KR20070114337A - 잡초 제거 화합물에 대한 내성을 식물에 제공하는 방법 - Google Patents

잡초 제거 화합물에 대한 내성을 식물에 제공하는 방법 Download PDF

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KR20070114337A
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Abstract

잡초 제거 화합물에 대한 내성을 갖는 식물은 하기의 두 단계에 의해 생성된다:
- (a) 잡초 제거 화합물의 잡초 제거 활성과 관련된 물질에 대해 특이적 친화성을 갖고, (b) 상기 단백질이 특이적 친화성을 갖는 물질을 변형시키는 능력이 실질적으로 없으며, (c) 면역글로불린내에서 가변 구역의 프레임워크(framework) 구역이 실질적으로 없는, 상기의 (a), (b) 및 (c) 의 특징을 갖는, 단백질 코딩 유전자를 식물 세포에 도입하는 단계; 및
- 상기 유전자를 발현시키는 단계.
프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질

Description

잡초 제거 화합물에 대한 내성을 식물에 제공하는 방법 {METHOD FOR GIVING RESISTANCE TO WEED CONTROL COMPOUNDS TO PLANTS}
본 발명은 잡초 제거 화합물에 대한 내성을 식물에 제공하는 방법에 관한 것이다.
잡초 제거는 수확되는 농작물의 생산량과 질을 향상시키는데 매우 중요한 일이다. 이 목적을 위해, 제초제와 같은 잡초 제거 화합물이 주로 사용된다. 그러나, 잡초 제거 화합물을 사용할 때, 수확되는 농작물을 이와 유사한 종류의 잡초와 구별하여 잡초만을 선택적으로 제거하는 것은 쉬운 일이 아니다. 그리하여, 잡초 제거 화합물에 대한 내성(이하 잡초제거화합물 내성이라고 칭함)농작물의 생산이 시도되었고, 내성을 갖는 일부 농작물이 실용화되기에 이르렀다.
최근, 잡초 제거 화합물에 대한 내성을 갖는 농작물을 생산하는데 유전자 공학 기술이 이용되어 왔다. 이러한 기술로서, 예컨대 힌케 (Hinchee, M.A.W.) 등은, 글리포세이트(glyphosate)의 목적 효소인 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타아제 (EPSPS) 유전자에 돌연변이를 만들어 글리포세이트에 대한 친화성을 감소시키고, 이 유전자를 식물에 도입하여, 제초제, 글리포세이트에 대한 내성을 갖는 식물을 생산하는 방법을 개시하고 있다 [Hinchee, M.A.W. 등, BIO/TECHNOLOGY, 6: p915 (1988)].
잡초 제거 화합물에 대한 내성을 식물에 제공하는 다양한 공지의 방법이 반드시 충분한 것은 아니며, 식물에 잡초 제거 화합물에 대한 내성을 제공하는 더 많은 각종 방법의 개발이 요망되어 왔다.
본 발명의 주목적은 잡초 제거 화합물에 대한 내성을 식물에 제공하는 신규한 방법을 제공하는 것이다.
당업자라면, 첨부된 도면을 참고로 하여 하기의 명세서로부터 상기 목적 및 기타 목적, 그리고 본 발명의 장점을 명백히 알 수 있을 것이다.
상기의 상황하에서, 본 발명자들은 잡초 제거 화합물에 대한 내성을 식물에 제공하는 신규한 방법을 개발하기 위해 집중적으로 연구하였다. 그 결과, 식물이 식물 세포내에서 특정한 단백질을 생산할 수 있도록 함으로써 잡초 제거 화합물에 대한 내성이 식물에 제공될 수 있음을 발견하였다.
즉, 본 발명은 하기를 제공한다 :
1. 하기의 단계를 포함하는, 잡초 제거 화합물에 대한 내성을 식물에 제공하는 방법 :
- (a) 잡초 제거 화합물의 잡초 제거 활성과 관련된 물질에 대해 특이적 친화성을 갖고, (b) 상기 단백질이 특이적 친화성을 갖는 물질을 변형시키는 능력이 실질적으로 없으며, (c) 면역글로불린내에서 가변 구역의 프레임워크(framework) 구역이 실질적으로 없는, 상기의 (a), (b) 및 (c) 의 특징을 갖는, 단백질 코딩 유전자를 식물 세포에 도입하는 단계; 및
- 상기 유전자를 발현시키는 단계(이하 본 발명의 첫 번째 양태라고 함).
2. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자가 둘 다 식물 세포내에서 작용을 하는 프로모터와 종결서열에 실시 가능하게 결찰되는(ligated) 형태로 식물 세포내로 도입되는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 잡초 제거 화합물의 잡초 제거 활성과 관련된 물질이 잡초 제거 화합물 자체인 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 잡초 제거 화합물의 잡초 제거 활성과 관련된 물질이 식물내의 내인성(endogenous) 물질인 방법.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 잡초 제거 화합물이 식물의 포르피린(porphyrin) 생합성을 억제하는 것인 방법.
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 잡초 제거 화합물이 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 억제형 제초 화합물인 방법.
7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 잡초 제거 화합물의 잡초 제거 활성과 관련된 물질이 프로토포르피린 IX 인 방법.
8. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 단백질이 마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질, 또는 프로토포르피린 IX 특이적 친화성을 갖는 상기 단백질의 변형체인 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 단백질이 광합성 미생물로부터 유도된 마그네슘 킬레 타아제인 방법.
10. 제 8 항에 있어서, 단백질이 식물로부터 유도된 마그네슘 킬레타아제인 방법.
11. 제 8 항에 있어서, 단백질이 담배로부터 유도된 마그네슘 킬레타아제인 방법.
12. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 단백질이 서열번호 53 의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
13. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 단백질이 서열번호 54 의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
14. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 단백질이 서열번호 55 의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
15. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 단백질이 서열번호 56 의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
16. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 단백질이 서열번호 57 의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
17. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 단백질이 서열번호 58 의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
18. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 단백질이 서열번호 59 의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
19. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 단백질이 서열번호 60 의 아미노산 서 열을 포함하는 방법.
20. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 단백질이 4 내지 100 개의 아미노산으로 구성된 방법.
21. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 잡초 제거 화합물의 잡초 제거 활성과 관련된 물질이 프로토포르피리노겐 IX 인 방법.
22. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 단백질이 프로토포르피리노겐 IX 를 산화시키는 능력이 없고 프로토포르피리노겐 IX 특이적 친화성을 갖는 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제의 변형체인 방법.
23. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 단백질이 프로토포르피리노겐 IX 를 산화시키는 능력이 없고 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 억제-형 제초 화합물 특이적 친화성을 갖는 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제의 변형체인 방법.
24. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 단백질이 식물로부터 유래된 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제의 변형체인 방법.
25. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 단백질이 대두로부터 유래된 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제의 변형체인 방법.
26. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 단백질이 조류(algae)로부터 유래된 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제의 변형체인 방법.
27. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 단백질이 클라미도모나스(Chlamydomonas)로부터 유래된 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제의 변형체인 방법.
28. 하기의 단계를 포함하는, 잡초 제거 화합물에 대한 내성을 식물에 제공하는 방법 :
- (a) 프로토포르피린 IX 에 대해 특이적 친화성을 갖고, (b) 상기 단백질이 프로토포르피리노겐 IX 를 변형시키는 능력이 실질적으로 없으며, (c) 면역글로불린내에서 가변 구역의 프레임워크 구역이 실질적으로 없는, 상기 (a), (b) 및 (c) 의 특징을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 식물 세포에 도입하는 단계; 및
- 상기 유전자를 발현시키는 단계(이하 본 발명의 두 번째 양태라고 함).
29. 제 28 항에 있어서, 상기 유전자가 둘 다 식물 세포내에서 기능을 하는 프로모터와 종결서열에 실시 가능하게 결찰되는 형태로 식물 세포내로 도입되는 방법.
30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, 잡초 제거 화합물이 식물의 포르피린 생합성을 억제하는 방법.
31. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, 잡초 제거 화합물이 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 억제-형 제초 화합물인 방법.
32. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 단백질이 마그네슘 킬레타아제이거나, 또는 프로토포르피린 IX 특이적 친화성을 갖는 상기 단백질의 변형체인 방법.
33. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 단백질이 페로킬레타아제이거나, 또는 프로토포르피린 IX 특이적 친화성을 갖는 상기 단백질의 변형체인 방법.
34. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 단백질이 식물로부터 유래된 페로킬레타아제인 방법.
35. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 단백질이 보리로부터 유래된 페로킬레타아제인 방법.
36. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 단백질이 오이로부터 유래된 페로킬레타아제인 방법.
37. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 단백질이 4 내지 100 개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드인 방법.
38. 하기의 단계를 포함하는, 잡초 제거 화합물에 대한 내성을 식물에 제공하는 방법 :
- (a) 프로토포르피리노겐 IX 에 대해 특이적 친화성을 갖고, (b) 코프로포르피리노겐 III 를 변형시키는 능력을 가지며, (c) 면역글로불린내의 가변 구역의 프레임워크 구역이 실질적으로 없는, 상기의 특징 (a), (b) 및 (c) 를 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 식물 세포에 도입하는 단계; 및
- 상기 유전자를 발현시키는 단계(이하 본 발명의 세 번째 양태라고 함).
39. 제 38 항에 있어서, 유전자가 둘 다 식물 세포내에서 기능을 하는 프로모터와 종결서열에 실시 가능하게 결찰되는 형태로 식물 세포내로 도입되는 방법.
40. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 단백질이 코프로포르피리노겐 III 옥시다아제 이거나 또는 프로토포르피리노겐 IX 에 대한 특이적 친화성을 갖는 상기 단백질의 변형체인 방법.
41. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 단백질이 미생물로부터 유래된 코프로포르피리노겐 III 옥시다아제인 방법.
42. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 단백질이 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터 유래된 코프로포르피리노겐 III 옥시다아제인 방법.
43. 제 1 항, 제 2 항, 제 28 항 또는 제 29 항의 방법에 의해 내성이 제공된, 잡초 제거 화합물에 대한 내성을 갖는 식물.
44. 제 38 항 또는 제 39 항의 방법에 의해 내성이 제공된, 잡초 제거 화합물에 대한 내성을 갖는 식물.
45. 제 43 항의 식물의 성장 지역에 잡초 제거 화합물을 사용하는 것으로 이루어진, 식물의 보호 방법.
46. 제 44 항의 식물의 성장 지역에 잡초 제거 화합물을 사용하는 것으로 이루어진, 식물의 보호 방법.
47. 제 43 항의 식물과 다른 식물의 성장 지역에 제 43 항의 식물이 내성을 갖는 잡초 제거 화합물을 사용하고, 상기 식물들간의 성장의 차이를 근거로 두 식물중 하나를 선택하는 것으로 이루어진, 식물의 선택 방법.
48. 제 44 항의 식물과 다른 식물의 성장 지역에 제 44 항의 식물이 내성을 갖는 잡초 제거 화합물을 사용하고, 상기 식물들간의 성장의 차이를 근거로 두 식물중 하나를 선택하는 것으로 이루어진, 식물의 선택 방법.
49. 제 47 항에 있어서, 상기 식물이 식물 세포인 방법.
50. 제 48 항에 있어서, 상기 식물이 식물 세포인 방법.
51. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 잡초 제거 화합물이 하기의 (1) 내지 (3) 의 화합물로부터 선택된 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 억제-형 제초 화합 물이고, 잡초 제거 화합물의 잡초 제거 활성과 관련된 물질이 프로토포르피린 IX, 프로토포르피리노겐 IX 또는 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 억제-형 제초 화합물인 방법 :
(1) 클로르메톡시닐, 비페녹스, 클로르니트로펜(CNP), 아시플루오르펜 (5-[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페녹시]-2-니트로벤조산) 및 그의 에틸 에스테르, 아시플루오르펜-나트륨, 옥시플루오르펜 (2-클로로-1-(3-에톡시-4-니트로페녹시)-4-트리플루오로메틸벤젠), 옥시디아존 (3-[2,4-디클로로-5-(1-메틸에톡시)페닐]-5-(1,1-디메틸에틸)-1,3,4-옥사디아졸-2-(3H)-온), 2-[4-클로로-2-플루오로-5-(프로프-2-이닐옥시)페닐]-2,3,4,5,6,7-헥사히드로-1H-이소인돌-1,3-디온, 클로르프탈림 (N-(4-클로로페닐)-3,4,5,6-테트라히드로프탈이미드), TNPP-에틸 (에틸 2-[1-(2,3,4-트리클로로페닐)-4-니트로피라졸릴-5-옥시]프로피오네이트), 또는 N3-(1-페닐에틸)-2,6-디메틸-5-프로피오닐니코틴아미드;
(2) G 는 하기의 화학식 G-1 내지 G-9 중 하나로 표현되는 기이고, J 는 하기의 화학식 J-1 내지 J-30 중 하나로 표현되는 하기 화학식 J-G (I)로 표현되는 화합물:
Figure 112007080679067-PAT00001
Figure 112007080679067-PAT00002
Figure 112007080679067-PAT00003
Figure 112007080679067-PAT00004
[식중, 화학식 J-5, J-6, J-12 및 J-24 에서 점선은 왼쪽 고리가 단일 결합을 포함하거나, 또는 고리내의 하나의 결합이 탄소 원자 사이의 이중 결합인 것을 나타내고;
X 는 산소 원자 또는 황 원자이고;
Y 는 산소 원자 또는 황 원자이고;
R1 은 수소 원자 또는 할로겐 원자이고;
R2 는 수소 원자, C1-C8 알킬기, C1-C8 할로알킬기, 할로겐 원자, OH 기, OR27 기, SH 기, S(O)pR27 기, COR27 기, CO2R27 기, C(O)SR27 기, C(O)NR29R30 기, CHO 기, CR27=NOR36 기, CH=CR37CO2R27 기, CH2CHR37CO2R27 기, CO2N=CR31R32 기, 니트로기, 시아노 기, NHSO2R33 기, NHSO2NHR33 기, NR27R38 기, NH2 기, 또는 하나 이상의 동일하거나 상이한 C1-C4 알킬기로 치환될 수 있는 페닐기이고;
p 는 0, 1 또는 2 이고;
R3 는 C1-C2 알킬기, C1-C2 할로알킬기, OCH3 기, SCH3 기, OCHF2 기, 할로겐 원자, 시아노기 또는 니트로기이고;
R4 는 수소 원자, C1-C3 알킬기, C1-C3 할로알킬기 또는 할로겐 원자이고;
R5 는 수소 원자, C1-C3 알킬기, 할로겐 원자, C1-C3 할로알킬기, 시클로프로필기, 비닐기, C2 알키닐기, 시아노기, C(O)R38 기, CO2R38 기, C(O)NR38R39 기, CR34R35CN 기, CR34R35C(O)R38 기, CR34R35CO2R38 기, CR34R35C(O)NR38R39 기, CHR34OH 기, CHR34OC(O)R38 기 또는 OCHR34OC(O)NR38R39 기이거나, 또는 G 가 G-2 또는 G-6 일 때, R4 및 R5 는 이들이 결합될 탄소 원자와 함께 C=O 기를 형성할 수 있으며;
R6 는 C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C2-C6 알콕시알킬기, C3-C6 알케닐기 또는 C3-C6 알키닐기이고;
X1 은 단일 결합, 산소 원자, 황 원자, NH 기, N(C1-C3 알킬)기, N(C1-C3 할로알킬)기 또는 N(알릴)기이고;
R7 는 수소 원자, C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, 할로겐 원자, S(O)2(C1-C6 알킬)기 또는 C(=O)R40 기이고;
R8 는 수소 원자, C1-C8 알킬기, C3-C8 시클로알킬기, C3-C8 알케닐기, C3-C8 알키닐기, C1-C8 할로알킬기, C2-C8 알콕시알킬기, C3-C8 알콕시알콕시알킬기, C3-C8 할로알키닐기, C3-C8 할로알케닐기, C1-C8 알킬술포닐기, C1-C8 할로알킬술포닐기, C3-C8 알콕시카르보닐알킬기, S(O)2NH(C1-C8 알킬)기, C(O)R41 기, 또는 페닐 고리가 R42 로 치환될 수 있는 벤질기이고;
n 및 m 은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3 이고 m + n 은 2 또는 3 이며;
Z 는 CR9R10 기, 산소 원자, 황 원자, S(O) 기, S(O)2 기 또는 N(C1-C4 알킬)기이고;
각 R9 는 독립적으로 수소 원자, C1-C3 알킬기, 할로겐 원자, 히드록시기, C1-C6 알콕시기, C1-C6 할로알킬기, C1-C6 할로알콕시기, C2-C6 알킬카르보닐옥시기 또는 C2-C6 할로알킬카르보닐옥시기이고;
각 R10 은 독립적으로 수소 원자, C1-C3 알킬기, 및 히드록시기 또는 할로겐원자이고;
R11 및 R12 는 독립적으로 수소 원자, 할로겐 원자, C1-C6 알킬기, C3-C6 알케닐기 또는 C1-C6 할로알킬기이고;
R13 는 수소 원자, C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C3-C6 알케닐기, C3-C6 할로알케닐기, C3-C6 알키닐기, C3-C6 할로알키닐기, HC(=O) 기, (C1-C4 알킬)C(=O) 기 또는 NH2 기이고;
R14 는 C1-C6 알킬기, C1-C6 알킬티오기, C1-C6 할로알킬기 또는 N(CH3)2 기이고;
W 는 질소 원자 또는 CR15 기이고;
R15 는 수소 원자, C1-C6 알킬기, 할로겐 원자, 또는 C1-C6 알킬기, 하나 또는 두 개의 할로겐 원자, C1-C6 알콕시기 또는 CF3 기로 치환될 수 있는 페닐기이고;
각 Q 는 독립적으로 산소 원자 또는 황 원자이고;
Q1 은 산소 원자 또는 황 원자이고;
Z1 은 CR16R17 기, 산소 원자, 황 원자, S(O) 기, S(O)2 기 또는 N(C1-C4 알킬)기이고;
각 R16 는 독립적으로 수소 원자, 할로겐 원자, 히드록시기,C1-C6 알콕시기, C1-C6 할로알킬기, C1-C6 할로알콕시기, C2-C6 알킬카르보닐옥시기 또는 C2-C6 할로알킬카르보닐옥시기이고;
각 R17 은 독립적으로 수소 원자, 히드록시기 또는 할로겐 원자이고;
R18 은 C1-C6 알킬기, 할로겐 원자 또는 C1-C6 할로알킬기이고;
R19 및 R20 는 독립적으로 수소 원자, C1-C6 알킬기 또는 C1-C6 할로알킬기이고;
Z2 은 산소 원자, 황 원자, NR9 기 또는 CR9R10 기이고;
R21 및 R22 는 독립적으로 C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C3-C6 알케닐기, C3-C6 할로알케닐기, C3-C6 알키닐기 또는 C3-C6 할로알키닐기이고;
R23 은 수소 원자, 할로겐 원자 또는 시아노기이고;
R24 는 C1-C6 알킬술포닐기, C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C3-C6 알케닐기, C3-C6 알키닐기, C1-C6 알콕시기, C1-C6 할로알콕시기 또는 할로겐 원자이고;
R25 는 C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C3-C6 알케닐기 또는 C3-C6 알키닐기이고;
R26 는 C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, 또는 C1-C6 알킬기, 하나 또는 두 개의 할로겐 원자, 하나 또는 두 개의 니트로기, C1-C6 알콕시기 또는 CF3 기로 치환될 수 있는 페닐기이고;
W1 는 질소 원자 또는 CH 기이고;
T 는 하기의 화학식 T-1, T-2 및 T-3 중 하나로 표현되는 기이고 :
Figure 112007080679067-PAT00005
(식중, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, E10, E11 및 E12 는 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬기이다);
R27 는 C1-C8 알킬기, C3-C8 시클로알킬기, C3-C8 알케닐기, C3-C8 알키닐기, C1-C8 할로알킬기, C2-C8 알콕시알킬기, C2-C8 알킬티오알킬기, C2-C8 알킬술피닐알킬 기, C2-C8 알킬술포닐알킬기, C1-C8 알킬술포닐기, 페닐 고리가 할로겐 원자 및 C1-C4 알킬기로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 페닐술포닐기, C4-C8 알콕시알콕시알킬기, C4-C8 시클로알킬알킬기, C6-C8 시클로알콕시알킬기, C4-C8 알케닐옥시알킬기, C4-C8 알키닐옥시알킬기, C3-C8 할로알콕시알킬기, C4-C8 할로알케닐옥시알킬기, C4-C8 할로알키닐옥시알킬기, C6-C8 시클로알킬티오알킬기, C4-C8 알케닐티오알킬기, C4-C8 알키닐티오알킬기, 고리가 할로겐 원자, C1-C3 알킬기 및 C1-C3 할로알킬기로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 치환체로 치환된 페녹시기로 치환된 C1-C4 알킬기, 고리가 할로겐 원자, C1-C3 알킬기 및 C1-C3 할로알킬기로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 치환체로 치환된 벤질옥시기, C4-C8 트리알킬실릴알킬기, C3-C8 시아노알킬기, C3-C8 할로시클로알킬기, C3-C8 할로알케닐기, C5-C8 알콕시알케닐기, C5-C8 할로알콕시알케닐기, C5-C8 알킬티오알케닐기, C3-C8 할로알키닐기, C5-C8 알콕시알키닐기, C5-C8 할로알콕시알키닐기, C5-C8 알킬티오알키닐기, C2-C8 알킬카르보닐기, 고리가 할로겐 원자, C1-C3 알킬기 및 C1-C3 할로알킬기로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 치환체로 치환된 벤질기, CHR34COR28 기, CHR34COOR28 기, CHR34P(0)(OR28)2 기, CHR34P(S)(OR28)2 기 , CHR34C(0)NR29R30 기 또는 CHR34C(0)NH2 기이고;
R28 는 C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기, C3-C6 알키닐기 또는 테트라히드로푸라닐기이고;
R29 및 R31 은 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
R30 및 R32 는 독립적으로 C1-C4 알킬기, 또는 고리가 할로겐 원자, C1-C3 알킬기 및 C1-C3 할로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 페닐기이거나; 또는
R29 와 R30 은 함께 -(CH2)5-, (CH2)4- 또는 -CH2CH2OCH2CH2- 를 형성할 수 있으며, 또는 이렇게 형성된 고리는 C1-C3 알킬기, 페닐기 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있으며; 또는
R31 및 R32 는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 C3-C8 시클로알킬기를 형성할 수 있고;
R33 는 C1-C4 알킬기, C1-C4 할로알킬기 또는 C3-C6 알케닐기이고;
R34 및 R35 는 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
R36 은 수소 원자, C1-C6 알킬기, C3-C6 알케닐기 또는 C3-C6 알키닐기이고;
R37 은 수소 원자, C1-C4 알킬기 또는 할로겐 원자이고;
R38 은 수소 원자, C1-C6 알킬기, C3-C6 시클로알킬기, C3-C6 알케닐기, C3-C6 알키닐기, C2-C6 알콕시알킬기, C1-C6 할로알킬기, 고리가 할로겐 원자, C1-C4 알킬기 및 C1-C4 알콕시기로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 페닐기, -CH2CO2(C1-C4 알킬)기 또는 -CH(CH3)CO2(C1-C4 알킬)기이고;
R39 는 수소 원자, C1-C2 알킬기 또는 C(O)O(C1-C4 알킬)기이고;
R40 은 수소 원자, C1-C6 알킬기, C1-C6 알콕시기 또는 NH(C1-C6 알킬)기이고;
R41 은 C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C1-C6 알콕시기, NH(C1-C4 알킬)기, 고리가 R42 기, 벤질기 및 C2-C8 디알킬아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나의 치환체로 치환될 수 있는 페닐기이고;
R42 는 C1-C6 알킬기, 하나 또는 두 개의 할로겐 원자, C1-C6 알콕시기 또는 CF3 기이다];
(3) 하기 화학식 (2) 의 화합물 또는 니필라크로펜:
Figure 112007080679067-PAT00006
[식중, R43 은 C1-C4 알킬기이고;
R44 는 C1-C4 알킬기, C1-C4 알킬티오기, C1-C4 알콕시기, C1-C4 할로알킬기, C1-C4 할로알킬티오기 또는 C1-C4 할로알콕시기이고;
R43 및 R44 는 함께 -(CH2)3- 또는 -(CH2)4- 를 형성할 수 있고;
R45 는 수소 원자 또는 할로겐 원자이고;
R46 은 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
R47 은 수소 원자, 니트로기, 시아노기, -COOR49기, -C(=X)NR50R51 기 또는 -C(=X2)R52 기이고;
R48 은 수소 원자, 할로겐 원자, 시아노기, 할로겐 원자 및 히드록시기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기, C1-C4 알콕시기, 할로겐 원자, 니트로기, 시아노기, C1-C4 알킬기, C1-C4 알콕시기 및 할로-C1-C4 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 페닐기, 피롤릴기, C2-C8 알킬기, C3-C8 알케닐기, C3-C8 알키닐기, C3-C8 알콕시기, 하나 이상의 산소 원자가 삽입된 C2-C8 알킬기, C3-C8 알케닐기, C3-C8 알키닐기 및 C3-C8 알콕시기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 기; 또는 하기의 화학식으로 표현되는 기들중 하나이고:
Figure 112007080679067-PAT00007
R49, R50 및 R52 은 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
R50 및 R51 은 이들이 결합된 질소 원자와 함께 포화 지환족 5 또는 6 원 고 리를 형성할 수 있으며;
R52 는 수소 원자, C1-C4 알킬기, 또는 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 C1-C4 알킬기이고;
R53 은 수소 원자, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C2-C6 알케닐기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C3-C6 알키닐기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 페닐기, C3-C8 시클로알킬기, 시아노메틸기, 또는 R63CO- 기이고;
R54 는 수소 원자, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C6 알킬기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C2-C6 알케닐기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C3-C6 알키닐기, 할로겐 원자로 치환될 수 있는 페닐기, C3-C8 시클로알킬기, 시아노메틸기, C1-C4 알콕시-C1-C6 알킬기, 디-C1-C4 알킬아미노-C1-C4 알킬기, 테트라히드로푸르푸릴메틸기, C3-C6 알키닐옥시-C1-C4 알킬기, 고리가 할로겐 원자, 니트로기, 시아노기, C1-C4 알킬기, C1-C4 알콕시기 및 할로-C1-C4 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된 치환체로 치환될 수 있는 벤질기, -C(=X2)R63 기, -(CH2)a-(O)d-R70 기, -(CH2)a-O-(CH2)b-R70 기, -(CH2)a-X2-R76 기이고;
R53 및 R54 는 이들이 결합된 질소 원자와 함께, 하나의 탄소 원자가 산소 원자로 대체될 수도 있는 포화 지환족 3, 5 또는 6 원 고리, 또는 방향족 5 또는 6 원 고리를 형성할 수 있으며;
R55 는 수소 원자, C1-C4 알킬기, C2-C6 알케닐기 또는 C3-C6 알키닐기이거나, 또는 R55 및 R56 은 함께 -(CH2)e- 를 형성할 수 있으며;
R56 및 R57 은 독립적으로 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C2-C6 알케닐기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C3-C6 알키닐기, 또는 하나 이상의 할로겐 원자, 수소 원자, C3-C6 시클로알킬기, -XR60 기 또는 -NR61R62 기로 치환될 수 있는 페닐기이고;
R58 은 수소 원자, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기, C3-C6 알키닐기, C1-C4 알킬카르보닐기, 시아노-C1-C3 알킬기, C1-C4 알콕시카르보닐-C1-C4 알킬기, 디-C1-C4 알콕시카르보닐-C1-C4 알킬기, 벤질기, C1-C4 알콕시-C1-C4 알키닐기, -(CH2)a-R75 기, -(CH2)a-X2-R72 기, -(CH2)a-X2-(CH2)b-R72 기 또는 -(CH2)a-X2-(CH2)b-X2-(CH2)c-R72 기이고;
R59 는 수소 원자, C1-C4 알킬기, C2-C6 알케닐기, C3-C6 알키닐기, 시아노-C1-C3 알킬기, C1-C4 알킬카르보닐-C1-C3 알킬기 또는 페닐기이고;
R60 은 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기이고;
R61 및 R62 는 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
R63 은 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기, C1-C4 알콕시-C1-C4 알킬기, C1-C4 알킬티오-C1-C4 알킬기, C3-C6 시클로알킬기, 고리가 할로겐 원자, 니트로기, 시아노기, C1-C4 알킬기, C1-C4 알콕시기 및 할로-C1-C4 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된 치환체로 치환될 수 있는 페닐기, -NR73R74 기 또는 -(CH2)a-(O)d-R75 기이고;
R64 는 C1-C4 알콕시카르보닐기 또는 카르복실기이고;
R65 는 클로로메틸기, 시아노메틸기, 하나 이상의 산소 원자가 삽입될 수 있 는 C3-C6 시클로알킬기, 또는 C1-C4 알콕시카르보닐-C1-C4 알킬기이고;
R66 는 히드록시기 또는 -NR67R68 기이고;
A 는 -NR67R68 기 또는 -S(0)f-R69 기이고;
R67 및 R68 은 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
R69 는 C1-C4 알킬기 또는 C1-C4 할로알킬기이고;
R70 은 수소 원자, 히드록시기, 할로겐 원자, 하나 이상의 C1-C4 알콕시기로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기, 하나 이상의 산소 원자가 삽입될 수 있는 C3-C6 시클로알킬기, 하나 또는 두 개의 메틸기로 치환될 수 있는 C3-C6 시클로알킬기, 푸릴기, 티에닐기 또는 -C(=O)R71 기이고;
R71 및 R72 는 동일하거나 상이하며, C1-C4 알킬기 또는 C1-C4 알콕시기이고;
R73 및 R74 는 동일하거나 상이하며, C1-C4 알킬기 또는 페닐기이고;
R75 는 하나 이상의 산소 원자가 삽입될 수 있는 C3-C6 시클로알킬기, 하나 또는 두 개의 메틸기로 치환될 수 있는 C3-C6 시클로알킬기, 푸릴기, 티에닐기 또는 -C(=O)R71 기이고;
R76 은 C1-C4 알킬기이고;
a, b 및 c 는 독립적으로 1, 2 또는 3 이고;
d 는 0 또는 1 이고;
e 는 2 또는 3 이고;
f 는 1 또는 2 이고;
X2 는 산소 원자 또는 황 원자이다].
