JPH0676438B2 - 血液から単離された蛋白質、該蛋白質の製造方法および該蛋白質を含有する製薬学的組成物 - Google Patents
血液から単離された蛋白質、該蛋白質の製造方法および該蛋白質を含有する製薬学的組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトの血液から単離されたそしてまた他の哺
乳動物の細胞、例えば、ウシの血液中に存在する新規な
蛋白質に関する。この新規な蛋白質は、プラスミノゲン
のクリングル（Kringle）４に特異的に結合することが
発見され、そしてテトラネクチンと呼ばれた。
乳動物の細胞、例えば、ウシの血液中に存在する新規な
蛋白質に関する。この新規な蛋白質は、プラスミノゲン
のクリングル（Kringle）４に特異的に結合することが
発見され、そしてテトラネクチンと呼ばれた。
プラスミノゲン−セファロース（Sepharose）のアフィ
ニティークロマトグラフィーにより精製されたα２−抗
プラスミンのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドの電気泳動（SDS−PAGE）は、約17,000ダルトンの
見掛の分子質量（molecular mass）を有する生成物の追
加の弱い帯を示す［ユーロピアン・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー（Eur. J. Biochem.）120、105−11
2（1981）］。この蛋白質はα２−抗プラスミンの調整
の汚染物質であると考えられた。
ニティークロマトグラフィーにより精製されたα２−抗
プラスミンのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドの電気泳動（SDS−PAGE）は、約17,000ダルトンの
見掛の分子質量（molecular mass）を有する生成物の追
加の弱い帯を示す［ユーロピアン・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー（Eur. J. Biochem.）120、105−11
2（1981）］。この蛋白質はα２−抗プラスミンの調整
の汚染物質であると考えられた。
今回、この分子質量17,000の蛋白質はプラスミノゲンの
クリングル４に特異的に結合し、そしてクリングル１〜
３またはミニプラスミノゲンに結合しないことが発見さ
れた。分子質量17,000の蛋白質は、分子質量68,000を有
するSDS解離生成物であることが発見された。この後者
の蛋白質は本発明に従う蛋白質、テトラネクチン（Tetr
anectin）であり、これについて以後詳しく説明する。
クリングル４に特異的に結合し、そしてクリングル１〜
３またはミニプラスミノゲンに結合しないことが発見さ
れた。分子質量17,000の蛋白質は、分子質量68,000を有
するSDS解離生成物であることが発見された。この後者
の蛋白質は本発明に従う蛋白質、テトラネクチン（Tetr
anectin）であり、これについて以後詳しく説明する。
フィブリノゲンのフィブリンへの転化は１つの重要な生
物学的過程である。フィブリンの形成は止血において極
めて重要であるが、それはまた他の生物学的過程、例え
ば、炎症および悪性の病気および組織の補修において重
要な面である。有機体におけるフィブリン蓄積物の分解
はセリンプテイナーゼプラスミンにより触媒され、そし
てプラスミンは活性化剤の影響下にプラスミノゲンから
形成される。このフィブリンの分解はこれらのプラスミ
ノゲン活性化剤により、プラスミン阻害剤により、そし
て活性化剤阻害剤により制御されることが知られてい
る。
物学的過程である。フィブリンの形成は止血において極
めて重要であるが、それはまた他の生物学的過程、例え
ば、炎症および悪性の病気および組織の補修において重
要な面である。有機体におけるフィブリン蓄積物の分解
はセリンプテイナーゼプラスミンにより触媒され、そし
てプラスミンは活性化剤の影響下にプラスミノゲンから
形成される。このフィブリンの分解はこれらのプラスミ
ノゲン活性化剤により、プラスミン阻害剤により、そし
て活性化剤阻害剤により制御されることが知られてい
る。
プラスミン仲介繊維素分解を制御する最も重要な阻害蛋
白質はα２−プラスミン阻害剤（α２ PI）である。α
２−PIがチモーゲンプラスミノゲンに可逆的に結合する
という観察はその精製手順を簡素化した。この阻害剤は
プラスミノゲンクリングル１〜３に結合し、そしてそれ
からリジンにより解離することができる。こうしてα２
−PIはプラスミノゲン−セファロース（Sepharose）ま
たはクリングル１＋２＋３−セファロースアフィニティ
ークロマトグラフィーにより精製することができる。し
かしながら、最近の研究は、ヒト血漿中に存在するα２
−PIのすべてをこの手順により精製することは不可能で
あることを示唆している。循環するα２−PIの分画はプ
ラスミノゲンと可逆的錯体を形成することができず、こ
れに対してそれはプラスミンの活性部位に向かうその阻
害潜在力をなお保持する。
白質はα２−プラスミン阻害剤（α２ PI）である。α
２−PIがチモーゲンプラスミノゲンに可逆的に結合する
という観察はその精製手順を簡素化した。この阻害剤は
プラスミノゲンクリングル１〜３に結合し、そしてそれ
からリジンにより解離することができる。こうしてα２
−PIはプラスミノゲン−セファロース（Sepharose）ま
たはクリングル１＋２＋３−セファロースアフィニティ
ークロマトグラフィーにより精製することができる。し
かしながら、最近の研究は、ヒト血漿中に存在するα２
−PIのすべてをこの手順により精製することは不可能で
あることを示唆している。循環するα２−PIの分画はプ
ラスミノゲンと可逆的錯体を形成することができず、こ
れに対してそれはプラスミンの活性部位に向かうその阻
害潜在力をなお保持する。
こうして、α２−PIの２つの型、プラスミノゲン結合形
態（PBα２−PI）および非プラスミノゲン結合形態（NP
Bα２−PIはヒト血漿中に存在する。プラスミノゲン−
セファロースのアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製されたPBα２ PIの調整物は、NPBα２ PIに自発
的に転化する。この転化は分子質量2,000のペプチドの
開放により達成される。この転化の原因となる、PBα２
PI中の可能な蛋白質分解酵素を同定する試みにおい
て、汚染する蛋白質が同定され、この蛋白質はプラスミ
ノゲン−セファロースの代わりにクリングル１＋２＋３
−セファロースのアフィニティークロマトグラフィーに
より精製されたα２−PIの調整物中に存在しない。
態（PBα２−PI）および非プラスミノゲン結合形態（NP
Bα２−PIはヒト血漿中に存在する。プラスミノゲン−
セファロースのアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製されたPBα２ PIの調整物は、NPBα２ PIに自発
的に転化する。この転化は分子質量2,000のペプチドの
開放により達成される。この転化の原因となる、PBα２
PI中の可能な蛋白質分解酵素を同定する試みにおい
て、汚染する蛋白質が同定され、この蛋白質はプラスミ
ノゲン−セファロースの代わりにクリングル１＋２＋３
−セファロースのアフィニティークロマトグラフィーに
より精製されたα２−PIの調整物中に存在しない。
テトラネクチンの性質をここでさらに詳しく述べる。
ヒトプラスミノゲンは、その分子のＮ−末端部分に５つ
の相同トリプル−ループ、３つのジサルファイド架橋ク
リングル構造を含有する。膵臓エステラーゼを使用する
プラスミノゲンの制限された蛋白質分解は、プラスミノ
ゲンからのクリングル１〜３およびクリングル４の断片
の切離しを生ずる。プロトロンビン、ウロキナーゼ、組
織プラスミノゲン活性化剤およびフィブロネクチン中に
また存在するこのようなクリングル構造は、これらの蛋
白質の生物学的機能の調節にとって必須の配位子の結合
に参加すると想像される。エステラーゼによりプラスミ
ノゲンから切離された精製されたプラスミノゲンクリン
グルは、フィブリン、PBα２ PIおよびヒスチジンに富
んだ糖蛋白質に結合することがわかった。生ずる複合体
のすべてはリジンの存在下に解離する。テトラネクチン
はプラスミノゲン分子のクリングル４の部分に結合する
が、プラスミノゲン中の最初の３つのクリングル構造ま
たはミニプラスミノゲンに結合しない。こうして、それ
はクリングル１〜３に結合する能力をもたず、クリング
ル４に特異的に結合する記載された最初の化合物である
と思われる。クリングル１〜３に結合するヒスチジンに
富んだ糖蛋白質およびα２ PIはクリングル４に結合し
ない。
の相同トリプル−ループ、３つのジサルファイド架橋ク
リングル構造を含有する。膵臓エステラーゼを使用する
プラスミノゲンの制限された蛋白質分解は、プラスミノ
ゲンからのクリングル１〜３およびクリングル４の断片
の切離しを生ずる。プロトロンビン、ウロキナーゼ、組
織プラスミノゲン活性化剤およびフィブロネクチン中に
また存在するこのようなクリングル構造は、これらの蛋
白質の生物学的機能の調節にとって必須の配位子の結合
に参加すると想像される。エステラーゼによりプラスミ
ノゲンから切離された精製されたプラスミノゲンクリン
グルは、フィブリン、PBα２ PIおよびヒスチジンに富
んだ糖蛋白質に結合することがわかった。生ずる複合体
のすべてはリジンの存在下に解離する。テトラネクチン
はプラスミノゲン分子のクリングル４の部分に結合する
が、プラスミノゲン中の最初の３つのクリングル構造ま
たはミニプラスミノゲンに結合しない。こうして、それ
はクリングル１〜３に結合する能力をもたず、クリング
ル４に特異的に結合する記載された最初の化合物である
と思われる。クリングル１〜３に結合するヒスチジンに
富んだ糖蛋白質およびα２ PIはクリングル４に結合し
ない。
これらの結果が示唆するように、プラスミノゲンの最初
の４つのクリングルはすべてリジンに結合するが、それ
らは異なる配位子の特異性を有する。α２ PI調整物中
に汚染物質として存在するテトラネクチンはゲル濾過に
