CN102680463B - 一种改进的茚三酮对固相多肽合成的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的一种改进的茚三酮对固相多肽合成的检测方法，1）取茚三酮500mg，用12.5ml沸蒸馏水溶解，得黄色溶液；在搅拌下加入维生素C溶液，出现沉淀继续搅拌15min，移至冰箱中冷却到4℃，用纯净水洗涤2-3次，经真空干燥机处置，得还原型茚三酮；2）称取Rink_Amide_MBHA树脂2g，计算摩尔数，选用带Fmoc保护基的氨基酸，在含8%碳化二亚胺的氮甲基吡咯烷酮溶液作用下反应2小时，可以得到肽树脂，再经25%哌啶溶液处理30分钟，得去除保护基后的肽树脂；3）取去除保护基后的肽树脂5-10mg，用无水甲醇溶液15ml对其清洗3次，经真空干燥机处置；称取肽树脂2-5mg，加入300ulBufferA：和75ulBufferB，混和均匀，用100℃水浴加热15min，并置于15-20℃水中冷却至室温；加1.2ml的60%乙醇溶液，混合均匀后，测定吸光值并读取。

Description

一种改进的茚三酮对固相多肽合成的检测方法

技术领域

本发明涉及对茚三酮检测法的改进，既对固相合成中的多肽进行游离氨基的定量测定，与传统方法相比较，该判定结果直接反应可缩合的程度及产率。

背景技术

在多肽合成领域对肽树脂合成过程是否完全的判定，直接影响到合成产率的多少，常规方法是对缩合完成后的肽树脂直接进行检测，从而粗略的判定合成完成度。但由于合成中存在着一些可能会造成合成反应不能继续的情况，如：树脂和氨基酸的保护基去除不全，合成后为避免错误序列的出现而进行的加保护处理等，这些若使用常规方式都会被判定为合成完全，而实际操作中正是由于这种误判，造成了我们没能及时作出有效的不就措施，致使最终产品中的完整肽链数量相对减少。

文献检索披露：原茚三酮检测法是针对于多肽合成领域的缩合完整度的定性实验，主要靠缩合后的树脂与茚三酮试剂发生反应，通过颜色的变化来对缩合完成度进行判定。这种方法使用2种试剂，试剂A：取0.66mg/ml氰化钾水溶液2ml加入到98ml吡啶溶液中，再加入4g/ml苯酚乙醇溶液10ml，混匀；试剂B：称取500mg茚三酮溶于10ml无水乙醇中。进行合成完成度检测时，取缩合反应完成后的肽树脂3mg，使用无水乙醇清洗3次，真空干燥后，加入试剂A 0.15ml，试剂B 0.05ml，100℃加热10分钟，看颜色变化来判定缩合完成度，颜色如果为蓝色或绿色就判定为缩合不完全，显黄色判定为缩合完全。

本发明构思是对合成完成的肽树脂，先经去除保护基以后再进行检测，来确定可用来进行下一步缩合的-NH2数量，从而可以得到一个对合成产率比较精确的预估，而且进行了试剂配方的改进，在不需要添加氰化钾的情况下依旧可以保持颜色变化的稳定性，其应用价值在于：通过对合成产率的预估，尽早发现合成中可能出现的影响合成产率的因素。

发明内容

本发明的目的在于：改进的茚三酮对固相多肽合成检测法，替代了传统茚三酮检测法判定缩合完成度，结果即准确又便于操作。

本发明的目的是这样实现的：一种改进的茚三酮对固相多肽合成的检测方法，采用新的茚三酮法，对固相多肽合成的产率得到准确的判定，步骤如下：

其1试剂配制：

还原型茚三酮的配制：取茚三酮500mg，用12.5ml沸蒸馏水溶解，得黄色溶液；在搅拌下加入维生素C溶液，其中该溶液用500mg维生素C用25ml温蒸馏水溶解制得；出现沉淀继续搅拌15min，移至冰箱中冷却到4℃，取出过滤得沉淀物，将沉淀物用纯净水洗涤2-3次，经真空干燥机，在温度45℃，真空度93.3～98.6KPa下处置，置于五氧化二磷真空干燥器中保存；

