NO177526B - Fremgangsmåte for fremstilling av farmasöytisk aktive konjugater - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører fremstilling av farmasøytisk aktive konjugater som har forbedret bindingsspesifisitet for spesifisert kroppsvev. I spesielle utførelsesformer vedrører oppfinnelsen fremstilling av farmasøytisk aktive konjugater som inneholder enten plasminogen-aktivatorer eller anti-reumatiske medikamenter.

Det er vanlig praksis å administrere store doser av forskjellige medikamenter til kroppen for å behandle tilstander som bare kan påvirke et lite område av kroppen. Store doser kreves ofte for å opprettholde en tilstrekkelig konsentrasjon av medikamentet i målområdet. Imidlertid kan disse store og konstant administrerte doser produsere alvorlige sidevirkninger i pasienter som blir behandlet, hvilket ofte har ført til at behandling er blitt avbrutt selv om forbedring i den behandlede tilstand kan ha funnet sted. Dette problem har eksistert i det forutgående spesielt i administrering av toksiske anti-tumor-medikamenter til ødeleggelse av cancerceller og i administrering av toksiske anti-reumatiske medikamenter, spesielt gull-forbindelser.

Ett videre eksempel på administrering av medikamenter hvor dette problem eksisterer, er i behandling av trombotiske tilstander. Konvensjonell behandling for visse trombotiske tilstander, slik som dypvene-tromboser eller pulmonær trombose involverer kontinuerlig infusjon av midler som stimulerer fibrinolyse. Fibrinolyse er begrepet gitt til fremgangsmåten for proteolytisk nedbrytning av fibrin-basert klump. Trombolyse er den plasmin-formidlede proteolyse som frembringer oppbrytning av store vaskulære tilstopninger. Det er hovedsakelig akseptert at hovedenzymet ansvarlig for fibrinolyse er plasminogen-plasmin. Zymogenet plasminogen blir omdannet ved én av en rekke aktivatorer til plasmin, som er en aktiv protease i stand til å nedbryte en kryssbundet fibrinklump til løselige produkter (FDP). Plasmin er en serin-protease, produsert fra plasminogen ved begrenset proteolyséspalting fulgt av en strukturforandring.

Den nøyaktige mekanisme av plasminogen-aktivering avhenger av den involverte plasminogen-aktivator. Således kan aktivering også forekomme uten proteolytisk spalting i tilfelle av plasminogen-aktivatorer fra visse mikroorganismer som virker allosterisk, f.eks. streptokinase. Hovedsakelig er aktivering mer effektiv hvis den forekommer på overflaten av klumpen, et fenomen som hjelpes av affiniteten som plasminogen har for fibrin. Plasminogen-aktivatorer forekommer i blod, en rekke vev og i kroppsvæsker slik som urin, spytt og sæd. Som angitt foran blir de også produsert av visse mikroorganismer. Små mengder av en labil plasminogen-aktivator, vevsplasminogen-aktivator (t-PA), forekommer i sirkulasjonen. Dets nivå heves etter stimuli, inkludert mosjon og vene-okklusjon. t-PA, som bærer et fibrin-bindende område, er blitt isolert fra kadaverplasma og fra kulturmedium av vaskulære endotelceller og Bowes melanom-cellelinje. Mer nylig er denne plasminogen-aktivator også blitt fremstilt ved rekombinant-DNA-teknologi (se f.eks. GB-A-2119804).

Urokinase (UK) er en plasminogen-aktivator til stede i urin. Til forskjell fra t-PA kan den lett isoleres i en høyt renset, krystallinsk form. Den er et enkelt-kjedet /3-globulin som eksisterer i to former for molekylvekter på henholdsvis 54.000

og 32.000. UK blir (tilsynelatende) syntetisert i nyren og, ulik t-PA, har den liten affinitet for fibrin. UK aktiverer plasminogen til å produsere plasmin som er utsatt for inhibering.

Streptokinase (SK) er en plasminogen-aktivator produsert av /3-hemolytiske streptokokker og tilgjengelig i rensede preparater. SK er et enkelt-kjedet a. 2-globulin som har en molekylvekt rundt 46.000. Den virker som en aktivator ved å binde seg til plasminogen og forårsaker en strukturforandring. Det resulterende SK-plasminogenkompleks har enzymatisk aktivitet, men blir ikke inhibert av a2-makroglobulin.

Både UK og SK er blitt anvendt med hell som trombolytiske midler. SK er mer vanlig anvendt siden det er billigere å produsere, selv om UK hovedsakelig betraktes som et bedre middel. SK er høyt antigent og er tilbøyelig til å være effektivt til bare én behandling, hvoretter antallet antistoffer som dannes av kroppens autoimmunsystem gjør videre behandlinger mye mindre effektive. I tillegg varierer titre av anti-SK-antistoffer mellom individer avhengig av den tidligere historie når det gjelder streptokokk-infeksjoner. Dette gjør det vanskelig å bestemme den effektive trygge dose. Antistoff-formidlet resistens forekommer ikke med UK.

Selv om UK ikke har noen antigenisitet, lider UK-terapi av de to ulemper begrenset tilgjengelighet og høye omkostninger, som en konsekvens av behovet for å fraksjonere svært store volumer av human urin. Den svært dose av UK som er nødvendig for å opprettholde en trombolytisk tilstand, mens å være delvis forårsaket av dens dårlige affinitet til fibrin. Resultatet er at et full^-stendig behandlingsforløp krever fraksjonering av rundt 5000 liter urin. I tilfellet av både UK- og SK-terapi er det en alvorlig risiko for blødningskomplikasjon på grunn av den systemiske administrering av store doser aktivator. Forsøk på å oppnå trombolyse ved lokal administrering har ikke vært oppmuntrende.

I tilfellet av SK er det tenkt at effektive og hemoragiske doser er nesten det samme, slik at en effektiv dose kan forårsake hyperplasminemi, fibronogen-nedbrytning og en akkumulering av fibrinogen-nedbrytningsprodukter som har en antikoagulantvirkning og så addere seg til hemoragiske komplikasjoner.

Mer nylig er forsøk blitt gjort på å overvinne dette problem ved å binde medikamenter til bærere som har høy affinitet til området i kroppen som krever behandling. Disse bærere målretter medikamentet til området som krever behandling og kan derved administreres i relativt lave, men fortsatt effektive doser. Eksempler på slike bærere er beskrevet i publiserte patent-spesifikasjoner EP-A2-114685 og mer nylig US-4587122, som beskriver fremstilling og anvendelse av forskjellige anti-tumor-, anti-bakterielle og anti-inflammatoriske medikamenter kovalent konjugert med hel-fibronektin (et adhesivt glykoprotein) ved å anvende protein-kryssbindingsmidler. Selv om fibronektin hevdes å være en effektiv bærer som binder seg lett til morbide områder av kroppen hvor behandling med medikamenter kunne kreves, bærer fibronektin selv bindingssteder for et stort antall kroppsvev, og således kan preferensiell binding til et sted i kroppen som krever behandling ikke garanteres; faktisk kan preferensiell binding forekomme i andre deler av kroppen, og i dette tilfelle kan mengden av medikament som akkumulerer seg i området som krever behandling i noen tilfeller være neglisjerbar. Videre er det tegn på at fibronektin normalt akkumulerer seg på steder i kroppen ved selv-assosiering på initielt bundet fibronektin. Det vil si at selv-assosiering fører til ikke-spesifikk forsterkning av fibronektin-akkumulering. Denne mekanisme ville klart i alvorlig grad svekke den "målrettende" evne til administrerte fibronektin-medikamentkonjugater siden de kunne binde seg til et hvilket som helst sted med fibronektin-akkumulering i kroppen.

Foreliggende oppfinnelse er basert på den forestilling at den gir forbedrede medikamentkonjugater som har målrettingsdeler som har en høyere relativ grad av bindingsspesifisitet for spesielle områder i kroppen hvor medikamentbehandling kreves og som har redusert tendens til å selv-assosiere. Foreliggende oppfinnelse søker således å gi en løsning på problemet hvordan man skal opp-fylle dette behov ved å gi målrettende deler av farmasøytisk aktive konjugater i form av proteinfragmenter, f.eks. dannet ved enzymatisk fordøying av adhesive glykoproteiner, som har affinitet for et spesifisert kroppsvev involvert i en kroppslig forstyrrelse. Én fordel ved å anvende disse fragmenter er at det er mulig å fremstille adhesive glykoprotein-fragmenter som har spesifisitet eller i det minste en høy grad av selektivitet for enkelte kroppsvevstyper, mens hele adhesive glykoproteiner, slik som intakt fibronektin, vanligvis har en bred områdeaffinitet for en rekke kroppsvev. Anvendelse av proteinfragmenter gjør det derfor mulig å fremstille konjugater som vil binde seg i det vesentlige bare til det spesifiserte kroppsvev involvert i sykdommen som blir behandlet. Videre er det funnet, ved å anvende fibronektin som en egnet modell, at proteinfragmenter har redusert tendens til å binde seg under fysiologiske betingelser til sitt opphavs-glykoprotein, som forbedrer deres spesifisitet til å binde seg i hele kroppen.

I henhold til foreliggende oppfinnelse fremstilles et farma-søytisk aktivt konjugat som omfatter et farmasøytisk aktivt stoff til behandling av en sykdom som involverer et spesifisert kroppsvev idet nevnte farmasøytisk aktive stoff blir kovalent konjugert direkte eller indirekte med minst ett fragment av fibronektin, idet nevnte fragment har forbedret bindingsspesifisitet til det nevnte kroppsvev, sammenlignet med hele fibronektin-molekylet.

Glykoproteinet vil normalt ha bindingssteder spesifikke på minst to forskjellige vev.

