JP4886701B2 - ペプチド中間体断片ｉｉｉを使用する合成 - Google Patents
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Description
本発明は、方法において使用され得るＴ−２０中間体ペプチド断片に加えて、固相および液相工程を使用して、Ｔ−２０ペプチドを調製するためのこれらの方法に関するものである。より特別には、本発明は、固相アプローチを使用して合成される２つの断片を使用する、Ｔ−２０ペプチドの調製に関するものである。
ペプチド合成についての多くの方法が、文献（例、米国特許第６，０１５，８８１号、 Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4005-4008、Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4009-4012、Kamber et al. (eds), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-526、Riniker et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:9307-9320、Lloyd-Williams et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:11065-11133、およびAndersson et al. (2000) Biopolymers 55:227-250参照）に記載される。合成のさまざまな方法は、合成が起こる相、すなわち液相または固相の物理的な状態によって区別される。
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）において、アミノ酸またはペプチド基は、固体支持体樹脂へ結合される。次に、連続的なアミノ酸またはペプチド基が、関心対象のペプチド材料が形成されるまで、支持体により結合されたペプチドへ付着される。次に、支持体により結合されるペプチドが典型的に、支持体から開裂され、さらなる工程および／または精製へ供される。いくつかの場合において、固相合成は、成熟ペプチド生成物を産じ、他の場合において、支持体から開裂したペプチド（すなわち、「ペプチド中間体断片」）が、より大きな成熟ペプチド生成物の調製に使用される。
固相工程から生じたペプチド中間体断片は、液相合成工程（本明細書で「溶液相合成」と呼ばれる。）において互いにカップリング（coupling）され得る。溶液相合成は、固相による有用な成熟ペプチドの合成が不可能であるかまたは実用的でないかのいずれかの場合に特に有用であり得る。例えば、固相合成において、より長いペプチドが、不規則な高次構造を結果として採用し得る一方で、固体支持体へなおも付着され、したがって、最終生成物における活性の部分的なまたは完全な損失を生じる。また、ペプチド鎖が支持体樹脂上でより長くなるにつれ、カップリングおよび脱保護などの工程段階の効率は妥協され得る。このことは、言い換えると、活性化可能なＲＡＵ／０２．０９．２００５、アミノ酸、共試薬、および溶媒などの出発材料における増大する損失に加えて、上述の問題を補償するために、より長い工程時間を生じ得る。これらの問題は、ペプチドの長さが増大するにつれ増大し得、それゆえ、固相手法のみを使用して合成される長さ３０超のアミノ酸の成熟ペプチドを見出すことは、比較的まれである。
溶液相カップリングにおいて、２つのペプチド中間体断片、またはペプチド中間体断片および反応性アミノ酸は、適切な溶媒中で、および通常、カップリング反応の効率および質を促進させるさらなる試薬の存在下でカップリングされる。ペプチド中間体断片は反応性に配置され、それによりある断片のＮ末端は、他の断片のＣ末端へカップリングされ、または逆も真である。さらに、固相合成中に存在する側鎖保護基は、断片の末端の特異的反応性を確実にするため、溶液相カップリング中に断片上で普遍的に保持される。これらの側鎖保護基は典型的に、成熟ペプチドが形成されるまで除去されない。
非常に大きなペプチドの合成について、複数の溶液相カップリング段階が、３または４またはそれより多くのペプチド中間体断片を使用して実施されることはまれである。複数のペプチド中間体断片が使用されるときに、溶液相反応における末端から末端へのカップリング反応の一般的な概念が、一般的に理論上直接的であるが、実際には、これはまれな場合である。不純物およびペプチド収量などのさまざまな因子が、全長のペプチドの質および収量に有意な影響を及ぼし得る。それゆえ、ハイブリッドスキームを使用するペプチド合成は、しばしば挑戦的であり、多くの場合、実際の合成が実施されるまで、問題が合成スキームに固有であることを予測することは困難である。
いくつかの場合、溶液相合成は、固相合成の後でペプチド中間体断片の純度を欠くことによって影響され得る。この点において、ペプチド中間体断片を精製段階へ供した後に、断片を溶液相工程においてカップリングすることは必要であり得る。精製は、言い換えると、ペプチド中間体断片の、したがって最終ペプチド生成物の収量における低下を生じ得る。
また、成熟ペプチドの収量は、成熟ペプチドを合成するのに必要とされる溶液相段階の数に反比例する。いくつかの場合、ペプチド中間体生成物を利用する３、４、または４を超える溶液相段階が、成熟ペプチドを生じるのに必要とされ得る。どのさらなる溶液相カップリング段階も、全長のペプチド生成物の回収の低下を生じ得る。それゆえ、全般的な収量を改善するため、カップリングに関与する段階を最小化することが一般に望ましい。
全般的な合成スキームにおける１つ以上の段階における適度の改善は、成熟ペプチドの調製における有意な改善に等しくあり得る。このような改善は、時間および試薬の大きな全体的な節約に至り得、最終生成物の純度および収量も有意に改善し得る。
ハイブリッド合成における改善の重要性の論議が、これらの手法を使用して生じるペプチドのいずれかの種類へ適用可能である一方、それは、治療上有用であり、商業的な医学的使用のためのスケールで製造されるペプチドの事情において特に重要である。小分子医薬品の合成が比較的安価であり得る一方、治療用ペプチドなどのより大きな生体分子医薬品の合成の経費は、比較の上で莫大に高くあり得る。他の因子に加えて、試薬の経費、合成時間のため、これらのより大きな生体分子医薬品の合成工程における非常にわずかな改善は、このような医薬品を製造するのにさらに経済的に実行可能であるかどうかに及ぼす有意な衝撃を有し得る。このような改善は、多くの場合、より大きな生体分子医薬品のこれらのタイプのもしあれば適切な治療上の選択肢があるという事実によって支持されるように、より大きな生体分子医薬品についてのこれらの高い製造経費により、必要である。
このことは、レトロウィルス感染によって生じる免疫不全疾病の治療のために使用される治療用ペプチドの場合において明確に見られる。抗レトロウィルス活性を有するペプチドは、異なる方法で作用し得、ウィルス粒子とホスト免疫細胞との融合を防止することによることを含む。多くの場合、伝統的に使用される抗ウィルスが、突然変異によるウィルス耐性のため、これらの疾病の処置に効果的ではなくなるため、これらの新規の効果的な治療用ペプチドについての大きな需要がある。
免疫不全疾病と戦うのに有用な治療用ペプチドのある見込みのあるクラスは、融合阻害剤である。治療ペプチドのこれらのタイプは、ウィルス力価を低下し得、免疫不全疾病を有する患者における生活の質を有意に改善する。例えば、合成された３６個のアミノ酸のペプチドのハイブリッドペプチドＴ−１２４９である（エンフビルチドまたはＴ−２０としても公知の）ＦＵＺＥＯＮ（登録商標）ペプチド、ならびにこれらのペプチドの誘導体および対応物は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療における融合阻害剤として恩典があることを証明している。ＦＵＺＥＯＮ（登録商標）ペプチドおよびその誘導体は、ＨＩＶに感染した人間における首尾一貫した強力な活性を示すＨＩＶの第一阻害剤である（Kilby et al. (1998) Nat Med 4:1302およびKilby et al. (2002) AIDS Res Hum Retroviruses 18:685）。
Ｔ−２０ペプチドおよびＴ−１２４９ペプチドなどの融合阻害剤は、ウィルスとＣＤ４＋ホスト細胞の膜との融合に関与するＨＩＶ１型（ＨＩＶ−１）の糖タンパク質４１エンベロープの領域へ結合する（Wild et al. (1993) AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:1051）。融合阻害剤は、細胞の外側に留まり、ＨＩＶ−１が細胞へ入る前にＨＩＶ−１を遮断する。ＦＵＺＥＯＮ（登録商標）ペプチドおよびその誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＩＶ−１を強力に選択的に阻害することによって、薬物の相互作用、副作用、および細胞毒性を最小化する。
これらの関心に加え、ペプチドの大規模生産についての生成物回収および生成物純度に関する問題は、試薬の取り扱い、保存、および廃棄と同様、ペプチド合成スキームの実行可能性に大きく影響を与え得る。したがって、改善された収量の大きなバッチ量における商業的な関心対象のペプチド材料を効率よく生産できるペプチド合成工程についての絶え間ない需要がある。ペプチドの固相合成後の開裂したペプチドの回収は、改善が必要とされる合成のある局面である。
本発明は、固相および溶液相（「ハイブリッド」）アプローチを使用して合成されるＴ−２０の調製に関するものである。一般に、アプローチは、固相化学物質を使用して、２つの異なるＴ−２０ペプチド中間体断片（配列番号２および配列番号３、またはそれらの対応物）を合成することを含む。いくつかの本発明の局面にしたがって、固相合成の後、これらの特異的Ｔ−２０中間体配列は、それ自体を溶液相カップリング段階に特に十分与えることがわかってきた。さらに、これらの中間体断片の形成に至る固相段階が、これらの中間体断片の収量および純度を有意に改善するために本発明で改変され得ることもわかってきた。この改善された収量および純度は、溶液相カップリング段階へと持ち越され、それにより合成工程全体を改善する。
本発明の方法および本明細書に記載のペプチド中間体断片は、特に多くの方法でＴ−２０合成工程がより効率的になるため、特に有利である。特に、Ｔ−２０ペプチド中間体生成物配列番号２または配列番号３の形成に至る固相合成段階は、標準的な固相技術において伝統的に使用されるものよりも低い負荷因子で支持体へ第一アミノ酸がカップリングされた支持体樹脂を利用する。好ましくは、このより低い負荷因子を使用して、非典型的に長い固相により合成された断片である配列番号２または配列番号３のＴ−２０ペプチド中間体生成物を使用して、改善された収量および改善された純度で製造されうることがわかってきた。
改善された純度および収量は、溶液相カップリング段階についての条件を有意に改善し、それによりＴ−２０の全般的な合成についての改善を生じる。
今まで、最も成功したＴ−２０合成アプローチは、溶液相カップリングを利用してきており、その中で、３つ以上のペプチド中間体断片が固相合成によって調製され、これらの中間体断片はその後、最終Ｔ−２０成熟生成物を調製するため、溶液相カップリング反応において使用される。３つの（またはそれより多くの）断片アプローチの利点は、中間体の固相合成のより高い質に関して見られ得るが、マイナス面は、３つの（またはそれより多くの）断片アプローチが、２断片アプローチと比較してより多くの単離段階および精製段階を包含し、これらのさらなる段階は一般に、加工時間を増大させ、合成反応の全般的な収量をその後低下させ得ることである。
本発明が、固相合成を介して調製されるたった２つのペプチド中間体断片を利用するため、ある明確な利点は、工程時間が短縮され、加工段階の排除によって、材料および試薬のより効率的な使用ができることである。しかしながら、２断片アプローチによる可能性のある不利は、固相合成によるより長い中間体断片の合成が複雑であり得、しばしば重大な純度および／または回収の問題に至ることである。これにもかかわらず、上述のように、本発明は、配列番号２または配列番号３に基づいた配列を有する中間体ペプチド断片を選択した後、低い樹脂負荷因子を使用する固相合成によってこれらの断片を合成することからなる方法によって、中間体断片が良好な収量および純度でうまく生成できることを示す。このような達成は、固相および溶液相の組み合わせたアプローチを使用してペプチドを合成するための従来のアプローチを考慮して、むしろ注目すべきである。
本発明は、ペプチドの純度の他の局面が改善されることにおいても有利である。特に、配列番号２または配列番号３に記載の配列を有する中間体ペプチド断片は、Ｎ末端グルタミン酸（Ｅ）残基を含まない。各々の中間体断片がグルタミン酸残基を含む限り、各々のこの残基は、中間体断片の配列内またはＣ末端に位置する。Ｎ末端にグルタミン酸を有する断片が、より多くのピログルタミン酸塩不純物を含む傾向があるため、（配列番号２および配列番号３などの）アミノ酸のこれらの一般的な配列配置を有する断片を使用するとき、断片中間体断片の純度が有意に高くあり得ることがわかってきた。
それゆえ、いくつかの局面において、本発明は、（ａ）０．５以下の負荷因子（loading factor）でカップリングされ、好ましくは０．２〜０．５の負荷因子でカップリングされるグルタミン酸（Ｅ）である残基へ第一アミノ酸がカップリングされた固相合成支持体樹脂を提供する段階、（ｂ）次の配列
を提供するよう、カップリングされた支持体上の第一アミノ酸へその後のアミノ酸をカップリングする段階、（ｃ）開裂反応において、支持体から
ペプチド中間体を除去する段階、および次に、
の前部または一部を有するペプチドの合成のために
ペプチド中間体を使用する段階を含む、Ｔ−２０ペプチドの合成についてのペプチド中間体断片を調製するための方法を提供する。
他の局面において、本発明は、（ａ）０．５以下の負荷因子でカップリングされ、好ましくは０．２〜０．５の負荷因子でカップリングされるトリプトファン（Ｗ）である残基へ第一アミノ酸がカップリングされた固相合成支持体樹脂を提供する段階、（ｂ）次の配列
を提供するため、その後のアミノ酸を第一アミノ酸へ、カップリングされた支持体上でカップリングさせる段階、（ｃ）開裂反応において支持体から
ペプチド中間体を除去する段階、および次に、