본 발명의 방법에서, 잡초 제거 화합물의 잡초 제거 활성과 관련된 물질 (이후 잡초 제거 물질로 칭함) 은 상기 화합물을 식물에 적용할 때 잡초 제거 활성에 책임이 있는 유기체의 대사 반응계의 일부를 구성하는 것들이다. 그 예로는 잡초 제거 화합물 자체, 식물의 내인성 물질 등이 포함된다. 구체적으로, 상기의 식물내의 내인성 물질로서, 예컨대, 잡초 제거 화합물이 작용하는 목적 효소의 기질, 또는 식물 세포에서 축적될 때 세포의 기능 장애를 유발하는 기질의 전구체 또는 대사산물; 세포의 기능 장애를 유발하는 식물 세포내의 상기 물질에 의해 생성된 물질 등이 있다. 좀 더 구체적으로, 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 (EC 1.3.3.4, 이후 PPO 로 칭함) 의 활성을 억제하는 제초 활성을 갖는 화합물 (이후 제초 화합물로 칭함) 이 식물에 사용되면, PPO 의 기질인 프로토포르피리노겐 IX 가 식물 세포내에 축적되고 이것은 대사 과정을 거쳐 프로토포르피린 IX 를 형성하 고, 이어서 식물 세포내에서 프로토포르피린 IX 와 광(光) 둘의 존재하에 세포 기능에 손상을 주는 활성 산소를 형성한다 [참고 문헌 : Junshi MIYAMOTO ed., Atarashii Noyaku no Kagaku (Chemistry of New Agrochemicals), Chapter 3, Section 3.3, p106 (1993), Hirokawa Shoten, Tokyo]. 따라서, 상기 계에서 프로토포르피리노겐 IX, 프로토포르피린 IX 및 활성 산소 등은 상기 물질로서 예시될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 잡초 제거 화합물로는 제초 활성, 식물 성장 레귤레이터 활성, 등을 갖는 화합물들이 포함된다.
제초 화합물의 예로는 포르피린 생합성을 억제하는 화합물, 광합성에서 전자 전달을 억제하는 화합물, 카로테노이드 생합성을 억제하는 화합물, 아미노산 생합성을 억제하는 화합물, 지질 생합성을 억제하는 화합물, 세포벽 생합성을 억제하는 화합물, 단백질 생합성, 헥산 생합성 및 세포 분열에 영향을 주는 화합물, 오옥신(auxin) 안타고니스트적(antagonistic) 활성을 갖는 화합물, 등이 포함된다. 좀 더 구체적으로, 포르피린 생합성을 억제하는 화합물로서, 예컨대 PPO 활성을 억제하는 화합물 (PPO 억제-형 제초 화합물) 등이 있다. 광합성에서 전자 전달을 억제하는 화합물로서, 광화학계 Ⅰ 또는 Ⅱ 의 전자 전달을 억제하는 화합물, 전자를 전달하는 플라스토퀴논의 생합성에 영향을 주는 4-히드록시페닐 피루베이트 디옥시게나아제 (EC 1.13.11.27; 이후 4-HPPD 로 지칭) 를 억제하는 화합물 등이 있다. 카로테노이드 생합성을 억제하는 화합물로서, 예컨대 피토엔 탈포화효소 (phytoene desaturase, 이후 PDS 로 지칭) 등을 억제하는 화합물들이 있다. 아 미노산 생합성을 억제하는 화합물로서, 예컨대 EPSPS, 아세토락테이트 신타아제 (EC 4.1.3.18; 이후 ALS 로 지칭), 글루타민 신타아제 (EC 6.3.1.2; 이후 GS 로 지칭), 디히드로프테로에이트 신타아제 (EC 2.5.1.15; 이후 DHP 로 지칭) 등을 억제하는 화합물이 있다. 지질 생합성을 억제하는 화합물로서, 예컨대 아세틸 CoA 카르복실라아제 (EC 6.4.1.2; 이후 ACC 로 지칭) 를 억제하는 화합물 등이 있다. 세포벽 생합성을 억제하는 화합물로서, 예컨대 셀룰로오스 생합성등을 억제하는 화합물 등이 있다. 단백질 생합성, 헥산 생합성 또는 세포 분열에 영향을 주는 화합물로서, 예컨대 미소관(microtubules)의 형성을 억제하는 화합물 등이 있다.
식물 성장 레귤레이터 활성을 갖는 화합물의 예로는 세포의 신장(elongation) 및 분화(differentiation)를 향상시키는 식물 호르몬에 대한 안타고니스트적 활성을 갖는 화합물 등이 포함된다. 구체적으로, 예컨대 2,4-D, 페녹시알칸 카르복실산, 벤조산의 유도체, 피콜린산의 유도체 등이 있다.
상술한 PPO 억제-형 제초 화합물로서, 문헌 [Duke, S.O., Rebeiz, C.A., ACS Symposium Series 559, Porphyric Pesticides, Chemistry, Toxicology, 및 Pharmaceutical Applications, American Chemical Society, Washington DC (1994)등] 에 개시된 화합물 등이 있다. 구체적으로, 그 예로는 하기의 화합물이 포함된다 :
(1) 클로르메톡시닐, 비페녹스, 클로르니트로펜(CNP), 아시플루오르펜 (5-[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페녹시]-2-니트로벤조산) 및 그의 에틸 에스테르, 아시플루오르펜-나트륨, 옥시플루오르펜 (2-클로로-1-(3-에톡시-4-니트로페녹시)- 4-트리플루오로메틸벤젠), 옥시디아존 (3-[2,4-디클로로-5-(1-메틸에톡시)페닐]-5-(1,1-디메틸에틸)-1,3,4-옥사디아졸-2-(3H)-온), 2-[4-클로로-2-플루오로-5-(프로프-2-이닐옥시)페닐]-2,3,4,5,6,7-헥사히드로-1H-이소인돌-1,3-디온, 클로르프탈림 (N-(4-클로로페닐)-3,4,5,6-테트라히드로프탈이미드), TNPP-에틸 (에틸 2-[1-(2,3,4-트리클로로페닐)-4-니트로피라졸릴-5-옥시]프로피오네이트), 또는 N3-(1-페닐에틸)-2,6-디메틸-5-프로피오닐니코틴아미드;
(2) G 는 하기의 화학식 G-1 내지 G-9 중 하나로 표현되는 기이고, J 는 하기의 화학식 J-1 내지 J-30 중 하나로 표현되는 하기 화학식 J-G (I)로 표현되는 화합물:
Figure 112007080679067-PAT00008
Figure 112007080679067-PAT00009
Figure 112007080679067-PAT00010
Figure 112007080679067-PAT00011
[식중, 화학식 J-5, J-6, J-12 및 J-24 에서 점선은 왼쪽 고리가 단지 단일결합을 포함하거나, 또는 고리내의 하나의 결합이 탄소 원자 사이의 이중 결합인 것을 나타내고;
X 는 산소 원자 또는 황 원자이고;
Y 는 산소 원자 또는 황 원자이고;
R1 은 수소 원자 또는 할로겐 원자이고;
R2 는 수소 원자, C1-C8 알킬기, C1-C8 할로알킬기, 할로겐 원자, OH 기, OR27 기, SH 기, S(O)pR27 기, COR27 기, CO2R27 기, C(O)SR27 기, C(O)NR29R30 기, CHO 기, CR27=NOR36 기, CH=CR37CO2R27 기, CH2CHR37CO2R27 기, CO2N=CR31R32 기, 니트로기, 시아노 기, NHSO2R33 기, NHSO2NHR33 기, NR27R38 기, NH2 기, 또는 하나 이상의 동일하거나 상이한 C1-C4 알킬기로 치환될 수 있는 페닐기이고;
p 는 0, 1 또는 2 이고;
R3 는 C1-C2 알킬기, C1-C2 할로알킬기, OCH3 기, SCH3 기, OCHF2 기, 할로겐 원자, 시아노기 또는 니트로기이고;
R4 는 수소 원자, C1-C3 알킬기, C1-C3 할로알킬기 또는 할로겐 원자이고;
R5 는 수소 원자, C1-C3 알킬기, 할로겐 원자, C1-C3 할로알킬기, 시클로프로필기, 비닐기, C2 알키닐기, 시아노기, C(O)R38 기, CO2R38 기, C(O)NR38R39 기, CR34R35CN 기, CR34R35C(O)R38 기, CR34R35CO2R38 기, CR34R35C(O)NR38R39 기, CHR34OH 기, CHR34OC(O)R38 기 또는 OCHR34OC(O)NR38R39 기이거나, 또는 G 가 G-2 또는 G-6 일 때, R4 및 R5 는 이들이 결합될 탄소 원자와 함께 C=O 기를 형성할 수 있으며;
R6 는 C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C2-C6 알콕시알킬기, C3-C6 알케닐기 또는 C3-C6 알키닐기이고;
X1 은 단일 결합, 산소 원자, 황 원자, NH 기, N(C1-C3 알킬)기, N(C1-C3 할로알킬)기 또는 N(알릴)기이고;
R7 는 수소 원자, C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, 할로겐 원자, S(O)2(C1-C6 알킬)기 또는 C(=O)R40 기이고;
R8 는 수소 원자, C1-C8 알킬기, C3-C8 시클로알킬기, C3-C8 알케닐기, C3-C8 알키닐기, C1-C8 할로알킬기, C2-C8 알콕시알킬기, C3-C8 알콕시알콕시알킬기, C3-C8 할로알키닐기, C3-C8 할로알케닐기, C1-C8 알킬술포닐기, C1-C8 할로알킬술포닐기, C3-C8 알콕시카르보닐알킬기, S(O)2NH(C1-C8 알킬)기, C(O)R41 기, 또는 페닐 고리가 R42 로 치환될 수 있는 벤질기이고;
n 및 m 은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3 이고 m + n 은 2 또는 3 이며;
Z 는 CR9R10 기, 산소 원자, 황 원자, S(O) 기, S(O)2 기 또는 N(C1-C4 알킬)기이고;
각 R9 는 독립적으로 수소 원자, C1-C3 알킬기, 할로겐 원자, 히드록시기, C1-C6 알콕시기, C1-C6 할로알킬기, C1-C6 할로알콕시기, C2-C6 알킬카르보닐옥시기 또는 C2-C6 할로알킬카르보닐옥시기이고;
각 R10 은 독립적으로 수소 원자, C1-C3 알킬기, 히드록시기 또는 할로겐원자이고;
R11 및 R12 는 독립적으로 수소 원자, 할로겐 원자, C1-C6 알킬기, C3-C6 알케닐기 또는 C1-C6 할로알킬기이고;
R13 는 수소 원자, C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C3-C6 알케닐기, C3-C6 할로알케닐기, C3-C6 알키닐기, C3-C6 할로알키닐기, HC(=O) 기, (C1-C4 알킬)C(=O) 기 또는 NH2 기이고;
R14 는 C1-C6 알킬기, C1-C6 알킬티오기, C1-C6 할로알킬기 또는 N(CH3)2 기이고;
W 는 질소 원자 또는 CR15 기이고;
R15 는 수소 원자, C1-C6 알킬기, 할로겐 원자, 또는 C1-C6 알킬기, 하나 또는 두 개의 할로겐 원자, C1-C6 알콕시기 또는 CF3 기로 치환될 수 있는 페닐기이고;
각 Q 는 독립적으로 산소 원자 또는 황 원자이고;
Q1 은 산소 원자 또는 황 원자이고;
Z1 은 CR16R17 기, 산소 원자, 황 원자, S(O) 기, S(O)2 기 또는 N(C1-C4 알킬)기이고;
각 R16 는 독립적으로 수소 원자, 할로겐 원자, 히드록시기,C1-C6 알콕시기, C1-C6 할로알킬기, C1-C6 할로알콕시기, C2-C6 알킬카르보닐옥시기 또는 C2-C6 할로알킬카르보닐옥시기이고;
각 R17 은 독립적으로 수소 원자, 히드록시기 또는 할로겐 원자이고;
R18 은 C1-C6 알킬기, 할로겐 원자 또는 C1-C6 할로알킬기이고;
R19 및 R20 는 독립적으로 수소 원자, C1-C6 알킬기 또는 C1-C6 할로알킬기이고;
Z2 은 산소 원자, 황 원자, NR9 기 또는 CR9R10 기이고;
R21 및 R22 는 독립적으로 C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C3-C6 알케닐기, C3-C6 할로알케닐기, C3-C6 알키닐기 또는 C3-C6 할로알키닐기이고;
R23 은 수소 원자, 할로겐 원자 또는 시아노기이고;
R24 는 C1-C6 알킬술포닐기, C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C3-C6 알케닐기, C3-C6 알키닐기, C1-C6 알콕시기, C1-C6 할로알콕시기 또는 할로겐 원자이고;
R25 는 C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C3-C6 알케닐기 또는 C3-C6 알키닐기이고;
R26 는 C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, 또는 C1-C6 알킬기, 하나 또는 두 개의 할로겐 원자, 하나 또는 두 개의 니트로기, C1-C6 알콕시기 또는 CF3 기로 치환될 수 있는 페닐기이고;
W1 는 질소 원자 또는 CH 기이고;
T 는 하기의 화학식 T-1, T-2 및 T-3 중 하나로 표현되는 기이고 :
Figure 112007080679067-PAT00012
(식중, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, E10, E11 및 E12 는 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬기이다);
R27 는 C1-C8 알킬기, C3-C8 시클로알킬기, C3-C8 알케닐기, C3-C8 알키닐기, C1-C8 할로알킬기, C2-C8 알콕시알킬기, C2-C8 알킬티오알킬기, C2-C8 알킬술피닐알킬 기, C2-C8 알킬술포닐알킬기, C1-C8 알킬술포닐기, 페닐 고리가 할로겐 원자 및 C1-C4 알킬기로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 페닐술포닐기, C4-C8 알콕시알콕시알킬기, C4-C8 시클로알킬알킬기, C6-C8 시클로알콕시알킬기, C4-C8 알케닐옥시알킬기, C4-C8 알키닐옥시알킬기, C3-C8 할로알콕시알킬기, C4-C8 할로알케닐옥시알킬기, C4-C8 할로알키닐옥시알킬기, C6-C8 시클로알킬티오알킬기, C4-C8 알케닐티오알킬기, C4-C8 알키닐티오알킬기, 고리가 할로겐 원자, C1-C3 알킬기 및 C1-C3 할로알킬기로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 치환체로 치환된 페녹시로 치환된 C1-C4 알킬기, 고리가 할로겐 원자, C1-C3 알킬기 및 C1-C3 할로알킬기로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 치환체로 치환된 벤질옥시기, C4-C8 트리알킬실릴알킬기, C3-C8 시아노알킬기, C3-C8 할로시클로알킬기, C3-C8 할로알케닐기, C5-C8 알콕시알케닐기, C5-C8 할로알콕시알케닐기, C5-C8 알킬티오알케닐기, C3-C8 할로알키닐기, C5-C8 알콕시알키닐기, C5-C8 할로알콕시알키닐기, C5-C8 알킬티오알키닐기, C2-C8 알킬카르보닐기, 고리가 할로겐 원자, C1-C3 알킬기 및 C1-C3 할로알킬기로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 치환체로 치환된 벤질기, CHR34COR28 기, CHR34COOR28 기, CHR34P(0)(OR28)2 기, CHR34P(S)(OR28)2 기 , CHR34C(0)NR29R30 기 또는 CHR34C(0)NH2 기이고;
R28 는 C1-C8 알킬기, C2-C8 알케닐기, C3-C8 알키닐기 또는 테트라히드로푸라닐기이고;
R29 및 R31 은 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
R30 및 R32 는 독립적으로 C1-C4 알킬기, 또는 고리가 할로겐 원자, C1-C3 알킬기 및 C1-C3 할로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 페닐기이거나; 또는
R29 와 R30 은 함께 -(CH2)5-, (CH2)4- 또는 -CH2CH2OCH2CH2- 를 형성할 수 있으며, 또는 이렇게 형성된 고리는 C1-C3 알킬기, 페닐기 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있으며; 또는
R31 및 R32 는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 C3-C8 시클로알킬기를 형성할 수 있고;
R33 는 C1-C4 알킬기, C1-C4 할로알킬기 또는 C3-C6 알케닐기이고;
R34 및 R35 는 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
R36 은 수소 원자, C1-C6 알킬기, C3-C6 알케닐기 또는 C3-C6 알키닐기이고;
R37 은 수소 원자, C1-C4 알킬기 또는 할로겐 원자이고;
R38 은 수소 원자, C1-C6 알킬기, C3-C6 시클로알킬기, C3-C6 알케닐기, C3-C6 알키닐기, C2-C6 알콕시알킬기, C1-C6 할로알킬기, 고리가 할로겐 원자, C1-C4 알킬기 및 C1-C4 알콕시기로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 페닐기, -CH2CO2(C1-C4 알킬)기 또는 -CH(CH3)CO2(C1-C4 알킬)기이고;
R39 는 수소 원자, C1-C2 알킬기 또는 C(O)O(C1-C4 알킬)기이고;
R40 은 수소 원자, C1-C6 알킬기, C1-C6 알콕시기 또는 NH(C1-C6 알킬)기이고;
R41 은 C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C1-C6 알콕시기, NH(C1-C6 알킬)기, 고리가 R42 기, 벤질기 및 C2-C8 디알킬아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나의 치환체로 치환될 수 있는 페닐기이고;
R42 는 C1-C6 알킬기, 하나 또는 두 개의 할로겐 원자, C1-C6 알콕시기 또는 CF3 기이다];
(3) 하기 화학식 (2) 의 화합물 또는 니필라크로펜:
[화학식 2]
Figure 112007080679067-PAT00013
[식중, R43 은 C1-C4 알킬기이고;
R44 는 C1-C4 알킬기, C1-C4 알킬티오기, C1-C4 알콕시기, C1-C4 할로알킬기, C1-C4 할로알킬티오기 또는 C1-C4 할로알콕시기이고;
R43 및 R44 는 함께 -(CH2)3- 또는 -(CH2)4- 를 형성할 수 있고;
R45 는 수소 원자 또는 할로겐 원자이고;
R46 은 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
R47 은 수소 원자, 니트로기, 시아노기, -COOR49기, -C(=X)NR50R51 기 또는 -C(=X2)R52 기이고;
R48 은 수소 원자, 할로겐 원자, 시아노기, 할로겐 원자 및 히드록시기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기, C1-C4 알콕시기, 할로겐 원자, 니트로기, 시아노기, C1-C4 알킬기, C1-C4 알콕시기 및 할로-C1-C4 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 페닐기, 피롤릴기, C2-C8 알킬기, C3-C8 알케닐기, C3-C8 알키닐기, C3-C8 알콕시기, 하나 이상의 산소 원자가 삽입된 C2-C8 알킬기, C3-C8 알케닐기, C3-C8 알키닐기 및 C3-C8 알콕시기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 기, 또는 하기의 화학식으로 표현되는 기들중 하나이고:
Figure 112007080679067-PAT00014
식중, R49, R50 및 R51 은 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
R50 및 R51 은 이들이 결합된 질소 원자와 함께 포화 지환족 5 또는 6 원 고리를 형성할 수 있으며;
R52 는 수소 원자, C1-C4 알킬기, 또는 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 C1-C4 알킬기이고;
R53 은 수소 원자, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C2-C6 알케닐기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C3-C6 알키닐기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 페닐기, C3-C8 시클로알킬기, 시아노메틸기, 또는 R63CO- 기이고;
R54 는 수소 원자, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C6 알킬기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C2-C6 알케닐기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C3-C6 알키닐기, 할로겐 원자로 치환될 수 있는 페닐기, C3-C8 시클로알킬기, 시아노메틸기, C1-C4 알콕시-C1-C6 알킬기, 디-C1-C4 알킬아미노-C1-C4 알킬기, 테트라히드로푸르푸릴메틸기, C3-C6 알키닐옥시-C1-C4 알킬기, 고리가 할로겐 원자, 니트로기, 시아노기, C1-C4 알킬기, C1-C4 알콕시기 및 할로-C1-C4 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된 치환체로 치환될 수 있는 벤질기, -C(=X2)R63 기, -(CH2)a-(O)d-R70 기, -(CH2)a-O-(CH2)b-R70 기, -(CH2)a-X2-R76 기이고;
R53 및 R54 는 이들이 결합된 질소 원자와 함께, 하나의 탄소 원자가 산소 원자로 대체될 수도 있는 포화 지환족 3, 5 또는 6 원 고리, 또는 방향족 5 또는 6 원 고리를 형성할 수 있으며;
R55 는 수소 원자, C1-C4 알킬기, C2-C6 알케닐기 또는 C3-C6 알키닐기이거나, 또는 R55 및 R56 은 함께 -(CH2)e- 를 형성할 수 있으며;
R56 및 R57 은 독립적으로 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C2-C6 알케닐기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C3-C6 알키닐기, 또는 하나 이상의 할로겐 원자, 수소 원자, C3-C6 시클로알킬기, -XR60 기 또는 -NR61R62 기로 치환될 수 있는 페닐기이고;
R58 은 수소 원자, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기, C3-C6 알키닐기, C1-C4 알킬카르보닐기, 시아노-C1-C3 알킬기, C1-C4 알콕시카르보닐-C1-C4 알킬기, 디-C1-C4 알 콕시카르보닐-C1-C4 알킬기, 벤질기, C1-C4 알콕시-C1-C4 알키닐기, -(CH2)a-R75 기, -(CH2)a-X2-R72 기, -(CH2)a-X2-(CH2)b-R72 기 또는 -(CH2)a-X2-(CH2)b-X2-(CH2)c-R72 기이고;
R59 는 수소 원자, C1-C4 알킬기, C2-C6 알케닐기, C3-C6 알키닐기, 시아노-C1-C3 알킬기, C1-C4 알킬카르보닐-C1-C3 알킬기 또는 페닐기이고;
R60 은 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기이고;
R61 및 R62 는 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
R63 은 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기, C1-C4 알콕시-C1-C4 알킬기, C1-C4 알킬티오-C1-C4 알킬기, C3-C6 시클로알킬기, 고리가 할로겐 원자, 니트로기, 시아노기, C1-C4 알킬기, C1-C4 알콕시기 및 할로-C1-C4 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된 치환체로 치환될 수 있는 페닐기, -NR73R74 기 또는 -(CH2)a-(O)d-R75 기이고;
R64 는 C1-C4 알콕시카르보닐기 또는 카르복실기이고;
R65 는 클로로메틸기, 시아노메틸기, 하나 이상의 산소 원자가 삽입될 수 있는 C3-C6 시클로알킬기, 또는 C1-C4 알콕시카르보닐-C1-C4 알킬기이고;
R66 는 히드록시기 또는 -NR67R68 기이고;
A 는 -NR67R68 기 또는 -S(0)f-R69 기이고;
R67 및 R68 은 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
R69 는 C1-C4 알킬기 또는 C1-C4 할로알킬기이고;
R70 은 수소 원자, 히드록시기, 할로겐 원자, 하나 이상의 C1-C4 알콕시기로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기, 하나 이상의 산소 원자가 삽입될 수 있는 C3-C6 시클로알킬기, 하나 또는 두 개의 메틸기로 치환될 수 있는 C3-C6 시클로알킬기, 푸릴기, 티에닐기 또는 -C(=O)R71 기이고;
R71 및 R72 는 동일하거나 상이하며, C1-C4 알킬기 또는 C1-C4 알콕시기이고;
R73 및 R74 는 동일하거나 상이하며, C1-C4 알킬기 또는 페닐기이고;
R75 는 하나 이상의 산소 원자가 삽입될 수 있는 C3-C6 시클로알킬기, 하나 또는 두 개의 메틸기로 치환될 수 있는 C3-C6 시클로알킬기, 푸릴기, 티에닐기 또는 -C(=O)R71 기이고;
R76 은 C1-C4 알킬기이고;
a, b 및 c 는 독립적으로 1, 2 또는 3 이고;
d 는 0 또는 1 이고;
e 는 2 또는 3 이고;
f 는 1 또는 2 이고;
X2 는 산소 원자 또는 황 원자이다].
