CN1236010A - 使植物产生杂草防治化合物耐受性的方法 - Google Patents

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Abstract

通过将一种可编码一种蛋白质的基因引入植物细胞并且表达该基因而产生耐杂草防治化合物的植物,所述的蛋白质具有至少下列(a)至(c)特征:(a)对可导致杂草防治化合物的杂草防治活性的物质具有特异性亲和性;(b)对与所述蛋白质有特异性亲合性的物质不具有修饰能力;(c)基本上不含免疫球蛋白中可变区的构架区。

Description

使植物产生杂草防治化合物耐受性的方法
本发明涉及一种用于使植物产生杂草防治化合物耐受性的方法。
杂草防治对于提高栽培的植物产量和质量来说是一项很重要的工作。对于这一目的来说，主要使用杂草防治化合物、诸如除草剂。然而，对于使用杂草防治化合物来说，将栽培植物与相关来源的物种区别开来以便仅能有选择地控制杂草并不总是容易的。已经尝试生产对杂草防治化合物具有耐受性(下文称作耐杂草防治化合物)作用的植物并且某些耐受性植物已经得到了实际应用。
近来，已经将基因工程技术用于生产具有耐杂草防治化合物作用的植物。作为这样一种技术，例如Hinchee,M.A.W.等公开了一种用于生产具有耐除草剂(草甘膦)作用的植物的方法，其中将作为草甘膦的耙酶的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因进行诱变以便降低对草甘膦的亲和性、并将该基因引入植物[Hinchee，M.A.W.等，《生物/技术》(BIO/TECHNOLOGY),6:p915(1988)]。
使植物产生耐杂草防治化合物作用的各种不同的公知方法不一定能满足需要且已经需要开发另外的用于使植物产生耐杂草防治化合物作用的各类方法。
本发明的主要目的是提供一种使植物产生耐杂草防治化合物作用的新型方法。
从下面的描述并参照附图可以清楚地理解这一目的以及其它目的和本发明的优点，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
附图1是质粒pETBCH的限制图。bchH是光合细菌类球红细菌(Rhodobactore sphaeroides)的镁螯合酶原卟啉Ⅸ结合亚单位基因。T7pro代表T7噬菌体的启动子序列，且T7ter代表T7噬菌体的终止子序列。Ampr是耐氨苄青霉素基因，lacⅠq是乳糖操纵子的阻抑蛋白基因，且ori是复制起点。
附图2是质粒pACYCSP的限制图。PPO是大豆的原卟啉原Ⅸ氧化酶基因且lac pro代表乳糖操纵子的启动子序列。Cmr是耐氯霉素基因且ori是复制起点。
附图3是质粒pTVBCH的限制图。bchH是光合细菌类球红细菌(Rhodobactore sphaeroides)的镁螯合酶原卟啉Ⅸ结合亚单位基因。lac pro代表乳糖操纵子的启动子序列。Ampr是耐氨苄青霉素基因且ori是复制起点。
附图4是质粒pBIBCH的限制图。bchH是光合细菌类球红细菌(Rhodobactore sphaeroides)的镁螯合酶原卟啉Ⅸ结合亚单位基因。NP是胭脂氨酸合酶基因的启动子序列，NT是胭脂氨酸合酶基因的终止子序列，且35S是花椰菜花叶病毒的35S启动子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分别代表T-DNA的右和左的边缘序列。
附图5是质粒pNO的限制图。NP是胭脂氨酸合酶基因的启动子序列，NT是胭脂氨酸合酶基因的终止子序列，且35S是花椰菜花叶病毒的35S启动子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分别代表T-DNA的右和左的边缘序列。
附图6是质粒pTCHLH的限制图。TCHLH是叶绿体转运信号已经缺失烟草镁螯合酶的原卟啉Ⅸ结合亚单位基因。lac pro代表乳糖操纵子的启动子序列。Amr是耐氨苄青霉素基因，Kmr耐卡那霉素基因且ori是复制起点。
附图7是质粒pBITCHLH的限制图。TCHLH是叶绿体转运信号已经缺失的烟草镁螯合酶的原卟啉Ⅸ结合亚单位基因。NP是胭脂氨酸合酶的启动子序列，NT是胭脂氨酸合酶的终止子序列，且35S是花椰菜花叶病毒的35S启动子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分别代表T-DNA的右和左的边缘序列。
附图8是质粒pTVGMP的限制图。GMP是叶绿体转运信号和FAD结合序列已经缺失的大豆原卟啉原Ⅸ氧化酶基因。lac pro代表乳糖操纵子的启动子序列。Ampr是耐氨苄青霉素基因且ori是复制起点。
附图9是质粒pBIGMP的限制图。GMP是叶绿体转运信号和FAD结合序列已经缺失的大豆原卟啉原氧化酶基因。NP是胭脂氨酸合酶的启动子序列，NT是胭脂氨酸合酶的终止子序列，且35S是花椰菜花叶病毒的35S启动子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分别代表T-DNA的右和左的边缘序列。
附图10是质粒pTVCRP的限制图。CRP是叶绿体转运信号和FAD结合序列已经缺失的Chlamydomonas reinhardtii的原卟啉原氧化酶基因。lac pro代表乳糖操纵子的启动子序列。Ampr是耐氨苄青霉素基因且ori是复制起点。
附图11是质粒pBICRP的限制图。CRP是叶绿体转运信号和FAD结合序列已经缺失的Chlamydomonas reinhardtii的原卟啉原氧化酶基因。NP是胭脂氨酸合酶的启动子序列，NT是胭脂氨酸合酶的终止子序列，且35S是花椰菜花叶病毒的35S启动子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分别代表T-DNA的右和左的边缘序列。
附图12是质粒pTVHVF1的限制图。HVF是信号序列已经缺失的大麦铁螯合酶基因。lac pro代表乳糖操纵子的启动子序列。Ampr是耐氨苄青霉素基因且ori是复制起点。
附图13是质粒pBIHVF的限制图。HVF是信号序列已经缺失的大麦铁螯合酶基因。NP是胭脂氨酸合酶的启动子序列，NT是胭脂氨酸合酶的终止子序列，且35S是花椰菜花叶病毒的35S启动子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分别代表T-DNA的右和左的边缘序列。
附图14是质粒pTVCSF的限制图。CSF是信号序列已经缺失的黄瓜铁螯合酶基因。lac pro代表乳糖操纵子的启动子序列。Ampr是耐氨苄青霉素基因且ori是复制起点。
附图15是质粒pBICSF的限制图。CSF是信号序列已经缺失的黄瓜铁螯合酶基因。NP是胭脂氨酸合酶的启动子序列，NT是胭脂氨酸合酶的终止子序列，且35S是花椰菜花叶病毒的35S启动子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分别代表T-DNA的右和左的边缘序列。
附图16是质粒pHEMF的限制图。HEMF是大肠杆菌的粪卟啉原(coproporphyrinogene)Ⅲ氧化酶基因hemF。lac pro代表乳糖操纵子的启动子序列。Ampr是耐氨苄青霉素基因且ori是复制起点。
附图17是质粒pBIHEMF的限制图。HEMF是大肠杆菌的粪卟啉原(coprophyrinogen)Ⅲ氧化酶基因hemF。NP是胭脂氨酸合酶的启动子序列，NT是胭脂氨酸合酶的终止子序列，且35S是花椰菜花叶病毒的35S启动子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分别代表T-DNA的右和左的边缘序列。
附图18是质粒pBIHASYS8的限制图。HASYS8是编码MG(HASYS)8蛋白质的基因。NP是胭脂氨酸合酶的启动子序列，NT是胭脂氨酸合酶的终止子序列，且35S是花椰菜花叶病毒的35S启动子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分别代表T-DNA的右和左的边缘序列。
附图19是质粒pBIRASSL8的限制图。RASSL8是可编码MG(RASSL)8蛋白质的基因(RASSL8 is MG(RASSL)8protein.)。NP是胭脂氨酸合酶的启动子序列，NT是胭脂氨酸合酶的终止子序列，且35S是花椰菜花叶病毒的35S启动子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分别代表T-DNA的右和左的边缘序列。
在这些情况下，本发明者已经进行了集中研究以便开发一种使植物产生杂草防治化合物耐受性的新型方法。结果发现：通过使植物在植物细胞中产生某种蛋白质而使植物产生杂草防治化合物耐受性。由此完成本发明。
即本发明提供了下列技术方案：
1．一种使植物产生杂草防治化合物耐受性的方法，包括下列步骤：
将一种可编码一种蛋白质的基因引入植物细胞，所述的蛋白质具有至少下列(a)至(c)特征：
(a)对涉及杂草防治化合物的杂草防治活性的物质具有特异性亲和性；
(b)对与所述蛋白质具有特异亲和性的物质基本不具有修饰能力
(c)基本上不含免疫球蛋白中可变区的构架区；
并且，表达该基因(以下称为本发明的第一方面)
2．根据上述1的方法，其中以这样一种方式将基因引入植物细胞、即以可操作的方式将它与均可在植物细胞中起作用的启动子和终止子进行连接。
3．根据上述1或2的方法，其中涉及杂草防治化合物的杂草防治活性的物质是杂草防治化合物自身。
4．根据上述1或2的方法，其中涉及杂草防治化合物的杂草防治活性的物质是衍生于一种植物的内源性物质。
5．根据上述1或2的方法，其中杂草防治化合物是可抑制植物卟啉的生物合成的物质。
6．根据上述1或2的方法，其中杂草防治化合物是原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物。
7．根据上述5或6的方法，其中可导致杂草防治化合物的杂草防治活性的物质是原卟啉Ⅸ。
8．根据上述5或6的方法，其中蛋白质是镁螯合酶的原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白、或对原卟啉Ⅸ具有特异性亲和性的蛋白质变体。
9．根据上述8的方法，其中蛋白质是衍生于光合微生物的镁螯合酶。
10．根据上述8的方法，其中蛋白质是衍生于一种植物的镁螯合酶。
11．根据上述8的方法，其中蛋白质是衍生于烟草的镁螯合酶。
12．根据上述5或6的方法，其中蛋白质含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列。
13．根据上述5或6的方法，其中蛋白质具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
14．根据上述5或6的方法，其中蛋白质含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
15．根据上述5或6的方法，其中蛋白质具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列。
16．根据上述5或6的方法，其中蛋白质含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
17．根据上述5或6的方法，其中蛋白质含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
18．根据上述5或6的方法，其中蛋白质含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
19．根据上述5或6的方法，其中蛋白质具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
20．根据上述5或6的方法，其中蛋白质由4-100个氨基酸组成。
21．根据上述5或6的方法，其中涉及杂草防治化合物的杂草防治活性的物质是原卟啉原Ⅸ。
22．根据上述5或6的方法，其中蛋白质是一种对原卟啉原Ⅸ没有氧化能力、而对原卟啉原Ⅸ具有特异性亲和性的原卟啉原Ⅸ氧化酶的变体。
23．根据上述5或6的方法，其中蛋白质是一种对原卟啉原Ⅸ没有氧化能力、而对原卟啉Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物具有特异性亲和性的原卟啉原Ⅸ氧化酶的变体。
24．根据上述22或23的方法，其中蛋白质是一种衍生于植物的原卟啉原Ⅸ氧化酶的变体。
25．根据上述22或23的方法，其中蛋白质是一种衍生于大豆的原卟啉原Ⅸ氧化酶的变体。
26．根据上述22或23的方法，其中蛋白质是一种衍生于藻类的原卟啉原Ⅸ氧化酶的变体。
27．根据上述22或23的方法，其中蛋白质是一种衍生于衣藻属的原卟啉原Ⅸ氧化酶的变体。
28．一种使植物产生杂草防治化合物耐受性的方法，包括下列步骤：
将一种可编码一种蛋白质的基因引入植物细胞并且表达该基因，所述的蛋白质具有下列(a)至(c)特征：
(a)对原卟啉Ⅸ具有特异性亲和性；
(b)对原卟啉原Ⅸ基本不具有修饰能力；
(c)基本上不含免疫球蛋白中可变区的构架区。
(以下称为本发明方法的第二方面)
29．根据上述28的方法，其中在植物细胞中以这样一种方式将基因引入植物细胞、即以可操作的方式将该基因与均可在植物细胞内起作用的启动子和终止子进行连接。
30．根据上述28或29的方法，其中杂草防治化合物是可抑制植物卟啉的生物合成的物质。
31．根据上述28或29的方法，其中杂草防治化合物是一种原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物。
32．根据上述30或31的方法，其中蛋白质是镁螯合酶或对原卟啉Ⅸ具有特异性亲和性的所述蛋白质的变体。
33．根据上述30或31的方法，其中蛋白质是铁螯合酶或对原卟啉Ⅸ具有特异性亲和性的所述蛋白质的变体。
34．根据上述30或31的方法，其中蛋白质是衍生于一种植物铁螯合酶。
35．根据上述30或31的方法，其中蛋白质是衍生于大麦属的铁螯合酶。
36．根据上述30或31的方法，其中蛋白质是来自黄瓜的铁螯合酶。
37．根据上述0或31的方法，其中蛋白质是一种由4-100个氨基酸组成的肽。
38．一种使植物产生杂草防治化合物耐受性的方法，包括下列步骤：
将一种可编码一种蛋白质的基因引入植物细胞并且表达该基因，所述的蛋白质具有下列(a)至(c)特征：
(a)对原卟啉原Ⅸ具有特异性亲和性；
(b)对粪卟啉原Ⅲ不具有修饰能力；
(c)基本上不含免疫球蛋白中可变区的构架区。
(以下称为本发明的方法的第三部分)
39．根据上述38的方法，其中以这样一种方式将基因引入植物细胞、即以可操作的方式将该基因与均可在植物细胞内起作用的启动子和终止子进行连接。
40．根据上述38或39的方法，其中蛋白质是粪卟啉原Ⅲ或对原卟啉原Ⅸ具有特异性亲和性的所述蛋白质的变体。
41．根据上述38或39的方法，其中蛋白质是衍生于一种微生物的粪卟啉原Ⅲ氧化酶。
42．根据上述38或39的方法，其中蛋白质是衍生于大肠杆菌的粪卟啉原Ⅲ氧化酶。
43．一种耐杂草防治化合物的植物，其耐受性按照上述1、2、28或29的方法而产生。
44．一种耐杂草防治化合物的植物，其耐受性按照上述38或39的方法而产生。
45．一种用于保护上述43的植物的方法，包括给所述植物的生长区施用所述的杂草防治化合物。
46．一种用于保护上述44的植物的方法，包括给所述植物的生长区施用所述的杂草防治化合物。
47．一种用于选择植物的方法，包括给上述43的植物和其它植物的生长区施用对上述43植物来说是耐受性的杂草防治化合物、并且根据植物间的生长差异来选择植物。
48．一种用于选择植物的方法，包括给上述44的植物和其它植物的生长区施用对上述44植物来说是耐受性的杂草防治化合物、并且根据植物间的生长差异来选择植物。
49．根据上述47的方法，其中植物是植物细胞。
50．根据上述48的方法，其中植物是植物细胞。
51．根据上述1或2的方法，其中杂草防治化合物是选自下列(1)至(3)化合物的原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物；并且涉及杂草防治化合物的杂草防治活性的物质是原卟啉Ⅸ、原卟啉原Ⅸ或一种原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物：
(1)氯硝醚、治草醚、草枯醚(CNP)、氟锁草醚、5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基(nitoro)苯甲酸及其乙酯、氟锁草醚钠、氟硝草醚、2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯氧基)-4-三氟苯、恶草灵、3-[2,4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯基]-5-(1,1-二甲基乙基)-1,3,4-氧代二唑-2-(3H)-酮、2-[4-氯-2-氟-5-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,3,4,5,6,7-六氢化-1H-异吲哚-1,3-二酮、N-(4-氟-2-氟-5-炔丙基羟苯基)-3,4,5,6-四氢苯邻二甲酰亚胺、N-(4-氯苯基)-3,4,5,6-四氢苯邻二甲酰亚胺chlorphthalim、TNPP乙基2-[1-(2,3,4-三氯苯基)-4-硝基吡唑基-5-氧基]丙酸乙酯、或N3-(1-苯乙基)-2,6-二甲基-5-丙炔基(propyonyl)烟酰胺；
(2)由一般通式J-G(1)所代表的化合物，其中G由下列通式G-1至G-9之任一，J由下列通式J-1至J-30之任一所代表。
Figure A9910530000251
Figure A9910530000271
Figure A9910530000281
其中通式J-5、J-6、J-12和J-24中的虚线代表含有单键的左旋环；或环中的一个键是碳原子间的双键；
X是氧原子或硫原子；
Y是氧原子或硫原子；
R1是氢原子或卤原子；
R2是氢原子、C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、卤原子、OH基、OR27基、SH基、S(O)pR27基、COR27基、CO2R27基、C(O)SR27基、C(O)NR29R30基、CHO基、CR27NOR36基、CH=CR37CO2R27基、CH2CHR37CO2R27基、CO2N=CR31R32基、硝基、氰基、NHSO2R33基、NHSO2NHR33基、NR27R38基、NH2基或任意用一个或多个以及相同或不同的C1-C44烷基取代的苯基；
P是0、1或2；
R3是C1-C2烷基、C1-C2卤代烷基、OCH3基、SCH3基、OCHF2基、卤原子、氰基或硝基；
R4氢原子、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基或卤原子；
R5是氢原子、C1-C3烷基、卤原子、C1-C3卤代烷基、环丙基、乙烯基、C2炔基、氰基、C(O)R38基、CO2R38基、C(O)NR38R39基、CR34R35CN基、CR34R35C(O)R38基、CR34R35CO2R38基、CR34R35C(O)NR38R39基、CHR34OH基、CHR34OC(O)R38基或OCHR34OC(O)NR38R39基；或当G是G-2或G-6时，R4和R5可以与连接它们的碳原子一起形成C=O基；
R6是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烷氧基烷基、C3-C6链烯基或C3-C6炔基；
X1是单键、氧原子、硫原子、NH基、N(C1-C3烷基)基团、N(C1-C3卤代烷基)基团或N(烯丙基)基团；
R7是氢原子、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤原子、S(O)2(C1-C6烷基)基团或C(=O)R40基；
R8是氢原子、C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C3-C8链烯基、C3-C8炔基、C1-C8卤代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C3-C8烷氧基烷氧基烷基、C3-C8卤代炔基、C3-C8卤代链烯基、C1-C8烷磺酰基、C1-C8卤代烷磺酰基、C3-C8烷氧基羰基烷基、S(O)2NH(C1-C8烷基)基团、C(O)R41基或其苯环可以被R42取代的苄基；
n和m独立地为0、1、2或3且m+n为2、3或4；
Z是CR9R10基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基团；
R9各自独立地为氢原子、C1-C3烷基、卤原子、羟基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6卤代烷基羰基氧基；
R10各自独立地为氢原子、C1-C3烷基、和羟基或卤原子；
R11和R12独立地为氢原子、卤原子、C1-C6烷基、C3-C6链烯基或C1-C6卤代烷基；
R13是氢原子、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C6链烯基、C3-C6卤代链烯基、C3-C6炔基、C3-C6卤代炔基、HC(=O)基、(C1-C4烷基)C(=O)基团或NH2基；
R14是C1-C6烷基、C1-C6烷硫基、C1-C6卤代烷基或N(CH3)2基；
W是氮原子或CR15；
R15是氢原子、C1-C6烷基、卤原子、任意被C1-C6烷基或一个或两个卤原子取代的苯基、C1-C6烷氧基或CF3基；
Q各自独立地为氧原子或硫原子；
Q1是氧原子或硫原子；
Z1是CR16R17基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基团；
R16各自独立地为氢原子、卤原子、羟基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6卤代烷基羰基氧基；
R17各自独立地为氢原子、羟基或卤原子；
R18是C1-C6烷基、卤原子或C1-C6卤代烷基；
R19和R20独立地为氢原子、C1-C6烷基、C3-C6环烷基或C1-C6卤代烷基；
Z2是氧原子、硫原子、NR9基或CR9R10基；
R21和R22独立地为C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C6链烯基、C3-C6卤代链烯基、C3-C6炔基或C3-C6卤代炔基；
R23是氢原子、卤原子或氰基；
R24是C1-C6烷磺酰基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C6链烯基、C3-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基或卤原子；
R25是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C6链烯基或C3-C6炔基；
R26是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基或任意被取代基取代的苯基，所述的取代基选自由C1-C6烷基，1-2个卤原子、1-2个硝基、C1-C6烷氧基和CF3基组成的组；
W1是氮原子或CH基；
T是由下列一般通式T-1、T-2和T-3所代表的任意基团之一：
Figure A9910530000301
(其中E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10、E11和E12独立地为氢原子或C1-C3烷基)；
R27是C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C3-C8链烯基、C3-C8炔基、C1-C8卤代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C2-C8烷硫基烷基、C2-C8烷亚磺酰基烷基、C2-C8烷磺酰基烷基、C1-C8烷磺酰基、其苯环可以被至少一个选自由卤原子和C1-C4烷基组成的组的取代基取代的苯磺酰基、C4-C8烷氧基烷氧基烷基、C4-C8环烷基烷基、C6-C8环烷氧基烷基、C4-C8链烯基氧基烷基、C4-C8炔基氧基烷基、C3-C8卤代烷氧基烷基、C4-C8卤代链烯基氧基烷基、C4-C8卤代炔基氧基烷基、C6-C8环烷硫基烷基、C4-C8链烯基硫代烷基、C4-C8炔基硫代烷基、被苯氧基取代的C1-C4烷基；其中苯氧基的苯环被至少一个选自由卤原子、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基组成的组的取代基取代、被苄氧基取代的C1-C4烷基；其中苄氧基的环被至少一个选自由卤原子、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基组成的组的取代基取代、C4-C8三烷基甲硅烷基烷基、C3-C8氰基烷基、C3-C8卤代环烷基、C3-C8卤代链烯基、C5-C8烷氧基链烯基、C5-C8卤代烷氧基链烯基、C5-C8烷基硫代链烯基、C3-C8卤代炔基、C5-C8烷氧基链烯基、C5-C8卤代烷氧基链烯基、C5-C8烷基硫代炔基、C2-C8烷基羰基、其苯环被至少一个选自由卤原子、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基组成的组的取代基取代的苄基、CHR34COR28基、CHR34COOR28基、CHR34P(O)(OR28)2基、CHR34P(S)(OR28)2基、CHR34C(O)NR29R30基或CHR34C(O)NH2基；
R28是C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C3-C6炔基或四氢呋喃基；
R29和R31独立地为氢原子或C1-C4烷基；
R30和R32独立地为C1-C4烷基或其环可以被至少一个取代基取代的苯基，所述的取代基选自由卤原子、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基组成的组；或
R29和R30一起可以形成-(CH2)5-、-(CH2)4-或-CH2CH2OCH2CH2-，或由此形成的环可以被至少一个选自由C1-C3烷基、苯基和苄基组成的组的取代基取代；或
R31和R32与连接它们的碳原子一起可以形成C3-C8环烷基；
R33是C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基或C3-C6链烯基；
R34和R35独立地为氢原子或C1-C4烷基；
R36是氢原子、C1-C6烷基、C3-C6链烯基或C3-C6炔基；
R37是氢原子、C1-C4烷基或卤原子；
R38是氢原子、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6链烯基、C3-C6炔基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、其环可以被选自由卤原子、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基组成的组的取代基取代的苯基、-CH2CO2(C1-C4烷基)基团或-CH(CH3)CO2(C1-C4烷基)基团；
R39是氢原子、C1-C2烷基或C(O)O(C1-C4烷基)基团；
R40是氢原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或NH(C1-C4烷基)基团；
R41是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、NH(C1-C6烷基)基团、其环可以被选自由基团R42、苄基和C2-C8二烷氨基组成的组的一个取代基取代的苯基；且
R42是C1-C6烷氧基、一个或两个卤原子、C1-C6烷氧基或CF3基；
(3)通式(Ⅱ)的化合物：
Figure A9910530000321
或nipilacrofen，
其中R43是C1-C4烷基；
R44是C1-C4烷基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷硫基和C1-C4卤代烷氧基；
R43和R44一起可以形成-(CH2)3-或-(CH2)4-；
R45是氢原子或卤原子；
R46是氢原子或C1-C4烷基；
R47是氢原子、硝基、氰基、-COOR49、-C(=X)NR50R51基或-C(X2)R52基；
R48是氢原子、卤原子、氰基、被至少一个选自由卤原子和羟基组成的组的取代基任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、被至少一个选自由卤原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤代C1-C4烷基组成的组的取代基任意取代的苯基、吡咯基、C2-C8烷基、C3-C8链烯基、C3-C8炔基、C3-C8烷氧基、选自由C2-C8烷基、C3-C8链烯基、C3-C8炔基和C3-C8烷氧基组成的组的一个基团，在该基团中至少插入一个氧原子；或R48是由下列通式所代表的任意一个基团：-NR53R54
Figure A9910530000331
-OR58    -S(O)fR59
Figure A9910530000332
Figure A9910530000333
Figure A9910530000334
-(CH2)a-A-(CH2)a-O(CH2)b-R64    -(CH2)a-O-R65    -COR66
其中R49、R50和R52相同或不同、为氢原子或C1-C4烷基；
R50和R51与连接它们的氮原子一起可以形成饱和的脂环5或6节环；
R52是氢原子、C1-C4烷基或被至少一个卤原子取代的C1-C4烷基；
R53是氢原子、被至少一个卤原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一个卤原子任意取代的C2-C6链烯基、被至少一个卤原子任意取代的C3-C6的炔基、被至少一个卤原子任意取代的苯基、C3-C8环烷基、氰甲基、或R63CO-基；
R54是氢原子、被至少一个卤原子任意取代的C1-C6烷基、被至少一个卤原子任意取代的C2-C6链烯基、被至少一个卤原子任意取代的C3-C6炔基、被至少一个卤原子任意取代的苯基、C3-C8环烷基、氰甲基、C1-C4烷氧基-C1-C6烷基、二-C1-C4烷氨基-C1-C4烷基、四氢糠基甲基、C3-C6炔基氧基-C1-C4烷基、其环可以被选自由卤原子、硝基、氰基、C1-C4烷氧基和卤代-C1-C4烷基组成的组的取代基取代的苄基、-C(=X2)R63基、-(CH2)a-(O)d-R70基、-(CH2)a-(O)b-R70基、-(CH2)a-X2-R76基；
R53和R54与连接它们的碳原子一起可以形成饱和3、5、6节脂环或芳香5或6节环，它的一个环碳原子可以被氧原子取代；
R55是氢原子、C1-C4烷基、C2-C6链烯基或C3-C6炔基；或R55和R56一起可以形成-(CH2)e-；
R56和R57独立地为被至少一个卤原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一个卤原子任意取代的C2-C6链烯基、被至少一个卤原子任意取代的C3-C6炔基或被至少一个卤原子任意取代的苯基、氢原子、C3-C6环烷基、-XR60基或-NR61R62基；
R58是氢原子、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C3-C6炔基、C1-C4烷基羰基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、二C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、苄基、C1-C4烷氧基-C1-C4炔基、-(CH2)a-R75基、-(CH2)a-X2-R72基、-(CH2)a-X2-(CH2)b-R72基或-(CH2)a-X2-(CH2)b-X2-(CH2)c-R72基；
R59是氢原子、C1-C4烷基、C2-C6链烯基、C3-C6炔基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷基羰基-C1-C3烷基或苯基；
R60是被至少一个卤原子任意取代的C1-C4烷基；
R61和R62相同或不同、为氢原子或C1-C4烷基；
R63是被至少一个卤原子任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷基、C1-C4烷硫基-C1-C4烷基、C3-C6环烷基、其环可以被至少一个选自由卤原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤代--C1-C4烷基组成的组的取代基取代的苯基、-NR73R74基或-(CH2)a-(O)d-R75基；
R64是C1-C4烷氧基羰基或羧基；
R65是氯甲基、氰甲基、至少可以插入一个氧原子的C3-C6环烷基、或C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基；
R66是羟基或-NR67R68基；
A是-NR67R68基或-S(O)p-R69基；
R67和R68相同或不同、为氢原子或C1-C4烷基；
R69是C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基；
R70是氢原子、羟基、卤原子、被至少一个C1-C4烷氧基任意取代的C1-C4烷基、至少可以插入一个氧原子的C3-C6环烷基、被一个或两个甲基任意取代的C3-C6环烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；
R71和R72相同或不同、为C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；
R73和R74相同或不同、为C1-C4烷基或苯基；
R75是可以插入至少一个氧原子的C3-C6环烷基、被一个或两个甲基任意取代的C3-C6环烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；