の全部または一部を有するペプチドの合成についての
ペプチド中間体を使用する段階を含む、Ｔ−２０ペプチドの合成についてのペプチド中間体断片を調製するための方法を提供する。
最も好ましくは、本発明は、（ａ）配列
を有する、０．５以下の負荷因子を使用して、好ましくは０．２〜０．５の負荷因子を使用して固体支持体上で合成されたペプチド中間体断片を提供する段階、（ｂ）溶液相において、
ペプチドをフェニルアラニンアミド残基と反応させ、配列
を提供する段階、および（ｃ）溶液相において、
ペプチドを
ペプチドと反応させ、
ペプチドを提供する段階を含む、Ｔ−２０ペプチドを調製するための方法を提供する。
他の局面において、カップリング段階において、第一アミノ酸は、０．５未満の負荷因子で支持体上に存在する。他の局面において、カップリング段階において、第一アミノ酸は、０．２〜０．４５の範囲の負荷因子、または０．２５〜０．４０の範囲の負荷因子で支持体上に存在する。
さらに他の局面において、固相合成は、１〜１．５当量の量で、アミノ酸を新生ペプチド鎖へカップリングさせることによって実施される。
他の局面において、本発明は、配列
を有するポリペプチドを提供する。配列番号２は、０．５以下の負荷因子を使用する固相合成によって合成され得る。
他の局面において、本発明は、配列
を有するポリペプチドを提供する。配列番号３は、０．５以下の負荷因子を使用する固相合成によって合成され得る。
後述の本発明の態様は、次の詳細な記述において開示される精確な形態へ徹底的であるようにまたは本発明を制限するよう企図されるものではない。むしろ、態様は、当業者が、本発明の原理および実際を正しく認識し理解し得るよう、選択され記載される。
本明細書で使用される専門用語は、本発明の範囲を制限するよう企図されるものではない。上述の請求項を含む本文を通じて、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段に脈絡が明確に記載されない限り、複数を含む。したがって、例えば、「アミノ酸残基」に対する言及は、１つ以上のアミノ酸残基に対する言及であり、当業者に公知のその等価物を含む。本発明において、特定の用語が頻繁に使用され、その意味が本明細書に提供される。別段の定義がなければ、本明細書で使用される用語は、当業者に対して普遍的に理解されるのと同一の意味を有する。いくつかの用語は、明細書において後述でもより詳細に説明され得る。
本発明は、（エンフビルチド（enfuvirtide）としても公知の）Ｔ−２０およびＴ−２０対応物の合成を改善するための、特にＴ−２０ペプチド中間体断片の固相合成に関する合成の局面を改善するための方法に向けられる。本発明の方法論は、固相により合成されたたった２つのペプチド断片を使用して、Ｔ−２０ペプチドおよびその対応物を作るのに有用である。本発明は、一般にＴ−２０合成に向けられるが、本明細書における本発明の教示は、他のペプチド、特に固相および溶液相アプローチの組み合わせを使用して合成されるものの合成へも適用可能であり得る。本発明は、不純物、特にピログルタミン酸塩不純物と関連したペプチド中間体断片の合成へも適用可能である。
本明細書に記載の方法は特に、Ｔ−２０ペプチドのスケールアップした合成の局面を改善するのに適している。スケールアップした手法は典型的に、分布に有用なペプチドのある量を提供するよう実施される。例えば、スケールアップした手法におけるペプチドの量は、バッチあたり５００ｇ、または１ｋｇ、またはそれより多くあり得、より典型的にはバッチあたり数十〜数百ｋｇまたはそれより多くであり得る。大規模合成などのスケールアップした合成手法において、１つ以上の大きな反応容器が使用され得る。これらは、合成工程におけるさまざまな段階についての樹脂、溶媒、アミノ酸、および化学物質などの試薬の量を収容でき、例えば総計、例えば１００〜５００ｋｇ以上の範囲のペプチドの生産が可能である大きさである。
本明細書に記載の方法は、特にスケールアップした手法についてのペプチド合成の局面を改善するのに特に適している。好ましい態様において、本発明の方法は、処理（合成）時間における短縮、生成物の収量における改善、生成物の純度における改善、および必要とされる試薬および出発材料の量の削減などの改善を提供できる。
Ｔ−２０は、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物からの膜貫通型タンパク質ｇｐ４１のアミノ酸残基６３８〜６７３に相当する、３６個のアミノ酸配列を有するペプチドである。Ｔ−２０（配列番号１）ペプチドの配列は、以下に示される。
Ｔ−２０は、ＨＩＶ−１感染の治療のために使用される抗レトロウィルス薬である。Ｔ−２０は、膜融合に必要な高次構造の変化を遮断することによって、ＨＩＶ−１ウィルス粒子とホスト細胞との融合を遮断するよう機能する。活性のこのタイプを有するペプチドは、本明細書でＴ−２０活性を有するといわれる。
Ｔ−２０合成は典型的に、エンフビルチド生成物を生じるために特異的なペプチド断片の群を合成して組み合わせるために、固相および液相の両手法を利用する（Bray, B.L., Nature Rev., 2:587-593 (2003)）。本発明は、エンフビルチドペプチド中間体および全長のエンフビルチド生成物の両者の改善された合成のための方法を提供する。本発明の方法は、エンフビルチド活性を有するペプチド、およびエンフビルチド活性を有するペプチドを調製するために使用されるペプチド中間体の合成も含む。エンフビルチド活性を有するペプチドは、米国特許第５，４６４，９３３号および第５，６５６，４８０号、およびＰＣＴ刊行物第ＷＯ９６／１９４９５号に記載される。
本発明は、全長のＴ−２０対応物およびＴ−２０ペプチド中間体対応物を含むＴ−２０対応物の合成へも適用可能である。本明細書で使用されるように、「Ｔ−２０対応物」は、Ｔ−２０またはＴ−２０中間体断片から派生した化合物を指す。ペプチド対応物は、ペプチドアナログ、ペプチド誘導体、融合化合物等を含むがそれらには限定されない。それゆえ、配列番号２および配列番号３の配列を有するＴ−２０ペプチド中間体断片を指すとき、それらの対応物は、例えば配列番号２および配列番号３のペプチドアナログ、ペプチド誘導体、融合化合物をそれぞれ含む。
本明細書に使用されるように、ペプチドアナログは一般に、別のペプチドまたはペプチド対応物に関連する１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、反転、および／または付加などによって改変されたアミノ酸配列を有するペプチドを指す。置換は好ましくは、保存され得るかまたは非常に保存され得る。保存的な置換は、一般に同一の正味の電荷および一般に同一の大きさおよび形状を有する別のアミノ酸とのアミノ酸の置換を指す。例えば、脂肪族または置換された脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、それらの側鎖における炭素およびヘテロ原子の総数が約４以下まで異なるとき、ほぼ同一の大きさを有する。前記アミノ酸は、それらの側鎖における分岐数が、約１または２以下まで異なるとき、ほぼ同一の形状を有する。側鎖にフェニル基または置換されたフェニル基を有するアミノ酸は、ほぼ同一の大きさおよび形状を有すると考えられる。以下に列挙されるのは、アミノ酸の５つの群である。化合物中のアミノ酸を同一群からの別のアミノ酸と置換すると、一般に保存的な置換が生じる。
Ｉ群：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、およびＣ１〜Ｃ４脂肪族側鎖またはＣ１〜Ｃ４ヒドリキシルにより置換された脂肪族側鎖（直鎖または単一分岐した（ｍｏｎｏｂｒａｎｃｈｅｄ））を有する非天然に発生するアミノ酸。
ＩＩ群：グルタミン酸、アスパラギン酸、およびカルボン酸により置換されるＣ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐地点）を有する非天然に発生するアミノ酸。
ＩＩＩ群：リジン、オルニチン、アルギニン、およびアミンまたはグアニジノにより置換されるＣ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐地点）を有する非天然に発生するアミノ酸。
ＩＶ群：グルタミン、アスパラギン、およびアミドにより置換されるＣ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐地点）を有する非天然に発生するアミノ酸。
Ｖ群：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、およびトリプトファン。
「非常に保存的な置換」とは、側鎖に同一の機能基を有し、ほぼ同一の大きさおよび形状を有する別のアミノ酸とのアミノ酸の置換である。脂肪族または置換された脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、それらの側鎖に炭素およびヘテロ原子の総数が２以下まで異なるとき、ほぼ同一の大きさを有する。前記アミノ酸は、それらが側鎖に分岐の同一数を有するとき、ほぼ同一の形状を有する。非常に保存的な置換の例は、ロイシンについてのバリン、セリンについてのスレオニン、グルタミン酸についてのアスパラギン酸、およびフェニルアラニンについてのフェニルグリシンを含む。
ペプチド誘導体は一般に、その側鎖基、アルファ炭素原子、末端アミノ基、および／または末端カルボン酸基のうちの１つ以上の化学的改変を有するペプチド、ペプチドアナログ、または他のペプチド対応物を指す。例証として、化学的改変は、化学部分を付加すること、新たな結合を作ること、および／または化学部分を除去することを含むが、それらには限定されない。アミノ酸側鎖基での改変は、リジンｅ−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン、またはリジンのＮ−アルキル化、グルタミン酸基またはアスパラギン酸カルボン酸基のアルキル化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミノ化を含むが、それらには限定されない。末端アミノ基の改変は、脱アミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキル、およびＮ−アシル（例、−ＣＯ−低級アルキル）改変を含むが、それらには限定されない。末端カルボキシ基の改変は、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、および低級アルキルエステルの改変を含むが、それらには限定されない。したがって、部分的または全体的に保護されるペプチドは、ペプチド誘導体を構成する。
言及は、ペプチドの次のセットに対してなされ、表１に記載されるＴ−２０およびＴ−２０中間体断片を含む。
概観を提供するため、本発明の方法に基づくように、Ｔ−２０ペプチドについての全般的な合成スキームは、次のとおりである。Ｔ−２０（配列番号１）は、Ｔ−２０ペプチド中間体断片
の固相合成を含む段階によって調製される。これらのペプチドは、本明細書に記載の方法を使用して合成された後、側鎖により保護された形態において固相樹脂から開裂される。次に、フェニルアラニンアミド残基が、溶液中で
ペプチド中間体へカップリングされ、
を生じる。次に、
は、溶液中で
へカップリングされ、
を生じる。
本発明にしたがって、固相合成技術は、
の１７個のアミノ酸配列またはその対応物を有するＴ−２０の第一ペプチド断片（中間体断片１）を調製するのに使用される。固相合成の好ましい方法に関する言及について、ペプチドのＣ末端部分に存在するアミノ末端グルタミン酸（Ｅ）残基（すなわち、配列番号２の残基番号１７）は、固相樹脂へカップリングされ、したがって固体支持体樹脂に関してアミノ酸の位置に関して断片のアルファアミノ酸を構成する第一アミノ酸残基である。この好ましい方法において、それゆえ固相合成は、アミノ末端からカルボキシル末端へとアミノ酸残基を連続して付加することによって進行し、望ましい配列に相当する方法でアミノ酸を連続的に付加する。ペプチド中間体断片の合成は、Ｎ末端残基（例えば、配列番号２のＮ末端チロシン（Ｙ））が新生ペプチド鎖へ付加された後に完了する。
固相合成技術は、
の１８個のアミノ酸配列またはその対応物を有するＴ−２０の第二ペプチド断片（中間体断片２）を調製するのにも使用される。固相合成の好ましい方法に関する言及について、アミノ末端トリプトファン（Ｗ）残基（すなわち、配列番号３の１８番目の残基、または配列番号１の残基番号３５）は、固相樹脂へカップリングされ、したがって固体支持体樹脂に関してアミノ酸の位置に関して断片のアルファアミノ酸を構成する第一アミノ酸残基である。この好ましい方法において、固相合成は、アミノ末端からカルボキシル末端へとアミノ酸残基を連続して付加することによっても進行し、望ましい配列に相当する方法でアミノ酸を連続的に付加する。ペプチド中間体断片の合成は、Ｎ末端残基（例えば、配列番号３のＮ末端リジン（Ｋ）（Ｙ））が、新生ペプチド鎖へ付加された後に完了する。
有利なことに、中間体断片１も中間体断片２も、Ｎ末端グルタミン酸（Ｅ）残基を含まない。各々の中間体断片がグルタミン酸残基を含む限り、各々の残基は、中間体断片の配列内にまたはＣ末端に位置する。アミノ酸のこれらの一般的な配列配置を有する断片を使用するとき、Ｎ末端にグルタミン酸を有する断片が、より多くのピログルタミン酸不純物を含む傾向にある限り、中間体断片の純度が有意により高くなり得ることがわかる。
中間体断片１および２の各々が、少なくとも１７個のアミノ酸の残基を含むことも注目される。これらは、固相合成の事情においてはむしろ大きなペプチド断片であるが、本発明の原理によって、このような大きな断片および結果として生じるＴ−２０が高い収量および高い純度で合成できる。
本発明にしたがって、固相樹脂上で合成されるペプチドの相対的な量を適切に調節することによって、有利な効果が、ペプチド中間体断片の収量および純度に関して得られ得ることが発見された。合成されるペプチドの相対的な量は、固相樹脂の１ｇあたりのアルファアミノ酸のミリモルとして典型的に表される樹脂のある量へカップリングされるアルファアミノ酸の量を指す負荷因子によって調節され得る。例えば、０．２５の負荷因子は、固相樹脂１００ｇへ実際にカップリングされるアルファアミノ酸の２５ｍｍｏｌに相当するであろう。第一アミノ酸を固相樹脂へカップリングする反応は、完全に効率的ではないかも知れず、それゆえ、カップリングされる実際の量は、出発試薬の１００％カップリング効率および量に基づいた理論上の量よりも小さくあり得る。カップリングされる材料の実際の量は、反応が生じた後で決定され得る。実際のカップリングを決定するため、ペプチドは、樹脂から開裂され得、例えば標準物質に対するＨＰＬＣ分析を使用することによってアッセイされ得る。カップリングされる第一アミノ酸残基の実際の量を決定するための方法は、本明細書に記載される。