또한, 다른 N-치환된 피라졸로서, 문헌 [Lyga 등, Pesticide Sci., 42: p29 (1994)] 에 기술된 3-치환-2-아릴-4,5,6,7-테트라히드로인다졸 등이 있다.
광화학계 Ⅰ 에서 전자 전달을 억제하는 화합물의 특정 예로서, 예컨대 파라쿼트(paraquat), 디쿼트(diquat) 등이 있다. 광화학계 Ⅱ 에서 전자 전달을 억제하는 화합물의 특정 예로서, 예컨대 트리아진 화합물 (예, 아트라진 등), 우레아 화합물 ( 예, 디우론, 등), 니트릴 화합물 (예, 브로목시닐 및 이속시닐) 등이 있다. 4-HPPD 를 억제하는 화합물의 특정 예로서, 예컨대 이속사졸 (예, 이속사플루톨), 피라졸, 트리케톤, 등이 있다. PDS 를 억제하는 화합물의 특정예로서, 예컨대 노르플루라존, 플루로클로리돈, 플루리돈, 플루르타몬, 디플루페니칸 등이 있다. EPSPS 를 억제하는 화합물의 특정예로서, 예컨대 글리포세이트 등 이 있다. ALS 를 억제하는 화합물의 특정예로서, 예컨대 술포닐우레아, 이미다졸리논, 피리미디닐티오벤조에이트, 트리아졸로피리미딘 등이 있다. GS 를 억제하는 화합물의 특정예로서, 예컨대 비알라포스, 글루포시네이트 등이 있다. DHP 를 억제하는 화합물의 특정예로서, 예컨대 아술람 등이 있다. ACC 를 억제하는 화합물의 특정예로서, 예컨대 시클로헥산디온, 아릴옥시페녹시프로피오네이트 등이 있다. 셀룰로오스를 억제하는 화합물의 특정예로서, 예컨대 디클로베닐 등이 있다.
본 발명에서 유용한 잡초 제거 화합물의 각종 예는 하기의 화학 구조로 나타나 있다:
Figure 112007080679067-PAT00015
Figure 112007080679067-PAT00016
Figure 112007080679067-PAT00017
Figure 112007080679067-PAT00018
Figure 112007080679067-PAT00019
본 발명의 방법의 첫 번째 측면으로, 사용 유전자는 하기 특성들 (a) 내지 (c) 를 갖는 단백질을 코딩하는 것들이다 (이후, 경우에 따라 이를 목적 단백질이라고 함) :
(a) 잡초 제거 물질에 대한 특이적 친화성을 가짐;
(b) 상기 단백질이 특이적 친화성을 갖는 물질을 변형시키는 능력이 실질적으로 없음;
(c) 면역글로불린의 가변 구역의 프레임워크가 실질적으로 없음.
상기 특성 (a) 의 잡초 제거 물질에 있어 용어 "특이적 친화성" 는 효소 (목적 단백질) 와 기질 (잡초 제거 물질), 또는 효소 (목적 단백질) 와 효소 활성 억제제 또는 제어제가 서로 효소반응으로 결합하는 것; 또는 목적 단백질과 잡초 제거 물질이 서로 친화성 및 특이성으로 인해 서로 결합하는 것, 예를 들면 수용체-화학적 결합, 예컨대 수용체와 리간드 간의 결합 등을 의미한다. 목적 단백질은 자연 발생하는 단백질; 자연 발생하는 단백질의 아미노산 치환, 추가, 결실, 변형 등으로 인해 수득되는 상기 단백질의 변형체; 및 잡초 제거 물질에 대한 친화성에 따라 선택되는 무작위 아미노산 서열을 갖는 인위 합성된 단백질일 수 있으며, 단, 이들은 잡초 제거 물질에 대해 특이적으로 결합하는 구조를 가진다.
특성 (b) 에서 "변형시키는 능력이 실질적으로 없는" 이란 용어는, (특성 (a) 에서의 잡초 제거 물질에 대한 특이적 친화성을 제외하고) 상기 단백질이 특이적 친화성을 갖는 기질에 대한 효소반응성이 실질적으로 불활성이거나 존재하지 않음을 의미한다. 그것의 예에는, 목적 단백질이 상기 단백질이 예를 들면 특정 잡초 제거 물질과 같이 특이적 친화성을 갖는 물질 또는 상기 단백질에 대한 특이적 친화성을 근거로 기질의 구조의 필수 부분을 갖는 물질 등을 상기 단백질이 특이적 친화성을 갖는 기질과 상이한 화학적 구조를 갖는 물질로 전환시키는 능력이 없는 경우가 포함된다. "변형시키는 능력이 실질적으로 없는" 단백질은 예를 들어, 상기 단백질을 코딩하는 유전자가 제거되어, 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 미생물에 도입하는 경우에서의 통상적인 조건 하에 성장할 수 없는 미생물의 성장의 비회복을, 도입된 유전자가 미생물에서 발현되도록 하는 상태에서 체크함으로써, 규명될 수 있다.
특성 (c) 에서, "면역글로불린의 가변 구역의 프레임워크 구역이 실질적으로 없는" 이라는 용어는, 목적 단백질이 면역글로불린의 가변 구역에 대해 입체구조적 특이성을 형성하지 않는다는 것을 의미한다. "면역글로불린의 가변 구역의 프레임워크 구역" 이라는 용어는 면역글로불린 분자의 성분인 H 체인 및 L 체인의 가변 구역으로부터 초가변 구역을 제거한 후, 남는 구역을 의미한다. 이 구역에서는, 아미노산 서열의 보존율이 매우 높고, 이 구역은 가변 구역의 매우 보존된 입체구조를 유지하는 작용을 한다. 상기 입체구조의 형성으로 인해, 각각의 H 체인 및 L 체인 상의 세개의 부위에 별도로 위치한 초가변 구역이 입체구조 상의 한 부위에 모여서, 항원 결합 사이트를 형성한다 [Alberts, B., 등 저 (1983), Molecular Biology of the Cell, p. 979, Garland Publishing, Inc., New York].
상기 특성 (c) 를 갖는 목적 단백질은 예를 들어, 단백질의 아미노산 서열에 기초하여 선택될 수 있다. 단백질의 전형예로서, 약 30 개 이상의 아미노산으로 구성되고, 면역글로불린의 가변 구역의 프레임워크 구역의 공지된 아미노산 서열과 약 60 % 이상의 상동성을 갖는 어떠한 아미노산 서열도 함유하지 않는 단백질 등이 있다. 예를 들면, 상기 프레임워크 구역의 존재 또는 부재를 주형으로서의 단백질을 코딩하는 유전자 및, 증폭 프라이머로서의 면역글로불린의 H 체인 또는 L 체인으로부터 유도된 가변 구역을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 DNA, 예를 들어 Clackson, T. 등의 [Nature 352; p 624 (1991)] 에 기재된 프라이머 VH1BACK 및 VH1FOR-2 또는 VK2BACK 및 VK4FOR, 또는 재조합 항체 유전자 클로닝을 위한 시판용 키트, 예를 들어 재조합 파아지 항체 시스템 (Pharmacia Biotech) 의 헤비 프라이머 믹스 또는 라이트 프라이머 믹스에 함유된 프라이머를 이용한 PCR 로 확인하여, 주어진 길이의 DNA 증폭의 존재 또는 부재를 분석할 수 있다.
잡초 제거 물질에 대한 특이적 친화성을 갖는 결합 단백질의 예에는 또한 잡초 제거 물질에 대한 친화성을 갖는 펩티드가 포함된다.
상기 특성들 (a) 내지 (c) 를 갖는 목적 단백질의 특정예에는, 프로토포르피린 IX 에 대해 친화성이 있는 불활성형 결합 단백질 [예 : 기질이 프로토포르피린 IX (잡초 제거 물질) 인 불활성형 마그네슘 킬레타아제, 불활성형 페로킬레타아제 (프로토헴 페롤리라아제; EC 4.9.9.1), 기질로서 테트라피롤환을 갖는 화합물과 코발트의 킬레이트화 반응을 촉매하는 불활성형 코발트 킬레타아제, 프로토포르피린 IX 에 대해 친화성을 갖는 펩티드, 예컨대 4 내지 100 개의 아미노산으로 구성된 단백질 (예들 들어, 프로토포르피린 IX 에 대해 친화성을 갖는 펩티드 HASYS, 예컨대 서열번호 53 의 아미노산 서열을 함유하는 단백질 및 서열번호 54 의 아미노산 서열을 갖는 단백질; 프로토포르피린 IX 에 대해 친화성을 갖는 RASSL, 예컨대 서열번호 55 의 아미노산 서열을 함유하는 단백질 및 서열번호 56 의 아미노산 서열을 갖는 단백질; 포르피린 화합물에 대한 친화성을 갖는 펩티드 YAGY, 예컨대 서열번호 57 의 아미노산 서열을 함유하는 단백질 및 서열번호 58 의 아미노산 서열을 갖는 단백질; 포르피린 화합물에 대한 친화성을 갖는 펩티드 YAGF, 예컨대 서열번호 59 의 아미노산 서열을 함유하는 단백질 및 서열번호 60 의 아미노산 서열을 갖는 단백질 등)], 프로토포르피리노겐 IX 에 대한 친화성을 갖는 불활성형 결합 단백질 (예컨대, 불활성 형태의 PPO, 불활성형 코프로포르피리노겐 III 옥시다아제), 등이 포함된다.
상기 불활성형 결합 단백질에는, 자연적 또는 인위적 조건 하에서 자연 발생하는 활성 단백질의 아미노산 치환, 추가, 결실의 변형 등에 의해 활성이 상실된, 그 단백질들의 변형체가 포함된다.
잡초 제거 물질에 의한 세포 기능장애는 목적하는 잡초 제거 화합물-내성을 나타내기위해 식물 세포의 잡초 제거 물질에 대한 이러한 결합 단백질의 결합에 의해 방지될 수 있다.
불활성형 마그네슘 킬레타아제는 마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질, 또는 프로토포르피린 IX 에 대한 특이적 친화성을 갖는 그것의 변형체이고, 그리고 그것의 특정예에는 이의 세포기관 트랜지트 시그널 시퀀스가 제거된 소단위 단백질 등이 포함된다.
불활성형 페로킬레타아제는 프로토포르피린 IX 를 변형시키는 능력이 없고, 프로토포르피린 IX 에 대한 특이적 친화성을 갖는 변형체이고, 그것의 예에는 페로킬레타아제의 Fe 이온 결합 사이트로 추정되는 구역이 변형된 페로킬레타아제 변형체 등이 포함된다.
불활성형 코발트 킬레타아제는 코발트 킬레타아제의 기질 결합 소단위 단 백질, 또는 프로토포르피린 IX 를 변형시키는 능력이 없고, 프로토포르피린 IX 에 대한 특이적 친화성이 있는 그것의 변형체이다.
불활성형 PPO 는 프로토포르피리노겐 IX 를 산화시키는 능력이 없고, 프로토포르피리노겐 IX 에 대한 특이적 친화성을 갖는 변형체로서, 그것의 특정 예에는 PPO 의 FAD 결합 사이트로 추정되는 구역 (아미노산 서열 GXGXXG (X 가 임의의 아미노산임), 예컨대 마우스-이어(ear) 크레스 (Arabidopsis thaliana) 의 엽록체 위치한 PPO 의 N-말단으로부터 63 내지 68번째 아미노산을 함유하고, GGGISG 의 아미노산 서열이 있는 구역) 이 제거된 PPO 변형체 등이 포함된다.
불활성형 코프로포르피리노겐 III 옥시다아제는 프로토포르피리노겐 IX 를 산화시키는 능력이 없고, 프로토포르피리노겐 IX 에 대한 특이적 친화성을 갖는 변형체이다.
상기 단백질을 코딩하는 유전자는 예를 들어 하기와 같이 수득될 수 있다.
마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질을 코딩하는 유전자로서, 예를 들어 광합성 박테리아, 로도박터 캅술라투스 (Rhodobacter capsulatus) (Genebank accession M74001), 마우스-이어 크레스 (mouse-ear cress) (Genebank accession Z68495), 보리 (Genebank accession U96216), 금어초 (snapdragon; Antirrhinum majus) (Genebank accession U26916), 시네쵸시스티스 (Synechocystis) P.C.C. 6803 (Genebank accession U29131) 등으로부터 유래된 것들이 공지되어 있다. 그러한 공지된 유전자 (그것의 핵산 서열이 공지됨) 를 단리시키기 위하여, 주형으로서의 목적하는 유전자를 가진 유기체의 게놈 DNA 또는 cDNA, 및 유전자에 의해 코딩된 단백질의 N- 및 C-말단 주변에 상응하는 핵산 서열을 기초로 생성된 프라이머를 이용하여 PCR 을 수행하여, 목적하는 유전자를 증폭시킬 수 있다. 또한, 마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질을 코딩하는 유전자를 상기 외의 광합성 유기체로부터 수득할 수 있다. 예를 들면, 첫째 목적하는 합성 유기체로부터 mRNA 를 수득하여, 주형으로서의 mRNA 를 이용하여 역전사효소로 cDNA 를 합성하고, 그 cDNA 를 ZAPII 등과 같은 파아지 벡터에 접합함으로써 cDNA 라이브러리를 구성한다. 마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질을 코딩하는 유전자의 일부분 이상을 함유하는 DNA 단편을 증폭하기 위해, 주형으로서의 상기 만들어진 cDNA 라이브러리 및 상기 기재된 유전자와 같이 공지된 유전자 중 잘 보존된 핵산 서열을 기초로 고안되어 합성된 프라이머를 이용함으로써, PCR 를 수행할 수 있다. 이어서 수득된 DNA 단편을 프로브로써 이용하여, cDNA 라이브러리의 스크리닝을 수행하여, 포지티브 클론을 선택할 수 있다. 마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질의 목적하는 유전자를 선택된 클론의 핵산 서열의 서열 결정으로 확인할 수 있다.
프로토포르피린 IX 에 대한 특이적 친화성을 갖는 마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질의 변이체를 코딩하는 유전자를 수득하기 위해, 소단위 단백질을 코딩하는 유전자를 핵산 치환, 추가, 결실의 변형 등 으로 돌연변이화 전후에, 수득된 유전자를 [Gibson, L.C.D. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92; p. 1941 (1995)] 등에 기재된 방법에 따라, E. coli BL21(DE3) 균주에 도입하여, 형질변환체를 수득하고, 이에 도입된 유전자의 높은 발현이 일어나는 조건 하에, 그 형질변환체를 배양한다. 프로토포르피린 IX 에 대한 특이적 친화성을 갖는 소단위 단백질의 변형체를 코딩하는, 목적하는 유전자는, 배양된 세포가 붉게 변하고, 프로토포르피린 IX 의 축적을 보이는 형광 흡광을 갖는 (여기 파장 405 nm, 방출 파장 630 nm) 균주를 선택함으로써 수득될 수 있다.
페로킬레타아제를 코딩하는 유전자로서, 예를 들어 E. coli (Genebank accession D90259), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) (Genebank accession M97208), 브라디리조비움 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum) (Genebank accession M92427), 효모 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) (Genebank accession J05395), 쥐 (Genebank accession J05697), 인간 (Genebank accession D00726), 보리 (Genebank accession D26105), 오이 (Genebank accession D26106) 등이 공지되어 있다. 상기와 같이 공지된 유전자 (그것의 핵산 서열이 공지됨) 를 단리시키기 위하여, 주형으로서의 목적하는 유전자를 가진 유기체의 게놈 DNA 또는 cDNA, 및 유전자에 의해 코딩된 단백질의 N- 및 C-말단 주변에 상응하는 핵산 서열을 기초로 생성된 프라이머를 이용하여 PCR 을 수행하여, 목적하는 유전자를 증폭시킬 수 있다. 또한, 페로킬레타아제를 코딩하는 다른 유전자를 수득하기 위해, 첫째 목적하는 유기체로 부터 mRNA 를 수득하여, 주형으로서의 mRNA 를 이용하여 역전사효소로 cDNA 를 합성하고, 그 cDNA 를 ZAPII 등과 같은 파아지 벡터, 또는 pUC 등과 같은 플라스미드 벡터에 접합함으로써 cDNA 라이브러리를 구성한다. cDNA 라이브러리를 Miyamoto, K. 등이 기술한 [Plant Physio., 105; p. 769 (1994)] 의 E. coli VS200 의 페로킬레타아제 결핍 돌연변이 균주에 도입한 후, 컴플리멘테이션 시험을 행하여, 목적하는 유기체로부터 유도된 페로킬레타아제 유전자를 함유하는 클론을 선택할 수 있다. 또한, DNA 단편을 증폭하기 위해, 주형으로서의 상기 만들어진 cDNA 라이브러리 및 상기 유전자와 같이 공지된 유전자 중 잘 보존된 핵산 서열을 기초로 제조된 프라이머를 이용하여, PCR 을 수행할 수 있다. 프로브로서 이어서 수득된 DNA 단편을 이용하여, cDNA 라이브러리의 스크리닝을 수행하여, 포지티브 클론을 선택할 수 있다. 선택된 클론의 핵산 서열의 서열 결정으로 목적하는 페로킬레타아제 유전자를 확인할 수 있다.
프로토포르피린 IX 을 변형시키는 능력이 없고, 프로토포르피린 IX 에 대한 특이적 친화성을 갖는 페로킬레타아제의 변형체를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 페로킬레타아제의 Fe 이온 결합 사이트로 추정되는 구역이 변형된 페로킬레타아제를 코딩하는 유전자) 를 수득하기 위해, 상기 부분에 대한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 기초로 그 구역에 돌연변이를 도입함으로써, 변이 프라이머를 제조하고, 시판용 사이트-유도 돌연변이 키트 (Mutan-Super Express, Takara Shuzo) 를 사용함으로써 PCR 를 수행하여, 상기 변형체를 코 딩하는 유전자를 수득할 수 있다. 보다 상세하게, 야생형 페로킬레타아제 유전자를 플라스미드 벡터 pKF19K 의 클로닝 사이트에 삽입하고, 주형으로서의 수득된 플라스키드 DNA 및 상기 기술된 돌연변이 프라이머 및 pKF19K 의 카나마이신 내성 유전자에 위치한 amber 돌연변이의 회복을 위한 선택 프라이머를 이용하여, PCR 을 수행한다. PCR 로 증폭된 유전자를 E. coli MV1184 (억제유전자가 없는 균주) 에 도입하고, 형질변환체를 카나마이신 내성에 따라 단리하여, 목적하는 구역을 구성하는 아미노산 서열에 따른 핵산 서열이 변형된 페로킬레타아제를 갖는 E. coli 를 단리할 수 있다. E. coli 의 플라스미드 DNA 의 핵산 서열을 분석함으로써, 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자로서, 단리시킨 유전자를 확인할 수 있다.
프로토포르피린 IX 에 대해 친화성을 갖는 펩티드, 즉 4 내지 100 개의 아미노산으로 구성된 단백질을 코딩하는 유전자를 예를 들어 [Sugimoto, N., Nakano, S., Chem., Lett., p 939 (1997)] 등에 기재된 조합 화학 방법에 따라 펩티드 라이브러리를 합성하고, 잡초 제거 물질에 대해 친화성을 갖는 펩티드를 선택하여, 이에 선택된 펩티드를 펩티드서열분석기로 아미노산 서열을 분석하며, 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 유전자를 디자인하고, DNA 합성기 등으로 핵산 서열을 합성함으로써 수득할 수 있다.
또한, 잡초 제거 물질에 대해 친화성을 갖는 펩티드를 표시하는 상(phase) 클론은 파아지 표시 방법에 따라 파아지 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 보다 상세하게는, 예를 들어 M13 파아지 입자의 표면 상의 무작위 아미노산 서열을 갖는 단백질을 표시하는 파아지 라이브러리를, 무작위 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 M13 파아지 유전자의 코트 단백질 pIII 를 코딩하는 구역의 상류에 삽입함으로써 구성될 수 있다. 한편, 비오틴으로 표지된 잡초 제거 물질을 아비딘 또는 스트렙토아비딘으로 코팅된 플레이트에 결합시켜, 잡초 제거 물질로 코팅된 지지체를 제조한다. 잡초 제거 물질에 대한 친화성을 갖는 목적하는 단백질을 표시하는 파아지를, 잡초 제거 물질로 코팅된 플레이트에 상기 파아지 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리할 수 있고, 목적하는 단백질의 유전자를 단리된 파아지로부터 수득할 수 있다.
서열번호 53, 55, 57 또는 59 로 표시되는 아미노산 서열이 4 번 또는 8 번 반복되는 단백질을 코딩하는 유전자는, 예를 들어 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이 개시 코돈 ATG 후에 주어진 회수만큼 반복되는 핵산 서열을 선택하여, 선택된 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드, 및 선택된 핵산 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 DNA 합성기로 합성한 후, 그것들을 어닐링(annealing) 시킴으로써 제조할 수 있다.
또한 서열번호 54, 56, 58 또는 60 으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를, 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 선택하여, 선택된 핵산 서열과 상보적인 핵산 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드 및 선택된 핵산 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 DNA 합성기로 합성한 후, 그것들을 어닐링(annealing) 시킴으로써 제조할 수 있다. 이에 대해서, 주어진 아 미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 선택하기 위해, 예를 들어 식물에서 유래된 유전자에서 빈번히 사용되는 코돈을 선택하는 것이 바람직하다.
PPO 유전자로서, 예를 들어, E. coli (Genebank accession X68660), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) (Genebank accession M97208), 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) (Genebank accession L42023), 쥐 (Genebank accession D45185), 인간 (Genebank accession D38537), 마우스-이어 크레스 (Genebank accession D83139), 담배 (Genebank accession Y13465, Y13466) 등으로부터 유래된 것들이 공지되어 있다. 상기와 같이 공지된 유전자 (그것의 핵산 서열이 공지됨) 를 단리시키기 위하여, 주형으로서의 목적하는 유전자를 가진 유기체의 게놈 DNA 또는 cDNA, 및 유전자에 의해 코딩된 단백질의 N- 및 C-말단 주변에 상응하는 핵산 서열을 기초로 생성된 프라이머를 이용하여 PCR 을 수행하여, 목적하는 유전자를 증폭시킬 수 있다. 또한, 다른 PPO 유전자를 수득하기 위해, 예를 들어, 첫째 상기 기재된 방법에 따라 목적하는 유전자를 갖는 유기체로부터 cDNA 라이브러리를 구성한다. cDNA 라이브러리를 [Narita, S., 등, Gene, 182; p. 169 (1996)] 에 기재된 E. coli PPO 결핍 돌연변이 균주 VSR800 에 도입한 후, 컴플리멘테이션 시험을 행하여, 목적하는 유기체로부터 유도된 PPO 유전자를 함유하는 클론을 선택할 수 있다. 또한, DNA 단편을 증폭하기 위해, 주형으로서의 상기 구성된 cDNA 라이브러리 및 상기 유전자와 같이 공지된 유전자 중 잘 보존된 핵산 서열을 기초로 제조된 프라이머를 이용하여, PCR 을 수행할 수 있다. 프로브로 서 이에 수득된 DNA 단편을 이용하여, cDNA 라이브러리의 스크리닝을 수행하여, 포지티브 클론을 선택할 수 있다. 선택된 클론의 핵산 서열의 서열 결정으로, 목적하는 PPO 유전자를 확인할 수 있다.