Buffer A的配制：5ml吡啶+1.185g苯酚+5ml乙醇混匀；

Buffer B的配制：487.5mg茚三酮+12.5mg还原型茚三酮+10ml乙醇；

25%哌啶溶液的配制：25ml哌啶+75ml氮甲基吡咯烷酮混匀；

其2样品处理：

称取适量的Rink_Amide_MBHA树脂2g,并根据树脂摩尔数的计算公式算出所需的树脂摩尔数A，选用带Fmoc保护基的氨基酸，每种氨基酸取2A摩尔，使用1A摩尔的Rink_Amide_MBHA树脂与2A摩尔的带Fmoc保护基的氨基酸，在含8%碳化二亚胺的氮甲基吡咯烷酮溶液作用下反应2小时，可以得到肽树脂，再经25%哌啶溶液处理30分钟，其中每摩尔肽树脂加入25%的哌啶溶液26ml，得去除保护基后的肽树脂；

树脂摩尔数的计算公式：

式中：A为Rink_Amide_MBHA树脂的摩尔数；

m为Rink_Amide_MBHA树脂的克数；

SD为Rink_Amide_MBHA树脂取代量值；

其3检测步骤：

取去除保护基后的肽树脂5-10mg，使用无水甲醇溶液15ml对其清洗3次，经真空干燥机，在温度45℃，真空度93.3～98.6KPa下处置；称取肽树脂2-5mg，加入300ul Buffer A：和75ul Buffer B，混和均匀，用100℃水浴加热15min，并置于15-20℃水中冷却至室温；取75ul的反应后的混合液加入到1.2ml的60%乙醇溶液中，混和均匀后，测定吸光值并在OD570下进行吸光值读取。

本发明的构思及作用机理：相对于原茚三酮检测法对结果判定易受到脱除保护基不完全或误加保护基的影响，这两种情况都会造成检测结果的误判；改变原茚三酮检测法的试剂配方，使该方法不需要添加氰化钾，大大减少了对试验人员可能存在的健康威胁，改变取样时间，在下一步缩合前取样，使得实验可以预估出下一步可能得到的产物数量，避免了由于保护基的存在对结果造成的假阴性影响。机理：氨基酸与茚三酮水合物在弱酸条件下共同加热时，氨基酸被氧化脱氨、脱羧，而茚三酮水合物被还原，其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨基结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化合物，根据溶液中游离氨基的多寡，其颜色也会有深浅变化，可以通过分光光度计测量吸光值，根据吸光值的不同我们可以对反应中的氨基含量进行判定。本方法改进了茚三酮反应液的配方，对于固相合成过程中的氨基含量判定更为准确，并通过改变取样时间，避免了假阴性结果的出现，更加直观的反应出了合成的预期结果，彰显技术进步。

具体实施方式

本发明结合实施例作进一步阐明。

实施例

新的茚三酮法的实施步骤：

（一）反应试剂的制备：

1）配制还原型茚三酮：称取茚三酮500mg，用12.5ml沸蒸馏水溶解，得黄色溶液，将500mg维生素C用25ml温蒸馏水溶解，并将其加入到茚三酮溶液中，出现沉淀后继续搅拌15min，完成后移至冰箱中冷却到4℃，取出后经过滤得到的沉淀用水洗涤3次，经真空干燥机处置后（温度45℃，真空度98.6KPa），置五氧化二磷真空干燥器中保存；

Buffer A：5ml吡啶+1.185g苯酚+5ml乙醇混匀；

Buffer B：487.5mg茚三酮+12.5mg还原型茚三酮+10ml乙醇；

25%哌啶溶液：25ml哌啶溶液+75ml氮甲基吡咯烷酮混匀。

（二）样品处理：

1）称取Rink_Amide_MBHA树脂2g，并根据树脂摩尔数的计算公式（略）算出所需的树脂摩尔数A，选用带Fmoc保护基的氨基酸，每种氨基酸取2A摩尔，使用1A摩尔的Rink_Amide_MBHA树脂与2A摩尔的带Fmoc保护基的氨基酸，在含8%碳化二亚胺的氮甲基吡咯烷酮溶液作用下反应2小时，可以得到肽树脂，再经25%哌啶溶液处理30分钟，其中每摩尔肽树脂加入25%的哌啶溶液26ml，得去除保护基后的肽树脂；