本発明にしたがって、（ペプチド中間体断片の配列番号２および配列番号３の配列などの）相対的に長いペプチド断片の収量および純度、それゆえ結果として生じるＴ−２０ペプチドの収量および純度は、０．５以下などの比較的低い負荷因子でより高い傾向にある。しかしながら、負荷因子が例えば０．２未満である場合、生成物処理量は削減され得る。これらの関係を平衡化するため、断片１および２のうちの少なくとも１つ、好ましくは断片１および２の両者に関する負荷因子は、約０．２〜約０．５０であり、好ましくは約０．２〜約０．４５の範囲にあり、より好ましくは約０．２〜約０．４０の範囲にある。例えば、実際のある代表的なモードにおいて、約０．３４の負荷因子を使用することが適切であろう。
この局面を説明するため、次の固相手法が実施され得る。適切な樹脂を得、適切な溶媒中で洗浄することによって調製する。次に、活性化可能な保護された形態にある第一アミノ酸を含有する溶液を、洗浄した樹脂へ添加する。望ましい範囲内で負荷因子を達成するため、アミノ酸の量および／または濃度、および／またはＨＯＢＴなどの共試薬の存在および濃度、カップリング反応の時間、カップリング反応の温度、等などの他の反応因子を選択し得る。
Ｆｍｏｃ化学物質を使用する固相合成は、樹脂へ連結される（配列番号２および配列番号３を含むペプチド中間体断片などの）Ｔ−２０中間体断片を調製するよう使用され得る。ペプチド中間体断片は、樹脂上に合成された後、開裂試薬を使用して、保護された形態にある溶液中のペプチド中間体断片を生じるよう開裂される。次に、ペプチド中間体断片が樹脂から分離される。いくつかの場合、ペプチド中間体断片は、溶液相カップリングを実施する前に、ペプチド中間体断片を精製するための方法として、沈殿剤と接触する。
固相アプローチを使用してペプチドを合成するための方法は、当技術分野において周知である。したがって、本発明は、Ｔ−２０最終生成物の調製において使用され得るペプチド中間体断片を調製するための低い負荷因子を使用するいずれかの固相合成アプローチを使用することを熟慮する。
例えば、本明細書に記載のＴ−２０ペプチド中間体断片は、標準的なＦＭＯＣプロトコールを使用するＳＳＰＳ技術によって合成され得る。例えば、Carpin et al. (1970), J. Am. Chem. Soc. 92(19):5748-5749; Carpin et al. (1972), J. Org. Chem. 37(22) :3404-3409, 「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis」, Weng C. Chan and Peter D. White Eds. (2000) Oxford University Press Oxford Engを参照してほしい。
固相ペプチド合成の実際に適した支持体のいずれかのタイプが使用され得る。好ましい態様において、支持体は、１つ以上のポリマー、共ポリマー、またはポリアミド、ポリスルフアミド、置換されたポリエチレン、ポリエチレングリコール、フェノール樹脂、多糖類、またはポリスチレンなどのポリマーの組み合わせから作られ得る樹脂を含む。ポリマー支持体は、ペプチド合成において使用される溶媒に対して十分に不溶性であり不活性であるいずれかの固体でもあり得る。固体支持体は典型的に、成長するペプチドが合成の間にカップリングされ、支持体からペプチドを放出するのに望ましい条件下で開裂され得る連結部分を含む。適切な固体支持体は、光開裂可能な、ＴＦＡ開裂可能な、ＨＦ開裂可能な、フッ素イオン開裂可能な、還元的に開裂可能な、Ｐｄ（Ｏ）開裂可能な、求核性開裂可能な、またはラジカル性開裂可能なリンカーを有し得る。好ましい連結部分は、開裂したペプチドがなおも実質的に包括的に保護されるような条件下で開裂できる。
合成のある好ましい方法において、ペプチド中間体断片は、トリチル基を含む酸感受性固体支持体上で、より好ましくは、張り出した塩素基を有するトリチル基を含む樹脂、例えば塩化２−クロロトリチル（２−ＣＴＣ）樹脂上で合成される（Barlos et al. (1989) Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946）。例は、塩化トリチル樹脂、塩化４−メチルトリチル樹脂、塩化４−メトキシトリチル樹脂、４−アミノブタン−１−オール２−クロロトリチル樹脂、４−アミノメチルベンゾイル２−クロロトリチル樹脂、３−アミノプロパン−１−オール２-クロロトリチル樹脂、ブロモ酢酸２−クロロトリチル樹脂、シアノ酢酸２−クロロトリチル樹脂、４−シアノ安息香酸２−クロロトリチル樹脂、グリシノール２−クロロトリチル樹脂、プロピオン酸２−クロロトリチル樹脂、エチレングリコール２−クロロトリチル樹脂、Ｎ−Ｆｍｏｃヒドロキシルアミン２−クロロトリチル樹脂、ヒドラジン２−クロロトリチル樹脂も含む。いくつかの好ましい固体支持体は、反応基が固着される支持体材料を形成するためにジビニルベンゼンと共重合され得るポリスチレンを含む。
ペプチド材料は典型的に、ビーズ表面およびビーズ内部内の両者で樹脂ビーズへ結合される。ＦＭＯＣおよび側鎖により保護されるペプチドは、ＤＣＭまたは酢酸中の希釈したＴＦＡなどの弱酸性試薬を使用してこの樹脂から保護された状態において簡単に開裂される。
固相合成において使用される他の樹脂は、スチレンおよびジビニルベンゼンと、４−ヒドロキシメチルフェニルオキシメチル固着基（Wang, S.S. 1973, J. Am. Chem. Soc）および４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸樹脂（Richter et al. (1994), Tetrahedron Letters 35(27):4705-4706）との共重合体を含む「Ｗａｎｇ」樹脂を含む。Ｗａｎｇ、塩化２−クロロトリチル、および４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸樹脂は、例えばCalbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, Californiaから購入され得る。
第一のカップリングされたアミノ酸を有する支持体を提供するため、樹脂は、例えば洗浄によって調製され得、次に、活性化された保護されたアミノ酸を含有する溶液とともにインキュベーションされ得る。樹脂へカップリングされる第一アミノ酸およびその後のアミノ酸は典型的に、Ｎ末端保護基、（特定のアミノ酸に依存する）側鎖保護基、および樹脂から張り出した基と反応性のある基または張り出したアミノ酸と反応性のある基を含む。
好ましい局面において、第一アミノ酸は、カルボキシ末端で支持体へ結合されるのに対し、Ｎ末端基および側鎖基は、保護基によって適切に保護される。典型的な記載として、
ペプチド中間体断片の固相合成は、保護されたグルタミン酸残基を塩化２−クロロトリチル（２−ＣＴＣ）樹脂へまず負荷することによって、カルボキシ末端からＮＨ２−末端の方向へ実施される。
保護基の性質および使用は、当技術分野において周知である。一般に、適切な保護基は、結合される原子または部分、例えば酸素または窒素が、処理および合成中に望ましくない反応で関与することを防止するのを助け得る基のいずれかの種類である。保護基は、側鎖保護基およびアミノ−またはＮ−末端保護基を含む。保護基は、カルボン酸、チオール等の反応または結合も防止し得る。
側鎖保護基とは、ペプチド合成、処理、等の段階において使用される化学物質との反応から側鎖の一部を保護するのを助けるアミノ酸の側鎖（すなわち、一般的なアミノ酸式Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｒ）（Ｈ）−ＣＯＯＨ）へカップリングされる化学的な部分を指す。側鎖保護基の選択は、さまざまな因子、例えば実施される合成のタイプ、ペプチドが供されるであろう処理、および望ましい中間体生成物または最終生成物に依存し得る。側鎖保護基の性質は、アミノ酸自体の性質にも依存する。一般に、固相合成中にα−アミノ酸基の脱保護中に除去されない側鎖保護基が選択される。それゆえ、α−アミノ保護基および側鎖保護基は、典型的には同一ではない。
いくつかの場合において、固相合成および他のペプチド処理において使用される試薬のタイプに依存して、アミノ酸は、側鎖保護基の存在を必要としないかもしれない。このようなアミノ酸は典型的に、側鎖に活性酸素種、窒素、または他の反応性部分を含まない。
側鎖保護基の例は、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ｔｅｒｔ−ブチル、トリフェニルメチル（トリチル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルエーテル（Ｂｚｌ）および２，６−ジクロロベンジル（ＤＣＢ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、アダマンチルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、メチル、エチルおよびｔ−ブチルエステル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、Ｔｏｓ、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、および芳香族または脂肪族ウレタン型保護基、ニトロベリトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）などの感光性基、およびトリメチルシリルオキシカルボニル（ＴＥＯＣ）などのフッ化物不安定基を含む。
好ましい側鎖保護基は、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＡｓｐ（Ｄ）アミノ酸残基についてのｔ−Ｂｕ基；Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、およびＡｓｎ（Ｎ）アミノ酸残基についてのｔｒｔ基；およびＬｙｓ（Ｋ）およびＴｒｐ（Ｗ）アミノ酸残基についてのＢｏｃ基を含む。
例えば、表１に列挙されるペプチド断片のアミノ酸残基の側鎖のいずれかの１つ以上は、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、トリチル（ｔｒｔ）、およびｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）などの標準的な保護基で保護され得る。ｔ−Ｂｕ基は、アミノ酸残基Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＡｓｐ（Ｄ）についての好ましい側鎖保護基であり、ｔｒｔ基は、アミノ酸残基Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、およびＡｓｎ（Ｎ）についての好ましい側鎖保護基であり、Ｂｏｃ基は、アミノ酸残基Ｌｙｓ（Ｋ）およびＴｒｐ（Ｗ）についての好ましい側鎖保護基である。
ヒスチジンを含むＴ−２０ペプチド中間体断片の合成の間、ヒスチジン残基の側鎖は、好ましくはトリチル（ｔｒｔ）保護基で望ましく保護される。保護されない場合、合成の間に、樹脂からペプチド断片を開裂させるかおよび／またはＦＭＯＣまたは他のＮ末端保護基を開裂させるのに使用される酸は、保護されていないヒスチジン残基と不利に反応し得、ペプチド断片の分解を生じ得る。非常に可能なことに、ヒスチジンが保護されない場合、別のアミノ酸のさらなる結合は生じ得ない。開裂時間の延長も、ヒスチジンからのｔｒｔなどの保護基を除去し得、典型的な質の特異化を満たすためのバッチ（batch）を生じ得る。
好ましくは、本発明の各ペプチド断片のアスパラギン残基は、すべて保護される。さらに、トリプトファン残基がＢｏｃ基で保護されることが好ましい。
アミノ末端保護基は、アミノ酸のアルファアミノ基へカップリングされた化学部分を含む。典型的に、アミノ末端保護基は、付加されるべき次のアミノ酸の成長しているペプチド鎖への付加の前の脱保護反応において除去されるが、ペプチドが支持体から開裂されるとき、維持され得る。アミノ末端保護基の選択は、さまざまな因子、例えば実施される合成のタイプおよび望ましい中間生成物または最終生成物に依存し得る。
アミノ末端保護基の例は、（１）ホルミル、アクリリル（Ａｃｒ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、およびアセチル（Ａｃ）などのアシル型保護基；（２）Ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルなど、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）および置換されたＺなどの芳香族ウレタン型保護基；（３）ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニルなどの脂肪族ウレタン保護基；（４）９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、およびシクロヘキシルオキシカルボニルなどのシクロアルキルウレタン型保護基；および（５）フェニルチオカルボニルなどのチオウレタン型保護基を含む。好ましい保護基は、９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−（４−ビフェニリル）−プロピル（２）オキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、２−フェニルプロピル（２）−オキシカルボニル（Ｐｏｃ）、およびｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）を含む。
本発明にしたがって、保護基は典型的に、固相合成を通じて、および溶液相カップリング反応へおよび溶液相カップリング反応を通じて、ペプチド中間体断片上に保持される。（一般に、溶液相カップリング段階が完了した後、脱保護段階は、ペプチドから１つ以上の保護基を除去するために実施される。）