R76是C1-C4烷基；
a、b和c独立地为1、2或3；
d是0或1；
e是2或3；
f是1或2；且
X2是氧原子或硫原子。
在本发明的方法中，涉及杂草防治化合物的杂草防治活性的物质(下文称作杂草防治物质)是构成生物体内代谢反应系统组成部分的那些物质，在将这些化合物施用于植物时，它们可产生杂草防治活性。其实例包括杂草防治化合物自身、衍生于植物的内源性物质等。特别是诸如衍生于植物的内源性物质，例如有：在靶酶上起作用的底物、或当蓄积在植物细胞内时可导致细胞功能异常的前体或底物代谢物；由上述在植物细胞内导致细胞功能异常的物质产生的物质等。更具体地说，已经公知：当将具有可抑制原卟啉原Ⅸ氧化酶(EC1.3.3.4，下文称作PPO)活性的除草活性的化合物(下文称作除草化合物)施用于植物时，作为PPO底物的原卟啉原蓄积在植物细胞内并且代谢成原卟啉X，随后在细胞中在既有原卟啉X又有光存在的条件下形成活性氧，这一过程可破坏细胞功能[Jansh,MTYAMOTO编辑，AtarashiiNoyaku no Kagaku(《新农用化学品化学》(Chemistry of NewAgrochemicals))，第3章第3.3部分，p106(1993)Hirokawa Shoten,Tokyo]。因此，这些系统中的原卟啉原Ⅸ、原卟啉Ⅸ和活性氧等可作为这些物质的典型实例。
在本发明的方法中，杂草防治化合物包括具有除草活性、植物生长调节活性等的化合物。
除草化合物的实例包括：抑制卟啉生物合成的化合物；抑制光合成中电子传进的化合物；抑制类胡萝卜素生物合成的化合物、抑制氨基酸生物合成的化合物；抑制脂类生物合成的化合物；抑制细胞壁生物合成的化合物；影响蛋白质生物合成、核酸生物合成和细胞分裂的化合物；具有生长素拮抗活性的化合物等。更具体地说，作为抑制卟啉生物合成的化合物，例如有抑制PPO活性的化合物(PPO抑制型除草化合物)等。作为抑制光合成中电子传递的化合物，例如有抑制光化学系统Ⅰ或Ⅱ的电子传递的化合物、抑制可影响传递电子的质体醌的生物合成的4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(EC1.13.11.27；下文称作4-HPPD)的化合物等。作为抑制类胡萝卜素生物合成的化合物，例如有抑制八氢番茄红素脱饱和酶(下文称作PDS)的化合物等。作为抑制氨基酸生物合成的化合物，例如有抑制EPSPS、乙酸乳酸合酶(EC4.1.3.18；下文称作ALS)、谷氨酰胺合成酶(EC6.3.1.2；下文称作GS)、二氢蝶酸合酶(EC 2.5.1.15；下文称作DHP)的化合物等。作为抑制脂类生物合成的化合物，例如有抑制乙酰CoA羧化酶(EC6.4.1.2；下文称作ACC)的化合物等。作为抑制细胞壁生物合成的化合物，例如有抑制纤维素生物合成的化合物等。作为影响蛋白质生物合成、核酸生物合成或细胞分裂的化合物，例如有抑制微管形成的化合物等。
具有植物生长调节剂活性的化合物实例包括具有对促进细胞生长和分化的植物激素有拮抗活性的化合物等。特别地，例如有2,4-D、苯乙基烷烃羧酸、苯甲酸的衍生物、吡啶甲酸衍生物等。
作为上述PPO抑制型除草化合物，例如有Duke,S.O.,Rebeiz,C.A.在《ACS专题论文集系列559》、《壳苔酸杀虫剂》、《化学》、《毒理学》、以及《药物应用》、Washington DC的美国化学会(1994)中公开的化合物等。特别地，它们的实例包括下列化合物：
(1)氯硝醚、治草醚、草枯醚(CNP)、氟锁草醚、5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基(nitoro)苯甲酸及其乙酯、氟锁草醚钠、氟硝草醚、2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯氧基)-4-三氟苯、恶草灵、3-[2,4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯基]-5-(1,1-二甲基乙基)-1,3,4-氧代二唑-2-(3H)-酮、2-[4-氯-2-氟-5-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,3,4,5,6,7-六氢化-1H-异吲哚-1,3-二酮、N-(4-氯-2-氟-5-炔丙基羟苯基)-3、4,5,6-四氢苯邻二甲酰亚胺、chlorphthalim、N-(4-氯苯基)-3,4,5,6-四氢苯邻二甲酰亚胺、TNPP乙基2-[1-(2,3,4-三氯苯基)-4-硝基吡唑基-5-氧基]丙酸乙酯、或N3-(1-苯乙基)-2,6-二甲基-5-丙炔基(propyonyl)烟酰胺；
(2)由一般通式J-G(Ⅰ)所代表的化合物，其中G是以下通式G-1至G-9之任一代表的基团，J是以下通式J-1至J-30之任一代表的基团：
Figure A9910530000381
Figure A9910530000411
其中通式J-5、J-6、J-12和J-24中的虚线代表含有单键的左旋环；或环中的一个键是碳原子间的双键；
X是氧原子或硫原子；
Y是氧原子或硫原子；
R1是氢原子或卤原子；
R2是氢原子、C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、卤原子、OH基、OR27基、SH基、S(O)pR27基、COR27基、CO2R27基、C(O)SR27基、C(O)NR29R30基、CHO基、CR27NOR36基、CH=CR37CO2R27基、CH2CHR37CO2R27基、CO2N=CR31R32基、硝基、氰基、NHSO2R33基、NHSO2NHR33基、NR27R38基、NH2基或任意用一个或多个以及相同或不同的C1-C44烷基取代的苯基；
p是0、1或2；
R3是C1-C2烷基、C1-C2卤代烷基、OCH3基、SCH3基、OCHF2基、卤原子、氰基或硝基；
R4氢原子、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基或卤原子；
R5是氢原子、C1-C3烷基、卤原子、C1-C3卤代烷基、环丙基、乙烯基、C2炔基、氰基、C(O)R38基、CO2R38基、C(O)NR38R39基、CR34R35CN基、CR34R35C(O)R38基、CR34R35CO2R38基、CR34R35C(O)NR38R39基、CHR34OH基、CHR34OC(O)R38基或OCHR34OC(O)NR38R39基；或当G是G-2或G-6时，R4和R5可以与连接它们的碳原子一起形成C=O基；
R6是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烷氧基烷基、C3-C6链烯基或C3-C6炔基；
X1是单键、氧原子、硫原子、NH基、N(C1-C3烷基)基团、N(C1-C3卤代烷基)基团或N(烯丙基)基团；
R7是氢原子、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤原子、S(O)2(C1-C6烷基)基团或C(=O)R40基；
R8是氢原子、C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C3-C8链烯基、C3-C8炔基、C1-C8卤代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C3-C8烷氧基烷氧基烷基、C3-C8卤代炔基、C3-C8卤代链烯基、C1-C8烷磺酰基、C1-C8卤代烷磺酰基、C3-C8烷氧基羰基烷基、S(O)2NH(C1-C8烷基)基团、C(O)R41基或其苯环可以被R42取代的苄基；
n和m独立地为0、1、2或3且m+n为2、3或4；
Z是CR9R10基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基团；
R9各自独立地为氢原子、C1-C3烷基、卤原子、羟基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6卤代烷基羰基氧基；
R10各自独立地为氢原子、C1-C3烷基、和羟基或卤原子；
R11和R12独立地为氢原子、卤原子、C1-C6烷基、C3-C6链烯基或C1-C6卤代烷基；
R13是氢原子、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C6链烯基、C3-C6卤代链烯基、C3-C6炔基、C3-C6卤代炔基、HC(=O)基、(C1-C4烷基)C(=O)基团或NH2基；
R14是C1-C6烷基、C1-C6烷硫基、C1-C6卤代烷基或N(CH3)2基；
W是氮原子或CR15；
R15是氢原子、C1-C6烷基、卤原子、任意被C1-C6烷基或一个或多个卤原子取代的苯基、C1-C6烷氧基或CF3基；
Q各自独立地为氧原子或硫原子；
Q1是氧原子或硫原子；
Z1是CR16R17基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基团；
R16各自独立地为氢原子、卤原子、羟基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6卤代烷基羰基氧基；
R17各自独立地为氢原子、羟基或卤原子；
R18是C1-C6烷基、卤原子或C1-C6卤代烷基；
R19和R20独立地为氢原子、C1-C6烷基、C3-C6环烷基或C1-C6卤代烷基；
Z2是氧原子、硫原子、NR9基或CR9R10基；
R21和R22独立地为C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C6链烯基、C3-C6卤代链烯基、C3-C6炔基或C3-C6卤代炔基；
R23是氢原子、卤原子或氰基；
R24是C1-C6烷磺酰基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C6链烯基、C3-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基或卤原子；
R25是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C6链烯基或C3-C6炔基；
R26是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基或任意被至少一个取代基取代的苯基，所述的取代基选自由C1-C6烷基1-2个卤原子、1-2个硝基、C1-C6烷氧基和CF3基组成的组；
W1是氮原子或CH基；
T是由下列一般通式T-1、T-2和T-3所代表的任意基团之一：
(其中E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10、E11和E12独立地为氢原子或C1-C3烷基)；
R27是C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C3-C8链烯基、C3-C8炔基、C1-C8卤代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C2-C8烷硫基烷基、C2-C8烷亚磺酰基烷基、C2-C8烷磺酰基烷基、C1-C8烷磺酰基、其苯环可以被至少一个选自由卤原子和C1-C4烷基组成的组的取代基取代的苯磺酰基、C4-C8烷氧基烷氧基烷基、C4-C8环烷基烷基、C6-C8环烷氧基烷基、C4-C8链烯基氧基烷基、C4-C8炔基氧基烷基、C3-C8卤代烷氧基烷基、C4-C8卤代链烯基氧基烷基、C4-C8卤代炔基氧基烷基、C6-C8环烷硫基烷基、C4-C8链烯基硫代烷基、C4-C8炔基硫代烷基、被苯氧基取代的C1-C4烷基；其中苯氧基的苯环被至少一个选自由卤原子、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基组成的组的取代基取代、被苄氧基取代的C1-C4烷基；其中苄氧基的环被至少一个选自由卤原子、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基组成的组的取代基取代、C4-C8三烷基甲烷基烷基、C3-C8氰基烷基、C3-C8卤代环烷基、C3-C8卤代链烯基、C5-C8烷氧基链烯基、C5-C8卤代烷氧基链烯基、C5-C8烷基硫代链烯基、C3-C8卤代炔基、C5-C8烷氧基链烯基、C5-C8卤代烷氧基链烯基、C5-C8烷基硫代炔基、C2-C8烷基羰基、其苯环被至少一个选自由卤原子、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基组成的组的取代基取代的苄基、CHR34COR28基、CHR34COOR28基、CHR34P(O)(OR28)2基、CHR34P(S)(OR28)2基、CHR34C(O)NR29R30基或CHR34C(O)NH2基；
R28是C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C3-C6炔基或四氢呋喃基；
R29和R31独立地为氢原子或C1-C4烷基；
R30和R32独立地为C1-C4烷基或其环可以被至少一个取代基取代的苯基，所述的取代基选自由卤原子、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基组成的组；或
R29和R30一起可以形成-(CH2)5-、-(CH2)4-或-CH2CH2OCH2CH2-，或由此形成的环可以被至少一个选自由C1-C3烷基、苯基和苄基组成的组的取代基取代；或
R31和R32与连接它们的碳原子一起可以形成C3-C8环烷基；
R33是C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基或C3-C6链烯基；
R34和R35独立地为氢原子或C1-C4烷基；
R36是氢原子、C1-C6烷基、C3-C6链烯基或C3-C6炔基；
R37是氢原子、C1-C4烷基或卤原子；
R38是氢原子、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6链烯基、C3-C6炔基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、其环可以被选自由卤原子、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基组成的组的取代基取代的苯基、-CH2CO2(C1-C4烷基)基团或-CH(CH3)CO2(C1-C4烷基)基团；
R39是氢原子、C1-C2烷基或C(O)O(C1-C4烷基)基团；
R40是氢原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或NH(C1-C4烷基)基团；
R41是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、NH(C1-C6烷基)基团、其环可以被选自由基团R42、苄基和C2-C8二烷氨基组成的组的一个取代基取代的苯基；且
R42是C1-C6烷氧基、一个或两个卤原子、C1-C6烷氧基或CF3基；
(3)通式(Ⅱ)的化合物：
或nipilacrofen，
其中R43是C1-C4烷基；
R44是C1-C4烷基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷硫基和C1-C4卤代烷氧基；
R43和R44一起可以形成-(CH2)3-或-(CH2)4-；
R45是氢原子或卤原子；
R46是氢原子或C1-C4烷基；
R47是氢原子、硝基、氰基、-COOR49、-C(=X)NR50R51基或-C(X2)R52基；
R48是氢原子、卤原子、氰基、被至少一个选自由卤原子和羟基组成的组的取代基任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、被至少一个选自由卤原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤代C1-C4烷基组成的组的取代基任意取代的苯基、吡咯基、C2-C8烷基、C3-C8链烯基、C3-C8炔基、C3-C8烷氧基、选自由C2-C8烷基、C3-C8链烯基、C3-C8炔基和C3-C8烷氧基组成的组的一个基团，在该基团中至少插入一个氧原子；或R48是由下列通式所代表的任意一个基团：-NR53R54 -OR58    -S(O)fR59
Figure A9910530000462
Figure A9910530000464
-(CH2)a-A-(CH2)a-O-(CH2)b-R64     -(CH2)a-O-R65    -COR66
其中R49、R50和R52相同或不同、为氢原子或C1-C4烷基；
R50和R51与连接它们的氮原子一起可以形成饱和的脂环5或6节环；
R52是氢原子、C1-C4烷基或被至少一个卤原子取代的C1-C4烷基；
R53是氢原子、被至少一个卤原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一个卤原子任意取代的C2-C6链烯基、被至少一个卤原子任意取代的C3-C6的炔基、被至少一个卤原子任意取代的苯基、C3-C8环烷基、氰甲基、或R63CO-基；
R54是氢原子、被至少一个卤原子任意取代的C1-C6烷基、被至少一个卤原子任意取代的C2-C6链烯基、被至少一个卤原子任意取代的C3-C6炔基、被至少一个卤原子任意取代的苯基、C3-C8环烷基、氰甲基、C1-C4烷氧基-C1-C6烷基、二-C1-C4烷氨基-C1-C4烷基、四氢糠基甲基、C3-C6炔基氧基-C1-C4烷基、其环可以被选自由卤原子、硝基、氰基、C1-C4烷氧基和卤代-C1-C4烷基组成的组的取代基取代的苄基、-C(=X2)R63基、-(CH2)a-(O)d-R70基、-(CH2)a-(O)b-R70基、-(CH2)a-X2-R76基；
R53和R54与连接它们的碳原子一起可以形成3、5或6节饱和脂环或芳香5或6节环，它的一个环碳原子可以被氧原子取代；
R55是氢原子、C1-C4烷基、C2-C6链烯基或C3-C6炔基；或R55和R56一起可以形成-(CH2)e-；
R56和R57独立地为被至少一个卤原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一个卤原子任意取代的C2-C6链烯基、被至少一个卤原子任意取代的C3-C6炔基或被至少一个卤原子任意取代的苯基、氢原子、C3-C6环烷基、XR60基或-NR61R62基；
R58是氢原子、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C3-C6炔基、C1-C4烷基羰基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、二C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、苄基、C1-C4烷氧基-C1-C4炔基、-(CH2)a-R75基、-(CH2)a-X2-R72基、-(CH2)a-X2-(CH2)b-R72基或-(CH2)a-X2-(CH2)b-X2-(CH2)c-R72基；
R59是氢原子、C1-C4烷基、C2-C6链烯基、C3-C6炔基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷基羰基-C1-C3烷基或苯基；
R60是被至少一个卤原子任意取代的C1-C4烷基；
R61和R62相同或不同、为氢原子或C1-C4烷基；
R63是被至少一个卤原子任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷基、C1-C4烷硫基-C1-C4烷基、C3-C6环烷基、其环可以被至少一个选自由卤原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤代-C1-C4烷基组成的组的取代基取代的苯基、-NR73R74基或-(CH2)a-(O)d-R75基；
R64是C1-C4烷氧基羰基或羧基；
R65是氯甲基、氰甲基、至少可以插入一个氧原子的C3-C6环烷基、或C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基；
R66是羟基或-NR67R68基；
A是-NR67R68基或-S(O)f-R69基；
R67和R68相同或不同、为氢原子或C1-C4烷基；
R69是C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基；
R70是氢原子、羟基、卤原子、被至少一个C1-C4烷氧基任意取代的C1-C4烷基、至少可以插入一个氧原子的C3-C6环烷基、被一个或两个甲基任意取代的C3-C6环烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；
R71和R72相同或不同、为C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；
R73和R74相同或不同、为C1-C4烷基或苯基；
R75是可以插入至少一个氧原子的C3-C6环烷基、被一个或两个甲基任意取代的C3-C6环烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；
R76是C1-C4烷基；
a、b和c独立地为1、2或3；
d是0或1；
e是2或3；
f是1或2；且
X2是氧原子或硫原子。
此外，作为其它N-取代的吡唑，有Lyga等在《杀虫剂科学》(Pesticide,Sci.)42:p29(1994)中记载的3-取代-2-芳基-4,5,6,7-四氢吲唑等。
作为抑制光化学系统Ⅰ中电子传递的化合物的特殊实例，例如有百草枯、杀草快等。作为抑制光化学系统Ⅱ中电子传递的化合物的特殊实例，例如有三嗪类化合物(例如阿特拉津等)、脲类化合物(例如敌草隆等)、腈类化合物(例如溴苯腈和4-羟基-3,5-二碘苯甲腈)等。作为抑制4-HPPD的化合物的特殊实例，例如有异噻唑isoxaflutole、吡唑类、三酮类等。作为抑制PDS的化合物的特殊实例，例如有达草灭、氟咯草酮(flurochloridone)、氟草同、呋草酮、吡氟草胺等。作为抑制EPSPS的化合物的特殊实例，例如有草甘膦等。作为抑制ALS的化合物的特殊实例，例如有磺酰脲类、咪唑啉酮、嘧啶基硫代苯甲酸酯、三唑并嘧啶等。作为抑制GS的化合物的特殊实例，例如有双丙氨酰膦、草铵膦等。作为抑制DHP的化合物的特殊实例，例如有黄草灵等。作为抑制ACC的化合物的特殊实例，例如有环己二酮、芳氧基苯氧基丙酸酯等。作为抑制纤维素的化合物的特殊实例，例如有敌草腈等。
用于发明中的杂草防治化合物的各种实例由下列化学结构来表示：结构1
Figure A9910530000501
结构2结构3
Figure A9910530000503
结构4
Figure A9910530000504
结构5
Figure A9910530000505
结构6
Figure A9910530000506
结构7
Figure A9910530000507
结构8
Figure A9910530000511
结构9
Figure A9910530000512
结构10结构11
Figure A9910530000514
结构12
Figure A9910530000515
结构13
Figure A9910530000516
结构14结构15结构16结构17结构18
Figure A9910530000523
结构19结构20
Figure A9910530000525
结构21
Figure A9910530000526
结构22结构23结构24
Figure A9910530000531
结构25结构26
Figure A9910530000533
结构27
Figure A9910530000534
结构28
Figure A9910530000535
结构29
Figure A9910530000536
结构30
Figure A9910530000537
结构31
Figure A9910530000538
结构32结构33结构34
Figure A9910530000543
结构35结构36
Figure A9910530000545
结构37
Figure A9910530000546
在本发明方法的第一个方面中，所用基因是可编码具有至少下列(a)至(c)特征之一的蛋白质(下文有时称作目标蛋白质)的那些基因：
(a)对杂草防治物质具有特异性亲和性；
(b)对与所述蛋白质有亲和性的物质基本不具有修饰能力；
(c)基本上不含免疫球蛋白的可变区的构架区。
对于上述特征(a)的杂草防治物质来说，术语“特异性亲和性”指的是酶(目标蛋白质)与底物(杂草防治物质)、或酶(目标蛋白质)与抑制剂或酶活性的调节物(杂草防治物质)通过酶化学方式相互结合；或者指的是目标蛋白质和杂草防治物质基于亲和性和特异性而相互结合，诸如用受体化学键、例如受体与配体间的一种键所表示的情况等。就具有的特异性结合杂草防治物质的结构来说，目标蛋白质可以是天然出现的蛋白质；通过氨基酸的取代、加成、缺失等而引入天然出现的蛋白质而获得的其变体；以及具有在对除杂草防治物质亲和性的引导下所选择的随机氨基酸序列的人工合成蛋白质。
在特征(b)中术语“不具有修饰能力”指的是与所述蛋白质具有特异亲和性的底物的酶化学反应是失活的(除特征(a)中对杂草防治物质的特异性亲和性之外)。这种情况的实例包括目标蛋白质不具有将与所述蛋白质具有特异亲和性的物质例如一些杂草防治物质，以及基于对于所述蛋白质的特异性亲和力，其有底物结构的转化成具有不同于杂草防治物质化学结构物质的能力这样一种情况“不具修饰能力”蛋白质可通过，例如检测删除了编码所述蛋白的基因的微生物的生长的不可恢复性而鉴定，该微生物由于该基因的删除因而不能在通常的，由于编码所述蛋白的基因被导入微生物中并且表达的情况下生长。
特征(c)中术语“基本上不含免疫球蛋白可变区的构架区”指的是目标蛋白质不形成对免疫球蛋白的可变区具有特异性的立体结构。术语“免疫球蛋白可变区的构架区”指的是在从作为免疫球蛋白分子的H链和L链可变区中除去高变区后剩余的区。在这些区中，保持了相对较高的氨基酸序列且这些区对维持可变区较高的保守立体结构起作用。由于形成了上述立体结构，所以分别位于相应H链和L链上三个位点的高变区聚集于立体结构上的一个位点，从而形成抗原结合位点[Alberts,B.等编辑《细胞分子生物学》(Molecular Biology ofthe Cell),p979,Garland Publishing,Inc.,New York]。
具有上述特征(c)的目标蛋白质可以根据、例如蛋白质的氨基酸序列来选择。作为这种蛋白质的特殊实例，有不含有由大于或等于约30个氨基酸组成的任意氨基酸序列并与免疫球蛋白可变区构架区的公知氨基酸序列具有大约60％同源性的蛋白质等。例如，上述构架区的存在与否可以通过PCR来证实，在PCR中，使用编码蛋白质的基因作为模板和具有编码衍生于免疫球蛋白H链或L链可变区的核苷酸序列的DNAs作为扩增引物，例如Clackson,T.等在《自然》(Nature)352；p624(1991)中所述的引物VH1BACK与VH1FOR-2或VK2BACK与VK4FOR；用于克隆重组抗体基因的商购试剂盒中包含的引物、例如重组噬菌体抗体系统(Pharmacia Biotech)的重引物混合物或轻引物混合物，由此分析是否存在具有所得长度的扩增DNA。
与杂草防治物质具有特异性亲和性的结合蛋白的例子也包括对杂草防治物质具有亲和性的肽。
具有上述特征(a)至(c)的目标蛋白质的特殊实例包括对原卟啉Ⅸ具有亲和性的失活型结合蛋白质[例如底物是原卟啉Ⅸ(杂草防治物质)的失活型镁螯合酶；失活型铁螯合酶(正铁血红素铁裂合酶；EC4.9.9.1)；可催化钴离子与含有四吡咯环的化合物作为底物的配位反应的失活型钴螯合酶；对原卟啉Ⅸ具有亲和性的肽、即由4-100个氨基酸组成的蛋白质(例如，对原卟啉Ⅸ具有亲和性的HASYS肽、例如含有SEQ ID NO:53氨基酸序列的蛋白质和含有SEQ ID NO:54氨基酸序列的蛋白质；对原卟啉Ⅸ具有亲和性的肽RASSL、例如含有SEQ ID NO:55氨基酸序列的蛋白质和具有SEQ ID NO:56氨基酸序列的蛋白质；对卟啉化合物具有亲和性的肽YAGA、例如含有SEQ IDNO:57氨基酸序列的蛋白质和具有SEQ ID NO:58氨基酸序列的蛋白质；对卟啉化合物具有亲和性的肽YAGF、例如含有SEQ ID NO:59氨基酸序列的蛋白质和具有SEQ ID NO:60氨基酸序列的蛋白质等)]；对原卟啉原Ⅸ具有亲和性的失活型结合蛋白质(例如，失活型PPO失活型粪卟啉原Ⅲ氧化酶)等。
上述失活型结合蛋白质包括它们的变体，其活性已经在天然或人工条件下通过天然出现的活性蛋白质的氨基酸取代、加成、缺失、修饰等而失去。
通过在植物细胞中将这些结合蛋白质与杂草防治物质进行结合可以防止由杂草防治物质导致的细胞功能异常，从而表现出所需的杂草防治化合物耐受性。
失活型镁螯合酶是镁螯合酶的原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白质、或对原卟啉Ⅸ具有特异性亲和性的其变体，且它们的特殊实例包括来自其细胞器转运信号序列已经缺失的亚单位蛋白质等。
失活型铁螯合酶是不具有修饰原卟啉Ⅸ的能力而对原卟啉Ⅸ具有特异性亲和性的其变体，且它们的特殊实例包括其中推定为铁螯合酶的Fe离子结合位点的区已经被修饰的铁螯合酶变体等。
失活型钴螯合酶是钴螯合酶的底物结合亚单位蛋白质、或不具有修饰原卟啉Ⅸ的能力而对原卟啉Ⅸ具有特异性亲和性的其变体。
失活型PPO是不具有氧化原卟啉原Ⅸ的能力而对原卟啉原Ⅸ具有特异性亲和性的其变体，且它们的特殊实例包括其中推定为PPO的FAD结合位点的区(具有氨基酸序列GXGXXG、其中X是任意氨基酸的区，例如含有来自拟南芥菜(拟南芥)叶绿体固定PPO的N-末端的第63至第68个氨基酸并具有GGGISG氨基酸序列的区)已经缺失的PPO变体等。
失活型粪卟啉原Ⅲ氧化酶是不具有氧化原卟啉原的能力而对原卟啉原Ⅸ具有特异性亲和性的其变体。
编码上述蛋白质的基因可以通过、例如下列方式获得。
作为编码镁螯合酶的原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白质的基因，例如那些已经公知的基因，它们衍生于光合细菌：荚膜红球菌(基因库登记号M74001)、拟南芥菜(基因库登记号Z68495)、大麦(基因库登记号U96216)、金鱼草属(金鱼草)(基因库登记号U26916)、集胞藻属P.C.C.6803(基因库登记号U29131)等。对于分离这类公知的基因(其核苷酸序列已经公知)来说，可以通过下列方式进行PCR：使用具有所需基因有机体的基因组DNA或cDNA作为模板和基于相当于由该基因编码的约蛋白质N-末端和C-末端的核苷酸序列产生的引物，从而扩增所需的基因。此外，编码镁螯合酶的原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白质的基因可以从光合有机体而不是上述物质获得。例如，首先通过下列步骤来构建cDNA文库：从所需的光合有机体中获得mRNA、通过使用mRNA作为模板与逆转录酶一起合成cDNA、并将cDNA整合入噬菌体载体、诸如ZAPⅡ等或质粒载体、诸如pUC等。为了扩增一种DNA片段、它含有至少部分可编码镁螯合酶的原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白质的基因，可以通过使用上述构建的cDNA文库作为模板和基于公知基因、诸如上述基因中保持良好的核苷酸序列而设计并合成的引物来进行PCR。通过使用由此获得的DNA片段作为探针对cDNA文库进行筛选以便选择阳性克隆。所需镁螯合酶的原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白质的基因可以通过所选克隆核苷酸序列的序列测定而得到确认。
为了获得可编码对原卟啉Ⅸ具有特异性亲和性的镁螯合酶的原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白质的变体的基因，例如通过引入核苷酸取代、加成、缺失、修饰等来诱变可编码该亚单位蛋白质的基因，随后按照Gibson,L.C.D.等在《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92；p1941(1995)中所述的方法等将所得基因引入大肠杆菌BL21(DE3)菌株以获得转化体，并在发生高表达由此引入的基因的条件下培养该转化体。编码对原卟啉Ⅸ具有特异性亲和性的亚单位蛋白质变体的所需基因可以通过选择一种菌株而获得，该菌株的培养细胞已经变红并具有表现出原卟啉Ⅸ蓄积的荧光吸收(激发波长为405nm，荧光波长为630nm)。
作为编码铁螯合酶的基因，例如是那些已经公知的基因，它们衍生于大肠杆菌(基因库登记号D90259)、枯草芽孢杆菌(基因库登记号M97208)、大豆慢生根瘤菌(基因库登记号M92427)、酵母酿酒酵母(基因库登记号J05395)、小鼠(基因库登记号J05697)、人(基因库登记号D00726)、大麦(基因库登记号D26105)、黄瓜(基因库登记号D26106)等。为了分离这样一种公知的基因(其核苷酸序列已经公知)，可以通过下列方式进行PCR：使用具有所需基因有机体的基因组DNA或cDNA作为模板和基于相当于由该基因编码的约蛋白质N-末端和C-末端的核苷酸序列产生的引物，从而扩增所需的基因。此外，为了获得其它可编码铁螯合酶的基因，例如首先通过下列步骤来构建cDNA文库：从所需的有机体中获得mRNA、通过使用mRNA作为模板与逆转录酶一起合成cDNA、并将cDNA整合入噬菌体载体、诸如ZAPⅡ等或质粒载体、诸如pUC等。可以将cDNA文库引入Miyamoto,K等在《植物生理学》(Plant Physiol.)105；p769(1994)中所述的铁螯合酶缺损的大肠杆菌菌株VS200，随后进行互补测验以选择含有衍生于所需有机体的铁螯合酶基因的克隆。此外，为了扩增DNA片段，可以通过使用上述构建的cDNA文库作为模板和基于公知基因、诸如上述基因中保持良好的核苷酸序列而制备的引物来进行PCR。通过使用由此获得的DNA片段作为探针对cDNA文库进行筛选以便选择阳性克隆。所需铁螯合酶基因可以通过所选克隆核苷酸序列的序列测定而得到确认。
