JPS62181299A - 血液から単離された蛋白質、該蛋白質の製造方法および該蛋白質を含有する製薬学的組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトの血液から単離されたそしてまた他の哺
乳動物の細胞、例えば、ウシの血液中に存在する新規な
蛋白質に関する。この新規な蛋白質は、プラスミノゲン
のクリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）４に特異的に結合する
ことが発見され、そしてテトラネクチンと呼ばれた。

プラスミノゲンーセフ７０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）
の親和クロマトグラフィーにより精製されたα２−抗プ
ラスミンのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドの電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、約１７，０００
ダルトンの見掛の分子ｆｉ！Ｊ：（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　　ｍａｓｓ）を有する生成物の追加の弱い帯を示す［
ユーロピアン・ジャーナル・オブφバイオケミストリー
（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１２０．１０５−１
１２（１９８１）］。この蛋白質はα２−’ｆｊＬプラ
スミンの調製の汚染物質であると考えられた。

今回、この分子質量１７．０００の蛋白質はプラスミノ
ゲンのクリングル４に特異的に結合し、そしてクリング
ル１〜３またはミニプラスミノゲンに結合しないことが
発見された。分子質量１７．０００の蛋白質は、分子質
量６８．０００を有するＳＤＳＭ離生成物であることが
発見された。この後者の蛋白質は本発明に従う蛋白質、
テトラネクチン（Ｔｅｔ　ｒａｎｅｃｔ　ｉｎ）であり
、これについて以後詳しく説明する。

フイプリノゲンのフィブリンへの転化は１つの重要な生
物学的過程である。フィブリンの形成は１ヒ血において
極めて重要であるが、それはまた他の生物学的過程、例
えば、炎症および悪性の病気および組織の補修において
重要な面である。右機体におけるフィブリン蓄積物の分
解はセリンプテイナーゼプラスミンにより触媒され、そ
してプラスミンは活性化剤の影響下にプラスミノゲンか
ら形成される。このフィブリンの分解はこれらのプラス
ミノゲン活性化剤により、プラスミン阻害剤により、そ
して活性他剤阻害剤により制御されることが知られてい
る。

プラスミン仲介繊維素分解を制御する最も重要な阻害蛋
白質はα２−プラスミン阻害剤（α２ＰＩ）である。α
２−ＰＩがチモーゲンプラスミノゲンに可逆的に結合す
るという観察はその精製手順を簡素化した。この阻害剤
はプラスミノゲンクリングルｌ〜３に結合し、そしてそ
れからリジンにより解離することができる。こうしてα
２−ＰＩはプラスミノゲンーセファロース（Ｓｅｐｈａ
ｒ　ｏ　ｓ　ｅ）またはクリングルｌ＋２＋３−セファ
ロースの親和クロマトグラフィーにより精製することが
できる。しかしながら、最近の研究は、ヒト血漿中に存
在するα２−ＰＩのすべてをこの手ｊ１により精製する
ことは不可能であることを示唆している。循環するα２
−ＰＩの分画はプラスミノゲンと可逆的錯体を形成する
ことができず、これに対してそれはプラスミンの活性部
位に向かうその阻害潜在力をなお保持する。

こうして、α２−ＰＩの２つの型、プラスミノケン結合
形Ｆｇ（ＰＢα２−ＰＩ）および非プラスミノゲン結合
形ｍ　（Ｎ　Ｐ　Ｂα２−ＰＩ）はヒト血漿中に存在す
る。プラスミノゲンーセファロースの親和クロマトグラ
フィーにより精製されたＰＢα２ＰＩの調製物は、ＮＰ
Ｂα２ＰＨに自発的に転化する。この転化は分子質ｆｉ
２，０００のペプチドの開放により達成される。この転
化の原因となる。ＰＢα２ＰＩ中の可１敞な蛋白質分解
酵素を同定する試みにおいて、汚染する蛋白質が同定さ
れ、この蛋白質はプラスミノゲンーセファロースの代わ
りにクリングルｌ＋２＋３−セファロースの親和クロマ
トグラフィーにより精製されたα２−ＰＩの調製物中に
存在しない。

テトラネクチンの性質をここでさらに詳しく述べる。

ヒトプラスミノゲンは、その分子のＮ−末端部分に５つ
の相同トリプル−ループ、３つのジサルファイド架橋ク
リングル構造を含有する。膵臓エステラーゼを使用する
プラスミノゲンの制限された蛋白質分解は、プラスミノ
ゲンからのクリングル１〜３およびクリングル４の断片
の切離しを生ずる。プロトロンビン、ウロキナーゼ、組
織プラスミノゲン活性化剤およびフィブロネクチン中に
また存在するこのようなりリンゲル構造は、これらの蛋
白質の生物学的機濠の調節にとって必須の配位子−の結
合に参加すると想像される。エステラーゼによりプラス
ミノゲンから切離された精製されたプラスミノゲンクリ
ングルは、フィブリン、ＰＢα２ＰＩおよびヒスチジン
に富んだ糖蛋白質に結合することがわかった。生ずる複
合体のすべてはリジンの存在下に解離する。テトラネク
チンはプラスミノゲン分子のクリングル４の部分に結合
するが、プラスミノダン中の最初の３つのクリングル構
造またはミニプラスミノゲンに結合しない、こうして、
それはクリングル１〜３に結合する能力をもたず、クリ
ングル４に特）４的に結合する記載された最初の化合物
であると思われる。クリングル１〜３に結合するヒスチ
ジンに富んだ糖蛋白質およびα２ＰＩはクリングル４に
結合しない。

これらの結果が示唆するように、プラスミノゲンの最初
の４つのクリングルはすべてリジンに結合するが、それ
らは異なる配位子の特異性を有する。α２ＰＩ調製物中
に汚染物質として存在するテトラネクチンはゲル濾過に
よりそれから除去することができない、これは後述する
ウルトロゲル（Ｕｌｔ　ｒｏｇｅｌ）ＡＣＡ３４を使用
するゲル濾過実験により容易に説明される。テトラネク
チンについて推定されるｓａ、ｏｏｏの分子質量はα２
ＰＩのそれ（６７，０００）に非常に近接し、そしてこ
れはゲル濾過により２種類の蛋白質の分離が不可能であ
る理由を説明する。この結果示すように、テトラネクチ
ンはテトラマーであり、これはＳＤＳ　（１％）および
グアニジン塩酸塩６Ｍの中で解離する。