配列番号２および配列番号３を有するペプチド中間体断片の合成のための樹脂へカップリングされ得る特異的な保護基を有する第一アミノ酸の特異的な例はそれぞれ、ＦｍｏｃＧｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨおよびＦｍｏｃＴｒｐ（Ｂｏｃ）ＯＨであり得る。
固相合成のための樹脂を調製するため、樹脂は、溶媒中で前洗浄され得る。例えば、２−ＣＴＣ樹脂などの固相樹脂は、ペプチドチャンバーへ添加され、適切な溶媒で前洗浄される。洗浄は、樹脂へカップリングされる第一アミノ酸と接触させるための樹脂を調製するために実施されうる。本質において、前洗浄は、第一アミノ酸の樹脂への効率的カップリングを促進するために実施され得る。前洗浄溶媒は、カップリング反応において使用される溶媒（または溶媒の混合物）のタイプに基づいて選択され得、その逆もまた真である。
洗浄、およびその後のカップリング反応にも適した溶媒は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジクロロエタン（ＤＣＥ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、塩化メチレン等を、これらの試薬の混合物と同様に含む。他の有用な溶媒は、ＤＭＳＯ、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、およびそれらの混合物を含む。いくつかの場合、カップリングは、ＤＭＦおよびＤＣＭの混合物などの、２成分溶媒システムにおいて実施され得る。
本明細書に記載されるように、約０．２〜約０．５０、好ましくは約０．２〜約０．４５、より好ましくは約０．２〜約０．４０の範囲にある樹脂上で第一アルファアミノ酸の負荷因子（loading factor）を調節することが望ましい。それゆえ、溶液は、標的範囲においてカップリング因子を提供するであろうアミノ酸のある量を有する溶液が調製される。このことは、カップリング効率が特定の反応のためのものであることが一般に公知であるので決定され得る。例えば、約０．３４の標的負荷因子を有することが望まれるとき、カップリング効率が約８０％であることが公知である場合、樹脂の１ｇについてアミノ酸０．４２５ｍｍｏｌを含有するカップリング溶液が使用されるべきである（０．３４／０．８）。
カップリング反応は、カップリング反応を高めるかまたは改善する１つ以上の化合物の存在において実施され得る。反応の率を増大し得、側鎖反応の率を低下させ得る化合物は、三級塩基、例えばジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下で、保護されたアミノ酸を活性化された種へ変換し得るホスホニウム塩およびウロニウム塩を含む（例えば、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰＯ、ＨＢＴＵ、およびＴＢＴＵはすべて、ＨＯＢｔエステルを生じる。）。他の試薬は、保護する試薬を提供することによってラセミ化を防止するのを助ける。これらの試薬は、付加された補助求核試薬（例えば、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、またはＨＯＳｕ）とともにカルボジイミド（例えば、ＤＣＣまたはＷＳＣＤＩ）を含む。利用され得る別の試薬は、ＴＢＴＵである。アジ化物と関連した低ラセミ化によるアジ化物方法と同様に、付加された補助求核試薬とともにまたはそれなしでクロロギ酸イソブチルを使用する、混合した無水物の方法も利用される。化合物のこれらのタイプは、カルボジイミドにより仲介されるカップリングの率も増大させ得、同様に、ＡｓｎおよびＧｌｎ残基の脱水も防止し得る。
カップリングの完了は、本明細書に記載の定量的ニンヒドリン検査でモニターされ得る。カップリングが完了したと決定した後、カップリング反応混合物を溶媒で洗浄し、ペプチド材料のその後のアミノ酸残基の各々について、カップリングサイクルを繰り返す。最終的なカップリングサイクルの後、樹脂をＮＭＰなどの溶媒で洗浄した後、ＤＣＭなどの不活性第二溶媒で洗浄する。
次のアミノ酸をカップリングするため、Ｎ末端保護基（例えば、Ｆｍｏｃ基）の除去が、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの溶媒中で（重量ベースの）２０〜５０％ピペリジンを含む試薬による処理によって典型的に達成される。Ｆｍｏｃ保護基の除去後、何回もの洗浄が典型的に実施され、残存するピペリジンおよび（ジベンゾフルベンおよびそのピペリジン付加物などの）Ｆｍｏｃ副産物を除去する。
第一アミノ酸が、望ましい負荷因子で樹脂へカップリングされ、Ｎ末端保護基が除去された後、その後のアミノ酸は、ペプチド中間体断片を調製するために付加され得る。その後のアミノ酸は、負荷因子に関連してアミノ酸の化学量論的過剰で利用され得る。しかしながら、本明細書に記載の特異的なＴ−２０中間体断片の固相合成が、これらの断片の固相合成において使用されるアミノ酸（および相当の試薬）の大過剰量を必要としないことがわかってきた。一般に、カップリング段階において使用されるアミノ酸の量は、樹脂上で第一アミノ酸の負荷因子と少なくとも等価である（１当量以上）。好ましくは、カップリング段階において使用されるアミノ酸の量は、１．３当量（０．３過剰）以上、最も好ましくは約１．５当量（０．５過剰）である。いくつかの場合、例えば、カップリング段階は、１〜１．５（１より大きく１．５より小さい）範囲でアミノ酸の等価の量を利用する。
アミノ酸のこの過剰量（例、約１．５）が完了に至るためのカップリング反応に十分であることがわかってきた。この過剰量は、脱保護試薬から反応許容過剰塩基を助けもし得る。
カップリング、洗浄、Ｎ末端脱保護基の脱保護、および洗浄の段階は、望ましいＴ−２０中間体生成物が形成されるまで反復され得る。
固相合成の後、Ｔ−２０中間体ペプチドを樹脂から除去するため、開裂したＴ−２０中間体ペプチドがなおも、十分な側鎖および末端保護基を有するような方法で、開裂処理を実施する。しかるべき位置に保護基を放置することは、開裂中または開裂後のペプチド断片の望ましくないカップリングまたは他の望ましくない反応を防止するのを助ける。ＦＭＯＣまたは同様の化学物質がペプチドを合成するのに使用される場合、保護された開裂は、樹脂も膨潤し得、開裂および分離工程に有用であり得るＤＣＭなどの溶媒中の酢酸または希ＴＦＡなどの比較的弱酸性の試薬を使用することなどによるいずれかの望ましい様式で達成され得る。ＤＣＭ中の０．５〜１０重量％、好ましくは１〜３重量％のＴＦＡの使用が好ましい。例えば、米国特許第６，２８１，３３５号を参照してほしい。
固相樹脂からのペプチド中間体断片の開裂の段階は、次のような典型的な工程のラインに沿って進行し得る。しかしながら、樹脂からペプチド中間体断片を効率よく開裂させるいずれかの適切な工程が使用され得る。例えば、酸性開裂試薬を含有する溶媒の約５〜２０容積、好ましくは約１０容積が、容器へ添加される。樹脂ビーズは、結果として試薬中に浸漬される。開裂反応は、液体含有量が、適切な温度で適切な時間撹拌されるよう生じる。撹拌は、ビーズが凝集するのを防止するのを助ける。適切な時間および温度の条件は、使用される酸試薬、ペプチドの性質、樹脂の性質等などの因子に依存するであろう。一般的なガイドラインとして、約−１５〜約５℃、好ましくは約−１０〜約０℃で５分間〜２時間、好ましくは約２５〜約４５分間撹拌することが適切であろう。開裂時間は、約１０分間〜約２時間の範囲であり得る。大規模生成について、好ましい時間は、約１５〜５０分間の範囲にある。開裂は、反応時に典型的に生じ得る反応熱を収容するような冷却した温度範囲において望ましく実施される。さらに、開裂反応のより低い温度は、ｔｒｔ基などの酸感受性側鎖保護基をこの段階での除去から保護する。
開裂処理の終了時に、反応物を急冷する。このことは、例えばピリジンまたは類似物などの適切な塩基を容器へ添加し、さらに５分間〜２時間などのさらなる時間撹拌し続けることによって達成され得る。塩基を添加し、撹拌し続けると、容器の内容物の温度が上昇する。撹拌の終了時に、容器の内容物は、約０〜約１５℃、好ましくは約５〜約１０℃の範囲の温度であり得る。
ペプチド回収の局面を改善するために、樹脂を膨潤および収縮させるなどの因子は、場合により、全般的な合成工程へと組み込められ得る。
例えば、開裂後、支持体は、場合により、結果として生じる洗浄物へと開裂ペプチドを抽出するための膨潤試薬で１回以上洗浄され得、洗浄物は、それらの洗浄からペプチドを回収できるよう回収される。例えば、ＤＣＭ中の希ＴＦＡを使用して２−ＣＴＣ樹脂からペプチドを開裂させることは、膨潤処理のすべてまたは一部をさらに構成するであろう。開裂後および膨潤処理が完了した後、支持体は、ペプチドのさらなる量が収縮洗浄から回収でき、同様に、１回以上のその後の任意の膨潤洗浄からさらなるペプチドを回収する能力を増強できる、１回以上の任意の収縮洗浄へ供され得る。さらなる膨潤処理からなるその後の任意の膨潤洗浄は、収縮処理が完了した後に実施され得る。
ＤＣＭなどの膨潤溶媒が、開裂試薬中の構成要素として使用され得るため、開裂処理は、開裂したペプチドの有意な量が液体へと抽出されるであろう第一膨潤処理も構成し得る。ＤＣＭ中のＴＦＡで膨潤されるとき、ビーズの体積は、開裂処理の開始時に最大である傾向にあろう。ビーズは、なおも膨潤されるであろうが、その体積は、ペプチドが液体へと抽出されるため低下する。
急冷後、容器の内容物は、洗浄物へと抽出されたペプチドを回収するため、空になり回収される。圧力は、フィルターを通じて容器の外へ出た液体によって運搬されるペプチド材料を含有する液体混合物に力を加えるために使用され得る。容器中に残存するビーズは、残余ＤＣＭをなおも含有するであろうし、ある程度までなおも膨潤されるであろう。残余ペプチドの有意な量は、ビーズ中にも保持される傾向があり、その後の収縮処理および膨潤処理は、残余ペプチドの有意な部分を回収するのを助ける。
オプションとして、蒸留等を介する濃縮の前に、回収された開裂試薬を水で洗浄することが望ましくあり得、通常、幾分かの濃縮が達成された後は除く。開裂後の水洗浄は、ペプチドの質を高め、それゆえある程度まで収量を高めるのに有用であると信じられている。例えば、開裂試薬中のＴＦＡまたは他の成分との接触時間の延長は、ペプチドのＨｉｓ６での脱トリチル化および／またはエステル化などによってペプチドの質を低下させ得る。水洗浄は、残余ＴＦＡおよびその副産物を除去する上で役に立つと信じられている。水洗浄／抽出処理の後、液体混合物は、蒸留装置へと転移され得、そこで混合物は、例えばＤＣＭ等を除去することによってさらに濃縮される。
開裂している混合物がペプチド回収のために容器から空になり回収された後、容器の内容物は、さらなるペプチドが抽出され得た後に回収され得る１回以上のさらなる膨潤洗浄へと供され得る。これらのさらなる膨潤洗浄も、容器を洗浄し、残余開裂試薬および副産物を除去するのを助ける。このような成分は、収縮処理による進行の前に望ましくは除去され、それにより収縮液体はそれらとは反応しないであろう。例えば、エタノールがＴＦＡと反応し得る限り、エタノールを含有する収縮液体を添加する前に、容器からＴＦＡを除去することが望ましい。典型的な膨潤洗浄処理は、約２分間〜約２時間、好ましくは約１０〜約５０分間撹拌しながら生じ得る。洗浄が実施された後、洗浄物は容器から除去された後、他の膨潤洗浄とともに蒸留容器へ添加され得る。場合により、蒸留ポットへ添加される前に、これらのさらなる膨潤洗浄は、もしあれば、不純物を除去するための水抽出処理へ供され得る。
いくつかの局面において、ペプチド中間体断片は、それらの純度を高める段階を実行することによって、例えば結晶化によって溶液相カップリングのために調製され得る。Ｔ−２０ペプチド中間体断片の１つ以上は、ペプチド中間体断片を結晶化するために、ＩＰＡおよびＤＣＭ、またはＩＰＡおよび水の混合物など、ＩＰＡを含有する溶液で処理され得る。
固相合成、樹脂からの開裂、ペプチド中間体のいずれかの洗浄または精製の後、配列
を有するペプチド中間体断片は、配列
を有するペプチド中間体断片を生じるために、フェニルアラニンアミド（Ｆ−ＮＨ２）残基と反応する。この溶液相反応は、本明細書に記載されるように、適切な溶液相反応溶液中で実施され得る。このペプチド中間体生成物は、非溶媒、例えば水中で沈殿され得、純度を改善するために洗浄される。
Ｔ−２０側鎖により保護されるペプチド中間体断片
は、配列
を有する全長のＴ−２０ペプチドを形成するため、溶液中で互いにカップリングされる。これらの中間体断片は、
ペプチド中間体断片のＮ末端が、
ペプチド断片のＣ末端へカップリングされるよう、化学的に配置する。
好ましくは、ペプチドは、ＨＰＬＣ特性に基づいた８０％以上、またはより好ましくは８２．５％、最も好ましくは８５％以上の純度レベルでカップリング反応へ供給される。本発明の方法にしたがって、低い負荷因子を利用する固相合成は、より高い純度レベルを有するＴ−２０中間体ペプチド断片を調製するための有意な局面である。
ペプチドカップリング反応は、例えば、 New Trends in Peptide Coupling Reagents; Albericio, Fernando; Chinchilla, Rafeal; Dodsworth, David J.; and Najera, Armen; Organic Preparations and Procedures International (2003), 33(3), 203- 25 303において概説される。
ペプチド中間体断片のカップリングは、ｉｎ ｓｉｔｕカップリング試薬、例えばＢＯＰ、ヘキサフルオロリン酸ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）、ＨＡＴＵ、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤＩ）、またはテトラフルオロホウ酸ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム（ＴＢＴＵ）を使用して実施され得る。他のカップリング技術は、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）およびｐ−ニトロフェノール（ＨＯＮｐ）エステルなどのあらかじめ形成された活性エステル、あらかじめ形成された対称性無水物、Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）、またはフッ化アシルおよび塩化アシルなどのハロゲン化酸を使用する。