为了获得可编码不具有修饰原卟啉Ⅸ的能力而对原卟啉Ⅸ具有特异性亲和性的铁螯合酶变体的基因(例如，编码铁螯合酶变体的基因、其中推定为铁螯合酶的Fe离子结合位点的区被修饰)，可以通过下列步骤进行PCR：制备一种用于将突变引入基于核苷酸序列的区的诱变引物、所述的核苷酸序列可编码与该区有关的氨基酸序列；并使用商购的定点诱变试剂盒(Mutan-Super Express,Takara Shuzo)，从而获得可编码上述变体的基因。特别地，将野生型铁螯合酶基因插入质粒载体pKF19K的克隆位点并通过使用所得质粒DNA作为模板、上述诱变引物和用于位于pKF19K的耐卡那霉素基因上的反向琥珀突变的选择引物来进行PCR。将通过PCR扩增的基因引入大肠杆菌MV1184菌株(不含抑制基因)并根据卡那霉素的耐受性来筛选转化体以分离含有铁螯合酶基因的大肠杆菌、其中相当于构成所需区的氨基酸序列的核苷酸序列已经被修饰。所分离的基因作为编码所需蛋白质的基因可以通过分析大肠杆菌质粒DNA的核苷酸序列而得到确认。
编码对原卟啉Ⅸ具有亲和性的肽的基因、即由4-100个氨基酸组成的蛋白质可以通过下列步骤来获得：根据例如Sugimoto,N.,Nakano,S.在《化学通讯》(Chem.Lett.)p939(1997)中所述的方法等合成一种肽文库；选择对杂草防治物质基因亲和性的肽；分析由此用一种肽测序仪选择的肽的氨基酸序列；设计含有编码氨基酸序列的核苷酸序列的基因；并用一种DNA合成仪或类似物来合成核苷酸序列。
此外，按照噬菌体展示法可以从噬菌体文库中选择可提供一种对杂草防治物质具有亲和性的肽的噬菌体克隆。特别地，例如通过将可编码具有随机氨基酸序列的核苷酸序列插入来自可编码M13噬菌体基因包被蛋白质pⅢ的区的上游来构建提供在M13噬菌体颗粒表面上具有随机氨基酸序列蛋白质的噬菌体文库。另一方面，将用生物素标记的杂草防治物质与用亲和素或链亲和素包被的平板结合以制备一种用杂草防治物质包被的支持物。通过在用杂草防治物质包被的平板上筛选上述噬菌体文库可以分离提供对杂草防治物质具有亲和性的所需蛋白质的噬菌体且所需蛋白质的基因可以从分离的噬菌体中获得。
例如通过下列步骤可以产生可编码含有重复四次或八次由SEQ IDNO:53、55、57或59表示的氨基酸序列的蛋白质的基因：选择一种核苷酸序列、其中可编码上述氨基酸序列的核苷酸序列在起始密码子ATG后以给定次数重复；用一种DNA合成仪合成一种含有所选核苷酸序列的寡核苷酸和一种含有与所选核苷酸序列互补的核苷酸序列的寡核苷酸；且然后将它们进行退火。此外，通过下列步骤可以产生可编码由SEQ ID NO:54、56、58或60表示的氨基酸序列的基因：选择一种可编码氨基酸序列的核苷酸序列；用一种DNA合成仪合成一种含有所选核苷酸序列的寡核苷酸和另一种含有与所选核苷酸序列互补的核苷酸序列的寡核苷酸；且然后将它们进行退火。在这方面，例如为了选择可编码给定氨基酸序列的核苷酸序列，更好的情况是选择频繁用于衍生于植物的基因中的密码子。
作为PPO基因，例如已经公知那些衍生于大肠杆菌(基因库登记号X68660)、枯草芽孢杆菌(基因库登记号M97208)、流感嗜血菌(基因库登记号L42023)、小鼠(基因库登记号D45185)、人(基因库登记号D38537)、拟南芥菜(基因库登记号D83139)、烟草(基因库登记号Y13465、Y13466)等的基团。为了分离这样一种公知的基因(其核苷酸序列已经公知)，使用含有所需基因有机体的基因组DNA或cDNA作为模板和基于相当于由该基因编码的约蛋白质N-和C-末端的核苷酸序列所产生的引物可以进行PCR，从而扩增所需的基因。此外，为了获得其它PPO基因，例如首先根据上述方法由含有所需基因的有机体来构建cDNA文库。将该cDNA文库引入Narita,S.等在《基因》(Gene)182；p169(1996)中所述的大肠杆菌PPO缺损突变体菌株VSR800，随后进行一种互补测验以选择含有衍生于所需有机体的PPO基因。此外，为了扩增DNA片段，可以通过使用上述构建的cDNA文库作为模板和基于公知基因、诸如上述基因中保持良好的核苷酸序列制备的引物来进行PCR。通过使用由此获得的DNA片段作为探针对cDNA文库进行筛选以便选择阳性克隆。所需PPO基因可以通过所选克隆核苷酸序列的序列测定而得到确认。
为了获得可编码不具有氧化原卟啉原Ⅸ的能力而对原卟啉原Ⅸ具有特异性亲和性的PPO变体的基因，例如通过引发核苷酸的取代、加成、缺失修饰等来诱变PPO基因并将所得修饰的基因引入上述大肠杆菌、其生长通过用PPO抑制型除草化合物处理而受到光依赖性抑制。通过在氯高铁血红素、氨基乙酰丙酸和PPO抑制型除草化合物存在的情况下培养如此获得的大肠杆菌可以选择编码具有原卟啉原Ⅸ结合能力的蛋白质的基因，从而选择一种甚至可在光下生长的克隆。编码对原卟啉原没有氧化能力的蛋白质的基因可以通过下列步骤来选择：在宿主、诸如大肠杆菌等中表达如此选择的修饰基因以制备由该基因编码的蛋白质；并按照Jacob,N.J.和Jacobs,J.M.在《酶》(Enzyme)(1982)28,206-219所述的方法等测定其氧化原卟啉原Ⅸ的能力。更具体地说，将上述修饰的基因插入用于大肠杆菌的表达载体并引入大肠杆菌PPO基因(hemG基因座)缺失突变体、诸如Yamamoto,F.等在《日本遗传杂志》（Japanese J.Genet.)63；p237(1988)中所述的大肠杆菌BT3菌株。将大肠杆菌在含有氯高铁血红素和氨基乙酰丙酸以及相当于引入大肠杆菌的载体选择标记的细胞生长抑制剂的培养基中进行培养以获得转化体。由该转化体可以产生由修饰基因编码的蛋白质。此外，通过在基本上不含氯高铁血红素和氨基乙酰丙酸的培养基中培养转化体可以获得不补充宿主细胞PPO基因缺损的基因，从而鉴定未生长的菌株。也可以将后一种方法用于选择可编码对原卟啉原Ⅸ不具有氧化能力的蛋白质的基因。
此外，为了获得可编码PPO变体的基因、其中其中推定为PPO的FAD结合位点的区(该区具有的氨基酸序列为GXGXXG，其中X是任意的氨基酸)被缺失，首先基于可编码与该区有关的氨基酸序列的核苷酸序列来制备用于引发该区缺失突变的诱变引物。然后通过使用该诱变引物和如上所述的商购定点诱变试剂盒(Mutan-Super Express,Takara Shuzo)来进行PCR，从而获得可编码上述变体的蛋白质的基因、其中该区已经被缺失。
可以通过对用一种DNA合成仪合成的寡核苷酸进行退火而获得可编码肽蛋白质、诸如对原卟啉Ⅸ具有亲和性的肽HASYS和RASSL以及对卟啉化合物具有亲和性的肽YAGA和YAGF的基因等。
另外，通过下列方法等可以产生可编码对其它杂草防治物质具有亲和性的未知肽蛋白质的基因。例如，按照例如Sugimoto,N.,Nakano,S.在《化学通讯》(Chem.,Lett.)p939(1997)中所述的组合化学法等可以构建各种肽文库。从在对杂草防治物质亲和性指导下如此构建的肽文库中选择肽，随后用一种肽测序仪来分析该肽的氨基酸序列。由此，通过一种DNA合成仪可以合成编码该肽的基因。可选择的情况是，提供对杂草防治物质具有亲和性的期限克隆(phase clone)可以通过按照噬菌体展示法选择噬菌体文库来获得。特别地，例如通过将可编码具有随机氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列插入来自可编码M13噬菌体基因包被蛋白质pⅢ的区的上游而构建提供在M13噬菌体颗粒表面上具有随机氨基酸序列的蛋白质的噬菌体文库。另一方面，将用生物素标记的杂草防治物质与用亲和素或链亲和素包被的平板结合以制备一种用杂草防治物质包被的支持物。通过在用杂草防治物质包被的平板上筛选上述噬菌体文库可以分离提供对杂草防治物质具有亲和性的所需蛋白质的噬菌体且所需肽蛋白质的基因可以从分离的噬菌体中获得。
作为可编码粪卟啉原Ⅲ氧化酶的基因，例如已经公知那些衍生于大肠杆菌(基因库登记号X75413)、鼠伤寒沙门氏菌(基因库登记号L19503)、酵母酿酒酵母(基因库登记号J03873)、小鼠(基因库登记号D1633)、人(基因库登记号D16333)、大豆(基因库登记号X71083)、大麦(基因库登记号X82830)、烟草(基因库登记号X82831)等的基团。为了分离这样一种公知的基因(其核苷酸序列已经公知)，通过使用含有所需基因有机体的基因组DNA或cDNA作为模板和基于相当于由该基因编码的约蛋白质N-和C-末端的核苷酸序列所产生的引物可以进行PCR，从而扩增所需的基因。此外，为了获得其它粪卟啉原Ⅲ氧化酶基因，例如首先通过下列步骤由含有所需基因的有机体来构建cDNA文库：由所需有机体制备mRNA；使用mRNA作为模板与一种逆转录酶一起合成cDNA；并将它整合入一种质粒载体、诸如Sikorski,R.S.等在《遗传学》(Genetis)122；p19(1989)中所述的pRS313等。可以将该cDNA文库引入Troup,B.等在《细菌学》(Bacteriol.)176；p673(1994)中所述的酵母粪卟啉原Ⅲ氧化酶缺损突变体菌株HEM13，随后进行一种互补测验以选择含有衍生于所需有机体的粪卟啉原Ⅲ氧化酶的克隆。此外，为了扩增DNA片段，可以通过使用上述构建的cDNA文库作为模板和基于公知基因、诸如上述基因中保持良好的核苷酸序列制备的引物来进行PCR。通过使用由此获得的DNA片段作为探针对cDNA文库进行筛选以便选择阳性克隆。所需粪卟啉原Ⅲ氧化酶可以通过所选克隆核苷酸序列的序列测定而得到确认。
为了获得可编码不具有氧化原卟啉原Ⅸ的能力而对原卟啉原Ⅸ具有特异性亲和性的粪卟啉原(coporphyrinogen)Ⅲ氧化酶变体的基因，例如通过引发核苷酸的取代、加成、缺失修饰等来诱变粪卟啉原Ⅲ氧化酶基因并将所得修饰的基因引入上述大肠杆菌、其生长通过用PPO抑制型除草化合物处理而受到光依赖性抑制。通过在氯高铁血红素、氨基乙酰丙酸和PPO抑制型除草剂存在的情况下培养如此获得的大肠杆菌可以选择编码具有酚卟啉原Ⅸ结合能力的蛋白质的基因，从而选择一种甚至可在光下生长的克隆。编码对原卟啉原Ⅸ没有氧化能力的基因可以通过下列步骤来选择：在宿主、诸如大肠杆菌等中表达如此选择的修饰基因以制备由该基因编码的蛋白质；并按照Jacob,N.J.和Jacobs,J.M.在《酶》(Enzyme)(1982)28,206-219中所述的方法等测定其氧化原卟啉原Ⅸ的能力。
用于本发明方法第二个方面的基因是那些可编码具有下列特征(a)至(c)的蛋白质的基因：
(a)对原卟啉Ⅸ具有特异性亲和性；
(b)对原卟啉原Ⅸ基本不具有修饰能力；
(c)基本上不含免疫球蛋白可变区的构架区。
特征(a)中术语对原卟啉Ⅸ的“特异性亲和性”基本上与上述本发明方法的第一个方面中所述的内容相同且指的是蛋白质与原卟啉Ⅸ通过酶学方式相互结合、或蛋白质与原卟啉Ⅸ基于如受体化学键中、诸如受体与配体间的一种键所示的亲和性和特异性的相互结合等。就具有的特异性结合原卟啉Ⅸ的结构来说，蛋白质可以是天然出现的蛋白质；将氨基酸的取代、加成、缺失修饰等引入天然出现的蛋白质而获得的其变体；以及具有在对原卟啉Ⅸ亲和性的指导下所选择的随机氨基酸序列的人工合成蛋白质。
在特征(b)中术语对原卟啉原Ⅸ“基本不具有修饰能力”指的是与蛋白质的原卟啉Ⅸ的酶化学反应是失活的或不存在。例如，这指的是蛋白质不具有将原卟啉原Ⅸ转化成具有不同于原卟啉原Ⅸ化学结构的物质的能力。
特征(c)中术语“基本上不含免疫球蛋白可变区的构架区”与上述本发明方法的第一个方面中所述的内容相同且如上文所述蛋白质不会形成对免疫球蛋白中的可变区具有特异性的立体结构。
作为具有上述特征(a)至(c)的蛋白质的特殊实例，有对原卟啉Ⅸ具有亲和性的活性或失活型结合蛋白质[例如底物是原卟啉Ⅸ的活性或失活型镁螯合酶；活性或失活型铁螯合酶；可催化与含有四吡咯环的化合物作为底物的钴离子配位反应的活性或失活型钴螯合酶；肽、即对原卟啉Ⅸ具有亲和性的由4-100个氨基酸组成的蛋白质(例如，含有至少选自对原卟啉Ⅸ具有亲和性的肽HASYS中一种肽的蛋白质、例如含有SEQ ID NO:53氨基酸序列的蛋白质和含有SEQ IDNO:54氨基酸序列的蛋白质；对原卟啉Ⅸ具有亲和性的肽RASSL、即含有SEQ ID NO:55氨基酸序列的蛋白质和含有SEQ ID NO:56氨基酸序列的蛋白质；对卟啉化合物具有亲和性的肽YAGA、例如含有SEQ ID NO:57氨基酸序列的蛋白质和含有SEQ ID NO:58氨基酸序列的蛋白质；对卟啉化合物具有亲和性的肽YAGF、即含有SEQ IDNO:59氨基酸序列的蛋白质和含有SEQ ID NO:60氨基酸序列的蛋白质等)]；对原卟啉原Ⅸ具有亲和性的失活型结合蛋白质(例如，失活型PPO)等。
编码上述蛋白质的基因可以，例如，如下获得：
活性型镁螯合酶，由三种异源亚单位蛋白质，即，原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白质(H亚单位蛋白质)，I亚单位蛋白质和D亚单位蛋白质，其都是催化活性所必需的。三种独立的亚单位蛋白质由不同基因编码。原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白质基因可由PCR式筛选cDNA文库获得。
作用编码镁螯合酶的I亚单位蛋白质的基因，例如，那些衍生于光合细菌，类球红细菌(基因库编号AF017642)，类膜红细菌(基因库编号Z11165)。拟南芥(基因库编号D49426)，大麦(基因库编号U26545)，大豆(基因库编号D45857)，烟草(基因库编号AF14053),Synechocytis P.C.C.6803(基因库编号U35144)等是公知的，使用具所需基因的生物体的基因组DNA式cDNA为模板，基于对应于所需基因编码的蛋白的N式C端核苷酸序列而产生的模板PCR。此外，编码镁螯合酶的I亚单位蛋白质的基因可从上述以外的光合生物中获得。例如，首先，从所需光合生物体中获得mRNA，用反转录酶以mRNA为模板合成cDNA，将cDNA整合到噬菌体载体如IAPⅡ等，或当质粒载体如PUC等构建cDNA库。为了扩增含有编码镁螯合酶I亚单位蛋白质的编码基因的至少一部分的DNA片段，使用上述构建的cDNA文库做为模板，以及基于在上述基因中已知是保守的核苷酸序列设计和合成的引物进行PCR。通过使用如此获得的DNA片段为探针来选择阳性克隆而进行cDNA文库筛选。镁螯合酶的I亚单位蛋白质的所需基团可通过确定选定克隆的核苷酸序列而确认。
作为编码镁螯合酶的D亚单位蛋白的基因，例如，那些衍生自光合细菌，类球红细菌(基因库编号AJ001690)，类膜红细菌(基因库编号Z11165)，豌豆(基因库编号AF014399)，烟草(基因库编号Y10022)，Synechocystis P.C.C.6803(基因库编号X95699)等是已知的。这样已知基因(其核苷酸序列是已知的；或上述基因以外基因之分离，可以如编码镁螯合剂I亚单位蛋白质的同样方式获得。
用于本发明方法第三个方面的基因是那些可编码具有至少下列特征(a)至(c)的蛋白质的基因：
(a)对原卟啉原Ⅸ具有特异性亲和性；
(b)对粪卟啉原Ⅲ具有修饰能力；
(c)基本上不含免疫球蛋白可变区的构架区。
特征(a)中术语对原卟啉原Ⅸ的“特异性亲和性”基本上与上述本发明方法的第一个或第二个方面中所述的内容相同且指的是蛋白质与原卟啉原Ⅸ通过酶方式相互结合、或蛋白质与原卟啉原Ⅸ基于如受体化学键中、诸如受体与配体间的一种键所示的亲和性和特异性的相互结合等。就具有的特异性结合原卟啉原Ⅸ的结构来说，蛋白质可以是天然出现的蛋白质；将氨基酸的取代、加成、缺失、修饰等引入天然出现的蛋白质而获得的其变体；以及具有在对原卟啉原Ⅸ亲和性的指导下所选择的随机氨基酸序列的人工合成蛋白质。
在特征(b)中术语“对粪卟啉原Ⅲ具有修饰能力”指的是与蛋白质的粪卟啉原Ⅲ的酶化学反应是失活的。例如，这指的是蛋白质具有将粪卟啉原Ⅲ转化成具有不同于粪卟啉原Ⅲ化学结构的物质的能力。
术语“基本上不含免疫球蛋白可变区的构架区”与上述本发明方法的第一个或第二个方面中所述的内容相同且如上文所述蛋白质不会形成对免疫球蛋白中的可变区具有特异性的立体结构。
作为具有至少上述特征(a)至(c)之一的蛋白质的特殊实例，有对原卟啉原Ⅸ具有亲和性的活性或失活型结合蛋白质，例如底物是原卟啉原Ⅸ的活性类粪卟啉原Ⅲ氧化酶等。
作为参考，镁螯合酶，铁螯合酶，铁螯合酶或粪卟啉原Ⅲ氧化酶的活性可通过下列方法测量。
(1)镁螯合酶
编码独立三个亚基蛋白质的基因被用于按Gibson.L.C.D等的方法检测镁螯合酶(美国国立科学院院报92；p1941(1995))等。
(2)铁螯合酶
铁螯合酶活性可以例如按Porra.R.J(分析生物化学68；p289(1975))等检测。
(3)粪卟啉原Ⅲ氧化酶
粪卟啉原Ⅲ氧化酶活性可以例如按Yoshinaga,J.,Sano.S.，等方法检测(生物化学杂志255；p4722(1980))。
在本发明的方法(包括上述第一至第三个方面)中，为了将编码具有特征(a)至(c)的蛋白质的基因引入植物细胞，可以引入可编码一种蛋白质的基因。此外，可以将编码不同蛋白质的多个基因引入植物细胞。可以通过常规的基因工程技术来进行这类将基因引入植物细胞的过程，例如农杆菌属感染法(JP-B2-58917和JP-A60-70070)、进入原生质体的电穿孔法(JP-A60-251887和JP-A5-68575)、基因枪法(JP-A5-508316和JP-A63-258525)等。优选的情况是，将引入植物细胞的基因整合入含有选择标记基因的载体，所述含有选择标记的基因诸如可以使植物细胞对细胞生长抑制剂产生耐受性的基因。
为了要植物细胞中表达该基因，可以通过同源重组将基因引入植物细胞的染色体[Fraley,R.T.等，《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acd.Sci.USA),80；p4803(1983)]以选择表达该基因的植物细胞。可选择的情况是，以这样一种形式将基因引入植物细胞、即以可操作的方式将它与均可以在植物细胞中起作用启动子和终止子连接。
本文所用的术语“可操作地连接”指的是上述启动子和终止子以这样一种形式连接、即在植物细胞中将引入的基因在该启动子和该终止子的控制下进行表达的方式。
作为可以在植物细胞中起作用的启动子，例如有：衍生于T-DNA的组成型启动子，诸如胭脂氨酸合酶基因启动子、章鱼氨酸合酶基因启动子等；衍生于植物病毒的启动子，诸如衍生于花椰菜花叶病毒的19S和35S启动子等；诱导型启动子，诸如苯丙氨酸脱氨酶基因启动子、抑素合酶基因启动子、与病理相关的蛋白质基因启动子等；以及类似的启动子。启动子不限于这些启动子且可以使用其它的启动子。
作为可以在植物细胞中起作用的终止子，例如由有：衍生于T-DNA的终止子，诸如胭脂氨酸合酶终止子等；衍生于植物病毒的终止子，诸如衍生于大蒜病毒GV1、GV2等的终止子等。终止子不限于这些终止子且可以使用其它的终止子。
作为引入基因的植物细胞，例如有：植物组织、完整植物体、培养的细胞、种子等。引入基因的植物物种的实例包括诸如烟草、棉花、油菜子、制糖甜菜、拟南芥菜、canola、亚麻、向日葵、马铃薯、苜蓿、莴苣属、香蕉、大豆、豌豆、荚果、松属、杨树、苹果、葡萄、桔果、坚果等这样的双子叶植物以及诸如玉米、稻、小麦、大麦、黑麦、燕麦、高粱属、甘蔗、菌苔等这样的单子叶植物。
表达基因的转化体植物细胞可以通过下列步骤获得、其中所述的基因可编码具有(a)至(c)特征之一的结合蛋白质：在相当于与基因上基因座连接的选择标记的选择培养基(例如，含有细胞生长抑制剂的培养基等)中培养转入了基因的细胞；并分离能够在该培养基中生长的克隆。可选择的情况是，通过下列步骤可以选择上述转化体植物细胞：在含有产生耐受性杂草防治化合物的培养基中培养引入了基因的植物细胞并分离能够在该培养基中生长的克隆。所需耐杂草防治化合物植物可以由转化体细胞获得，所述的转化体细胞通过按照(例如)《用于生产转基因植物的方法》(Method for Producing TransgenicPlants)的“植物基因操作说明”(Plant Gene Manipulation Manual)(UCHIMIYA，Kodansha Scientmc(1996))中所述的常规植物细胞培养法使植物体再生而获得。因此，可以获得转化的植物，转入植物组织、植物个体、培养的细胞、种子等。
例如，按照《模型植物的实验方案》(Experimental Protocol of ModelPlants)-《稻米和拟南芥菜》版(Rice and Mouse-Ear Cress Edition)(监制人：Koh SHIMAMOTO和Kiyotaka OKADA,Shuzun-sha,1996)第4章所述的方法可以获得表达可编码上述蛋白质的基因的稻米和拟南芥菜。此外，按照JP-A3-291501中所述的方法，通过用一种基因枪将基因引入大豆无定形胚而获得表达可编码结合蛋白质的基因的大豆。同样，按照Fromm,M.E.等在《生物/技术》(Bio/Tchnology)8；p838(1990)中所述的方法，通过用一种基因枪将基因引入无定形胚可以获得表达可编码上述蛋白质的基因的棉花。按照TAKUMI等在《繁殖协会杂志》(Journal of Breeding Society)(1995)44：附卷1,p57中所述的常规方法，通过用一种基因枪将基因引入无菌培养的小麦未成熟鳞片可以获得表达可编码上述蛋白质的基因的小麦。同样，按照HAGIO等在《繁殖协会杂志》(Journal of Breeding Society)(1995)44：附卷1,p67中所述的常规方法，通过用一种基因枪将基因引入大麦的未成熟鳞片可以获得表达可编码上述蛋白质的基因的大麦。
为了证实表达可编码上述蛋白质的基因的植物对杂草防治化合物的耐受性，优选通过施用产生耐受性的杂草防治化合物以评价植物生殖的程度而使植物再生。为了更加定量地进行证实，例如就具有PPO抑制型除草活性的化合物的耐受性来说，优选将植物的叶片浸入不同浓度的含有具有PPO抑制型除草活性的化合物的水溶液中、或将含有具有除草活性的化合物的水溶液喷在植物的叶片上，随后在室温和光下使之维持在琼脂培养基上。几天后，按照Mackenney,G.在《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)140,p315(1941)中所述的方法从植物的叶中提取叶绿素以测定叶绿素的含量。
由于通过本发明方法(包括第一至第三个方面)获得的耐杂草防治化合物植物(例如植物组织、植物个体、培养的细胞、种子等)表现出对杂草防治化合物的耐受性，所以甚至在将杂草防治化合物施用于生长区(例如栽培区、繁殖区等)的情况下，该植物仍可以生长。由此，当将杂草防治化合物施用于所需耐杂草防治化合物植物的生长区时，可使所需植物避免对杂草防治植物没有耐受性的不利影响。例如，通过在对杂草防治化合物具有耐受性的植物的生长区喷洒杂草防治化合物可以有效地控制杂草。
此外，通过对用本发明方法(包括第一至第三个方面)获得的耐杂草防治化合物植物和其它植物(例如那些对杂草防治化合物没有或具有弱耐受性的植物)的生长区施用杂草防治化合物，可以根据生长中的差异来选择这些植物之一。例如，通过对用本发明方法获得的耐杂草防治化合物植物和其它植物(例如那些对杂草防治化合物没有或具有弱耐受性的植物)的栽培区施用(添加)杂草防治化合物，可以根据生长中的差异来有效地选择这些植物细胞之一。
下面的实施例更进一步来解释本发明，但它们不用来限定本发明的范围。
实施例1
镁螯合酶的原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白质基因的分离
使用用于基因组DNA制备的ISOPLANT试剂盒(由Nippon Gene生产)来制备光合细菌类球红细菌ATCC17023的基因组DNA。然后，按照Gibson,L.C.D.等在《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.USA)92；p1951(1995)中所述，通过使用约1μg所述基因组DNA作为模板以及10pmol由SEQ ID NO:1代表的核苷酸序列组成的寡核苷酸和10pmol由SEQ ID NO:2代表的核苷酸序列组成的寡核苷酸作为引物来进行PCR，从而扩增含有镁螯合酶的原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白质基因bchH的DNA片段。用一种DNA合成仪(PE应用生物系统；型号394DNA/RNA合成仪)来制备寡核苷酸并用一种寡核苷酸纯化柱(PE应用生物系统；OPC柱)来对它进行纯化。通过下列步骤来进行PCR反应：在94℃下维持2分钟、在96℃下维持40秒且然后在68℃下维持7分钟；将在96℃下维持40秒且然后在68℃维持7分钟的一个循环重复28次；且最后在96℃下维持40秒、在68℃下维持7分钟且然后在72℃下维持10分钟。
实施例2
大肠杆菌(下文缩写为E.coli)中镁螯合酶的原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白质基因的表达
按照Gibson,L.C.D.等在《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.USA)92；p1941(1995)中所述，用限制酶NdeⅠ和BglⅡ来消化实施例1中制备的含有bchH基因的DNA片段。将所得DNA片段插入表达载体pET11a(由Stratagene生产)的NdeⅠ限制位点与BamHⅠ限制位点之间以获得质粒pETBCH(附图1)。按照与感受态细胞相关的操作指南将这种质粒pETBCH引入大肠杆菌BL21(DE3)菌株感受态细胞(由Stratagene生产)，从而获得大肠杆菌BL21(DE3)/pETBCH菌株。将该菌株接种入试管(14×10mm)内含有100μg/ml氨苄青霉素的1.5ml LB液体培养基(1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)，将该试管用铝箔覆盖(下文称作在黑暗条件下)，在37℃、荧光灯(约8000勒)的光下通过振摇进行培养。当液体培养基在600nm处的吸收度变为约0.6时，将异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)加入到液体培养基中，使得最终的浓度为0.4mM，并将该培养过程另外持续约20小时。此后，大肠杆菌变红并且观察到表现原卟啉Ⅸ在大肠杆菌中蓄积的荧光吸收(激发波长405nm，荧光波长630nm)。除不加入IPTG外，当按照相同的方式培养大肠杆菌BL21(DE3)/pETBCH菌株时，大肠杆菌没有变红并且没有检测到上述荧光吸收。与此相反，除不用铝箔覆盖(下文称作光条件)外，当按照相同的方式(含有IPTG)培养大肠杆菌BL21(DE3)/pETBCH菌株时，大肠杆菌生长并且如上所述变红。
实施例3
衍生于大豆的PPO基因在hemG基因缺损大肠杆菌中的表达
将大豆(甘氨酸最大变种Williams82)种植且在25℃下培养20天并收集绿叶。用液氮冷冻收集的绿叶并用研杵和研钵研磨冷冻的绿叶。通过使用RNA提取试剂ISOGEN(由Nippon Gene生产)、按照附于其中的操作指南从磨碎的叶中提取RNA。将所得RNA液体提取物进行乙醇沉淀以收集总RNA，然后通过使用聚腺苷酸RNA分级分离试剂盒即BIOMAG mRNA纯化试剂盒(由Perceptive Bio System生产)、按照附于其中的操作指南来对总RNA进行分级分离以收集聚腺苷酸RNA级分。使用1μg这种聚腺苷酸RNA级分作为模板，用MarathoncDNA扩增试剂盒(由Clothech生产)中含有的cDNA合成试剂、按照附于其中的操作指南来合成cDNA。通过使用所得cDNA作为模板和由SEQ ID NO:3核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:4核苷酸序列组成的寡核苷酸作为引物来进行PCR以扩增含有叶绿体类原卟啉原Ⅸ氧化酶基因的DNA片段。用一种DNA合成仪(PE应用生物系统；型号394DNA/RNA合成仪)制备上述寡核苷酸并用一种寡核苷酸纯化柱(PE应用生物系统；OPC注)对其进行纯化。通过下列步骤来进行PCR反应：在94℃下维持1分钟且然后在65℃下维持5分钟；将在94℃下维持15秒且然后在65℃维持5分钟的一个循环重复29次。PCR反应后，通过用MicroSpin S-400HR(由Pharmacia Biotech生产)过滤反应混合物而对扩增的DNA片段进行纯化，并将该DNA片段与由限制酶SalⅠ切割的质粒pCR2.1(由Invitrogen生产)连接以获得质粒pSPPO-P。然后，将该质粒引入大肠杆菌INVαF’菌株(由Invitrogen生产)的感受态细胞并选择耐氨苄青霉素菌株。接着，通过使用染料终止子循环测序试剂盒(由PE应用生物系统生产)和DNA测序仪373S(由PE应用生物系统生产)来对所选耐氨苄青霉素菌株中含有的质粒进行测序。结果显示出了SEQ ID NO:5的核苷酸序列，由此证实质粒pSPPO-P含有大豆的叶绿体类原卟啉原Ⅸ氧化酶基因。
用限制酶PshBⅠ消化质粒pSPPO-P，通过使用T4DNA聚合酶使所得DNA片段钝端化并进一步用SphⅠ消化以分离含有大豆的叶绿体类PPO基因和lac启动子的DNA片段。然后，用限制酶NruⅠ和SphⅠ来消化质粒pACYC184(由Nippon Gene生产)以除去410bp的片段而代之插入上述DNA片段以获得质粒pACYCSP(附图2)。接着，按照Hanahan,D.J.在《分子生物学》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，将质粒pACYCSP引入PPO基因(hemG基因的基因座)缺损突变体大肠杆菌BT3菌株(Yamamoto,F.等在《日本遗传学杂志》(Japanese J.Genet.)63；p237(1988)等)。在含有15μg/ml氯霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培养基(5g/升酵母(east)提取物、5g/升胰化蛋白胨、5g/升胨、10g/升NaCl,pH7.0)中培养所得大肠杆菌以选择对氯霉素和卡那霉素具有耐受性的大肠杆菌BT3/pACYCSP菌株，通过衍生于大豆的PPO基因对其hemG基因缺损进行了补充。
实施例4
产生杂草防治混合物耐受性能力的镁螯合酶原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白质的试验
将实施例3中制备的大肠杆菌BT3/pACYCSP菌株接种入YPT培养基，该培养基含有10或1ppm的由上述结构8所代表的PPO抑制型除草化合物、10μg/ml氯高铁血红素、50μg/ml氨基乙酰丙酸、15μg/ml氯霉素和10μg/ml卡那霉素；按照与实施例2中相同的方式在黑暗条件或光条件下进行培养。作为对照组，在同样条件下，在与上述不含除草化合物的相同培养基中培养大肠杆菌BT3/pACYCSP菌株。然后，在培养开始18小时后，在600nm处测定液体培养基的吸收度。将不含除草化合物的培养基的吸收度看作1，计算含有除草化合物培养基的吸收度的相应值。结果如表1中所示。
表1
大肠杆菌菌株 培养条件            相应的吸收度
           试验化合物的浓度
  10ppm   1ppm   0ppm
 BT3/pACYCSP    光下    0.10    0.25    1.0
 BT3/pACYCSP   黑暗下    0.73    0.95    1.0
通过下列步骤来构建质粒pTVBCH(附图3)：使用由SEQ ID NO:1核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:2核苷酸序列组成的寡核苷酸、按照与实施例1中相同的方式来扩增含有衍生于光合细菌类球红细菌的bchH基因的DNA片段；用限制酶NcoⅠ和BglⅡ来消化所得DNA片段并将消化的DNA片段引入质粒pTV118N(由Takara ShuzoCo.,Ltd.生产)的NcoⅠ限制位点与BamHⅠ限制位点之间。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物学》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法将质粒pTVBCH和pTV118N引入实施例3中制备的大肠杆菌BT3/pACYCSP菌株。在含有100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培养基中培养所得大肠杆菌以获得具有质粒pACYCSP和pTVBCH的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pTVBCH菌株以及具有质粒pACYCSP和pTV118N的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
将这些菌株接种入YPT培养基，该培养基含有10或1ppm的由上述结构8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素、10μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高铁血红素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照与实施例2中相同的方式在黑暗条件或光条件下进行培养。然后，在培养开始后18小时，在600nm处测定液体培养基的吸收度。将不含除草化合物的培养基的吸收度看作1，计算含有除草化合物培养基的吸收度的相应值。结果如表2中所示。
表2
    大肠杆菌菌株  培养条件              相应的吸收度
             试验化合物的浓度
   10ppm   1pp   0ppm
   BT3/pACYCSP+pTVBCH   光下     0.80    0.77    1.0
   BT3/pACYCSP+pTVBCH  黑暗下     0.90    1.06    1.0
   BT3/pACYCSP+pTV118N   光下     0.18    0.31    1.0
   BT3/pACYCSP+pTV118N  黑暗下     0.68    0.77    1.0
此外，将运些菌株接种入YPT培养基，该培养基含有分别由上述结构1、14、15、18-22、29、32、33、34和36所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素、10μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高铁血红素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照与实施例2中相同的方式在黑暗条件或光条件下进行培养。然后，在培养开始18小时后，在600nm处测定液体培养基的吸收度。将不含除草化合物的培养基的吸收度看作1，计算含有除草化合物培养基的吸收度的相应值。结果如表3中所示。
