヒビターのボーラス注射を、ＩＣＨラットモデルで検討した。このモデルにおいて、脳の右線条体内へのコラゲナーゼの注射によって、脳内出血を誘発させた。負傷の１５分後に、Ｍ５（１０ｍｇ／４ｍｌ／ｋｇの用量で）、またはビヒクルを３０分間の静脈内注入によって投与し、直後に、上記したように、ボーラス注射を行った。Ｃ１ｉｎｈ／Ｍ５を投与した動物と、生理食塩水／生理食塩水を投与した動物との間に有意差は認められなかった（ｐ＝０．６８９９）（図１）。

直接的な血腫量（体積）
組織学的な出血量の決定による場合と同様に、Ｃ１ｉｎｈ／Ｍ５を投与した動物と、生理食塩水／生理食塩水を投与した動物との間に有意差は認められなかった（ｐ＝０．５１９４）（図１０Ａおよび１０Ｂ）。図１０Ａは、ラットモデルにおける脳内出血後の血腫量を示す棒グラフである。脳内出血は、コラゲナーゼの定位的な注射によって誘発させた。ラットは、負傷の１５分後に、Ｃ１インヒビターをボーラス注射で投与され、続けて、直ちにＭ５（１０ｍｇ／４ｍｌ／ｋｇの用量で）を３０分間注入された。血腫量は、投薬後２時間におけるヘモグロビン量によって測定した。Ｃ１ｉｎｈ／Ｍ５を投与した動物と、生理食塩水／生理食塩水を投与した動物との間に有意差は認められなかった（ｐ＝０．５１９４）。

図１０Ｂは、ラットモデルにおける脳内出血後の出血量の組織学的な決定を示す棒グラフである。脳内出血は、コラゲナーゼの定位的な注射によって誘発させた。ラットは、負傷の１５分後に、Ｃ１インヒビターをボーラス注射で投与され、続けて、直ちにＭ５（１０ｍｇ／４ｍｌ／ｋｇの用量で）を３０分間注入された。Ｃ１ｉｎｈ／Ｍ５を投与した動物と、生理食塩水／生理食塩水を投与した動物との間に、出血量に有意差は認められなかった（ｐ＝０．６８９９）。

このコラゲナーゼで脳内出血を誘発したラットモデルにおいて、ＩＣＨ誘発の１５分後に投与した、Ｃ１インヒビター／Ｍ５の投与は、生理食塩水／生理食塩水で処置した動物と比較して、血腫量および出血サイズに違いを生じなかった。よって、Ｍ５は、この脳卒中モデルにおいて出血を誘発せず、または出血を増大させず、よって、出血性の脳卒中などの出血性イベントにおける使用に安全なはずである。

ｔＰＡとＭ５との組み合わせによる臨床試験
年齢１８歳以上３５歳以下、体重が少なくとも６０ｋｇでボディ・マス・インデックス（ＢＭＩ）が１８．５ｋｇ／ｍ^２以上２５ｋｇ／ｍ^２以下の、健康な男性対象を臨床試験に登録した。これらの対象は、スクリーニング時および試験第１日目において、内因性のＣ１インヒビター濃度、α２−抗プラスミン濃度、およびフィブリノーゲン濃度が正常であり、ＨＩＶ、ＨＢｓＡｇ、およびＨＣＶについて血清学的に陰性であり、アルコールおよび薬物の乱用に関する試験で陰性であった。対象には、臨床的に大きな異常はあり得なかった。

対象は、以下の基準の１つ以上にあてはまる場合は組み入れられず、その基準は（１）対象が、止血経路もしくは凝集経路に影響するか、出血傾向の増大を伴うことがわかっているもしくは疑われている、遺伝的、先天的、または後天的な疾患もしくは状態を有している、（２）対象が、臨床的に重大な出血イベント、または試験中に相当な時間にわたって検出されない出血イベントを起こす合理的な可能性がある、例えば、対象が、（ａ）予期される投与日前３か月以内に、大きな（内臓の）手術または外傷を受けている、（ｂ）腸または大脳の血管奇形を有している、（ｃ）予期される投与日から２週間以内に、衝撃の大きいコンタクトスポーツ、例えばキックボクシングに参加した、（３）対象が、本プロトコルによって、投与前に製品の除去半減期の少なくとも７倍のウォッシュアウト期間を経なければ認められない、何らかの全身吸収性の薬物または物質（処方薬、一般用医薬品、または代替薬を含む）の投与を受けた、（４）対象が、どのような形態にせよ、投与の３か月以内にたばこを喫煙したか、平均で、１日に５本以上の紙巻きたばこ（またはそれと同等のもの）を喫煙していたことがある、（５）対象が、投与日の前年に、血液または血漿分画製剤の輸血または投与を受けた、（６）対象が、投与の３か月前に、地域の献血機関（ｉ．ｃ．Ｓａｎｑｕｉｎ）による限度を超えた血液または血漿を失った、（７）対象が、治験物質または関連するいずれかの化合物に対して既知の過敏症である、（８）対象が、重篤な過敏症または激しい反応を伴うアレルギーの病歴を有する、（９）対象が、カフェイン、たばこ、およびアルコールを含む、物質乱用の経歴がある、（１０）対象が、治験責任医師の意見によれば、対象の健康もしくは福祉、または試験結果の化学的完全性を危険にさらし得る状態であるか、危険にさらし得る態度を示している、（１１）対象が、精神的または法律的に、インフォームドコンセントに同意する能力がない、ことである。