適切なカップリング溶媒は、カップリング反応において使用され得る。使用されるカップリング溶媒が、形成されるペプチド結合のラセミ化の程度、ペプチドおよび／またはペプチド断片の可溶性、およびカップリング反応速度に影響を及ぼし得ることは理解される。
いくつかの態様において、カップリング反応は、水混和性溶媒を含む。水混和性溶媒の例は、例えば、ＤＭＳＯ、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、またはそれらの混合物を含む。
他の態様において、カップリング反応は、非水混和性溶媒を含む。典型的な非水混和性溶媒は、塩化メチレンである。これらの態様において、非水混和性溶媒は好ましくは、脱保護反応と互換性があり、例えば、非水混和性溶媒が好ましく使用される場合、脱保護反応に負の影響を及ぼさない。
ペプチド中間体断片が、Ｔ−２０ペプチドを生じるためにカップリングされた後、生成物は、側鎖保護基を除去するための脱保護段階へ供され得る。
包括的な脱保護による側鎖保護基の除去は典型的に、側鎖保護基を開裂させる酸性溶解（ａｃｉｄｏｌｙｔｉｃ）剤を含む脱保護溶液を利用する。包括的な脱保護のために普遍的に使用される酸性溶解試薬は、正味のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ＨＣｌ、ＢＦ３Ｅｔ２ＯまたはＭｅ３ＳｉＢｒなどのルイス酸、液体フッ化水素酸、臭化水素（ＨＢｒ）、トリフルオロメタン硫酸、およびそれらの組み合わせを含む。脱保護溶液は、１つ以上の適切な陽イオンスカベンジャー、例えば、ジチオスレイトール、アニソール、ｐ−クレソール、エタンジチオール、または硫化ジメチルも含む。脱保護溶液は水も含み得る。本明細書で使用されるように、脱保護組成物中に存在する試薬の量は、典型的には比で表され、個々の成分の量は、「部分重量」または「部分容積」などの「部分」における分子として表され、分母は、組成物中の総部分である。例えば、９０：５：５（重量／重量／重量）の比でＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＤＴＴを含有する脱保護溶液は、重量による９０／１００部分のＴＦＡ、重量による５／１００部分のＨ２Ｏ、重量による５／１００部分のＤＴＴを有する。
いくつかの態様において、脱保護組成物中の酸性溶解剤、好ましくはＴＦＡの量が重量による９０／１００部分よりも大きいように、脱保護反応が実施され得る。他の好ましい脱保護組成物は、重量による９３／１００部分以上の量で、または重量による９３／１００〜９５／１００部分の範囲の量で酸性溶解剤の量を含む。
Ｔ−２０ペプチドが脱保護され、最終的な形態になった後、場合により、全般的な合成スキームにおけるこの段階に存在し得る凝集したペプチドを脱凝集させる手法へ、ペプチドのバッチが供され得る。
脱凝集は、水溶性塩基中にペプチド試料を溶解した後、水溶性混合物を酸性化して塩および共溶媒のうちの少なくとも１つの存在下でペプチドを沈殿させることによって、脱凝集が実施され得る。好ましくは、塩および共溶媒の両者が、脱凝集溶液中に存在する。脱凝集は、比較的低温で（後で、最終的な望ましいｐＨへの酸性化、例えば３〜６がよりゆっくりと生じ得る、少なくとも、アルカリ媒体のｐＨが６〜７．５の範囲のｐＨへ低下する酸性化の第一段階において）ペプチドを比較的迅速に沈殿させることによって実施され得る。
脱凝集について、水性緩衝性アルカリ溶液は、水、少なくとも１つの塩、および望ましい溶解ｐＨを提供するための少なくとも１つの塩基の十分量を含む成分から一般に派生する。Ｔ−２０ペプチドおよび水性緩衝性アルカリ溶液を構成するさまざまな成分は、いずれかの順序で組み合わせられ得る。実際のあるモードにおいて、溶液は、その構成体成分から調製された後、すでに調製された溶液へペプチドが添加される。実際の別のモードにおいて、ペプチドは、塩を含み、溶解には低すぎて生じ得ないｐＨを有する水性溶液へ添加され得る。次に、溶解が生じるであろう値までｐＨを上昇させるために、塩基がこの混合物へ添加される。なおさらに別の選択肢として、塩は、溶解の前、間、および／または後に溶液へ添加され得る。だが一般に、さらに後述にあるように、ペプチドを沈殿させる方法でｐＨを低下させる前に、塩は溶液中へと組み込まれる。
溶液中のペプチドの濃度は、幅広い範囲にわたって変動し得る。一般的なガイドラインとして、溶液中のＴ−２０ペプチド濃度は、約３〜約６ｇ／Ｌの範囲にあり得る。
望ましいｐＨを提供するため、多様な１つ以上の塩基が溶液中へと組み込まれ得る。適切な塩基の代表的な例は、ＮａＯＨなどの水酸化物塩基、および重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウムあるいは炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムなどの重炭酸塩基および炭酸塩基を含む。水酸化ナトリウム、特に０．５〜１Ｎ ＮａＯＨが好ましい。ペプチドが時間の妥当な量で溶液中に溶解するであろう望ましい値へｐＨを調整するために、塩基が使用される。多くのペプチドについて、このことは、約８〜約１１の範囲の溶解ｐＨに相当する。
溶液の塩構成体は、結果として生じる沈殿したペプチドの溶解特徴を改善する。特に、より低いｐＨで水溶液中に迅速に溶解する可溶性ペプチドは、塩が適切な濃度で存在するとき、より一貫して調製される。
多様な塩は、本発明の実施において有用であろう。例は、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸アンモニウム、これらのナトリウムおよびカリウム版、これらの組み合わせなどを含む。酢酸アンモニウムが最も好ましい。
溶液中の塩の濃度は、幅広い範囲にわたって変動し得る。塩の１〜２００ｍＭ当量を使用することは、適切であろう塩濃度の範囲の一例である。実施の特異的なモードにおいて、塩、特に酢酸アンモニウムの約５〜約５０ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭ当量を使用することは、適切であることがわかってきた。
溶解温度は一般に、ペプチドが溶解する水溶液の温度を指す。溶解は、いずれかの適切な温度で生じ得る。一般に、約１０〜約３０℃、好ましくは約１０〜約２５℃、より好ましくは約１５〜約２０℃の範囲の１つ以上の温度で維持される溶液中でペプチドを溶解することが好ましいであろう。
共溶媒は、ペプチドのその後の沈殿が共溶媒の存在下で生じるよう、溶液へと好ましく組み込まれる。共溶媒は、溶解の前、間、およびまたは後で溶液へ添加され得るが、好ましくは、ペプチドの溶解後に即座に添加される。共溶媒は、ペプチドが溶解ｐＨで可溶性である１つ以上のさらなる溶媒を指す。好ましくは、ペプチドの理論的な分子量に対するペプチドの測定された分子量の比が、約２：１〜約１：１の範囲にあるときペプチドは十分に脱凝集しているので、ペプチドは、２５℃および生理学的ｐＨで可溶性である。共溶媒の例は、アセトニトリル、メタノール、これらの組み合わせ等を含む。
本発明の好ましい態様において、溶液が、共溶媒の約２〜５０容積％、好ましくは約５〜約３０容積％、およびより好ましくは約１０〜約２０容積％を含有するよう、共溶媒の十分量が添加される。
溶解後および望ましくは共溶媒の添加後、望まれる場合、ペプチドのさらなる脱凝集を促進するため、さらなる塩基を添加することによって、溶液のｐＨは場合によりさらに上昇する。次に、溶液は、望ましくは即座にろ過される。０．２ミクロンフィルターを通じての圧力ろ過が適しているであろう。ろ液は、真空下で場合により脱気された後、溶液は適切な時間寝かされ得た後、脱気工程を完了するためにさらに処理される。一般に、ペプチドが、上昇したｐＨにある（寝かし時間（aging time）だけではなく、ろ過時間、脱気時間、等も含む）総時間が、約５分間〜約６時間、より好ましくは約３０分間〜約２時間の範囲にあるよう寝かされる。寝かした後、溶液は、場合により再度ろ過され得る。
寝かした後、ペプチドが沈殿するのに効果的な条件下で、溶液のｐＨは低下し、例えば酸性化される。一般的なガイドラインとして、約３〜約６、好ましくは４〜約６の範囲の最終ｐＨが適切であり得る。
溶液のｐＨは好ましくは、１つ以上の酸を溶液へ添加することによって低下する。酸の例は、ＨＣｌ、硫酸、酢酸、シュウ酸、これらの組み合わせ等を含む。酢酸が好ましい。例えば、水溶性の５％または１０％の酢酸溶液が適していることがわかってきた。
実施のいくつかのモードにおいて、優れた溶解特性を有するペプチド生成物は、ｐＨを中間的なｐＨへのみ低下させるために比較的迅速に酸が添加される場合、さらに得られ得る。この初期の比較的迅速な酸の添加の後、最終的な望ましいｐＨへと溶液のｐＨを低下させるために、酸は、第二の比較的ゆっくりとした速度で添加される。適切な中間的ｐＨ値は、約６〜約８の範囲、より好ましくは約６．０〜約７．５の範囲であろう。望ましくは、ｐＨをまず迅速に低下させることは、約１時間未満、好ましくは３０分以下、より好ましくは１５分以下の時間で生じる。
例えば、実施のある適切なモードは、１１のｐＨでまずＴ−２０溶液のｐＨを低下させることを包含する。ｐＨを約６．０の中間的な値へ低下させるために、酸の十分量が、１０分間にわたって比較的迅速に添加される。次に、ｐＨを５．３〜５．５に低下させるため、酸が、１０〜２０分かけてよりゆっくり添加される。
混合物は望ましくは、ペプチドの沈殿を生じさせるために酸を添加する経過の間に十分混合される。一般的なガイドラインとして、混合物をあわ立たせるのを回避するのに十分な安全上の余裕を残しながら、酸を添加する間、混合物を実施上できるだけ激しく撹拌することが好ましい。
ペプチドの沈殿を生じさせる酸の添加は、いずれかの適切な温度で溶液を使用して実施され得る。ガイドラインとして、１０〜３０℃、好ましくは１５〜２５℃、最も好ましくは１６〜１８℃の範囲の温度で沈殿を実施することが適切であろう。
沈殿後、ペプチドは、望ましく単離され乾燥した後、他の成分と組み合わされ、凍結乾燥され、包装され、保存され、さらに処理され、および／またはさもなくば取り扱われる。このことは、いずれかの適切な様式で達成され得る。ある適切なアプローチにしたがって、ペプチドは、ろ過を介して回収され、適切なレベルまで最終的な塩含有量を低下させるためにアンプル水洗浄で洗浄した後、乾燥する。
ペプチドが、ろ過についての不適切な形態で沈殿する場合（例えば、沈殿物が「ゲル様」である場合）、ペプチド粒子が、粒子を「硬化させる」ために凝集する望ましい撹拌をともなう寝かし工程（aging step）へ、沈殿が供され得る。
実施の好ましいモードにおいて、この寝かし硬化処理は、冷却／加熱／冷却処理の経過において撹拌しながらペプチドを寝かすことを包含する。このことは、ペプチドの三次構造の過度の損傷をせずに、ペプチドのろ過特徴を改善する。実施の特異的なモードにおいて、処理は、好ましくは、０℃超〜約２０℃、好ましくは１０〜２０℃、より好ましくは約１６℃の範囲にある、大気温を下回る第一温度で、５分〜４８時間、好ましくは３０分〜８時間、より好ましくは３０分〜２時間、水性混合物中で粒子を寝かすことを包含した。撹拌は望ましくは、粒子が寝かしの間に十分分散することを確実にするのに使用される。
次に、混合物の温度は、適度により温かい温度に至る約２〜約３０℃だけ、好ましくは約５〜約１５℃まで上昇し、より温かい温度への移行は、約１分〜約４８時間、好ましくは５分〜８時間、より好ましくは２０分〜２時間の間にわたって、撹拌しながら生じる。好ましくは、新たな適度により温かい温度は、なおも大気温以下である。実施の特異的なモードにおいて、温度を１６℃から２１℃まで約１時間で上昇させることは、適切であることがわかった。撹拌は望ましくは、この移行の間に続行する。混合物は次に、５分〜８時間、好ましくは２０分〜４時間、より好ましくは約３時間、撹拌しながらより温かい温度で寝かされる。
この寝かし段階後、混合物の温度は、約２〜約３０℃、好ましくは約５〜約１５℃だけ低下し適度により冷たい温度に至る。より冷たい温度への移行は好ましくは、約１分〜約４８時間、好ましくは５分〜８時間、より好ましくは２０分〜４時間にわたって撹拌しながら生じる。好ましくは、新たな適度により冷たい温度は、約３℃超〜約１８℃の範囲で、より好ましくは約１０℃である。実施の特異的なモードにおいて、温度を２１℃から１０℃まで約２時間で低下させることは、適切であることがわかった。次に、混合物は、好ましくは約５分〜４８時間の間、より好ましくは約６時間、より冷たい温度でさらに寝かされる。
この寝かし処理により、ろ液からのペプチド粒子のろ過および分離が、ペプチドの二次構造を過度に変化させることなくより迅速に生じるので、沈殿した粒子のろ過特徴を改善する。
したがって、この寝かしの後、沈殿はろ過され、好ましくは、１ｐｓｉｇのＮ２などで圧力ろ過される。フィルターケーキは、望ましくは約３〜約２０℃、好ましくは５〜約１５℃の範囲で、より好ましくは約１０℃の温度などへあらかじめ冷却された水で１回以上洗浄され得る。このことは、ケーキの塩含有量を低下させるのを助ける。フィルターケーキは次に、適切な温度で１分〜４８時間、好ましくは５分〜８時間、より好ましくは約６時間の適切な時間、窒素によりケーキに窒素を通過させるなどによって、部分的にまたは完全に乾燥し得る。ほぼ大気温にある窒素を使用することは、簡便かつ適切である。ケーキは、乾燥を容易にするために周期的に混合され得る。乾燥は場合により、個別の乾燥装置の中で完了され得る。このような任意の乾燥は好ましくは、真空下で、例えば３０ｍｍＨｇ未満で、ペプチドを分解しないような適度な温度、例えば約３０℃未満の温度、好ましくは約２８℃未満の温度で生じる。
本発明の原理は、いまや次の実例となる実施例に関してさらに説明されるであろう。
実施例
次の実施例について、次の標準的な試薬および学術用語を採用する。
次の実施例について、次の標準的な試薬および学術用語を採用する。
クロラニル検査
トルエン中のクロラニルの飽和溶液の滴下をアセトン約１ｍＬへ添加することによって、クロラニル検査溶液を調製した。洗浄の滴下をクロラニル検査溶液へ添加することによって、ＮＭＰ洗浄を検査した。青色または紫色は、二級アミンの存在についての正の表示であり、Ｆｍｏｃにより脱保護された副産物および／または残余ピペリジンがなおも存在することを示す。