表3
 试验化合物的结构序号  试验浓度                    相应的吸收度
BT3/pACYCSP+pTVBCH BT3/pACYCSP+pTV118N
   光下     黑暗下     光下   黑暗下
 结构1  5.0    0.88      0.88     0.31    0.87
 结构14  10    0.47      0.93     0.12    0.81
 结构15  0.5    0.94      0.94     0.38    0.82
 结构18  2.0    0.68      1.0     0.33    0.91
 结构19  5.0    0.78      0.89     0.40    0.71
 结构20  5.0    0.57      0.88     0.11    0.75
 结构21  10    0.88      0.91     0.25    0.85
 结构22  10    0.55      0.93     0.29    0.94
 结构29  0.5    0.64      0.90     0.22    0.77
 结构32  2.0    0.70      0.94     0.37    0.87
 结构33  2.0    0.81      0.92     0.41    0.91
 结构34  1.0    0.41      0.94     0.19    0.86
 结构36  0.5    0.55      0.95     0.28    0.96
实施例5
将编码镁螯合酶的原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白质的基因引入烟草
通过农杆菌属感染法构建用于将bchH基因引入植物的质粒。首先，用限制酶SacⅠ消化二元载体pBI121(由Clonetech生产)，并插入KpnⅠ接头(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)以制备质粒pBIK，其中除去pBI121的SacⅠ识别位点而添加KpnⅠ识别位点。另一方面，按照与实施例1中所述相同的方式，通过使用光合细菌类球红细菌作为模板以及由SEQ ID NO:7核苷酸序列组成的寡核苷酸引物和由SEQ IDNO:8核苷酸序列组成的寡核苷酸引物来进行PCR，从而扩增含有bchH基因的DNA片段。然后，用限制酶XbaⅠ和KpnⅠ消化上述质粒pBIK以除去β-葡糖苷酸酶基因、并替换，将通过用限制酶XbaⅠ和KpnⅠ消化上述含有bchH基因的DNA片段而获得的DNA片段插入以产生质粒pBIBCH(附图4)，其中bchH基因与来自35S启动子的下游连接。还用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化二元载体pBI121(由Clonetech生产)以除去β-葡糖苷酸酶基因，通过使用T4 DNA聚合酶使所得DNA片段钝端化，随后用TADNA连接酶自环化以构建质粒pNO(附图5)。将该质粒用作bchH表达质粒pBIBCH的载体对照。
分别将质粒pBIBCH和pNO引入根癌土壤杆菌LBA4404。通过在含有300μg/ml链霉素、100μg/ml利福霉素和25μg/ml卡那霉素的培养基中培养所得转化体并选择所需转化体而将具有pBIBCH的土壤杆菌属菌株和具有pNO的土壤杆菌属菌株进行分离。
然后，按照“植物基因的基因操作说明”(Manual for Plant Gene ofGene Manipulation)(Hirofumi UCHIMIYA,Kodan-sha Scientific,1992)中所述的方法，将基因引入烟草。在28℃下将具有质粒pBIBCH的土壤杆菌属(Abrobacterium)菌株在LB培养基(0.5％酵母提取物、1.0％细菌培养用胰化蛋白胨、0.5％NaCl)培养过夜且然后将无菌培养的烟草叶片浸入液体培养基中。在室温下将叶片在含有0.8％琼脂、0.1mg/升萘乙酸和0.1mg/ml苄基氨基嘌呤的Murashige-Skoog培养基(MS培养基，Murashige T.和Skoog F.在《植物生理学》(Physiol.Plant.)(1962)15,p473中所述)培养2天。接着，将叶片用无菌水洗涤并在含有0.8％琼脂、0.1mg/升萘乙酸、0.1mg/升苄基氨基嘌呤和500μg/ml头孢氨噻的MS培养基上培养7天。将该叶片移植到含有0.8％μg/ml头孢氨噻的MS培养基上培养7天。将该叶片移植到含有0.8％琼脂、0.1mg/升萘乙酸、0.1％mg/升苄基氨基嘌呤、500μg/ml头孢氨噻和100μg/ml卡那霉素的MS培养基(下文称作选择性MS培养基)上并通过每1个月将烟草叶片移植到新鲜选择性MS培养基上的方式在培养基上连续培养4个月。在培养期间，从烟草叶片中出现茎-叶分化的嫩枝，将这些嫩枝移植到含有0.8％琼脂、300μg/ml头孢氨噻和50μg/ml卡那霉素的MS培养基上并将根制成再生的个体。将所得再生的个体移植到含有0.8％琼脂和50μg/ml卡那霉素的MS培养基上并培养以获得引入了bchH基因的烟草个体。类似地，用具有pNO的农杆菌属菌株感染烟草叶片以由烟草叶片和烟草个体获得再生的个体(下文称作对照重组烟草)。
实施例6
具有可编码镁螯合酶的原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白质的引入基因的烟草对除草化合物的耐受性的试验
分别收集引入了bchH基因的烟草叶和实施例5中获得的重组烟草叶并沿主脉将叶各自分成左右相等的片。对一片施用含有0.3ppm的结构8的PPO抑制型除草化合物的水溶液，而对另一片不施用该化合物。将这些叶片放在含有0.8％琼脂的MS培养基上并使之在光处、室温下维持7天。然后，用研杵和研钵将每一叶片在5ml 80％的丙酮水溶液中研磨以提取叶绿素。按照Macknney G.在《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)(1941)140,p315中所述的方法用80％的丙酮水溶液稀释该提取液并在750nm、663nm和645nm处测定吸收度以计算总叶绿素含量。将从引入了bchH基因烟草的4个克隆中获得的结果(BCH1-4)和对照重组烟草的结果列在表4中。在该表中，对除草化合物的耐受程度通过用除草化合物处理叶片的总叶绿素含量与未处理叶片的总叶绿素含量之比的百分数来表示。
表4
 重组烟草     总叶绿素含量(mg/g鲜重)  对试验化合物的耐受程度(％)
 未处理的叶   处理的叶
对照     2.49     0.19     7.63
BCH-1     1.35     1.70     126
BCH-2     2.06     2.14     104
BCH-3     1.93     1.57     81.3
BCH-4     1.51     1.06     70.2
按照相同的方式用含有由上述结构3、7、10、11、13、17、23、24、25、27、28、30或35所代表的PPO抑制型除草化合物的溶液处理引入了bchH基因的烟草克隆和对照重组烟草，并测定对每一除草化合物的耐受程度。结果如表5中所示。在该表中，对除草化合物的耐受程度通过用除草化合物处理叶片的总叶绿素含量与未处理叶片的总叶绿素含量之比的百分数来表示。
表5
试验化合物序号 试验浓度(ppm)                  对试验化合物的耐受程度(％)
  bchH重组烟草  对照重组烟草
结构3    10      114      9.94
结构7    30      89.3      8.62
结构10    10      84.0      14.9
结构11    0.30      78.1      5.51
结构13    30      95.2      14.8
结构17    0.30      80.4      14.3
结构23    3.0      106      5.58
结构24    10      129      5.18
结构25    10      104      16.0
结构27    10      86.8      16.8
结构28    0.30      72.2      8.79
结构30    3.0      102      4.24
结构35    0.30      83.3      17.4
实施例7
分离可编码烟草镁螯合酶的原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白质的蛋白质变体的基因
使用Rneasy植物试剂盒(由QIAGEN生产)、按照附于其中的操作指南由烟草的叶组织(烟草变种(Nicotiana tabacum cv.SR1)制备总RNAs。通过使用RNALAPCR试剂盒(AMV)Ver1.1(Taraka ShuzoCo.,Ltd.生产)、按照附于其中的操作指南来获得DNA片段，它含有可编码叶绿体转运信号已经缺失的烟草镁螯合酶原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白质的基因(下文称作烟草螯合酶亚单位变体)。首先，通过使用烟草总RNAs作为模板和上述试剂盒中含有的寡核苷酸dT-衔接头引物作为引物与上述试剂盒中含有的逆转录酶一起来合成第一链cDNA。然后，通过使用第一链cDNA作为模板和上述试剂盒中含有的LA Taq聚合酶来进行PCR以扩增DNA片段，它含有可编码烟草螯合酶亚单位变体的基因。在这种PCR中，使用的是由SEQ ID NO:9的核苷酸序列组成的寡核苷酸引物和由SEQ ID NO:10的核苷酸序列组成的寡核苷酸引物。通过使用一种DNA合成仪(PE应用生物系统；型号394DNA/RNA合成仪)来合成这些寡核苷酸并用移植寡核苷酸纯化柱(PE应用生物系统；OPC柱)来对其进行纯化。通过下列步骤来进行PCR反应：在94℃下维持2分钟且然后将在94℃下维持30秒、在50℃下维持30秒且然后在72℃维持7分钟的一个循环重复30次。PCR反应后，通过使用TA克隆试剂盒(Invitrogen生产)、按照附于其中的操作指南将PCR反应扩增的DNA片段克隆入质粒pCR2.1。用限制酶KpnⅠ消化所得质粒并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。将来自所检测的8.0kbDNA片段的质粒称作pTCHLH。该质粒具有这样一种结构、即在lac启动子控制下已经以定向表达的方式插入了可编码烟草螯合酶亚单位的基因。用限制酶KpnⅠ消化质粒pTCHLH，随后进行自身连接，从而获得质粒pTCHLH1(附图6)，其中由约60个核苷酸组成的DNA片段已经从质粒pTCHLH中缺失。
实施例8
对除草化合物生产耐受性能力的烟草螯合酶亚单位变体的试验
按照Hanahan,D.J.在《分子生物学》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，分别将实施例7中制备的质粒pTCHLH1和pCR2.1引入实施例3中制备的大肠杆菌BT3/pACYCSP菌株。通过在含有100Pg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的YPT培养基中培养上述菌株而分别获得具有质粒pACYCSP和pTCHLH1的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pTCHLH1菌株以及具有质粒pACYCSP和pCR2.1的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pCR2.1菌株。
将这些菌株接种入YPT培养基，该培养基含有10或1ppm的由上述结构8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高铁血红素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照与实施例2中相同的方式在黑暗条件或光条件下进行培养。然后，在培养开始18小时后，在600nm处测定液体培养基的吸收度。将不含除草化合物的培养基的吸收度看作1，计算含有除草化合物培养基的吸收度的相应值。结果如表6中所示。
表6
   大肠杆菌菌株  培养条件           相应的吸收度
          试验化合物的浓度
  10ppm    1pp    0ppm
   BT3/pACYCSP+pTCBCH1   光下    0.69    0.89    1.0
   BT3/pACYCSP+pTCBCH1   黑暗下    0.92    0.93    1.0
   BT3/pACYCSP+pCR2.1   光下    0.03    0.08    1.0
   BT3/pACYCSP+pCR2.1   黑暗下    1.0    1.0    1.0
实施例9
将可编码烟草镁螯合酶亚单位变体的基因引入烟草
构建通过农杆菌属感染法将可编码烟草镁螯合酶亚单位蛋白质的基因引入烟草的质粒。首先，通过用限制酶KpnⅠ和SalⅠ消化实施例7中制备的质粒pTVBCH1来制备DNA片段，它含有可编码烟草镁螯合酶亚单位蛋白质变体的基因。另一方面，用限制酶SamⅠ消化二元载体pBI121(由Clonetech生产)并将KpnⅠ接头(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)插入这部分以制备质粒pBI121K，其中除去pBI121的SmaⅠ识别位点而添加KpnⅠ识别位点。用限制酶SacⅠ消化质粒pBI121K，随后通过用DNA聚合酶Ⅰ将核苷酸添加到双链DNA缺口上而使DNA钝端化。然后，用衍生于牛肠的碱性磷酸酶使DNA去磷酸化并通过插入磷酸化SalⅠ接头(4680P，由Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)而使之环化，从而构建质粒pBI121KS。用限制酶KpnⅠ和SalⅠ消化二元载体pBI121KS以除去β-葡糖醛酸酶(β-glucronidase)基因并将编码烟草螯合酶亚单位的基因插入这部分以制备质粒pBITCHLH(附图7)。
将质粒pBITCHLH引入根癌土壤杆菌LBA4404。在含有300μg/ml链霉素、100μg/ml利福霉素和25μg/ml卡那霉素的培养基中培养所得的转化体，随后选择所需的转化体以分离具有pBITCHLH的农杆菌属菌株。
用农杆菌属菌株感染无菌培养的烟草叶片并按照与实施例5中相同的方式获得引入了可编码烟草镁螯合酶亚单位蛋白质变体的基因的烟草。
实施例10
具有可编码烟草镁螯合酶亚单位蛋白质变体的引入基因的烟草对除草化合物耐受性的确认
按照与实施例6中相同的方式、通过检测实施例9中制备的引入了可编码烟草镁螯合酶亚单位蛋白质变体的基因的烟草而定量地确定对除草化合物的耐受程度。
实施例11
分离编码对原卟啉原Ⅸ没有氧化能力而对原卟啉原Ⅸ具有特异性亲和性的大豆PPO蛋白质变体的基因
通过下列方式进行PCR：使用实施例3中制备的质粒pSPPO-P作为模板和由SEQ ID NO:11的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ IDNO:12的核苷酸序列组成的寡核苷酸作为引物，从而扩增DNA片段，它可编码叶绿体转运信号和FAD结合序列已经缺失的大豆PPO(下文称作大豆PPO变体)。用一种DNA合成仪(PE应用生物系统；型号394DNA/RNA合成仪)来制备寡核苷酸并用一种寡核苷酸纯化柱(PE应用生物系统；OPC柱)来对它进行纯化。通过将在94℃下维持1分钟、在55℃下维持2分钟且然后在72℃下维持3分钟的一个循环重复30次来进行PCR反应。用限制酶NcoⅠ和SalⅠ消化扩增的DNA片段并引入质粒pTV118N(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)的NcoⅠ限制位点和SalⅠ限制位点，从而构建质粒pTVGMP(附图8)。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物学》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，将质粒pTVGMP引入大肠杆菌PPO基因缺损突变体系BT3菌株。当在含有100μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培养基中培养所得的大肠杆菌时，互补克隆没有生长。
实施例12
大豆PPO变体对除草化合物产生耐受性作用的试验
按照Hanahan,D.J.在《分子生物学》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，分别将实施例11中制备的质粒pTVGMP和pTV118N引入实施例3中制备的大肠杆菌BT3/pACYCSP菌株。通过在含有100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的YPT培养基中培养上述菌株而获得具有质粒pACYCSP和pTVGMP的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pTVGMP菌株以及具有质粒pACYCSP和pTV118N的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
将这些菌株接种入YPT培养基，该培养基含有10或1ppm的由结构8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素、10μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高铁血红素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照与实施例2中相同的方式在黑暗条件或光条件下进行培养。然后，在培养开始18小时后，在600nm处测定液体培养基的吸收度。将不含除草化合物的培养基的吸收度看作1，计算含有除草化合物培养基的吸收度的相应值。结果如表7中所示。
表7
    大肠杆菌菌株  培养条件            相应的吸收度
           试验化合物的浓度
 10ppm   1pp   0ppm
 BT3/pACYCSP+pTVGMP   光下   0.33   0.85    1.0
 BT3/pACYCSP+pTVGMP   黑暗下   0.91   0.94    1.0
 BT3/pACYCSP+pTV118N   光下   0.05   0.09    1.0
 BT3/pACYCSP+pTV118N   黑暗下   0.89   0.91    1.0
实施例13
将可编码大豆PPO变体的基因引入烟草
构建通过农杆菌属感染法将可编码大豆PPO变体的基因引入植物的质粒。通过使用实施例3中制备的质粒pSPPO-P作为模板、由SEQ IDNO:13的核苷酸序列组成的寡核苷酸引物和由SEQ ID NO:14的核苷酸序列组成的寡核苷酸引物来进行PCR，从而扩增可编码大豆PPO变体的基因的DNA片段。然后，用限制酶KpnⅠ和SacⅠ消化实施例9中制备的质粒pBI121K以除去β-葡糖醛酸酶(β-glucronidase)基因，并将通过用限制酶KpnⅠ和SacⅠ消化含有可编码大豆PPO变体的上述基因的DNA片段而获得的DNA片段插入这部分以制备质粒pBIGMP(附图)，其中基因与35S启动子的下游连接。
将质粒pBIGMP引入根癌土壤杆菌LBA4404。在含有300μg/ml链霉素、100μg/ml利福霉素和25μg/ml卡那霉素的培养基中培养所得的转化体，随后选择所需的转化体以分离具有pBIGMP的农杆菌属菌株。
用农杆菌属菌株感染无菌培养的烟草叶片并按照与实施例5中相同的方式获得引入了可编码大豆PPO变体的基因的烟草。
实施例14
具有可编码大豆PPO变体的引入基因的烟草对除草化合物耐受性的确认
通过检测按照与实施例6中相同的方式引入了实施例13中制备的可编码大豆PPO变体的基因的烟草而定量地确定对由结构8代表的抑制型除草化合物的耐受程度。将从引入了可编码大豆PPO变体的基因的烟草4个克隆(GMP1-4)和对照重组烟草获得的结果列在表8中。在该表中，对除草化合物的耐受程度通过用除草化合物处理叶片的总叶绿素含量与未处理叶片的叶绿素含量之比的百分数来表示。
表8
 重组烟草        总叶绿素含量(mg/g鲜重) 对试验化合物的耐受程度(％)
 未处理的叶  处理的叶
对照     3.49    0.35     10.0
GMP-1     1.89    2.55     135
GMP-2     0.89    0.96     108
GMP-3     1.50    1.49     99.3
GMP-4     2.91    2.34     80.4
实施例15
分离衣藻属的PPO基因
从衣藻属遗传中心(地址：DCMB小组，植物系，91000信箱，Duke大学，Durham,NC2708-1000,USA)获得雷氏衣藻CC407菌株，在200μE/m2/s光合有效光下将该菌株在含有7mM NH4Cl、0.4mMMgSO4·7H2O、0.34mM CaCl2·2H2O、25 mM磷酸钾、0.5mM Tris(pH7.5)、1ml/升Hatner痕量元素和1ml/升冰醋酸的TAP液体培养基(E.H.Harris，《衣藻属参考资料》(The Chlamydomonas Sourcebook),Academic Press,San Diego,1989,p576-577)中培养5天，从而获得200ml(1.0×106细胞/ml)含有早期稳定生长期细胞的液体培养基。
通过使用ISOGEN(Nippon Gene)、按照附于其中的操作指南，由这些细胞制备总RNAs。此外，使用BioMag mRNA纯化试剂盒(Perceptive Bio System)、按照附于其中的操作指南对聚腺苷酸RNA进行分级分离。通过使用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clonetech)、按照附于其中的操作指南从所得聚腺苷酸RNA合成cDNA并将cDNA用作PCR的模板。
作为PCR引物，制备由SEQ ID NO:15的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:16的核苷酸序列组成的寡核苷酸。用一种DNA合成仪(PE应用生物系统；型号394DNA/RNA合成仪)来制备寡核苷酸并用一种寡核苷酸纯化柱(PE应用生物系统；OPC柱)来对它们进行纯化。
通过下列步骤来进行PCR：使用有效cDNA PCR试剂盒(Clonetech)、按照附于其中的操作指南来制备反应液；接着在94℃下维持1分钟和在65℃下维持5分钟后，将在94℃下维持15秒且然后在65℃维持5分钟的一个循环重复29次。在PCR反应后，通过用MicroSpin S-400HR(由Pharmacia Biotech生产)过滤反应液而对扩增的DNA片段进行纯化，并通过使用TA克隆试剂盒(由Invitrogen生产)、按照附于其中的操作指南而将DNA片段克隆入质粒pCR2.1以构建质粒pCPPO。
通过使用染料终止子循环测序试剂盒(由PE应用生物系统生产)和DNA测序仪373S(由PE应用生物系统生产)来测定所得质粒pCPPO中含有的DNA片段的核苷酸序列。结果显示出SEQ ID NO:17的核苷酸序列，由此证实质粒pCPPO含有雷氏衣藻的全长PPO cDNA。
实施例16
分离可编码没有能力氧化原卟啉原Ⅸ而对原卟啉原Ⅸ基因特异性亲和性的雷氏衣藻PPO蛋白质变体的基因
通过下列方式进行PCR；使用实施例15中制备的质粒pSPPO作为模板和由SEQ ID NO:19的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ IDNO:20的核苷酸序列组成的寡核苷酸作为引物，从而扩增DNA片段，它可编码叶绿体转运信号和FAD结合序列已经缺失的雷氏衣藻PPO(下文称作雷氏农藻PPO变体)。用一种DNA合成仪(PE应用生物系统；型号394DNA/RNA合成仪)来制备寡核苷酸并用一种寡核苷酸纯化柱(PE应用生物系统；OPC柱)来对它进行纯化。通过将在94℃下维持1分钟、在55℃下维持2分钟且然后在72℃下维持3分钟的一个循环重复30次来进行PCR反应。用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化扩增的DNA片段并将其插入质粒pTV118N(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)的BamHⅠ限制位点与SacⅠ限制位点之间，从而构建质粒pTVCRP(附图10)。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物学》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，将质粒pTVCRP引入大肠杆菌PPO基因缺损突变体系BT3菌株。当在含有100μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培养基中培养所得的大肠杆菌时，互补克隆没有生长。
实施例17
对除草化合物产生耐受性能力的修饰的雷氏衣藻PPO变体的试验
按照Hanahan,D.J.在《分子生物学》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法分别将实施例16中制备的质粒pTVCRP和pTV118N引入实施例3中制备的大肠杆菌BT3/pACYCSP菌株。通过在含有100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培养基中培养上述菌株而获得具有质粒pACYCSP和pTVCRP的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pTVCRP菌株以及具有质粒pACYCSP和pTV118N的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
将这些菌株接种入YPT培养基，该培养基含有10或1ppm的由结构8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素、10μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高铁血红素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照与实施例2中相同的方式在黑暗条件或光条件下进行培养。然后，在培养开始18小时后，在600nm处测定液体培养基的吸收度。将不含除草化合物的培养基的吸收度看作1，计算含有除草化合物培养基的吸收度的相应值。结果如表9中所示。
表9
    大肠杆菌菌株  培养条件            相应的吸收度
           试验化合物的浓度
  10ppm    1pp    0ppm
 BT3/pACYCSP+pTVCRP   光下    0.23    0.42    1.0
 BT3/pACYCSP+pTVCRP   黑暗下    0.81    0.82    1.0
 BT3/pACYCSP+pTV118N   光下    0.12    0.24    1.0
 BT3/pACYCSP+pTV118N   黑暗下    0.80    0.91    1.0
实施例18
将可编码雷氏衣藻PPO变体的基因引入烟草
构建通过农杆菌属感染法将可编码雷氏衣藻PPO变体的基因引入植物的质粒。通过用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化实施例16中制备的质粒pTVCRP来制备DNA片段，它含有可编码雷氏衣藻PPO变体的基因。用限制酶BamHⅠ和SalⅠ消化二元载体pBI121(由Clonetech生产)以除去β-葡糖醛酸酶(β-glucronidase)基因并将上述编码雷氏衣藻PPO变体的基因插入这部分以制备质粒pBICRP(附图11)。
将质粒pBICRP引入根癌土壤杆菌LBA4404。在含有300μg/ml链霉素、100μg/ml利福霉素和25μg/ml卡那霉素的培养基中培养所得的转化体，随后选择所需的转化体以分离具有pBICRP的农杆菌属菌株。
用农杆菌属菌株感染无菌培养的烟草叶片并按照与实施例5中相同的方式获得引入了可编码雷氏衣藻PPO变体的基因的烟草。
实施例19
具有可编码雷氏衣藻PPO变体(varian)的引入基因的烟草对除草化合物耐受性的确认
通过检测按照与实施例6中相同的方式引入了实施例18中制备的可编码雷氏衣藻PPO变体的基因的烟草而定量地确定对由结构8代表的抑制型除草化合物的耐受程度。将从引入了可编码雷氏衣藻PPO变体的基因的烟草4个克隆(CRP1-4)和对照重组烟草获得的结果列在表10中。在该表中，对除草化合物的耐受程度通过用除草化合物处理叶片的总叶绿素含量与未处理叶片的叶绿素含量之比的百分数来表示。
表10
重组烟草       总叶绿素含量(mg/g鲜重) 对试验化合物的耐受程度(％)
 未处理的叶  处理的叶
对照     2.28     0.42     18.4
CRP-1     1.27     1.54     121
CRP-2     1.50     1.67     111
CRP-3     1.10     1.11     101
CRP-4     1.58     1.57     99.4
实施例20
对原卟啉原Ⅸ具有亲和性的大麦铁螯合酶蛋白质变体特别对除草化合物产生耐受能力的试验
通过Miyamoto,K等在《植物生理学》(Plant Physiol.)105；p769(1994)中所述的方法来制备具有大麦铁螯合酶基因的质粒。用限制酶NspⅠ和EcoRⅠ消化所得的质粒以获得DNA片段，它含有可编码信号序列已经缺失的大麦铁螯合酶的基因(下文称作大麦铁螯合酶变体)。将这种DNA片段插入质粒pTV119N(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)的SphⅠ限制位点与EcoRⅠ限制位点之间，从而构建质粒pTVHVF1(附图12)。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物学》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法分别将质粒pTVHVF1和pTV118N引入实施例3中制备的大肠杆菌BT3/pACYCSP菌株。通过在含有100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培养基中培养上述菌株而获得具有质粒pACYCSP和pTVHVF1的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pTVHVF1菌株以及具有质粒pACYCSP和pTV118N的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
将这些菌株接种入YPT培养基，该培养基含有10或1ppm的由结构8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素、10μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高铁血红素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照与实施例2中相同的方式在黑暗条件或光条件下进行乙酰丙酸；按照与实施例2中相同的方式在黑暗条件或光条件下进行培养。然后，在培养开始18小时后，在600nm处测定液体培养基的吸收度。将不含除草化合物的培养基的吸收度看作1，计算含有除草化合物培养基的吸收度的相应值。结果如表11中所示。
表11
    大肠杆菌菌株  培养条件            相应的吸收度
           试验化合物的浓度
 10ppm    1pp   0ppm
  BT3/pACYCSP+pTVHVF1    光下   0.39    0.94    1.0
  BT3/pACYCSP+pTVHVF1   黑暗下   0.94    0.96    1.0
  BT3/pACYCSP+pTV118N    光下   0.12    0.24    1.0
  BT3/pACYC SP+pTV118N   黑暗下   0.80    0.91    1.0
实施例21
将可编码大麦铁螯合酶变体的基因引入烟草
构建通过农杆菌属感染法将可编码大麦铁螯合酶的基因引入烟草的质粒。用限制酶NcoⅠ消化实施例20中所述的质粒pTVHVF1，随后用DNA聚合酶Ⅰ、通过将核苷酸添加到双链DNA缺口上而使DNA钝端化。然后，用衍生于牛肠的碱性磷酸酶使DNA去磷酸化并通过插入磷酸化BamHⅠ接头(4610P，由Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)而使之环化，从而构建质粒pTVHVF2。用限制酶EcoRⅠ消化pTVHVF2，随后用DNA聚合酶Ⅰ、通过将核苷酸添加到双链DNA缺口上而使DNA钝端化。此外，用衍生于牛肠的碱性磷酸酶使DNA去磷酸化并通过插入磷酸化SalⅠ接头(4680P，由Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)而使之环化，从而构建质粒pTVHVF3。用限制酶BamHⅠ和SalⅠ消化实施例9中制备的质粒pBI121KS以除去β-葡糖苷酸酶基因。通过用限制酶BamHⅠ和SalⅠ消化上述pTVHVF3来制备DNA片段，它含有可编码大麦铁螯合酶变体的基因。通过置换β-葡糖醛酸酶(β-glucronidase)基因的方式将所得DNA片段插入质粒pBI121KS以制备质粒pBIHVF(附图13)，其中bchH基因连接在35S启动子的下游。