よりそれから除去することができない。これは後述する
ウルトロゲル（Ultrogel）ACA34を使用するゲル濾過実
験により容易に説明される。テトラネクチンについて推
定される68,000の分子質量はα２ PIのそれ（67,000）
に非常に近接し、そしてこれはゲル濾過により２種類の
蛋白質の分離が不可能である理由を説明する。この結果
示すように、テトラネクチンはテトラマーであり、これ
はSDS（１％）およびグアニジン塩酸塩6Mの中で解離す
る。
の４つのクリングルはすべてリジンに結合するが、それ
らは異なる配位子の特異性を有する。α２ PI調整物中
に汚染物質として存在するテトラネクチンはゲル濾過に
よりそれから除去することができない。これは後述する
ウルトロゲル（Ultrogel）ACA34を使用するゲル濾過実
験により容易に説明される。テトラネクチンについて推
定される68,000の分子質量はα２ PIのそれ（67,000）
に非常に近接し、そしてこれはゲル濾過により２種類の
蛋白質の分離が不可能である理由を説明する。この結果
示すように、テトラネクチンはテトラマーであり、これ
はSDS（１％）およびグアニジン塩酸塩6Mの中で解離す
る。
精製されたテトラネクチンはCa++およびヘパリンに結合
する。
する。
ヒスチジンに富んだ糖蛋白質は、プラスミノゲンのクリ
ングル１〜３に特異的に結合し、またヘパリンに結合す
る。この結合はCa++依存性であり、そしてEDTAにより壊
滅される。このようなCa++依存性のクリングル４とテト
ラネクチンとの間の相互作用についての支持は存在しな
い。ヘパリンのカラムからテトラネクチンを溶離するた
めに必要な高いNaClの濃度は、蛋白質の等電点およびヘ
パリンカラム中の実験条件（pH7.4）に比較すると、テ
トラネクチンのヘパリンへの結合が、抗トロンビンIII
におけるように、その分子の特定のヘパリン結合部位を
含みうることを示すであろう。
ングル１〜３に特異的に結合し、またヘパリンに結合す
る。この結合はCa++依存性であり、そしてEDTAにより壊
滅される。このようなCa++依存性のクリングル４とテト
ラネクチンとの間の相互作用についての支持は存在しな
い。ヘパリンのカラムからテトラネクチンを溶離するた
めに必要な高いNaClの濃度は、蛋白質の等電点およびヘ
パリンカラム中の実験条件（pH7.4）に比較すると、テ
トラネクチンのヘパリンへの結合が、抗トロンビンIII
におけるように、その分子の特定のヘパリン結合部位を
含みうることを示すであろう。
Ca++、EDTAまたはヘパリンの存在は、蛋白質の正味の電
荷に影響を及ぼすばかりでなく、かつまたその抗原性に
影響を及ぼす。EDTAの存在下に得られる結果と比較し
て、Ca++の存在下に電気免疫アッセイにより得られる非
常に小さい沈殿は、その分子の全体のコンフォメーショ
ンの変化を示すであろう。その理由で、血漿または血清
の定量的電気免疫アッセイは、Ca++の不存在下で実施す
るとき、不可能である。血漿または血清の電気免疫アッ
セイへのCa++およびEDTAの影響は、血漿または血清の中
の他の成分への結合にまったく関係がない。精製された
テトラネクチンを適用するとき、同一の結果が得られ
る。この蛋白質のテトラマーの形態はCa++の配位の結果
ではない。なぜなら、ゲル濾過実験におけるこの蛋白質
の溶離プロフィルはCa++またはEDTAの存在に依存しない
からである。強い洗浄剤のみがこのテトラマーをモノマ
ーに解離することができるだけである。また、K4または
プラスミノゲンへのテトラネクチンの結合のために、Ca
++の存在は必要ではない。
荷に影響を及ぼすばかりでなく、かつまたその抗原性に
影響を及ぼす。EDTAの存在下に得られる結果と比較し
て、Ca++の存在下に電気免疫アッセイにより得られる非
常に小さい沈殿は、その分子の全体のコンフォメーショ
ンの変化を示すであろう。その理由で、血漿または血清
の定量的電気免疫アッセイは、Ca++の不存在下で実施す
るとき、不可能である。血漿または血清の電気免疫アッ
セイへのCa++およびEDTAの影響は、血漿または血清の中
の他の成分への結合にまったく関係がない。精製された
テトラネクチンを適用するとき、同一の結果が得られ
る。この蛋白質のテトラマーの形態はCa++の配位の結果
ではない。なぜなら、ゲル濾過実験におけるこの蛋白質
の溶離プロフィルはCa++またはEDTAの存在に依存しない
からである。強い洗浄剤のみがこのテトラマーをモノマ
ーに解離することができるだけである。また、K4または
プラスミノゲンへのテトラネクチンの結合のために、Ca
++の存在は必要ではない。
テトラネクチンの全体の構造は推定された。それは４つ
のポリペプチド鎖からなり、その構造は添付図面に示さ
れており、ここで個々のアミノ酸残基は次のコードで示
されている： Ａ アラニン Ｂ アスパラギン酸 Ｅ グルタミン酸 Ｆ フェニルアラニン Ｇ グリシン Ｈ ヒスチジン Ｉ イソロイシン Ｋ リジン Ｌ ロイシン Ｍ メチオニン Ｎ アスパラギン Ｐ プロリン Ｑ グルタミン Ｒ アルギニン Ｓ セリン Ｔ スレオニン Ｖ バリン Ｗ トリプトファン Ｙ チロシン Ｎ−末端アミノ酸配列はＮ−glu−pro−pro−thr−glu
である。４つのペプチドの各々は181アミノ酸を含有
し、３つのジサルファイド架橋が各鎖中に存在し、そし
て鎖間には存在しない。各鎖は20200であると推定され
る。この蛋白質は炭水化物を含有しない。肝臓からのヒ
ト、ラットおよびニワトリのアシアロ（asialo）−糖蛋
白質受容体との相同性は発見されなかった。これにより
示されるように、この蛋白質はレクチン類の族に属し、
そしてその理由で、可溶性の受容体蛋白質であろう。レ
クチン類は蛋白質であり、しばしば糖蛋白質であり、炭
水化物の構造に結合する。これと一致して、テトラネク
チンは、交差免疫電気泳動により評価するとき、ヘパリ
ンおよびコンドロイチン硫酸酸塩Ａ、ＢおよびＣへ結合
する。また、レクチン類の族と一致して、テトラネクチ
ンは二価の金属イオンと結合し、そしてポリマーの構造
を形成する。さらに、テトラネクチンは、レクトン類の
ように、多分エストロゲン依存性の細胞増殖のためのミ
トゲンであろう。避妊薬を経口的に投与された受精能力
のある女性は、また後期の妊娠の場合におけるように、
テトラネクチンの血漿水準を高度に優位に減少させた。
のポリペプチド鎖からなり、その構造は添付図面に示さ
れており、ここで個々のアミノ酸残基は次のコードで示
されている： Ａ アラニン Ｂ アスパラギン酸 Ｅ グルタミン酸 Ｆ フェニルアラニン Ｇ グリシン Ｈ ヒスチジン Ｉ イソロイシン Ｋ リジン Ｌ ロイシン Ｍ メチオニン Ｎ アスパラギン Ｐ プロリン Ｑ グルタミン Ｒ アルギニン Ｓ セリン Ｔ スレオニン Ｖ バリン Ｗ トリプトファン Ｙ チロシン Ｎ−末端アミノ酸配列はＮ−glu−pro−pro−thr−glu
である。４つのペプチドの各々は181アミノ酸を含有
し、３つのジサルファイド架橋が各鎖中に存在し、そし
て鎖間には存在しない。各鎖は20200であると推定され
る。この蛋白質は炭水化物を含有しない。肝臓からのヒ
ト、ラットおよびニワトリのアシアロ（asialo）−糖蛋
白質受容体との相同性は発見されなかった。これにより
示されるように、この蛋白質はレクチン類の族に属し、
そしてその理由で、可溶性の受容体蛋白質であろう。レ
クチン類は蛋白質であり、しばしば糖蛋白質であり、炭
水化物の構造に結合する。これと一致して、テトラネク
チンは、交差免疫電気泳動により評価するとき、ヘパリ
ンおよびコンドロイチン硫酸酸塩Ａ、ＢおよびＣへ結合
する。また、レクチン類の族と一致して、テトラネクチ
ンは二価の金属イオンと結合し、そしてポリマーの構造
を形成する。さらに、テトラネクチンは、レクトン類の
ように、多分エストロゲン依存性の細胞増殖のためのミ
トゲンであろう。避妊薬を経口的に投与された受精能力
のある女性は、また後期の妊娠の場合におけるように、
テトラネクチンの血漿水準を高度に優位に減少させた。
要約すると、テトラネクチンと呼ぶ、本発明の新規な蛋
白質は次の通りである： テトラネクチンは４つのペプチド鎖からなるテトラマー
の蛋白質であり、各々はドデシル硫酸ナトリウムの存在
下のポリアクリルアミドの電気泳動において約17,000の
分子質量を有し、そして約20,000の計算した分子質量を
有する。
白質は次の通りである： テトラネクチンは４つのペプチド鎖からなるテトラマー
の蛋白質であり、各々はドデシル硫酸ナトリウムの存在
下のポリアクリルアミドの電気泳動において約17,000の
分子質量を有し、そして約20,000の計算した分子質量を
有する。
テトラマーの見掛けの分子質量は、ウルトロゲル（Ultr
ogel）ACA34のゲルクロマトグラフィーにより決定し
て、約68,000であり；アミノ酸分析に基づいて、分子質
量は約80,000であると計算される。
ogel）ACA34のゲルクロマトグラフィーにより決定し
て、約68,000であり；アミノ酸分析に基づいて、分子質
量は約80,000であると計算される。
Ｎ−末端アミノ酸配列はＮ−glu−pro−pro−thr−glu
である。
である。
このテトラマーはγ−カルボキシグルタミン酸残基を含
有しない。
有しない。
それは水酸化アルミニウムまたは硫酸バリウムに吸着せ
ず、これによりそれはビタミン−Ｋ依存性蛋白質でにこ
とが示される。
ず、これによりそれはビタミン−Ｋ依存性蛋白質でにこ
とが示される。
テトラネクチンは糖残基を含有せず、そして糖蛋白質で
はない。これはコンカナバリンＡへの結合の不存在およ
びPAS試薬との色反応性の不存在から明らかである。
はない。これはコンカナバリンＡへの結合の不存在およ
びPAS試薬との色反応性の不存在から明らかである。
テトラネクチンは二価のカチオン、例えば、カルシウ
ム、ニッケル、コバルトおよびマンガンと結合し、そし
てこれより低い程度に、亜鉛およびマンガンと結合す
る。
ム、ニッケル、コバルトおよびマンガンと結合し、そし
てこれより低い程度に、亜鉛およびマンガンと結合す
る。
テトラネクチンはヘパリンへ結合する。結合は遊離カル
シウムイオンの不存在下のみならず、かつまた存在下に