登録された対象は、以下の処置群の１つに無作為に割り当てる。
（１）２．５ｍｇのｔＰＡからなるボーラスの注射と、それに続くｍｐｒｏＵＫ、例えば、Ｍ５の、ほぼ８０ｍｇ／時（単剤療法の用量の５０％）で、６０〜９０分間にわたる静脈内注入、
（２）２．５ｍｇのｔＰＡからなるボーラスの注射と、それに続くプラセボの、６０〜９０分間にわたる静脈内注入、
（３）プラセボボーラスの注射と、それに続くｍｐｒｏＵＫ、例えば、Ｍ５の、ほぼ１６０ｍｇ／時で、６０〜９０分間にわたる静脈内注入、または
（４）２．５ｍｇのｔＰＡからなるボーラスの注射と、それに続くＣ１インヒビター（Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標））のボーラス（例えば、１０００ＥＵ（２バイアル））、およびｍｐｒｏＵＫ、例えば、Ｍ５の、ほぼ８０ｍｇ／時（単剤療法の用量の５０％）で、６０〜９０分間にわたる静脈内注入。

ｍｐｒｏＵＫの用量は、６０〜１２０ｍｇ／時の範囲である。Ｃ１インヒビターのボーラスは、（対象の体重を基準として）２５〜１００Ｕ／ｋｇのＢｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）からなる。この試験は、プラスミン血症が生じた場合、または十分なデータが集まった場合、のいずれかの場合に終了する。

この試験で集められたデータを元に、ｔＰＡと、ｍｐｒｏＵＫ、例えばＭ５との組み合わせについて、全体的な安全性および忍容性を評価した。ｍｐｒｏＵＫによって引き起こされる凝集の変化に対する、低用量のｔＰＡの効果を評価した。ｔＰＡ−ｍｐｒｏＵＫの組み合わせの全体的な安全性および忍容性に対するＣ１インヒビターの単回投与の効果、ならびにｔＰＡ−ｍｐｒｏＵＫによって引き起こされる凝集の変化に対するＣ１インヒビターの単回投与の効果を評価した。

他の実施形態
本発明は、発明の詳細な説明に関連して説明されているが、前記した説明は例示を意図するものであり、発明の範囲を限定することを意図するものではなく、発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって画定されるものと理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (38)