Proteinfragmenter egnet for anvendelse ved fremgangsmåten

i henhold til foreliggende oppfinnelse kan dannes f.eks. ved protease-fordøying av et naturlig forekommende adhesivt glykoprotein eller en del av dette, i glykosylert eller i ikke-glykosylert form, eller fra en genetisk utarbeidet ekvivalent av dette som har den samme aminosyresekvens eller den samme aminosyresekvens bortsett fra én eller flere forandringer som ikke påvirker bindingsspesifisiteten. Videre vil det forstås at egnede proteinfragmenter for bruk ved foreliggende oppfinnelse alternativt kan fremstilles direkte ved rekombinant-DNA-teknologi eller kjemisk syntese. Det farmasøytisk aktive stoff vil fortrinnsvis være kovalent konjugert til det valgte proteinfragment eller fragmenter direkte eller indirekte gjennom et kryssbindingsreagens eller via et bærermolekyl som kan bære en rekke molekyler av et aktivt stoff såvel som ett eller flere fragmenter av et adhesivt protein.

Et farmasøytisk aktivt konjugat av denne type kan administreres på normale måter (vanligvis oralt eller intravenøst) og blir likevel lettere og mer effektivt målrettet til spesielle steder i kroppen som er involvert i en spesifikk kroppslig sykdom. Et slikt konjugat vil være tilbøyelig til å binde seg med en høy grad av selektivitet til et sted av interesse på en lett og hurtig måte da det blir båret forbi stedet i blodstrømmen eller en annen kroppsvæske, og således vil tendensen for at konkurrerende side-reaksjoner skal forekomme mellom det aktive stoff i konjugatet og andre kroppsvev, være redusert. Dette har den dobbelte fordel at det minker dosekravene for behandling av en spesifisert sykdom mens det samtidig reduserer graden av uønskede sidevirkninger som ofte er forbundet med administrering av store mengder av ueffektivt anvendte farmasøytisk aktive stoffer til kroppen.

Adhesive glykoproteiner og visse fordøyingsfragmenter av disse er kjent for å ha sterk affinitet til visse proteiner produsert av kroppen. Foretrukne konjugater fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er derfor av en type som er effektive til behandling av sykdommer i kroppen som involverer en akkumulering av vev som inneholder eller består av proteinstoff. I dette tilfelle kan det farmasøytisk aktive stoff fortrinnsvis bestå av et middel for utføring av den proteolytiske nedbrytning av det akkumulerte protein. Der hvor det akkumulerte protein består av en fibrin-basert klump, vil et egnet konjugat omfatte en plasminogen-aktivator, f.eks. t-PA, streptokinase (SK) eller urokinase (UK), konjugert til et proteinfragment med en høy grad av selektivitet for binding til fibrin, fortrinnsvis et fibronektinfragment med bindingsaffinitet for fibrin, men som forskjellig fra hel-fibronektin i det vesentlige mangler gelatin-eller kollagen-bindingsaffinitet. Faktisk er konjugater fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse funnet å være spesielt effektive når det farmasøytisk aktive stoff er i form av et protein eller enzym fordi disse lett kan konjugeres gjennom kovalent binding til glykoproteinfragmenter.

Videre eksempler på foretrukne konjugater som fremstilles ved oppfinnelsen er anti-reumatiske medikament-protein-konjugater egnet for selektiv målretting av det valgte medikament mot artikulært vev i ledd affisert av reumatoid artritt. Denne tilstand er karakterisert ved kronisk synovial inflammasjon som fører til frigjøring og aktivering av kollagenase med det resultat at kollagen i bindevevet i affiserte ledd blir nedbrutt og denaturert til å danne gelatin. Således vil et konjugat fremstilt ved oppfinnelsen til behandling av reumatoid artritt omfatte et anti-reumatisk medikament slik som gull, en gullforbindelse eller penicillamin, bundet direkte eller indirekte til ett eller flere proteinfragmenter med en høy grad av selektivitet for gelatinbinding i kroppen. Som angitt foran har fibronektin et gelatin-bindende område,og videre har det en høyere affinitet for gelatin (denaturert kollagen) enn naturlig kollagen. Følgelig er det mest foretrukket som proteinfragment-komponenten av et anti-reumatisk medikamentkonjugat ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen å anvende ett eller flere fibronektin-fragmenter som omfatter et gelatin-bindende område, men som i det vesentlige ikke har noen fibrin-bindende affinitet.

Andre farmasøytisk aktive stoffer som kan konjugeres med proteinfragmenter ved fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse, er anti-tumormidler, anti-inflammatoriske midler og anti-bakterielle midler som er i hoved-antibiotika. Eksempler på stoffer som kan konjugeres, er gitt i EP-A2-0114685 og US-4587122 og inkluderer daunomycin, mitomycin, cefalotin, penicillin G og sekretin. Enda videre eksempler på farmasøytisk aktive stoffer som kan konjugeres ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, er proteinvekstfaktorer for f.eks. å fremme lokalisert sår-reparasjon og antistoffer (f.eks. av IgM eller IgG-klasse).

Det ene essensielle karakteristikum som er innehatt av farmasøytisk aktive stoffer egnet til inkorporering med konjugater ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er deres evne til å kombinere seg med proteiner, spesielt adhesive glykoprotein-fragmenter, eller ikke-toksiske bærermolekyler slik som dekstran enten direkte eller via en bindingsgruppe. De kan f.eks. inneholde en funksjonell gruppe slik som en amino-, karboksy-eller hydroksylgruppe. Ett spesielt aktivt stoff av interesse for foreliggende oppfinnelse er gull som kan konjugeres direkte med sulfhydrylgrupper til stede i proteiner.

For å øke effektiviteten av avgivelse av et farmasøytisk aktivt stoff til et spesifisert kroppsvev, kan et konjugat fremstilles, hvor det aktive stoff er bundet til et ikke-toksisk bærermolekyl slik som et dekstran, fortrinnsvis et protein slik som fibronektin eller albumin eller en del av dette, og konjugert direkte eller indirekte med ett eller flere målrettende proteinfragmenter. Bæreren vil hovedsakelig være kovalent konjugert. Mange adhesive proteinfragmenter, f.eks. fra 1 til 20, spesielt fra 1 til 5, kan klart være konjugert til et enkelt bærermolekyl.

Således vil det forstås at der hvor den valgte bærer er fibronektin eller en høymolekylvektdel av dette, som har et område med forskjellige bindingsspesifisiteter, vil disse i stor grad oppheves ved tilknytning av det aktive stoff og proteinfragmenter og således være forhindret fra i det vesentlige å redusere konjugatets selektivitet. Anvendelse av en slik bærer er spesielt foretrukket til fremstilling av anti-reumatiske konjugater som her beskrevet, hvor gull eller en gullforbindelse anvendes sammen med ett eller flere gelatin-bindende fibronektinfragmenter. Konven" sjonell administrering av en toksisk gullforbindelse til behandling av reumatoid artritt har den ulempe at uønskede sideeffekter er tilbøyelig til å forekomme, spesielt som et resultat av akkumulering av gull i lever og nyrer. Imidlertid, ved å anvende et anti-reumatisk konjugat fremstilt ved oppfinnelsen, hvor gull eller en gullforbindelse er bundet til både et bærermolekyl og minst ett målrettende fibronektinfragment som har en høy grad av selektivitet for gelatinbinding i kroppen, kan en høy konsentrasjon av gull oppnås ved artritiske ledd med en vesentlig redusert risiko for lever- eller nyreskade. Spesielt foretrukket er konjugater av denne type, hvor gull i seg selv, dannet f.eks. fra aurotiomalisk syre eller et salt av dette, direkte blir konjugert til sulfhydrylgrupper på et bærerprotein. I et slikt konjugat vil de(t) målrettende proteinfragment(er), fortrinnsvis ett eller flere fibronektinfragmenter som har gelatin-bindende affinitet, men i det vesentlige mangler fibrin-bindende affinitet, være konjugert til bæreren ved hjelp av et kryss-bindende middel, f.eks. cyanamid. På grunn av sin høye kapasitet for å binde gull via sulfhydrylgrupper er fibronektin eller en del av dette spesielt foretrukket som bærermolekyl for et konjugat av denne type. Under fremstilling av et slikt anti-reumatisk konjugat ved å anvende hel-fibronektin eller en del av dette som har et gelatin-bindende område, må forsiktighetsregler tas for å beskytte den gelatin-bindende affinitet av bærerproteinet av sluttkonjugatet. Således kan direkte kovalent konjugering av bærerproteinet med gull utføres i nærvær av gelatin, f.eks. løselig gelatin eller gelatin bundet til en agarose-basert bærer slik som sefarose. Videre kan binding av de(t) målrettende proteinfragmenter) utføres under milde betingelser som ikke ødelegger bærerproteinets gelatin-bindende evne. Ved å ta slike beskyttende foranstaltninger for å sikre bevaring av et gelatin-bindende sted i bærerproteinet vil selektiviteten av sluttkonjugatet ikke bli redusert og faktisk kan den bli forbedret.

Fremstilling av fragmenter av et adhesivt glykoprotein som har forbedret spesifisitet sammenlignet med opphavsproteinet for en enkelt vevstype, kan oppnås ved å anvende de følgende prosedyretrinn: (a) Selekter et adhesivt glykoprotein som har den ønskede vevsbindingsspesifisitet; (b) fragmenter det selekterte protein, fortrinnsvis ved enzymatisk fordøying med en protease, f.eks. trypsin, trombin

eller katepsin D; og

(c) selekter de fragmenter som har spesifikk affinitet eller minst en høy grad av selektivitet sammenlignet med opphavsproteinet for kroppsvevet involvert i den sykdom som skal behandles.

I tilfellet av fremstilling av et konjugat hvor det farma-søytisk aktive stoff er ikke-proteinholdig, f.eks. gull eller en gullforbindelse, vil det være forstått at det aktive stoff kan konjugeres direkte eller via et kryssbindingsreagens til det adhesive protein selektert i trinn (a) før proteolyse, idet konjugeringsbetingelsene blir valgt slik at det adhesive protein holder tilbake bindings-affinitet for vevet av interesse.