結合する。全血漿中のテトラネクチンの交差免疫電気泳
動は、テトラネクチンのβ−移動性がヘパリンの存在下
にα−移動性となることを示す。鋭い単一のピークが現
われ、これは結合が強くかつ特異的であることを示唆す
る。これは非常に広いピークを示しかつ弱い結合を示唆
するコンドロイチン硫酸塩を使用する結果と対照的であ
る。
シウムイオンの不存在下のみならず、かつまた存在下に
結合する。全血漿中のテトラネクチンの交差免疫電気泳
動は、テトラネクチンのβ−移動性がヘパリンの存在下
にα−移動性となることを示す。鋭い単一のピークが現
われ、これは結合が強くかつ特異的であることを示唆す
る。これは非常に広いピークを示しかつ弱い結合を示唆
するコンドロイチン硫酸塩を使用する結果と対照的であ
る。
フィブロネクチンはフィブリンに結合する。血漿が凝固
するとき、テトラネクチンの約15〜20％は液体から消失
する。さらに、テトラネクチンはフィブリン上に検出す
ることができる。遊離カルシウムイオンが存在するとき
にのみ、フィブリンへの結合は有意である。フィブリン
への結合は凝固因子XIIIの活性に対してして独立であ
り、そしてEACAによりあるいはｔ−PA濃度の変化により
影響を受けることができない。フィブリンへの結合はテ
トラネクチンの血漿レベルに対してして比例する。
するとき、テトラネクチンの約15〜20％は液体から消失
する。さらに、テトラネクチンはフィブリン上に検出す
ることができる。遊離カルシウムイオンが存在するとき
にのみ、フィブリンへの結合は有意である。フィブリン
への結合は凝固因子XIIIの活性に対してして独立であ
り、そしてEACAによりあるいはｔ−PA濃度の変化により
影響を受けることができない。フィブリンへの結合はテ
トラネクチンの血漿レベルに対してして比例する。
等電点電気泳動により決定したテトラネクチンの等電点
は、遊離カルシウムイオンの不存在下に5.8であり、そ
してその存在下に7.8である。
は、遊離カルシウムイオンの不存在下に5.8であり、そ
してその存在下に7.8である。
１％のアガロースおよびpH8.6におけるテトラネクチン
の電気泳動の移動度は、カルシウムイオンの存在下に血
漿β−２−グロブリンのそれと同一であり、そしてカル
シウムイオンの不存在下に血漿α−グロブリンのそれと
同一である。ヘパリンの存在下に、移動度は両者の場合
においてα−グロブリンのそれと同一である。
の電気泳動の移動度は、カルシウムイオンの存在下に血
漿β−２−グロブリンのそれと同一であり、そしてカル
シウムイオンの不存在下に血漿α−グロブリンのそれと
同一である。ヘパリンの存在下に、移動度は両者の場合
においてα−グロブリンのそれと同一である。
本発明は、前述の性質を有するテトラネクチンに関す
る。本発明は、また、テトラネクチンを調整する方法に
関する。第１に、テトラネクチンは哺乳類、例えば、ヒ
トまたはウシの血液または分画から、その蛋白質の性質
の１つまたは２つ以上に適合する通常の蛋白質精製技術
により得ることができる。
る。本発明は、また、テトラネクチンを調整する方法に
関する。第１に、テトラネクチンは哺乳類、例えば、ヒ
トまたはウシの血液または分画から、その蛋白質の性質
の１つまたは２つ以上に適合する通常の蛋白質精製技術
により得ることができる。
テトラネクチンの実際の源はヒト血漿であるが、コーン
フラクションIIIおよび低温沈殿物欠乏血漿（cryopreci
pitate depleted plasma）も適する。また、この蛋白質
を血小板から単離することが可能である。血小板および
肝臓、乳房および子宮の組織切片の中のテトラネクチン
の存在は、なかでも、これらの組織または前駆体細胞が
組み換えDNA技術のためのRNA源であることを示す。
フラクションIIIおよび低温沈殿物欠乏血漿（cryopreci
pitate depleted plasma）も適する。また、この蛋白質
を血小板から単離することが可能である。血小板および
肝臓、乳房および子宮の組織切片の中のテトラネクチン
の存在は、なかでも、これらの組織または前駆体細胞が
組み換えDNA技術のためのRNA源であることを示す。
本発明は、細胞培養により、あるいは組み換えDNA技術
により修飾された微生物または他の宿主により生産され
るテトラネクチンを包含する。
により修飾された微生物または他の宿主により生産され
るテトラネクチンを包含する。
テトラネクチンの精製は、プラスミノゲンの結合したク
リングル４を使用するカラム、抗テトラネクチン抗体カ
ラムまたはヘパリンカラムの新和クロマトグラフィーに
より実施することができる。不純の抗プラスミンをテト
ラネクチン源として使用すると、クリングル４カラムを
首尾よく使用することができるが、抗プラスミンは、ま
た、クリングル１〜３カラムへの吸着、およびこのカラ
ムを通過させる溶離液からのテトラネクチンの単離によ
り除去することができる。
リングル４を使用するカラム、抗テトラネクチン抗体カ
ラムまたはヘパリンカラムの新和クロマトグラフィーに
より実施することができる。不純の抗プラスミンをテト
ラネクチン源として使用すると、クリングル４カラムを
首尾よく使用することができるが、抗プラスミンは、ま
た、クリングル１〜３カラムへの吸着、およびこのカラ
ムを通過させる溶離液からのテトラネクチンの単離によ
り除去することができる。
同一方法で、ウシテトラネクチンは、例えば、ウシ血漿
からクリングル４カラムの使用により単離することがで
きる。
からクリングル４カラムの使用により単離することがで
きる。
それ以上の単離および精製の方法は実施例に説明されて
いる。
いる。
本発明は、また、テトラネクチンに対する抗血清および
抗体に関する。抗血清は動物をテトラネクチンで免疫化
し、そして血清を単離することによって調整することが
できる。単一特異的（monospecific）抗血清は免疫化し
たウサギから得た。抗血清は交差免疫電気泳動において
単一のピークを示した。テトラネクチンに対するモノク
ローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系統は同様
によく構成された。
抗体に関する。抗血清は動物をテトラネクチンで免疫化
し、そして血清を単離することによって調整することが
できる。単一特異的（monospecific）抗血清は免疫化し
たウサギから得た。抗血清は交差免疫電気泳動において
単一のピークを示した。テトラネクチンに対するモノク
ローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系統は同様
によく構成された。
ウシテトラネクチンはヒトテトラネクチンに対する抗血
清と交差反応する。
清と交差反応する。
さらに、本発明は、テトラネクチンに対する抗体を使用
する検出およびアッセイの方法に関する。既知の任意の
免疫学的方法を適用することができる。例えば、ラウレ
ル（Laurell）の電気泳動法またはサンドイッチELISA技
術をテトラネクチンの定量的アッセイに使用することが
できる。この方法は遊離カルシウムイオンの不存在下に
実施すべきである。遊離のカルシウムイオンはキレート
化剤、例えばEDTAの添加により錯化することがある。
する検出およびアッセイの方法に関する。既知の任意の
免疫学的方法を適用することができる。例えば、ラウレ
ル（Laurell）の電気泳動法またはサンドイッチELISA技
術をテトラネクチンの定量的アッセイに使用することが
できる。この方法は遊離カルシウムイオンの不存在下に
実施すべきである。遊離のカルシウムイオンはキレート
化剤、例えばEDTAの添加により錯化することがある。
テトラネクチンはヒト血漿中に0.2μモル（15mg/l）の
平均濃度で存在する。この平均（100％）は正常の健康
なボランティアにおいて決定した。テトラネクチンの濃
度はその日の間変化しない（0900〜1500時間）。20人の
男性において103±20％（標準偏差）および38人の女性
において111±13％の平均濃度が発見され、最低値は71
％であり、そして最高値は171％であった。
平均濃度で存在する。この平均（100％）は正常の健康
なボランティアにおいて決定した。テトラネクチンの濃
度はその日の間変化しない（0900〜1500時間）。20人の
男性において103±20％（標準偏差）および38人の女性
において111±13％の平均濃度が発見され、最低値は71
％であり、そして最高値は171％であった。
急性ではない肝硬変症の患者において、テトラネクチン
の血漿レベルは有意に83±28（SD）％（ｎ＝28）に減少
し、最低レベルは研究したグループにおいて26％であっ
た。これは肝臓が合成部位であることを示唆し、免疫組
織化学の研究と一致する。使用する免疫組織化学の方法
は、ホルムアルデヒド固定しかつトリプシン処理した組
織についての間接のイムノペルオオキシダーゼの技術で
ある。使用する抗体は、テトラネクチン−カラムの親和
精製した、ウサギ抗ヒトテトラネクチンであった。抗体
−抗体複合体は、ペルオキシダーゼと接合したブタ抗ウ
サギIgGにより検出した。ペルオキシダーゼのための基
質は、過酸化水素を含むジメチルホルムアミド中の３−
アミノ−９−エチルカルバゾールであった。テトラネク
チンカラムへ吸着しないIgG分画で着色する対照は絶え
ず陰性であった。上の方法により、テトラネクチンは肝
臓組織（肝臓細胞）、子宮内膜および正常の乳房および
乳癌の腺組織（脈管または接続組織ではない）の中に検
出された。結果は腎臓、脾臓、胃腸管、前立腺、皮膚、
腺甲状腺、心臓および肺において陰性であった。
の血漿レベルは有意に83±28（SD）％（ｎ＝28）に減少
し、最低レベルは研究したグループにおいて26％であっ
た。これは肝臓が合成部位であることを示唆し、免疫組
織化学の研究と一致する。使用する免疫組織化学の方法
は、ホルムアルデヒド固定しかつトリプシン処理した組
織についての間接のイムノペルオオキシダーゼの技術で
ある。使用する抗体は、テトラネクチン−カラムの親和
精製した、ウサギ抗ヒトテトラネクチンであった。抗体
−抗体複合体は、ペルオキシダーゼと接合したブタ抗ウ
サギIgGにより検出した。ペルオキシダーゼのための基
質は、過酸化水素を含むジメチルホルムアミド中の３−