프로토포르피린 IX 를 산화시키는 능력이 없고, 프로토포르피린 IX 에 대한 특이적 친화성을 갖는 PPO 의 변형체를 코딩하는 유전자를 수득하기 위해, 예를 들어 핵산 치환, 추가, 결실의 변형 등으로 PPO 유전자에 돌연변이를 만들고, 수득된, 변형된 유전자를, PPO 억제형 제초 화합물로 처리함으로써 광(光)-의존적으로 성장이 억제되는 상기 E. coil 에 도입한다. 프로토포르피리노겐 IX 결합능력을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를, 이에 수득된 E. coli 를 헤민, 아미노레불린산 및 PPO 억제형 제초 화합물의 존재 하에 배양함으로써 선택하여, 명 상태 하에서도 성장할 수 있는 클론을 선택할 수 있다. 프로토포르피리노겐 IX 을 산화시키는 능력이 없는 단백질을 코딩하는 유전자를, 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 제조하기 위해, E. coli 등과 같은 호스트에서 이에 선택된 변형된 유전자를 발현시키고, [Jacobs, N. J. 및 Jacobs. J. M. (1982) Enzyme, 28, 206 - 219] 등에 기재된 방법에 따라 프로토프로피리노겐 IX 를 산화시키는 능력을 측정함으로써 선택할 수 있다. 더욱 상세하게는, 상기 변형된 유전자를 E. coli 의 발현 벡터에 삽입하고, Yamamoto, F., 등의 [Japanese J. Genet., 63; p 237 (1988)] 등에 기재된 E. coli BT3 균주 등과 같은 E. coli 의 PPO 유전자 (hemG 위치) 결핍된 E.Coli에 도입한다. E. coli 는 E. coli 에 도입되는 벡터의 선택 마커에 상응하는 셀 성장 억제제에 부가하여, 헤민 및 아미노레불린산을 함유하는 배양 매질에서 배양하여, 형질변환체를 수득한다. 변형된 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 형질변환체로부터 수득할 수 있다. 또한, 호스트 셀이 결핍된 PPO 유전자를 보완하지 않는 유전자는, 변형된 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 형질변환체를 헤민 및 아미노레불린산이 실질적으로 없는 배양 매질 중에 배양하여 성장하지 않는 균주를 규명함으로써 수득된다. 이 후자의 방법은 또한 프로토프로피리노겐 IX 을 산화시키는 능력이 없는 단백질을 코딩하는 유전자의 선택에 사용된다.
또한, PPO 의 FAD 결합 사이트로 추정되는 구역 (아미노산 서열 GXGXXG (여기에서, X 는 임의의 아미노산임)) 이 제거된 PPO 의 변형체를 코딩하는 유전자를 수득하기 위해, 첫째, 구역의 결실 돌연변이 도입을 위한 돌연변이 프라이머를 그 구역에 관한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 기초로 제조한다. 이어서, 상기 기재한 바와 같은 시판용 사이트-유도 돌연변이 키트 (Mutan-Super Express, Takara Shuzo) 및 돌연변이 프라이머를 이용함으로써, PCR 을 수행하여, 구역이 제거된 상기 변형체 단백질을 코딩하는 유전자를 수득한다.
프로토포르피린 IX 에 대한 친화성을 갖는 펩티드 HASYS 및 RASSL, 및 포르피린 화합물에 대한 친화성을 갖는 펩티드 YAGA 및 YAGF 와 같은 펩티드 단백질 등을 코딩하는 유전자를 DNA 합성기로 합성된 올리고뉴클레오티드에 어닐링시킴으로써 수득할 수 있다.
또한, 다른 잡초 제거 물질에 대해 친화성이 있는, 알려지지 않은 펩티드 단백질을 코딩하는 유전자는 하기 방법 등에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 각종 펩티드 라이브러리는, 예를 들어 [Sugimoto, N., Nakano, S., Chem., Lett., p 939 (1997)] 등에 기재된 조합 화학 방법에 따라 구성될 수 있다. 펩티드는 잡초 제거 물질에 대한 친화성에 따라 상기 구성된 펩티드로부터 선택된 후, 펩티드서열분석기로 펩티드의 아미노산 서열을 분석한다. 이에, 펩티드를 코딩하는 유전자를 DNA 합성기로 합성될 수 있다. 택일적으로는, 잡초 제거 물질에 대한 친화성을 갖는 펩티드를 표시하는 상 클론을, 파아지 표시 방법에 따라 파아지 라이브러리를 선택함으로써 수득할 수 있다. 상세하게는, 예를 들어 M13 파아지 입자의 표면에 무작위 아미노산 서열을 갖는 단백질을 표시하는 파아지 라이브러리를, 무작위 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 M13 파아지 유전자의 코트 단백질 pIII 를 코딩하는 구역의 상류에 삽입함으로써 구성된다. 한편, 비오틴으로 라벨링된 잡초 제거 물질을 아비딘 또는 스트렙토아비딘으로 코팅된 플레이트에 결합시켜, 잡초 제거 물질로 코팅된 지지체를 제조한다. 잡초 제거 물질에 대한 친화성을 갖는 목적하는 단백질을 표시하는 파아지를, 잡초 제거 물질로 코팅된 플레이트에 상기 파아지 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리할 수 있고, 목적하는 단백질의 유전자를 단리시킨 파아지로부터 수득할 수 있다.
코프로포르피리노겐 III 옥시다아제를 코딩하는 유전자로서, 예를 들면 E. coli (Genebank accession X75413), 살모넬라 티피무림 (Salmonella typhimurim) (Genebank accession L19503), 효모 삭카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) (Genebank accession J03873), 쥐 (Genebank accession D1633), 인간 (Genebank accession D16333), 대두 (Genebank accession X71083), 보리 (Genebank accession X82830), 담배 (Genebank accession X82831) 등으로부터 유래된 것들이 공지되어 있다. 그러한 공지된 유전자 (그것의 핵산 서열이 공지됨) 를 단리시키기 위하여, 주형으로서의 목적하는 유전자를 가진 유기체의 게놈 DNA 또는 cDNA, 및 유전자에 의해 코딩된 단백질의 N- 및 C-말단 주변에 상응하는 핵산 서열을 기초로 생성된 프라이머를 이용하여 PCR 을 수행하여, 목적하는 유전자를 증폭시킬 수 있다. 또한, 다른 코프로포르피리노겐 III 옥시다아제 유전자를 수득하기 위해, 예를 들어, 첫째, 목적하는 유기체로부터 mRNA 를 준비하고, 역전사효소로, 주형으로서의 mRNA 를 이용하여 cDNA 를 합성하고, 이를 [Sikorski, R. S. 등 Genetics, 122; p 19 (1989)] 등에 의해 기재된 pRS313 과 같은 플라스미드 벡터에 접합함으로써 cDNA 라이브러리를 구성한다. [Troup, B., 등, Bacteriol., 176; p 673 (1994)] 에 의해 기재된 효모 코프로포르피리노겐 III 옥시다아제 결핍 균주 HEM13 으로 cDNA 라이브러리를 도입한 후, 보완 시험을 시행하여, 목적하는 유기체로부터 유래된 코프로포르피리노겐 III 옥시다아제를 함유하는 클론을 선택할 수 있다. 또한, DNA 단편을 증폭하기 위해, 주형으로서의 상기-구성된 cDNA 라이브러리 및 상기 기재된 유전자와 같이 공지된 유전자 중 잘 보 존된 핵산 서열을 기초로 제조된 프라이머를 이용함으로써, PCR 를 수행할 수 있다. 이에 수득된 DNA 단편을 프로브로써 이용하여, cDNA 라이브러리의 스크리닝을 수행하여, 포지티브 클론을 선택할 수 있다. 목적하는 코프로토포르피리노겐 III 옥시다아제 유전자를, 선택된 클론의 핵산 서열의 서열 결정으로 확인할 수 있다.
프로토포르피리노겐 IX 를 산화시키는 능력이 없고, 프로토포르피리노겐 IX 에 대한 특이적 친화성을 갖는 코프로토포르피리노겐 III 옥시다아제의 변형체를 코딩하는 유전자를 수득하기 위해, 예를 들어 핵산 치환, 추가, 결실의 변형 등으로 코프로토포르피리노겐 III 옥시다아제 유전자에 돌연변이를 만들고, 수득된 유전자를 PPO 억제형 제초 화합물로 처리함으로써 광(光)-의존적으로 성장이 억제되는 상기 E. coli 에 도입한다. 프로토포르피리노겐 IX 결합 능력을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를, 이에 수득된 E. coli 를 헤민, 아미노레불린산 및 PPO 억제형 제초 화합물의 존재 하에 배양함으로써 선택하여, 명 상태 하에서도 성장할 수 있는 클론을 선택할 수 있다. 프로토포르피리노겐 IX 을 산화시키는 능력이 없는 단백질을 코딩하는 유전자를, 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 제조하기 위해, E. coli 등과 같은 호스트에서 이에 선택된 변형된 유전자를 발현시키고, [Jacobs, N. J. 및 Jacobs. J. M. (1982) Enzyme, 28, 206 - 219 ] 등에 기재된 방법에 따라 프로토프로피리노겐 IX 를 산화시키는 능력을 측정함으로써 선택할 수 있다
본 발명의 방법의 두 번째 측면에서 사용되는 유전자는 하기 특성 (a) 내지 (c) 를 갖는 단백질을 코딩하는 것들이다 :
(a) 프로토포르피린 IX 에 대한 특이적 친화성을 가짐;
(b) 프로토포르피린 IX 를 변형시키는 능력이 실질적으로 없음;
(c) 면역글로불린의 가변 구역의 프레임워크가 실질적으로 없음.
상기 특성 (a) 에서의 프로토포르피린 IX 에 대한 "특이적 친화성" 이라는 용어는 본 발명의 방법의 첫 번째 측면에서와 실질적으로 동일하고, 단백질과 프로토포르피린 IX 이 상호 효소반응으로 결합하거나, 단백질과 프로토포르피린 IX 이 수용체 화학 결합, 예컨대 수용체와 리간드 간의 결합 등에서와 같이 친화성 및 특이성으로 인해 상호 결합하는 것을 의미한다. 단백질은 자연 발생하는 단백질; 자연 발생하는 단백질의 아미노산 치환, 추가, 결실의 변형 등에 의한 상기 단백질의 형질변환체; 및 프로토포르피린 IX 에 대한 친화성에 따라 선택되는 무작위 아미노산 서열을 갖는 인위 합성된 단백질일 수 있으며, 단 그것들은 프로토포르피린 IX 에 특이적으로 결합하는 구조를 갖는다.
특성 (b) 에서 "변형시키는 능력이 실질적으로 없는" 이란 용어는, 단백질의 프로토포르피리노겐 IX 과의 효소 반응성이 실질적으로 불활성이거나 존재하지 않음을 의미한다. 예를 들어, 이는 단백질이 프로토포르피리노겐 IX 을 프로토포르피리노겐 IX 과 상이한 화학적 구조를 갖는 물질로 전환시키는 능력을 가지지 않음을 의미한다.
"면역글로불린의 가변 구역의 프레임워크 구역이 실질적으로 없는" 이라는 용어는, 본 발명의 방법의 첫 번째 측면에서와 동일한 의미를 가지고, 그 단 백질은 상기한 바와 같이 면역글로불린에서의 가변 구역에 대한 입체구조적 특이성을 형성하지 않는다.
상기 특성들 (a) 내지 (c) 를 갖는 단백질의 특정예에는, 프로토포르피린 IX 에 대해 친화성이 있는 활성 또는 불활성형 결합 단백질 [예 : 기질이 프로토포르피린 IX 인 활성 또는 불활성형 마그네슘 킬레타아제, 활성 또는 불활성형 페로킬레타아제, 기질로서 테트라피롤환을 갖는 화합물과 코발트 이온의 킬레이트화 반응을 촉매하는 활성 또는 불활성형 코발트 킬레타아제, 펩티드, 즉 프로토포르피린 IX 에 대해 친화성을 갖는, 예컨대 4 내지 100 개의 아미노산으로 구성된 단백질 (예들 들어, 프로토포르피린 IX 에 대해 친화성을 갖는 펩티드 HASYS, 예컨대 서열번호 53 의 아미노산 서열을 함유하는 단백질 및 서열번호 54 의 아미노산 서열을 갖는 단백질; 프로토포르피린 IX 에 대해 친화성을 갖는 펩티드 RASSL, 예컨대 서열번호 55 의 아미노산 서열을 함유하는 단백질 및 서열번호 56 의 아미노산 서열을 갖는 단백질; 포르피린 화합물에 대한 친화성을 갖는 펩티드 YAGY, 즉 서열번호 57 의 아미노산 서열을 함유하는 단백질 및 서열번호 58 의 아미노산 서열을 갖는 단백질; 포르피린 화합물에 대한 친화성을 갖는 펩티드 YAGF, 예컨대 서열번호 59 의 아미노산 서열을 함유하는 단백질 및 서열번호 60 ; 및 등등의 아미노산 서열을 갖는 단백질 등으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드를 포함하는 단백질)] 등이 포함된다.
상기 단백질을 코딩하는 유전자는 예를 들어 하기와 같이 수득될 수 있다.
활성형 마그네슘 킬레타아제는 3 개의 이종 소단위 단백질, 즉 프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질 (H 소단위 단백질), I 소단위 단백질 및 D 소단위 단백질로 구성되고, 이들 모두는 촉매 활성에 필수적이다. 3 개의 독립적 소단위 단백질들은 상이한 유전자에 의해 코딩된다. 프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질의 유전자는 상기한 바대로 PCR 또는 cDNA 라이브러리의 스크리닝으로써 수득될 수 있다.
마그네슘 킬레타아제의 I 소단위 단백질을 코딩하는 유전자로서, 예를 들어, 광합성 박테리아, 로도박터 스파에로이드 (Rhodobacter sphaeroide) (Genebank accession AF017642), 로도박터 캅술라투스 (Rhodobacter capsulatus) (Genebank accession Z11165), Arabidopsis (Genebank accession D49426), 보리 (Genebank accession U26545), 대두 (Genebank accession D45857), 담배 (Genebank accession AF14053), 시네쵸시스티스 (Synechocystis) P.C.C. 6803 (Genebank accession U35144) 등으로부터 유래된 것들이 공지되어 있다. 그러한 공지된 유전자 (그것의 핵산 서열이 공지됨) 를 단리시키기 위하여, 주형으로서의, 목적하는 유전자를 가진 유기체의 게놈 DNA 또는 cDNA, 및 목적하는 유전자에 의해 코딩된 단백질의 N- 및 C-말단 주변에 상응하는 핵산 서열을 기초로 생성된 프라이머를 이용하여 PCR 을 수행할 수 있다. 또한, 마그네슘 킬레타아제의 I 소단위 단백질을 코딩하는 유전자를 상기 외의 광합성 유기체로부터 수득할 수 있다. 예를 들면, 첫째 목적하는 광합성 유기체로부터 mRNA 를 수득하여, 역전사효소로 주형으로서의 mRNA 를 이용하여 cDNA 를 합성하고, 그 cDNA 를 ZAPII 등과 같은 파아지 벡터 또는 pUC 등과 같은 플라스미드 벡터에 접합함으로써 cDNA 라이브러리를 구성한다. 마그네슘 킬레타아제의 I 소단위 단백질을 코딩하는 유전자의 일부분 이상을 함유하는 DNA 단편을 증폭하기 위해, 주형으로서의 상기-구성된 cDNA 라이브러리 및 상기 기재된 유전자와 같이 공지된 유전자 중 잘 보존된 핵산 서열을 기초로 고안되고 합성된 프라이머를 이용함으로써, PCR 를 수행할 수 있다. 이에 수득된 DNA 단편을 프로브로써 이용하여, cDNA 라이브러리의 스크리닝을 수행하여, 포지티브 클론을 선택할 수 있다. 마그네슘 킬레타아제의 I 소단위 단백질의 목적하는 유전자를 선택된 클론의 핵산 서열의 서열 결정으로 확인할 수 있다.
마그네슘 킬레타아제의 D 소단위 단백질을 코딩하는 유전자로서, 예를 들어, 광합성 박테리아, Rhodobacter sphaeroide (Genebank accession AJ001690), Rhodobacter capsulatus (Genebank accession Z11165), 콩 (Genebank accession AF014399), 담배 (Genebank accession Y10022), 시네쵸시스티스 (Synechocystis) P.C.C. 6803 (Genebank accession X96599) 등으로부터 유래된 것들이 공지되어 있다. 그러한 공지된 유전자 (그것의 핵산 서열이 공지됨) 또는 상기 이외의 유전자를 단리시키기 위하여, 마그네슘 킬레타아제의 I 소단위 단백질을 코딩하는 단백질의 경우에서 기재된 바와 동일한 방법으로 수행한다.
본 발명의 세 번째 측면에서 사용되는 유전자는 하기 특성 (a) 내지 (c) 를 갖는 단백질을 코딩하는 것들이다 :
(a) 프로토포르피리노겐 IX 에 대한 특이적 친화성을 가짐;
(b) 코프로포르피리노겐 III 를 변형시키는 능력을 가짐; 및
(c) 면역글로불린의 가변 구역의 프레임워크가 실질적으로 없음.
상기 특성 (a) 에서의 프로토포르피리노겐 IX 에 대한 "특이적 친화성" 이라는 용어는 본 발명의 방법의 첫 번째 또는 두 번째 측면에서와 실질적으로 동일하고, 단백질과 프로토포르피리노겐 IX 이 상호 효소반응으로 결합하거나, 단백질과 프로토포르피리노겐 IX 이 수용체와 리간드 간의 결합 등의 수용체-화학적 결합에서와 같이 친화성 및 특이성을 기초로 상호 결합하는 것을 의미한다. 단백질은 천연 단백질; 아미노산 치환, 추가, 결실의 변형 등이 천연적으로 발생하는 단백질에 도입된, 상기 단백질의 형질변환체; 및 프로토포르피리노겐 IX 에 대한 친화성에 따라 선택되는 무작위 아미노산 서열을 갖는 인위 합성된 단백질일 수 있으며, 단 그것들은 프로토포르피리노겐 IX 에 특이적으로 결합하는 구조를 갖는다.
특성 (b) 에서 코프로포르피리노겐 III 을 "변형시키는 능력을 갖는" 이란 용어는, 단백질의 코프로포르피리노겐 III 과의 효소 반응성이 실질적으로 활성임을 의미한다. 예를 들어, 이는 단백질이 코프로포르피리노겐 III 을 코프로포르피리노겐 III 과 상이한 화학적 구조를 갖는 물질로 전환시키는 능력을 가짐을 의미한다.
"면역글로불린의 가변 구역의 프레임워크 구역이 실질적으로 없는" 이라는 용어는, 본 발명의 방법의 첫 번째 또는 두 번째 측면에서와 동일한 의미를 가지고, 그 단백질은 상기한 바와 같이 면역글로불린에서의 가변 구역에 대한 입체구조적 특이성을 형성하지 않는다.
상기 특성들 (a) 내지 (c) 를 갖는 단백질의 특정예에는, 프로포르피리노겐 IX 에 대해 친화성이 있는 활성 또는 불활성형 결합 단백질, 예를 들어 기질이 프로포르피리노겐 IX 인 활성형 코르포포르피리노겐 III 옥시다아제 등이 있다.
참고로, 마그네슘 킬레타아제, 페로킬레타아제 또는 코프로포르피리노겐 III 옥시다아제의 활성은 예를 들어, 하기 방법을 이용하여 측정될 수 있다.
(1) 마그네슘 킬레타아제 :
독립적 3 개의 소단위 단백질을 코딩하는 유전자를 사용하여, [Gibson, L.C.D. 등, Proc. Acad. Sci. USA, 92; p. 1941 (1995)] 등에 기재된 방법에 따라, 마그네슘 킬레타아제 활성을 탐지할 수 있다.
(2) 페로킬레타아제;
페로킬레타아제 활성은 예를 들어, [Porra, R. J., Anal. Biochem., 68; p289(1975)] 의 방법 등에 따라 탐지될 수 있다.
(3) 코프로포르피리노겐 III 옥시다아제;
코프로포르피리노겐 III 옥시다아제 활성은 예를 들어, [Yoshinaga, T., Sano, S., 등 (J. Biol. Chem., 255; p4722(1980)] 의 방법 등에 따라 탐지될 수 있다.
본 발명의 방법 (첫 번째 내지 세 번째 방법을 포함) 에 있어서, 특성 (a) 내지 (c) 를 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 식물 세포에 도입하기 위해, 하나의 단백질을 코딩하는 하나의 유전자를 도입할 수 있다. 또한, 상이한 단백질들을 코딩하는 다수 유전자를 식물 세포에 도입할 수 있다. 그러한 식물 세포로의 유전자 도입은 통상적인 유전공학 기술, 예를 들어, Agrobacterium infection (JP-B 2-58917 및 JP-A 60-70070), 원형질체로의 일렉트로포레이션(electoporation) (JP-A 60-251887 및 JP-A 5-68575), 입자건(gun) 방법 (JP-A 5-508316 및 JP-A 63-258525) 등에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 식물 세포에 도입되는 유전자는 식물 세포에 세포 성장 억제제에 대한 내성을 줄 수 있는 유전자와 같은 선택 마커 유전자를 갖는 벡터에 접합시킨다.
식물 세포에서의 유전자 발현을 위해, 유전자를 상동(homologus) 재조합에 의해 식물 세포의 염색체에 도입하여 [Fraley, R.T. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80; p 4803(1983)], 유전자를 발현하는 식물 세포를 선택할 수 있다. 그와 달리, 식물 세포에서 작용할 수 있는 프로모터 및 종결서열에 실시가능히 접합시키는 형태로 식물 세포에 유전자를 도입할 수 있다.
여기에서 사용된 "실시가능히 접합시킨" 이라는 용어는 상기 프로모터 및 종결서열이, 도입된 유전자가 프로모터 및 종결서열의 제어 하에 식물 세포에서 발현되는 상태로 합쳐진 것을 의미한다.
식물 세포에서 작용할 수 있는 컨스티튜티브(constitutive) 프로모터로는, 예를 들어 노팔린 신타아제 유전자 프로모터, 옥토핀 신타아제 유전자 프로모터 등과 같은 T-DNA 로부터 유래된 컨스티튜티브 프로모터, 콜리플라워 모자이크 바이러스 유래의 19S 및 35S 프로머터 등과 같은 식물 바이러스로부터 유래된 프로모터, 페닐알라닌 암모니아-리아제 유전자 프로모터, 찰콘 (chalcone) 신타아제 유전자 프로모터, 발병(pathogenesis)-관련의 단백질 유전자 프로모터 등와 같은 유도성 프로모터 등이 있다. 프로모터는 상기 프로모터들에 한정되지 않고, 다른 식물 프로모터를 사용할 수 있다.
식물 세포에서 작용할 수 있는 종결서열로는, 예를 들어, 노팔린 신타아제 종결서열 등과 같은 T-DNA 로부터 유래된 종결서열, 마늘 바이러스 GV1, GV2 등으로부터 유래된 종결서열과 같은 식물 바이러스로부터 유래된 종결서열 등이 있다. 종결서열은 상기 종결서열들에 한정되지 않고, 다른 식물 종결서열을 사용할 수 있다.
유전자가 도입되는 식물 세포로는, 예를 들어 식물 조직, 식물 전체, 배양 세포, 종자 등이 있다. 유전자가 도입되는 식물 종의 예에는 디코틸레돈, 예컨대 담배, 면, 평지씨, 사탕무우, 마우스-이어 크레스, 카놀라, 아마, 해바라기, 감자, 자주개자리, 상치, 바나나, 대두, 콩, 레굼(콩과), 솔, 포플라, 사과, 포도, 감귤류 과일, 견과류 등; 및 모노코틸레돈, 예컨대 옥수수, 쌀, 밀, 보리, 호밀, 귀리, 수수속 식물, 사탕수수, 잔디 등이 포함된다.
유전자의 위치(locus)에 연결된 선택 마커에 상응하는 선택 배지, 예를 들어, 세포 성장 억제제 등이 함유된 배지에서, 유전자가 옮겨진 세포를 배양하고, 배지에서 성장가능한 클론을 단리시킴으로써, 특성 (a) 내지 (c) 를 갖는 결합 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 변형체 식물 세포를 수득할 수 있다. 그와 달리, 내성을 주는 잡초 제거 물질 함유의 배지에서, 유전자가 도입된 식물 세포를 배양하고, 배지에서 성장가능한 클론을 단리시킴으로써 배양 변형체 식물 세포를 선택할 수 있다. 목적하는 잡초 제거 화합물-내성 식물을 종래의 식물 배양법, 예를 들어 [Plant Gene Manipulation Manual, Method for Producing Transgenic Plants, UCHIMIYA, Kodansha Scientific (1996)] 에 기재된 것에 따라 전체 식물을 재생하여 수득된 변형체 식물로부터 수득할 수 있다. 이에, 식물 조직, 전체 식물, 배양된 세포, 종자 등과 같은 변형체 식물을 수득할 수 있다.