1. 付随する出血性副作用が最小であると同時に、血栓溶解速度が最大である、脳卒中または急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の症状がある対象を処置する方法であって、
   （ａ）脳卒中の原因を決定することなしに、脳卒中またはＡＭＩの１つまたは複数の症状を観察することによって、脳卒中またはＡＭＩを起こしている可能性がある対象を特定すること、および
   （ｂ）５ｍｇ未満の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）を含有する第１の組成物のボーラスを対象に投与し、続いて、プロウロキナーゼ変異体（ｍｐｒｏＵＫ）を含有する第２の組成物を、６０〜９０分間にわたり、６０〜１２０ｍｇ／時の速度で注入することで、静脈内注入することを含み、
   付随する出血性副作用が最小であることと同時に、最大の血栓溶解速度が達成される、
   前記方法。
2. 対象が、脳卒中の症状を有する、請求項１に記載の方法。
3. 付随する出血性副作用が最小であることが、対象の血液におけるフィブリノーゲンの分解度が約３０％未満であることとして決定される、請求項１に記載の方法。
4. 最大の血栓溶解速度が達成されたことが、心筋梗塞における血栓溶解（ＴＩＭＩ）が２以上であることによって示される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 最大の血栓溶解速度が達成されたことが、対象における少なくとも１つの血栓の質量の約５０％の溶解が、７５分以内に実現したことによって示される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. プロウロキナーゼ変異体が、プロウロキナーゼの３００位のアミノ酸における、リジンからヒスチジンへの置換（Ｌｙｓ３００→Ｈｉｓ）を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. ボーラスが、２〜４．５ｍｇのｔＰＡを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. ボーラスが、２〜４．０ｍｇのｔＰＡを含む、請求項７に記載の方法。
9. ボーラスが、２ｍｇのｔＰＡを含む、請求項７に記載の方法。
10. 第２の組成物が、ｍｐｒｏＵＫの、６０〜９０ｍｇ／時の速度での静脈内注入として、６０〜９０分間にわたり投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 第２の組成物が、ｍｐｒｏＵＫの、６０〜８０ｍｇ／時の速度での静脈内注入として、６０分間にわたり投与される、請求項１０に記載の方法。
12. 第２の組成物の投与が、第１の組成物の投与後、５分以内に開始される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 第１の組成物と第２の組成物とが、一緒になって、対象における少なくとも１つの血栓の質量の５０％を、１時間未満で溶解する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. Ｃ１インヒビターのボーラスを含有する第３の組成物を対象に投与することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 第３の組成物が、第２の組成物の投与前に対象に投与される、請求項１４に記載の方法。
16. 第３の組成物が、第２の組成物とほぼ同時に対象に投与される、請求項１４に記載の方法。
17. 第３の組成物が、対象の血液中のＣ１インヒビター濃度が約５００〜約７５０μｇ／ｍｌに到達するのに十分な量で投与される、請求項１４に記載の方法。
18. 第３の組成物が、Ｃ１インヒビターの５００〜１５００ｍｇのボーラスを含む、請求項１４に記載の方法。
19. 第１の組成物と第２の組成物とが、一緒になって、Ｃ１インヒビター存在下、ｔＰＡ単独またはプロウロキナーゼ単独のいずれか一方の単剤療法と比較して、フィブリノーゲンの分解が３０％未満の状態で、血栓を溶解する、請求項１４に記載の方法。
20. 第１の容器に入った、２〜５ｍｇの組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）を含有する第１の組成物と、
    第２の容器に入った、プロウロキナーゼの３００番目のアミン酸位置において、リジンからヒスチジンへの置換（Ｌｙｓ３００→Ｈｉｓ）を含む６０〜１２０ｍｇのプロウロキナーゼ変異体（ｍｐｒｏＵＫ）を含有する第２の組成物とを含む、キット。
21. 第１の組成物が、ボーラスとしての投与に適するように製剤化される、請求項２０に記載のキット。
22. 第２の組成物が、静脈内注入に適するように製剤化される、請求項２０に記載のキット。
23. ５００〜１５００ｍｇのＣ１インヒビターを含有する第３の組成物をさらに含む、請求項２０に記載のキット。
24. 第３の組成物が、ボーラスとしての投与に適するように製剤化される、請求項２３に記載のキット。
25. 付随する出血性副作用が最小であると同時に、血栓溶解速度が最大である、脳卒中または急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の症状がある対象の処置に使用するための組成物であって、前記組成物が、
    ５ｍｇ未満の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）を含有する第１の組成物を含み、前記第１の組成物は、ボーラスの投与レジメンで対象に投与され、または投与するために調製され、かつ
    プロウロキナーゼ変異体（ｍｐｒｏＵＫ）を含有する第２の組成物を含み、前記第２の組成物は、第１の組成物の投与に続き、６０〜１２０ｍｇ／時で６０〜９０分間にわたる投与レジメンで、静脈内注入によって対象に投与され、または投与するために調製され、
    ここで、前記対象は、第１の組成物の投与に先立って、脳卒中の原因を決定することなしに、脳卒中またはＡＭＩの１つまたは複数の症状を観察することによって、脳卒中またはＡＭＩを起こしている可能性があるものと特定され、
    付随する出血性副作用が最小であることと同時に、最大の血栓溶解速度が達成される、
    前記組成物。
26. 脳卒中の症状がある対象に、処置を施すために使用する、請求項２５に記載の組成物。
27. 付随する出血性副作用が最小であることが、対象の血液におけるフィブリノーゲンの分解度が約３０％未満であることとして決定される、請求項２５または請求項２６に記載の組成物。
28. 最大の血栓溶解速度が達成されたことが、心筋梗塞における血栓溶解（ＴＩＭＩ）が２以上であることによって示される、請求項２５または請求項２６に記載の組成物。
29. 最大の血栓溶解速度が達成されたことが、対象における少なくとも１つの血栓の質量の約５０％の溶解が、７５分以内に実現したことによって示される、請求項２５または請求項２６に記載の組成物。
30. プロウロキナーゼ変異体が、プロウロキナーゼの３００位のアミノ酸における、リジンからヒスチジンへの置換（Ｌｙｓ３００→Ｈｉｓ）を含む、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
31. ボーラスが、２〜４．５ｍｇのｔＰＡを含む、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
32. ボーラスが、２〜４．０ｍｇのｔＰＡを含む、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
33. ボーラスが、２ｍｇのｔＰＡを含む、請求項３２に記載の組成物。
34. 第２の組成物が、ｍｐｒｏＵＫの、６０〜９０ｍｇ／時の速度での静脈内注入として、６０〜９０分間にわたり投与するために調製される、請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
35. 第２の組成物が、ｍｐｒｏＵＫの、６０〜８０ｍｇ／時の速度での静脈内注入として、６０分間にわたり投与するために調製される、請求項３４に記載の方法。
36. Ｃ１インヒビターのボーラスを含有する第３の組成物をさらに含む、請求項２５〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
37. 第３の組成物が、Ｃ１インヒビターの５００〜１５００ｍｇのボーラスを含有する、請求項３６に記載の組成物。
38. 請求項１〜１９のいずれかに記載の方法で使用するための組成物。