アミノ−９−エチルカルバゾールであった。テトラネク
チンカラムへ吸着しないIgG分画で着色する対照は絶え
ず陰性であった。上の方法により、テトラネクチンは肝
臓組織（肝臓細胞）、子宮内膜および正常の乳房および
乳癌の腺組織（脈管または接続組織ではない）の中に検
出された。結果は腎臓、脾臓、胃腸管、前立腺、皮膚、
腺甲状腺、心臓および肺において陰性であった。
沈殿させ、洗浄した血小板のトリトンの抽出液中に、23
±８％（標準偏差）（ｎ＝３）（正常な血漿に関して１
％）のテトラネクチンが発見された。トロンビンで処理
後、９±0.6％（ｎ＝３）が残り、これにより凝固過程
において発生したトロンビンはテトラネクチンを血小板
から開放できることを示す。このことが意味するよう
に、凝固の間、血小板は約15％の追加のテトラネクチン
を血液濃度に添加することができる。
±８％（標準偏差）（ｎ＝３）（正常な血漿に関して１
％）のテトラネクチンが発見された。トロンビンで処理
後、９±0.6％（ｎ＝３）が残り、これにより凝固過程
において発生したトロンビンはテトラネクチンを血小板
から開放できることを示す。このことが意味するよう
に、凝固の間、血小板は約15％の追加のテトラネクチン
を血液濃度に添加することができる。
テトラネクチンは止血機構の種々の成分、例えば、プラ
スミノゲン、フィブリン、ヘパリン、血小板へ結合する
接着因子である。最も起こうる主要な結合は、プラスミ
ノゲンのクリングル４との結合である。
スミノゲン、フィブリン、ヘパリン、血小板へ結合する
接着因子である。最も起こうる主要な結合は、プラスミ
ノゲンのクリングル４との結合である。
テトラネクチンはプラスミノゲンの活性化を刺激しかつ
制御し、その結果ことに血小板の存在下にかつ血液から
の複雑なフィブリンの凝固物の存在下に、凝血の溶解ま
たは繊維素溶解の速度を高める。
制御し、その結果ことに血小板の存在下にかつ血液から
の複雑なフィブリンの凝固物の存在下に、凝血の溶解ま
たは繊維素溶解の速度を高める。
第２に、テトラネクチンは、フィブリンの不存在下であ
るが、コファクター、例えば、ポリリジンの存在下にプ
ラスミノゲンの活性化を刺激しかつ制御する。このフィ
ブリン依存性のプラスミノゲンの活性化は組織の成長お
よび修復の過程において１つの役割を演ずる。
るが、コファクター、例えば、ポリリジンの存在下にプ
ラスミノゲンの活性化を刺激しかつ制御する。このフィ
ブリン依存性のプラスミノゲンの活性化は組織の成長お
よび修復の過程において１つの役割を演ずる。
テトラネクチンのフィブリンへの結合は過剰のヘパリン
により混乱されず、そしてフィブリンへの結合はプラス
ミノゲンへの結合により影響を受けないことが発見され
た。フィブリン−テトラネクチン複合体へのプラスミノ
ゲンの添加は影響されず、そしてプラスミノゲン−テト
ラネクチンの結合を破壊するEACAの添加はテトラネクチ
ン−フィブリン複合体へ影響を及ぼさなかった。
により混乱されず、そしてフィブリンへの結合はプラス
ミノゲンへの結合により影響を受けないことが発見され
た。フィブリン−テトラネクチン複合体へのプラスミノ
ゲンの添加は影響されず、そしてプラスミノゲン−テト
ラネクチンの結合を破壊するEACAの添加はテトラネクチ
ン−フィブリン複合体へ影響を及ぼさなかった。
ヘパリンへの結合はプラスミノゲンへの結合と置換され
ないかあるいは容易には置換されない。カルシウム含有
培地中の交差免疫電気泳動において、プラスミノゲンは
ヘパリン誘導移動性の変化を消去できなかった。
ないかあるいは容易には置換されない。カルシウム含有
培地中の交差免疫電気泳動において、プラスミノゲンは
ヘパリン誘導移動性の変化を消去できなかった。
これらの結果が示唆するように、テトラネクチンのテト
ラマーの構造は、ヘパリン、フィブリンおよびテトラネ
クチンの異なる下位単位（sub−unit）へのいくつかの
同時の結合を可能とするであろう。これはテトラネクチ
ンの接着機能を説明するであろう。
ラマーの構造は、ヘパリン、フィブリンおよびテトラネ
クチンの異なる下位単位（sub−unit）へのいくつかの
同時の結合を可能とするであろう。これはテトラネクチ
ンの接着機能を説明するであろう。
テトラネクチン血漿濃度は、種々の損傷、例えば、外科
手術、心筋梗塞および癌の後、有意に減少するように見
える。この挙動は陰性の急性期の反応体（negative acu
te phase reactant）のそれに類似する。この作用は比
較的長く続き、そして血漿濃度は損傷の存在またはそれ
からの回復の１つの指示である。主要な腹の外科手術を
実施した24人の患者のグループにおいて、テトラネクチ
ンのレベルは減少し、手術後さらに減少した。手術後に
深部の静脈の血栓を発生した９人の患者において、手術
後第１日のテトラネクチン濃度は血栓をもたない14人の
患者（平均60％）（p 0.05）におけるよりも有意に低か
った（平均48％）。
手術、心筋梗塞および癌の後、有意に減少するように見
える。この挙動は陰性の急性期の反応体（negative acu
te phase reactant）のそれに類似する。この作用は比
較的長く続き、そして血漿濃度は損傷の存在またはそれ
からの回復の１つの指示である。主要な腹の外科手術を
実施した24人の患者のグループにおいて、テトラネクチ
ンのレベルは減少し、手術後さらに減少した。手術後に
深部の静脈の血栓を発生した９人の患者において、手術
後第１日のテトラネクチン濃度は血栓をもたない14人の
患者（平均60％）（p 0.05）におけるよりも有意に低か
った（平均48％）。
凝血溶解へのその同時の活性をかんがみて、テトラネク
チンは止血の調整の因子として使用することができる。
それぞれテトラネクチンまたはテトラネクチン阻害剤、
例えば、抗テトラネクチン抗体の投与によるテトラネク
チンの血液レベルの増加または減少は、また、新形成の
処置において価値をもつことがある。
チンは止血の調整の因子として使用することができる。
それぞれテトラネクチンまたはテトラネクチン阻害剤、
例えば、抗テトラネクチン抗体の投与によるテトラネク
チンの血液レベルの増加または減少は、また、新形成の
処置において価値をもつことがある。
したがって、本発明は、また、活性成分としてテトラネ
クチンを含有する製薬学的組成物に関する。さらに、本
発明はテトラネクチンに対する抗体を含有する製薬学的
組成物に関する。
クチンを含有する製薬学的組成物に関する。さらに、本
発明はテトラネクチンに対する抗体を含有する製薬学的
組成物に関する。
次に実施例により、本発明を説明する。実施例において
使用した物質および方法は次の通りである。
使用した物質および方法は次の通りである。
緩衝液および化学物質 トリス（Tris）:NaOH、Ｉ＝0.15ンル/lでpH7.70（20
℃）に調節した、0.05モルのトリス/HCl 0.10モルのNaC
l。リン酸ナトリウム0.04モル pH7.4。硫酸アンモニウ
ムはメルク（Merk）（西ドイツ、ダーマシュタット）か
ら入手した。
℃）に調節した、0.05モルのトリス/HCl 0.10モルのNaC
l。リン酸ナトリウム0.04モル pH7.4。硫酸アンモニウ
ムはメルク（Merk）（西ドイツ、ダーマシュタット）か
ら入手した。
トランキサム酸（tranexamic acid）およびＤ−Val−Le
u−Lys−Nan（S 2251）はカビ（Kabi）（スウェーデ
ン、ストックホルム）から入手した。凍結乾燥したアン
モニウムヘパリン（150,000U/mg）はレオ・ファーマシ
ューティカルス（Leo Pharmaceuticals）（デンマー
ク、コペンハーゲン）から入手した。
u−Lys−Nan（S 2251）はカビ（Kabi）（スウェーデ
ン、ストックホルム）から入手した。凍結乾燥したアン
モニウムヘパリン（150,000U/mg）はレオ・ファーマシ
ューティカルス（Leo Pharmaceuticals）（デンマー
ク、コペンハーゲン）から入手した。
アガロース（Agarose）A37［インズビオース（Indubios
e ）、EEO＝％0.17］ル’インダスリース・バイオロジ
ーク（L'Industries Biologique）（フランス）。ウル
トロゲル（Ultrogel）ACA34および44はLKB（スウェーデ
ン）から入手した。セファロース（Sepharose）4B臭化
シアン活性化、ヘパリン−セファロース・エン・DEAE−
セファロースCL−6Bはファーマシア（スウェーデン）か
ら入手した。
e ）、EEO＝％0.17］ル’インダスリース・バイオロジ
ーク（L'Industries Biologique）（フランス）。ウル
トロゲル（Ultrogel）ACA34および44はLKB（スウェーデ
ン）から入手した。セファロース（Sepharose）4B臭化
シアン活性化、ヘパリン−セファロース・エン・DEAE−
セファロースCL−6Bはファーマシア（スウェーデン）か
ら入手した。
蛋白質 新鮮な血漿または古い血漿は供与体の血液から得た（ク
エン酸ナトリウム、0.073モル、クエン酸、0.038モル；
およびグルコース、0.124モルを含有する溶液の0.13容
量で安定化された）。
エン酸ナトリウム、0.073モル、クエン酸、0.038モル；
およびグルコース、0.124モルを含有する溶液の0.13容
量で安定化された）。
プラスミノゲンは、バイオヒミカ・エイ・バイオフィジ
カ・アクタ（Biochim. Biophys. Acta）668、377−387
（1981）に記載されるようにリジン−セファロースの親
和クロマトグラフィーにより調整した。Glu1−プラスミ
ノゲンおよびLys77−プラスミノゲンは同一文献に記載
されているようにして調整した。
カ・アクタ（Biochim. Biophys. Acta）668、377−387
（1981）に記載されるようにリジン−セファロースの親
和クロマトグラフィーにより調整した。Glu1−プラスミ
ノゲンおよびLys77−プラスミノゲンは同一文献に記載
されているようにして調整した。
プラスミノゲン−セファロースは、クリステンセン（Ch
ristensen）、U.およびクレメンセン（Clemmensen）、
I.（1978）、バイオケミカル・ジャーナル（Biochem.