精製されたテトラネクチンはＣａ”およびヘパリンに結
合する。

ヒスチジンに富んだ糖蛋白質は、プラスミノゲンのクリ
ングル１〜３に特異的に結合し、またヘパリンに結合す
る。この結合はＣａ″″１依存性であり、そしてＥＤＴ
Ａにより壊滅される。このようなＣａ＋“依存性のクリ
ングル４とテトラネクチンとの間の相互作用についての
支持は存在しない、ヘパリンのカラムからテトラネクチ
ンを溶離するために必要な高いＮａＣ１の濃度は、蛋白
質の等電点およびヘパリンカラム中の実験条件（ｐＨ７
，４）に比較すると、テトラネクチンのヘパリンへの結
合が、抗トロンビン■におけるように、その分子の特定
のヘパリン結合部位を含みうることを示すであろう。

Ｃａ＋“、ＥＤＴＡまたはヘパリンの存在は、蛋白質の
正味の電荷に影響を及ぼすばかりでなく、かつまたその
抗原性に影響を及ぼす。ＥＤＴＡの存在下に得られる結
果と比較して、Ｃａ”の存在下に電気免疫アッセイによ
り得られる非常に小さい沈殿は、その分子の全体のコン
フォメーションの変化を示すであろう。その理由で。

血漿または血清の定量的電気免疫アッセイは、Ｃａ＋１
の不存在丁で実施するとき、不Ｏｆ詣である。血漿また
は血清の電気免疫アッセイへのＣａ”＋およびＥＤＴＡ
の影響は、血漿または血清の中の他の成分への結合にま
ったく関係がない。精製されたテトラネクチンを適用す
るとき、同一の結果が得られる。この蛋白質のテトラマ
ーの形態はＣａ”″の配位の結果ではない、なぜなら、
ゲル濾過実験におけるこの蛋白質の溶離プロフィルはＣ
ａ“１またはＥＤＴＡの存在に依存しないからである０
強い洗浄剤のみがこのテトラマーを七ツマ−に解離する
ことができるだけである。また、Ｋ４またはプラスミノ
ゲンへのテトラネクチンの結合のために、Ｃａ”の存在
は必要ではない。

テトラネクチンの全体の構造は推定された。それは４つ
のポリペプチド鎖からなり、その構造は添付図面に示さ
れており、ここで個々のアミノ酸残基は次のコードで示
されている： Ａ　アラニン Ｂ　アスパラギン酸 Ｅ　グルタミン酸 Ｆ　フェニルアラニン Ｇ　グリシン Ｈヒスチジン ■　インロイシン Ｋ　リジン Ｌ　ロイシン Ｍ　メチオニン Ｎ　アスパラギン Ｐ　プロリン Ｑ　グルタミン Ｒアルギニン Ｓ　セリン Ｔ　スレオニン Ｖ　バリン Ｗ　トリプトファン Ｙ　チロシン Ｎ−末端アミノ酸配列はＮ−ｇｌｕ−ｐｒｏ−ｐｒｏ−
ｔｈｒ−ｇｔｕである。４つのペプチドの各々は１８１
アミノ酸を含有し、３つのジサルファイド架橋が各鎖中
に存在し、そして鉛量には存在しない、各類は２０２０
０であると推定される。この蛋白質は炭水化物を含有し
ない、肝臓からのヒト、ラットおよびニワトリのアシア
ロ（ａｓ　ｉ　ａ　ｌ　ｏ）−糖蛋白質受容体との相同
性は発見されなかった。これにより示されるように、こ
の蛋白質はレクチン類の族に属し、そしてその理由で、
可溶性の受容体蛋白質であろう、レクチン類は蛋白質で
あり、しばしば糖蛋白質であり、炭水化物の構造に結合
する。これと一致して、テトラネクチンは、交差免疫電
気泳動により評価するとき、ヘパリンおよびコンドロイ
チン硫酸酸塩Ａ、ＢおよびＣへ結合する。また、レクチ
ン類の族と一致して、テトラネクチンは二価の金属イオ
ンと結合し、そしてポリマーの構造を形成する。さらに
、テトラネクチンは、レフトン類のように、多分エスト
ロゲン依存性の細胞増殖のためのミトゲンであろう。避
妊薬を経口的に投与された受精能力のある女性は、また
後期の妊娠の場合におけるように、テトラネクチンの血
漿水準を高度に優位に減少させた。

要約すると、テトラネクチンと呼ぶ、本発明の新規な蛋
白質は次の通りである： テトラネクチンは４つのペプチド鎖からなるテトラマー
の蛋白質であり、各々はドデシル硫酸ナトリウムの存在
下のポリアクリルアミドの電気泳動において約１７，０
００ｎｏ分子質賛を有し。

そして約２０，０００の計算した分子質量を有する。

テトラマーの見掛けの分子質量は、ウルトロゲル（Ｕｌ
　ｔ　ｒｏｇｅ　１）ＡＣＡ３４のゲルクロマトグラフ
ィーにより決定して、約６８，０００でありニアミノ酸
分析に基づいて、分子賀ｆｆｆ＝は約８ｏ　、ｏｏｏで
あると計算される。

Ｎ−末端アミノ酸配列はＮ−ｇｌｕ−ｐｒｏ−ｐｒｏ−
ｔｈｒ−ｇｌｕである。

このテトラマーはγ−カルボキシグルタミン酸残ノＳを
含有しない。

それは水酸化アルミニウムまたは硫酸バリウムに吸着せ
ず、これによりそれはビタミン−に依存性蛋白質でにこ
とが示される。

テトラネクチンは糖残基を含有せず、そして糖蛋白質で
はない、これはコンカナバリンＡへの結合の不存在およ
びＰＡＳ試薬との色反応性の不存在から明らかである。

テトラネクチンは二価のカチオン、例えば、カルシウム
、ニッケル、コバルトおよびマンガンと結合し、そして
これより低い程度に、亜鉛およびマンガンと結合する。

テトラネクチンはヘパリンへ結合する。結合は遊離カル
シウムイオンの不存在下のみならず、かつまた存在下に
結合する。全血漿中のテトラネクチンの交差免疫電気泳
動は、テトラネクチンのβ−移動性がヘパリンの存在下
にα−移動性となることを示す、鋭い単一のピークが現
われ、これは結合が強くかつ特異的であることを示唆す
る。これは非常に広いピークを示しかつ弱い結合を示唆
するコンドロイチン硫酸塩を使用する結果と対照的であ
る。