예를 들어, 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 쌀 및 마우스-이어 크레스를, [Experimental Protocal of Model Plants, Rice 및 Mouse-Ear Cress Edition, (Supervisior : koh SHIMAMOTO 및 Kiyotaka OKADA, Shujun-sha 1996) 제 4 장] 에 기재된 방법에 따라, 수득될 수 있다. 또한, JP-A 3-291501 에 기재된 방법에 따라, 유전자를 대두 외래 배아(embryo) 에 입자건으로 도입함으로써 결합 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 대두를 수득할 수 있다. 마찬가지로, Fromm, M. E., 등 Bio/Technology, 8; p 838 (1990) 에 기재된 방법에 따라, 외래 배아에 입자건으로 유전자를 도입함으로써, 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 옥수수를 수득할 수 있다. 유전자를 [TAKUMI 등., Journal of Breeding Society (1995), 44; Extra Vol. 1, p 57] 에 의해 기재된 종래의 방법에 따라 멸균-배양된 밀 미성숙 배반에 입자건으로 유전자를 도입함으로써, 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 밀을 수득할 수 있다. 마찬가지로, [HAGIO 등, Journal of Breeding Society (1995), 44; Extra Vol. 1, p 67] 에 의해 기재된 종래의 방법에 따라, 입자건으로 유전자를 멸균-배양된 보리 미성숙 배반에 도입함으로써, 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 보리를 수득할 수 있따.
상기 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 식물의 잡초 제거 화합물-내성을 확인하기 위해, 내성이 주어진 잡초 제거 화합물을 적용하여 식물을 재생시켜, 식물의 재생도를 평가한다. 더욱 양적으로 확인하기 위해, 예를 들어, PPO 억제-형 제초 활성을 갖는 화합물에 대한 내성의 경우, 식물의 잎 조각을 각종 농도의 PPO 억제-형 제초 활성을 갖는 화합물을 함유하는 수용액에 침액시키거나, 제초 활성을 갖는 화합물을 함유하는 수용액을 식물의 잎 조각에 분무한 후, 실온에서 명 상태에서 한천 배지 상에 방치한다. 며칠 후, Mackenney, G., J. Biol. Chem., 140; p 315 (1941) 에 의해 기재된 방법에 따라 식물 입으로부터 클로로필을 추출하여, 클로로필의 함량을 결정한다.
본 발명의 방법 (첫 번째 내지 세 번째 측면을 포함함) 에 의해 수득된 잡초 제거 화합물-내성 식물 (예 : 식물 조직, 전체 식물, 배양된 세포, 종자 등) 이 잡초 제거 화합물에 대한 내성을 나타내기 때문에, 잡초 제거 물질을 재배지 (예 : 경작지, 증폭지 등) 에 적용할 경우에도, 식물이 성장이 성장할 수 있다. 그러므로, 잡초 제거 화합물을 목적하는 잡초 제거 화합물-내성 식물의 재배지에 적용할 경우, 목적하는 식물이 잡초 제거 식물에 대한 내성 없이 식물로부터 보호될 수 있다. 예를 들어, 잡초 제거 화합물에 대한 내성을 갖 는 식물의 재배지에 잡초 제거 화합물을 적용함으로써, 잡초를 효과적으로 제거할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법 (첫번째 내지 세 번째 측면을 포함함) 에 의해 수득된 잡초 제거 화합물-내성 식물 및 기타 식물 (예 : 잡초 제거 화합물에 대한 내성이 없거나 내성이 약한 식물들) 의 재배지에 잡초 제거 화합물을 적용함으로써, 성장 차이를 기준으로 양 식물 간에 식물 중 하나를 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 수득된 잡초 제거 화합물-내성 식물 세포 및, 기타 식물 세포 (예 : 잡초 제거 화합물에 대해 내성이 없거나 약한 식물) 의 경작지 (배지) 에 잡초 제거 화합물을 적용(첨가) 함으로써, 성장 차이를 기준으로 식물세포 중 하나를 선택할 수 있다.
본 발명으로부터, 식물은 잡초 제거 화합물에 대한 내성을 가질 수 있다.
하기 실시예들은 본 발명을 상세하게 설명하나, 본 발명의 영역을 한정하는 것으로 간주하지 않는다.
실시예
실시예 1
마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질 유전자의 단리
광합성 박테리아 로도박터 스파에로이드 (Rhodobacter sphaeroides) ATCC17023 의 게놈 DNA 를 게놈 DNA 준비용 ISOPLANT 키트 (Nippon Gene 사 제조) 를 이용하여 준비한다. 이어서, [Gibson, L. C. D. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92; p 1941 (1995)] 의 기재 내용에 따라, 주형으로서의 약 1 ㎍ 의 상기 게놈 DNA, 및 프라이머로서의, 서열번호 1 로 표시되는 핵산 서열로 구성된 10 pmol 의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2 로 표시되는 핵산 서열로 구성된 10 pmol 의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR 을 수행하여, 마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질 유전자 bchH 를 함유하는 DNA 단편을 증폭한다. DNA 합성기 (PE Applied Biosystems; Model 394 DNA/RNA 합성기) 로 올리고뉴클레오티드를 제조하여, 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지 (PE Applied Biosystems; OPC cartridge) 로 정제한다. PCR은 94 ℃ 에서 2 분간, 96 ℃ 에서 40 초간, 이어서 68 ℃ 에서 7 분간 수행하고, 이어서, 96 ℃ 에서 40 초간, 이어서 68 ℃ 에서 7 분간 28 회 주기를 반복하고, 최종적으로 96 ℃ 에서 40 초간, 68 ℃ 에서 7 분간, 이어서 72 ℃ 에서 10 분간 유지시켜 수행된다.
실시예 2
에스케리키아 콜라이 (Escherichia Coli, 이하 E. Coli로 줄임)의 마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질 유전자의 발현
[Gibson, L. C. D. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92; p 1941 (1995)] 의 기재 내용에 따라, 실시예 1 에서 제조된 bchH 유전자를 함유하는 DNA 단편을 제한효소 NdeI 및 BglII 로 절단한다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 pET11a (Stratagene 제조) 의 NdeI 제한효소 부위와 BamHI 제한효소 부위사이에 삽입하여, 플라스미드 pETBCH 을 수득한다 (도 1). 이 플라스미드 pETBCH 를 컴피턴트(competent) 세포에 첨부된 매뉴얼에 따라 E. coli BL21 (DE3) 균주의 컴피턴트(competent) 세포(Stragene 사 제조) 에 도입하여 , E. coli BL21 (DE3)/pETBCH 균주를 수득한다. 균주를 튜브 (14 x 10 mm) 에 100 ㎍/ml 의 암피실린을 함유하는 1.5 ml 의 LB 액체 배지 (1% 트립톤, 0.5 % 의 효모 추출물, 0.5 % NaCl) 에 접종하여, 그 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 (이후, 암상태라고 말함), 형광 램프 (약 8000 룩스) 의 빛 아래, 37 ℃ 에서 진탕시킨다. 액체 배지의 600 nm 에서의 흡광도가 약 0.6 이 될 때, 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 를 액체 배지에 첨가하여, 최종 농도가 0.4 mM 이 되고, 부가적으로 약 20 시간동안 배양을 지속시킨다. 그 때, E. coli 가 붉은 색으로 변화하고, E. coli 에서 프로토포르피린 IX 의 축적을 보이는 형광 흡광도 (여기 파장 405 nm, 방출 파장 630 nm) 를 관찰한다. E. coli BL21 (DE3)/pETBCH 균주를 IPTG 를 첨가하지 않는 것을 제외하고 동일한 방법에 따라 배양할 경우, E. coli 가 적색으로 변하지 않으며, 상기 형광 흡광도가 탐지되지 않는다. 이와 대조적으로, E. coli BL21 (DE3)/pETBCH 균주를, 튜브를 알루미늄 호일로 덮지 않는 것 (이후, 명상태라고 함) 을 제외하고, 동일한 방법 (IPTG 첨가) 에 따라 배양할 경우, E. coli 가 성장하고, 상기와 같이 붉게 변한다.
실시예 3
hemG 유전자 결핍 E. coli 에서의 대두 유래의 PPO 유전자의 발현
대두 (글리신 max var. Williams82) 를 씨 뿌리고, 25 ℃ 에서 20 일간 배양하고, 녹색 잎을 수집한다. 수집한 녹색 잎을 액화 질소로 냉동시키고, 냉동된 잎을 막자 및 모르타르로 분쇄한다. 분쇄된 잎으로부터, RNA 추출 시약 ISOGEN (Nippon Gene 사 제조) 를 이용하여, 첨부된 매뉴얼에 따라 RNA 를 추출한다. 수득된 RNA 액체 추출물을 에탄올 침전시켜, 총 RNA 을 수집한 후, 총 RNA 를 폴리 (A) RNA 분획 키트 BIOMAG mRNA 정제 키트 (Perceptive Bio system) 를 그 키트에 첨부된 매뉴얼에 따라 이용하여 분획함으로써, 폴리 (A) RNA 분획을 수집한다. 1 ㎍ 의 상기 폴리 (A) RNA 분획을 주형으로 이용하여, cDNA 를 마라톤 (Marathon) cDNA 증폭 키트 (Clontech 제조) 에 함유된 cDNA 합성 시약으로 그 키트에 첨부된 매뉴얼에 따라 합성한다. 주형으로서의 수득된 cDNA, 및 프라이머로서의 서열번호 3 로 표시되는 핵산 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4 로 표시되는 핵산 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR 을 수행하여, 엽록체형 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 유전자를 함유하는 DNA 단편을 증폭한다. DNA 합성기 (PE Applied Biosystems; Model 394 DNA/RNA 합성기) 로 상기 올리고뉴클레오티드를 제조하여, 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지 (PE Applied Biosystems; OPC cartridge) 로 정제한다. PCR은 94 ℃ 에서 1 분 및 이어서 65 ℃ 에서 5 분간을 수행하고, 94 ℃ 에서 15 초 및 65 ℃ 에서 5 분간의 29 회 주기를 반복한다. PCR 후, 반응 혼합물을 MicroSpin S-400HR (Pharmacia Biotech 제조) 를 이용하여 여과하여, 증폭된 DNA 단편을 정제하고, 그 DNA 단편을 제한 효소 SalI 로 절단된 플라스미드 pCR2.1 (Invitrogen 제조) 에 접합시켜, 플라스미드 pSPPO-P 를 수득한다. 이어서, 플라스미드를 E. coli INVαF' 균주 (Invitorgen 제조) 의 캄피턴트 셀에 도입하고, 암피실린 내성 균주를 선택한다. 이어서, 선택된 암피실린 내성 균주에 함유된 플라스미드를 Dye terminator cycle sequencing 키트 (PE applied Biosystems 제조) 및 DNA 염기서열분석기 373S (PE applied Biosystems 제조) 로 염기서열 분석을 한다. 그 결과, 서열번호 5 의 뉴클레오티드 서열을 밝혀냈고, 플라스미드 pSPPO-P 는 대두의 엽록체형 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 유전자를 함유하는 것을 확인한다.
플라스미드 pSPPO-P 를 제한 효소 PshBI 로 절단하고, 수득된 DNA 단편을 T4 DNA 폴리머라아제로 블런트화하고, SphI 로 더 절단하여, 대두의 엽록체형 PPO 유전자 및 lac 프로모터를 함유하는 DNA 단편을 단리시킨다. 이어서, 플라스미드 pACYC184 (Nippon Gene 제조) 를 제한 효소 NruI 및 SphI 로 절단하여, 410 bp 의 단편을 제거하고, 상기 DNA 단편을 대신 삽입하여, 플라스미드 pACYCSP (도 2) 를 수득한다. 이어서, [Hanahan, D.J., Mol. Biol., 166; p 557 (1983)] 에 기재된 방법에 따라, 플라스미드 pACYCSP 를 PPO 유전자 (hemG 유전자 위치) 결핍 돌연변이 E. coli BT3 균주 (Yamamoto, F. 등, 일본 J. Genet., 63;p 237 (1988) 등에 기재) 에 도입한다. 수득된 E. coli 를 15 ㎍/ml 클로르암페니콜 및 10 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 YPT 배지 (5 g/l 효모 추출물, 5 g/l 트립톤, 5 g/l 펩톤, 10 g/l NaCl, pH 7.0) 에서 배양하여, hemG 유전자 결핍이 대두 유래의 PPO 유전자로 보완되는 클로르암페니콜 및 카나마이신에 대한 내성을 갖는 E. coli BT3/pACYCSP 균주를 선택한다.
실시예 4
잡초 제거 화합물-내성을 주는 능력에 대한 마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질의 시험
실시예 3 에서 제조된 E. coli BT3/pACYCSP 균주를 상기 구조 8로 표시되는 10 또는 1 ppm 의 PPO 억제형 제초 화합물, 10 ㎍/ml 헤민, 50 ㎍/ml 아미노레불린산, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜 및 10 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 YPT 배지에 접종하고, 실시예 2 에서와 같은 방법으로 암 상태 또는 명 상태 하에 배양한다. 대조군으로서, E. coli BT3/pACYCSP 균주를 동일 조건 하에 제초 화합물 없는 상기와 동일한 배지에서 배양한다. 이어서, 배양 시작 18 시간 경과 후, 액체 배지의 흡광도를 600 nm 에서 측정한다. 제초 화합물 없는 배지의 흡광도를 1로서 취하여, 제초 화합물을 함유하는 배지의 흡광도의 상대값을 계산한다. 결과가 표 1 에 나와 있다.
E. coli 균주 배양 조건 상대 흡광도
시험 화합물의 농도
10 ppm 1 ppm 0 ppm
BT3/pACYCSP 명 상태 0.10 0.25 1.0
BT3/pACYCSP 암 상태 0.73 0.95 1.0
서열번호 1 의 핵산 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2 의 핵산 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 이용하여, 실시예 1 과 동일한 방법으로, 광합성 박테리아 Rhodobacter sphaeroide 로부터 유래된 bchH 유전자를 함유하는 DNA 단편을 증폭하여 수득하고, 수득된 DNA 단편을 제한 효소 NcoI 및 BglII 로 절단하고, 절단된 DNA 단편을 플라스미드 pTV118N (Takara Shuzo Co., Ltd. 제조)의 NcoI 제한효소 부위와 BamHI 제한효소 부위사이에 도입함으로써, 플라스미드 pTVBCH (도 3) 을 구축한다.
플라스미드 pTVBCH 및 pTV118 을 각기, [Hanahan, D. J., Mol. Biol., 166; p 557 (1983)] 에 기재된 방법에 따라 실시예 3 에서 제조된 E. coli BT3/pACYCSP 균주에 도입한다. 수득된 E. coli 를 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜 및 10 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 YPT 배지에서 배양하여, 플라스미드 pACYCSP 및 pTVBCH 를 갖는 E. coli BT3/pACYCSP + pTVBCH 균주, 및 플라스미드 pACYCSP 및 pTV118N 을 갖는 E. coli BT3/pACYCSP + pTV118N 균주를 수득한다.
이 균주들을 상기 구조 8 로 표시되는 10 또는 1 ppm 의 PPO 억제형 제초 화합물, 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜, 10 ㎍/ml 카나마이신, 10 ㎍/ml 헤민 및 50 ㎍/ml 아미노레불린산을 함유하는 YPT 배지에 접종하고, 실시예 2 에서와 같은 방법으로 암 상태 또는 명 상태 하에 배양한다. 이어서, 배양 시작 18 시간 경과 후, 액체 배지의 흡광도를 600 nm 에서 측정한다. 제초 화합물 없는 배지의 흡광도를 1로서 취하여, 제초 화합물을 함유하는 배지의 흡광도의 상대값을 계산한다. 결과가 표 2 에 나와 있다.
E. coli 균주 배양 조건 상대 흡광도
시험 화합물의 농도
10 ppm 1 ppm 0 ppm
BT3/pACYCSP+pTVBCH 명 상태 0.80 0.77 1.0
BT3/pACYCSP+pTVBCH 암 상태 0.90 1.06 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N 명 상태 0.18 0.31 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N 암 상태 0.68 0.77 1.0
또한 이 균주들을 상기 구조 1, 14, 15, 18 - 22, 29, 32, 33, 34 및 36으로 표시되는 PPO억제형 제초 화합물을 포함하며 각기 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜, 10 ㎍/ml 카나마이신, 10 ㎍/ml 헤민 및 50 ㎍/ml 아미노레불린산을 함유하는 YPT 배지에 접종하고, 실시예 2 에서와 같은 방법으로 암 상태 또는 명 상태 하에 배양한다. 이어서, 배양 시작 18 시간 경과 후, 액체 배지의 흡광도를 600 nm 에서 측정한다. 제초 화합물 없는 배지의 흡광도를 1로서 취하여, 제초 화합물을 함유하는 배지의 흡광도의 상대값을 계산한다. 결과가 표 3 에 나와 있다.
Figure 112007080679067-PAT00020
실시예 5
마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질을 코딩하는 유전자의 담배로의 도입.
아그로박테리아 (Agrobacterim) 감염법으로, bchH 유전자를 식물에 도입하기 위해, 플라스미드를 구축한다. 첫 째, 바이너리 벡터 pBI121 (Clontech 제조) 를 제한 효소 SacI 로 절단하고, Kpn I 링커 (Takara Shuzo Co., Ltd. 제조) 를 삽입하여, pBI121의 SacI 인식 사이트가 제거되고 KpnI 인식 사이트가 첨가된 플라스미드 pBIK을 구축한다. 한편, 실시예 1 에 기재된 동일 방법에 따라, 주형으로서의, 광합성 박테리아 로도박터 스파에로이드 (Rhodobacter sphaeroides) 의 게놈 DNA, 및 프라이머로서의 서열번호 7 로 표시되는 핵산 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8 로 표시되는 핵산 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR 을 수행하여, bchH 유전자를 함유하는 DNA 단편을 증폭한다. 이어서, 상기 플라스미드 pBIK 를 제한효소 XbaI 및 KpnI 로 절단하여, β-글루쿠로니다아제 유전자를 제거하고, 그 대신, 제한효소 XbaI 및 KpnI 로 bchH 유전자를 함유한 상기 DNA 단편을 절단함으로써 수득된 DNA 단편을 삽입하여, bchH 유전자가 35S 프로모터로부터의 하류에 합쳐된 플라스미드 pBIBCH (도 4) 를 수득한다. 바이너리 벡터 pBI121 (Clontech 제조) 를 또한 제한효소 BamHI 및 SacI 로 절단하여, β-글루쿠로니다아제 유전자를 제거하고, 수득된 DNA 단편을 T4 폴리머라아제로 블런트화한 후, T4 DNA 리가아제로 자기-고리화시켜, 플라스미드 pNO (도 5) 를 구성한다. bchH 발현 플라스미드 pBIBCH 의 벡터 대조군으로서, 상기 플라스미드를 사용한다.
플라스미드 pBIBCH 및 pNO 를 Agrobacterium tumefaciens LBA4404 에 각기 도입한다. pBIBCH 를 함유한 Agrobacterium 균주와 pNO 를 함유하는 Agrobacterium 균주를, 300 ㎍/ml 스트렙토마이신, 100 ㎍/ml 리팜피신 및 25 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 배지에 수득된 형질변환체를 접종하고, 목적하는 형질변환체를 선택함으로써, 단리시킨다.
이어서, [Gene Manipulation of Plant (Hirofumi UCHIMIYA Kodan-sha Scientific, 1992)] 의 매뉴얼에 기재된 방법에 따라, 유전자를 담배에 도입한다. 플라스미드 pBIBCH 를 함유한 Agrobacterium 균주를 28 ℃ 에서 하룻밤 동안 LB 배지 중에 배양한 후, 무균 배양된 담배의 잎 조각을 액체 배지 중에 침액시킨다. 잎 조각을 실온에서 2 일간, 0.8 % 한천, 0.1 mg/l 나프탈렌 아세트산 및 1.0 mg/l 벤질 아미노푸린을 함유하는 Murashige-Skoog 배지 (MS-배지, Murasige T. 및 Skoog F., Physiol. Plant. (1962) 15, p 473) 에서 배양한다. 이어서, 잎 조각을 무균수로 세척하고, 0.8 % 한천, 0.1 mg/l 나프탈렌 아세트산, 1.0 mg/l 벤질 아미노푸린 및 500 ㎍/ml 세포탁심 (cefotaxime) 을 함유하는 MS 배지에서 7 일간 배양한다. 잎 조각을 0.8 % 한천, 0.1 mg/l 나프탈렌 아세트산, 1.0 mg/l 벤질 아미노푸린, 500 ㎍/ml 세포탁심 (cefotaxime) 및 100 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 MS 배지 (이후, 선택적 MS 배지라고 함) 에 이식하고, 담배 잎 조각을 매월 신선한 선택적 MS 배지에 이식하면서, 4 개월간 배지에서 연속 배양한다. 배양 중, 줄기-잎으로 분화된 싹이 담배 잎 조각에서 나타나고, 이러한 싹을 0.8 % 한천, 300 ㎍/ml 세포탁심 및 50 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 MS 배지에 이식하고, 뿌리를 유도하여, 재생 식물을 수득하도록 한다. 수득된 재생 식물을 0.8 % 한천 및 50 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 MS 배지에 이식하여 배양함으로써, bchH 유전자가 도입된 담배 식물을 수득한다. 마찬가지로, 담배 잎 조각을 pNO 를 갖는 Agrobacterium 균주로 감염시켜, 담배 잎 조각으로부터 재생된 식물 및 담배 식물 (이후, 대조군 재조합 담배라고 함) 을 수득한다.
실시예 6
제초 화합물에 대한 내성을 위해 마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질을 코딩하는 도입된 유전자를 갖는 담배 시험
실시예 5 에서 수득한 bchH 유전자가 도입된 담배잎 및 대조군 재조합 담배잎을 수집하고, 각 잎을 주 잎맥에 따라 좌우 동등한 조각으로 나눈다. 한 조각에, 상기 구조 8로 표시되는 0.3 ppm PPO 억제형 제초 화합물을 함유하는 수용액을 적용하는 반면, 다른 조각에는 그 화합물을 적용하지 않는다. 이 조각잎을 0.8 % 한천을 함유하는 MS 배지에 두고, 실온에서 밝은 곳에서 7 일간 방치한다. 이어서, 각 잎 조각을 5 ml 의 80 % 아세톤 수용액 중에 막자 및 모르타르로 분쇄하여, 클로로필을 추출한다. 추출물을 80 % 아세톤 수용액으로 희석하고, 750 nm, 663 nm 및 645 nm 에서 흡광도를 측정하여, [Macknney G., J. Biol. Chem. (1941) 140, p 315] 에 의해 기재된 방법에 따라, 총 클로로필 함량을 계산한다. bchH 유전자가 도입된 담배의 4 클론으로부터 수득한 결과물 (BCH1 내지 4) 및 대조군 재조합 담배가 표 4 에 나와 있다. 표에서, 제초 화합물에 대한 내성 수준을, 미처리된 잎 조각에 대한 제초 화합물로 처리된 잎 조각의 총 클로로필 함량의 % 로 표시하였다.
재조합 담배 총 클로로필 함량 (mg/g-신선 중량) 시험 화합물에 대한 내성 수준 (%)
미처리된 잎 처리된 잎
대조군 2.49 0.19 7.63
BCH-1 1.35 1.70 126
BCH-2 2.06 2.14 104
BCH-3 1.93 1.57 81.3
BCH-4 1.51 1.06 70.2
동일한 방법으로 bchH 유전자가 도입된 담배 클론 및 대조군 재조합 담배는 또한 상기 구조식 3, 7, 10, 11, 13, 17, 23, 24, 25, 27, 28, 30 또는 35 로 나타낸 PPO 억제형 제초 화합물을 함유하는 용액으로 동일한 방법으로 처리하고, 각 제초 화합물에 대한내성 수준을 측정한다. 결과는 하기 표 5 에 나타내었다. 표에서, 제초 화합물에 대한 내성 수준은 제초 화합물로 처리된 잎조각의 총 엽록소 함량 대 비처리 잎조각의 총 엽록소 함량의 백분율로 나타낸다.