J.）175、635−641に記載されるようにして、30μモル
のプラスミノゲンを60gのCNBr−活性化セファロースへ
結合することによって調整した。
ristensen）、U.およびクレメンセン（Clemmensen）、
I.（1978）、バイオケミカル・ジャーナル（Biochem.
J.）175、635−641に記載されるようにして、30μモル
のプラスミノゲンを60gのCNBr−活性化セファロースへ
結合することによって調整した。
プラスミノゲンのＮ−末端部分からのクリングル１＋２
＋３（K 1＋２＋３）およびクリングル４（K4）の調整
および分離は、プログレス・イン・ケミカル・フィブリ
ノリシス・アンド・トロンボリシス（Progress in Chem
ical Fibrinolysis and Thrombolysis）［デイビドソン
（Davidson）、J. F.、ロウワン（Rowan）、R. M.、サ
マナ（Samana）、M. M.およびデスノイアーズ（Desnoye
rs）、P. C.編］vol. 3、191−209ページ、レイベン・
プレス（Raven Press）、ニューヨーク（1978）に記載
されるように、プラスミノゲンを膵臓エステラーゼで消
化することによって実施した。
＋３（K 1＋２＋３）およびクリングル４（K4）の調整
および分離は、プログレス・イン・ケミカル・フィブリ
ノリシス・アンド・トロンボリシス（Progress in Chem
ical Fibrinolysis and Thrombolysis）［デイビドソン
（Davidson）、J. F.、ロウワン（Rowan）、R. M.、サ
マナ（Samana）、M. M.およびデスノイアーズ（Desnoye
rs）、P. C.編］vol. 3、191−209ページ、レイベン・
プレス（Raven Press）、ニューヨーク（1978）に記載
されるように、プラスミノゲンを膵臓エステラーゼで消
化することによって実施した。
10μモルのK 1＋２＋３および８μモルのK4を、それぞ
れ20gおよび15gのセファロースに結合した。
れ20gおよび15gのセファロースに結合した。
すべてのアフィニティークロマトグラフィーの実験は、
リン酸ナトリウム緩衝液0.04モル pH7.4中で実施し、
そして溶離はトランキサム酸１ミリモルを使用して実施
した。
リン酸ナトリウム緩衝液0.04モル pH7.4中で実施し、
そして溶離はトランキサム酸１ミリモルを使用して実施
した。
ヒトフィブリノゲンはIMCO（スウェーデン）から入手し
た。ウシ血清トロンビンはノボ（Novo）（デンマーク）
から入手した。ウロキナーゼはレオ・ファーマシューテ
ィカルス（Leo Pharmaceuticals）（デンマーク）から
の試薬調整物であった。ヒト黒腫細胞プラスミノゲン
は、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J. Biol. Chem.）256、7035−7041（1981）に記載さ
れるようにして精製した。α２プラスミノゲン阻害例、
プラスミノゲン、フィブリノゲンおよびIgGに対する免
疫グロブリンは、すべてダコパット（Dakopatt）（デン
マーク）からのものであった。
た。ウシ血清トロンビンはノボ（Novo）（デンマーク）
から入手した。ウロキナーゼはレオ・ファーマシューテ
ィカルス（Leo Pharmaceuticals）（デンマーク）から
の試薬調整物であった。ヒト黒腫細胞プラスミノゲン
は、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J. Biol. Chem.）256、7035−7041（1981）に記載さ
れるようにして精製した。α２プラスミノゲン阻害例、
プラスミノゲン、フィブリノゲンおよびIgGに対する免
疫グロブリンは、すべてダコパット（Dakopatt）（デン
マーク）からのものであった。
蛋白質濃度の決定 プラスミノゲンK 1＋２＋３、K4およびα２ PIの濃度は
分光高度測定により決定した［スロンボシス・リサーチ
（Thromb. Res.）21,65−71（1981）およびプログレス
・イン・ケミカル・フィブリノリシス・アンド・トロン
ボリシス（Progress in Chemical Fibrinolysis and Th
rombolysis）［デイビドソン（Davidson）、J. F.、ロ
ウワン（Rowan）、R. M.、サマナ（Samana）、M. M.お
よびデスノイアーズ（Desnoyers）、P. C.編］vol.3、1
91−209ページ、レイベン・プレス（Raven Rress）、ニ
ューヨーク（1978）］。ウロキナーゼ１モル＝5.6×10
12プロウグ（Ploug）単位［バイオヒミカ・エト・バイ
オフィジカ・アクタ（Biochim. Biophys. Acta）569、1
77−183（1979）は、その質量濃度および分子質量＝70,
000を使用して黒腫細胞活性化剤のモル濃度を計算する
ために使用した［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（J. Biol. Chem.）256、7035−7041（198
1）］。
分光高度測定により決定した［スロンボシス・リサーチ
（Thromb. Res.）21,65−71（1981）およびプログレス
・イン・ケミカル・フィブリノリシス・アンド・トロン
ボリシス（Progress in Chemical Fibrinolysis and Th
rombolysis）［デイビドソン（Davidson）、J. F.、ロ
ウワン（Rowan）、R. M.、サマナ（Samana）、M. M.お
よびデスノイアーズ（Desnoyers）、P. C.編］vol.3、1
91−209ページ、レイベン・プレス（Raven Rress）、ニ
ューヨーク（1978）］。ウロキナーゼ１モル＝5.6×10
12プロウグ（Ploug）単位［バイオヒミカ・エト・バイ
オフィジカ・アクタ（Biochim. Biophys. Acta）569、1
77−183（1979）は、その質量濃度および分子質量＝70,
000を使用して黒腫細胞活性化剤のモル濃度を計算する
ために使用した［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（J. Biol. Chem.）256、7035−7041（198
1）］。
蛋白質の濃度は、また、ロウリイ（Lowry）ら［ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol.
Chem.）193、265−275（1951）］の方法のワング（Wan
g）およびスミス（Smith）［アナリティカル・バイオケ
ミストリー（Anal. Biochem.）63、414−417（1975）］
による修正法によって、参照物質としてアルブミンを使
用しそしてラウレル（Laurell）［スカンジナビアン・
ジャーナル・オブ・クリニカル・アンド・ラボラトリー
・インベスチゲイション（Scand. J. Clin. Lab. Inves
t.）29, Suppl. 124、21−37（1972）］に記載される電
気免疫アッセイにより決定した。
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol.
Chem.）193、265−275（1951）］の方法のワング（Wan
g）およびスミス（Smith）［アナリティカル・バイオケ
ミストリー（Anal. Biochem.）63、414−417（1975）］
による修正法によって、参照物質としてアルブミンを使
用しそしてラウレル（Laurell）［スカンジナビアン・
ジャーナル・オブ・クリニカル・アンド・ラボラトリー
・インベスチゲイション（Scand. J. Clin. Lab. Inves
t.）29, Suppl. 124、21−37（1972）］に記載される電
気免疫アッセイにより決定した。
SDS中のポリアクリルアミドゲルの電気泳動（SDS−PAG
E）は、ザ・プロテインズ（The Proteins）［ネウラス
（Neurath）、H.およびヒル（Hill）、R. L.編］、Vol.
1、179−223ページ、アカデミック・プレス（Academic
Press）、ロンドン（1975）に記載されるているように
して実施した。分子質量の決定は、ファーマシア（Phar
macia）からの参照蛋白質［LMWカリブレイション・キッ
ト・プロテインズ（Clibration kit proteins）］を使
用して実施した。
E）は、ザ・プロテインズ（The Proteins）［ネウラス
（Neurath）、H.およびヒル（Hill）、R. L.編］、Vol.