2）对去保护后的肽树脂进行取样，并使用甲醇溶液对其进行清洗，经真空干燥机处置后（温度45℃，真空度98.6KPa），称取3mg的肽树脂；

3）加入Buffer A：300ul；Buffer B：75ul，混匀，100℃水浴加热15min，并用冷水冷却15min，之后取反应液75ul+1.2ml 60%的乙醇溶液；

4）测ABS前再加60%的乙醇溶液1.2ml混匀；

5）在OD570下进行吸光值读取。

（三）检测流程：

（1）称取适量的Rink_Amide_MBHA树脂,合成用氨基酸选用带Fmoc保护基的氨基酸，合成方法；

（2）将合成树脂等分成三份，其中一份按正常程序进行合成（称取适量的Rink_Amide_MBHA树脂2g,并根据树脂摩尔数的计算公式算出所需的树脂摩尔数A，选用带Fmoc保护基的氨基酸，每种氨基酸取2A摩尔，使用1A摩尔的Rink_Amide_MBHA树脂与2A摩尔的带Fmoc保护基的氨基酸，在含8%碳化二亚胺的氮甲基吡咯烷酮溶液作用下反应2小时，即可得到肽树脂），并使用常规法和改进的茚三酮法，检测每缩合1摩尔氨基酸其脱保护后的吸光值；

树脂摩尔数的计算公式：

$A=\frac{m}{\mathrm{SD}}$

式中：A为Rink_Amide_MBHA树脂的摩尔数；

m为Rink_Amide_MBHA树脂的克数；

SD为Rink_Amide_MBHA树脂取代量值；

（3）第二份在合成树脂正常脱保护后，加入2.5%咪唑溶液（2.5mg咪唑粉末加入到100ml氮甲基吡咯烷酮中，每摩尔肽合成树脂的用量为25ml）反应1分钟，模拟错误加保护的情况，使用常规法和改进的茚三酮法的吸光值；

（4）第三份在1mer缩合时缩短脱保护时间至15min，模拟脱保护不完全的情况（正常脱保护使用25%哌啶溶液反应30-45min），继续进行缩合，并使用常规法和改进的茚三酮法的吸光值；

将上述反应均继续缩合至4摩尔，得到一组数据，比较他们之间的差异，并计算合成的产率得出结论。

试验验证结果见表1、2、3、4。

表1            正常合成

由上表数据得知：在正常合成情况下常规方法与改进后的茚三酮检测法均可以对缩合完成率有准确的判定。

表2            错误加保护后的肽树脂

由上表数据得知：在错误加了保护基后，常规茚三酮法检测结果显示缩合过程完成，改进茚三酮法则可以对错误加保护基的情况做出准确的判定。

表3            脱保护不完全的肽树脂

由上表数据得知：在脱保护不完全的情况下，常规茚三酮检测法的检测结果显示缩合过程完全，改进茚三酮法的结果对合成情况的判定和真实情况相符。

表4            合成产率计算统计

	方法一	方法二	方法三
				合成前装载树脂重量(克)	50	50	50
合成后树脂总重量(克)	66.38	62.62	56.66
				FMOC保护基质量	222	222	222
树脂取代量（厂家提供）（毫摩尔/克）	0.37	0.37	0.37
				带保护基团的合成肽分子质量	1126.5	1126.5	1126.5
实际合成肽重量（克）	20.49	16.73	10.77
				理论合成肽重量(克)	20.84	20.84	20.84
合成产率	98.3%	80.3%	51.7%

由上表数据得知：模拟了合成过程，存在的三种不同情况，方法一是正常合成所能得到的合成肽，合成产率为98.3%；方法二是在错误加了保护基后所能得到的合成肽，合成产率为80.3%；方法三是脱保护不完全的情况下所能得到的合成肽，合成产率为51.7%；试验数据证明我们所模拟的这三种情况与我们预期所要达到的结果相符，可以反映出实际合成中可能碰到的意外情况。