시험화합물 구조식 번호 시험농도(ppm) 시험화합물에대한내성수준(%)
bchH 재조합담배 대조군 재조합 담배
구조식 3 10 114 9.94
구조식 7 30 89.3 8.62
구조식 10 10 84.0 14.9
구조식 11 0.30 78.1 5.51
구조식 13 30 95.2 14.8
구조식 17 0.30 80.4 14.3
구조식 23 3.0 106 5.58
구조식 24 10 129 5.18
구조식 25 10 104 16.0
구조식 27 10 86.8 16.8
구조식 28 0.30 72.2 8.79
구조식 30 3.0 102 4.24
구조식 35 0.30 83.3 17.4
실시예 7
담배 마그네슘 켈라타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질의 변형된 단백질을 코딩하는 유전자의 단리
총 RNA 는 RNeasy Plant Kit (QIAGEN 사제) 를 이용하여 첨부된 매뉴얼에 따라 담배의 잎조직 (Nicotiana tabacum cv. SR1) 로부터 준비한다. 엽록체 전이 시그널이 결실된 담배 마그네슘 켈라타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 단백질 (이후 변형된 담배 켈라타아제 소단위로 칭함)을 함유하는 DNA 단편은 RNA LA PCR Kit (AMV) Ver 1.1 (Takara Shuzo 사제) 를 이용하여 첨부된 매뉴얼에 따라 수득한다. 우선, 제 1 가닥 cDNA 는 상기 키트내 함유된 역전사효소로, 주형으로는 담배 총 RNA 및 프라이머로는 상기 키트내 함유된 올리고 dT-Adaptor Primer 를 이용하여 합성한다. 이어서, 주형으로 제 1 가닥 cDNA 및 상기 키트내 함유된 LA Taq 폴리머라아제를 이용하여 PCR 을 실시하여 변형된 담배 켈라타아제 소단위 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 이 PCR 에서는, 서열번호 9 의 염기 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 10 의 염기 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 DNA 합성기 (PE Applied Biosystems: Model 394 DNA/RNA 합성기) 를 사용하여 합성하고, 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지 (PE Applied Biosystems ; OPC 카트리지) 로 정제한다. PCR 은 94℃ 에서 2 분간 유지시킨후, 94℃ 에서 30 초, 50℃ 에서 30 초 및 72℃ 에서 7 분 유지시키는 주기로 30 회 반복하여 실시한다. PCR 후, PCR 로 증폭된 DNA 단편은 TA Cloning Kit (Invitrogen 사제) 를 이용하여 첨부된 매뉴얼에 따라 플라스미드 pCR2.1 로 클로닝시킨다. 생성된 플라스미드는 제한효소 KpnI 으로 절단하고, 아가로오스 겔 전기 영동으로 분석한다. 8.0 kb DNA 단편이 검출되는 플라스미드를 pTCHLH 로 명한다. 플라스미드는 변형된 담배 켈라타아제 소단위를 코딩하는 유전자가 lac 프로모터의 제어하 발현할 수 있는 방향으로 삽입된 구조를 갖는다. 플라스미드 pTCHLH 는 제한효소 KpnI 로 절단한 후, 자가 결찰로 약 60 개의 염기로 구성된 DNA 단편이 플라스미드 pTCHLH 로부터 결실된 플라스미드 pTCHLH1 (도 6) 를 수득한다.
실시예 8
제초 화합물에 대해 내성을 제공하는 능력에 대한 변형된 담배 마그네슘 켈라타아제 소단위 단백질의 시험
실시예 7 에서 제조한 플라스미드 pTCHLH1 및 pCR2.1 를 각각 문헌 [Hanahan, D.J., Mol. Biol., 166; p 557 (1983)] 에 기재되어 있는 방법에 따라 실시예 3 에서 제조된 대장균 BT3/pACYCSP 주에 도입시킨다. 플라스미드 pACYCSP 및 pTCHLH1 을 지닌 대장균 BT3/pACYCSP + pTCHLH1 주 및 플라스미드 pACYCSP 및 pCR2.1 을 지닌 대장균 BT3/pACYCSP + pCR2.1 은 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜 및 50 ㎍/ml 카나마이신을 각각 함유하는 YPT 배지에서 상기 균주를 배양하여 수득한다.
상기 대장균주는 10 또는 1 ppm 의 구조식 8 로 나타낸 PPO 억제형 제초 화합물, 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜, 50 ㎍/ml 카나마이신, 10 ㎍/ml 헤민 및 50 ㎍/ml 아미노레블린산을 함유하는 YPT 배지에 접종한후, 실시예 2 에서와 동일한 방식에 따라 암조건 또는 명조건하에서 배양한다. 이어서, 배양개시 18 시간후, 액체 배양배지의 흡광도를 600 nm 에서 측정한다. 제초 화합물이 없는 배지의 흡광도를 1 로 취하여, 제초 화합물을 함유한 배지의 흡광도의 상대값을 계산한다. 결과는 표 6 에 나타내었다.
대장균주 배양조건 상대흡광도
시험화합물의 농도
10ppm 1ppm 0ppm
BT3/pACYCSP+pTCHLH1 명 0.69 0.89 1.0
BT3/pACYCSP+pTCHLH1 암 0.92 0.93 1.0
BT3/pACYCSP+pCR2.1 명 0.03 0.08 1.0
BT3/pACYCSP+pCR2.1 암 1.0 1.0 1.0
실시예 9
변형된 담배 마그네슘 켈라타아제 소단위 단백질을 코딩하는 유전자의 담배로의 도입
아그로박테리윰 감염 방법으로 변형된 담배 마그네슘 켈라타아제 소단위 단백질을 코딩하는 유전자를 담배에 도입하기 위한 플라스미드를 구축한다. 우선, 변형된 담배 마그네슘 켈라타아제 소단위 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편은 실시예 7 에서 제조한 플라스미드 pTCHLH1 를 제한효소 KpnI 및 SalI 로 절단하여 제조한다. 한편, 2 원의 벡터 pBI121 (Clontech 사제) 는 제한효소 SmaI 로 절단하는 경우 KpnI 링커 (Takara Shuzo 사제) 를 상기 부분에 삽입시켜, pBI121 의 SmaI 인식부위가 제거되고 KpnI 인식 부위가 부가된 플라스미드 pBI121K 를 제조한다. 플라스미드 pBI121K 는 제한효소 SacI 로 절단한 후 DNA 폴리머라아제 I 로 이중가닥 DNA 갭에 염기를 부가하여 DNA 를 평활화시킨다. 이어서, DNA 를 송아지 장에서 유래한 알칼린 포스파타아제로 탈인산화시키고, 인산화 SalI 링커 (4680P, Takara Shuzo사제) 를 삽입하여 고리화시켜 플라스미드 pBI121KS 를 구축한다. 2원의 벡터 pBI121KS 는 제한효소 KpnI 및 SalI 로 절단하여 β-글루쿠로니다아제 유전자를 제거하고, 변형된 담배 마그네슘 켈라타아제 소단위 단백질을 코딩하는 유전자를 상기 부분에 삽입하여 플라스미드 pBITCHLH (도 7)을 제조한다.
플라스미드 pBITCHLH 는 아그로박테리윰 투메파시언스 (Agrobacterium tumefaciens )LBA4404 에 도입한다. 생성된 형질전환체는 300 ㎍/ml 스트렙토마이신, 100 ㎍/ml 리팜피신 및 25 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 배지에서 배양한후, 목적하는 형질전환체를 선별하여 pBITCHLH 를 지닌 아그로박테리윰 균주를 단리시킨다.
멸균 배양된 담배의 잎조각은 아그로박테리윰 균주로 감염시키고, 실시예 5 와 동일한 방법에 따라, 변형된 담배 마그네슘 켈라타아제 소단위 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 담배를 수득한다.
실시예 10
변형된 담배 마그네슘 켈라타아제 소단위 단백질을 코딩하는 도입 유전자를 지닌 담배의 제초 화합물에 대한 내성의 확인
제초 화합물에 대한 내성의 수준은 실시예 6 에서와 동일한 방법에 따라 실시예 9 에서 제조한 변형된 담배 마그네슘 켈라타아제 소단위 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 담배를 시험하여 정량적으로 확인한다.
실시예 11
프로토포르피리노겐 IX를 산화하는 능력이 없고, 프로토포리피리노겐 IX 에 대한 특이적 친화성을 갖는 대두 PPO 의 변형된 단백질을 코딩하는 유전자의 단리
주형으로 실시예 3 에서 제조한 플라스미드 pSPPO-P 를 사용하고, 프라이머로 서열번호 11 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 을 실시하여 엽록체 전이 시그널 및 FAD 결합 서열이 결실된 대두 PPO (이후 변형된 대두 PPO 로 칭함) 를 코딩하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 올리고뉴클레오티드는 DNA 합성기 (PE Applied Biosystems; Model 394 DNA/RNA 합성기) 로 제조하고, 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지 (PE Applied Biosystems; OPC 카트리지) 로 정제한다. PCR 은 94℃ 에서 1 분, 55℃ 에서 2 분 및 72℃ 에서 3 분을 유지하는 주기를 30 회 반복하여 실행한다. 증폭된 DNA 단편은 제한효소 NcoI 및 SalI 로 절단하고, 플라스미드 pTV118N (Takara Shuzo 사제) 의 NcoI 제한효소 부위 및 SalI 제한효소 부위 사이에 도입하여 플라스미드 pTVGMP (도 8) 을 구축한다.
플라스미드 pTVGMP 를 문헌 [Hanahan, D.J., Mol. Biol., 166;p 557 (1983)] 에 기재된 방법에 따라 대장균 PPO 유전자 결핍 돌연변이 BT3 주에 도입한다.
100 ㎍/ml 암피실린 및 10 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 YPT 배지에서 생성된 대장균을 배양하는 경우, 성장이 보완되는 클론은 수득되지 않는다.
실시예 12
변형된 대두 PPO 의 제초 화합물에 대한 내성 제공의 효과 시험
실시예 11 에서 제조한 플라스미드 pTVGMP 및 pTV118N 를 문헌 [Hanahan, D.J., Mol. Biol., 166; p 557 (1983)] 에 기재된 방법에 따라 각각 실시예 3 에서 제조한 대장균 BT3/pACYCSP 주에 도입한다. 플라스미드 pACYCSP 및 pTVGMP 를 지닌 대장균 BT3/pACYCSP+pTVGMP 주, 및 플라스미드 pACYCSP 및 pTV118N 을 지닌 대장균 BT3/pACYCSP + pTV118N 주는 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜 및 10 ㎍/ml 카나마신을 함유하는 YPT 배지에서 상기 균주를 배양하여 수득한다.
상기 대장균 주는, 10 또는 1 ppm 의 구조식 8 로 나타낸 PPO 억제형 제초 화합물, 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜, 10 ㎍/ml 카나마이신, 10 ㎍/ml 헤민 및 50 ㎍/ml 아미노레불린산을 함유하는 YPT 배지에 접종시킨후 실시예 2 에서와 동일한 방법에 따라 암조건 또는 명조건하에서 배양한다. 이어서, 배양개시 18 시간후, 액체 배양 배지의 흡광도를 600nm 에서 측정한다. 제초 화합물이 없는 배지의 흡광도를 1 로 취하여, 제초 화합물을 함유하는 배지의 흡광도의 상대값을 계산한다. 결과는 하기 표 7 에 나타내었다.
대장균주 배양조건 상대흡광도
시험화합물의 농도
10ppm 1ppm 0ppm
BT3/pACYCSP+pTVGMP 명 0.33 0.85 1.0
BT3/pACYCSP+pTVGMP 암 0.91 0.94 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N 명 0.05 0.09 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N 암 0.89 0.91 1.0
실시예 13
변형된 대두 PPO 를 코딩하는 유전자의 담배로의 도입
아그로박테륨 감염법으로 변형된 대두 PPO 를 코딩하는 유전자를 식물에 도입하기 위한 플라스미드를 구축한다. 주형으로 실시예 3 에서 제조한 플라스미드 pSPPO-P, 서열번호 13 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 14 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 PCR 을 실시하여 변형된 대두 PPO 를 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 이어서, 실시예 9 에서 제조한 플라스미드 pBI121K 는 제한효소 KpnI 및 SacI 로 절단하여 β-글루쿠로니다아제 유전자를 제거하고, 변형된 대두 PPO 를 코딩하는 상기 유전자를 함유하는 DNA 단편을 제한효소 KpnI 및 SacI 로 절단하여 수득한 DNA 단편을 상기 부분에 삽입하여, 유전자가 35S 프로모터의 하류에 결합된 플라스미드 pBIGMP (도 9) 를 제조한다.
플라스미드 pBIGMP 를 아그로박테륨 투메파시언스 LBA4404 에 도입한다. 생성된 형질전환체는 300 ㎍/ml 스트렙토마이신, 100 ㎍/ml 리팜피신 및 25 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 배지에서 배양한후, 목적하는 형질전환체를 선별하여 pBIGMP 를 지닌 아그로박테리윰 균주를 단리시킨다.
멸균 배양된 담배 잎조각은 아그로박테륨 균주로 감염시키고, 실시예 5 와 동일한 방법에 따라, 변형된 대두 PPO 를 코딩하는 유전자가 도입된 담배를 수득한다.
실시예 14
변형된 대두 PPO 를 코딩하는 도입된 유전자를 지닌 담배의 제초 화합물에 대한 내성의 확인
구조식 8 로 나타낸 PPO 억제형 제초 화합물에 대한 내성수준은 실시예 13 에서 제조한 변형된 대두 PPO 를 코딩하는 유전자가 실시예 6 과 동일한 방법에 따라 도입된 담배를 시험하여 정량적으로 확인한다. 변형된 대두 PPO 를 코딩하는 유전자가 도입된 담배의 4개 클론 (GMP1-4) 및 대조군 재조합 담배로부터 얻은 결과를 표 8 에 나타내었다. 표에서, 제초 화합물에 대한 내성 수준은 제초 화합물로 처리된 입조각의 총 엽록소 함량 대 비처리 잎 조각의 총 엽록소 함량의 백분율로 나타낸다.
재조합 담배 총엽록소 함량(mg/g-프레쉬(fresh)중량) 시험화합물에 대한 내성 수준(%)
비처리잎 처리잎
대조군 3.49 0.35 10.0
GMP-1 1.89 2.55 135
GMP-2 0.89 0.96 108
GMP-3 1.50 1.49 99.3
GMP-4 2.91 2.34 80.4
실시예 15
클라미도모나스의 PPO 유전자의 단리
클라미도모나스 레인하르티이 (Chlamydomonas reinhardtii) CC407 균주는 클라미도모나스 제네틱 센터 (주소: DCMB Group, Department of Botany, Box 91000, Duke University, Durham, NC 27708-1000, USA) 로부터 수득하고, 7 mM NH4Cl, 0.4 mM MgSO4·7H2O, 0.34 mM CaCl2·2H2O, 25 mM 인산칼륨, 0.5 mM Tris (pH 7.5), 1 ml/l 해트너 마이너 (Hatner miner) 원소 및 1ml/l 빙초산을 함유하는 TAP 액체 배양 배지 (E.H. Harris, The Chlamydomonas Sourcebook, Academic Press, San Diego, 1989, p 576-577) 에서 5 일간 200 μE/m2/s 광합성 활성광 하에서 배양하여 초기 정상 (early stationary) 성장기 세포를 함유하는 200 ml (1.0 x 106 세포/ml) 액체 배양 배지를 수득한다.
총 RNA 를 ISOGEN (Nippon Gene 사제) 를 이용하여 첨부된 매뉴얼에 따라 상기 세포로부터 제조한다. 또한 폴리 (A)RNA 는 BioMag mRNA Purification Kit (Perceptive Bio System 사제) 를 이용하여 첨부된 매뉴얼에 따라 분획화시킨다. cDNA 는 Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech 사제) 를 이용하여 첨부된 매뉴얼에 따라 생성된 폴리(A)RNA 로부터 합성하고, cDNA 는 PCR 용 주형으로 사용한다.
PCR 프라이머로서, 서열번호 15 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 16 의 뉴클레오티드 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 제조한다. 올리고뉴클레오티드는 DNA 합성기 (PE Applied Biosystems; Model 394 DNA/RNA 합성기) 로 제조하고, 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지 (PE Applied Biosystems; OPC 카트리지) 로 정제한다.
Advantage cDNA PCR Kit (Clontech 사제) 를 이용하여 첨부된 매뉴얼에 따라 반응액을 제조한후, 94℃ 에서 1 분, 이어서 65℃ 에서 5 분 유지시킨후, 94℃ 에서 15 초, 65℃ 에서 5 분간 유지시키는 주기를 29 회 반복하여 PCR 을 실시한다. PCR 후, 증폭된 DNA 단편은 반응 액체를 MicroSpin S-400HR (Pharmacia Biotech 사제) 로 여과하여 정제하고, 이 DNA 단편은 TA Cloning Kit (Invitrogen 사제) 를 이용하여 첨부된 매뉴얼에 따라 플라스미드 pCR2.1 에 클론시켜 플라스미드 pCPPO 를 구축한다.
생성된 플라스미드 pCPPO 에 함유된 DNA 단편의 염기서열은 Dye terminator cycle sequencing kit (PE applied Biosystems 사제) 및 DNA sequencer 373S (PE applied Biosystems 사제) 를 이용하여 결정한다. 그 결과, 서열번호 17 의 염기서열이 밝혀졌고, 이에 따라 플라스미드 pCPPO 는 클라미도모나스 레인하르티이의 전장 PPO cDNA 를 함유함이 확인되었다.
실시예 16
프로토포피리노겐 IX를 산화시키는 능력이 없고, 프로토포리피리노겐 IX 에 대한 특이적 친화성을 갖는 클라미도모나스 레인하르티이 PPO 의 변형된 단백질을 코딩하는 유전자의 단리
주형으로 실시예 15 에서 제조한 플라스미드 pCPPO 를 사용하고, 프라이머로 서열번호 19 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 20 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 엽록체 전이 시그널 및 FAD 결합 서열이 결실된 클라미도모나스 레인하르티이 PPO (이후 변형된 클라미도모나스 레인하르티이 PPO 로 칭함) 를 코딩하는 DNA 단편을 증폭시키는 PCR 을 실시한다. 올리고뉴클레오티드는 DNA 합성기 (PE Applied Biosystems; Model 394 DNA/RNA 합성기) 로 제조하고, 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지 (PE Applied Biosystems; OPC 카트리지) 로 정제한다. PCR 은 94℃ 에서 1 분, 55℃ 에서 2 분 및 72℃ 에서 3 분을 유지시키는 주기를 30 회 반복하여 실행한다. 증폭된 DNA 단편은 제한효소 BamHI 및 SacI 로 절단하고, 플라스미드 pTV119N (Takara Shuzo 사제) 의 BamHI 제한효소 부위 및 SacI 제한효소 부위 사이에 도입하여 플라스미드 pTVCRP (도 10) 을 구축한다.
플라스미드 pTVCRP 를 문헌 [Hanahan, D.J., Mol. Biol., 166;p 557 (1983)] 에 기재된 방법에 따라 대장균 PPO 유전자 결핍 돌연변이 BT3 주에 도입한다.
생성된 대장균을 100 ㎍/ml 암피실린 및 10 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 YPT 배지에서 배양하는 경우, 성장이 보완되는 클론은 수득되지 않는다.
실시예 17
변형된 수정(modified) 클라미도모나스 레인하르티이 PPO의 제초 화합물에 대한 내성 제공 능력 시험
실시예 16 에서 제조한 플라스미드 pTVCRP 및 pTV118N 를 문헌 [Hanahan, D.J., Mol. Biol., 166; p 557 (1983)] 에 기재된 방법에 따라 각각 실시예 3 에서 제조한 대장균 BT3/pACYCSP 주에 도입한다. 플라스미드 pACYCSP 및 pTVCRP 를 지닌 대장균 BT3/pACYCSP+pTVCRP 주, 및 플라스미드 pACYCSP 및 pTV118N 을 지닌 대장균 BT3/pACYCSP + pTV118N 주는 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜 및 10 ㎍/ml 카나마신을 함유하는 YPT 배지에서 상기 균주를 배양하여 수득한다.
상기 대장균 주는 10 또는 1 ppm 의 구조식 8 로 나타낸 PPO 억제형 제초 화합물, 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜, 10 ㎍/ml 카나마이신, 10 ㎍/ml 헤민 및 50 ㎍/ml 아미노레불린산을 함유하는 YPT 배지에 접종시킨후, 실시예 2 와 동일한 방법에 따라 암조건 또는 명조건 하에서 배양한다. 이어서, 배양개시 18 시간후, 액체 배양 배지의 흡광도는 600nm 에서 측정한다. 제초 화합물이 없는 배지의 흡광도를 1 로 취하여, 제초 화합물을 함유하는 배지의 흡광도의 상대값을 계산한다. 결과는 하기 표 9 에 나타내었다.
대장균주 배양조건 상대흡광도
시험화합물의 농도
10ppm 1ppm 0ppm
BT3/pACYCSP+pTVCRP 명 0.23 0.42 1.0
BT3/pACYCSP+pTVCRP 암 0.81 0.82 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N 명 0.12 0.24 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N 암 0.80 0.91 1.0
실시예 18
변형된 클라미도모나스 레인하르티이 PPO 를 코딩하는 유전자의 담배로의 도입
아그로박테륨 감염법으로 변형된 클라미도모나스 레인하르티이 PPO 를 코딩하는 유전자를 식물에 도입하기 위한 플라스미드를 구축한다. 변형된 클라미도모나스 레인하르티이 PPO 를 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편은 제한효소 BamHI 및 SacI 로 실시예 16 에서 제조한 플라스미드 pTVCRP 를 절단하여 제조한다. 2원의 벡터 pBI121 (Clontech 사제) 는 제한효소 BamHI 및 SacI 로 절단하여 β-글루쿠로니다아제 유전자를 제거하고, 변형된 클라미도모나스 레인하르티이 PPO 를 코딩하는 상기 유전자는 상기 부분에 삽입하여 플라스미드 pBICRP (도 11) 를 제조한다.
플라스미드 pBICRP 를 아그로박테륨 투메파시언스 LBA4404 에 도입한다. 생성된 형질전환체는 300 ㎍/ml 스트렙토마이신, 100 ㎍/ml 리팜피신 및 25 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 배지에서 배양한후, 목적하는 형질전환체를 선별하여 pBICRP 를 지닌 아그로박테리윰 균주를 단리시킨다.
멸균 배양된 담배 잎조각은 아그로박테륨 균주로 감염시키고, 실시예 5 와 동일한 방법에 따라, 클라미도모나스 레인하르티이 PPO 를 코딩하는 유전가 도입된 담배를 수득한다.
실시예 19
변형된 클라미도모나스 레인하르티이 PPO 를 코딩하는 도입된 유전자를 지닌 담배의 제초 화합물에 대한 내성의 확인
구조식 8 로 나타낸 PPO 억제형 제초 화합물에 대한 내성 수준은 실시예 18 에서 제조한 변형된 클라미도모나스 레인하르티이 PPO 를 코딩하는 유전자가 실시예 6 과 동일한 방법에 따라 도입된 담배를 시험하여 정량적으로 확인한다. 변형된 클라미도모나스 레인하르티이 PPO 를 코딩하는 유전자가 도입된 담배의 4 클론 (CRP 1-4) 및 대조군 재조합 담배로부터 얻은 결과를 표 10 에 나타내었다. 표에서, 제초 화합물에 대한 내성 수준은 제초 화합물로 처리된 입조각의 총 엽록소 함량 대 비처리 잎 조각의 총 엽록소 함량의 백분율로 나타낸다.
재조합 담배 총엽록소 함량(mg/g-프레쉬(fresh)중량 시험화합물에 대한 내성 수준(%)
비처리잎 처리잎
대조군 2.28 0.42 18.4
CRP-1 1.27 1.54 121
CRP-2 1.50 1.67 111
CRP-3 1.10 1.11 101
CRP-4 1.58 1.57 99.4
실시예 20
특히 제초 화합물에 내성을 제공하는 능력에 대한 프로토포피딘 IX 에 대해 친화성을 갖는 보리 페로켈라타아제의 변형된 단백질의 시험
문헌 [Miyamoto,K. et al., Plant Physiol. 105; p 769 (1994)] 에 기재된 방법으로 보리 페로켈라타아제 유전자를 지닌 플라스미드를 제조한다. 생성된 플라스미드는 제한효소 NspI 및 EcoRI 로 절단하여 시그널 서열이 결실된 보리 페로켈라타아제 (이후 변형된 보리 페로켈라타아제로 칭함) 를 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 수득한다. 이러한 DNA 단편은 플라스미드 pTV119N(Takara Shuzo 사제)의 SphI 제한효소 부위 및 EcoRI 제한효소 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pTVHVF1 (도 12) 를 구축한다.
플라스미드 pTVHVF1 및 pTV118N 은 문헌 [Hanahan, D.J., Mol. Biol., 166; p 557 (1983)] 에 기재된 방법에 따라 각각 실시예 3 에서 제조한 대장균 BT3/pACYCSP 주에 도입한다. 플라스미드 pACYCSP 및 pTVHVF1 을 지닌 대장균 BT3/pACYCSP+pTVHVF1 주, 및 플라스미드 pACYCSP 및 pTV118N 을 지닌 대장균 BT3/pACYCSP + pTV118N 주는 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜 및 10 ㎍/ml 카나마신을 함유하는 YPT 배지에서 상기 균주를 배양하여 수득한다.
상기 대장균 주는 10 또는 1 ppm 의 구조식 8 로 나타낸 PPO 억제형 제초 화합물, 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜, 10 ㎍/ml 카나마이신, 10 ㎍/ml 헤민 및 50 ㎍/ml 아미노레불린산을 함유하는 YPT 배지에 접종시킨후, 실시예 2 와 동일한 방법에 따라 암조건 또는 명조건 하에서 배양한다. 이어서, 배양개시 18 시간후, 액체 배양 배지의 흡광도는 600nm 에서 측정한다. 제초 화합물이 없는 배지의 흡광도를 1 로 취하여, 제초 화합물을 함유하는 배지의 흡광도의 상대값을 계산한다. 결과는 하기 표 11 에 나타내었다.