Trinn (c) blir fortrinnsvis utført ved affinitets-kromatografi. Således kan proteinfragmentene som resulterer fra proteolyse i trinn (b) underkastes affinitets-kromatografi på en affinitetsbærer som har spesifikk bindingsaffinitet for vevsbindingsstedet av interesse eller et nært assosiert ikke-vevsbindingssted. De bundne fragmenter kan så elueres, og om nødvendig, ett eller flere videre affinitetskromatograferingstrinn deretter utføres for å fjerne fragmenter som i tillegg til vevsbindingsstedet av interesse bærer ett eller flere tilleggs-vevsbindingssteder. Det initielle affinitets-kromatograferings-trinn og et hvilket som helst påfølgende affinitets-kromatogra-feringstrinn kan f.eks. utføres på en affinitetsbærer hvor det er immobilisert egnet kroppsvev eller simulert kroppsvev. Til en slik affinitetsbærer kan vevet eller simulert vev på en passende måte være immobilisert på en agarose-basert bærer, f.eks. sefarose.

Der hvor det valgte protein for proteolyse har mer enn én vevsbindingsspesifisitet, kan alternativt for å oppnå fragmenter som har den ønskede forbedrede spesifisitet for en spesiell vevstype, trinn (c) begynne med at proteinfragmentene fra trinn (b) underkastes ett eller flere separeringstrinn hvor proteinfragmenter som har affinitet for kroppsvev forskjellig fra vevene av interesse, blir selektivt fjernet. Hvert slikt separeringstrinn kan utføres på en egnet måte, f.eks. ved affinitets-kromatografi på immobilisert kroppsvev (eller simulert kroppsvev) for hvilket bindingsaffinitet ikke kreves i fragmentene av interesse. Til slutt kan de ønskede fragmenter isoleres ved affinitetskromatografi ved å anvende en videre affinitetsbærer med immobilisert kroppsvev eller simulert kroppsvev som har affinitet for vevsbindingsstedet av interesse eller ved å anvende en affinitetsbærer med spesifikk bindingsaffinitet for et ikke-vevsbindingssted nært assosiert med det påkrevede vevsbindingssted.

Størrelsen av de selekterte fragmenter vil avhenge av størrelsen av proteinet hvorfra fragmentene dannes, fremgangsmåten for proteinfragmentering (som fortrinnsvis er ved proteolytisk enzymfordøying), og av graden og hardheten av den anvendte fragmenteringsmetode.

Ett protein hvorfra fragmentene kan dannes, er det naturlig forekommende adhesive glykoprotein fibronektin (m.v. 440.000), som er kjent for å inneha et vidt område av bindingssteder, inkludert bindingssteder for gelatin og fibrin, og lett kan fordøyes til fragmenter ved proteolytiske enzymer. Det er funnet i plasma og andre kroppsfluider og er assosiert med bindevev, celleoverflater og basalmembraner. Dets vide varietet av biologiske funksjoner er knyttet til en rekke spesifikke bindingssteder som binder det ikke bare til gelatin og fibrin, men også til celleoverflater, glykos-aminoglykaner og andre makromolekyler. Plasma-fibronektin er sammensatt av to svært like, men ikke-identiske polypeptidkjeder som er forbundet ved en disulfidbinding ved COOH-terminus og er mer følsomt for proteolyse enn andre basalmembraner og plasma-proteiner. Serin-proteaser spalter intakt fibronektin i utgangspunktet ved to preferensielle steder, idet de frigjør et kort COOH-terminalt fragment som inneholder mellomkjede-disulfidene og et NH2-terminalt fragment, mv 27.000-30.000. Dette bærer bindingssteder for fibrin, actin, S. aureus og heparin og et kryssbindingssted for plasma-transglutaminase (faktor Xllla). Fordøyingen skrider frem og gir bindingsområdene vist nedenfor:

Fragment

1 - Binder seg til fibrin, heparin, actin og S. aureus

2 - Binder seg til gelatin, kollagener og fibronektin

4 - Binder seg til celler

5 - Binder seg til heparin

6 - Binder seg til fibrin

Fibronektinfragmenter som har bindingsaffinitet for fibrin

i fravær av gelatin-bindende affinitet eller gelatin-bindende affinitet i fravær av fibrin-bindende affinitet kan på en egnet måte isoleres fra en blanding av fibronektinfragmenter, f.eks. en proteasefordøyingsblanding av hel fibronektin, ved en egnet to-stadiums-affinitetskromatograferingsprosedyre ved å anvende en fibrinmonomer-affinitetsbærer, f.eks. fibrinmonomer-sefarose, og en gelatin-affinitetsbærer, f.eks. gelatin-sefarose. Siden de fibrin-bindende steder i fibronektin er nært assosiert med heparin-bindende steder, kan fibrin-monomer-affinitetsbæreren i de ovenfor angitte fragmentrenseprosedyrer på en fordelaktig måte substitueres med en heparin-affinitetsbærer, f.eks. heparin-sefarose, som har høyere kapasitet enn fibrin-monomer-sefarose og lettere kan fremstilles. Faktisk kan heparin-sefarose oppnås fra kommersielle kilder, f.eks. Pharmacia A.B.

Det foretrukne molekylvektområde for fibronektinfragmenter som har fibrinbindingsspesifisitet, er fra 25 til 400 kDa som målt ved HPLC (høy-ytelse-væskekromatografi) eller fra 25 til 200 kDa som målt ved SDS-PAGE (natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgel-elektroforese), mens molekylvektområdet for fibronektinfragmenter som har gelatinbindingsspesifisitet, fortrinnsvis er i området 40-500 kDa som målt ved HPLC eller 40-200 kDa som målt ved SDS-PAGE, idet de mindre fragmentene i disse områder har økt spesifisitet. De høyere molekylvekter målt ved HPLC, er sannsynligvis forårsaket av assosiering av fragmentene før eller under måling som gir opphav til økning i tilsynelatende molekylvekter.

Fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse, for fremstilling av et farmasøytisk aktivt konjugat, er karakterisert ved at et farmasøytisk aktivt stoff direkte eller indirekte konjugeres kovalent, eventuelt via en bærer, til minst ett fragment av fibronektin, i et forhold på 1-100 mol aktivt stoff til 1 mol fragment, idet fragmentet har forbedret bindings-spesif isitet for et kroppsvev involvert i sykdommen som skal behandles, sammenlignet med hele fibronektin-molekylet. Hvis det farmasøytisk aktive stoff ikke er et protein, konjugeres det farmasøytisk aktive stoff til hele fibronektin-molekylet eller en del av dette, eventuelt med beskyttelse av bindingssteder som er spesifikke for det nevnte kroppsvev, ved en pH-verdi på 5-9, fulgt av proteolyse for å produsere fibronektinfragmenter som bærer konjugert farmasøytisk aktivt stoff, og seleksjon av minst ett av de nevnte fragmenter som har forbedret bindingsspesifisitet sammenlignet med for fibronektin-molekylet eller en del av dette.

Således kan f.eks. et anti-reumatisk konjugat fremstilles i henhold til foreliggende oppfinnelse ved direkte å konjugere gull til sulfhydrylgrupper av et adhesivt protein som har gelatin-bindende affinitet, f.eks. hel-fibronektin, fulgt av protease-fordøying og seleksjon av et konjugat med forbedret selektivitet i forhold til opphavskonjugatet for gelatinbinding i kroppen. Der hvor fibronektin eller en gelatin-bindende del av dette blir valgt som start-adhesivt protein, vil gullkonjugering utføres i nærvær av gelatin, f.eks. løselig gelatin eller gelatin bundet til en agarose-basert bærer, for således å beskytte det gelatin-bindende sted i det adhesive protein.

I tilfellet av en fremgangsmåte i henhold til den foreliggende oppfinnelse hvor ett eller flere fragmenter av et adhesivt protein som har forbedret bindingsspesifisitet sammenlignet med opphavsproteinet for vevet av interesse, blir anvendt til konjugering til et farmasøytisk aktivt stoff, kan det farmasøytisk aktive stoff være bundet, fortrinnsvis kovalent, til en bærer før konjugering direkte eller indirekte med de(t) målrettende proteinerfragment(er), eller slik bærerbinding kan utføres etter proteinfragmentbinding, og i dette tilfelle vil slike betingelser bli valgt at den påkrevde vevsbindingskapasitet av protein-fragmentet(ene) blir bevart. Der hvor det fremstilles et konjugat hvor det farmasøytisk aktive stoff omfatter en ikke-proteinholdig type, ved proteasefordøying av et større adhesivt protein-inneholdende konjugat, kan det også være mulig videre å binde det selekterte konjugat til en bærer uten i det vesentlige å redusere den ønskede vevsbindingsspesifisitet.

Aktiviteten av konjugater fremstilt ifølge oppfinnelsen øker med økende mengde av det aktive stoff bundet til proteinfragmentet (ene) , og således er det aktive stoff fortrinnsvis til stede i molart overskudd i konjugatet. Imidlertid vil for høy mengde av aktivt stoff være tilbøyelig til å maskere det påkrevde vevsbindingssted på vevsbindingssubstratet og kan gi opphav til dårlig konjugasjonseffektivitet. Av denne grunn inneholder et konjugat som her beskrevet fortrinnsvis fra 1 til 100, mer foretrukket fra 1 til 50, mol aktivt stoff (vanligvis en enkelt forbindelse eller et element) pr. mol proteinfragment. Når det aktive stoff består av et protein eller enzym eller annet høy-molekylvektstoff, er det molare forholdet mellom proteinfragment og aktivt stoff i konjugatet fortrinnsvis fra 1:1 til 1:10. På den annen side er aktive stoffer med lav molekylvekt, f.eks. gull-atomer, fortrinnsvis til stede i høyere mengdeforhold, f.eks. 1:10 til 1:50.

Hvis det ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen fremstilles et konjugat forskjellig fra et gull-proteinfragment-anti-reumatisk konjugat som er beskrevet foran, er proteinfragmentet eller -fragmentene mest foretrukket bundet til det farmasøytisk aktive stoff ved at det anvendes et kjent protein-kryssbindings-middel slik som et karbodiimid, et dialdehyd-derivat av en dikarboksylsyre, et diisocyanat eller et oksydert dekstran som har en aldoheksopyranose-ringspaltet struktur.