フィブロネクチンはフィブリンに結合する。面朶が凝固
するとき、テトラネクチンの約１５〜２０％は液体から
消失する。さらに、テトラネクチンはフィブリンｈに検
出することができる。遊離カルシウムイオンが存在する
ときにのみ、フィブリンへの結合は有意である。フィブ
リンへの結合は凝固因子Ｘ■の活性に対してして独立で
あり、モしてＥＡＣＡによりあるいはｔ−１’Ａ５度の
変化により影響を受けることができない、フィブリンへ
の結合はテトラネクチンの血漿レベルに対してして比例
する。

′：ｆ＝重点電気泳動により決定したテトラネクチンの
等電点は、遊離カルシウムイオンの不存在下に５．８で
あり、そしてその存在ドに７．８である。

１％のアガロースおよびｐＨ８，６におけるテトラネク
チンの電気泳動の移動度は、カルシウムイオンの存在下
に血漿β−２−グロブリンのそれと同一であり、そして
カルシウムイオンの不存在下に血漿α−グロブリンのそ
れと同一である。ヘパリンの存在下に、移動度は両者の
場合においてα−グロブリンのそれと同一である。

本発明は、前述の性質を有するテトラネクチンに関する
０本発明は、また、テトラネクチンを調製する方法に関
する。第１に、テトラネクチンは哺乳類１例えば、ヒト
またはウシの血液または分画から、その蛋白質の性質の
１つまたは２つ以りに適合する通常の蛋白質精製技術に
より得ることができる。

テトラネクチンの実際の源はヒト血漿であるが、コーン
フラクション■および低温沈殿物欠乏血１３７（ｃｒｙ
ｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ　　ｄｅｐｌｅｔｅｄ　　ｐ
ｌａｓｍａ）も適する。また、この蛋白質を血小板から
単離することが可能である。血小板および肝臓、乳房お
よび子宮の組織切片の中のテトラネクチンの存在は、な
かでも、これらの組織または前駆体細胞が組み換えＤＮ
Ａ技術だめのＲＮＡ源であることを示す。

本発明は、細胞培養により、あるいは組み換えＤＮＡ技
術により修飾された微生物または他の宿主により生産さ
れるテトラネクチンを包含する。

テトラネクチンの精製は、プラスミノゲンの結合したク
リングル４を使用するカラム、抗テトラネクチン抗体カ
ラムまたはヘパリンカラムの親和クロマトグラフィーに
より実施することができる。不純の抗プラスミンをテト
ラネクチン源として使用すると、クリングル４カラムを
酋尾よ〈使用することができるが、抗プラスミンは、ま
た、クリングルｌ〜３カラムへの吸着、およびこの方ラ
ムを通過させる溶離液からのテトラネクチンの単離によ
り除去することができる。

同一方法で、ウシテトラネクチンは１例えば、ウシ血漿
からクリングル４カラムの使用により単離することがで
きる。

それ以Ｅのｍ＃および精製の方法は実施例に説明されて
いる。

本発明は、また、テトラネクチンに対する抗血清および
抗体に関する。抗血清は動物をテトラネクチンで免疫化
し、そして血清をｃｍすることによって調製することが
できる。単一特異的（ｍ。

ｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗血清は免疫化したウサギから
得た。抗血清は交差免疫電気泳動において弔−のピーク
を示した。テトラネクチンに対するモノクローナル抗体
を生産するハイプリドーマ細胞系統は同様によ〈構成さ
れた。

ウシテトラネクチンはヒトテトラネクチンに対する抗血
清と交差反応する。

さらに、本発明は、テトラネクチンに対する抗体を使用
する検出およびアッセイの方法に関する。既知の任意の
免疫学的方法を適用することができる。例えば、テウレ
ル（Ｌａｕ　ｒｅ　Ｉ　ｌ）の電気泳動法またはサンド
イッチＥＬＩＳＡ技術をテトラネクチンの定量的アッセ
イに使用することができる。この方法は遊離カルシウム
イオンの不存イＩＦに実施すべきである。遊離のカルシ
ウムイオンはキレート化剤、例えばＥＤＴＡの添加によ
り錯化することがある。

テトラネクチンはヒト血禁中に０．２ｇモル（１５ｍｇ
／ｌ）の平均濃度で存在する。この平均（１００％）は
正常の廿康なボランティアにおいて決定した。テトラネ
クチンの濃度はその日の量変化しない（０９００〜１５
００時間）。２０人の男性において１０３±２０％（標
準偏差）および３８人の女性において１１１±１３％の
平均濃度が発見され、最低値は７１％であり、そして最
高ｆ１は１７１％であった。

急性ではない肝硬変症の患者において、テトラネクチン
の血漿レベルは有意に８３±２８（ＳＤ）％（ｎ＝２８
）に減少し、最低レベルは研究したグループにおいて２
６％であった。これは肝臓が合成部位であることを示唆
し、免疫組織化学の研究と一致する。使用する免疫組織
化学の方法は、ホルムアルデヒド固定しかつトリプシン
処理した組織についての間接のイムノペルオオキシター
ゼの技術である。使用する抗体は、テトラネクチン−カ
ラムの親和精製した、ウサギ抗ヒトテトラネクチンであ
った。抗体−抗体複合体は、ペルオキシダーゼと接合し
たブタ抗ウサギＩｇＧにより検出した。ペルオキシダー
ゼのための基質は、過酸化水素を含むジメチルホルムア
ミド中の３−アミノ−９−エチルカルバゾール テトラネクチンカラムへ吸着しないＩｇＧ分画で着色す
る対照は絶えず陰性であった．Ｌの方法により、テトラ
ネクチンは肝臓組織（肝臓細胞）、ｆ−宮内膜および正
常の乳房および乳癌の腺組織（脈管または接続組織では
ない）の中に検出された。結果は腎臓、牌臓、胃腸管、
前立腺，皮膚、腺甲状腺、心臓および肺において陰性で
あった。

沈殿させ，洗浄した血小板のトリトンの抽出液中に、２
３±８％（標準偏差）（ｎ＝３）（正常な血醤に関して
１％）のテトラネクチンが発見された．トロンビンで処
理後、９±０．６％（ｎ＝３）が残り、これにより凝固
過程において発生したトロンビンはテトラネクチンを血
小板から開放できることを示す．このことが意味するよ
うに。