1、179−223ページ、アカデミック・プレス（Academic
Press）、ロンドン（1975）に記載されるているように
して実施した。分子質量の決定は、ファーマシア（Phar
macia）からの参照蛋白質［LMWカリブレイション・キッ
ト・プロテインズ（Clibration kit proteins）］を使
用して実施した。
蛋白質の限外濾過は、バイオケミカル・ジャーナル（Bi
ochem. J.）159、545−553（1976）に記載されるように
して実施した。
ochem. J.）159、545−553（1976）に記載されるように
して実施した。
α２ PIの精製は、ユーロピアン・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー（Eur. J. Biochem.）120、105−11
2（1981）に記載される２つの異なる方法により、血漿
または低温沈殿物欠乏血漿を使用して実施した。
バイオケミストリー（Eur. J. Biochem.）120、105−11
2（1981）に記載される２つの異なる方法により、血漿
または低温沈殿物欠乏血漿を使用して実施した。
簡単に述べると、この方法は次の工程からなる： リジン−セファロースのアフィニティークロマトグラフ
ィー、（NH4）2SO4（0.8−2.7モル）による分画、プラ
スミノゲン−セファロースのアフィニティークロマトグ
ラフィー（方法Ａ）またはK 1＋２＋３−セファロース
のアフィニティークロマトグラフィー（方法Ｂ）、DEAE
CL 6B、pHのイオン交換クロマトグラフィーおよびウル
トロゲル（Ultrogel）ACA34のゲル濾過によるプラスミ
ノゲンの除去。
ィー、（NH4）2SO4（0.8−2.7モル）による分画、プラ
スミノゲン−セファロースのアフィニティークロマトグ
ラフィー（方法Ａ）またはK 1＋２＋３−セファロース
のアフィニティークロマトグラフィー（方法Ｂ）、DEAE
CL 6B、pHのイオン交換クロマトグラフィーおよびウル
トロゲル（Ultrogel）ACA34のゲル濾過によるプラスミ
ノゲンの除去。
セファデックスG75スーパーファイン（superfine）を使
用する方法Ａにより精製されたPBα２ PIのゲル濾過 これはカラム（5.3cm2×90cm）中で実施し、このカラム
はトリス−HCl 0.05モル、NaCl 0.1モル pH7.4（グア
ニジン塩酸塩６モルを含むかあるいは含まない）で平衡
化しかつ溶離した。適用した試料は、方法により精製さ
れ、同一緩衝液中に溶解した30ナノモルのPBα２ PIを
含有した。溶離後、蛋白質を280nmにおける吸収の測定
により推定した。溶離した蛋白質のピークをプールし、
そして限外濾過により濃縮し［アミコン（Amicon）、米
国］そしてSDS−PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム ポリ
アクリルアミドゲルの電気泳動）に適用した。
用する方法Ａにより精製されたPBα２ PIのゲル濾過 これはカラム（5.3cm2×90cm）中で実施し、このカラム
はトリス−HCl 0.05モル、NaCl 0.1モル pH7.4（グア
ニジン塩酸塩６モルを含むかあるいは含まない）で平衡
化しかつ溶離した。適用した試料は、方法により精製さ
れ、同一緩衝液中に溶解した30ナノモルのPBα２ PIを
含有した。溶離後、蛋白質を280nmにおける吸収の測定
により推定した。溶離した蛋白質のピークをプールし、
そして限外濾過により濃縮し［アミコン（Amicon）、米
国］そしてSDS−PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム ポリ
アクリルアミドゲルの電気泳動）に適用した。
ウルトロゲルACA34のゲル濾過 これはカラム（5.3cm2
×90cm）を使用して実施し、このカラムはCaCl2 2ミリ
モルまたはEDTA 2ミリモルを含むか、あるいは含まない
トリス緩衝液で平衡化しかつ充填した。このカラムは異
なるマーカー蛋白質の使用により目盛定めした。
×90cm）を使用して実施し、このカラムはCaCl2 2ミリ
モルまたはEDTA 2ミリモルを含むか、あるいは含まない
トリス緩衝液で平衡化しかつ充填した。このカラムは異
なるマーカー蛋白質の使用により目盛定めした。
等電点電気泳動は、マルチフォア（Multiphor）システ
ム2117［LKB、プロダクツ（Products）AB、スウェーデ
ン、ブロンマ］において、一定の電力供給ISCO490型、
ポリアクリルアミド勾配ゲル（pH3.5−9.5）、アノード
およびカソードの電極溶液、試料適用片および電極フォ
ーカシング（focusing）［インストロメンテイション・
スペシアルティーズ・カンパニー（Instrumentation Sp
esialties Company）、Lincoln Neb.、USA］を使用して
実施した。ストリップはLKBプロダクツ（Products）か
ら入手した。予備電気泳動を1,000Vで30分間実施し、そ
して電気泳動を0.6ナノモルのＫ−４結合性蛋白質を適
用後1,000Vにおいて2.5時間実施した。pH勾配の目盛定
めは、ファーマシア（Pharmacia）からの等電点電気泳
動目盛定めキットIsoelectric Focusing Calibration K
it）（pH3−10）を使用して実施した。
ム2117［LKB、プロダクツ（Products）AB、スウェーデ
ン、ブロンマ］において、一定の電力供給ISCO490型、
ポリアクリルアミド勾配ゲル（pH3.5−9.5）、アノード
およびカソードの電極溶液、試料適用片および電極フォ
ーカシング（focusing）［インストロメンテイション・
スペシアルティーズ・カンパニー（Instrumentation Sp
esialties Company）、Lincoln Neb.、USA］を使用して
実施した。ストリップはLKBプロダクツ（Products）か
ら入手した。予備電気泳動を1,000Vで30分間実施し、そ
して電気泳動を0.6ナノモルのＫ−４結合性蛋白質を適
用後1,000Vにおいて2.5時間実施した。pH勾配の目盛定
めは、ファーマシア（Pharmacia）からの等電点電気泳
動目盛定めキットIsoelectric Focusing Calibration K
it）（pH3−10）を使用して実施した。
ヘパリン−セファロースのアフィニティークロマトグラ
フィー これはカラム（1.76m2×8cm）中に詰めたヘパリン−セ
ファロース（ファーマシア）を使用して実施し、このカ
ラムはチェレックス（chelex）100［200〜400メッシ
ュ、バイロラド（Biorad）から入手した］を通過した水
から調整したトリス緩衝液で平衡化した。Ca++の不存在
下のアフィニティークロマトグラフィー（実験Ａ）は、
試料（10mlのトリス緩衝液中の20ナノモルの精製したＫ
−４結合性蛋白質）を使用して実施し、この試料は200
容量のトリス緩衝液、５ミリモルのEDTAに対しておよび
再び200容量のトリス緩衝液に対して一夜透析したもの
であった。このカラムを20mlのトリス緩衝液で洗浄し、
そして蛋白質を300mlのトリス緩衝液と300mlの1.0モル
のNaClを含有するトリス緩衝液との混合により形成した
直線の塩の勾配で溶離した。
フィー これはカラム（1.76m2×8cm）中に詰めたヘパリン−セ
ファロース（ファーマシア）を使用して実施し、このカ
ラムはチェレックス（chelex）100［200〜400メッシ
ュ、バイロラド（Biorad）から入手した］を通過した水
から調整したトリス緩衝液で平衡化した。Ca++の不存在
下のアフィニティークロマトグラフィー（実験Ａ）は、
試料（10mlのトリス緩衝液中の20ナノモルの精製したＫ
−４結合性蛋白質）を使用して実施し、この試料は200
容量のトリス緩衝液、５ミリモルのEDTAに対しておよび
再び200容量のトリス緩衝液に対して一夜透析したもの
であった。このカラムを20mlのトリス緩衝液で洗浄し、
そして蛋白質を300mlのトリス緩衝液と300mlの1.0モル
のNaClを含有するトリス緩衝液との混合により形成した
直線の塩の勾配で溶離した。
Ca++の不存在下のアフィニティークロマトグラフィー
（実験Ｂ）は、トリス緩衝液および５ミリモルのCaCl2
に対して透析した試料を使用して実施した。実験Ａにお
けるように、このカラムを洗浄し、そして蛋白質を溶離
したが、緩衝液はEDTAの代わりに５ミリモルのCaCl2を
含有した。
（実験Ｂ）は、トリス緩衝液および５ミリモルのCaCl2
に対して透析した試料を使用して実施した。実験Ａにお
けるように、このカラムを洗浄し、そして蛋白質を溶離
したが、緩衝液はEDTAの代わりに５ミリモルのCaCl2を
含有した。
γ−カルボキシグルタミン酸含有血漿蛋白質のクエン酸
バリウムへの吸着 これはバイオケミカル・ジャーナル
（Biochem. J.）209、837−646（1983）に記載されてい
るようにして実施した。吸着後の上澄み液およびEDTAで
溶離された蛋白質を、精製されたＫ−４結合性蛋白質に
対してレイズ（raisea）した抗体を使用する定量電気免
疫アッセイにかけた。
バリウムへの吸着 これはバイオケミカル・ジャーナル
（Biochem. J.）209、837−646（1983）に記載されてい
るようにして実施した。吸着後の上澄み液およびEDTAで
溶離された蛋白質を、精製されたＫ−４結合性蛋白質に
対してレイズ（raisea）した抗体を使用する定量電気免
疫アッセイにかけた。
フィブリン凝固物の溶解アッセイ これは記載されるよ
うにウコキナーゼおよび黒腫組織活性化剤を使用して実
施した［ヘモスタシス（Haemostasis）５、218−230（1
976）］。
うにウコキナーゼおよび黒腫組織活性化剤を使用して実
施した［ヘモスタシス（Haemostasis）５、218−230（1
976）］。
ポリ−Ｄ−リジンの存在下の黒腫細胞組織活性化剤によ
り触媒されるプラスミノゲンの活性化 これは記載されているように［バイオケミカル・ジャー
ナル（Biochem. J.）225、149−158（1985）］ポリ−Ｄ
−リジンの存在下に、増加する量の精製された蛋白質の
存在下におよび不存在下に、プラスミンのための特定の
色素原のペプチド基質を使用して実施した。
り触媒されるプラスミノゲンの活性化 これは記載されているように［バイオケミカル・ジャー
ナル（Biochem. J.）225、149−158（1985）］ポリ−Ｄ
−リジンの存在下に、増加する量の精製された蛋白質の
存在下におよび不存在下に、プラスミンのための特定の
色素原のペプチド基質を使用して実施した。
実施例Ｉ PBα２ PIの精製 方法Ａおよび方法Ｂの両者により精製された阻害剤調整
物は、両者とも67,000の分子質量を示した。方法Ａによ
り精製されたPBα２ PI調整物は、分子質量が17,000で
ある追加の蛋白質の帯（SDS−PAGE）が発見されたが、
これに対して方法Ｂにより精製された阻害剤調整物中に
はそれが存在しなかった。変性剤の不存在下のゲル濾過
により汚染蛋白質を除去する試みは不成功に終った。セ
ファデックスG75スーパーファインのゲル瀘過にかけ、
そしてトリス緩衝液で溶離したとき、蛋白質はPBα2 PI
と一緒に溶離され、これに対してブアニジン塩酸塩６モ