대장균주 배양조건 상대흡광도
시험화합물의 농도
10ppm 1ppm 0ppm
BT3/pACYCSP+pTVHVF1 명 0.39 0.94 1.0
BT3/pACYCSP+pTVHVF1 암 0.94 0.96 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N 명 0.12 0.24 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N 암 0.80 0.91 1.0
실시예 21
변형된 보리 페로켈라타아제를 코딩하는 유전자의 담배로의 도입
아그로박테리윰 감염 방법으로 보리 페로켈라타아제를 코딩하는 유전자를 담배에 도입하기 위한 플라스미드를 구축한다. 실시예 20 에 기재된 플라스미드 pTVHVF1 을 제한효소 NcoI 로 절단한 후 이중가닥 DNA 갭에 염기를 부가하는 DNA 폴리머라아제 I 로 DNA 를 평활화시킨다. 이어서, DNA 를 송아지 장에서 유래한 알칼린 포스파타아제로 탈인산화시키고, 인산화된 BamHI 링커 (4610P, Takara Shuzo 사제)를 삽입하여 고리화시켜 플라스미드 pTVHVF2 를 구축한다. 이어서 pTVHVF2 는 제한효소 EcoRI 로 절단한 후 염기를 이중가닥 DNA 갭에 부가하여 DNA 폴리머라아제 I 로 DNA 를 평활화시킨다. 추가로, DNA 를 송아지 장에서 유래한 알칼린 포스파타아제로 탈인산화시키고, 인산화된 SalI 링커 (4680P, Takara Shuzo 사제) 를 삽입하여 고리화시켜 플라스미드 pTVHVF3 을 구축한다. 실시예 9 에서 제조한 플라스미드 pBI121KS 를 제한효소 BamHI 및 SalI 로 절단하여 β-글루쿠로니다아제 유전자를 제거한다. 변형된 보리 페로켈라타아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편은 상기 pTVHVF3 를 제한효소 BamHI 및 SalI 로 절단하여 제조한다. 생성된 DNA 단편은 β-글루쿠로니다아제 유전자를 대체하여 플라스미드 pBI121KS 에 삽입하여 변형된 보리 유전자가 35S 프로모터의 하류에 결합된 플라스미드 pBIHVF (도 13)을 제조한다.
플라스미드 pBIHVF 는 아그로박테리윰 투메파시언스 LBA4404 에 도입한다. 생성된 형질전환체는 300 ㎍/ml 스트렙토마이신, 100 ㎍/ml 리팜피신 및 25 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 배지에서 배양한후, 목적하는 형질전환체를 선별하여 pBIHVF 를 지닌 아그로박테리윰 균주를 단리시킨다.
멸균 배양된 담배의 잎조각은 아그로박테리윰 균주로 감염시키고, 실시예 5 와 동일한 방법에 따라, 변형된 보리 페로켈라타아제를 코딩하는 유전자가 도입된 담배를 수득한다.
실시예 22
변형된 보리 페로켈라타아제를 코딩하는 도입된 유전자를 지닌 담배의 제초 화합물에 대한 내성 확인
구조식 8 로 나타낸 PPO 억제형 제초 화합물에 대한 내성 수준은 실시예 21 에서 제조한 변형된 보리 페로켈라타아제를 코딩하는 유전자가 실시예 6 과 동일한 방법에 따라 도입된 담배를 시험하여 정량적으로 확인한다. 변형된 보리 페로켈라타아제를 코딩하는 유전자가 도입된 담배의 4 클론 (HVF 1-4) 및 대조군 재조합 담배로부터 얻은 결과를 표 12 에 나타내었다. 표에서, 제초 화합물에 대한 내성 수준은 제초 화합물로 처리된 입조각의 총 엽록소 함량 대 비처리 잎 조각의 총 엽록소 함량의 백분율로 나타낸다.
재조합 담배 총엽록소 함량(mg/g-프레쉬(fresh)중량) 시험화합물에 대한 내성 수준(%)
비처리잎 처리잎
대조군 1.93 0.160 8.29
HVF-1 0.876 0.930 106
HVF-2 1.14 1.16 102
HVF-3 1.06 1.04 98.1
HVF-4 1.48 1.42 95.9
실시예 23
제초 화합물에 대한 내성을 제공하는 능력에 대한 프로토포르피린 IX 에 대해 특이적 친화성을 갖는 오이 페로켈라타아제의 변형된 단백질의 시험
문헌 [Miyamoto,K. et al., Plant Physiol. 105; p 769 (1994)] 에 기재된 방법으로 단리한 오이 페로켈라타아제 cDNA 클론을 주형으로 이용하고, 서열번호 21 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 22 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR 을 실시하여 시그널 서열이 결실된 오이 페로켈라타아제 (이후 변형된 오이 켈라타아제로 칭함) 를 코딩하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 올리고뉴클레오티드는 DNA 합성기 (PE Applied Biosystems; Model 394 DNA/RNA 합성기) 로 제조하고, 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지 (PE Applied Biosystems; OPC 카트리지) 로 정제한다. PCR 은 94℃ 에서 1 분, 55℃ 에서 2 분 및 72℃ 에서 3 분을 유지하는 주기를 30 회 반복하여 실행한다. 증폭된 DNA 단편은 제한효소 BamHI 및 SacI 로 절단하고, 플라스미드 pTV119N (Takara Shuzo 사제) 의 BamHI 제한효소 부위 및 SacI 제한효소 부위 사이에 도입하여 플라스미드 pTVCSF (도 14) 를 구축한다.
플라스미드 pTVCSF 및 pTV118N 을 문헌 [Hanahan, D.J., Mol. Biol., 166;p 557 (1983)] 에 기재된 방법에 따라 각각 실시예 3 에서 제조한 대장균 BT3/pACYCSP 주에 도입한다. 플라스미드 pACYCSP 및 pTVCSF 를 지닌 대장균 BT3/pACYCSP+pTVCSF 주, 및 플라스미드 pACYCSP 및 pTV118N 을 지닌 대장균 BT3/pACYCSP + pTV118N 주는 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜 및 10 ㎍/ml 카나마신을 함유하는 YPT 배지에서 상기 균주를 배양하여 수득한다.
상기 대장균 주는 10 또는 1 ppm 의 구조식 8 로 나타낸 PPO 억제형 제초 화합물, 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜, 10 ㎍/ml 카나마이신, 10 ㎍/ml 헤민 및 50 ㎍/ml 아미노레불린산을 함유하는 YPT 배지에 접종시킨후 실시예 2 와 동일한 방법에 따라 암조건 또는 명조건 하에서 배양한다. 이어서, 배양개시 18 시간후, 액체 배양 배지의 흡광도는 600nm 에서 측정한다. 제초 화합물이 없는 배지의 흡광도를 1 로 취하여, 제초 화합물을 함유하는 배지의 흡광도의 상대값을 계산한다. 결과는 하기 표 13 에 나타내었다.
대장균주 배양조건 상대흡광도
시험화합물의 농도
10ppm 1ppm 0ppm
BT3/pACYCSP+pTVCSF 명 0.73 0.78 1.0
BT3/pACYCSP+pTVCSF 암 0.89 0.92 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N 명 0.06 0.08 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N 암 0.81 0.91 1.0
실시예 24
변형된 수정 오이 페로켈라타아제를 코딩하는 유전자의 담배로의 도입
아그로박테륨 감염법으로 수정된 오이 페로켈라타아제를 코딩하는 유전자를 담배에 도입하기 위한 플라스미드를 구축한다. 플라스미드 pBI121 (Clontech사제) 는 제한효소 BamHI 및 SacI 로 절단하여 β-글루쿠로니다아제 유전자를 제거한다. 변형된 오이 페로켈라타아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편은 실시예 23 에 기재된 플라스미드 pTVCSF 를 제한효소 BamHI 및 SacI 로 절단하여 제조한다. 생성된 DNA 단편은 β-글루쿠로니다아제 유전자를 대체하여 플라스미드 pBI121 에 도입하여 변형된 오이 페로켈라타아제 유전자가 35S 프로모터의 하류에 결합되어 있는 플라스미드 pBICSF (도 15) 를 제조한다.
플라스미드 pBICSF 를 아그로박테륨 투메파시언스 LBA4404 에 도입한다. 생성된 형질전환체는 300 ㎍/ml 스트렙토마이신, 100 ㎍/ml 리팜피신 및 25 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 배지에서 배양한후, 목적하는 형질전환체를 선별하여 pBICSF 를 지닌 아그로박테리윰 균주를 단리시킨다.
멸균 배양된 담배 잎조각은 상기 아그로박테륨 균주로 감염시키고, 실시예 5 와 동일한 방법에 따라, 수정된 오이 페로켈라타아제를 코딩하는 유전자가 도입된 담배를 수득한다.
실시예 25
변형된 오이 페로켈라타아제를 코딩하는 도입된 유전자를 지닌 담배의 제초 화합물에 대한 내성의 확인
PPO 억제형 제초 화합물에 대한 내성의 수준은 실시예 6 에서와 동일한 방법에 따라 실시예 24 에서 제조한 수정된 오이 페로켈라타아제를 코딩하는 유전자가 도입된 담배를 시험하여 정량적으로 확인한다.
실시예 26
대장균 코프로포피리노겐 III 옥시다아제(hemF) 유전자의 단리
대장균 LE392 주로부터 게놈 DNA를 게놈 DNA 제조물용 Kit ISOPLANT (Nippon Gene 사제) 를 이용하여 준비한다. 서열번호 23 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 24 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 GenBank (수탁번호 X75413) 에 등록되어 있는 대장균 hemF 유전자의 5' 및 3' 영역의 염기서열에 따라 합성한다. 올리고뉴클레오티드는 DNA 합성기 (PE Applied Biosystems; Model 394 DNA/RNA 합성기) 로 제조하고, 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지 (PE Applied Biosystems; OPC 카트리지) 로 정제한다. 주형으로 약 1 ㎍ 의 대장균 LE392 주 게놈 DNA 및 프라이머로 상기 올리고뉴클레오티드 (각 10pmol) 을 이용하여 PCR 을 실시하여 대장균 hemF 유전자를 함유하는 DNA 단편을 증폭한다. 96℃ 에서 1 분, 55℃ 에서 2 분, 이어서 72℃ 에서 3 분간 유지하는 주기를 30 회 반복하는 PCR 을 실시한다.
실시예 27
제초 화합물에 대한 내성을 제공하는 능력에 대한 대장균 hemF 단백질의 시험
실시예 26 에 기재된 방법으로 증폭된 hemF 유전자를 함유하는 DNA 단편은 제한 효소 FbaI 및 PstI 로 절단하고, 시판 플라스미드 pUC118N (Takara Shuzo 사제) 의 BamHI 제한효소 부위와 PstI 제한효소 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pHEMF (도 16) 을 구축한다.
플라스미드 pHEMF 및 pTV118N 는 문헌 [Hanahan, D.J., Mol.Biol., 166; p 557 (1983)] 에 기재된 방법에 따라 각각 실시예 3 에서 제조한 대장균 BT3/pACYCSP 주에 도입한다. 플라스미드 pACYCSP 및 pHEMF 를 지닌 대장균 BT3/pACYCSP + pHEMF 주, 및 플라스미드 pACYCSP 및 pTV118N 을 지닌 대장균 BT3/pACYCSP + pTV118N 주는 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜 및 10 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 YPT 배지에서 상기 균주를 배양하여 수득한다.
상기 대장균 주는 10 또는 1 ppm 의 구조식 8 로 나타낸 PPO 억제형 제초 화합물, 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜, 10 ㎍/ml 카나마이신, 10 ㎍/ml 헤민 및 50 ㎍/ml 아미노레불린산을 함유하는 YPT 배지에 접종시킨후 실시예 2 에서와 동일한 방법에 따라 암조건 또는 명조건 하에서 배양한다. 이어서, 배양개시 18 시간후, 액체 배양 배지의 흡광도는 600nm 에서 측정한다. 제초 화합물이 없는 배지의 흡광도를 1 로 취하여, 제초 화합물을 함유하는 배지의 흡광도의 상대값을 계산한다. 결과는 하기 표 14 에 나타내었다.
대장균주 배양조건 상대흡광도
시험화합물의 농도
10ppm 1ppm 0ppm
BT3/pACYCSP+pHEMF 명 0.48 1.0 1.0
BT3/pACYCSP+pHEMF 암 0.94 0.95 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N 명 0.06 0.16 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N 암 0.96 0.98 1.0
실시예 28
대장균 hemF 유전자의 담배로의 도입
아그로박테륨 감염법으로 대장균 hemF 유전자를 식물에 도입하기 위한 플라스미드를 구축한다. 첫째로, 대장균 hemF 유전자를 수득하기 위하여, 서열번호 25 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 26 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 DNA 합성기 (PE Applied Biosystems; Model 394 DNA/RNA 합성기) 로 제조하고, 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지 (PE Applied Biosystems; OPC 카트리지) 로 정제한다. 실시예 26 에서와 동일한 방법에 따라 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 PCR 을 실시하여 대장균 hemF 유전자를 함유하는 DNA 단편을 증폭시킨다.
플라스미드 pBI121 (Clontech 사제) 는 제한효소 BamHI 및 SacI 로 절단하여 β-글루쿠로니다아제 유전자를 제거한다. 대장균 hemF 유전자를 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편은 상기 PCR-증폭된 DNA 단편을 제한효소 BamHI 및 SacI 로 절단하여 제조한다. 생성된 DNA 단편은 β-글루쿠로니다아제 유전자를 대체하여 플라스미드 pBI121 에 도입하여 대장균 hemF 유전자가 35S 프로모터의 하류에 결합되어 있는 플라스미드 pBIHEMF (도 17) 을 제조한다.
플라스미드 pBIHEMF 를 아그로박테륨 투메파시언스 LBA4404 에 도입한다. 생성된 형질전환체는 300 ㎍/ml 스트렙토마이신, 100 ㎍/ml 리팜피신 및 25 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 배지에서 배양한후, 목적하는 형질전환체를 선별하여 pBIHEMF 를 지닌 아그로박테리윰 균주를 단리시킨다.
멸균 배양된 담배 잎조각은 아그로박테륨 균주로 감염시키고, 실시예 5 와 동일한 방법에 따라, 대장균 hemF 유전자가 도입된 담배를 수득한다.
실시예 29
대장균 hemF 유전자가 도입된 담배의 제초 화합물에 대한 내성의 확인
PPO 억제형 제초 화합물에 대한 내성 수준은 실시예 6 에서와 동일한 방법에 따라 대장균 hemF 유전자 (실시예 2 에서 제조된) 가 도입된 담배를 시험하여 정량적으로 확인한다.
실시예 30
프로토포르피린 IX 에 대한 포르피린 화합물-결합 단백질의 결합 시험
포르피린 화합물 5, 10, 15, 20-테트라키스 (N-메틸피리디니늄-4-일)-21H, 23H-포르핀(H2TMpyP) 에 특이적으로 결합 할 수 있는 아미노산 서열 HASYS 또는 RASSL (식중, H 는 히스티딘, A 는 알라닌, S 는 세린, Y 는 티로신, R 은 아르기닌 및 L 은 류신이다) 을 함유하는 단백질을 발현하는 파아지 클론 및 5 개의 무작위 아미노산으로 구성된 아미노산 서열을 함유하는 단백질을 발현하는 파아지 라이브러리를 문헌 [KITANO 등, Nihon Kagakukai (Chemical Society of Japan) 74th Spring Annual Meeting Pre-Published Abstracts of Presentation II, p 1353, 4G511 (1988)] 에 기재된 방법에 따라 제조한다.
우선, 5 개의 무작위 아미노산으로 구성된 아미노산 서열을 함유하는 단백질을 발현하는 파아지 라이브러리를 구축한다. 서열번호 27 의 염기서열로 구성된 혼합된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 28 의 염기서열로 구성된 혼합된 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 혼합된 올리고뉴클레오티드는 DNA 합성기 (PE Applied Biosystems; Model 394 DNA/RNA 합성기) 로 합성하고, 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지 (PE Applied Biosystems;OPC 카트리지) 로 정제한다. 상기 혼합된 올리고뉴클레오티드 (각 50 pmol) 를 각각 T4 DNA 키나아제로 처리하여 5' 말단을 인산화시킨다. 이것을 혼합하고, 70℃ 에서 10 분간 가열한후, 0.5℃/분의 속도로 실온으로 서서히 냉각시켜 어닐링시킨다. 플라스미드 pCANTAB5E (Pharmacia Biotech 사제) 는 제한효소 SfiI 및 NotI 로 절단하여 재조합 항체 유전자 ScFv 를 제거한다. 상기 인산화 및 어닐링된 올리고뉴클레오티드 쌍은 상기 재조합 항체 유전자 ScFv 의 부분에 삽입하여 M13 파아지 코트 단백질의 아미노산 서열을 함유하는 단백질의 상류에서 5 개의 무작위 아미노산 서열로 구성된 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 플라스미드를 제조한다. 플라스미드는 문헌 [Hanahan, D.J., Mol. Biol. 166; p 557 (1983)] 에 따라 대장균 TG-1 주 에 도입하고 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 2 x YT 배지 (10 g/l 이스트 추출물, 15 g/l 트립톤 및 5 g/l NaCl,pH 7.2) 에서 배양하여 재조합 대장균 TG-1 주를 수득한다. 재조합 대장균 TG-1 주는 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 2 x YT 배지에 접종하고 37℃ 에서 진탕하여 배양한다. 이어서, 배양개시 1 시간후, 6 x 1010 pfu 헬퍼-파아지 M13K07 (Pharmacia Biotech 사제) 를 배지에 접종하고, 배양은 진탕하면서 추가로 18 시간동안 지속시킨다. 이어서, 액체 배양 배지는 1,000 x g 에서 20 분간 원심분리하여 5 개의 무작위 아미노산으로 구성된 아미노산 서열을 함유하는 단백질을 발현하는 파아지 라이브러리를 수거한다.
아미노산 서열 HASYS (서열번호 53) 을 함유하는 단백질을 발현하는 파아지 클론을 제조하기 위하여, 서열 번호 29 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 30 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 아미노산 서열 RASSL (서열번호 55) 을 함유하는 단백질을 발현하는 파아지 클론을 제조하기 위하여, 서열 번호 31 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 32 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 DNA 합성기 (PE Applied Biosystems; Model 394 DNA/RNA 합성기) 로 제조하고, 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지 (PE Applied Biosystems; OPC 카트리지) 로 정제한다. 아미노산 서열 HASYS 및 RASSL 를 함유하는 단백질을 발현하는 파아지 클론은 5 개의 무작위 아미노산으로 구성된 아미노산 서열를 함유하는 단백질를 발현하는 파아지 라이브러리를 수득하기 위한 상기 작업과 동일한 작업으로 수득한다.
아미노산 서열 HASYS 을 함유하는 단백질을 발현하는 파아지 클론을 함유하는 파아지 현탁액, 아미노산 서열 RASSL 을 함유하는 단백질을 발현하는 파아지 클론 또는 5 개의 무작위 아미노산 (적정 105 pfu) 으로 구성된 아미노산 서열을 함유하는 단백질을 발현하는 파아지 라이브러리는 각각 니트로 셀룰로오스 필터 (Schleicher & Schuell 사제) 에 스폿시킨후, 1% 소혈청 알부민을 함유하는 PBT 버퍼 (137mM NaCl, 8.10 mM Na2HPO4, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4, 0.05% Tween 20, pH 7.2) 에서 진탕시켜 니트로 셀룰로오스 필터를 블록시킨다. 이 니트로 셀룰로오스 필터는 PBT 버퍼로 세척하고, 10μM 프로토포르피린 IX 를 함유하는 2 x SSC 버퍼 (0.3 M NaCl, 0.03 M 시트르산 나트륨) 에서 18 시간동안 진탕한다. 추가로, 상기 니트로 셀룰로오스 필터는 2 x SSC 버퍼로 세척하고, 건조시키고, 프로토포르피린 IX 에서 유래한 형광을 자외선 (365nm) 하에서 검출한다.
파아지 라이브러리의 점(spot)은 형광을 보이지 않는 반면, 아미노산 서열 HASYS 을 함유하는 단백질 및 아미노산 서열 RASSL 을 함유하는 단백질을 발현하는 양 파아지 클론의 점은 뚜렷한 형광을 보인다.
실시예 31
제초 화합물에 대한 내성을 제공하는 능력에 대한 프로토포르피린 IX 결합 단백질의 시험
우선, 아미노산 서열 HASYS (서열 번호 53) 및 아미노산 서열 RASSL (서열번호 55) 를 함유하는 단백질을 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 플라스미드를 제조한다. 서열번호 54 의 아미노산 서열로 구성된 단백질 (이후 단백질 MGHASYS) 를 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 플라스미드를 제조하기 위하여, 서열번호 33 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 34 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 올리고뉴클레오티드는 DNA 합성기 (PE Applied Biosystems; Model 394 DNA/RNA 합성기) 로 제조하고, 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지 (PE Applied Biosystems; OPC 카트리지) 로 정제한다. 상기 올리고뉴클레오티드 (각 50 pmol) 는 각각 T4 DNA 키나아제로 처리하여 5' 말단에서 인산화시킨다. 이것은 혼합한후, 70℃ 에서 10 분간 가열한후, 0.5℃/분의 속도로 서서히 실온으로 냉각시켜 어닐링시킨다. 플라스미드 pTV118N 은 제한효소 NcoI 및 EcoRI 로 절단하여 16 염기쌍으로 구성된 유전자 단편을 제거한다. 단백질 MGHASYS 를 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있는 플라스미드 pHASYS 는 상기 인산화 및 어닐링된 올리고뉴클레오티드 쌍을 상기 16 염기쌍의 위치에 삽입시켜 제조한다.
이어서, 서열번호 56 의 아미노산 서열로 구성된 단백질 (이후 단백질 MGRASSL 로 칭함) 를 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 플라스미드를 제조하기 위하여, 서열번호 35 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 36 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 올리고뉴클레오티드는 DNA 합성기 (PE Applied Biosystems; Model 394 DNA/RNA 합성기) 로 제조하고, 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지 (PE Applied Biosystems; OPC 카트리지) 로 정제한다. 단백질 MGRASSL 을 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 플라스미드 pRASSL 은 플라스미드 pHASYS 에 대해서와 동일한 절차로 제조한다.
포르피린 화합물 H2TMPyP 에 결합할 수 있는 아미노산 서열 YAGY 또는 YAGF (여기에서, Y 는 티로신, A 는 알라닌, G 는 글리신, F 는 페닐알라닌이다) (Sugitomo, N., Nakano. S., Chem. Lett. p 939, 1997) 를 함유하는 단백질을 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 플라스미드를 제조한다. 서열번호 58 의 아미노산 서열로 구성된 단백질 (이후 단백질 MGYAGY 로 칭함) 를 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있는 플라스미드를 제조하기 위하여, 서열번호 37 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 38 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 서열번호 60 의 아미노산 서열로 구성된 단백질 (이후 단백질 MGYAGF 로 칭함) 를 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있는 플라스미드를 제조하기 위하여, 서열번호 39 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 40 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 또한 합성한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 DNA 합성기 (PE Applied Biosystems; Model 394 DNA/RNA 합성기) 로 제조하고, 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지 (PE Applied Biosystems; OPC 카트리지) 로 정제한다. 단백질 MGYAGY 를 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 플라스미드 pYAGY 및 단백질 MGYAGF 을 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 플라스미드 pYAGF 를 플라스미드 pHASYS 에서와 동일한 절차로 제조한다.
상기 플라스미드 pHASYS, pRASSL, pYAGY 및 pYAGF 및 pTV118N 은 문헌 [Hanahan, D.J., Mol. Biol., 166; p 557 (1983)] 에 기재된 방법에 따라 각각 실시예 3 에서 제조한 대장균 BT3/pACYCSP 주에 도입한다. 플라스미드 pACYCSP 및 pHASYS 를 지닌 대장균 BT3/pACYCSP+pHASYS 주, 플라스미드 pACYCSP 및 pRASSL 을 지닌 대장균 BT3/pACYCSP+pRASSL 주, 플라스미드 pACYCSP 및 pYAGY 를 지닌 대장균 BT/pACYCSP+pYAGY 주, 플라스미드 pACYCSP 및 pYAGF 을 지닌 대장균 BT3/pACYCSP+pYAGF 주 및 플라스미드 pACYCSP 및 pTV118N 을 지닌 대장균 BT3/pACYCSP+pTV118N 주를 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜 및 10 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 YPT 배지에 상기 균주를 배양하여 수득한다.
상기 대장균 주는 1 ppm 의 구조식 8 로 나타낸 PPO 억제형 제초 화합물, 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜, 10 ㎍/ml 카나마이신, 10 ㎍/ml 헤민 및 50 ㎍/ml 아미노레불린산을 함유하는 YPT 배지에 접종시킨후, 실시예 2 와 동일한 방법에 따라 암조건 또는 명조건 하에서 배양한다. 이어서, 배양개시 18 시간후, 액체 배양 배지의 흡광도는 600nm 에서 측정한다. 제초 화합물이 없는 배지의 흡광도를 1 로 취하여, 제초 화합물을 함유하는 배지의 흡광도의 상대값을 계산한다. 결과는 하기 표 15 에 나타내었다.
대장균주 배양 조건 상대 흡광도
시험화합물의 농도
1ppm 0ppm
BT3/pACYCSP+pHASYS 명 0.65 1.0
BT3/pACYCSP+pHASYS 암 0.96 1.0
BT3/pACYCSP+pRASSL 명 0.59 1.0
BT3/pACYCSP+pRASSL 암 1.0 1.0
BT3/pACYCSP+pYAGY 명 0.48 1.0
BT3/pACYCSP+pYAGY 암 0.99 1.0
BT3/pACYCSP+pYAGF 명 0.62 1.0
BT3/pACYCSP+pYAGF 암 0.96 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N 명 0.07 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N 암 0.93 1.0
추가로, 아미노산 서열 HASYS 또는 RASSL 의 하나의 단위가 반복적으로 결합된 아미노산 서열을 함유한 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있는 플라스미드를 구축한다. 서열번호 61 의 아미노산 서열로 구성된 단백질 (이후 단백질 MG(HASYS)4 로 칭함, (HASYS)n 은 펩티드 HASYS 가 상호간에 n 번 반복적으로 결합된 서열을 의미함) 을 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있는 플라스미드를 제조하기 위해서는, 서열 번호 41, 42, 43 또는 44 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 DNA 합성기 (PE Applied Biosystems; Model 394 DNA/RNA 합성기) 로 제조하고, 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지 (PE Applied Biosystems; OPC 카트리지) 로 정제한다. 우선, 서열번호 42 의 염기 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 43 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드는 T4 DNA 키나아제로 처리하여 5' 말단에서 각각 인산화시킨다. 이후, 서열 번호 41 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 42 의 인산화된 염기서열의 올리고뉴클레오티드 또는 서열번호 43 의 인산화된 염기 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 44 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 혼합하고 (각 300 pmol), 70℃ 에서 5 분간 가열한후, 0.5℃/분 의 속도로 실온으로 서서히 냉각시켜 어닐링시킨다. 상기 두 어닐링된 올리고뉴클레오티드 쌍은 혼합하고, T4 DNA 리가아제로 결합시킨후, 생성된 DNA 단편을 T4 DNA 키나아제로 5' 말단에서 인산화시킨다. 한편, 벡터 pTV118N 는 제한효소 NcoI 및 EcoRI 로 절단하여 16 염기 쌍의 DNA 단편을 제거하고, 상기 인산화 DNA 단편은 상기 부분에 삽입하여 단백질 MG (HASYS)4 를 코딩하는 유전자를 발현시키는 플라스미드 pHASYS4 를 수득한다.