凝固の間、血小板は約１５％の追加のテトラネクチンを
血液濃度に添加することができる。

テトラネクチンは＋ｈ血機構の種々の成分，例えば、プ
ラスミノゲン、フィブリン、ヘパリン、血小板へ結合す
る接着因子である．最も起こうる１要な結合は、プラス
ミノゲンのクリングル４との結合である。

テトラネクチンはプラスミノゲンの活性化を刺激しかつ
制御し、その結果ことに血小板の存在下にかつ血液から
の複雑なブイプリンの凝固物の存在下に、凝血の溶解ま
たは繊維素溶解の速度を高める。

第２に、テトラネクチンは，フィブリンの不存在下であ
るが、コファクター、例えば、ポリリジンの存在下にプ
ラスミノゲンの活性化を刺激しかつ制御する。このフィ
ブリン依存性のプラスミノゲンの活性化は組織の成長お
よび修復の過程において１つの役割を演する。

テトラネクチンのフィブリンへの結合は過剰のヘパリン
により混乱されず、そしてフィブリンへの結合はプラス
ミノゲンへの結合により影響を受けないことが発見され
た。フィブリン−テトラネクチン複合体へのプラスミノ
ゲンの添加は影響されず、そしてプラスミノゲンーテト
ラネクチンの結合を破壊するＥＡＣＡの添加はテトラネ
クチン−フィブリン複合体へ影響を及ぼさなかった。

ヘパリンへの結合はプラスミノゲンへの結合と置換され
ないかあるいは容易には置換されない。

カルシウム含有培地中の交差免疫電気泳動において、プ
ラスミノゲンはヘパリン誘導移動性の変化を消去できな
かった。

これらの結果が示唆するように、テトラネクチンのテト
ラマーの構造は、ヘパリン、フィブリンおよびテトラネ
クチンの異なるド位中位（ｓｕｂ−ｕｎｉｔ）へのいく
つかの同時の結合を可能とするであろう。これはテトラ
ネクチンの接着機ｆＥを説明するであろう。

テトラネクチン血漿濃度は、種々の損傷、例えば、外科
手術、心筋梗塞および癌の後、有、αに減少するように
見える。この挙動は陰性の急性期の反応体（ｎｅｇａｔ
ｉｖｅ　　ａｃｕｔｅ　　ｐｈａｓｅ　　ｒｅａｃｔａ
ｎｔ）のそれに類似する。この作用は比較的長く続き、
そして血漿濃度は損傷の存在またはそれからの回復の１
つの指示である。主要な腹の外科手術を実施した２４人
の患者のグループにおいて、テトラネクチンのレベルは
減少し、手術後さらに減少した。手術後に深部の静脈の
血栓を発生した９人の患者において、手術後第１日のテ
トラネクチン濃度は血栓をもたない１４人の患者（平均
６０％）（ｐ　　０．０５）におけるよりも有意に低か
った（モ均４８％）。

凝血溶解へのその同時の活性をかんがみて、テトラネク
チンは止血の調節の因子として使用することができる。

それぞれテトラネクチンまたはテトラネクチン阻害剤、
例えば、抗テトラネクチン抗体の投与によるテトラネク
チンの血液レベルの増加または減少は、また、新形成の
処置において価値をもつことがある。

したがって、本発明は、また、活性成分としてテトラネ
クチンを含有する製薬学的組成物に関する。さらに、本
発明はテトラネクチンに対する抗体を含有する製薬学的
組成物に関する。

次に実施例により１本発明を説明する。実施例において
使用した物質および方法は次の通りである。

緩衝液および化学物 トリス（Ｔｒｉｓ）：ＮａＯＨ，Ｉ＝０．１５ンル／ｌ
でｐＨ７，７０（２０℃）に調節した、０．０５モルの
トリス／ＨＣＩ　　０．１０モルのＮａＣ１，リン酸ナ
トリウム０．０４％ル　ｐＨ７、４，硫酸アンモニウム
はメルク（Ｍｅｒｋ）（西ドイツ、ダーマシュタット）
から入手した。

トランキサム酸（ｔ　ｒａｎｅｘａｍｉ　ｃ　　ａｃｉ
ｄ）およびＤ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｎａｎ（Ｓ　
　２２５１）はカビ（Ｋａｂｉ）（スウェーデン、スト
ックホルム）から入「した。凍結乾爆したアンモニウム
ヘパリン（１５０，０００Ｕ／ｍｇ）はレオ・ファーマ
シュー゛ティカルス（Ｌｅｏ　　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
　１ｃａｌｓ）（デンマーク、コペンハーゲン）から人
りした。

７カロース（Ａｇａｒｏｓｅ）Ａ３７　［インズビオー
ス（Ｉｎｄｕｂｉｏｓｅ＠）、ＥＥＯ＝％０．１７］は
ル°インダスリース・バイオロジーク（Ｌ’Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉｅｓ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅ）（７ランス）、
ウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅ　１）ＡＣＡ３４および
４４はＬＫＢ　（スウェーデン）から入手した。セファ
ロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ臭化シアン活性化、
ヘパリン−セファロース・エン・ＤＥＡＥ−セファロー
スＣＬ−６Ｂはファーマシア（スウェーデン）から人ト
した。

笠皇二 新鮮な血漿または古い血漿は供与体の血液から得た（ク
エン酸ナトリウム、０．０７３モル、クエ７１％Ｆ、０
．０３８モル：およびグルコース、０．１２４モルを含
有する溶液の０．１３容量で安定化された）。

プラスミノゲンは、バイオヒミカ・エト・パイオフィジ
カ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔ
ａ）６旦港、３７７−３８７　（１９８１）に記載され
るようにリジン−セファロースの親和クロマトグラフィ
ーにより調製した。ＧＩｕｌ−プラスミノゲンおよびＬ
ｙｓ７フーブラスミノゲンは同一文献に記載されている
ようにして調製した。

プラスミノゲンーセファロースは、クリステンセン（Ｃ
ｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）、Ｕ、およびクレメｙセｙ（Ｃ
ｌｅｍｍｅｎｓｅｎ）、１．（１９７８）、バイオケミ
カル・ジャーナル（Ｂ　ｉ　。

ｃｈｅｍ、Ｊ、）１７５，６３５−６４１に記載される
ようにして、３０μモルのプラスミノゲンを６０ｇのＣ
ＮＢｒ−活性化セフ７０−スへ結合することによって調
製した。