将质粒pBIHVF引入根癌土壤杆菌LBA4404。在含有300μg/ml链霉素、100μg/ml利福霉素和25μg/ml卡那霉素的培养基中培养所得的转化体，随后选择所需的转化体以分离具有pBIHVF的农杆菌属菌株。
用所述的农杆菌属菌株感染无菌培养的烟草叶片并按照与实施例5中相同的方式获得引入了可编码大麦铁螯合酶变体的基因的烟草。
实施例22
具有可编码大麦铁螯合酶变体的引入基因的烟草对除草化合物耐受性的确认
通过检测按照与实施例6中相同的方式引入了实施例21中制备的可编码大麦铁螯合酶变体的基因的烟草而定量地确定对由结构8代表的PPO抑制型除草化合物的耐受程度。将从引入了可编码大麦铁螯合酶变体的基因的烟草4个克隆(HVF1-4)和对照重组烟草获得的结果列在表12中。在该表中，对除草化合物的耐受程度通过用除草化合物处理叶片的总叶绿素含量与未处理叶片的叶绿素含量之比的百分数来表示。
表12
重组烟草        总叶绿素含量(mg/g鲜重) 对试验化合物的耐受程度(％)
未处理的叶   处理的叶
对照     1.93     0.160     8.29
HVF-1     0.876     0.930     106
HVF-2     1.14     1.16     102
HVF-3     1.06     1.04     98.1
HVF-4     1.48     1.42     95.9
实施例23
对原卟啉原Ⅸ具有特异性亲和性的黄瓜铁螯合酶的蛋白质变体对除草化合物产生耐受能力的试验
通过下列方式来进行PCR：通过使用由Miyamoto,K等在《植物生理学》(Plant Physiol.)105；p769(1994)中所述方法分离的黄瓜铁螯合酶cDNA克隆作为模板、由SEQ ID NO:21的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:22的核苷酸序列组成的寡核苷酸作为引物，从而扩增DNA片段，它可编码信号序列已经缺失的黄瓜铁螯合酶(下文称作黄瓜铁螯合酶变体)。用一种DNA合成仪(PE应用生物系统；型号394 DNA/RNA合成仪)来制备寡核苷酸并用一种寡核苷酸纯化柱(PE应用生物系统；OPC柱)来对它们进行纯化。通过将在94℃下维持1分钟、在55℃下维持2分钟且然后在72℃下维持3分钟的一个循环重复30次来进行PCR反应。用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化扩增的DNA片段并将其插入质粒pTV119N(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)的BamHⅠ限制位点与之间SacⅠ限制位点，从而构建质粒pTVCSF(附图14)。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物学》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，分别将质粒pTVCSF和pTV118N引入大肠杆菌BT3/pACYCSP菌株。通过在含有100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的YPT培养基中培养上述菌株而获得具有质粒pACYCSP和pTVCSF的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pTVCSF菌株以及具有质粒pACYCSP和pTV118N的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
将这些菌株接种入YPT培养基，该培养基含有10或1ppm的由结构8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素、10μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高铁血红素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照与实施例2中相同的方式在黑暗条件或光条件下进行培养。然后，在培养开始18小时后，在600nm处测定液体培养基的吸收度。将不含除草化合物的培养基的吸收度看作1，计算含有除草化合物培养基的吸收度的相应值。结果如表13中所示。
表13
    大肠杆菌菌株  培养条件           相应的吸收度
          试验化合物的浓度
 10ppm   1pp   0ppm
   BT3/pACYCSP+pTVCSF    光下   0.73   0.78    1.0
   BT3/pACYCSP+pTVCSF   黑暗下   0.89   0.92    1.0
   BT3/pACYCSP+pTV118N    光下   0.06   0.08    1.0
   BT3/pACYCSP+pTV118N   黑暗下   0.81   0.91    1.0
实施例24
将可编码黄瓜铁螯合酶的基因引入烟草
构建通过农杆菌属感染法将可编码本修饰的黄瓜铁螯合酶的基因引入烟草的质粒。用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化质粒pBI121(由Clonetech生产)以除去β-葡糖苷酸酶基因。通过用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化实施例23中所述的质粒pTVHCSF来制备DNA片段，它含有可编码黄瓜铁螯合酶变体的基因。通过置换β-葡糖苷酸酶基因的方式将所得DNA片段插入质粒pBI121KS以制备质粒pBICSF(附图13)，其中黄瓜铁螯合酶基因与35S启动子的下游连接。
将质粒pBICSF引入根癌土壤杆菌LBA4404。在含有300μg/ml链霉素、100μg/ml利福霉素和25μg/ml卡那霉素的培养基中培养所得的转化体，随后选择所需的转化体以分离具有pBICSF的农杆菌属菌株。
按照与实施例5中相同的方式用所述的农杆菌属菌株感染无菌培养的烟草叶片以获得引入了可编码本修饰的黄瓜铁螯合酶的基因的烟草。
实施例25
具有可编码黄瓜铁螯合酶变体的引入基因的烟草对除草化合物耐受性的确认
通过检测按照与实施例6中相同的方式引入了实施例24中制备的可编码本修饰的黄瓜铁螯合酶的基因的烟草而定量地确定对PPO抑制型除草化合物的耐受程度。
实施例26
大肠杆菌粪卟啉原Ⅲ氧化酶(hemF)基因的分离
使用用于基因组DNA制备的试剂盒ISOPLANT(由Nippon Gene生产)由大肠杆菌LE392菌株制备基因组DNA。由SEQ ID NO:23的核苷酸序列组成的寡核苷酸引物和由SEQ ID NO:24的核苷酸序列组成的寡核苷酸引物根据在基因库登记的大肠杆菌hemF基因(登记号X75413)及其5’和3’区的核苷酸序列来合成。用一种DNA合成仪(PE应用生物系统；型号394DNA/RNA合成仪)来制备寡核苷酸并用一种寡核苷酸纯化柱(PE应用生物系统；OPC柱)来对它们进行纯化。通过使用约1μg大肠杆菌LE392菌株基因组DNA作为模板和上述寡核苷酸(各10pmol)为引物来进行PCR以扩增含有大肠杆菌hemF基因的DNA片段。通过将在96℃下维持1分钟、在55℃下维持2分钟且然后在72℃下维持1分钟的一个循环重复30次来进行PCR反应。
实施例27
对除草化合物产生耐受能力的大肠杆菌hemF蛋白质的试验
用限制酶FbaⅠ和PstⅠ消化含有由实施例26中所述方法扩增hemF基因的DNA片段，并将其插入商购质粒pUC118(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)的BamHⅠ限制位点与PstⅠ限制位点之间以构建质粒pHEMF(附图16)。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物学》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法分别将质粒pHEMF和pTV118N引入实施例3中制备的大肠杆菌BT3/pACYCSP菌株。通过在含有100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培养基中培养上述菌株而获得具有质粒pACYCSP和pHEMF的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pHEMF菌株以及具有质粒pACYCSP和pTV118N的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
将这些大肠杆菌菌株接种入YPT培养基，该培养基含有10或1ppm的由结构8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素、10μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高铁血红素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照与实施例2中相同的方式在黑暗条件或光条件下进行培养。然后，在培养开始18小时后，在600nm处测定液体培养基的吸收度。将不含除草化合物的培养基的吸收度看作1，计算含有除草化合物培养基的吸收度的相应值。结果如表14中所示。
表14
    大肠杆菌菌株  培养条件          相应的吸收度
         试验化合物的浓度
 10ppm    1pp    0ppm
  BT3/pACYCSP+pHEMF    光下   0.48    1.0    1.0
  BT3/pACYCSP+pHEMF   黑暗下   0.94    0.95    1.0
  BT3/pACYCSP+pTV118N    光下   0.06    0.16    1.0
  BT3/pACYCSP+pTV118N   黑暗下   0.96    0.98    1.0
实施例28
将大肠杆菌hemF基因引入烟草
构建通过农杆菌属感染法将大肠杆菌hemF基因引入植物的质粒。首先，为了获得大肠杆菌hemF基因，用一种DNA合成仪(PE应用生物系统；型号394DNA/RNA合成仪)来合成由SEQ ID NO:25的核苷酸序列组成的寡核苷酸引物和由SEQ ID NO:26的核苷酸序列组成的寡核苷酸引物并用一种寡核苷酸纯化柱(PE应用生物系统；OPC柱)来对其进行纯化。通过使用这些寡核苷酸、按照与实施例26中相同的方式来进行PCR以扩增含有大肠杆菌hemF基因的DNA片段。
用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化质粒pBI121(由Clonetech生产)以除去β-葡糖苷酸酶基因。将通过用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化上述PCR扩增的DNA片段而制备含有可编码大肠杆菌hemH基因的DNA片段。通过置换β-葡糖苷酸酶基因的方式将所得DNA片段引入质粒pBI121以制备质粒pBIHEMF(附图17)，其中大肠杆菌hemF基因连接于35S启动子的下游。
将质粒pBIHEMF引入根癌土壤杆菌LBA4404。在含有300μg/ml链霉素、100μg/ml利福霉素和25μg/ml卡那霉素的培养基中培养所得的转化体，随后选择所需的转化体以分离具有pBIHEMF的农杆菌属(Abrobacterium)菌株。
按照与实施例5中相同的方式用农杆菌属(Abrobacterium)菌株感染无菌培养的烟草叶片以获得制备的引入了大肠杆菌hemF基因的烟草。
实施例29
引入大肠杆菌hemF基因的烟草对除草化合物耐受性的确认
按照与实施例6中相同的方式、通过检测引入了大肠杆菌hemF基因的烟草而定量地确定对PPO抑制型除草化合物的耐受程度。
实施例30
卟啉化合物结合蛋白质与原卟啉原Ⅸ的结合测试
按照KITANO等在Nihon Kagakukai(日本化学协会)1998年第74届春季会议预出版年报的报告Ⅱ中的摘要p1353,4G511中所述的方法来制备可提供含有由5个随机氨基酸组成的氨基酸序列的蛋白质的噬菌体文库和可提供含有氨基酸序列HASYS或RASSL(其中H是组氨酸、A是丙氨酸、S是丝氨酸、R是精氨酸、Y是酪氨酸、L是亮氨酸)的蛋白质的噬菌体文库，它们可以特异性地结合卟啉化合物5,10,15,20-四(N-甲基吡啶鎓-4-基)-21H,23H-卟吩(H2TMpyP)。
首先，构建可提供含有由5个随机氨基酸组成的氨基酸序列的蛋白质的噬菌体文库。合成由SEQ ID NO:27的核苷酸序列组成的混合的寡核苷酸和由SEQ ID NO:28的核苷酸序列组成的混合的寡核苷酸。用一种DNA合成仪(PE应用生物系统；型号394 DNA/RNA合成仪)来合成混合的寡核苷酸并用一种寡核苷酸纯化柱(PE应用生物系统；OPC柱)来对其进行纯化。通过用T4DNA激酶处理而分别使上述混合的寡核苷酸(各50pmol)在5’端磷酸化。将它们混合并且在70℃下加热10分钟后通过以0.5℃/分钟的速率缓慢冷却至室温而将它们退火。用限制酶SfiⅠ和NotⅠ消化质粒pCANTAB5E(由Pharmacia Biotech生产)以除去重组抗体基因ScFv。将上述磷酸化并退火的寡核苷酸对插入上述重组抗体基因ScFv的部分以制备一种质粒，它含有可编码由5个随机氨基酸序列和与之连接的M13噬菌体表面蛋白质的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列。按照Hanahan,D.J.在《分子生物学》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法将该质粒引入大肠杆菌TG-1菌株并在含有100μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基(10g/升酵母(east)提取物、15g/升胰化蛋白胨和5g/升NaCl，pH7.2)中培养以获得重组大肠杆菌TG-1菌株。将重组大肠杆菌TG-1菌株接种入含有100μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基并通过振摇的方式进行培养。然后，在培养开始1小时后，将6×1010pfu辅助噬菌体M13K07(由Pharmacia Biotech生产)接种入该培养基并通过振摇的方式将培养再持续18个小时。接着，以1,000×g将液体培养基离心20分钟以收集可提供含有由5个随机氨基酸组成的氨基酸序列的蛋白质的噬菌体文库。
为了制备可提供含有氨基酸序列HASYS(SEQ ID NO:53)的蛋白质的噬菌体克隆，合成由SEQ ID NO:29的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:30的核苷酸序列组成的寡核苷酸。并且，为了制备可提供含有氨基酸序列RASSL(SEQ ID NO:55)的蛋白质的噬菌体克隆，合成由SEQ ID NO:31的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:32的核苷酸序列组成的寡核苷酸。用一种DNA合成仪(PE应用生物系统；型号394DNA/RNA合成仪)来合成这些寡核苷酸并用一种寡核苷酸纯化柱(PE应用生物系统；OPC柱)来对它们进行纯化。通过与上述获得可提供含有由5个随机氨基酸组成的氨基酸序列的蛋白质的噬菌体文库相同的操作方式来获得可提供含有氨基酸序列HASYS或RASSL的蛋白质的噬菌体克隆。
将可提供含有氨基酸序列HASYS的蛋白质的噬菌体克隆、可提供含有氨基酸序列RASSL的蛋白质的噬菌体克隆或可提供含有由5个随机氨基酸组成的氨基酸序列的蛋白质的噬菌体文库制成噬菌体悬浮液，将这些悬浮液(滴度105pfu)点滴在硝酸纤维素膜(由Schleicher &Schuell生产)上，然后通过将它们在含有1％牛血清白蛋白的PBT缓冲液(137mM NaCl,8.10mM Na2HPO4,2.68mM Kcl,1.47mMKH2PO4,0.05％ Tween20,pH7.2)中振摇而将硝酸纤维素膜阻塞。用PBT缓中液洗涤该硝酸纤维素膜并将它们在含有10μM原卟啉Ⅸ的2×SSC缓中液(0.3M NaCl,0.03M柠檬酸钠)中振摇18小时。此外，用2×SSC缓中液洗涤所述的硝酸纤维素膜、干燥并在紫外光(365nm)下检测衍生于原卟啉Ⅸ的荧光。
噬菌体文库的斑点没有显现出荧光，而可提供含有氨基酸序列HASYS的蛋白质的噬菌体克隆和可提供含有氨基酸序列RASSL的蛋白质的噬菌体克隆显现出清楚的荧光。
实施例31
对除草化合物产生耐受性能力的原卟啉Ⅸ结合蛋白质的试验
首先，制备一种质粒，它可以表达可编码含有氨基酸序列HASYS(SEQ ID NO:53)、或氨基酸序列RASSL(SEQ ID NO:55)的蛋白质的基因。为了制备能够表达可编码由SEQ ID NO:54氨基酸序列组成的蛋白质(下文称作蛋白质MGHASYS)的基因，合成由SEQ IDNO:33的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:34的核苷酸序列组成的寡核苷酸。用一种DNA合成仪(PE应用生物系统；型号394DNA/RNA合成仪)来合成这些寡核苷酸并用一种寡核苷酸纯化柱(PE应用生物系统；OPC柱)来对它们进行纯化。通过用T4 DNA激酶处理而分别使上述寡核苷酸(各50pmol)在5’端磷酸化。将它们混合并且在70℃下加热10分钟后通过以0.5℃/分钟的速率缓慢冷却至室温而将它们退火。用限制酶NotⅠ和NcoⅠ消化质粒pTV118N以除去由16个碱基对组成的基因片段。通过将上述磷酸化并退火的寡核苷酸对插入上述16个碱基对的位置来制备能够表达可编码蛋白质MGHASYS的基因的质粒pHASYS。
然后，为了制备能够表达可编码由SEQID NO:54氨基酸序列组成的蛋白质(下文称作蛋白质MGRASSL)的基因的质粒，合成由SEQID NO:35的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:34的核苷酸序列组成的寡核苷酸。用一种DNA合成仪(PE应用生物系统；型号394 DNA/RNA合成仪)来合成这些寡核苷酸并用一种寡核苷酸纯化柱(PE应用生物系统；OPC柱)来对它们进行纯化。通过与制备质粒pHASYS相同的过程来制备能够表达可编码蛋白质MGRASSL的基因的质粒pRASSL。
制备能够表达可编码含有氨基酸序列YAGY或YAGF(其中Y是酪氨酸、A是丙氨酸、G是甘氨酸、F是苯丙氨酸)(Sugimoto,N.,Nakano.S.,《化学通讯》(Chem.Lett.)p939,1997)的蛋白质的基因的质粒，其中所述的氨基酸序列YAGY或YAGF能够结合卟啉化合物H2TMpyP。为了制备能够表达可编码由SEQ ID NO:58氨基酸序列组成的蛋白质(下文称作蛋白质MGYAGF)的基因的质粒，合成由SEQ IDNO:37的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:38的核苷酸序列组成的寡核苷酸。为了制备能够表达可编码由SEQ ID NO:60氨基酸序列组成的蛋白质(下文称作蛋白质MGYAGF)的基因的质粒，合成由SEQ ID NO:39的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:40的核苷酸序列组成的寡核苷酸。用一种DNA合成仪(PE应用生物系统；型号394 DNA/RNA合成仪)来合成这些寡核苷酸并用一种寡核苷酸纯化柱(PE应用生物系统；OPC柱)来对它们进行纯化。通过与制备质粒pHASYS相同的过程来制备能够表达可编码蛋白质MGYAGY的基因的质粒pYAGY和能够表达可编码蛋白质MGYAGF的基因的质粒pYAGF。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物学》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法分别将上述质粒pHASYS、pRASSL、pYAGY、pYAGF和pTV118N引入实施例3中制备的大肠杆菌BT3/pACYCSP菌株。通过在含有100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培养基中培养上述菌株而获得具有质粒pACYCSP和pHASYS的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pHASYS菌株、具有质粒pACYCSP和pRASSL的大肠杆菌BT/pACYCSP+pYAGY株，其载有质粒pACYCSP和pYAGY大肠杆菌BT3/pACYCSP+pRASSL菌株、具有质粒pACYCSP和pYAGF的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pYAGF菌株以及具有质粒pACYCSP和pTV118N的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
将这些大肠杆菌菌株接种入YPT培养基，该培养基含有1ppm的由结构8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素、10βg/ml卡那霉素、10lμg/ml氯高铁血红素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照与实施例2中相同的方式在黑暗条件或光条件下进行培养。然后，在培养开始18小时后，在600nm处测定液体培养基的吸收度。将不含除草化合物的培养基的吸收度看作1，计算含有除草化合物培养基的吸收度的相应值。结果如表15中所示。
表15
  大肠杆菌菌株  培养条件           相应吸收度
          试验化合物的浓度
1ppm 0ppm
BT3/pACYCSP+pHASYS    光下 0.65 1.0
BT3/pACYCSP+pHASYS   黑暗下 0.96 1.0
BT3/pACYCSP+pRASSL    光下 0.59 1.0
BT3/pACYCSP+pRASSL   黑暗下 1.0 1.0
BT3/pACYCSP+pHAGY    光下 0.48 1.0
BT3/pACYCSP+pHAGY   黑暗下 0.99 1.0
BT3/pACYCSP+pHAGF    光下 0.62 1.0
BT3/pACYCSP+pHAGF   黑暗下 0.96 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N    光下 0.07 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N   黑暗下 0.93 1.0
此外，在一种能够表达可编码含有氨基酸序列的蛋白质的基因的质粒中，一个单位的氨基酸序列HASYS或RASSL相互重复连接。为了制备能够表达可编码由SEQ ID NO:61氨基酸序列组成的蛋白质(下文称作蛋白质MG(HASYS)4,(HASYS)n称作肽HASYS相互重复连接n次的序列)的基因的质粒，合成由SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44的核苷酸序列组成的寡核苷酸。用一种DNA合成仪(PE应用生物系统；型号394 DNA/RNA合成仪)来合成这些寡核苷酸并用一种寡核苷酸纯化柱(PE应用生物系统；OPC柱)来对它们进行纯化。首先，通过用T4 DNA激酶处理而分别使由SEQ ID NO:42的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:43的核苷酸序列组成的寡核苷酸在5＇端磷酸化。此后，将由SEQ ID NO:41的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:42的核苷酸序列组成的寡核苷酸或由SEQ ID NO:43以及由SEQ ID NO:44的核苷酸序列组成的寡核苷酸的磷酸化的核苷酸组成的寡核苷酸混合(各300pmol)，并且在70℃下加热5分钟后通过以0.5℃/分钟的速率缓慢冷却至室温而将它们退火。将上述两种退火的寡核苷酸对混合并用T4DNA连接酶将它们偶联，然后用T4DNA激酶使所得DNA片段在5’端磷酸化。另一方面，用限制酶NotⅠ和EcoRⅠ消化载体pTV118N以除去由16个碱基对的DNA片段并将上述磷酸化的DNA片段插入这部分以获得表达可编码蛋白质MG(HASYS)4的基因的质粒pHASYS4。
此外，为了制备能够表达可编码由SEQ ID NO:62氨基酸序列组成的蛋白质(下文称作蛋白质MG(HASYS)8)的基因的质粒，合成由SEQ ID NO:45的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:46的核苷酸序列组成的寡核苷酸。用一种DNA合成仪(PE应用生物系统；型号394DNA/RNA合成仪)来合成这些寡核苷酸并用一种寡核苷酸纯化柱(PE应用生物系统；OPC柱)来对它们进行纯化。首先，通过用T4 DNA激酶处理而使上述寡核苷酸在5’端磷酸化。此后，将由SEQ ID NO:41的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:42的磷酸化的核苷酸序列组成的寡核苷酸混合(各300pmol)，将由SEQ IDNO:43的磷酸化的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:44的核苷酸序列组成的寡核苷酸混合(各300pmol)，且进一步将由SEQID NO:45的磷酸化的核苷酸序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:46的磷酸化的核苷酸序列组成的寡核苷酸混合(各600pmol)。将这三种混合物在70℃下加热5分钟并通过以0.5℃/分钟的速率缓慢冷却至室温而将它们退火。将上述三种退火的寡核苷酸对混合、用T4DNA连接酶将它们偶联、且然后用T4DNA激酶使所得DNA片段在5’端磷酸化。按照与制备上述质粒pHASYS4相同的方式来制备能够表达蛋白质MG(HASYS)8的质粒pHASYS8。
然后，为了制备能够表达可编码由SEQ ID NO:63氨基酸序列组成的蛋白质(下文称作蛋白质MG(RASSL)4,(RASSL)n称作肽RASSL相互重复连接n次的序列)的基因的质粒，合成由SEQ ID NO:47、SEQID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的核苷酸序列组成的寡核苷酸。此外，为了制备能够表达可编码由SEQ ID NO:64氨基酸序列组成的蛋白质(下文称作蛋白质MG(RASSL)8)的基因的质粒，合成由SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52的核苷酸序列组成的寡核苷酸。用一种DNA合成仪(PE应用生物系统；型号394DNA/RNA合成仪)来合成这些寡核苷酸并用一种寡核苷酸纯化柱(PE应用生物系统；OPC柱)来对它们进行纯化。
按照与制备上述质粒pHASYS4相同的方式来制备能够表达蛋白质MG(RASSL)4的质粒pRASSL4。还按照与制备上述质粒pHASYS8相同的方式来制备能够表达蛋白质MG(RASSL)8的质粒pRASSL8。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物学》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法分别将上述质粒pHASYS4、pRASSL4、pRASSL8和pTV118N引入实施例3中制备的大肠杆菌BT3/pACYCSP菌株。通过在含有100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培养基中培养上述菌株而获得具有质粒pACYCSP和pHASYS4的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pHASYS4菌株、具有质粒pACYCSP和pRASSL4的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pRASSL4菌株、具有质粒pACYCSP和pRASSL8的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pRASSL8菌株以及具有质粒pACYCSP和pTV118N的大肠杆菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
将这些大肠杆菌菌株接种入YPT培养基，该培养基含有1ppm的由结构8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml氯霉素、10μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高铁血红素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照与实施例2中相同的方式在黑暗条件或光条件下进行培养。然后，在培养开始18小时后，在600nm处测定液体培养基的吸收度。将不含除草化合物的培养基的吸收度看作1，计算含有除草化合物培养基的吸收度的相应值。结果如表16中所示。
表16
 大肠杆菌菌株   培养条件             相应吸收度
            试验化合物的浓度
    1ppm    0ppm
BT3/pACYCSP+pHASYS4     光下      0.91     1.0
BT3/pACYCSP+pHASYS4    黑暗下      1.0     1.0
BT3/pACYCSP+pHASYS8     光下      0.57     1.0
BT3/pACYCSP+pHASYS8    黑暗下      1.0     1.0
BT3/pACYCSP+pRASSL4     光下      1.1     1.0
BT3/pACYCSP+pRASSL4    黑暗下      0.98     1.0
BT3/pACYCSP+pRASSL8     光下      0.79     1.0
BT3/pACYCSP+pRASSL8    黑暗下      1.0     1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N     光下      0.15     1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N    黑暗下      0.81     1.0
实施例32
将可编码原卟啉Ⅸ结合肽的基因引入烟草
构建通过农杆菌属感染法将可编码原卟啉Ⅸ结合肽的基因引入烟草的质粒。用限制酶NcoⅠ消化实施例31中制备的质粒pHASYS8，随后通过用DNA聚合酶将核苷酸加入到双链DNA缺口上而使DNA钝端化。然后，用衍生于牛肠的碱性磷酸酶使DNA去磷酸化并通过插入磷酸化的BamHⅠ接头(4610P，由Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)而使之环化，从而构建质粒pHASYS8B。用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化质粒pBI121(由Clonetech生产)以除去β-葡糖苷酸酶基因。另一方面，用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化质粒pHASYS8B以制备含有可编码蛋白质MG(HASYS)8的基因的DNA片段，通过置换β-葡糖苷酸酶基因的方式将所得DNA片段插入质粒pBI121以制备质粒pHASYS8(附图18)，其中可编码原卟啉Ⅸ结合蛋白质MG(HASYS)8的基因与35S启动子的下游连接。
构建通过农杆菌属感染法将可编码原卟啉Ⅸ结合肽MG(HASYS)8的基因引入植物的质粒。按照与制备pBIHASYS8相同的方式，由pRASSL8来制备质粒pBRASSL8(附图19)，其中可编码原卟啉Ⅸ结合蛋白质MG(RASSL)8的基因与35S启动子的下游连接。
分别将质粒pBIHASYS8和pBIHASYS8引入根癌土壤杆菌LBA4404。在含有300μg/ml链霉素、100μg/ml利福霉素和25μg/ml卡那霉素的培养基中培养所需转化体、随后选择所需转化体，从而分离分别具有pBIHASYS8和pBIRASSL8的土壤杆菌属(Abrobacterium)菌株。
按照与实施例2中相同的方式，用所述的农杆菌属(Abrobacterium)菌株感染无菌培养的烟草叶片以获得引入了可编码原卟啉Ⅸ结合蛋白质MG(HASYS)8的基因的烟草以及引入了可编码原卟啉Ⅸ结合蛋白质MG(RASSL)8的基因的烟草。
实施例33
具有可编码原卟啉Ⅸ结合肽的引入基因的烟草对除草混合物耐受性的确认
按照与实施例14中相同的方式、通过检测引入了实施例32中制备的可编码原卟啉Ⅸ结合肽的基因的烟草而定量地确定对除草化合物的耐受程度。
正如本文所述的，根据本发明，可以产生耐杂草防治化合物的植物。
不含序列表的内容
SEQ ID NO:1
为扩增bchH基因而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:2
为扩增bchH基因而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:3
为扩增大豆PPO基因而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:4
为扩增大豆PPO基因而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:7
为扩增bchH基因而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:8
为扩增bchH基因而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:9