トルエン中のクロラニルの飽和溶液の滴下をアセトン約１ｍＬへ添加することによって、クロラニル検査溶液を調製した。洗浄の滴下をクロラニル検査溶液へ添加することによって、ＮＭＰ洗浄を検査した。青色または紫色は、二級アミンの存在についての正の表示であり、Ｆｍｏｃにより脱保護された副産物および／または残余ピペリジンがなおも存在することを示す。
ニンヒドリン（カイザー（Ｋｅｉｓｅｒ））検査
定量的なニンヒドリン検査において、樹脂２〜２０ｍｇの試料を引き抜き、ＮＭＰで洗浄した後、ＤＣＭまたはメタノールで洗浄した。エタノール中のフェノールの７６％溶液３滴、ピリジン中の０．２ｍＭ ＫＣＮ溶液６滴、およびエタノール中のニンヒドリン０．２８Ｍ溶液の３滴を試料へ添加し、試料を約１００℃で約５分間加熱ブロック中に置いた。試料を取り出し、エタノール／水溶液（９：１）で即時希釈した。青色または紫色は、遊離アミンの存在の正の表示であり、カップリング反応がまだ完了していないことを示す。正のニンヒドリン検査反応をカップリング反応の１時間後に観察した場合、カップリング反応はさらに１時間続行した。正のニンヒドリン検査反応がカップリング反応の３時間後に生じた場合、容器をドレインし、活性化されたアミノ酸および試薬の約１当量を使用して、カップリングを反復した。
定量的なニンヒドリン検査において、樹脂２〜２０ｍｇの試料を引き抜き、ＮＭＰで洗浄した後、ＤＣＭまたはメタノールで洗浄した。エタノール中のフェノールの７６％溶液３滴、ピリジン中の０．２ｍＭ ＫＣＮ溶液６滴、およびエタノール中のニンヒドリン０．２８Ｍ溶液の３滴を試料へ添加し、試料を約１００℃で約５分間加熱ブロック中に置いた。試料を取り出し、エタノール／水溶液（９：１）で即時希釈した。青色または紫色は、遊離アミンの存在の正の表示であり、カップリング反応がまだ完了していないことを示す。正のニンヒドリン検査反応をカップリング反応の１時間後に観察した場合、カップリング反応はさらに１時間続行した。正のニンヒドリン検査反応がカップリング反応の３時間後に生じた場合、容器をドレインし、活性化されたアミノ酸および試薬の約１当量を使用して、カップリングを反復した。
実施例１．
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）により負荷された２−ＣＴＣ樹脂の調製
５Ｌのペプチド反応器を窒素でパージした後、２−ＣＴＣ樹脂２００ｇおよびＤＣＭ２Ｌを入れた。樹脂−ＤＣＭ混合物を２５±２℃で３０分間撹拌した。その間、３８．０ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨ、１．４ＬのＤＭＦ、２００ｍＬのＤＣＭ、および２４．５ｇのＤＩＥＡを２Ｌフラスコへ入れた。フラスコの内容物を大気温で撹拌しし、固体を溶解した。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）により負荷された２−ＣＴＣ樹脂の調製
５Ｌのペプチド反応器を窒素でパージした後、２−ＣＴＣ樹脂２００ｇおよびＤＣＭ２Ｌを入れた。樹脂−ＤＣＭ混合物を２５±２℃で３０分間撹拌した。その間、３８．０ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨ、１．４ＬのＤＭＦ、２００ｍＬのＤＣＭ、および２４．５ｇのＤＩＥＡを２Ｌフラスコへ入れた。フラスコの内容物を大気温で撹拌しし、固体を溶解した。
ＤＣＭを反応器からドレイン（drain）した後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨを含有する混合物を反応器へ樹脂とともに入れ、窒素下で２５±２℃で２時間撹拌した。２時間後、反応器をドレインした。
樹脂上の活性部位を、ＤＩＥＡ：ＭｅＯＨ（２００：１８００ｍＬ）の混合物で末端キャッピングした。この混合物を次に、２５±２℃で１時間撹拌した。ベッドをドレインし、２ＬのＤＭＦで１回、１ＬのＤＭＦで１回、２ＬのＤＣＭで４回、および１ＬのＤＣＭで１回洗浄した。最後の洗浄は、負の紫外線検査反応を示した。
樹脂を次に、イソプロパノール（ＩＰＡ）２Ｌで２回洗浄した。樹脂を４０±２℃で一定の重量まで真空乾燥させると、２３０．１３ｇの負荷した樹脂となった。
樹脂からアミノ酸を開裂し、標準物質に対してアッセイすることによって、定量的なＨＰＬＣ分析を実施した。材料のＨＰＬＣアッセイは、０．３８ｍｍｏｌ／ｇの樹脂負荷を示した。
カラム：Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−ＣＮ、５ミクロン、３．０×２５０ｍｍ
流速：０．５ｍＬ／分
検出；２２０ｎＭでのＵＶ
移動相：Ａ：０．０１Ｍ ＴＥＡ−Ｐ
Ｂ：アセトニトリル
保持時間：約１７分
流速：０．５ｍＬ／分
検出；２２０ｎＭでのＵＶ
移動相：Ａ：０．０１Ｍ ＴＥＡ−Ｐ
Ｂ：アセトニトリル
保持時間：約１７分
実施例２．
Ｔ−２０中間体断片Ａｃ−ＡＡ（１−１７）ＯＨ（配列番号２）の固相合成
Ｔ−２０中間体断片Ａｃ−ＡＡ（１−１７）ＯＨ（配列番号２）の固相合成
を生じるための固相合成を実施した。
実施例１に記載されるようなＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｏ−２−ＣＴＣ樹脂（２０．０ｇ）を固相合成反応器へ、ＤＣＭ２００ｍＬとともに入れた。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌した。チャンバーをドレインし、樹脂ベッドをＮＭＰ１００ｍＬで３回洗浄した。（すべての洗浄について、使用される液体の量は、洗浄１回あたりの液体の量である。）
反応器へ入れたのは、ＮＭＰ中の２０％ピペリジンの１００ｍＬであり、その後、３０±３℃で３０分間撹拌した。反応器をドレインした後、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬを入れた。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器をドレインした。
カップリングの順序は、残基＃１６から残基＃１へと進行した。すなわち
であった。
（残基＃１６）次に、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＯＨ９．８１ｇ、２．４８ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．３３ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。内容物を大気温で撹拌して固体を溶解した後、それを１０℃へ冷却した。
次に、６．０８ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを分離フラスコへ入れた。混合物を大気温で撹拌し、固体を溶解した後、１０℃へ冷却した。次に、冷却したＨＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＯＨ溶液へ添加し、混合物を固相反応器へ入れた。次に、フラスコをＤＣＭ４０ｍＬで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へ入れた。混合物を３０±３℃で３時間撹拌した。次に、樹脂ビーズを反応の完了についてカイザー検査によってサンプリングした。反応が完了した後、反応器をドレインし、樹脂ベッドを１００ｍＬのＮＭＰで洗浄した。
次に、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１０ｍＬを反応器へ入れた後、それを３０±３℃で３０分間撹拌した。反応器をドレインし、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬを添加した。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌した後、反応器をドレインした。次に、樹脂ベッドを１００ｍＬのＮＭＰで４回洗浄した。次に、最後の洗浄物をピペリジンレベルについて、定量的ニンヒドリン検査によりサンプリングした。
（残基＃１５）次に、９．８４ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＯＨ、２．４９ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．３２ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階で示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
次に、６．１４ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを分離フラスコへ入れた。第一段階で示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃１４）次に、８．１９ｇのＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）ＯＨ、２．１３ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．０９ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。内容物を溶解し、第一段階において示されるように冷却した。
分離フラスコにおいて、５．１８ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを添加した。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃１３）次に、８．４２ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＯＨ、２．２０ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．０８ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、５．１８ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃１２）次に、５．２３ｇのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）ＯＨ、２．１２ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．０７ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し冷却した。
分離フラスコにおいて、５．２０ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃１１）次に、５．８６ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨ、２．１５ｇのＨＯＢＴ一水和物、１．９９ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し冷却した。
分離フラスコにおいて、５．２１ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃１０）次に、５．８５ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨ、２．１６ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．０４ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し冷却した。
分離フラスコにおいて、５．１７ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃９）次に、４．８５ｇのＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、２．１６ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．０４ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し冷却した。
分離フラスコにおいて、５．２２ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃８）次に、４．８７ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２．１４ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．０４ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、５．２２ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃７）次に、５．２８ｇのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、２．１４ｇのＨＯＢＴ一水和物、１．９８ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、５．２１ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃６）次に、１０．０５ｇのＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、２．５４ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．３３ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、６．１２ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃５）次に、５．７２ｇのＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、２．５３ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．３３ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、６．１１ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃４）次に、５．７２ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２．５２ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．２９ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、６．１５ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃３）次に、６．２１ｇのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、２．５４ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．２９ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、６．１５ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃２）次に、６．４０ｇのＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、２．５２ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．２９ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、６．１３ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃１）次に、７．５１ｇのＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、２．５５ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．２９ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、６．１３ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