Egnede karbodiimider inkluderer et hvilket som helst av dem som er beskrevet i US-patent nr. 4 046871 og kan være selektert fra et hvilket som helst av de følgende: l-etyl-3-(3-dimetyl-aminopropyl)-karbodiimid-hydroklorid, l-cykloheksyl-3-(2-morfolinoetyl)-karbodiimid-meto-p-toluen-sulfonat, l-cykloheksyl-3-(4-dietylaminocykloheksyl)karbodiimid-meto-p-toluensulfonat, * l-cykloheksyl-3- (/3-dietylaminoetyl) -karbodiimid, l-etyl-3-(2-morfolinoetyl)-karbodiimid-hydroklorid, l-etyl-3-(2-morfolinoetyl)-karbodiimidsulfat og cyanamid.

Der hvor det anvendte kryss-bindende middel består av et dialdehyd-derivat av en dikarboksylsyre, er syren fortrinnsvis et karboksy-terminert C2-C5-rettkjedet alkan og er mest foretrukket glutarsyre, hvorav dialdehyd-derivatet er glutaraldehyd. En egnet fremgangsmåte for konjugering ved å anvende glutaraldehyd er gitt av J.W. Payne i Biochem. J (1973) 135, 867-873.

Et eksempel på et egnet diisocyanat er heksametylen-diisocyanat.

Egnede oksyderte dekstraner og fremgangsmåter for konjugering ved å anvende det samme er beskrevet i US-patent nr. 4587122.

Kovalent binding av et farmasøytisk aktivt stoff med ett eller flere proteinfragmenter for utførelse av foreliggende oppfinnelse kan f.eks. utføres ved (a) blanding og reagering samtidig av proteinfragmentet(ene),

kryssbindingsmidlet og det farmasøytisk aktive stoff,

(b) å omsette kryssbindingsmidlet med det farmasøytisk aktive stoff, og så omsette produktet med proteinfragmentet(ene),

eller

(c) å omsette kryssbindingsmidlet med proteinfragmentet(ene), og så omsette produktet med det farmasøytisk aktive stoff.

Kovalent binding av et farmasøytisk aktivt stoff med ett eller flere proteinfragmenter for å danne et konjugat som her beskrevet vil hovedsakelig bli utført i en vandig løsning med pH 5-9, fortrinnsvis 6-8 og fortrinnsvis i en pufferløsning. Foretrukne reaksjonstemperaturer er 10 til 30°C, spesielt romtemperatur. Reaksjonstiden er fortrinnsvis fra 0,5 til 15 timer, mer foretrukket fra 0,5 til 5 timer. Det foretrukne molare forhold mellom farmasøytisk aktivt stoff og proteinfragment i reaksjonsblandingen er fortrinnsvis fra 1:1 til 100:1, med, hvis passende, tilstrekkelig eller overskudd av kryssbindende middel til stede for å utføre konjugering av de to.

Aktive stoff-proteinfragment-konjugater som er produsert ved fremgangsmåten og beskrevet ovenfor, blir fortrinnsvis separert fra reaksjonsblandingen hvor de blir produsert, ved affinitets-kromatografi på immobilisert kroppsvev eller simulert kroppsvev for hvilket proteinfragmentene har affinitet.

Påfølgende kovalent binding av et aktivt stoff-protein-fragmentkonjugat til en høymolekylvektbærer, f.eks. fibronektin, albumin eller en høymolekylvektdel av dette, kan også f.eks. utføres ved å anvende et kryss-bindende reagens under milde betingelser som spesifisert ovenfor. Imidlertid, når det ønskes å preparere et konjugat fremstilt ved oppfinnelsen med en bærer, vil bæreren fortrinnsvis være kovalent bundet til det farmasøytisk aktive stoff, enten direkte eller via et bindingsreagens, før proteinfragmentbinding. Således, for fremstilling av et foretrukket anti-reumatisk konjugat hvor gull blir konjugert til et bærerprotein, vil fortrinnsvis i utgangspunktet en egnet gullforbindelse, f.eks. aurotioeplesyre eller et salt av denne, slik som natrium-aurotiomalat, bli omsatt med sulfhydrylgruppene av bæreren for således direkte å binde gull via disse grupper. Som angitt foran, der hvor det valgte protein for dette trinn er fibronektin eller en gelatin-bindende del av dette, kan bærer-konjugeringen utføres i nærvær av gelatin, f.eks. løselig gelatin eller gelatin bundet til en agarose-basert bærer, f.eks. sefarose, og i dette tilfelle vil bærerproteinet bevare et gelatin-bindende sted. Alternativt kan f.eks. fibronektin på egnet måte være direkte bundet til gull, når det selv er konjugert til en agarose-basert bærer slik som sefarose eller når det er adsorbert på fibronektin og således bundet. For fremstilling av en bærer som inneholder anti-reumatisk konjugat som her beskrevet kan gull også på egnet måte bli direkte konjugert til albumin via sulfhydrylgrupper i proteinet ved f.eks. å omsette en egnet gullforbindelse slik som natrium-aurotiomalat med albumin bundet til en agarose-basert bærer, f.eks. en albumin-sefarose-kolonne. Hvis i fremstillingen av et anti-reumatisk konjugat gull i utgangspunktet blir konjugert til et protein som selv er kovalent konjugert på en bærer, f.eks. sefarose, vil det være forstått at det krevde gull-bærerproteinkonjugat kan frigjøres ved egnet proteasefordøying, d.v.s. bærerproteinet i sluttkonjugatet vil bli dannet fra et større pre-bærerprotein.

Et farmasøytisk aktivt konjugat fremstilt i henhold til oppfinnelsen kan bli oppløst eller dispergert i et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller en bærer, f.eks. saltløsning. Administrering av sammensetningen kan være ved intravenøs injeksjon eller ved oralt inntak av sammensetningen i form av en tablett eller inntagbar væske. En typisk dose av vandig sammensetning kan inneholde 10-300 mg konjugat i 0,05-10 ml sammensetning.

Videre kan et konjugat fremstilt i henhold til oppfinnelsen anvendes i terapeutisk behandling av et menneske eller et ikke-humant dyr, f.eks. konjugater hvor en plasminogenaktivator er bundet til et fibronektinfragment som har i fremherskende grad fibrin-målrettende evne for anvendelse i behandling av en trombotisk tilstand eller anvendelse av et konjugat fremstilt i henhold til oppfinnelsen hvor et anti-reumatisk stoff, f.eks. gull, blir konjugert til et fibronektinfragment som har i fremherskende grad gelatin-målrettende evne til anvendelse i behandling av reumatoid artritt.

En ytterligere anvendelse av et konjugat fremstilt i henhold til oppfinnelsen er til fremstilling av en sammensetning til anvendelse i behandling av en sykdom som involverer et spesifikt kroppsvev for hvilket nevnte konjugat har en fremherskende målrettende evne.

De følgende eksempler har til hensikt å illustrere foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1:

Fremstilling av anti- trombotiske konjugater

A. Materialer

Al. Fremstilling av fysiologisk fibrinmonomer ( PFM)

PFM anvendt i de følgende eksempler besto av fibrinogen som ble renset ved presipitering fra blodplasma-kryopresipitat tilført av Plasma Fractionation Laboratory, Churchill Hospital, Oxford, England (GB). Dette PFM inneholdt 68 vekt% fibrinogen, 10% fibronektin (en naturlig kontaminant) med spor av faktor VIII:RAg og faktor Xllla. Siden normale fibrinblodkoagulater ufravikelig inkorporerer fibronektin, ble dette PFM videre anvendt som et simulert fibrin-blodkoagulat.

A2. Fremstilling av fibronektin- fri fibrinmonomer ( FFFM)

FFFM ble fremstilt ved å fjerne fibronektin fra fibrinogenet i PFM ved å utsette fibrinogen for gelatin-sefarose-affinitets-kromatograf i. Fremstillingen av kolonner anvendt i denne kromato-grafiske prosedyre er beskrevet nedenfor.

B. Generelle fremgangsmåter

Bl. Fremstilling og anvendelse av gelatin- sefarose-af f initets- kromatograf ikolonner

Gelatin-sefarose-kolonner ble fremstilt ved å følge bindings-prosedyren beskrevet i produsentens (Pharmacia, Uppsala, Sverige) anbefalte fremgangsmåte for å adsorbere materialer på CNBr-aktivert sefarose 4B. Et bindingsforhold på 15 mg gelatin pr. gram fuktig vekt sefarosegel ble anvendt for å fremstille kolonnene.

De løpende betingelser for de fremstilte kolonner ble adaptert fra Vuento og Vaheri, J. Biochem. (1979) 183, s. 331 med de følgende forandringer: den løpende puffer besto av en 10 mM fosfat, 10 mM citrat, 150 mM NaCl-løsning, pH 7,5 og eluering ble oppnådd med IM arginin i fosfatbufret saltvann. Kolonnene ble anvendt ved 4°C.

B2. Fremstilling og anvendelse av fibrinmonomer- sefarose-af f initetskroinatoqraf i- kolonner

Fibrinmonomer-kolonner ble fremstilt ved å følge fremgangsmåten til Heene og Matthias, Throm. Res. (1973) 2, s. 137. To typer kolonner ble fremstilt, hvor monomeren som ble anvendt, enten var fysiologisk fibrinmonomer (PFM) eller fibronektin-fri fibrinmonomer (FFFM). PFM-sefarose og FFFM-sefarose-kolonner ble fremstilt ved å binde enten PFM eller FFFM til CNBr-aktivert sefarose 4B ved produsentens (Pharmacia) anbefalte fremgangsmåte. De løpende betingelser for begge typer kolonne var de samme som dem som ble anvendt i generell prosedyre Bl beskrevet ovenfor.

B3. Fremstilling og anvendelse av heparin- sefarose-af finitetskromatografikolonner

Heparin-sefarose-kolonner ble fremstilt ved å følge fremgangsmåten anbefalt av produsenten for å binde materialer på CNBr-aktivert sefarose 4B. Slike kolonner er også tilgjengelige "ferdig-koblet" fra den samme produsent (Pharmacia, Uppsala, Sverige). Løpende betingelser var som beskrevet ovenfor for gelatin-sefarose, med unntak av at den løpende puffer besto av en 10 mM fosfat, 20 mM NaCl, 0,5 mM EDTA-løsning, pH 7,5 og eluering ble oppnådd ved å bruke en 10 mM fosfat, 0,5M NaCl, 0,5 mM EDTA-løsning, pH 7,5. Kolonner ble anvendt ved romtemperatur.