为扩增具有烟草chlH基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:10
为扩增具有烟草chlH基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:11
为扩增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:12
为扩增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:13
为扩增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:14
为扩增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:15
为扩增衣藻属PPO基因而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:16
为扩增衣藻属PPO基因而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:19
为扩增具有衣藻属PPO基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:20
为扩增具有衣藻属PPO基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:21
为扩增具有黄瓜铁螯合酶基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:22
为扩增具有黄瓜铁螯合酶基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:23
为扩增大肠杆菌hemF基因而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:24
为扩增大肠杆菌hemF基因而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:25
为扩增大肠杆菌hemF基因而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:26
为扩增大肠杆菌hemF基因而设计的寡核苷酸引物
SEQ ID NO:27
为合成可编码含有5个氨基酸的随机肽的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:28
为合成可编码含有5个氨基酸的随机肽的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:29
为合成可编码肽HASYS的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:30
为合成可编码肽HASYS的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:31
为合成可编码肽RASSL的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:32
为合成可编码肽RASSL的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:33
为合成可编码肽MGHASYS的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:34
为合成可编码肽MGHASYS的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:35
为合成可编码肽MGRASSL的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:36
为合成可编码肽MGRASSL的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:37
为合成可编码肽MGYAGY的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:38
为合成可编码肽MGYAGY的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:39
为合成可编码肽MGYAGF的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:40
为合成可编码肽MGYAGF的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:41
为合成可编码肽MG(HASYS)4的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:42
为合成可编码肽MG(HASYS)4的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:43
为合成可编码肽MG(HASYS)4的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:44
为合成可编码肽MG(HASYS)4的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:45
为合成可编码肽MG(HASYS)8的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:46
为合成可编码肽MG(HASYS)8的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:47
为合成可编码肽MG(RASSL)4的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:48
为合成可编码肽MG(RASSL)4的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:49
为合成可编码肽MG(RASSL)4的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:50
为合成可编码肽MG(RASSL)4的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:51
为合成可编码肽MG(RASSL)8的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:52
为合成可编码肽MG(RASSL)8的基因而设计的寡核苷酸
SEQ ID NO:53
原卟啉Ⅸ结合蛋白质HASYS
SEQ ID NO:54
原卟啉Ⅸ结合蛋白质MGHASYS
SEQ ID NO:55
原卟啉Ⅸ结合蛋白质RASSL
SEQ ID NO:56
原卟啉Ⅸ结合蛋白质MGRASSL
SEQ ID NO:57
H2TmpyP结合蛋白YAGY
SEQ ID NO:58
H2TmpyP结合蛋白MGYAGY
SEQ ID NO:59
H2TmpyP结合蛋白YAGF
SEQ ID NO:60
H2TmpyP结合蛋白MGYAGF
SEQ ID NO:61
原卟啉Ⅸ结合蛋白质MG(HASYS)4
SEQ ID NO:62
原卟啉Ⅸ结合蛋白质MG(HASYS)8
SEQ ID NO:63
原卟啉Ⅸ结合蛋白质MG(RASSL)4
SEQ ID NO:64
原卟啉Ⅸ结合蛋白质MG(RASSL)8
序列表<110>Hiroki NAKAJIMA等人；Sumitomo Chemical Company Limited<120>使植物产生对杂草控制化合物的耐受性的方法<130><150>JP 10/120553<151>1998-04-30<150>JP 10/281127<151>1998-10-02<150>JP 10/330981<151>1998-11-20<150>JP 11/054730<151>1999-03-02<160>64<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增bchH基因设计的寡核苷酸引物<400>1gacatctaga ggagacgacc atatgcacgg tgaagtctc       39<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增bchH基因设计的寡核苷酸引物<400>2acggaagctt agatcttcac tcggcggcaa t               31<210>3<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增大豆PPO基因设计的寡核苷酸引物<400>3tcgagctcca tggtttccgt cttcaacgag atcctattc       39<210>4<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增大豆PPO基因设计的寡核苷酸引物<400>4ttgtcgacaa ctgctactat ttgtacactc tatttg          36<210>5<211>1632<212>DNA<213>甘氨酸最大变种Williams82<220><221>CDS<222>(1)…(1632)<400>5atg gtt tcc gtc ttc aac gag atc cta ttc ccg ccg aac caa acc ctt     48Met Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro Pro Asn Gln Thr Leu1               5                  10                  15ctt cgc ccc tcc ctc cat tcc cca acc tct ttc ttc acc tct ccc act     96Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr
         20                  25                  30cga aaa ttc cct cgc tct cgc cct aac cct att cta cgc tgc tcc att    144Arg Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile
     35                  40                  45gcg gag gaa tcc acc gcg tct ccg ccc aaa acc aga gac tcc gcc ccc    192Ala Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr Arg Asp Ser Ala Pro
 50                  55                  60gtg gac tgc gtc gtc gtc ggc gga ggc gtc agc ggc ctc tgc atc gcc    240Val Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Val Ser Gly Leu Cys Ile Ala65                  70                  75                  80cag gcc ctc gcc acc aaa cac gcc aat gcc aac gtc gtc gtc acg gag    288Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Ala Asn Ala Asn Val Val Val Thr Glu
             85                  90                  95gcc cga gac cgc gtc ggc ggc aac atc acc acg atg gag agg gac gga    336Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Met Glu Arg Asp Gly
        100                 105                 110tac ctc tgg gaa gaa ggc ccc aac agc ttc cag cct tct gat cca atg    384Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met
    115                 120                 125ctc acc atg gtg gtg gac agt ggt tta aag gat gag ctt gtt ttg ggg    432Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly
130                 135                 140gat cct gat gca cct cgg ttt gtg ttg tgg aac agg aag ttg agg ccg    480Asp Pro Asp Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro145                 150                 155                 160gtg ccc ggg aag ctg act gat ttg cct ttc ttt gac ttg atg agc att    528Val Pro Gly Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile
            165                 170                 175ggt ggc aaa atc agg gct ggc ttt ggt gcg ctt gga att cgg cct cct    576Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro
        180                 185                 190cct cca ggt cat gag gaa tcg gtt gaa gag ttt gtt cgt cgg aac ctt    624Pro Pro Gly His Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu
    195                 200                 205ggt gat gag gtt ttt gaa cgg ttg ata gag cct ttt tgt tca ggg gtc    672Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val
210                 215                 220tat gca ggc gat cct tca aaa tta agt atg aaa gca gca ttc ggg aaa    720Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys225                 230                 235                 240gtt tgg aag ctg gaa aaa aat ggt ggt agc att att ggt gga act ttc    768Val Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe
            245                 250                 255aaa gca ata caa gag aga aat gga gct tca aaa cca cct cga gat ccg    816Lys Ala Ile Gln Glu Arg Asn Gly Ala Ser Lys Pro Pro Arg Asp Pro
        260                 265                 270cgt ctg cca aaa cca aaa ggt cag act gtt gga tct ttc cgg aag gga    864Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly
    275                 280                 285ctt acc atg ttg cct gat gca att tct gcc aga cta ggc aac aaa gta    912Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Lys Val
290                 295                 300aag tta tct tgg aag ctt tca agt att agt aaa ctg gat agt gga gag    960Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys Leu Asp Ser Gly Glu305                 310                 315                 320tac agt ttg aca tat gaa aca cca gaa gga gtg gtt tct ttg cag tgc   1008Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Leu Gln Cys
            325                 330                 335aaa act gtt gtc ctg acc att cct tcc tat gtt gct agt aca ttg ctg   1056Lys Thr Val Val Leu Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Thr Leu Leu
        340                 345                 350cgt cct ctg tct gct gct gct gca gat gca ctt tca aag ttt tat tac   1104Arg Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr
    355                 360                 365cct cca gtt gct gca gtt tcc ata tcc tat cca aaa gaa gct att aga   1152Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg
370                 375                 380tca gaa tgc ttg ata gat ggt gag ttg aag ggg ttt ggt caa ttg cat   1200Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His385                 390                 395                 400cca cgt agc caa gga gtg gaa aca tta gga act ata tac agc tca tca   1248Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser
            405                 410                 415cta ttc ccc aac cga gca cca cct gga agg gtt cta ctc ttg aat tac   1296Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr
        420                 425                 430att gga gga gca act aat act gga att tta tcg aag acg gac agt gaa   1344Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Asp Ser Glu
    435                 440                 445ctt gtg gaa aca gtt gat cga gat ttg agg aaa atc ctt ata aac cca   1392Leu Val Glu Thr Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Ile Leu Ile Asn Pro
450                 455                 460aat gcc cag gat cca ttt gta gtg ggg gtg aga ctg tgg cct caa gct   1440Asn Ala Gln Asp Pro Phe Val Val Gly Val Arg Leu Trp Pro Gln Ala465                 470                 475                 480att cca cag ttc tta gtt ggc cat ctt gat ctt cta gat gtt gct aaa   1488Ile Pro Gln Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Val Ala Lys
            485                 490                 495gct tct atc aga aat act ggg ttt gaa ggg ctc ttc ctt ggg ggt aat   1536Ala Ser Ile Arg Asn Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn
        500                 505                 510tat gtg tct ggt gtt gcc ttg gga cga tgc gtt gag gga gcc tat gag   1584Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu
    515                 520                 525gta gca gct gaa gta aac gat ttt ctc aca aat aga gtg tac aaa tag   1632Val Ala Ala Glu Val Asn Asp Phe Leu Thr Asn Arg Val Tyr Lys
530                 535                 540         543<210>6<211>543<212>PRT<213>甘氨酸最大变种Williams82<400>6Met Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro Pro Asn Gln Thr Leu1               5                  10                  15Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr
         20                  25                  30Arg Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile
     35                  40                 45Ala Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr Arg Asp Ser Ala Pro
 50                  55                  60Val Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Val Ser Gly Leu Cys Ile Ala65                 70                   75                  80Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Ala Asn Ala Asn Val Val Val Thr Glu
             85                  90                  95Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Met Glu Arg Asp Gly
        10                  105                 110Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met
    115                 120                 125Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly
130                 135                 140Asp Pro Asp Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro145                 150                 155                 160Val Pro Gly Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile
            165                 170                 175Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro
        180                 185                 190Pro Pro Gly His Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu
    195                 200                 205Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val
210                 215                 220Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys225                 230                 235                 240Val Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe
            245                 250                 255Lys Ala Ile Gln Glu Arg Asn Gly Ala Ser Lys Pro Pro Arg Asp Pro
        260                 265                 270Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly
    275                 280                 285Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Lys Val
290                 295                 300Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys Leu Asp Ser Gly Glu305                 310                 315                 320Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Leu Gln Cys
            325                 330                 335Lys Thr Val Val Leu Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Thr Leu Leu
        340                 345                 350Arg Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr
    355                 360                 365Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg
370                 375                 380Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His385                 390                 395                 400Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser
            405                 410                 415Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr
        420                 425                 430Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Asp Ser Glu
    435                 440                 445Leu Val Glu Thr Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Ile Leu Ile Asn Pro
450                 455                 460Asn Ala Gln Asp Pro Phe Val Val Gly Val Arg Leu Trp Pro Gln Ala465                 470                 475                 480Ile Pro Gln Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Val Ala Lys
            485                 490                 495Ala Ser Ile Arg Asn Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn
        500                 505                 510Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu
    515                 520                 525Val Ala Ala Glu Val Asn Asp Phe Leu Thr Asn Arg Val Tyr Lys