次に、４．１０ｇの無水酢酸、５．２０ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。溶液を混合し、１０℃へ冷却した。冷却した無水酢酸溶液をＳＰＰＳ反応器へ入れ、フラスコを４０ｍＬのＮＭＰですすぎ、反応器へ添加した。次に、混合物を３０±３℃で１時間撹拌した。次に、樹脂ビーズを反応の完了についてカイザー検査によってサンプリングした。一度反応が完了すると、反応器をＮＭＰ１００ｍＬで４回洗浄してドレインした。次に、樹脂ベッドを２００ｍＬのＤＣＭで４回、イソプロパノール１００ｍＬで４回洗浄した。次に、樹脂を４０±２℃で乾燥させた。
固相合成後のペプチドの収量は、５１．７４ｇであった。
実施例３．
固相樹脂からのＡｃ−ＡＡ（１−１７）ＯＨ（配列番号２）の開裂および精製
実施例２において調製されるような、ＣＴＣ樹脂からの新生Ａｃ−ＡＡ（１−１７）ＯＨペプチドの開裂を実施した。
固相樹脂からのＡｃ−ＡＡ（１−１７）ＯＨ（配列番号２）の開裂および精製
実施例２において調製されるような、ＣＴＣ樹脂からの新生Ａｃ−ＡＡ（１−１７）ＯＨペプチドの開裂を実施した。
樹脂からペプチドを開裂させるため、ペプチドのカップリングした樹脂２９．９０ｇを反応器中の１２０ｍＬのＤＣＭと組み合わせた。樹脂およびＤＣＭを大気温で約５分間撹拌した。次に、反応器をドレインし、ＤＣＭ洗浄をもう１回反復した。（すべての洗浄について、使用される液体の量は、洗浄１回あたりの液体の量である。）次に、反応器を−１０±５℃へ冷却した。
次に、４．３９ｇのトリフルオロ酢酸および１１８ｍＬのＤＣＭの溶液を調製し、０±５℃へ冷却した。
次に、冷却したＴＦＡ溶液を反応器へ入れ、スラリーを０±５℃で３０分間撹拌した。次に、４．０８ｇのピリジンを反応器へ添加し、０±５℃でさらに５分間撹拌した。次に、反応器をドレインし、樹脂ベッドを大気温で１００ｍＬのＤＣＭにより７回洗浄した。次に、樹脂ベッドを１００ｍＬのイソプロパノール、１００ｍＬのＤＣＭ、および１００ｍＬのイソプロパノールで洗浄した。次に、ＤＣＭ溶液を約１００ｍＬ容積まで濃縮し、１００ｍＬの水で洗浄した。次に、ＤＣＭ溶液を約２３ｍＬ容積まで濃縮した後、２７０ｍＬのイソプロパノールを添加した。ＤＣＭレベルが１％未満になるまで、ＤＣＭを蒸留した。次に、溶液を１０±５℃へ冷却した。生成物をろ過し、０℃のイソプロパノール（２３ｍＬ）で洗浄し、４０±２℃で真空乾燥すると、生成物１６．９４ｇ（９８％）を生じた。
実施例４．
ＦｍｏｃＴｒｐ（Ｂｏｃ）の負荷された２−ＣＴＣ樹脂の調製
５Ｌのペプチド反応器を窒素でパージした後、２−ＣＴＣ樹脂２００ｇおよびＤＣＭ２Ｌを入れた。樹脂−ＤＣＭ混合物を２５±２℃で３０分間撹拌した。その間、５１．８ｇのＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）ＯＨ、１．４ＬのＤＭＦ、２００ｍＬのＤＣＭ、および２６．６６ｇのＤＩＥＡを２Ｌフラスコへ入れた。フラスコの内容物を大気温で、固体を溶解するまで撹拌した。
ＦｍｏｃＴｒｐ（Ｂｏｃ）の負荷された２−ＣＴＣ樹脂の調製
５Ｌのペプチド反応器を窒素でパージした後、２−ＣＴＣ樹脂２００ｇおよびＤＣＭ２Ｌを入れた。樹脂−ＤＣＭ混合物を２５±２℃で３０分間撹拌した。その間、５１．８ｇのＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）ＯＨ、１．４ＬのＤＭＦ、２００ｍＬのＤＣＭ、および２６．６６ｇのＤＩＥＡを２Ｌフラスコへ入れた。フラスコの内容物を大気温で、固体を溶解するまで撹拌した。
ＤＣＭを反応器からドレインした後、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）ＯＨを含有する混合物を反応器へ樹脂とともに入れ、２５±２℃で窒素下で２時間撹拌した。２時間後、反応器をドレインした。
樹脂上の活性部位をＤＩＥＡ：ＭｅＯＨ（２００：１８００ｍＬ）の混合物で末端キャッピングした。次に、この混合物を２５±２℃で１時間撹拌した。ベッドをドレインし、２ＬのＤＭＦで１回、１ＬのＤＭＦで１回、２ＬのＤＣＭで４回洗浄した。最後の２ＬのＤＣＭ洗浄は、負のＵＶ検査反応を示した。
次に、樹脂をＮ−メチル−ピロリドン（ＮＭＰ）２Ｌで３回洗浄した後、２８±２℃で３０分間撹拌しながら、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン２．７５Ｌで処理した。次に、反応器をドレインし、ピペリジン処理段階を反復した。ベッドをドレインし、３ＬのＮＭＰで５回の洗浄後、３ＬのＤＭＦで５回洗浄した。３×１．５ＬのＩＰＡで洗浄することによって、樹脂を脱膨潤した。樹脂を４０±２℃で一定重量まで真空乾燥すると、２２０．０６ｇの負荷した樹脂となった。
アミノ酸を樹脂から開裂し、標準物質に対してアッセイすることによって、定量的ＨＰＬＣ分析を実施した。材料のＨＰＬＣアッセイは、０．３７ｍｍｏｌ／ｇの樹脂負荷を示した。
カラム：Ｂｅｔａｂａｓｉｃ−１８、１５０×４．６ｍｍ、３μｍ粒子サイズ、１５０Å孔サイズ
流速：１．２５ｍＬ／分
検出：２６０ｎＭでのＵＶ
移動相：Ａ：１０ｎＭのＴＥＡＰ水溶液
Ｂ：アセトニトリル
保持時間：約１３分
流速：１．２５ｍＬ／分
検出：２６０ｎＭでのＵＶ
移動相：Ａ：１０ｎＭのＴＥＡＰ水溶液
Ｂ：アセトニトリル
保持時間：約１３分
実施例５．
Ｔ−２０中間体断片Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１８−３５）ＯＨ（配列番号３）の固相合成、開裂、および精製
Ｔ−２０中間体断片Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１８−３５）ＯＨ（配列番号３）の固相合成、開裂、および精製
を生じるための固相合成を実施した。
Ｈ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｏ−２−ＣＴＣ樹脂（１５．０ｇ、実施例４において調製されるのと同様）および１８０ｍＬのＤＣＭを固相反応チャンバーの中で組み合わせた。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌した。次に、反応器をドレインし、樹脂ベッドを９０ｍＬのＮＭＰで３回洗浄した。（すべての洗浄について、使用される液体の量は、洗浄１回あたりの液体の量である。）
カップリングの順序は、残基＃３４から残基＃１８へと進行した（成熟Ｔ−２０配列のアミノ酸番号を参照）。
（残基＃３４）次に、８．６０ｇのＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）ＯＨ、２．２２ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．２２ｇのＤＩＥＡ、および６７．５ｍＬのＮＭＰをフラスコの中で組み合わせ、内容物を大気温で撹拌して固体を溶解した後、溶液を１０℃へ冷却した。
次に、分離フラスコにおいて、５．５１ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせ、大気温で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却した。冷却したＨＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）ＯＨ溶液へ添加し、この溶液をＳＰＰＳ反応器へ入れた。フラスコを３６ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へ入れた。次に、混合物を３０±３℃で３時間撹拌した。次に、樹脂ビーズを反応の完了についてサンプリングした（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器をドレインし、樹脂ベッドを９０ｍＬのＮＭＰで洗浄した。
次に、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン９０ｍＬを反応器へ入れ、３０±３℃で３０分間撹拌した。反応器をドレインした後、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン９０ｍＬを反応器へ添加した。次に、混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器をドレインした。次に、樹脂ベッドを９０ｍＬのＮＭＰで３回洗浄した。最後の洗浄物をピペリジンレベルについて定量的ニンヒドリン検査によってサンプリングした。
（残基＃３３）次に、７．５８ｇのＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）ＯＨ、２．２５ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．２３ｇのＤＩＥＡ、および６７．５ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、５．４８ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃３２）次に、５．１０ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２．２５ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．２３ｇのＤＩＥＡ、および６７．５ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、５．４８ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃３１）次に、５．５９ｇのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、２．２２ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．１９ｇのＤＩＥＡ、および６７．５ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、５．５０ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃３０）次に、４．４７ｇのＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、２．２６ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．２１ｇのＤＩＥＡ、および６７．５ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、５．４９ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃２９）次に、７．６４ｇのＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、２．２５ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．１７ｇのＤＩＥＡ、および６７．５ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、５．４７ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃２８）次に、６．８０ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、２．２４ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．２１ｇのＤＩＥＡ、および６７．５ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、５．４６ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃２７）次に、６．０２ｇのＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、２．２４ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．１７ｇのＤＩＥＡ、および６７．５ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、５．