プラスミ７ゲンのＮ−末端部分からのクリング仁ハケミ
カル・フィブリツリシス争アンド・トロンポリシス（ｐ
ｒｏｇｒｅｓｓ　　ｉｎ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　　Ｆ
ｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　　　ａｎｄＴｈｒｏｍｂｏｌ
ｙｓｉｓ）　　［デイビドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）、
Ｊ、Ｆ、、ロウ７ｙ（Ｒｏｗａｎ）、Ｒ，Ｍ、、サマナ
（Ｓａｍａｎａ）１Ｍ、Ｍ、およびデスノイアーズ（Ｄ
ｅｓｎｏｙｅｒｓ）、Ｐ、Ｃ，！Ｑｌ　ｖｏｌ、３．１
９１−２０９ページ、レイベン・プレス（ＲａｖｅｎＰ
ｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９７８）に記載されるよ
うに、プラスミノゲンを膵臓エステラーゼで消化するこ
とによって実施した。

１０ルモルのＫ　　ｌ＋２＋３および８ルモルのに４を
、それぞれ２０ｇおよび１５ｇのセファロースに結合し
た。

すべての親和クロマトグラフィーの実験は、リン酸ナト
リウム緩衝液０．０４モル　ｐＨ７，４中で実施し−そ
して溶離はトランキサム酸１ミリモルを使用して実施し
た。

ン）から人手した。ウシ血清トロンビンはノボ（Ｎ　ｏ
　ｖ　ｏ）　　（デフマーク）から入手した。ウロキナ
ーゼはレオ・７アーマシユーテイカルス（Ｌｅｏ　　Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔ　ｔｃａｌｓ）（デフマーク）から
の試薬調製物であった。ヒト黒腫細胞プラスミノゲンは
、ジャーナル争オブ・バイオロジカルｅケミストリー（
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２５６．７０３５−７０４
１　（１９８１）に記載されるようにして精製した。α
２プラスミノゲン阻害剤、プラスミノゲン、フィブリノ
ゲンおよびＩｇＧに対する免疲久二ノ旦Ｚは、すべてダ
コパット（Ｄａｋｏｐａｔｔ）（デフ　−７−り）から
のものであった。

蛋白質Ｃ度の決定 プラスミノゲンＫ　　ｌ＋２＋３、Ｋ４およびα２ＰＩ
のＣ度は分光高度測定により決定した［スロンポシス吻
リサーチ（Ｔｈ　ｒ　ｏｍｂ　、　Ｒｅｓ　、）２１．
６５−７１　（１９８１）およびプログレス・イン・ケ
ミカル・フィブリツリシス・アンド番トロンポリシス（
ｐｒｏｇｒｅｓｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｃａｌ　　Ｆｉｂ
ｒｉｎｏｌｙｓｉｓａｎｄ　　Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉ
ｓ）［デイビドンン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）、Ｊ、Ｆ、、
ロウ７７　（Ｒｏｗａｎ）、Ｒ，Ｍ、、サマナ（Ｓａｍ
ａｎａ）１Ｍ、Ｍ、およびデスノイアーズ（Ｄｅｓｎｏ
ｙｅｒｓ）、Ｐ、Ｃ，編］ｖｏ１．３．１９１−２０９
ページ、レイベン・ブレス（ＲａＹｅｎ　　Ｐｒｅｓｓ
）、＝、−３−り（１９７８）］。ウロキナーゼ１モル
＝５．６Ｘ１０１２プロウグ（Ｐｌｏｕｇ）単位［バイ
オヒミカ拳エトーバイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）５旦！、１７７−１８３（
１９７９）は、その質量濃度および分子質Ｈ＝−’ｏ、
ｏｏｏを使用して黒腫細胞活性化剤のモル濃度を計算す
るために使用した［ジャーナル９オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉ　ｏ　ｌ　、Ｃｈｅｍ、）２
旦！、７０３５−７０４１（１９８１）］。

蛋白質の濃度は、また、ロウレイ（Ｌ　ｏ　ｗ　ｒｙ）
ら［ジャーナル働オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）１９３．２６５−２７５
　（１９５１）］の方法のワンプ（Ｗａｎｇ）およびス
ミス（Ｓｍｉｔｈ）［アナリティカル・バイオケミスト
リー（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）６３．４１４−４１７　（１９７５
）］による修正法によって、参照物質としてアルブミン
を使用しそしてラウリル（Ｌａｕｒｅｌｌ）［スカンジ
ナビアン・ジャーナル・オブ・クリニカル」アンド・ラ
ボラトリ−Ｏインベスチゲイシ、ン（Ｓｃａｎｄ、Ｊ、
Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、）２９，５ｕｐｐ１
．１２４．２１−３７　（１９７２）］に記載される電
気免疫アッセイにより決定した。

ＳＤＳ中のポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ＳＯ３
−ＰＡＧＥ）は、ザ・プロテインズ（Ｔｈｅ　　ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ）［ネウラス（Ｎｅｕｒａｔｈ）、Ｈ，およ
びヒル（Ｈｉ　Ｉ　１）　、　Ｒ。

Ｌ０編］、Ｖｏｌ、１．１７９−２２３ページ、アカデ
ミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ）、
ロンドン（１９７５）に記載されるているようにして実
施した０分子質量の決定は、ファーマシア（Ｐｈａｒｍ
ａ、ｃｉａ）からの参照蛋白質［ＬＭＷカリブレイショ
ン・キット・プロテインズ（Ｃ１ｉｂｒａｔｉｏｎ　　
ｋｉｔ　　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）］・を使用して実施した
。

蛋白質の限外濾過は、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）１５９，５４５−５５３　（１９
７６）に記載されるようにして実施した。

α２ＰＩの精製は、ユーロピアン・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）
１２０，１０５−１１２　（１９８１）に記載される２
つの異なる方法により、血漿または低温沈殿物欠乏血漿
を使用して実施した。

簡単に述べると、この方法は次の１程からなる： リジン−セファロースの親和クロマトグラフィー、　　
（ＮＨａ　）　２　ＳＯａ　　（０、８−２、７モル）
による分画、プラスミノゲンーセファロースの親和クロ
マトグラフィー（方法Ａ）またはに１＋２＋３−セファ
ロースの親和クロマトグラフィー（方法Ｂ）、ＤＥＡＥ
　　ＣＬ　　６Ｂ、ｐＨのイオン交換クロマトグラフィ
ーおよびウルトロゲル（Ｕｌ　ｔ　ｒｏｇｅ　１）ＡＣ
Ａ３４のゲル濾過によるプラスミノゲンの除去。