530                 535                 540         543<210>7<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><213>为扩增bchH基因设计的寡核苷酸引物<400>7gacatctagt ctagacgacc atatgcacgg tgaagtctc    39<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增bchH基因设计的寡核苷酸引物<400>8acggaagctt ggtacctcac tcggcggcaa t     31<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增具有烟草chlH基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物<400>9ccaatgtaat gctatggtac ctatgttatt cactc 35<210>10<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增具有烟草chlH基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物<400>10gagatcattc tttttgctgt cgacttatcg atcg   34<210>11<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物<400>11ggcggaggcg tcaccatggt ctgcatcgcc caggcc 36<210>12<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物<400>12gcctgcaggt cgacaactgc tactatttgt acactc 36<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物<400>13cacaggaaag gtaccatggt ctgcatcgcc cag   33<210>14<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物<400>14cctgcagctc gagagctcct actatttgta cac   33<210>15<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增衣藻属PPO基因设计的寡核苷酸引物<400>15aatgatgttg acccagactc ctgggacc    28<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增衣藻属PPO基因设计的寡核苷酸引物<400>16tactacacat cccagcaagc gccaatg     27<210>17<211>1838<212>DNA<213>雷氏衣藻CC407<220><221>CDS<222>(2)…(1693)<400>17a atg atg ttg acc cag act cct ggg acc gcc acg gct tct agc cgg       46Met Met Leu Thr Gln Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ala Ser Ser Arg
1               5                  10                  15cgg tcg cag atc cgc tcg gct gcg cac gtc tcc gcc aag gtc gcg cct     94Arg Ser Gln Ile Arg Ser Ala Ala His Val Ser Ala Lys Val Ala Pro
             20                  25                  30cgg ccc acg cca ttc tcg gtc gcg agc ccc gcg acc gct gcg agc ccc    142Arg Pro Thr Pro Phe Ser Val Ala Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ser Pro
         35                  40                  45gcg acc gcg gcg gcc cgc cgc aca ctc cac cgc act gct gcg gcg gcc    190Ala Thr Ala Ala Ala Arg Arg Thr Leu His Arg Thr Ala Ala Ala Ala
     50                  55                  60act ggt gct ccc acg gcg tcc gga gcc ggc gtc gcc aag acg ctc gac    238Thr Gly Ala Pro Thr Ala Ser Gly Ala Gly Val Ala Lys Thr Leu Asp
 65                  70                  75aat gtg tat gac gtg atc gtg gtc ggt gga ggt ctc tcg ggc ctg gtg    286Asn Val Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Gly Gly Leu Ser Gly Leu Val80                  85                  90                  95acc ggc cag gcc ctg gcg gct cag cac aaa att cag aac ttc ctt gtt    334Thr Gly Gln Ala Leu Ala Ala Gln His Lys Ile Gln Asn Phe Leu Val
            100                 105                 110acg gag gct cgc gag cgc gtc ggc ggc aac att acg tcc atg tcg ggc    382Thr Glu Ala Arg Glu Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Ser Met Ser Gly
        115                 120                 125gat ggc tac gtg tgg gag gag ggc ccg aac agc ttc cag ccc aac gat    430Asp Gly Tyr Val Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Asn Asp
    130                 135                 140agc atg ctg cag att gcg gtg gac tct ggc tgc gag aag gac ctt gtg    478Ser Met Leu Gln Ile Ala Val Asp Ser Gly Cys Glu Lys Asp Leu Val
145                 150                 155ttc ggt gac ccc acg gct ccc cgc ttc gtg tgg tgg gag ggc aag ctg    526Phe Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe Val Trp Trp Glu Gly Lys Leu160                 165                 170                 175cgc ccc gtg ccc tcg ggc ctg gac gcc ttc acc ttc gac ctc atg tcc    574Arg Pro Val Pro Ser Gly Leu Asp Ala Phe Thr Phe Asp Leu Met Ser
            180                 185                 190atc ccc ggc aag atc cgc gcc ggg ctg ggc gcc atc ggc ctc atc aac    622Ile Pro Gly Lys Ile Arg Ala Gly Leu Gly Ala Ile Gly Leu Ile Asn
        195                 200                 205gga gcc atg ccc tcc ttc gag gag agt gtg gag cag ttc atc cgc cgc    670Gly Ala Met Pro Ser Phe Glu Glu Ser Val Glu Gln Phe Ile Arg Arg
    210                 215                 220aac ctg ggc gat gag gtg ttc ttc cgc ctg atc gag ccc ttc tgc tcc    718Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Phe Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser
225                 230                 235ggc gtg tac gcg ggc gac ccc tcc aag ctg tcc atg aag gcg gcc ttc    766Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe240                 245                 250                 255aac agg atc tgg att ctg gag aag aac ggc ggc agc ctg gtg gga ggt    814Asn Arg Ile Trp Ile Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Leu Val Gly Gly
            260                 265                 270gcc atc aag ctg ttc cag gaa cgc cag tcc aac ccg gcc ccg ccg cgg    862Ala Ile Lys Leu Phe Gln Glu Arg Gln Ser Asn Pro Ala Pro Pro Arg
        275                 280                 285gac ccg cgc ctg ccg ccc aag ccc aag ggc cag acg gtg ggc tcg ttc    910Asp Pro Arg Leu Pro Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe
    290                 295                 300cgc aag ggc ctg aag atg ctg ccg gac gcc att gag cgc aac atc ccc    958Arg Lys Gly Leu Lys Met Leu Pro Asp Ala Ile Glu Arg Asn Ile Pro
305                310                  315gac aag atc cgc gtg aac tgg aag ctg gtg tct ctg ggc cgc gag gcg   1006Asp Lys Ile Arg Val Asn Trp Lys Leu Val Ser Leu Gly Arg Glu Ala320                 325                 330                 335gac ggg cgg tac ggg ctg gtg tac gac acg ccc gag ggc cgt gtc aag   1054Asp Gly Arg Tyr Gly Leu Val Tyr Asp Thr Pro Glu Gly Arg Val Lys
            340                 345                 350gtg ttt gcc cgc gcc gtg gct ctg acc gcg ccc agc tac gtg gtg gcg   1102Val Phe Ala Arg Ala Val Ala Leu Thr Ala Pro Ser Tyr Val Val Ala
        355                 360                 365gac ctg gtc aag gag cag gcg ccc gcc gcc gcc gag gcc ctg ggc tcc   1150Asp Leu Val Lys Glu Gln Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ser
    370                 375                 380ttc gac tac ccg ccg gtg ggc gcc gtg acg ctg tcg tac ccg ctg agc   1198Phe Asp Tyr Pro Pro Val Gly Ala Val Thr Leu Ser Tyr Pro Leu Ser
385                 390                 395gcc gtg cgg gag gag cgc aag gcc tcg gac ggg tcc gtg ccg ggc ttc   1246Ala Val Arg Glu Glu Arg Lys Ala Ser Asp Gly Ser Val Pro Gly Phe400                 405                 410                 415ggt cag ctg cac ccg cgc acg cag ggc atc acc act ctg ggc acc atc   1294Gly Gln Leu His Pro Arg Thr Gln Gly Ile Thr Thr Leu Gly Thr Ile
            420                 425                 430tac agc tcc agc ctg ttc ccc ggc cgc gcg ccc gag ggc cac atg ctg   1342Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Gly Arg Ala Pro Glu Gly His Met Leu
        435                 440                 445ctg ctc aac tac atc ggc ggc acc acc aac cgc ggc atc gtc aac cag   1390Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Thr Thr Asn Arg Gly Ile Val Asn Gln
    450                 455                 460acc acc gag cag ctg gtg gag cag gtg gac aag gac ctg cgc aac atg   1438Thr Thr Glu Gln Leu Val Glu Gln Val Asp Lys Asp Leu Arg Asn Met
465                 470                 475gtc atc aag ccc gac gcg ccc aag ccc cgt gtg gtg ggc gtg cgc gtg   1486Val Ile Lys Pro Asp Ala Pro Lys Pro Arg Val Val Gly Val Arg Val480                  485                490                 495tgg ccg cgc gcc atc ccg cag ttc aac ctg ggc cac ctg gag cag ctg    1534Trp Pro Arg Ala Ile Pro Gln Phe Asn Leu Gly His Leu Glu Gln Leu
            500                 505                 510gac aag gcg cgc aag gcg ctg gac gcg gcg ggg ctg cag ggc gtg cac    1582Asp Lys Ala Arg Lys Ala Leu Asp Ala Ala Gly Leu Gln Gly Val His
        515                 520                 525ctg ggg ggc aac tac gtc agc ggt gtg gcc ctg ggc aag gtg gtg gag    1630Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Lys Val Val Glu
    530                 535                 540cac ggc tac gag tcc gca gcc aac ctg gcc aag agc gtg tcc aag gcc    1678His Gly Tyr Glu Ser Ala Ala Asn Leu Ala Lys Ser Val Ser Lys Ala
545                 550                 555gca gtc aag gcc taa gcggctgcag cagtagcagc agcagcatcg ggctgtagct    1733Ala Val Lys Ala560         563ggtaaatgcc gcagtggcac cggcagcagc aattggcaag cacttggggc aagcggagtg  1793gaggcgaggg gggggctacc attggcgctt gctgggatgt gtagt                  1838<210>18<21l>563<212>PRT<213>雷氏衣藻CC407<400>18Met Met Leu Thr Gln Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ala Ser Ser Arg
1               5                  10                  15Arg Ser Gln Ile Arg Ser Ala Ala His Val Ser Ala Lys Val Ala Pro
             20                  25                  30Arg Pro Thr Pro Phe Ser Val Ala Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ser Pro
         35                  40                  45Ala Thr Ala Ala Ala Arg Arg Thr Leu His Arg Thr Ala Ala Ala Ala
     50                  55                  60Thr Gly Ala Pro Thr Ala Ser Gly Ala Gly Val Ala Lys Thr Leu Asp
 65                  70                  75Asn Val Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Gly Gly Leu Ser Gly Leu Val80                  85                  90                  95Thr Gly Gln Ala Leu Ala Ala Gln His Lys Ile Gln Asn Phe Leu Val
            100                 105                 110Thr Glu Ala Arg Glu Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Ser Met Ser Gly
        115                 120                 125Asp Gly Tyr Val Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Asn Asp
    130                 135                 140Ser Met Leu Gln Ile Ala Val Asp Ser Gly Cys Glu Lys Asp Leu Val
145                 150                 155Phe Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe Val Trp Trp Glu Gly Lys Leu160                 165                 170                 175Arg Pro Val Pro Ser Gly Leu Asp Ala Phe Thr Phe Asp Leu Met Ser
            180                 185                 190Ile Pro Gly Lys Ile Arg Ala Gly Leu Gly Ala Ile Gly Leu Ile Asn
        195                 200                 205Gly Ala Met Pro Ser Phe Glu Glu Ser Val Glu Gln Phe Ile Arg Arg
    210                 215                 220Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Phe Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser
225                 230                 235Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe240                 245                 250                 255Asn Arg Ile Trp Ile Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Leu Val Gly Gly
            260                 265                 270Ala Ile Lys Leu Phe Gln Glu Arg Gln Ser Asn Pro Ala Pro Pro Arg
        275                 280                 285Asp Pro Arg Leu Pro Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe
    290                 295                 300Arg Lys Gly Leu Lys Met Leu Pro Asp Ala Ile Glu Arg Asn Ile Pro
305                 310                 315Asp Lys Ile Arg Val Asn Trp Lys Leu Val Ser Leu Gly Arg Glu Ala320                 325                 330                 335Asp Gly Arg Tyr Gly Leu Val Tyr Asp Thr Pro Glu Gly Arg Val Lys
            340                 345                 350Val Phe Ala Arg Ala Val Ala Leu Thr Ala Pro Ser Tyr Val Val Ala
        355                 360                 365Asp Leu Val Lys Glu Gln Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ser
    370                 375                 380Phe Asp Tyr Pro Pro Val Gly Ala Val Thr Leu Ser Tyr Pro Leu Ser
385                 390                 395Ala Val Arg Glu Glu Arg Lys Ala Ser Asp Gly Ser Val Pro Gly Phe400                 405                 410                 415Gly Gln Leu His Pro Arg Thr Gln Gly Ile Thr Thr Leu Gly Thr Ile
            420                 425                 430Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Gly Arg Ala Pro Glu Gly His Met Leu
        435                 440                 445Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Thr Thr Asn Arg Gly Ile Val Asn Gln
    450                 455                 460Thr Thr Glu Gln Leu Val Glu Gln Val Asp Lys Asp Leu Arg Asn Met
465                 470                 475Val Ile Lys Pro Asp Ala Pro Lys Pro Arg Val Val Gly Val Arg Val480                 485                 490                 495Trp Pro Arg Ala Ile Pro Gln Phe Asn Leu Gly His Leu Glu Gln Leu
            500                 505                 510Asp Lys Ala Arg Lys Ala Leu Asp Ala Ala Gly Leu Gln Gly Val His
        515                 520                 525Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Lys Val Val Glu
    530                 535                 540His Gly Tyr Glu Ser Ala Ala Asn Leu Ala Lys Ser Val Ser Lys Ala
545                 550                 555Ala Val Lys Ala560         563<210>19<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增具有衣藻属PPO基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物<400>19ggtcggtgga ggggatccga tgctggtgac cg    32<210>20<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增具有衣藻属PPO基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物<400>20gctactgctg cgagctctta ggccttgact gc    32<210>21<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增具有黄瓜铁螯合酶基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物<400>21gctttagaat cggatcctat ggcagtggat gac    33<210>22<211>36<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>为扩增具有黄瓜铁螯合酶基因部分序列的DNA片段而设计的寡核苷酸引物<400>22ggtgaacttc tatttgagct ctcaggtaaa tataag 36<210>23<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增大肠杆菌hemF基因设计的寡核苷酸引物<400>23gctgaaggcg tgatcagtta tttcc  25<210>24<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增大肠杆菌hemF基因设计的寡核苷酸引物<400>24catcagcctg cagtgcgaaa agtg   24<210>25<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增大肠杆菌hemF基因设计的寡核苷酸引物<400>25cgaaaaaggg atccgttatg aaaccc 26<210>26<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增大肠杆菌hemF基因设计的寡核苷酸引物<400>26gctgttttcc gagctcccgt cac    23<210>27<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码含有5个氨基酸的无规则肽的基因而设计的寡核苷酸<400>27tggccnnknn knnknnknnk gc        22<210>28<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码含有5个氨基酸的无规则肽的基因而设计的寡核苷酸<400>28ggccgcmnnm nnmnnmnnmn nggccagct 29<210>29<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽HASYS的基因而设计的寡核苷酸<400>29tggcccatgc tagttagtcg gc        22<210>30<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽HASYS的基因而设计的寡核苷酸<400>30tggcgccgac taactagcat gggccagct 29<210>31<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽RASSL的基因而设计的寡核苷酸<400>31tggcccgggc gtcgtcgttg gc        22<210>32<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽RASSL的基因而设计的寡核苷酸<400>32ggccgccaac gacgacgccc gggccagct 29<210>33<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MGHASYS的基因而设计的寡核苷酸<400>33catgggtcac gcttcttact cctaag   26<210>34<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MGHASYS的基因而设计的寡核苷酸<400>34aattcttagg agtaagaagc gtgacc   26<210>35<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MGRASYS的基因而设计的寡核苷酸<400>35catgggtcgt gcttcttccc tgtaag   26<210>36<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MGRASSL的基因而设计的寡核苷酸<400>36aattcttaca gggaagaagc acgacc   26<210>37<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MGYAGY的基因而设计的寡核苷酸<400>37catgggttac gctggctact aag    23<210>38<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MGYAGY的基因而设计的寡核苷酸<400>38aattcttagt agccagcgta acc    