４６ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃２６）次に、５．１０ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２．２７ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．１９ｇのＤＩＥＡ、および６７．５ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、５．５４ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃２５）次に、６．２０ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、２．２７ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．１９ｇのＤＩＥＡ、および６７．５ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、５．５４ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃２４）次に、５．１２ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２．２５ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．１８ｇのＤＩＥＡ、および６７．５ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、５．５０ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃２３）次に、５．１２ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２．２５ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．１７ｇのＤＩＥＡ、および６７．５ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、５．５０ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃２２）次に、６．２３ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、２．２５ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．１９ｇのＤＩＥＡ、および６７．５ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、５．５１ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃２１）次に、８．８４ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−ＯＨ、２．２５ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．２５ｇのＤＩＥＡ、および６７．５ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、５．５３ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。アッセイした時、カイザー検査は、反応が不完全であることを示した。反応器をドレインし、試薬の５０％を使用して１．５時間再カップリングすることによって、再カップリングを実施した。一度カップリング反応が完了すると、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃２０）次に、８．２１ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、３．０３ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．８７ｇのＤＩＥＡ、および６７．５ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、７．３０ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。カップリング段階後、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃１９）次に、１１．５０ｇのＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、３．０７ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．９３ｇのＤＩＥＡ、および６７．５ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、７．３０ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、カップリングし、検査し、洗浄した。アッセイした時、カイザー検査は、反応が不完全であることを示した。反応器をドレインし、試薬の５０％を使用して２．２５時間再カップリングすることによって、再カップリングを実施した。一度カップリング反応が完了すると、第一段階において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、検査した。
（残基＃１８）次に、９．００ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、３．０７ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．９３ｇのＤＩＥＡ、および６７．５ｍＬのＮＭＰをフラスコへ入れた。第一段階において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
分離フラスコにおいて、７．３０ｇのＨＢＴＵおよび４０ｍＬのＮＭＰを組み合わせ、大気温で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却した。冷却したＨＢＴＵ溶液を、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ溶液へ添加し、混合物をＳＰＰＳ反応器へ入れた。フラスコを３６ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へ入れた。次に、混合物を３０±３℃で３時間撹拌した。次に、樹脂ビーズを反応の完了についてカイザー検査により検査した。一度反応が完了すると、反応器をドレインし、樹脂ベッドを９０ｍＬのＮＭＰで３回洗浄した。次に、樹脂ベッドを９０ｍＬのＤＣＭで５回、９０ｍＬのイソプロパノールで４回洗浄した。次に、樹脂を４０±２℃で真空乾燥すると、生成物４７．１３ｇを生じた。
実施例６．
固相樹脂からのＦｍｏｃ−ＡＡ（１８−３５）ＯＨ（配列番号３）の開裂および精製
実施例５において調製されるように、ＣＴＣ樹脂からの新生Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１８−３５）ＯＨペプチドの開裂を実施した。ペプチドを樹脂から開裂させるため、ペプチドのカップリングした樹脂２０．１５ｇを反応器中で９０ｍＬのＤＣＭと組み合わせた。樹脂およびＤＣＭを大気温で約５分間撹拌した。次に、反応器をドレインし、ＤＣＭ洗浄を２回以上反復した。（すべての洗浄について、使用される液体の量は、洗浄１回あたりの液体の量である。）次に、反応器を−１０±５℃へ冷却した。
固相樹脂からのＦｍｏｃ−ＡＡ（１８−３５）ＯＨ（配列番号３）の開裂および精製
実施例５において調製されるように、ＣＴＣ樹脂からの新生Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１８−３５）ＯＨペプチドの開裂を実施した。ペプチドを樹脂から開裂させるため、ペプチドのカップリングした樹脂２０．１５ｇを反応器中で９０ｍＬのＤＣＭと組み合わせた。樹脂およびＤＣＭを大気温で約５分間撹拌した。次に、反応器をドレインし、ＤＣＭ洗浄を２回以上反復した。（すべての洗浄について、使用される液体の量は、洗浄１回あたりの液体の量である。）次に、反応器を−１０±５℃へ冷却した。
次に、２．２８ｇのトリフルオロ酢酸および７５．４ｍＬのＤＣＭの溶液を調製し、０±５℃へ冷却した。
次に、冷却したＴＦＡ溶液を反応器へ入れ、スラリーを０±５℃で３０分間撹拌した。次に、２．１３ｇのピリジンを反応器へ添加し、０±５℃でさらに５分間撹拌した。次に、反応器をドレインし、大気温で樹脂ベッドを９０ｍＬのＤＣＭで６回洗浄した。
次に、樹脂ベッドを９８ｍＬのイソプロパノール、９０ｍＬのＤＣＭで、および９８ｍＬのイソプロパノールで２回洗浄した。ＤＣＭ溶液を約１００ｍＬ容積まで濃縮した後、１００ｍＬの水で洗浄した。次に、ＤＣＭ溶液を約２５ｍＬ容積まで濃縮し、１０℃へ冷却した後、９０ｍＬの水を添加した。スラリーを０℃へ冷却し、１時間寝かせた。生成物をろ過紙、２５ｍＬの５℃水で洗浄した。次に、生成物を４０±２℃で真空乾燥させると、１４．６３ｇ（８８．９％）を生じた。
実施例７．
Ｈ−ＡＡ（１８−３６）ＮＨ２（配列番号４）の溶液相合成
ＰｈｅＮＨ２をＦｍｏｃ−ＡＡ（１８−３５）ＯＨへ溶液相カップリングすることによって、Ｔ−２０中間体断片Ｈ−ＡＡ（１８−３６）ＮＨ２を調製した。
Ｈ−ＡＡ（１８−３６）ＮＨ２（配列番号４）の溶液相合成
ＰｈｅＮＨ２をＦｍｏｃ−ＡＡ（１８−３５）ＯＨへ溶液相カップリングすることによって、Ｔ−２０中間体断片Ｈ−ＡＡ（１８−３６）ＮＨ２を調製した。
実施例６に記載されるようなＦｍｏｃ−ＡＡ（１８−３５）ＯＨ（１２．０ｇ、２．８３ｍｍｏｌ、１．０当量）、ＰｈｅＮＨ２−ＨＣｌ（０．７４ｇ、３．６８ｍｍｏｌ、１．３当量）、および６−クロロＨＯＢＴ（０．９６ｇ、５．６６ｍｍｏｌ、２．０当量）をＤＭＦ（１００ｍＬ、８．３容積）中に溶解した。溶液を−１０℃へ冷却し、ＤＭＦ（５ｍＬ、３．６容積）中のＤＩＥＡ（１．４ｍＬ、７．９２ｍｍｏｌ、２．８当量）を添加した。ＴＢＴＵ（１．２ｇ、３．６８ｍｍｏｌ、１．３当量）を一部添加した後、ＤＭＦ（１５ｍＬ）ですすいだ。反応混合物を−１０℃で一晩撹拌し、大気温へ加温した。撹拌をさらに４時間続行した。０．４％の出発物質Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１８−３５）ＯＨが残存していることを示すＨＰＬＣ分析により、反応の完了をモニターした。ピペリジン（１．２３ｍＬ、１４．４３ｍｍｏｌ、５．１当量）を添加し、溶液を３０℃で３時間撹拌した。Ｆｍｏｃの除去の完了を、＜１％のＦｍｏｃ−ＡＡ（１８−３６）ＮＨ２を示すＨＰＬＣ分析によりモニターした。水（１００ｍＬ、８．３容積）を添加して生成物を沈殿した。固体を吸引ろ過により回収し、水で洗浄した。大気温で一晩乾燥させると、１１．８５ｇを生じた（１０１％ＡＮ ＨＰＬＣ）。
次に、Ｈ−ＡＡ（１８−３６）ＮＨ２に関して、再度の作業の手法を実施した。Ｈ−ＡＡ（１８−３６）ＮＨ２（１１．８５ｇ）をＥｔＯＨ：水（２００ｍＬ、１７容積）中に懸濁した。スラリーを大気温で２時間撹拌した。吸引ろ過および一定重量への乾燥は、８０．０％の純度（ＡＮ ＨＰＬＣ）を有する１１．６ｇを提供した（両段階に対して９８．９％の収率）。次のＨＰＬＣ装置および因子を使用して、生成物を分析した。
カラム：Ｚｏｒｂａｘ−ＡＣＥ、３μｍ、Ｃ１８、３．０×１００ｍｍ
検出器：２２０ｎｍでのＵＶ
流速：０．６ｍＬ／分
移動相：Ａ＝０．１０％ＴＦＡ／水／４０％ＩＰＡ
Ｂ＝０．０７％ＴＦＡ／アセトニトリル／４０％ＩＰＡ
勾配：０分７０％Ｂ、８分８０％Ｂ、１５〜１６分９０％Ｂ、１６．１〜２０分７０％Ｂ
保持時間：約８分
検出器：２２０ｎｍでのＵＶ
流速：０．６ｍＬ／分
移動相：Ａ＝０．１０％ＴＦＡ／水／４０％ＩＰＡ
Ｂ＝０．０７％ＴＦＡ／アセトニトリル／４０％ＩＰＡ
勾配：０分７０％Ｂ、８分８０％Ｂ、１５〜１６分９０％Ｂ、１６．１〜２０分７０％Ｂ
保持時間：約８分
実施例８．
Ａｃ−ＡＡ（１−３６）ＮＨ２（配列番号１）の溶液相合成
Ｔ−２０最終生成物をＡｃ−ＡＡ（１−１７）ＯＨとＨ−ＡＡ（１８−３６）ＮＨ２との溶液相カップリングにより調製し、断片Ａｃ−ＡＡ（１−３６）ＮＨ２（配列番号１）を生じた。
Ａｃ−ＡＡ（１−３６）ＮＨ２（配列番号１）の溶液相合成
Ｔ−２０最終生成物をＡｃ−ＡＡ（１−１７）ＯＨとＨ−ＡＡ（１８−３６）ＮＨ２との溶液相カップリングにより調製し、断片Ａｃ−ＡＡ（１−３６）ＮＨ２（配列番号１）を生じた。
Ｈ−ＡＡ（１８−３６）ＮＨ２（２．０ｇ、０．５ｍｍｏｌ、１当量）、Ａｃ−ＡＡ（１−１７）ＯＨ（１．８７ｇ、０．５ｍｍｏｌ、１当量）、および６−クロロＨＯＢＴ（０．１３ｇ、０．７６ｍｍｏｌ、１．５当量）をＤＭＦに溶解した（４０ｍＬ、２０容積、３０分）。溶液を０±５℃へ冷却し、ＤＩＥＡ（０．１２ｇ、０．９５ｍｍｏｌ、１．８５当量）、その後にＨＢＴＵ（０．２３ｇ、０．６ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加した。０℃で一晩撹拌した後、水（５０ｍＬ）を滴下して添加した。結果として生じるスラリーを大気温で３〜４時間撹拌し、生成物を吸引ろ過により単離した。真空オーブンの中で４５℃で一晩乾燥させると、６３．５％の純度（ＡＮ ＨＰＬＣ）を有するＡｃ−ＡＡ（１−３６）ＮＨ２の３．７５ｇ（９８．２％）となった。次のＨＰＬＣ装置および因子を使用して、生成物を分析した。
カラム：Ｚｏｒｂａｘ−ＡＣＥ、３μｍ、Ｃ１８、３．０×１００ｍｍ
検出器：２２０ｎｍでのＵＶ
流速：０．６ｍＬ／分
移動相：Ａ＝０．１０％ＴＦＡ／水／４０％ＩＰＡ
Ｂ＝０．０７％ＴＦＡ／アセトニトリル／４０％ＩＰＡ
勾配：０分７０％Ｂ、８分８０％Ｂ、１５〜１６分９０％Ｂ、１６．１〜２０分７０％Ｂ
保持時間：約１５分
検出器：２２０ｎｍでのＵＶ
流速：０．６ｍＬ／分
移動相：Ａ＝０．１０％ＴＦＡ／水／４０％ＩＰＡ
Ｂ＝０．０７％ＴＦＡ／アセトニトリル／４０％ＩＰＡ
勾配：０分７０％Ｂ、８分８０％Ｂ、１５〜１６分９０％Ｂ、１６．１〜２０分７０％Ｂ
保持時間：約１５分
Claims (1)
- （ａ）固体支持体上で合成された、配列
（ｂ）溶液中で、
（ｃ）溶液中で、
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