CN101015686B - 一种溶栓药物增效剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种溶栓药物增效剂及其制备方法。主要是以人体中广泛存在的P11蛋白作为溶栓药物的增效剂与其他溶栓药物组成溶栓药物组合物，它能显著增强溶栓药物的活性，显著提高溶栓效果从而显著减少药物的使用量，相应减轻毒副作用；并大大降低溶栓药物成本。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体地说涉及一种溶栓药物增效剂及制备方法。
背景技术
P11蛋白(calpactin I，light chain)属于S100家族的一员(Schafer Bw等，Trends Biochem Sci，1996，21(4)：134-140)，又称为S100A10，是一个包含97个氨基酸残基的多肽(11Kda)。P11蛋白具有EF-hand型结构，以螺旋-环-螺旋的形式存在(S.Rety，等，Nat.Struct.Biol.6(1999)89-95.27)。P11蛋白通常作为膜联蛋白(annexin II)异四聚体复合物(AIIt)的亚基调节血液纤溶系统(G.Kassam，B等，Biochemistry 37(1998)16958-16966.)，可以单独或者与膜联蛋白(annexin II)以复合物的形式刺激组织型纤溶酶原活性因子(t-PA)调节纤溶酶原活性(Travis J.等，Biological Chemistry，2003，278(28)：25577-25584)。在人体内P11通常以它的C-端赖氨酸残基(K-95和K-96)结合在纤溶酶原上，与纤溶酶原的kringle结构相结合。P11亚基结合t-PA、纤溶酶原、纤溶酶的Kd值分别为0.45μM、1.81μM、0.36μM(Travis J.等，Biological Chemistry，2003，278(28)：25577-25584)。P11的C末端赖氨酸构成t-PA和纤溶酶原结合位点，可刺激t-PA催化的纤溶酶原激活作用增强46倍(Hyoung-Min Kang等，TCM 1999，9(3/4)；92-102；Kassam，G.等，(1998)J.Biol.Chem.273，4790-4799)。此外，P11也显示出对纤溶酶和t-PA的保护作用，它们分别受到来自于α2-抗纤溶酶和纤溶酶原激活因子抑制型1的钝化作用(G.Kassam等，Biochemistry 37(1998)16958-16966.)。
天然葡激酶(staphylokinase，Sak)是金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种单链蛋白，作为溶栓药物目前已在国内上市。它可与血栓表面的纤溶酶原1∶1结合形成复合物，并进一步激活纤溶系统(Collen，D.等，J BiolChem，1993.268：p.8284-8289.)，具有较强的溶栓活性(Collen D等，Blood，1994，84：680～686；Lijnen H R等，J B iol Chem，1991，266：11826～11832)，临床研究表明其溶栓效应等同或优于t-PA。
到目前为止，没有发现有关P11作为溶栓药物的增效剂的专利申请和文献报道。
发明内容
本发明目的之一是提供P11蛋白作为溶栓药物增效剂组成的溶栓药物组合物。
本发明的另一目的是提供了P11蛋白的制备方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种以P11蛋白作为增效剂的溶栓药物组合物，含有P11蛋白和其他溶栓药物。
上述溶栓药物组合物，其所述的其他溶栓药物可以是葡激酶、t-PA、纤溶酶原、尿激酶原、引激酶或链激酶等溶栓药物中之一种。
上述溶栓药物组合物，含有P11蛋白和葡激酶。
上述溶栓药物组合物，含有P11蛋白和纤溶酶原。
上述溶栓药物组合物，含有P11蛋白和尿激酶原。
上述溶栓药物组合物，含有P11蛋白和引激酶。
上述溶栓药物组合物，含有P11蛋白和链激酶。
上述溶栓药物组合物，P11蛋白和葡激酶的摩尔比为1∶1。
P11蛋白在制备溶栓药物中的应用。
在上述溶栓药物组合物中，P11蛋白的作用主要是作为其他溶栓药物的增效剂。
上述溶栓药物组合物的制备方法：将P11蛋白和其他溶栓药物按照一定的比例在注射用缓冲液中混合均匀，即得本发明溶栓药物组合物。
上述溶栓药物组合物的制备方法，其所述的注射用缓冲液是指生理盐水或PBS。
上述溶栓药物组合物，按照通常的方法，可以制成的剂型为：静脉注射剂、口腔崩解片和肠溶片剂等。
P11蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)、根据GenBank(NM 002966.2)设计引物，引物序列为：
上游引物：5’gcgaattcatgccatctcaaatggaac acg 3’
下游引物：5’gcgaatccttacttctttcccttctgcttcat 3’
从人脑cDNA文库中，PCR扩增P11全长编码区，获得P11基因；扩增出的片段经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后用EcoR I、BamH I双酶切，酶切产物与质粒pBV220重组，转化DH5α酶切鉴定，筛选阳性克隆，得pBV220-P11质粒，对其进行核苷酸序列分析；
(2)将测序正确的pBV220-p11质粒转化大肠杆菌Bl21，然后在LB培养基(0.1g/L氨苄青霉素)上30℃培养至D600达0.4-0.6；再在42℃下水浴，诱导表达4小时；收集菌体超声破碎，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，目的蛋白以可溶性形式表达；