ルの存在下の同一のゲル濾過実験において２つの蛋白質
が別々のピークとして現われる。
物は、両者とも67,000の分子質量を示した。方法Ａによ
り精製されたPBα２ PI調整物は、分子質量が17,000で
ある追加の蛋白質の帯（SDS−PAGE）が発見されたが、
これに対して方法Ｂにより精製された阻害剤調整物中に
はそれが存在しなかった。変性剤の不存在下のゲル濾過
により汚染蛋白質を除去する試みは不成功に終った。セ
ファデックスG75スーパーファインのゲル瀘過にかけ、
そしてトリス緩衝液で溶離したとき、蛋白質はPBα2 PI
と一緒に溶離され、これに対してブアニジン塩酸塩６モ
ルの存在下の同一のゲル濾過実験において２つの蛋白質
が別々のピークとして現われる。
実施例II 方法Ａによる阻害剤調整物のK4−セファロースおよびK
1＋２＋３−セファロースのアフィニティークロマトグ
ラフィー Ａ、方法Ｂによるα２ PIの精製に使用する配位子は、
ミニプラスミノゲンおよびプラスミノゲンのクリングル
４部分が欠如することにより方法において使用したもの
と異なる。これは、方法Ａによる阻害剤調整物中に存在
する汚染蛋白質がプラスミノゲン配位子のクリングル４
部分に吸着されたことを示唆する。したがって、ある実
験を組み立て、ここで方法Ａにより得られた阻害剤の50
ナノモルを含有する調整K4−セファロースのアフィニテ
ィークロマトグラフィーに適用した。阻害剤は空隙体積
中に現われ、これに対して同時に精製された蛋白質は保
持され、そして引続いてトランキサム酸１ミリモル/lで
カラムから溶離した。溶離液は、最も純粋な形態でSDS
−PAGEにより17,000の分子質量を示す同時に精製された
成分を含有した。同時に精製された蛋白質は、結合した
ミニプラスミノゲンを含むカラムへ結合しなかった。
1＋２＋３−セファロースのアフィニティークロマトグ
ラフィー Ａ、方法Ｂによるα２ PIの精製に使用する配位子は、
ミニプラスミノゲンおよびプラスミノゲンのクリングル
４部分が欠如することにより方法において使用したもの
と異なる。これは、方法Ａによる阻害剤調整物中に存在
する汚染蛋白質がプラスミノゲン配位子のクリングル４
部分に吸着されたことを示唆する。したがって、ある実
験を組み立て、ここで方法Ａにより得られた阻害剤の50
ナノモルを含有する調整K4−セファロースのアフィニテ
ィークロマトグラフィーに適用した。阻害剤は空隙体積
中に現われ、これに対して同時に精製された蛋白質は保
持され、そして引続いてトランキサム酸１ミリモル/lで
カラムから溶離した。溶離液は、最も純粋な形態でSDS
−PAGEにより17,000の分子質量を示す同時に精製された
成分を含有した。同時に精製された蛋白質は、結合した
ミニプラスミノゲンを含むカラムへ結合しなかった。
Ｂ、方法Ａにより得られた阻害剤調整物をK 1＋２＋３
−セファロースのカラムへ適用すると、空隙体積中に分
子質量17,000の蛋白質が出現し、これに対して阻害剤は
カラムに保持され、そしてトランキサム酸１ミリモル/l
で溶離することができなかった。
−セファロースのカラムへ適用すると、空隙体積中に分
子質量17,000の蛋白質が出現し、これに対して阻害剤は
カラムに保持され、そしてトランキサム酸１ミリモル/l
で溶離することができなかった。
実施例III K4結合性蛋白質のウルトロゲルACA34のゲル濾過 実施例IIAに従って得られたK4結合性蛋白質の調整物を
目盛定めしたウルトロゲルACA34へ適用すると、蛋白質
はアルブミンのちょうど前面で溶離され、約70,000の分
子質量を示唆した（５回の異なる実験）。これはグアニ
ジン塩酸塩の不存在下のセファデックスG75のゲル濾過
実験に従うが、SDS−PAGEにより得られた約17,000の分
子質量と明らかに矛盾する。この不一致は、K4結合性蛋
白質がSDSにより解離されるオリゴマー（テトラマー）
の蛋白質として存在すると仮定すると、説明することが
できる。グアニジン塩酸塩の存在下に実施したゲル濾過
は、また、この過程を支持する。
目盛定めしたウルトロゲルACA34へ適用すると、蛋白質
はアルブミンのちょうど前面で溶離され、約70,000の分
子質量を示唆した（５回の異なる実験）。これはグアニ
ジン塩酸塩の不存在下のセファデックスG75のゲル濾過
実験に従うが、SDS−PAGEにより得られた約17,000の分
子質量と明らかに矛盾する。この不一致は、K4結合性蛋
白質がSDSにより解離されるオリゴマー（テトラマー）
の蛋白質として存在すると仮定すると、説明することが
できる。グアニジン塩酸塩の存在下に実施したゲル濾過
は、また、この過程を支持する。
血漿（4ml）または血清を、また、目盛定めしたウルト
ロゲルのカラムに適用し、そして溶離のプロフィルをα
２ PIおよびK4結合性蛋白質の電気免疫アッセイにより
監視した。同時に精製されたK4結合性蛋白質を含有する
α２ PIの調整物を用いて得られた結果に従うと、２種
類の蛋白質の両者は約70,000の分子質量をもつ蛋白質と
して溶離される。
ロゲルのカラムに適用し、そして溶離のプロフィルをα
２ PIおよびK4結合性蛋白質の電気免疫アッセイにより
監視した。同時に精製されたK4結合性蛋白質を含有する
α２ PIの調整物を用いて得られた結果に従うと、２種
類の蛋白質の両者は約70,000の分子質量をもつ蛋白質と
して溶離される。
実施例IV 血漿からのK4結合性蛋白質の精製 血漿中のK4結合性蛋白質を精製する方法を開発した。こ
の蛋白質は、クエン酸バリウム沈殿後の上澄み液中に発
見された。プラスミノゲンを１リットルの血漿からリジ
ン−セファロースの親和クロマトグラフィーにより除去
し、そしてプラスミノゲン欠乏血漿からの蛋白質の（NH
4）2SO4沈殿のための最適条件を決定し、そしてα２ PI
精製において使用したもの（0.8モル〜2.7モル）と同様
であることがわかった。（NH4）2SO4（2.7モル）の添加
後得られる沈殿をリン酸ナトリウム緩衝液0.04モル、pH
7.4中に溶解し、そして同一緩衝液に対して一夜透析し
た。透析した血漿を、K4−セファロースを詰めたカラム
（5.2cm2×10cm）に適用した。このカラムをリン酸塩緩
衝液で、280nmにおける吸収が0.050以下となるまで、パ
ーコレーションした。蛋白質を同一緩衝液中のトランキ
サム酸１ミリモルで溶離した。蛋白質の溶離を電気免疫
アッセイにより追跡し、そして分画をプールし、そして
リン酸ナトリウム緩衝液0.04モル pH7.4で平衡化したD
EAE CL6B−セファロースのカラム（5.2cm2×10cm）に適
用した。溶離は300mlの平衡化緩衝液とNaCl 0.3モルを
添加した300mlの平衡化緩衝液との直線の勾配で溶離し
た。K4結合性蛋白質を含有する溶離分画を5mlに濃縮
し、そしてトリス緩衝液中のウルトロゲルACA34を充填
したカラム（5.2cm2×10cm）へ適用した。再び、蛋白質
の溶離を電気免疫アッセイにより追跡し、そして分画を
プールし、そして5mlに濃縮した。精製された蛋白質のS
AS−PAGEは分子質量17,000の１つのみの帯を明らかにし
た。280nmにおける吸収の測定およびロウリイ（Lowry）
法により決定した蛋白質濃度に基づいて、 の吸収計数が得られた。
の蛋白質は、クエン酸バリウム沈殿後の上澄み液中に発
見された。プラスミノゲンを１リットルの血漿からリジ
ン−セファロースの親和クロマトグラフィーにより除去
し、そしてプラスミノゲン欠乏血漿からの蛋白質の（NH
4）2SO4沈殿のための最適条件を決定し、そしてα２ PI
精製において使用したもの（0.8モル〜2.7モル）と同様
であることがわかった。（NH4）2SO4（2.7モル）の添加
後得られる沈殿をリン酸ナトリウム緩衝液0.04モル、pH
7.4中に溶解し、そして同一緩衝液に対して一夜透析し
た。透析した血漿を、K4−セファロースを詰めたカラム
（5.2cm2×10cm）に適用した。このカラムをリン酸塩緩
衝液で、280nmにおける吸収が0.050以下となるまで、パ
ーコレーションした。蛋白質を同一緩衝液中のトランキ
サム酸１ミリモルで溶離した。蛋白質の溶離を電気免疫
アッセイにより追跡し、そして分画をプールし、そして
リン酸ナトリウム緩衝液0.04モル pH7.4で平衡化したD
EAE CL6B−セファロースのカラム（5.2cm2×10cm）に適
用した。溶離は300mlの平衡化緩衝液とNaCl 0.3モルを
添加した300mlの平衡化緩衝液との直線の勾配で溶離し
た。K4結合性蛋白質を含有する溶離分画を5mlに濃縮
し、そしてトリス緩衝液中のウルトロゲルACA34を充填
したカラム（5.2cm2×10cm）へ適用した。再び、蛋白質
の溶離を電気免疫アッセイにより追跡し、そして分画を
プールし、そして5mlに濃縮した。精製された蛋白質のS
AS−PAGEは分子質量17,000の１つのみの帯を明らかにし
た。280nmにおける吸収の測定およびロウリイ（Lowry）
法により決定した蛋白質濃度に基づいて、 の吸収計数が得られた。
精製された蛋白質の調整物（0.2g/l）を定量的電気免疫
アッセイにおいて標準として使用して、血漿中の濃度お
よび異なる分画化工程における蛋白質の収率を決定し
た。血漿中の濃度は約15mg/lまたは0.2モル/lであると
推定された。
アッセイにおいて標準として使用して、血漿中の濃度お
よび異なる分画化工程における蛋白質の収率を決定し
た。血漿中の濃度は約15mg/lまたは0.2モル/lであると
推定された。
実施例Ｖ 交差免疫電気泳動 pH8.6における血漿（または血清）の交差免疫電気泳動
において、K4結合性蛋白質はβ−グロブリンのそれに類
似する移動度を生ずる正味の電荷を有することがわかっ
た。精製されたK4結合性蛋白質は、また、β−領域にお
いて見出された。精製されたK4結合性蛋白質のpH8.6に
おける電気泳動の移動度は、電気泳動の第１次元におい
てEDTA 2ミリモル/lにより高度に影響を受けた。この蛋
白質の移動度はβ−グロブリンからインター−α−グロ
ブリンの移動度へ変化した。また、電気泳動の第１次元
におけるCa++（２ミリモル/l）の存在は電気泳動の移動
度を変化させた。さらに、免疫沈殿の形状はCa++により
高度に影響を受けるように見えた。Ca++の存在は非常に
小さい沈殿のピークを生じたが、EDTAの存在は高い沈殿
のピークを生じた。ヘパリンの存在（ゲルおよびゲル緩
衝液中において５×10'単位/l）は、また、K4結合性蛋
白質の電気泳動の移動度を増加させた。電気泳動の移動
度および沈殿の形状は、電気泳動の間にEDTAが存在した
ときに得られた結果とほぼ同一であった。Ca++、EDTAお
よびヘパリンのK4結合性蛋白質の電気泳動の移動度への
同様な影響は、また、血漿を使用した時に見られた。
において、K4結合性蛋白質はβ−グロブリンのそれに類
似する移動度を生ずる正味の電荷を有することがわかっ
た。精製されたK4結合性蛋白質は、また、β−領域にお
いて見出された。精製されたK4結合性蛋白質のpH8.6に
おける電気泳動の移動度は、電気泳動の第１次元におい
てEDTA 2ミリモル/lにより高度に影響を受けた。この蛋
白質の移動度はβ−グロブリンからインター−α−グロ
ブリンの移動度へ変化した。また、電気泳動の第１次元
におけるCa++（２ミリモル/l）の存在は電気泳動の移動
度を変化させた。さらに、免疫沈殿の形状はCa++により
高度に影響を受けるように見えた。Ca++の存在は非常に