综上所述：

（1）若将方法一的合成产率看做100%，那么根据最终4mer的570nm处吸光值可以得出，方法二的合成产率是方法一的81.7%，方法三的合成率是方法一的52.2%，该结果与计算结果相当。

（2）实验采用传统方式检测，缩合以后的三种情况吸光值并无明显的变化，结果均表明缩合完成度良好，但后两种情况的最终合成产率显示其合成并不完全，只有改进茚三酮法得出的结果与最终产率结果相当，表明了此方法与传统方法相比，对于合成过程中意外状况的判断更准确,可以有效的反应出最终产品的合成产率，更有利于对反应过程中意外状况的判定。

本发明试验选用的合成用树脂（Rink Amide-MBHA Resin）购自天津南开合成有限公司，货号：HCRAm04-1-1；哌啶和茚三酮购自Sigma，其货号110-89-4和货号N4876;氮甲基吡咯烷酮购自张家港合泰化工有限公司，货号：872504；乙醇购自永大试剂，货号：xk13-011-00011；吡啶购自天津市风船化学试剂科技有限公司，货号：：xk13-201-00115；苯酚购自Sigma，货号：P5566-100g；带Fmoc保护基的氨基酸，购自吉尔生化（上海）有限公司。

Claims (2)

1.一种改进的茚三酮对固相多肽合成的检测方法，其特征在于：采用新的茚三酮法，对固相多肽合成的产率得到准确的判定，步骤如下：

其1试剂配制：

还原型茚三酮的配制：取茚三酮500mg，用12.5ml沸蒸馏水溶解，得黄色溶液；在搅拌下加入维生素C溶液，其中该溶液用500mg维生素C用25ml温蒸馏水溶解制得；出现沉淀继续搅拌15min，移至冰箱中冷却到4℃，取出过滤得沉淀物，将沉淀物用纯净水洗涤2-3次，经真空干燥机，在温度45℃，真空度93.3～98.6KPa下处置，置于五氧化二磷真空干燥器中保存；

Buffer A的配制：5ml吡啶+1.185g苯酚+5ml乙醇混匀；

Buffer B的配制：487.5mg茚三酮+12.5mg还原型茚三酮+10ml乙醇；

25%哌啶溶液的配制：25ml哌啶+75ml氮甲基吡咯烷酮混匀；

其2样品处理：

称取Rink_Amide_MBHA树脂2g,并根据树脂摩尔数的计算公式算出所需的树脂摩尔数A，选用带Fmoc保护基的氨基酸2A摩尔，使用1A摩尔的Rink_Amide_MBHA树脂与2A摩尔的带Fmoc保护基的氨基酸，在含8%碳化二亚胺的氮甲基吡咯烷酮溶液作用下反应2小时，得到肽树脂，再经25%哌啶溶液处理30分钟，其中每摩尔肽树脂加入25%的哌啶溶液26ml，得去除保护基后的肽树脂；

树脂摩尔数的计算公式：

$A=\frac{m}{\mathrm{SD}}$

式中：A为Rink_Amide_MBHA树脂的摩尔数；

m为Rink_Amide_MBHA树脂的克数；

SD为Rink_Amide_MBHA树脂取代量值；

其3检测步骤：

取去除保护基后的肽树脂5-10mg，使用无水甲醇溶液15ml对其清洗3次，经真空干燥机，在温度45℃，真空度93.3～98.6KPa下处置；取上步肽树脂2-5mg，加入300ul Buffer A和75ul Buffer B，混和均匀，用100℃水浴加热15min，并置于15-20℃水中冷却至室温；取75ul的反应后的混合液加入到1.2ml的60%乙醇溶液中，混和均匀后，测定吸光值并在OD570下进行吸光值读取。

2.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于：选用的Rink Amide-MBHAResin树脂购自天津南开合成有限公司；哌啶、茚三酮购自Sigma；氮甲基吡咯烷酮购自张家港合泰化工有限公司；吡啶购自天津市风船化学试剂科技有限公司；带Fmoc保护基的氨基酸，购自吉尔生化有限公司。