B4. Separering av proteinfra<g>menter på sefakryl S2 00

Videre resolusjon av proteinfra<g>menter selektert ved affinitetskromatografi ble utført ved gel-permeasjons-kromatografi ved å anvende sefakryl S200. Den løpende puffer var 10 mM fosfat, 150 mM NaCl, pH 7,5. Omtrent 10 mg ble påført på en 320 ml lag-volum-kolonne (2,2 x 84 cm) ved en strømningshastighet på 12 ml/time.

B5. Måling for plasminogen- aktivatorer

Konsentrasjonene av plasminogen-aktivator i løsninger ble bestemt ved å anvende Kabi Diagnostica "Initiell reaksjons-hastighet11 -metoden for bestemmelse av plasminogen i plasma, ved å anvende S-2251 kromogent substrat (Kabi Vitrium, Sverige). Skjemaet for denne fremgangsmåte er oppsummert nedenfor: (1) Fortynn humant blodplasma med målingspufferløsning som består av 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 som inneholder 12 mM NaCl i det volumetriske forhold mellom plasma og pufferløsning på 1:20 og tilsett 2 00 /il av det fortynnede plasma til et reaksjons-rør.

(2) Inkuber røret ved 37°C i 2-6 minutter.

(3) Tilsett enten et kjent antall enheter (f.eks. 10 eller

25 enheter) av plasminogen-aktivator eller et testkonjugat

som inneholder plasminogen-aktivator, laget opp til 100 /ul

med målingspufferløsning til røret.

(4) Inkuber røret ved 37"C i 10 min.

(5) Tilsett 700 Ml substratløsning som består av S-2251 fortynnet til 0,86 mM arbeidspuffer med målingspuffer. (6) Bland, overfør innholdene i røret til en mikro-kyvette og mål forandringen med tiden av absorbansen (A) av blandingen ved

37°C ved 405 nm bølgelengde lys (Å A405) .

(7) Beregn Å A405 pr. min. og plott dette resultat mot enhetene av plasminogen-aktivator pr. ml til stede i pufferløsningen.

En alternativ plasminogen-aktivatormåling ble anvendt for å teste for slik aktivitet på PFM - sefarose. En endepunkt-måling måtte anvendes fordi sefarose ikke kunne testes ved hjelp av "initiell reaksjonshastighetsmålingen" beskrevet ovenfor. Målings-skjemaet er oppsummert nedenfor: (1) Tørk delvis test-PFM - sefarose ved oppsugningsfiltrering på en glass-sintertrakt. (2) Vei 100 mg test-PFM - sefarose (fuktig vekt) i et reaksjons-rør.

(3) Tilsett 200 /il fortynnet human blodplasma.

(4) Bland

(5) Inkuber røret i 10 min. ved 37°C.

(6) Tilsett 700 /xl S-2251 kromogent substrat (Kabi)-løsning ved 37°C, bland og inkuber i nøyaktig 180 sekunder. (7) Tilsett 100 Ml 50% eddiksyre og bland øyeblikkelig for å stoppe reaksjonen. (8) Mål absorbansen av den resulterende løsning ved 405 nm innen 4 timer og relater resultatet til en standardkurve for kjente konsentrasjoner av plasminogen-aktivator mot absorbans.

C. Dannelse av proteinfragmenter ved fordøying av et adhesivt protein med proteolytiske enzymer

Fibronektin ble valgt som det start-adhesive protein. Før fordøying ble fibronektinet sjekket på renhet ved størrelses-eksklusjon-høytrykksvæskekromatografi (HPLC) ved å anvende en Ultropac TSK G 4000 SW-kolonne, fraksjoneringsområde fra 1000 kDa ned til 5 kDa. Dette var nødvendig for å standardisere fibronektinfragmentene dannet ved proteolytisk enzymfordøying, siden tilstedeværelse av fibronektinaggregater eller fragmenter i fibronektinet før fordøying kunne ha påvirket den videre fordøyingsprosess.

Cl. Fordøying av fibronektin med trypsin

10 mg fibronektin i 10 ml PBS (PBS = fosfatpufret saltvann pH 7,5 som inneholder 10 mM natriumfosfat og 0,15 M NaCl) ble fordøyd med 0,05 mg trypsin i 2 timer ved 37°C. Trypsin er en endopeptidase i stand til spesifikt å spalte peptidbindinger tilstøtende til en arginin- eller lysin-rest. Prøver av reaksjonsblandingen ble fjernet ved tidene notert i tabell 1 nedenfor. Reaksjonen ble stoppet etter 2 timer ved tilsetning av 0,1 mg soyabønneinhibitor.

Molekylvektene av fibronektinfragmentene produsert ved for-døying, ble bestemt ved gelpermeasjons-høytrykksvæske-kromatografi (HPLC)-analyse ved å anvende en TSK G 3000 SW-kolonne. Den løpende puffer var en 0,1 M fosfatløsning, pH 6,8 som inneholdt 0,05% natriumazid, strømningshastighet 0,4 ml/min., med en 70 minutters elueringstid. Absorbansen av eluatet ble målt ved 280 nm for tilstedeværelse av fibronektinfragmenter.

Ekstensiv fordøying av fibronektin ved trypsin (d.v.s. i mer enn 10 min.) reduserte dramatisk dets gelatin-bindende aktivitet, som målt ved en kompetitiv, enzymbundet måling (Doran et al., Vox Sang

(1983) 45, 243-251). Følgelig ble prinsippet å anvende den minimale effektive fordøyingstid på 10 min. antatt.

C2. Fordøying; av fibronektin med trombin

Fremgangsmåten i Cl ble gjentatt, med unntak av at fibronektinet ble fordøyd med 250 internasjonale enheter (iu) trombin istedenfor trypsin. Trombin er en serin protease ansvarlig for sluttomdannelsen av fibrinogen til fibrin under blodkoagulat-dannelse. Fordøyingen ble stoppet etter 120 min. ved tilsetning av benzamidin til en sluttkonsentrasjon på 8 mM i reaksjonsblandingen. Prøver av reaksjonsblandingen.ble fjernet ved de tider som er angitt i tabell 2 nedenfor og ble analysert ved å anvende samme fremgangsmåte som beskrevet i Cl.

D. Seleksjon og rensing av proteinfragmenter

Produkter fra fibronektinfordøying med trypsin eller trombin som omfattet en blanding av fragmenter med gelatin-bindende affinitet eller fibrin-bindende affinitet eller begge eller ingen av disse to bindingsspesifisiteter, ble anvendt som startmateriale for å selektere ut fibronektinfragmenter som hadde fibrin-bindende affinitet i fravær av gelatin-bindende affinitet eller vice versa ved å anvende en dobbeltkolonne- affinitets-kromatograferings-prosedyre.

Dl. Anvendelse av trombin- genererte fibronektinfragmenter

Fremgangsmåten i C2 ble gjentatt i en større skala med mengdene av reagenser og løsningsvolum økt proporsjonalt. Produktet, som besto av en løsning av fibronektinfragmenter oppnådd ved fibronektin-fordøying i 120 min. ved 37"C med trombin, ble delt i flere alikvote mengder som inneholdt kjente mengder av fibronektinfragmenter. Disse alikvote mengder ble påført direkte til en 15 ml kolonne av gelatin-sefarose (se den generelle prosedyre Bl beskrevet ovenfor) for å fjerne disse proteinfragmenter med en affinitet for gelatin som hadde både gelatin- og fibrin-bindende steder eller et gelatin-bindende sted i fravær av et fibrin-bindende sted. De ubundne fraksjoner av disse alikvote mengder, som inneholdt proteinfragmenter med en affinitet for fibrin i fravær av gelatin-bindende affinitet og proteinfragmenter som verken hadde fibrin- eller gelatin-bindende affinitet, ble så påført til en 15 ml kolonne av FFFM-sefarose (se den generelle fremgangsmåte B2 beskrevet ovenfor). Eluatene fra FFFM-sefarose-kolonnen inneholdt rensede proteinfragmenter med bindingsaffinitet for fibrin, men ingen bindingsaffinitet for gelatin. Resultatene fra denne to-stadiums affinitets-kromatografiprosedyre er gitt i tabell 3 nedenfor uttrykt i produktutbytter.

Utbyttene av proteinfragmenter ved hvert stadium gitt i tabell 3 ovenfor var basert på absorbansen av fraksjoner ved 280 nm ved å anvende ekstinksjonskoeffisienten for fibronektin (E<1cm>280 1 mg/ml = 1,28) .

Eluatene fra FFFM-sefarose og gelatin-sefarose-kolonnene ble analysert ved HPLC for å bestemme molekylvektene av både gelatin-bindende og fibrin-bindende fragmenter. Størrelsene av fragmenter elulert fra gelatinkolonnen ble funnet å være 435 og 296 kDa. Størrelsene av fragmentene eluert fra FFFM-kolonnen ble funnet å være 382, 110 og 45 kDa.

Det vil forstås at 2-stadiums-affinitets-kromatografi-prosedyren ovenfor kan reverseres (FFFM-adsorpsjon fulgt av gel-adsorpsjon) for å gi eluater fra det andre adsorpsjonsstadiet som inneholder rensede proteinfragmenter med bindingsaffinitet for gelatin i fravær av fibrin-bindende affinitet.

D2. Anvendelse av trypsin- qenererte fibronektinfragmenter

(a) Fremgangsmåten i Dl ble gjentatt ved å anvende fibronektin fordøyd i 10 min. med trypsin i en større skalaversjon av fremgangsmåten beskrevet i Cl ovenfor. Eluatene fra affinitetskolonnene ble analysert ved hjelp av HPLC. Dette åpenbarte at proteinfragmenter ble eluert fra gelatinkolonnen med størrelser 358, 140, 119 og 69 kDa og proteinfragmenter

på 56 kDa ble eluert fra FFFM-kolonnen.