小さい沈殿のピークを生じたが、EDTAの存在は高い沈殿
のピークを生じた。ヘパリンの存在（ゲルおよびゲル緩
衝液中において５×10'単位/l）は、また、K4結合性蛋
白質の電気泳動の移動度を増加させた。電気泳動の移動
度および沈殿の形状は、電気泳動の間にEDTAが存在した
ときに得られた結果とほぼ同一であった。Ca++、EDTAお
よびヘパリンのK4結合性蛋白質の電気泳動の移動度への
同様な影響は、また、血漿を使用した時に見られた。
実施例VI ラウレル（Laurell）に従う電気免疫アッセイ ロケット（rocket）免疫電気泳動は、また、Ca++、EDTA
およびヘパリンの不存在または存在により影響を受け
た。
およびヘパリンの不存在または存在により影響を受け
た。
ゲルおよび緩衝液中のCa++（２ミリモル）の存在は、血
漿および血清を適用したとき、免疫沈殿の形成をほぼ防
止し、これに対してEDTA 2ミリモルをゲルおよび緩衝液
に適用すると正常なロケットが生ずる。
漿および血清を適用したとき、免疫沈殿の形成をほぼ防
止し、これに対してEDTA 2ミリモルをゲルおよび緩衝液
に適用すると正常なロケットが生ずる。
実施例VII ヘパリン−セファロースへの会合 K4結合性蛋白質は、Ca++の不存在ならびに存在の両者に
おいて、ヘパリン−セファロースにより保持された。ED
TA 5ミリモルを実験Ｂ（Ca++の存在下）に添加すると、
ヘパリンのカラムからK4結合性蛋白質を開放しなかっ
た。これはEDTAおよびヘパリンがK4結合性蛋白質中でCa
++について競争しないことを示す。これはK4結合性蛋白
質へのヘパリンの結合Ca++を含まないことを示すであろ
う。両者の実験において、K4結合性蛋白質は0.3〜0.45
モルのNaClの添加によりカラムから開放された。
おいて、ヘパリン−セファロースにより保持された。ED
TA 5ミリモルを実験Ｂ（Ca++の存在下）に添加すると、
ヘパリンのカラムからK4結合性蛋白質を開放しなかっ
た。これはEDTAおよびヘパリンがK4結合性蛋白質中でCa
++について競争しないことを示す。これはK4結合性蛋白
質へのヘパリンの結合Ca++を含まないことを示すであろ
う。両者の実験において、K4結合性蛋白質は0.3〜0.45
モルのNaClの添加によりカラムから開放された。
実施例VIII 等電点電気泳動およびＮ−末端アミノ酸 等電点電気泳動による等電点は5.8であることがわかっ
た。最初の５つのＮ−末端アミノ酸ハＮ−glu−pro−pr
o−thr−gluであることがわかった。
た。最初の５つのＮ−末端アミノ酸ハＮ−glu−pro−pr
o−thr−gluであることがわかった。
実施例IX フィブリン凝固物の溶解（lysis）アッセイ プラスミノゲンおよびウロキナーゼをまた含有する精製
されたフィブリンを有するフィブリン凝固物系に、0.1
〜0.2μモル/l（最終濃度）の種々な量のK4結合性蛋白
質を添加すると、K4結合性蛋白質の不存在下に得られた
溶解時間に比較して、凝固物の溶解時間に影響を及ぼさ
なかった。同一の事実は、黒腫細胞プラスミノゲン活性
化剤（ｔ−PA）を用いる同様な実験に適用される。
されたフィブリンを有するフィブリン凝固物系に、0.1
〜0.2μモル/l（最終濃度）の種々な量のK4結合性蛋白
質を添加すると、K4結合性蛋白質の不存在下に得られた
溶解時間に比較して、凝固物の溶解時間に影響を及ぼさ
なかった。同一の事実は、黒腫細胞プラスミノゲン活性
化剤（ｔ−PA）を用いる同様な実験に適用される。
これと対照的に、黒腫細胞プラスミノゲン活性化剤およ
びトロンビンに富んだ全血の溶解は、精製されたK4結合
性蛋白質（テトラネクチン）の添加により加速され、そ
してウサギにおいて誘導したテトラネクチンの対する抗
血清から得られた精製された免疫グロブリンの添加によ
り阻止された。
びトロンビンに富んだ全血の溶解は、精製されたK4結合
性蛋白質（テトラネクチン）の添加により加速され、そ
してウサギにおいて誘導したテトラネクチンの対する抗
血清から得られた精製された免疫グロブリンの添加によ
り阻止された。
実施例Ｘ ポリ−Ｄ−リジン刺激プラスミノゲン活性化の増強 この実験は、ポリ−Ｄ−リジンの存在下のｔ−Pa触媒Gl
u1−プラスミノゲン活性化へのK4結合性蛋白質の作用を
示す。この蛋白質の添加は、ポリ−Ｄ−リジンのみの存
在下に得られた速度に関するプラスミンの発生速度にお
ける増加を生じた。この速度は再びポリ−Ｄ−リジンの
不存在下に得られた速度ようりも非常に高かった。K4結
合性蛋白質により誘導される増加は、約0.25μモルに1/
2最大をもつ飽和曲線に従った。
u1−プラスミノゲン活性化へのK4結合性蛋白質の作用を
示す。この蛋白質の添加は、ポリ−Ｄ−リジンのみの存
在下に得られた速度に関するプラスミンの発生速度にお
ける増加を生じた。この速度は再びポリ−Ｄ−リジンの
不存在下に得られた速度ようりも非常に高かった。K4結
合性蛋白質により誘導される増加は、約0.25μモルに1/
2最大をもつ飽和曲線に従った。
添付図面は、本発明によるテトラネクチンと呼ぶ蛋白質
の４つのポリペプチド鎖からなる構造をに示す。
の４つのポリペプチド鎖からなる構造をに示す。
Claims (5)
- 【請求項１】４つのポリペプチド鎖をその分子中に含ん
でなり、該ポリペプチド鎖の各々が下記式： を有する蛋白質。 - 【請求項２】次の性質： a.ウルトロゲル（Ultrogel）ACA34上のゲルクロマトグ
ラフイーにより決定して約68,000およびアミノ酸組成か
ら計算して約80,800の見掛けの分子質量を有する、 b.ドデシル硫酸ナトリウムの存在下に、解離してSDS−P
AGEにより約17,000またはアミノ酸組成から計算して約2
0,200の見掛けの分子質量を有する蛋白質サブユニツト
となる、 c.N−末端配列がＮ−glu−pro−pro−thr−gluである、 d.プラスミノゲンのクリングル（Kingle）４に特異的に
結合する、 e.γ−カルボキシグルタミン酸残基を含有しない、 f.糖残基を含有せずかつ糖蛋白質でない、 g.二価のカチオンと結合する、 h.ヘパリンに結合しそして、カルシウムイオンの存在下
に、フイブリンに結合する、 の少なくとも１つの示す特許請求の範囲第１項記載の蛋
白質。 - 【請求項３】４つのポリペプチド鎖をその分子中に含ん
でなり、該ポリペプチド鎖の各々が下記式： を有する蛋白質を製造するにあたり、該蛋白質を含有す
る体液、細胞または有機体を、クリングル４、ヘパリン
または該蛋白質に対する抗体を含有するカラム上でアフ
イニテイークロマトグラフイーに付すことを特徴とする
上記蛋白質の製造方法。 - 【請求項４】血液または血液分画をアフイニテイークロ
マトグラフイーに付す特許請求の範囲３項記載の方法。 - 【請求項５】４つのポリペプチド鎖をその分子中に含ん
でなり、該ポリペプチド鎖の各々が下記式： を有する蛋白質を有効成分として含有することを特徴と
する線維素溶解制御剤。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| NL8501682 | 1985-06-11 | ||
| NL8501682A NL8501682A (nl) | 1985-06-11 | 1985-06-11 | Nieuw, uit bloed geisoleerd eiwit, werkwijze ter bereiding van dit eiwit, antilichamen tegen het nieuwe eiwit en farmaceutische preparaten, die het eiwit of de antilichamen bevatten. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| JPS62181299A JPS62181299A (ja) | 1987-08-08 |
| JPH0676438B2 true JPH0676438B2 (ja) | 1994-09-28 |
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| JP (1) | JPH0676438B2 (ja) |
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| US5510102A (en) * | 1995-01-23 | 1996-04-23 | The Regents Of The University Of California | Plasma and polymer containing surgical hemostatic adhesives |
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| US11124558B2 (en) | 2017-06-02 | 2021-09-21 | The Feinstein Institutes For Medical Research | Use of tetranectin and peptide agonists to treat inflammatory diseases |
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-
1986
- 1986-06-10 DE DE8686201005T patent/DE3667061D1/de not_active Expired
- 1986-06-10 US US06/872,613 patent/US4853220A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-06-10 EP EP86201005A patent/EP0206400B1/en not_active Expired
- 1986-06-10 AT AT86201005T patent/ATE48142T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-06-11 JP JP61135864A patent/JPH0676438B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-07-21 US US07/384,283 patent/US5064942A/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
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| US5064942A (en) | 1991-11-12 |
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| DE3667061D1 (en) | 1989-12-28 |
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| EP0206400A1 (en) | 1986-12-30 |
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| JPS62181299A (ja) | 1987-08-08 |
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