これはカラム（５，３ｃｍ２Ｘ９０ｃｍ）中で実施し、
この方ラムはトリス−ＨＣｌ　　０．０５モル、ＮａＣ
１０，１モル　ｐＨ７，４（グアニジン塩酸塩６モルを
含むかあるいは含まない）で乎衡化しかつ溶離した。適
用した試料は、方法により精製され、同一緩衝液中に溶
解した３０すノモルのＰＢα２ＰＩを含有した。溶離後
、蛋白質を２８０ｎｍにおける吸収の測定により推定し
た。溶離した蛋白質のピークをプールし、そして限外濾
過により濃縮し［アミコン（Ａｍｉｃ。

ｎ）、米国Ｊそレ−Ｃ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ドデシル硫
酸ナトリウム　ポリアクリルアミドゲルの電気泳動）に
適用した。

ウルトロゲルＡＣＡ３４のゲルｉＩ！過　　これはカラ
ム（５，３ｃｍ２Ｘ９０ｃｍ）を使用して実施し、この
カラムはＣａＣｌ２　２ミリモルまたはＥＤＴＡ　　２
ミリモルを含むか、あるいは含まないトリス緩衝液で平
衡化しかつ充填した。この方ラムは異なるマーカー蛋白
質の使用により目盛定めした。

等重点電気泳動は、マルチフォア（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ
）システム２１１７　［ＬＫＢ、プロダクツ（ｐｒｏｄ
ｕｃｔ　５）ＡＢ、スウェーデン、ブロンマ］において
、一定の電力供給ｌ５ＣＯ４９０型、ポリアクリルアミ
ド勾配ゲル（ｐＨ３、５−９，５）、　　アノードおよ
びカソードの゛、耽極溶液、試料適用片および電極フォ
ーカシング（ｆ。

ｃｕｓｉｎｇ）Ｃインストロメンティジョン・スペシア
ルティーズ争カンパニー（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉ
ｏｎ　　５ｐｅｓｉａｌｔｉｅｓ　　Ｃｏｍｐａｎｙ）
、Ｌｉｎｃｏｌｎ　　Ｎｅｂ、、ＵＳＡＩを使用して実
施した。ストリップはＬＫＢプロダクツ（ｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ）から人手した。

予備電気泳動をｔ　、ｏｏｏｖで３０分間実施し、そし
て電気泳動を０．６ナノモルのに一４結合性蛋白質を適
用後ｉ、ｏｏｏｖにおいて２．５時間実施した。ＰＨ勾
配の目盛定めは、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
からの等電点電気泳動目盛室めキット（Ｉｓｏｅｌｅｃ
ｔｒｉｃ　　Ｆｏｃｕｓｉｎｇ　　Ｃａ１ｉｂｒａｔｉ
ｏｎ　　Ｋｉｔ）（ｐＨ３−１０）を使用して実施した
。

ヘパリン−セファロースの親和クロマトグラＺ工＝ これはカラム（１，７６ｍ’　Ｘ８ｃｍ）中に詰めたヘ
パリン−セファロース（）７−マシア）を使用して実施
し、この方ラムはチェレックス（Ｃｈｅ　ｔｅｘ）１０
０　［２００〜４００メツシュ、パイロラド（Ｂｉｏｒ
ａｄ）から人手した］を通過した水から調製したトリス
緩衝液で平衡化した。Ｃａ”＋の不存在下の親和クロマ
トグラフィー（実験Ａ）は、試料（ｌ　Ｏｍ　ｌのトリ
ス緩衝液中の２０ナノモルの精製したに一４結合性蛋白
質）を使用して実施し、この試料は２００容量のトリス
緩衝液、５ミリモルのＥＤＴＡに対しておよび再び２０
０容量のトリス緩衝液に対して一夜透析したものであっ
た。この方ラムを２０ｍ１のトリス緩衝液で洗浄し、そ
して蛋白質を３００ｍ１のトリス緩衝液と３００　ｍ　
ｌの１．０モルのＮａＣ１を含有するトリス緩衝液との
混合により形成した直線の塩の勾配で溶離した。

Ｃａ”の存在下の親和クロマトグラフィー（実験Ｂ）は
、トリス緩衝液および５ミリモルのＣａＣｌ２に対して
透析した試料を使用して実施した。実験Ａにおけるよう
に、この方ラムを洗浄し、そして蛋白質を溶離したが、
緩衝液はＥＤＴＡの代わりに５ミリモルのＣａＣｌ２を
含有した。

ルージャーナル（Ｂｆｏｃｈｅｍ、Ｊ、）２０旦、８３
７−６４６　（１９８３）に記載されているようにして
実施した。吸着後のト澄み液およびＥＤＴＡで溶離され
た蛋白質を、精製されたに一４結合性蛋白質に対してレ
イズ（ｒａｉｓｅａ）した抗体を使用する定量電気免疫
アッセイにかけた。

フィブリン凝固物の溶解アッセイ　これは記載されるよ
うにウコキナーゼおよび黒腫組織活性化剤を使用して実
施した［ヘモスタシス（Ｈａ　ｅ　ｍｏｓｔａｓｉｓ）
５．２１８−２３０　（１９７６）］。

ポリ−ローリジンの存在下の黒腫細胞組織活性止剤によ
り触奴されるプラスミノゲンの活性化これは記載されて
いるように［バイオケミカルΦジャーナル（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｊ、）２２５．１４９−１５８　（１９８５）］
］ポリーＤ−リジの存在下に、増加する量の精製された
蛋白質の存在下におよび不存在下に、プラスミンのため
の特定の色素原のペプチド基質を使用して実施した。

実施例Ｉ ＰＢα２ＰＩの精製 方法Ａおよび方法Ｂの両者により精製された阻害剤調製
物は１両者とも６７．０００の分子質量を示した。方法
Ａにより精製されたＰＢα２ＰＩ調製物は１分子質量が
１７．０００である追加の蛋白質の帯（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）が発見されたが、これに対して方法Ｂにより精製さ
れた阻害剤調製物中にはそれが存在しなかった。変性剤
の不存在下のゲル濾過により汚染蛋白質を除去する試み
は不成功に経った。セファデックスＧ７５スーパーフア
インのゲルｄｉｄにかけ、そしてトリス緩衝液で溶離し
たとき、蛋白質はＰＢα２ＰＩと一緒に溶離され、これ
に対してブアニジン塩酸１′１！６モルの存在ドの同一
のゲル纏過実験において２つの蛋白質が別々のピークと
して現われる。