(b) Den nære assosiasjon mellom fibrinbindingsstedene og heparin-bindingsstedene i fibronektin ble undersøkt ved å anvende heparin-sefarose istedenfor FFFM-sefarose i en alternativ dobbeltkolonne-affinitetskromatografiprosedyre for å isolere fibronektinfragmenter som hadde fibrin-bindende affinitet i fravær av gelatin-bindende affinitet.

En løsning av tryptiske fragmenter av fibronektin ble fremstilt som i D2(a) ovenfor, og løsningen delt i flere alikvote mengder som inneholdt kjente mengder fibronektinfragmenter. Alikvote mengder ble påført til en 15 ml kolonne av heparin-sefarose ved hjelp av den generelle fremgangsmåte som tidligere beskrevet i B3 ovenfor. Bundne fraksjoner som inneholdt proteinfragmenter med en affinitet for heparin og fibrin ble så påført til en 30 ml kolonne av gelatin-sefarose ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i Bl ovenfor. Ubundne fraksjoner inneholdt rensede proteinfragmenter med affinitet for heparin/fibrin. De som bandt seg til gelatin-sefarose, som var de med både gelatin-og heparin/fibrin-bindende aktivitet, ble utelatt. Resultater fra denne to-stadiums-affinitetskromatografiprosedyre er gitt i tabell 4 nedenfor.

Eluatene fra adsorbanskolonnene ble analysert ved HPLC. Dette åpenbarte at størrelsene av proteinfragmentene fra to-stadiums-renseprosedyren var 360, 181, 140 (minimum), 56 og 42 kDa.

Mens alle disse fragmenter bevarte heparin/fibrin-bindings-aktivitet og ikke bandt seg til gelatin, kunne de forskjellige fragmentstørrelser dannet ved denne fremgangsmåte videre oppløses ved separasjon på Sefakryl S200 som beskrevet i B4 ovenfor. Proporsjonene av fragmentene i den heparin-bindende, ikke-gelatin-bindende fraksjon er gitt i tabell 5.

Proporsjonen av proteinfragmenter ved hvert stadium som var fibrin-bindende, ble bestemt ved å påføre alikvote mengder til en PFM-sefarose-kolonne ved hjelp av fremgangsmåten i B2 ovenfor.

Det vil forstås at hvis de to typer affinitets-kromatografi-kolonner anvendes i motsatt rekkefølge, d.v.s. den bundne fraksjon av en gelatin-sefarose-kolonne påføres til en heparin-sefarose-kolonne, vil dette resultere i isolering av fibronektinfragmenter som har gelatin-bindende affinitet i fravær av fibrin- og heparin-bindende affinitet.

E. Konjugering av selekterte fibronektinfragmenter som

har fibrin- bindende affinitet til streptokinase

En vandig løsning av et kommersielt streptokinasepreparat (handelsnavn "Kabikinase", levert av Kabi Vitrum AB Haematology, Stockholm, Sverige) som inneholdt i vekt 4% streptokinase, 50% albumin, 44% natriumsalter og 2% H20 ble passert gjennom en kolonne av Cibacron Blue-Sepharose CL6B-adsorpsjonsharpiks ved omgivelsestemperaturer for å adsorbere albuminet, for derved å separere det fra streptokinasen. De ubundne fraksjoner ble målt for plasminogenaktivator-aktivitet. 2 ml av en vandig løsning av de ubundne fraksjoner, som inneholdt omtrent 600 enheter av albumin-uttømt streptokinase pr. ml, ble fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet ovenfor. Et likt volum av en vandig løsning av fibrin-bindende fibronektin-fragmenter fremstilt i henhold til fremgangsmåten i Dl (0,12 mg pr. ml) ble tilsatt til streptokinaseløsningen. pH av blandingen ble justert til 7,0 ved tilsetning av en liten mengde 0,1N saltsyre. Til den resulterende løsning ble det tilsatt, med røring og ved romtemperatur, en 0,588 M l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid-hydrokloridløsning inntil innholdet av karbodiimid-hydrokloridet i den resulterende løsning nådde 0,5 vekt/vol.%. Røring ble fortsatt i 2 timer for å produsere et konjugert streptokinase-proteinfragmentprodukt i reaksjonsblandingen. Det ønskede produkt ble utvunnet fra blandingen ved adsorpsjon på FFFM-sefarose fulgt av eluering med 0,2M NaCl-løsning. Konsentrasjonen av konjugatet i det resulterende eluat ble, hvor nødvendig, økt ved hjelp av trykk-ultra-filtrering.

Aktiviteten av streptokinasen i konjugatet ved forskjellige konjugatkonsentrasjoner i løsning ble målt ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i B5 ovenfor mot ekvivalente konsentrasjoner i løsning av ukonjugert streptokinase. Resultatene fra disse målinger er gitt i tabell 6 nedenfor.

Disse resultater viser at streptokinaseaktiviteten i konjugatet varierte fra 38 til 52% av den som var til stede i dets ukonjugerte form.

F. Konjugering av selekterte fibronektinfragmenter

som har fibrin- bindende affinitet til urokinase

2240 enheter urokinase (UK) ble løst i 2 ml pH 7,3 puffer-løsning (20 mM Tris HC1). 0,15 mol natriumklorid) som inneholdt 0,12 mg/ml fibrin-bindende fibronektinfragmenter fremstilt i henhold til fremgangsmåten i Dl. Det totale innhold av proteinfragmenter i løsningen var ekvivalent til 3,27 x 10<_6>M. Til den resulterende løsning ble det tilsatt 80 /il 5 vekt/vol. % glutar-aldehydløsning i vann (sluttkonsentrasjon 0,2%). Den resulterende løsning ble blandet på en vortex-blander mens glutaraldehydet ble tilsatt. Blanding ble fortsatt i 1 min., og løsningen ble så inkubert ved romtemperatur (20°C) i 24 timer. Det ønskede produkt ble utvunnet ved å anvende FFFM-sefarose som beskrevet i fremgangsmåte E ovenfor. Konsentrasjonen av konjugatet i løsningen ble justert som nødvendig enten ved trykk-ultrafiltrerings-konsentrasjon eller ved fortynning med pufferløsning.

Aktiviteten av urokinasen i konjugatet ved forskjellige konjugatkonsentrasjoner i løsning ble målt ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i B5 ovenfor mot ekvivalente konsentrasjoner i løsning av ukonjugert urokinase. Resultatene fra disse målinger er gitt i tabell 7.

Resultatene gitt i tabell 7 ovenfor viser at plasminogen-aktiviteten av urokinasen i konjugatet er 21-30% av dens aktivitet når den er i sin opprinnelige, ukonjugerte form.

G. Alternativ fremgangsmåte for konjugering av selekterte fibro- nektinfragmenter som har fibrin- bindende affinitet til urokinase

2240 enheter UK ble løst i 2 ml pH 7,3 pufferløsning (20 mM Tris-HCl, 0,15M NaCl) som inneholdt 0,12 mg/ml (3,27 x 10"<6>M) fibrin-bindende fibronektinfragmenter fremstilt som i Dl ovenfor. pH av løsningen ble justert til 5 ved tilsetning av små mengder 0,1N saltsyre. Til den resulterende løsning ble det under røring og ved romtemperatur tilsatt en 0,588M l-etyl-3-(3-dimetylamino-propyl)-karbodiimid-hydrokloridløsning inntil innholdet av karbodiimid-hydroklorid i den resulterende løsning nådde 1,0 vekt/ vol.%. Røring ble fortsatt i 1 time for å produsere et konjugert urokinase-fibronektinfragmentprodukt i reaksjonsblandingen. En mild form av karbodiimid-kryssbinding var også egnet ved å anvende 0,5 vekt/vol.% karbodiimid i 2 timer ved pH 7,0 (d.v.s. ikke noe HC1 tilsatt). Det ønskede konjugerte produkt ble fjernet fra blandingen ved adsorpsjon på FFFM-sefarose fulgt av eluering med

0,2M NaCl-løsning. Konsentrasjonen av konjugatet i det resulterende eluat ble, hvor nødvendig, økt ved trykk-ultrafiltrering.

Aktiviteten av urokinase i konjugatet ved forskjellige konjugatkonsentrasjoner i løsning ble målt som i fremgangsmåte F ovenfor. Resultatene fra disse målinger er gitt i tabell 8 nedenfor.

Det kan sees fra tabell 8 ovenfor at plasminogenaktivator-aktiviteten av UK i konjugatet varierer fra 64 til 67% av dens aktivitet når den er i sin opprinnelige, ukonjugerte form.

H. Konjugering av selekterte fibronektinfragmenter

som har fibrin- bindende affinitet til urokinase

Fremgangsmåten i G ovenfor ble gjentatt med unntak av at konsentrasjonen av fibrin-bindende fibronektinfragmenter i Tris-HCl-saltløsningen ble redusert til 0,06 mg/ml.

I. Konjugering av selekterte fibronektinfragmenter som har fibrin- bindende aktivitet til urokinase

Fremgangsmåten i G ovenfor ble gjentatt med unntak av at konsentrasjonen av fibrin-bindende fibronektinfragmenter i Tris-HCl-saltløsningen ble redusert til 0,03 mg/ml.

J. Binding av plasminogenaktivator- proteinfraqroent-

konjugater til simulert blodkoagulatvev ( fibrinmonomer)

For å teste effektiviteten av konjugatene fremstilt ved hjelp av fremgangsmåtene beskrevet i E og G-I ovenfor ble løsninger av hvert konjugat kontaktet med immobilisert simulert blodkoagulatvev og mengden av plasminogenaktivator adsorbert av vevet ble målt. Det er kjent at det er en direkte korrelasjon i kroppen mellom opptaket av plasminogenaktivator ved fibrin-koagulater og deres hastighet for videre fibrinolyse, og derfor gir denne test en anvendbar indikasjon på den farmakologiske verdi av disse konjugater.