(3)筛选高表达菌株，然后在发酵罐中进行发酵，42℃诱导表达后，离心收集菌体；菌体用咪唑-CL缓冲液重悬，超声破碎离心后收集上清，再经过纯化，获得P11蛋白。
上述P11蛋白的制备方法，其步骤(3)中所述的纯化可以是(a)、经Q-sepharose阴离子柱层析纯化，NaCL梯度洗脱收集洗脱峰中的目的蛋白；或(b)乙酸钠缓冲液透析，S-sepharose阳离子柱用乙酸钠缓冲液平衡，将透析后的蛋白液层析纯化，收集洗脱峰中的目的蛋白；或(c)凝胶过滤层析柱Sephacryl S-200使用PB(50mM，pH7.4)缓冲液平衡，将阳离子交换柱收集的目的蛋白过凝胶柱，流速0.4ml/min，收集蛋白峰进行SDS-PAGE。
本发明中所述的P11蛋白的氨基酸序列为：MPSQMEHAME TMMFTFHKFAGDKGYLTKED LRVLMEKEFP GFLENQKDPL AVDKIMKDLD QCRDGKVGFQ SFFSLIAGLTIACNDYFVVH MKQKGKK。
P11本身也具有一定的溶栓活性，相关报道指出其能激活血纤溶系统。发明人通过对P11和SAK混合物、P11、SAK的溶栓活性进行对比分析，发现P11与SAK混合溶栓效果显著增强。虽然P11也具有活性，但要远远低于葡激酶的活性，葡激酶在其中起主要作用，当两者混合后，出现协同促进效应，溶栓效果远远大于两者单独相加。因此，以P11作为溶栓药物的增效剂来增强溶栓活性将具有重要的临床应用价值。
本发明的优点和有益效果：(1)本发明可以显著提高溶栓效果；(2)本发明可以显著减少药物的使用量；(3)本发明因为用量少，相应减轻毒副作用；(4)本发明能大大降低药物成本。
附图说明
图1.PCR扩增的P11基因的电泳检测图谱。
图2.重组表达质粒pBV220-P11双酶切鉴定图谱。
图3.P11蛋白在BL21中的表达结果电泳图谱。
图4.P11纯化结果电泳图谱。
图5.P11和SAK、SAK与P11的混合物溶栓活性检测图。
图6.SAK与P11混合物与SAk活性对比柱型图。
具体实施方式
实施例1
(1)人P11蛋白基因的克隆及原核表达质粒的构建、筛选与鉴定
菌株与表达载体：表达菌株大肠杆菌BL21，E.coli DH5α，质粒pBV220均为中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所保存。它们都是可以公开在其他地方得到的。
酶与生化试剂：限制性内切酶BamH I、EcoR I、Taq DNA聚合酶及T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；核酸分子量标准DL2000购自TaKaRa公司；蛋白分子量标准购自经科生物工程公司；DNA纯化试剂盒钩自博大生物技术公司；质粒提取试剂盒为Promega公司产品。Bradford法蛋白定量试剂盒购自普莱博公司。人凝血酶、人纤溶酶原、人纤维蛋白原、活性标准品(1000IU/ml)购自国家生物制品检验所。SAK由本室提供。
根据GenBank(NM 002966.2)设计克隆引物序列，其引物序列为：
上游引物：5’gcgaattcatgccatctcaaatggaac acg 3’
下游引物：5’gcgaatccttacttctttcccttctgcttcat 3’
从人脑cDNA文库中，PCR扩增p11全长编码区，获得P11基因(见图1，泳道1显示为P11基因，泳道2为核酸分子量标准(DL200))。扩增出的片段经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后EcoR I、BamH I双酶切，酶切产物与质粒pBV220重组，转化DH5α酶切鉴定，筛选阳性克隆。得pBV220-P11质粒(见图2，泳道1显示获得了P11蛋白的克隆)，核苷酸序列分析由申能博彩公司完成，P11蛋白的氨基酸序列为：MPSQMEHAME TMMFTFHKFA GDKGYLTKED LRVLMEKEFP GFLENQKDPLAVDKIMKDLD QCRDGKVGFQ SFFSLIAGLT IACNDYFVVH MKQKGKK。
(2)重组蛋白在宿主菌的表达
将测序正确的pBV220-p11质粒(见图2)转化大肠杆菌B121，LB培养基(0.1g/L氨苄青霉素)30℃培养至D600达0.4-0.6，水浴42℃，诱导表达4小时，收集菌体超声破碎，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，目的蛋白以可溶性形式表达，结果见图3(泳道1：未诱导BL21/pBV220-p11；泳道2：BL21/pBV220；泳道3：蛋白分子量标准；泳道4：诱导后沉淀；泳道5：诱导后上清；泳道6：诱导后BL21/pBV220-p11全菌)。
(3)工程菌的诱导表达及重组蛋白的纯化
筛选高表达菌株，然后用10L发酵罐进行发酵，42℃诱导表达后，离心收集菌体。菌体用咪唑-CL缓冲液重悬，超声破碎离心后收集上清，(1)经Q-sepharose阴离子柱层析纯化，NaCL梯度洗脱收集洗脱峰中的目的蛋白；(2)乙酸钠缓冲液透析，S-sepharose阳离子柱用乙酸钠缓冲液平衡，将透析后的蛋白液层析纯化，收集洗脱峰中的目的蛋白；(3)凝胶过滤层析柱Sephacryl S-200使用PB(50mM，pH7.4)缓冲液平衡，将阳离子交换柱收集的目的蛋白过凝胶柱，流速0.4ml/min，收集蛋白峰进行SDS-PAGE。结果见图4(泳道2、3、4分别表示纯化后的P11蛋白，1：未纯化的BL21/pBV220-P11上清；2：阴离子交换层析结果；3：阳离子交换层析结果；4凝胶过滤层析结果；5：蛋白分子量标准)。