実施例ＩＩ マドグラフィー Ａ、方法Ｂによるα２ＰＩの精製に使用する配位子は、
ミニプラスミノゲンおよびプラスミノゲンのクリングル
４部分が欠如することにより方法において使用したもの
と異なる。これは、方法Ａによる阻害剤調製物中に存在
する汚染蛋白質がプラスミノゲン配位子のクリングル４
部分に吸着されたことを示唆する。したがって、ある実
験を組み立て、ここで方法Ａにより得られたａｌｌ害剤
の５０ナノモルを含有する調製に４−セファロースの親
和クロマトグラフィーに適用した。阻害剤は空隙体積中
に現われ、これに対して同時に精製された蛋白質は保持
され、そして引続いてトランキサム酸１ミリモル／ｌで
カラムから溶離した。溶離液は、最も純粋な形態で５０
５−ＰＡＧＥにより１７．０００の分子質量を示す同時
に精製された成分を含有した。同時に精製された蛋白質
は、結合したミニプラスミノゲンを含むカラムへ結合し
なかった。

Ｂ、方法Ａにより得られた阻害剤調製物をに１＋２＋３
−セファロースのカラムへ適用すると、空隙体積中に分
子質量１７，０００の蛋白質が出現し、これに対して阻
害剤はカラムに保持され、そしてトランキサム酸１ミリ
モル／ｌで溶離することができなかった。

実施例■ に４結合性蛋白質のウルトロゲルＡＣＡ３４のゲ翌政過 実施例ＩＩＡに従って得られたに４結合性蛋白質の調製
物を目盛定めしたウルトロゲルＡＣＡ３４へ適用すると
、蛋白質はアルブミンのちょうど前面で溶離され、約７
０．０００の分子？［ｔを示唆した（５回の異なる実験
）、これはグアニジン塩酸塩の不存在下のセファデック
スＧ７５のゲル濾過実験に従うが、５ＤＳ−ＰＡＧＥに
より得られた約１７．０００の分子質量と明らかに矛盾
する。この不一致は、Ｋ４結合性蛋白質がＳＯＳにより
解離されるオリゴマー（テトラマー）の蛋白質として存
在すると仮定すると、説明することができる。グアニジ
ン塩酸塩の存在下に実施したゲル濾過は、また、この過
程を支持する。

血漿（４ｍｌ）または血清を、また、目盛定めしたウル
トロゲルのカラムに適用し、そして溶離のプロフィルを
α２ＰＩおよびに４結合性蛋白質のＩ［気免疫アッセイ
により監視した。同時に精製されたに４結合性蛋白質を
含有するα２ＰＩの調製物を用いて得られた結果に従う
と、２種類の蛋白質の両者は約７０．０００の分子質量
をもつ蛋白質として溶離される。

実施例■ 血漿からのに４結合性蛋白質の精製 血漿中のに４結合性蛋白質を精製する方法を開発した。

この蛋白質は、クエン酸バリウム沈殿後のＦＫｌみ液中
に発見された。プラスミノゲンを１リツトルの血漿から
りジン−セファロースの親和クロマトグラフィーにより
除去し、そしてプラスミノゲン欠乏血葉からの蛋白質の
（ＮＨａ　）　２　Ｓ０２沈殿のための最適条件を決定
し、モしてα２ＰＩ精製において使用したもの（０，８
モル〜２．７モル）と同様であることがわかった。　　
（ＮＨａ）２ｓＯａ　　（２，７モル）の添加後書られ
る沈殿をリン酸ナトリウム緩衝液０．０４モル、ｐＨ７
，４中に溶解し、そして同一緩衝液に対して一夜透析し
た。透析した血漿を、Ｋ４−セファロースを詰めたカラ
ム（５，２ｃｍ２ＸｌＯｃｍ）に適用した。この方ラム
をリン酸塩緩衝液で、２８０ｎｍにおける吸収が０．０
５０以下となるまで、パーコレーションした。蛋白質を
同一緩衝液中のトランキサム酸１ミリモルで溶離した。

蛋白質の溶離を電気免疫アッセイにより追跡し、そして
分画をプールし、そしてリン酸ナトリウム緩衝液０．０
４モル　ＰＨ７，４で平衡化したＤＥＡＥ　　ＣＬ６Ｂ
−セファロースのカラム（５，２ｃｍ２ＸｌＯｃｍ）に
適用した。溶離は３００　ｍ　ｌの平衡化緩衝液とＮａ
Ｃ１Ｏ，３モルを添加した３００ｍ１の平衡化緩衝液と
の直線の勾配で溶離した。に４結合性蛋白質を含有する
溶離分画を５ｍｌに濃縮し、そしてトリス緩衝液中のウ
ルトロゲルＡＣＡ３４を充填したカラム（５，２ｃｍ２
Ｘ１０ｃｍ）　へ適用した。再び、蛋白質の溶離を電気
免疫アッセイにより追跡し、そして分画をプールし、そ
して５ｍｌにｃｉ縮した。精製された蛋白質の５ＡＳ−
ＰＡＧＥは分子ｆｉ量１７，０００の１つのみの帯を明
らかにした。２８０ｎｍにおける吸収の測定およびロウ
リイ（Ｌｏｗｒｙ）法により決定した蛋白質濃度に得ら
れた。

精製された蛋白質の調製物（０，２ｇ／ｌ）を定着的電
気免疫アッセイにおいて標準として使用して、血漿中の
濃度および異なる分画化工程における蛋白質の収率を決
定した。血漿中の濃度は約１５ｍｇ／ｌまたは０．２モ
ル／ｌであると推定された。

実施例Ｖ 交差免疫電気泳動 ｐＨ８，６における血漿（または血清）の交差免疫電気
泳動において、Ｋ４結合性蛋白質はβ−グロブリンのそ
れに類似する移動度を生ずる正味の電荷を有することが
わかった。精製されたに４結合性蛋白質は、また、β−
領域において見出された。精製されたに４結合性蛋白質
のｐＨ８、６における電気泳動の移動度は、′１ニ気泳
動の第１次元においてＥＤＴＡ　　２ミリモル／ｌによ
り高度に影響を受けた。この蛋白質の移動度はβ−グロ
ブリンからインター−α−グロブリンの移動度へ変化し
た。また、電気泳動の第１次元におけるＣａ”　（２ミ
リモル／ｌ）の存在は電気泳動の移動度を変化させた。