Det simulerte vev som ble selektert, var fysiologisk fibrinmonomer (PFM)-preparat som er kjent å inkludere mange av komponentene i et normalt blodkoagulat. Uforedlet fibrinmonomer (Kabi Diagnostica), her referert til som PFM, ble immobilisert på sefarose 4B kuler (Pharmacia, Sverige), ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i B2 ovenfor. Plasminogenaktivator-fibronektin-fragmentkonjugater ble laget opp i separate løsninger med kjent konsentrasjon som inneholdt fra 16 til 160 enheter/ml plasminogen-aktivator-aktivitet. Disse løsninger ble så blandet i rulleblander i 2 timer ved 4°C med 100 mg (fuktig vekt) mengder av det immobiliserte PFM beskrevet ovenfor. Det immobiliserte PFM ble så vasket grundig med 50 mM Tris-HCl-løsning, pH 7,6, for å fjerne all ubundet aktivitet. Mengden av bundet konjugat ble så bestemt ved direkte måling av PFM-sefarosen ved å anvende endepunkt-målingen beskrevet i B5 ovenfor og alikvote mengder av affinitets-adsorbenten i suspensjon. Aktiviteten av plasminogenaktivatoren i både startmateriale (plasminogenaktivator-fibronektinfragmentkonjugat) og i den vaskede PFM-sefarose etter binding ble bestemt (uttrykt i enheter plasminogenaktivator (PA) pr. ml i løsning) som et mål på fibrin-bindende fibrinolytisk middel i testkonjugatene. Resultatene fra disse bestemmelser er gitt i tabell 9 nedenfor.

Resultatene i tabell 9 er illustrert diagrammatisk i fig. 1 og 2. Fig. 1 er en grafisk fremstilling som viser korrelasjonen mellom mengden av konjugat tilsatt til det immobiliserte PFM og mengden av PA videre bundet til det. Fig. 2 illustrerer forholdet for konjugatene fremstilt ved hjelp av fremgangsmåtene i E og G-I ovenfor mellom mengden av plasminogenaktivator (i enheter) pr. mg fibronektinfragment anvendt i kryssbindings-reaksjonsblandingen som produserte konjugatene og menden av fibrin-bindende plasminogenaktivator som ble produsert i konjugatene. Ved å anvende urokinase er det en to-fase-stigning på økningen i konjugat PA-innhold, idet mer plasminogenaktivator ble anvendt i den kryssbindende reaksjonsblanding. Stigningen med streptokinase er mye brattere, hvilket indikerer mer effektiv binding.

K. Binding av plasminogenaktivator- fobronektin-fragment- koniugater til sefarose 4B

For å fastslå at plasminogenaktivator-fibronektinfragment-konjugatene bandt seg selektivt til fibrinmonomeren heller enn til dens bærermatriks, ble produktet fra fremgangsmåten G ovenfor påført til usubstituert sefarose 4B-gel ved å anvende bindings-prosedyren beskrevet i J. De resulterende fraksjoner ble målt for plasminogenaktivator-aktivitet. Den eneste aktivitet som ble funnet, var i de ubundne fraksjonene. Utbyttet var 100%. Siden konjugatet fra fremgangsmåte G hadde neglisjerbar affinitet for usubstituert sefarose, ble det konkludert at en fibrin-substituert sefarose oppførte seg som en simulert fibrinklump og konjugatet bundet helt til proteindelen av den simulerte klump.

L. Binding av ukoniugert plasminogenaktivator til simulert blodkoagulatvev

2016 enheter urokinase ble laget opp til 2 ml med pH 7,3 pufferløsning (2 0mM Tris HC1 som inneholdt 0,15M NaCl) og påført på PFM-sefarose 4B. Blandingen ble holdt ved 4°C i 2 timer. Det ble funnet at bare 5% av den opprinnelige UK-aktivitet til stede i løsning ble bundet til det simulerte koagulat, hvilket indikerte at den basale binding av umodifisert urokinase til det simulerte blodkoagulatvev var minimal.

M. Oppløsning av fibrin- basert koagulatvev som svar på plasminogenaktivatorer og plasminogenaktivator-fibronektinfragmentkonnugater

Den farmakologiske effektivitet av plasminogenaktivator-fibronektinfragment-konjugatproduktet fra fremgangsmåte G ble videre testet ved undersøkelse av lysis av fibrin-baserte klumper som svar på den selektive binding av konjugatet. Innflytelsen av målrettede plasminogenaktivator-konjugater ble undersøkt ved måling av 1<25>I-FDP frigjort fra <125>I-merkede koagulater inn i koagulatbadmediet.

Fibrinogen ble jodert ved kloramin T-metoden (Green et al., Biochem. J., (1963), 89, s. 114) og aktivert ved å anvende 100 U trombin pr. gram fibrinogen. PBS-vasket koagulatvev ble presset ut i form av et proteinlag hvorfra små skiver (10-2 0 mg) lett kunne skjæres ut. <125>I-fibrinkoagulatskiver (20 mg) ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur i 0,25 ml, Tris-pufferløsning, pH 7,4 (50 mM Tris, 110 mM NaCl) som inneholdt enten 800 U/ml urokinase eller 800 U/ml urokinase-fibronektinfragmentkonjugat.

Koagulatskivene ble vasket to ganger med 2 ml Tris-puffer-løsning, pH 7,4, for å fjerne ikke-spesifikt bundet urokinase. Kontroll-koagulatskiver ble inkubert i Tris-puffer-løsning, pH 7,4, uten urokinase eller konjugat og vasket parallelt med test-prøvene.

Koagulatskiver ble overført til et kammer (10 ml vol.) hvori-gjennom koagulatbadmediet (25 ml) ble sirkulert fra et reservoar ved en strømningshastighet på 2 ml/min. Badmediet besto av Tris-puf ferløsning, pH 7,4, som inneholdt 0,03 mg/ml plasminogen og 1 mg/ml humant albumin.

Prøver (0,5 ml) av badmediet ble tatt ved intervaller over en 24 timers periode og løseliggjort radioaktivitet bestemt. Resultatene av disse målinger er representert diagrammatisk i fig. 3, som er en grafisk fremstilling som viser tidsforløpet for <125>I radioaktivitet frigjort fra fibrinkoagulatskiver som svar på urokinaseaktivitet. Oppløsning av koagulatene inkubert med konjugat var opp til 3,3 ganger hurtigere (f.eks. ved 18 timer: kontroll = ingen aktivator-stimulert lysis) enn den var med den ekvivalente aktivitet av plasminogenaktivator alene. Dette indikerte at spesifikk og preferensiell binding av konjugat kan forbedre aktiveringen av plasminogen i nærheten av et koagulat og således fibrinolytisk nedbrytning av koagulatet.

Eksempel 2:

Fremstilling av anti- reumatiske konjugater

A. Direkte kovalent binding av gull til fibronektin

eller albumin

Al. Direkte kovalent binding av gull til fibronektin fibronektin- sefarose eller albumin- sefarose 1 ml fibronektin-sefarose-oppslemming [1-2 deler bindingspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, IM urea) pluss 1 del vått, avsatt volum av gel som besto av 0,7 mg fibronektin/mg CNBr-aktivert sefarose 4B] pluss 1 ml bindingspuffer som inneholdt 50 ^m natrium-aurotiomalat ble inkubert med rulleblanding i 4 timer ved 37°C. Sefarosen ble så vasket med en egnet løsning, f.eks. 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, for å fjerne ureagert gullforbindelse og protein. En fuktig pellet av gel ble utvunnet enten ved sentrifugering eller ved vakuumfiltrering gjennom en glass-sinter og inkubert med trypsin ved et forhold mellom enzym og protein-substrat på omtrent 1:200 i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, i 15-120 min. ved 37°C. Frigjort gull-fibronektin-fragmentkonjugat ble separert fra sefarosen ved sentrifugering.

Albumin-sefarose ble substituert for fibronektin-sefarose som i fremgangsmåten ovenfor for å oppnå gull-albuminfragment-konjugater.

GulIkonjugater som kan oppnås ved fremgangsmåten ovenfor, er egnet som bærerprotein-gullkonjugater til fremstilling av anti-reumatiske konjugater ved kryssbinding til gelatin-målrettende adhesive proteinfragmenter.

Konjugering av gull ble også testet over et område av betingelser (temperatur, inkuberingstid, ionestyrke). Gull-komponenten i natrium-aurotiomalat ble fulgt spesifikt ved atom-adsorpsjons-spektroskopi, og protein ble målt ved Folin-Lowry-måling. Tabell 10 nedenfor viser hvordan mengden av bundet gull varierte. Binding (i jumol gull pr. volumenhet av f ibronektin-sefarose) var signifikant, men lav (6-8 /xM) i lav ionestyrke Tris-HCl. Tilsetning av IM urea økte bindingen med mellom 50 og 150% med optimum ved 4 timer og 37°C. Tabell 11 nedenfor viser den relative virkning av økende nivåer av urea på binding av gull til fibronektin-sefarose. Økende urea-konsentrasjon mellom 0,1 og 1,0M økte gullinkorporeringen med nesten fire ganger (i dette tilfelle ble gullbinding målt relativt til protein-innholdet i konjugatet). Faktisk er dette svært høye bindingsnivåer av størrelsesorden på 1,2 x 10<4> mol gull/mol fibronektin. Når albumin-sefarose ble substituert for fibronektin-sefarose, var gullbinding omtrent 35% på en proteinvektbasis av minimumsnivået for fibronektin-sefarose. Selv om binding var ved lav ionestyrke, var sluttkonjugatet stort sett stabilt overfor fysiologiske NaCl-nivåer. Tap av gull fra det immobiliserte kompleks var konstant ved 21 til 23% mellom 0,1M og 0,75M NaCl.