23<210>39<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MGYAGF的基因而设计的寡核苷酸<400>39catgggttac gctggcttct aag             23<210>40<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MGYAGF的基因而设计的寡核苷酸<400>40aattcttaga agccagcgta acc             23<210>41<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MG(HASYS)4的基因而设计的寡核苷酸<400>41catgggtcac gcttcttact cccatgcatc ttac 34<210>42<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MG(HASYS)4的基因而设计的寡核苷酸<400>42gtgggagtaa gatgcatggg agtaagaagc gtgacc  36<210>43<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MG(HASYS)4的基因而设计的寡核苷酸<400>43tcccacgctt cttactccca tgcatcttac tcctaag 37<210>44<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MG(HASYS)4的基因而设计的寡核苷酸<400>44aattcttagg agtaagatgc atgggagtaa gaagc 35<210>45<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MG(HASYS)8的基因而设计的寡核苷酸<400>45tcccacgctt cttactccca tgcatcttac       30<210>46<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MG(HASYS)8的基因而设计的寡核苷酸<400>46gtgggagtaa gatgcatggg agtaagaagc      30<210>47<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MG(RASSL)4的基因而设计的寡核苷酸<400>47catgggtcgt gcttcttccc tgcgcgcatc ttcc 34<210>48<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MG(RASSL)4的基因而设计的寡核苷酸<400>48acgcagggaa gatgcgcgca gggaagaagc acgacc  36<210>49<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MG(RASSL)4的基因而设计的寡核苷酸<400>49ctgcgtgctt cttccctgcg cgcatcttcc ctgtaag 37<210>50<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MG(RASSL)4的基因而设计的寡核苷酸<400>50aattcttaca gggaagatgc gcgcagggaa gaagc   35<210>51<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MG(RASSL)8的基因而设计的寡核苷酸<400>51ctgcgtgctt cttccctgcg cgcatcttcc         30<210>52<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>为合成可编码肽MG(RASSL)8的基因而设计的寡核苷酸peptide MG(RASSL)8<400>52acgcagggaa gatgcgcgca gggaagaagc   30<210>53<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>原卟啉      Ⅸ结合蛋白     HASYS<400>53His Ala Ser Tyr Ser1               5<210>54<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>原卟啉       Ⅸ结合蛋白       MGHASYS<400>54Met Gly His Ala Ser Tyr Ser1               5<210>55<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>原卟啉phyrin Ⅸ结合蛋白       RASSL<400>55Arg Ala Ser Ser Leu1               5<210>56<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>原卟啉    Ⅸ结合蛋白    MGRASSL<400>56Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu1                5<210>57<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>H2TMpyP   结合蛋白      YAGY.<400>57Tyr Ala Gly Tyr 4<210>58<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>HzTMpyP   结合蛋白      MGYAGY<400>58Met Gly Tyr Ala Gly Tyr1               5<210>59<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>H2TMpyP    结合蛋白    YAGF<400>59Tyr Ala Gly Phe1<210>60<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>H2TMpyP    结合蛋白    MGYAGF<400>60Met Gly Tyr Ala Gly Phe1               5<210>61<211>22<212>PRT<213>人工序列<220><223>原卟啉    Ⅸ结合蛋白    MG(HASYS)4<400>61Met Gly His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr1               5                  10                  15Ser His Ala Ser Tyr Ser
         20<210>62<211>42<212>PRT<213>人工序列<220><223>原卟啉    Ⅸ结合蛋白    MG(HASYS)8<400>62Met Gly His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr1               5                  10                  15Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser
         20                  25                  30His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser
     35                  40<210>63<211>22<212>PRT<213>人工序列<220><223>原卟啉    Ⅸ：结合蛋白    MG(RASSL)4<400>63Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser1               5                  10                  15Leu Arg Ala Ser Ser Leu
         20<210>64<211>42<212>PRT<213>人工序列<220><223>原卟啉      Ⅸ结合蛋    MG(RASSL)8.<400>64Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser1               5                  10                  15Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu
        20                   25                  30Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu
     35                  40

Claims (51)

1．一种使植物产生杂草防治化合物耐受性的方法，包括下列步骤：
将一种可编码一种蛋白质的基因引入植物细胞并且表达该基因，所述的蛋白质具有下列(a)至(c)特征：
(a)对可导致杂草防治化合物的杂草防治活性的物质具有特异性亲和性；
(b)对与所述蛋白质有特异性亲和性的物质基本不具有修饰能力；
(c)基本上不含免疫球蛋白中可变区的构架区。
2．根据权利要求1的方法，其中以这样一种方式将基因引入植物细胞、即以可操作的方式将它与均可在植物细胞中起作用的启动子和终止子进行连接。
3．根据权利要求1或2的方法，其中可导致杂草防治化合物的杂草防治活性的物质是杂草防治化合物自身。
4．根据权利要求1的方法，其中可导致杂草防治化合物的杂草防治活性的物质是衍生于一种植物的内源性物质。
5．根据权利要求1的方法，其中杂草防治化合物是可抑制植物卟啉的生物合成的物质。
6．根据权利要求1的方法，其中杂草防治化合物是原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物。
7．根据权利要求5或6的方法，其中可导致杂草防治化合物的杂草防治活性的物质是原卟啉Ⅸ。
8．根据权利要求5或6的方法，其中蛋白质是镁螯合酶的原卟啉Ⅸ结合亚单位蛋白、或对原卟啉Ⅸ具有特异性亲和性的蛋白质变体。
9．根据权利要求8的方法，其中蛋白质是衍生于光合微生物的镁螯合酶。
10．根据权利要求8的方法，其中蛋白质是衍生于一种植物的镁螯合酶。
11．根据权利要求8的方法，其中蛋白质是衍生于烟草的镁螯合酶。
12．根据权利要求5或6的方法，其中蛋白质含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列。
13．根据权利要求5或6的方法，其中蛋白质具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
14．根据权利要求5或6的方法，其中蛋白质含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
15．根据权利要求5或6的方法，其中蛋白质具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列。
16．根据权利要求5或6的方法，其中蛋白质含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
17．根据权利要求5或6的方法，其中蛋白质含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
18．根据权利要求5或6的方法，其中蛋白质具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
19．根据权利要求5或6的方法，其中蛋白质具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
20．根据权利要求5或6的方法，其中蛋白质由4-100个氨基酸组成。
21．根据权利要求5或6的方法，其中可导致杂草防治化合物的杂草防治活性的物质是原卟啉原Ⅸ。
22．根据权利要求5或6的方法，其中蛋白质是一种对原卟啉原Ⅸ没有氧化能力、而对原卟啉原Ⅸ具有特异性亲和性的原卟啉原Ⅸ氧化酶的变体。
23．根据权利要求5或6的方法，其中蛋白质是一种对原卟啉原Ⅸ没有氧化能力、而对原卟啉Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物具有特异性亲和性的原卟啉原Ⅸ氧化酶的变体。
24．根据权利要求22或23的方法，其中蛋白质是一种衍生于植物的原卟啉原Ⅸ氧化酶的变体。
25．根据权利要求22或23的方法，其中蛋白质是一种衍生于大豆的原卟啉原Ⅸ氧化酶的变体。
26．根据权利要求22或23的方法，其中蛋白质是一种衍生于藻类的原卟啉原Ⅸ氧化酶的变体。
27．根据权利要求22或23的方法，其中蛋白质是一种衍生于衣藻属的原卟啉原Ⅸ氧化酶的变体。
28．一种使植物产生杂草控制化合物抗性的方法，包括下列步骤：
将一种可编码一种蛋白质的基因引入植物细胞并且表达该基因，所述的蛋白质具有下列(a)至(c)特征：
(a)对原卟啉Ⅸ具有特异性亲和性；
(b)对原卟啉原Ⅸ基本不具有修饰能力；
(c)基本上不含免疫球蛋白中可变区的构架区。
29．根据权利要求28的方法，其中在植物细胞中以这样一种方式将基因引入植物细胞、即以可操作的方式将该基因与均可在植物细胞内起作用的启动子和终止子进行连接。
30．根据权利要求28的方法，其中杂草防治化合物是可抑制植物卟啉的生物合成的物质。
31．根据权利要求28的方法，其中杂草防治化合物是一种原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物。
32．根据权利要求30或31的方法，其中蛋白质是镁螯合酶或对原卟啉Ⅸ具有特异性亲和性的所述蛋白质的变体。
33．根据权利要求30或31的方法，其中蛋白质是铁螯合酶或对原卟啉Ⅸ具有特异性亲和性的所述蛋白质的变体。
34．根据权利要求30或31的方法，其中蛋白质是衍生于一种植物铁螯合酶。
35．根据权利要求30或31的方法，其中蛋白质是衍生于大麦属的铁螯合酶。
36．根据权利要求30或31的方法，其中蛋白质是来自黄瓜的铁螯合酶。
37．根据权利要求30或31的方法，其中蛋白质是一种由4-100个氨基酸组成的肽。
38．一种使植物产生杂草防治化合物耐受性的方法，包括下列步骤：
将一种可编码一种蛋白质的基因引入植物细胞并且表达该基因，所述的蛋白质具有下列(a)至(c)特征：
(a)对原卟啉原Ⅸ具有特异性亲和性；
(b)对粪卟啉原Ⅲ具有修饰能力；
(c)基本上不含免疫球蛋白中可变区的构架区。
39．根据权利要求38的方法，其中以这样一种方式将基因引入植物细胞、即以可操作的方式将该基因与均可在植物细胞内起作用的启动子和终止子进行连接。
40．根据权利要求38的方法，其中蛋白质是粪卟啉原Ⅲ或对原卟啉原Ⅸ具有特异性亲和性的所述蛋白质的变体。
41．根据权利要求38的方法，其中蛋白质是衍生于一种微生物的粪卟啉原Ⅲ氧化酶。
42．根据权利要求38的方法，其中蛋白质是衍生于大肠杆菌的粪卟啉原Ⅲ氧化酶。
43．一种耐杂草防治化合物的植物，其耐受性按照权利要求1或28的方法而产生。
44．一种耐杂草防治化合物的植物，其耐受性按照权利要求38的方法而产生。
45．一种用于保护植物的方法，包括给所述权利要求43的植物的生长区施用所述的杂草防治化合物。
46．一种用于保护植物的方法，包括给所述权利要求44的植物的生长区施用所述的杂草防治化合物。
47．一种用于选择植物的方法，包括给权利要求43的植物和其它植物的生长区施用对权利要求43植物来说是耐受性的杂草防治化合物、并且根据植物间的生长差异来选择植物。
48．一种用于选择植物的方法，包括给权利要求44的植物和其它植物的生长区施用对权利要求44植物来说是耐受性的杂草防治化合物、并且根据植物间的生长差异来选择植物。
49．根据权利要求47的方法，其中植物是植物细胞。
50．根据权利要求48的方法，其中植物是植物细胞。
51．根据权利要求1或2的方法，其中杂草防治化合物是选自下列(1)至(3)化合物的原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物；并且可导致杂草防治化合物的杂草防治活性的物质是原卟啉Ⅸ、原卟啉原Ⅸ或一种原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物：
(1)氯硝醚、治草醚、草枯醚、氟锁草醚及其乙酯、氟锁草醚钠、氟硝草醚、恶草灵、2-[4-氯-2-氟-5-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,3,4,5,6,7-六氢化-1H-异吲哚-1,3-二酮、chlorphthalim、乙基TNPP、或N3-(1-苯乙基)-2,6-二甲基-5-丙炔基(propyonyl)烟酰胺；
(2)由一般通式J-G(1)任意一个所代表的化合物，其中G是由通式G-1至G-9之任一，J是由通式J-1至J-30之任一代表的基团：
Figure A9910530000071
Figure A9910530000091
其中通式J-5、J-6、J-12和J-24中的虚线代表含有单键的左旋环；或环中的一个键是碳原子间的双键；
X是氧原子或硫原子；
Y是氧原子或硫原子；
R1是氢原子或卤原子；
R2是氢原子、C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、卤原子、OH基、OR27基、SH基、S(O)pR27基、COR27基、CO2R27基、C(O)SR27基、C(O)NR29R30基、CHO基、CR27=NOR36基、CH=CR37CO2R27基、CH2CHR37CO2R27基、CO2N=CR31R32基、硝基、氰基、NHSO2R33基、NHSO2NHR33基、NR27R38基、NH2基或任意用一个或多个以及相同或不同的C1-C44烷基取代的苯基；
P是0、1或2；
R3是C1-C2烷基、C1-C2卤代烷基、OCH3基、SCH3基、OCHF2基、卤原子、氰基或硝基；
R4氢原子、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基或卤原子；
R5是氢原子、C1-C3烷基、卤原子、C1-C3卤代烷基、环丙基、乙烯基、C2炔基、氰基、C(O)R38基、CO2R38基、C(O)NR38R39基、CR34R35CN基、CR34R35C(O)R38基、CR34R35CO2R38基、CR34R35C(O)NR38R39基、CHR34OH基、CHR34OC(O)R38基或OCHR34OC(O)NR38R39基；或当G是G-2或G-6时，R4和R5可以与连接它们的碳原子一起形成C=O基；
R6是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烷氧基烷基、C3-C6链烯基或C3-C6炔基；
X1是单键、氧原子、硫原子、NH基、N(C1-C3烷基)基团、N(C1-C3卤代烷基)基团或N(烯丙基)基团；
R7是氢原子、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤原子、S(O)2(C1-C6烷基)基团或C(=O)R40基；
R8是氢原子、C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C3-C8链烯基、C3-C8炔基、C1-C8卤代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C3-C8烷氧基烷氧基烷基、C3-C8卤代炔基、C3-C8卤代链烯基、C1-C8烷磺酰基、C1-C8卤代烷磺酰基、C3-C8烷氧基羰基烷基、S(O)2NH(C1-C8烷基)基团、C(O)R41基或其苯环可以被R42取代的苄基；
n和m独立地为0、1、2或3且m+n为2或3；
Z是CR9R10基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基团；
R9各自独立地为氢原子、C1-C3烷基、卤原子、羟基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6卤代烷基羰基氧基；
R10各自独立地为氢原子、C1-C3烷基、和羟基或卤原子；
R11和R12独立地为氢原子、卤原子、C1-C6烷基、C3-C6链烯基或C1-C6卤代烷基；
R13是氢原子、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C6链烯基、C3-C6卤代链烯基、C3-C6炔基、C3-C6卤代炔基、HC(=O)基、(C1-C4烷基)C(=O)基团或NH2基；
R14是C1-C6烷基、C1-C6烷硫基、C1-C6卤代烷基或N(CH3)2基；
W是氮原子或CR15；
R15是氢原子、C1-C6烷基、卤原子、任意被C1-C6烷基或一个或多个卤原子取代的苯基、C1-C6烷氧基或CF3基；
Q各自独立地为氧原子或硫原子；
Q1是氧原子或硫原子；
Z1是CR16R17基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基团；
R16各自独立地为氢原子、卤原子、羟基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6卤代烷基羰基氧基；
R17各自独立地为氢原子、羟基或卤原子；
R18是C1-C6烷基、卤原子或C1-C6卤代烷基；
R19和R20独立地为氢原子、C1-C6烷基或C1-C6卤代烷基；
Z2是氧原子、硫原子、NR9基或CR9R10基；
R21和R22独立地为C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C6链烯基、C3-C6卤代链烯基、C3-C6炔基或C3-C6卤代炔基；
R23是氢原子、卤原子或氰基；
R24是C1-C6烷磺酰基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C6链烯基、C3-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基或卤原子；
R25是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C6链烯基或C3-C6炔基；
R26是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基或任意被取代基取代的苯基，所述的取代基选自由1-2个卤原子、1-2个硝基、C1-C6烷氧基和CF3基组成的组；
W1是氮原子或CH基；
T是由下列一般通式T-1、T-2和T-3所代表的任意基团之一：
Figure A9910530000111
(其中E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10、E11和E12独立地为氢原子或C1-C3烷基)；
R27是C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C3-C8链烯基、C3-C8炔基、C1-C8卤代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C2-C8烷硫基烷基、C2-C8烷亚磺酰基烷基、C2-C8烷磺酰基烷基、C1-C8烷磺酰基、其苯环可以被至少一个选自由卤原子和C1-C4烷基组成的组的取代基取代的苯磺酰基、C4-C8烷氧基烷氧基烷基、C4-C8环烷基烷基、C6-C8环烷氧基烷基、C4-C8链烯基氧基烷基、C4-C8炔基氧基烷基、C3-C8卤代烷氧基烷基、C4-C8卤代链烯基氧基烷基、C4-C8卤代炔基氧基烷基、C6-C8环烷硫基烷基、C4-C8链烯基硫代烷基、C4-C8炔基硫代烷基、被苯氧基取代的C1-C4烷基；其中苯氧基的苯环被至少一个选自由卤原子、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基组成的组的取代基取代、被苄氧基取代的C1-C4烷基；其中苄氧基的环被至少一个选自由卤原子、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基组成的组的取代基取代、C4-C8三烷基甲硅烷基烷基、C3-C8氰基烷基、C3-C8卤代环烷基、C3-C8卤代链烯基、C5-C8烷氧基链烯基、C5-C8卤代烷氧基链烯基、C5-C8烷基硫代链烯基、C3-C8卤代炔基、C5-C8烷氧基链烯基、C5-C8卤代烷氧基链烯基、C5-C8烷基硫代炔基、C2-C8烷基羰基、其苯环被至少一个选自由卤原子、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基组成的组的取代基取代的苄基、CHR34COR28基、CHR34COOR28基、CHR34P(O)(OR28)2基、CHR34P(S)(OR28)2基、CHR34C(O)NR29R30基或CHR34C(O)NH2基；
R28是C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C3-C6炔基或四氢呋喃基；
R29和R31独立地为氢原子或C1-C4烷基；
R30和R32独立地为C1-C4烷基或其环可以被至少一个取代基取代的苯基，所述的取代基选自由卤原子、C1-C3烷基和C1-C3卤代烷基组成的组；或
R29和R30一起可以形成-(CH2)5-、-(CH2)4-或-CH2CH2OCH2CH2-，或由此形成的环可以被至少一个选自由C1-C3烷基、苯基和苄基组成的组的取代基取代；或
R31和R32与连接它们的碳原子一起可以形成C3-C8环烷基；
R33是C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基或C3-C6链烯基；
R34和R35独立地为氢原子或C1-C4烷基；
R36是氢原子、C1-C6烷基、C3-C6链烯基或C3-C6炔基；
R37是氢原子、C1-C4烷基或卤原子；
R38是氢原子、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6链烯基、C3-C6炔基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6卤代烷基、其环可以被选自由卤原子、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基组成的组的取代基取代的苯基、-CH2CO2(C1-C4烷基)基团或-CH(CH3)CO2(C1-C4烷基)基团；
R39是氢原子、C1-C2烷基或C(O)O(C1-C4烷基)基团；
R40是氢原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或NH(C1-C4烷基)基团；
R41是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、NH(C1-C4烷基)基团、其环可以被选自由基团R42、苄基和C2-C8二烷氨基组成的组的一个取代基取代的苯基；且
R42是C1-C6烷氧基、一个或两个卤原子、C1-C6烷氧基或CF3基；
(3)通式(Ⅱ)的化合物：
或nipilacrofen，
其中R43是C1-C4烷基；
R44是C1-C4烷基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷硫基和C1-C4卤代烷氧基；
R43和R44一起可以形成-(CH2)3-或-(CH2)4-；
R45是氢原子或卤原子；
R46是氢原子或C1-C4烷基；
R47是氢原子、硝基、氰基、-COOR49、-C(=X)NR50R51基或-C(=X2)R52基；
R48是氢原子、卤原子、氰基、被至少一个选自由卤原子和羟基组成的组的取代基任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、被至少一个选自由卤原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤代C1-C4烷基组成的组的取代基任意取代的苯基、吡咯基、C2-C8烷基、C3-C8链烯基、C3-C8炔基、C3-C8烷氧基、选自由C2-C8烷基、C3-C8链烯基、C3-C8炔基和C3-C8烷氧基组成的组的一个基团，在该基团中至少插入一个氧原子；或R48是由下列通式所代表的任意一个基团：-NR53R54
Figure A9910530000141
-OR58    -S(O)fR59
Figure A9910530000143
Figure A9910530000144
-(CH2)a-A-(CH2)a-O-(CH2)b-R64   -(CH2)a-O-R65    -COR66
其中R49、R50和R52相同或不同、为氢原子或C1-C4烷基；
R50和R51与连接它们的氯原子一起可以形成饱和的脂环5或6节环；
R52是氢原子、C1-C4烷基或被至少一个卤原子取代的C1-C4烷基；
R53是氢原子、被至少一个卤原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一个卤原子任意取代的C2-C6链烯基、被至少一个卤原子任意取代的C3-C6的炔基、被至少一个卤原子任意取代的苯基、C3-C8环烷基、氰甲基、或R63CO-基；
R54是氢原子、被至少一个卤原子任意取代的C1-C6烷基、被至少一个卤原子任意取代的C2-C6链烯基、被至少一个卤原子任意取代的C3-C6炔基、被至少一个卤原子任意取代的苯基、C3-C8环烷基、氰甲基、C1-C4烷氧基-C1-C6烷基、二-C1-C4烷氨基-C1-C4烷基、四氢糠基甲基、C3-C6炔基氧基-C1-C4烷基、其环可以被选自由卤原子、硝基、氰基、C1-C4烷氧基和卤代-C1-C4烷基组成的组的取代基取代的苄基、-C(=X2)R63基、-(CH2)a-(O)d-R70基、-(CH2)a-(O)b-R70基、-(CH2)a-X2-R76基；
R53和R54与连接它们的碳原子一起可以形成饱和脂环3、5或6节环或芳香5或6节环，它的一个环碳原子可以被氧原子取代；
R55是氢原子、C1-C4烷基、C2-C6链烯基或C3-C6炔基；或R55和R56一起可以形成-(CH2)e-；
R56和R57独立地为被至少一个卤原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一个卤原子任意取代的C2-C6链烯基、被至少一个卤原子任意取代的C3-C6炔基或被至少一个卤原子任意取代的苯基、氢原子、C3-C6环烷基、XR60基或-NR61R62基；
R58是氢原子、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C3-C6炔基、C1-C4烷基羰基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、二C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、苄基、C1-C4烷氧基--C1-C4炔基、-(CH2)a-R75基、-(CH2)a-X2-R72基、-(CH2)a-X2-(CH2)b-R72基或-(CH2)a-X2-(CH2)b-X2-(CH2)c-R72基；
R59是氢原子、C1-C4烷基、C2-C6链烯基、C3-C6炔基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷基羰基-C1-C3烷基或苯基；
R60是被至少一个卤原子任意取代的C1-C4烷基；
R61和R62相同或不同、为氢原子或C1-C4烷基；
R63是被至少一个卤原子任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷基、C1-C4烷硫基-C1-C4烷基、C3-C6环烷基、其环可以被至少一个选自由卤原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤代--C1-C4烷基组成的组的取代基取代的苯基、-NR73R74基或-(CH2)a-(O)d-R75基；
R64是C1-C4烷氧基羰基或羧基；
R65是氯甲基、氰甲基、至少可以插入一个氧原子的C3-C6环烷基、或C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基；
R66是羟基或-NR67R68基；
A是-NR67R68基或-S(O)f-R69基；
R67和R68相同或不同、为氢原子或C1-C4烷基；
R69是C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基；
R70是氢原子、羟基、卤原子、被至少一个C1-C4烷氧基任意取代的C1-C4烷基、至少可以插入一个氧原子的C3-C6环烷基、被一个或两个甲基任意取代的C3-C6环烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；
R71和R72相同或不同、为C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；
R73和R74相同或不同、为C1-C4烷基或苯基；
R75是可以插入至少一个氧原子的C3-C6环烷基、被一个或两个甲基任意取代的C3-C6环烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；
R76是C1-C4烷基；
a、b和c独立地为1、2或3；
d是0或1；
e是2或3；
f是1或2；且
X2是氧原子或硫原子。
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