さらに、免疫沈殿の形状はＣａ十“により高度に影響を
受けるように見えた。Ｃａ＋１の存在は非常に小さい沈
殿のピークを生じたが、ＥＤＴＡの存在は高い沈殿のピ
ークを生じた。ヘパリンの存在（ゲルおよびゲル緩衝液
中において５Ｘ１０’単位／ｌ）は、また、Ｋ４結合性
蛋白質の電気泳動の移動度を増加させた。電気泳動の移
動度および沈殿の形状は、電気泳動の間にＥＤＴＡが存
在したときに得られた結果とほぼ同一であった。Ｃａ”
、ＥＤＴＡおよびヘパリンのに４結合性蛋白質の電気泳
動の移動度への同様な影響は、また、血漿を使用した時
に見られた。

実施例■ ラウリル（Ｌａｕｒｅｌｌ）に従う電気免疫アッ丸４ ０ケツト（ｒｏｃｋｅｔ）免疫電気泳動は、また、Ｃａ
＋１、ＥＤＴＡおよびヘパリンの不存在または存在によ
り影響を受けた。

ゲルおよび緩衝液中のＣａ”　（２ミリモル）の存在は
、血漿および血清を適用したとき、免疫沈殿の形成をほ
ぼ防止し、これに対してＥＤＴＡ２ミリモルをゲルおよ
び緩衝液に適用すると正常なロケットが生ずる。

実施例■ ヘパリン−セファ０−スへの会合 に４結合性蛋白質は、Ｃａ＋“の不存在ならびに存在の
両者において、ヘパリン−セファロースにより保持され
た。ＥＤＴＡ　　５ミリモルを実験Ｂ（Ｃａ＋１の存在
下）に添加すると、ヘパリンのカラムからに４結合性蛋
白質を開放しなかった。これはＥＤＴＡおよびヘパリン
かに４結合性蛋白質中でＣａ”について競争しないこと
を示す。これはに４結合性蛋白質へのヘパリンの結合Ｃ
ａ＋１を含まないことを示すであろう。両者の実験にお
いて、Ｋ４結合性蛋白質は０．３〜０゜４５モルのＮａ
Ｃ１の添加によりカラムから開Ｍされた。

実施例■ 等′重点電気泳動およびＮ−末端アミノ酸等重点電気泳
動による等重点は５．８であることがわかった。最初の
５つのＮ−末端アミノ酸ハＮ−ｇｌｕ−ｐｒｏ−ｐｒｏ
−ｔ　ｈｒ−ｇｌｕであることがわかった。

実施例■ フィブリン凝固物の溶解（ｌｙｓｉｓ）アッセイ プラスミノゲンおよびウロキナーゼをまた含有する精製
されたフィブリンを有するフィブリン凝固物系に、０．
１〜２．０ｕＬモル／１（最終濃度）の種々な量のに４
結合性蛋白質を添加すると、Ｋ４結合性蛋白質の不存在
下に得られた溶解時間に比較して、凝固物の溶解時間に
影響を及ぼさなかった。同一の事実は、黒腫細胞プラス
ミノゲン活性止剤（ｔ−ＰＡ）を用いる同様な実験に適
用される。

これと対照的に、黒腫細胞プラスミノゲン活性止剤およ
びトロンビンに富んだ全血の溶解は、精製されたに４結
合性蛋白質（テトラネクチン）の添加により加速され、
そしてウサギにおいて誘導したテトラネクチンの対する
抗血清から得られた精製された免疫グロブリンの添加に
より阻止された。

実施例Ｘ ポリーＤ−リジン刺激プラスミノゲン活性化の増漉 この実験は、ポリーＤ−リジンの存在下の１−Ｐａ触媒
Ｇｌｕ１−プラスミノゲン活性化へのに４結合性蛋白質
の作用を示す。この蛋白質の添加は、ポリーＤ−リジン
のみの存在下に得られた速度に関するプラスミンの発生
速度における増加を生じた。この速度は再びポリーＤ−
リジンの不存在下に得られた速度ようりも非常に高かっ
た。に４結合性蛋白賀により誘導される増加は、約０゜
２５ｐモルに１／２最大をもつ飽和曲線に従った。

【図面の簡単な説明】

添付図面は２本発明によるテトラネクチンと呼ぶ蛋白質
の４つのポリペプチド鎖からなる構造をに示す。 特許出願人　ネーデルランドセ・セントラレ番オルガニ
ザテイエ・フール・テゲパス トーナトウールペテンシャツペリー ク・オンデルツエク

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、添付図面に示された式を有する４つのポリペプチド
   鎖からなる構造を有するテトラネクチンと呼ぶ蛋白質。 ２、次の性質： ａ、ウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）ＡＣＡ３４のゲ
   ルクロマトグラフィーにより 決定して約６８，０００およびアミノ酸 組成から計算して約８０，８００の見掛 けの分子質量を有する、 ｂ、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下に、解離してＳＤ
   Ｓ−ＰＡＧＥにより約１７， ０００またはアミノ酸組成から計算して 約２０，２００の分子質量を有する蛋白 質の下位単位となる、 ｃ、Ｎ−末端配列がＮ−ｇｌｕ−ｐｒｏ−ｐｒｏ−ｔｈ
   ｒ−ｇｌｕである、 ｄ、プラスミノゲンのクリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）４
   に特異的に結合する、 ｅ、γ−カルボキシグルタミン酸残基を含有しない、 ｆ、糖残基を含有せずかつ糖蛋白質でな い、 ｇ、二価のカチオンと結合する、 ｈ、ヘパリンに結合しそして、カルシウムイオンの存在
   下に、フィブリンに結合す る、 の少なくとも１つの示すテトラネクチンと呼ぶ蛋白質。 ３、テトラネクチンを含有する流体、細胞または右機体
   を血液の蛋白質の単離について既知の方法に付し、前記
   方法はテトラネクチンの特定の性質に適合することを特
   徴とするテトラネクチンを調製する方法。 ４、血液または血液の分画を前記単離方法に付す特許請
   求の範囲第３項記載の方法。 ５、前記単離方法はクリングル４、ヘパリンまたは抗テ
   トラネクチン抗体のカラムの親和クロマトグラフィーで
   ある特許請求の範囲第３または４項記載の方法。 ６、テトラネクチンに対する抗血清および精製された、
   モノクローナル抗体を包含する、抗体。 ７、テトラネクチンに対する抗血清または抗体を免疫学
   的試薬として使用するテトラネクチンを免疫学的に検出
   およびアッセイする方法。 ８、テトラネクチンまたはテトラネクチンに対する抗体
   を含有する製薬学的組成物。