A2. Direkte kovalent binding av gull til fibronektin eller fibronektinfragmenter immobilisert på fibronektin-

sefarose

Fibronektin-sefarose binder store mengder løselig fibronektin ved lav ionestyrke som kan utvinnes ved å heve puffer-NaCl-konsentrasj onen. 1 ml fibronektin/sefarose-oppslemming [1-2 deler puffer (50mM Tris HC1, pH 7,5) pluss 1 del vått, avsatt volum av gel som besto av 0,7 mg fibronektin/mg CNBr-aktivert sefarose 4B] ble blandet med 2 ml renset plasmafibronektin (omtrent 1 mg/ml) i den samme puffer og blandet i 15-30 min. Gelen ble vasket (samme puffer) for å fjerne ubundet fibronektin og inkubert med rulleblanding i 4 timer ved 37°C i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 som inneholdt IM urea og 25 jumol gull som natrium-aurotiomalat pr. mg fibronektin tilsatt. Gelen ble så igjen vasket og resuspendert i høy ionestyrkepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5:0,5M NaCl) for å dissosiere det adsorberte fibronektin-gullkonjugat. Blanding ble utført ved romtemperatur i 15-60 min. Gull-fibronektinkonjugatet i løsning ble avsaltet ved dialyse, ultrafiltrering eller gel-filtrering eller en kombinasjon av slike teknikker og lagret frosset eller tørt.

Ved å anvende denne teknikk for gullkonjugering ble 37% av det tilsatte gull konjugert for å gi en spesifikk bindingsverdi av 9,8 x IO<3> mol gull/mol fibronektin. Etter kryssbinding til gelatin-målrettende trombinfragmenter av fibronektin (se avsnitt C) ble den spesifikke gullbinding redusert til 1,1 x IO<3> mol gull/ mol fibronektin. 1 fremgangsmåten ovenfor kan løselig fibronektin erstattes av fibronektinfragmenter til også å gi bærerprotein-gullkonjugater egnet til fremstilling av anti-reumatiske konjugater ved kryssbinding til gelatin-målrettende adhesive proteinfragmenter.

A3. Direkte kovalent binding av gull til fibronektin i

nærvær av gelatin

Ved å anvende gulIkonjugasjonsmetodene beskrevet i Al og A2 ovenfor bevarer de resulterende gull-fibronektin- eller gull-fibronektinfragment-konjugater ikke gelatin-bindende aktivitet.

I denne tredje fremgangsmåte anvendt for direkte å binde gull til fibronektin eller fibronektinfragmenter, ble de gelatin-bindende steder av proteinet som ble anvendt i bindingsreak-sjonen, beskyttet ved å binde seg til gelatin enten i form av løselig gelatin eller gelatin-sefarose. 2 ml av en 1 til 5 mg/ml løsning av gelatin (fremstilt ved denaturering av renset hud-kollagen) i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 ble blandet med 2 mg intakte fibronektin eller gelatin-bindende fibronektinfragmenter i den samme puffer. Blandingen ble rullet i 1 time ved romtemperatur. Alternativt ble fibronektin eller gelatin-bindende fibronektinfragmeter adsorbert på gelatin-sef arose i den samme puffer. 50 /mol natrium-aurotiomalat ble tilsatt, og løsningen eller gelatin-sefarose-fibronektin-oppslemmingen laget opp til IM med urea og blandet ved romtemperatur i 4 timer.

Der hvor løselig gelatin ble anvendt, ble gelatin-fibronektin-bindingen avbrutt ved å tilsette 4M urea, dialysere i 20 mM natriumfosfat som inneholdt 4M urea ved pH 5,2 og blande med 1 mg for-svellet karboksymetylcellulose-ionebytter (Whatman CM52). Løselig gelatin ble bundet til ionebytteren og fjernet ved

sentrifugering, hvilket etterlot det løselige konjugat.

Der hvor gelatin-sefarose ble anvendt, ble fibronektin-gullkonjugater laget på gelen og ureagert medikament eller proteinfragment fjernet ved vasking med den samme puffer fri for gullforbindelse. Slutt-fibronektin-gullkonjugatet ble utvunnet ved å vaske gelatin-sefarose-absorbenten enten med 4M urea eller IM arginin i 50 ml Tris-HCl, pH 7,5.

Ved å anvende en "gelatin-bindende beskyttelsesmetode" som ovenfor med hel fibronektin, ble det funnet mulig å konjugere omtrent 50% av gullet til å gi fibronektin-gullkonjugat med 2,3 x 10<3>M gull/M fibronektin.

Fra gelatin-bindende gull-fibronektinfragment-konjugater som ble isolert på denne måte, kan konjugater som har et fibronektinfragment med gelatin-bindende affinitet, men som mangler fibrin-bindende affinitet, selekteres ved FFFM-sefarose eller heparin-sefarose-affinitetskromatografi egnet til direkte anvendelse som anti-reumatiske konjugater. Det vil forstås at slike anti-reumatiske konjugater også kan oppnås ved å utsette gelatin-bindende gull-hel-fibronektinkonjugater isolert ved en fremgangsmåte som ovenfor for proteasefordøying, med påfølgende seleksjon av gull-fibronektinfragment-konjugater som mangler fibrin-bindende affinitet. Alternativt kan gull/fibronektin-konjugater, såvel som gull/fibronektinfragment-konjugater fremstilt ved en "gelatin-bindings-beskyttelsesmetode" som ovenfor, anvendes som bærerprotein-gullkonjugater til fremstilling av anti-reumatiske konjugater ved kryssbinding til gelatin-målrettende adhesive proteinfragmenter, f.eks. fibronektinfragmenter som har gelatin-bindende affinitet, men i det vesentlige mangler fibrin-bindende affinitet.

B. Fremstilling av gelatin- bindende fragmenter av

fibronektin som mangler fibrin- bindende affinitet

Fibronektin ble fordøyd med trypsin eller trombin som beskrevet i avsnitt Cl og C2 i eks. 1 eller med katepsin D på konvensjonell måte for å gi en blanding av fragmenter med gelatin-bindende affinitet eller fibrin-bindende affinitet eller begge eller ingen av disse to bindingsspesifisiteter. 10 ml av en 1 mg/ml løsning av protease-fordøyd fibronektin i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, ble tilsatt til en heparin-sefarose-kolonne. Ubundet materiale (fritt for fragmenter med et heparin- eller fibrin-bindingssted) ble tilsatt til en gelatin-sefarose-kolonne ved 1 mg/ml i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, som inneholdt 0,5M NaCl. Etter å ha vasket av ubundet protein ble gelatin-bindende fragmenter eluert med enten 4M urea eller IM arginin i løpende puffer og avsaltet ved dialyse.

C. Kryss- binding av bærerprotein- gullkoniugater til gelatin- målrettende fibronektinfragmenter 5 ml fibronektinbærer-gulIkonjugat (fremstilt ved fremgangsmåten som beskrevet i Al, A2 eller A3 ovenfor) i 10 mM natrium-fosfatpuffer, pH 5,2, ble laget opp til en sluttkonsentrasjon på 1% (0,24M) cyanamid og inkubert ved 22°C i 1-4 timer med 5 ml gelatin-bindende fibronektinfragmenter fremstilt som i B ovenfor, ved den samme proteinkonsentrasjon som fibronektin-gulIkonjugatet. Overskudd reaktanter ble fjernet ved dialyse, ultrafiltrering eller gelfiltrering.

D. Testing for gelatinbindingsaktivitet i slutt-

konjugatet

Sluttkonjugatet ble målt for gelatinbindingsaktivitet ved å tilsette det til en gelatin-sefarose-kolonne som i B ovenfor. Bundet materiale ble eluert og målt for totalt protein og for gullinnhold. Dette ga et mål av gelatinbinding som ixM av gull//xg gelatin-bindende protein.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk aktivt konjugat, karakterisert ved å konjugere kovalent et farmasøytisk aktivt stoff direkte eller indirekte, eventuelt via en bærer, til minst ett fragment av fibronektin, i et forhold på 1-100 mol aktivt stoff til 1 mol fragment, idet fragmentet har forbedret bindingsspesifisitet for et kroppsvev involvert i sykdommen som skal behandles, sammenlignet med hele fibronektin-molekylet, eller, hvor det farmasøytisk aktive stoff ikke er et protein, å konjugere det farmasøytisk aktive stoff til hele fibronektin-molekylet eller en del av dette, eventuelt med beskyttelse av bindingssteder som er spesifikke for det nevnte kroppsvev, ved en pH-verdi på 5-9, fulgt av proteolyse for å produsere fibronektinfragmenter som bærer konjugert farmasøytisk aktivt stoff, og seleksjon av minst ett av de nevnte fragmenter som har forbedret bindingsspesifisitet sammenlignet med for fibronektin-molekylet eller en del av dette.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at det farmasøytisk aktive stoff konjugeres direkte eller indirekte med ett eller flere fragmenter selektert fra en protease-fordøyingsblanding av fibronektin som har forbedret bindingsspesifisitet for nevnte kroppsvev sammenlignet med for hele fibronektinmolekylet.

3. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at det som bærer anvendes et protein som inneholder sulfhydrylgrupper.

4. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av de fore-gående krav, karakterisert ved at nevnte farmasøytisk aktive stoff er selektert fra anti-tumor-, anti-bakterielle, anti-inflammatoriske, anti-reumatiske, anti-trombotiske midler, vekstfaktorer og antistoffer.

5. Fremgangsmåte i henhold til krav 4, karakterisert ved at en plasminogenaktivator blir konjugert direkte eller indirekte med minst ett fibronektinfragment som har fibrin-bindende affinitet i det vesentlige i fravær av gelatin- eller kollagen-bindende affinitet.

6. Fremgangsmåte i henhold til krav 4, karakterisert ved at et anti-reumatisk middel blir konjugert direkte eller indirekte med minst ett fibronektinfragment som har gelatin-bindende affinitet i det vesentlige i fravær av fibrin-bindende affinitet.

7. Fremgangsmåte i henhold til krav 6, karakterisert ved at nevnte anti-reumatiske middel er selektert fra gull, anti-reumatiske gullforbindelser og penicillamin.

8. Fremgangsmåte i henhold til krav 6, for fremstilling av et anti-reumatisk konjugat, karakterisert ved at gull blir direkte konjugert til et bærerprotein via sulfhydrylgrupper av nevnte protein ved å omsette nevnte protein eller et større pre-bærerprotein med aurotioeplesyre eller et salt av denne, fulgt i tilfelle av konjugering av et pre-bærerprotein ved proteasefordøying og seleksjon av det ønskede bærerprotein-gul1konj ugat.