(4)P11活性和P11与SAK混合物生物学活性测定
琼脂糖-纤维蛋白平板溶圈法(Saksela O.AnalBiochem.1981，111：276-282)：125mg琼脂糖溶于23ml生理盐水后，依次加入14μl人凝血酶、28μl人纤溶酶原、1.1ml人纤维蛋白原，混匀后倒平板。待溶液凝固后在平板上打孔点样，每孔加样6μl，25℃放置8小时，测量溶圈直径。标准品倍比稀释点样，以标准品溶圈直径的对数为横坐标，标准品活性的对数为纵坐标作标准曲线。取6μl定量后的样品点样，测量溶圈直径，测定待测样品的溶圈活性。
将SAK用生理盐水稀释至0.667μM，同时将蛋白定量后的P11蛋白用生理盐水稀释成一系列的浓度，分别与SAK按1∶1(V/V)混合，取6μl的混合样品点样于琼脂糖-纤维蛋白平板上。取6ul的SAK(0.333μM)点样作对照，测定活性，结果(见图5)显示：当P11蛋白达到一定的浓度后出现明显的溶圈，表明P11蛋白具有纤溶活性；P11蛋白与SAK混合后点样，溶圈依然存在并且溶圈直径大于单独的SAK或P11的溶圈直径(见图5)表明两者混合仍然具有纤溶活性。(图中A1、A2、A3、D3为P11浓度分别为4.5μM、11μM、30μM、2μM；B1、B2、B3、B4、B5、D1为P11与SAK混合物其摩尔比分别为1/5、1/3、1/2、1/1、3/1、5/1(其中SAK浓度为0.333μM)；C1、C2、C3、C4、C5为活性标准品；D2是SAK(0.333μM))
计算各个样品的活力，结果(见图6)显示当P11与SAK混合后，随着P11与SAK摩尔比的增加，活力也在显著增加(见图6，左侧为SAK+P11，右侧为SAK)。当P11与SAK的摩尔比达到一定1/1后，活性的变化趋于平缓。
Claims (2)
1.一种以P11蛋白作为增效剂的溶栓药物组合物，其特征在于含有P11蛋白和葡激酶。
2.按照权利要求1的溶栓药物组合物，其特征在于它们的剂型为静脉注射剂、口腔崩解片或肠溶片剂。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002067857A3 (en) * | 2001-02-21 | 2002-11-07 | Surromed Inc | Modified annexin proteins and methods for preventing thrombosis |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002067857A3 (en) * | 2001-02-21 | 2002-11-07 | Surromed Inc | Modified annexin proteins and methods for preventing thrombosis |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| Geetha Kassam et al.The Role of Annexin II Tetramer in the Activation ofPlasminogen.The Journal of Biological Chemistry273 8.1998,273(8),4790-4799. |
| Geetha Kassam et al.The Role of Annexin II Tetramer in the Activation ofPlasminogen.The Journal of Biological Chemistry273 8.1998,273(8),4790-4799. * |
| Kassam G. et al.The p11 subunit of the annexin II tetramer plays a key role inthe stimulation of t-PA-dependent plasminogen activation.Biochemistry37 48.1998,37(48),16958-16966. |
| Kassam G. et al.The p11 subunit of the annexin II tetramer plays a key role inthe stimulation of t-PA-dependent plasminogen activation.Biochemistry37 48.1998,37(48),16958-16966. * |
| Travis J. et al.Phospholipid-associated Annexin A2-S100A10 Heterotetramerand Its Subunits.The Journal of Biological Chemistry278 28.2003,278(28),25577-25584. |
| Travis J. et al.Phospholipid-associated Annexin A2-S100A10 Heterotetramerand Its Subunits.The Journal of Biological Chemistry278 28.2003,278(28),25577-25584. * |
| 许芳等.溶栓药物的研究进展及发展方向.现代商贸工业 7.2003,(7),45-47. |
| 许芳等.溶栓药物的研究进展及发展方向.现代商贸工业 7.2003,(7),45-47. * |
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