추가로, 서열 번호 62 의 아미노산 서열로 구성된 단백질 (이후 단백질 MG(HASYS)8 로 칭함) 를 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있는 플라스미드를 제조하기 위해서는, 서열 번호 45 의 뉴클레오티드 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 46 의 뉴클레오티드 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 합성한다.
이러한 올리고뉴클레오티드는 DNA 합성기 (PE Applied Biosystems; Model 394 DNA/RNA 합성기) 로 제조하고, 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지 (PE Applied Biosystems; OPC 카트리지) 로 정제한다. 우선, 상기 올리고뉴클레오티드는 T4 DNA 키나아제로 처리하여 5' 말단에서 인산화시킨다. 이후, 서열 번호 41 의 염기 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 42 의 인산화된 염기 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드는 혼합하고 (각 300 pmol), 서열번호 43 의 인산화된 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 44 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 혼합하고 (각 300 pmol), 추가로, 서열번호 45 의 인산화된 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 46 의 인산화된 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드는 혼합한다 (각 600 pmol). 이러한 세개의 혼합물은 70℃ 에서 5 분간 가열하고, 각각 0.5℃/분의 속도로 실온으로 서서히 냉각시켜 어닐링시킨다. 상기 세개의 어닐링된 올리고뉴클레오티드 쌍은 혼합하고, T4 DNA 리가아제로 결찰시키고, 이어서 생성된 DNA 단편은 5' 말단에서 T4 DNA 키나아제로 인산화시킨다. 단백질 MG(HASYS)8 을 발현할 수 있는 플라스미드 pHASYS8 은 상기 플라스미드 pHASYS4 에서와 동일한 방법으로 제조한다.
*이어서, 서열번호 63 의 아미노산 서열로 구성된 단백질 (이후 단백질 MG(RASSL)4 로 칭함, (RASSL)n 은 펩티드 RASSL 이 상호간에 n 번 반복적으로 결합된 서열을 의미함) 을 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있는 플라스미드를 제조하기 위해서는, 서열 번호 47, 48, 49 또는 50 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 또한, 서열번호 64 의 아미노산 서열로 구성된 단백질 (이후 단백질 MG(RASSL)8 로 칭함)을 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있는 플라스미드를 제조하기 위해서, 서열번호 51 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 52 의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 DNA 합성기 (PE Applied Biosystems; Model 394 DNA/RNA 합성기) 로 합성하고, 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지 (PE Applied Biosystems; OPC 카트리지) 로 정제한다.
단백질 MG(RASSL)4 를 발현할 수 있는 플라스미드 pRASSL4 는 상기 플라스미드 pHASYS4 에서와 동일한 방법에 따라 제조한다. 또한 단백질 MG(RASSL)8 을 발현할 수 있는 플라스미드 pRASSL8 을 상기 플라스미드 pHASYS8 에서와 같은 방법에 따라 제조한다.
상기 플라스미드 pHASYS4, pHASYS8, pRASSL4, pRASSL8 및 pTV118N 은 문헌 [Hanahan, D.J., Mol. Biol., 166; p 557 (1983)] 에 기재된 방법에 따라 각각 실시예 3 에서 제조한 대장균 BT3/pACYCSP 주에 도입한다. 플라스미드 pACYCSP 및 pHASYS4 를 지닌 대장균 BT3/pACYCSP+pHASYS4 주, 플라스미드 pACYCSP 및 pHASYS8 을 지닌 대장균 BT3/pACYCSP+pHASYS8 주, 플라스미드 pACYCSP 및 pRASSL4 를 지닌 대장균 BT3/pACYCSP+pRASSL4 주, 플라스미드 pACYCSP 및 pRASSL8 을 지닌 대장균 BT3/pACYCSP+pRASSL8 주 및 플라스미드 pACYCSP 및 pTV118N 을 지닌 대장균 BT3/pACYCSP+pTV118N 주를 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜 및 10 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 YPT 배지에 상기 균주를 배양하여 수득한다.
상기 대장균 주는 1 ppm 의 구조식 8 로 나타낸 PPO 억제형 제초 화합물, 100 ㎍/ml 암피실린, 15 ㎍/ml 클로르암페니콜, 10 ㎍/ml 카나마이신, 10 ㎍/ml 헤민 및 50 ㎍/ml 아미노레불린산을 함유하는 YPT 배지에 접종시킨후 실시예 2 와 동일한 방법에 따라 암조건 또는 명조건하에서 배양한다. 이어서, 배양개시 18 시간후, 액체 배양 배지의 흡광도는 600nm 에서 측정한다. 제초 화합물이 없는 배지의 흡광도를 1 로 취하여, 제초 화합물을 함유하는 배지의 흡광도의 상대값을 계산한다. 결과는 하기 표 16 에 나타내었다.
대장균주 배양 조건 상대 흡광도
시험화합물의 농도
1ppm 0ppm
BT3/pACYCSP+pHASYS4 명 0.91 1.0
BT3/pACYCSP+pHASYS4 암 1.0 1.0
BT3/pACYCSP+pHASYS8 명 0.57 1.0
BT3/pACYCSP+pHASYS8 암 1.0 1.0
BT3/pACYCSP+pRASSL4 명 1.1 1.0
BT3/pACYCSP+pRASSL4 암 0.98 1.0
BT3/pACYCSP+pRASSL8 명 0.79 1.0
BT3/pACYCSP+pRASSL8 암 1.0 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N 명 0.15 1.0
BT3/pACYCSP+pTV118N 암 0.81 1.0
실시예 32
프로토포르피린 IX 결합 펩티드를 코딩하는 유전자의 담배로의 도입
아그로박테리윰 방법으로 프로토포르피린 IX 결합 펩티드를 코딩하는 유전자를 담배에 도입하기 위한 플라스미드를 구축한다. 실시예 31 에서 제조된 플라스미드 pHASYS8 을 제한효소 NcoI 로 절단한 후 이중가닥 DNA 갭에 염기를 부가하는 DNA 폴리머라아제 I 로 DNA 를 평활화시킨다. 이어서, DNA 를 송아지 장에서 유래한 알칼린 포스파타아제로 탈인산화시키고, 인산화된 BamHI 링커 (4610P, Takara Shuzo 사제) 를 삽입하여 고리화시켜 플라스미드 pHASYS8B 를 구축한다. 플라스미드 pBI121 (Clontech사제) 를 제한효소 BamHI 및 SacI 로 절단한 후 β-글루쿠로니다아제 유전자를 제거한다. 한편, 플라스미드 pHASYS8B 는 제한 효소 BamHI 및 SacI 로 절단하여 단백질 MG(HASYS)8 을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 제조하고, 생성된 DNA 단편은 β-글루쿠로니다아제 유전자를 대체하여 플라스미드 pBI121 에 삽입하여 프로토포르피린 IX 결합 단백질 MG(HASYS)8 을 코딩하는 유전자가 35S 프로모터의 하류에 결합된 플라스미드 pBIHASYS8 (도 18)을 제조한다.
아그로박테리윰 감염 방법으로 프로토포르피린 IX 결합 펩티드 MG(RASSL)8 을 코딩하는 유전자를 식물에 도입하기 위한 플라스미드를 구축한다. 프로토포르피린 IX 결합 단백질 MG(RASSL)8 을 코딩하는 유전자가 35S 프로모터의 하류에 결합된 플라스미드 pBIRASSL8 (도 19) 을 pBIHASYS8 에서와 동일한 절차에 따라 pRASSL8 로부터 제조한다.
상기 플라스미드 pBIHASYS8 및 pBIRASSL8 을 아그로박테륨 투메퍼시언스 LBA4404 에 각각 도입한다. 생성된 형질전환체는 300 ㎍/ml 스트렙토마이신, 100 ㎍/ml 리팜피신 및 25 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 배지에서 배양한후, 목적하는 형질전환체를 선별하여 각각 pBIHASYS8 및 pBIRASSL8 을 지닌 아그로박테륨 균주를 단리시킨다.
멸균 배양된 담배의 잎조각은 아그로박테리윰 균주로 감염시키고, 실시예 5 에서와 동일한 방법에 따라, 프로토포르피린 IX 결합 단백질 MG(HASYS)8 를 코딩하는 유전자가 도입된 담배, 및 프로토포르피린 IX 결합 단백질 MG(RASSL)8 를 코딩하는 유전자가 도입된 담배를 수득한다.
실시예 33
프로토포르피린 IX 결합 펩티드를 코딩하는 도입된 유전자를 지닌 담배의 제초 화합물에 대한 내성의 확인
제초 화합물에 대한 내성의 수준은 실시예 14 와 동일한 방법에 따라 실시예 32 에서 제조한 프로토포르피린 IX 결합 펩티드를 코딩하는 유전자가 도입된 담배를 시험하여 정량적으로 확인한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따라, 잡초 방제 화합물 내성 식물을 생산할 수 있다.
서열 목록
서열 번호 1 :
bchH 유전자를 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 2 :
bchH 유전자를 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 3 :
대두 PPO 유전자를 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 4 :
대두 PPO 유전자를 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 7 :
bchH 유전자를 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 8 :
bchH 유전자를 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 9 :
담배 ch1H 유전자의 부분 서열을 갖는 DNA 단편을 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 10 :
담배 ch1H 유전자의 부분 서열을 갖는 DNA 단편을 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 11 :
대두 PPO 유전자의 부분 서열을 갖는 DNA 단편을 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 12 :
대두 PPO 유전자의 부분 서열을 갖는 DNA 단편을 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 13 :
대두 PPO 유전자의 부분 서열을 갖는 DNA 단편을 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 14 :
대두 PPO 유전자의 부분 서열을 갖는 DNA 단편을 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 15 :
클라미도모나스 PPO 유전자를 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 16 :
클라미도모나스 PPO 유전자를 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 19 :
클라미도모나스 PPO 유전자의 부분 서열을 갖는 DNA 단편을 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 20 :
클라미도모나스 PPO 유전자의 부분 서열을 갖는 DNA 단편을 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 21 :
오이 페로켈라타아제 유전자의 부분 서열을 갖는 DNA 단편을 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 22 :
오이 페로켈라타아제 유전자의 부분 서열을 갖는 DNA 단편을 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 23 :
대장균 hemF 유전자를 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 24 :
대장균 hemF 유전자를 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 25 :
대장균 hemF 유전자를 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 26 :
대장균 hemF 유전자를 증폭시키기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머
서열번호 27 :
5 개의 아미노산을 함유하는 무작위 펩티드를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 28 :
5 개의 아미노산을 함유하는 무작위 펩티드를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 29 :
펩티드 HASYS 를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 30 :
펩티드 HASYS 를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 31 :
펩티드 RASSL 을 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 32 :
펩티드 RASSL 을 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 33 :
펩티드 MGHASYS 를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 34 :
펩티드 MGHASYS 를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 35 :
펩티드 MGRASSL 을 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 36 :
펩티드 MGRASSL 을 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 37 :
펩티드 MGYAGY 를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 38 :
펩티드 MGYAGY 를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 39 :
펩티드 MGYAGF 를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 40 :
펩티드 MGYAGF 를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 41 :
펩티드 MG(HASYS)4 를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 42 :
펩티드 MG(HASYS)4 를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 43 :
펩티드 MG(HASYS)4 를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 44 :
펩티드 MG(HASYS)4 를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 45 :
펩티드 MG(HASYS)8 을 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 46 :
펩티드 MG(HASYS)8 를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 47 :
펩티드 MG(RASSL)4 를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 48 :
펩티드 MG(RASSL)4 를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 49 :
펩티드 MG(RASSL)4 를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 50 :
펩티드 MG(RASSL)4 를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 51 :
펩티드 MG(RASSL)8 을 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 52 :
펩티드 MG(RASSL)8 을 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 고안된 올리고뉴클레오티드
서열번호 53 :
프로토포르피린 IX 결합 단백질 HASYS
서열번호 54 :
프로토포르피린 IX 결합 단백질 MGHASYS
서열번호 55 :
프로토포르피린 IX 결합 단백질 RASSL
서열번호 56 :
프로토포르피린 IX 결합 단백질 MGRASSL
서열번호 57 :
H2TMpyP 결합 단백질 YAGY
서열번호 58 :
H2TMpyP 결합 단백질 MGYAGY
서열번호 59 :
H2TMpyP 결합 단백질 YAGF
서열번호 60 :
H2TMpyP 결합 단백질 MGYAGF
서열번호 61 :
프로토포르피린 IX 결합 단백질 MG(HASYS)4
서열번호 62 :
프로토포르피린 IX 결합 단백질 MG(HASYS)8
서열번호 63 :
프로토포르피린 IX 결합 단백질 MG(RASSL)4
서열번호 64 :
프로토포르피린 IX 결합 단백질 MG(RASSL)8
도 1 은 플라스미드 pETBCH 의 제한효소 지도이다. bchH 는 광합성 박테리아인 로도박터 스파에로이드(Rhodobacter sphaeroides)의 마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린(protoporphyrin) IX 결합 소단위(subunit) 유전자이다. T7 pro 는 T7 파아지의 프로모터 서열을 나타내고, T7 ter 은 T7 파아지의 종결서열을 나타낸다. Ampr 은 암피실린 내성 유전자이고, lacIq 는 락토오스 오페론의 리프레서 단백질 유전자이고, ori 는 복제 원점이다.
도 2 는 플라스미드 pACYCSP 의 제한효소 지도이다. PPO 는 대두의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 유전자이고, lac pro 는 락토오스 오페론의 프로모터 서열을 나타낸다. Cmr 은 클로르암페니콜 내성 유전자이고, ori 는 복제 원점이다.
도 3 은 플라스미드 pTVBCH 의 제한효소 지도이다. bchH 는 광합성 박테리아인 로도박터 스파에로이드의 마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 유전자이다. lac pro 는 락토오스 오페론의 프로모터 서열을 나타낸다. Ampr 은 암피실린 내성 유전자이고, 피실린 내성 유전자이고, ori 는 복제 원점이다.
도 4 는 플라스미드 pBIBCH 의 제한효소 지도이다. bchH 는 광합성 박테리아인 로도박터 스파에로이드의 마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 유전자이다. NP 는 노팔린 신타아제(synthase) 유전자의 프로모터 서열 이고, NT 는 노팔린 신타아제 유전자의 종결서열이며, 35S 는 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터이다. NPTII 는 카나마이신 내성 유전자를 나타내고, RB 및 LB 는 각각 T-DNA 의 오른쪽 및 왼쪽 경계(border) 서열을 나타낸다.
도 5 는 플라스미드 pNO 의 제한효소 지도이다. NP 는 노팔린 신타아제 유전자의 프로모터 서열이고, NT 는 노팔린 신타아제 유전자의 종결서열이며, 35S 는 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터이다. NPTII 는 카나마이신 내성 유전자를 나타내고, RB 및 LB 는 각각 T-DNA 의 오른쪽 및 왼쪽 경계 서열을 나타낸다.
도 6 은 플라스미드 pTCHLH 의 제한효소 지도이다. TCHLH 는 엽록체 트랜지트(transit) 시그널이 제거된 담배(tobacco) 마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 유전자이다. lac pro 는 락토오스 오페론의 프로모터 서열을 나타낸다. Ampr 은 암피실린 내성 유전자이고, Kmr 은 카나마이신 내성 유전자이고, ori 는 복제 원점이다.
도 7 은 플라스미드 pBITCHLH 의 제한효소 지도이다. TCHLH 는 엽록체 트랜지트 시그널이 제거된 담배 마그네슘 킬레타아제의 프로토포르피린 IX 결합 소단위 유전자이다. NP 는 노팔린 신타아제 유전자의 프로모터 서열이고, NT 는 노팔린 신타아제 유전자의 종결서열이며, 35S 는 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터이다. NPTII 는 카나마이신 내성 유전자를 나타내고, RB 및 LB 는 각각 T-DNA 의 오른쪽 및 왼쪽 경계 서열을 나타낸다.
도 8 은 플라스미드 pTVGMP 의 제한효소 지도이다. GMP 는 엽록체 트랜지트 시그널 및 FAD 결합 서열이 제거된 대두의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 유전자이다. lac pro 는 락토오스 오페론의 프로모터 서열을 나타낸다. Ampr 은 암피실린 내성 유전자이고, ori 는 복제 원점이다.
도 9 는 플라스미드 pBIGMP 의 제한효소 지도이다. GMP 는 엽록체 트랜지트 시그널 및 FAD 결합 서열이 제거된 대두의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자이다. NP 는 노팔린 신타아제 유전자의 프로모터 서열이고, NT 는 노팔린 신타아제 유전자의 종결서열이며, 35S 는 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터이다. NPTII 는 카나마이신 내성 유전자를 나타내고, RB 및 LB 는 각각 T-DNA 의 오른쪽 및 왼쪽 경계 서열을 나타낸다.
도 10 은 플라스미드 pTVCRP 의 제한효소 지도이다. CRP 는 엽록체 트랜지트 시그널 및 FAD 결합 서열이 제거된 클라미도모나스 레인하르드티(Chlamydomonas reinhardtii)의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자이다. lac pro 는 락토오스 오페론의 프로모터 서열을 나타낸다. Ampr 은 암피실린 내성 유전자이고, ori 는 복제 원점이다.
도 11 은 플라스미드 pBICRP 의 제한효소 지도이다. CRP 는 엽록체 트랜지트 시그널 및 FAD 결합 서열이 제거된 클라미도모나스 레인하르드티의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자이다. NP 는 노팔린 신타아제의 프로모터 서열이고, NT 는 노팔린 신타아제의 종결서열이며, 35S 는 콜리플라워 모자이크 바이러스 의 35S 프로모터이다. NPTII 는 카나마이신 내성 유전자를 나타내고, RB 및 LB 는 각각 T-DNA 의 오른쪽 및 왼쪽 경계 서열을 나타낸다.
도 12 는 플라스미드 pTVHVF1 의 제한효소 지도이다. HVF 는 시그널 서열이 제거된 보리의 페로킬레타아제(ferrochelatase) 유전자이다. lac pro 는 락토오스 오페론의 프로모터 서열을 나타낸다. Ampr 은 암피실린 내성 유전자이고, ori 는 복제 원점이다.
도 13 은 플라스미드 pBIHVF 의 제한효소 지도이다. HVF 는 시그널 서열이 제거된 보리의 페로킬레타아제 유전자이다. NP 는 노팔린 신타아제의 프로모터 서열이고, NT 는 노팔린 신타아제의 종결서열이며, 35S 는 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터이다. NPTII 는 카나마이신 내성 유전자를 나타내고, RB 및 LB 는 각각 T-DNA 의 오른쪽 및 왼쪽 경계 서열을 나타낸다.
도 14 는 플라스미드 pTVCSF 의 제한효소 지도이다. CSF 는 시그널 서열이 제거된 오이의 페로킬레타아제 유전자이다. lac pro 는 락토오스 오페론의 프로모터 서열을 나타낸다. Ampr 은 암피실린 내성 유전자이고, ori 는 복제 원점이다.
도 15 는 플라스미드 pBICSF 의 제한효소 지도이다. CSF 는 시그널 서열이 제거된 오이 페로킬레타아제 유전자이다. NP 는 노팔린 신타아제의 프로모터 서열이고, NT 는 노팔린 신타아제의 종결서열이며, 35S 는 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터이다. NPTII 는 카나마이신 내성 유전자를 나타내고, RB 및 LB 는 각각 T-DNA 의 오른쪽 및 왼쪽 경계 서열을 나타낸다.
도 16 은 플라스미드 pHEMF 의 제한효소 지도이다. HEMF 는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli, 이후 E. coli 로 칭함)의 코프로포르피리노겐 (coproporphyrinogen) III 옥시다아제 유전자 (hemF) 이다. lac pro 는 락토오스 오페론의 프로모터 서열을 나타낸다. Ampr 은 암피실린 내성 유전자이고, ori 는 복제 원점이다.
도 17 은 플라스미드 pBIHEMF 의 제한효소 지도이다. HEMF 는 E. coli 의 코프로포르피리노겐 III 옥시다아제 유전자 (hemF) 이다. NP 는 노팔린 신타아제의 프로모터 서열이고, NT 는 노팔린 신타아제의 종결서열이며, 35S 는 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터이다. NPTII 는 카나마이신 내성 유전자를 나타내고, RB 및 LB 는 각각 T-DNA 의 오른쪽 및 왼쪽 경계 서열을 나타낸다.
도 18 은 플라스미드 pBIHASYS8 의 제한효소 지도이다. HASYS8 은 MG(HASYS)8 단백질을 코딩하는 유전자이다. NP 는 노팔린 신타아제의 프로모터 서열이고, NT 는 노팔린 신타아제의 종결서열이며, 35S 는 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터이다. NPTII 는 카나마이신 내성 유전자를 나타내고, RB 및 LB 는 각각 T-DNA 의 오른쪽 및 왼쪽 경계 서열을 나타낸다.
도 19 는 플라스미드 pBIRASSL8 의 제한효소 지도이다. RASSL8 은 MG(RASSL)8 단백질이다. NP 는 노팔린 신타아제의 프로모터 서열이고, NT 는 노 팔린 신타아제의 종결서열이며, 35S 는 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터이다. NPTII 는 카나마이신 내성 유전자를 나타내고, RB 및 LB 는 각각 T-DNA 의 오른쪽 및 왼쪽 경계 서열을 나타낸다.
<110> Akio KOSAI ; Sumitomo Chemical Company Limited <120> Method for giving resistance to weed control compounds to plants <150> JP 10/120553 <151> 1998-04-30 <150> JP 10/281127 <151> 1998-10-02 <150> JP 10/330981 <151> 1998-11-20 <150> JP 11/054730 <151> 1999-03-02 <160> 64 <170> KOPATIN 1.0 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify bchH gene <400> 1 gacatctaga ggagacgacc atatgcacgg tgaagtctc 39 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify bchH gene <400> 2 acggaagctt agatcttcac tcggcggcaa t 31 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify soybean PPO gene <400> 3 tcgagctcca tggtttccgt cttcaacgag atcctattc 39 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify soybean PPO gene <400> 4 ttgtcgacaa ctgctactat ttgtacactc tatttg 36 <210> 5 <211> 1632 <212> DNA <213> Glycine max var. Williams82 <220> <221> CDS <222> (1)..(1629) <400> 5 atg gtt tcc gtc ttc aac gag atc cta ttc ccg ccg aac caa acc ctt 48 Met Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro Pro Asn Gln Thr Leu 1 5 10 15 ctt cgc ccc tcc ctc cat tcc cca acc tct ttc ttc acc tct ccc act 96 Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr 20 25 30 cga aaa ttc cct cgc tct cgc cct aac cct att cta cgc tgc tcc att 144 Arg Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile 35 40 45 gcg gag gaa tcc acc gcg tct ccg ccc aaa acc aga gac tcc gcc ccc 192 Ala Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr Arg Asp Ser Ala Pro 50 55 60 gtg gac tgc gtc gtc gtc ggc gga ggc gtc agc ggc ctc tgc atc gcc 240 Val Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Val Ser Gly Leu Cys Ile Ala 65 70 75 80 cag gcc ctc gcc acc aaa cac gcc aat gcc aac gtc gtc gtc acg gag 288 Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Ala Asn Ala Asn Val Val Val Thr Glu 85 90 95 gcc cga gac cgc gtc ggc ggc aac atc acc acg atg gag agg gac gga 336 Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Met Glu Arg Asp Gly 100 105 110 tac ctc tgg gaa gaa ggc ccc aac agc ttc cag cct tct gat cca atg 384 Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met 115 120 125 ctc acc atg gtg gtg gac agt ggt tta aag gat gag ctt gtt ttg ggg 432 Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly 130 135 140 gat cct gat gca cct cgg ttt gtg ttg tgg aac agg aag ttg agg ccg 480 Asp Pro Asp Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro 145 150 155 160 gtg ccc ggg aag ctg act gat ttg cct ttc ttt gac ttg atg agc att 528 Val Pro Gly Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile 165 170 175 ggt ggc aaa atc agg gct ggc ttt ggt gcg ctt gga att cgg cct cct 576 Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro 180 185 190 cct cca ggt cat gag gaa tcg gtt gaa gag ttt gtt cgt cgg aac ctt 624 Pro Pro Gly His Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu 195 200 205 ggt gat gag gtt ttt gaa cgg ttg ata gag cct ttt tgt tca ggg gtc 672 Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val 210 215 220 tat gca ggc gat cct tca aaa tta agt atg aaa gca gca ttc ggg aaa 720 Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys 225 230 235 240 gtt tgg aag ctg gaa aaa aat ggt ggt agc att att ggt gga act ttc 768 Val Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe 245 250 255 aaa gca ata caa gag aga aat gga gct tca aaa cca cct cga gat ccg 816 Lys Ala Ile Gln Glu Arg Asn Gly Ala Ser Lys Pro Pro Arg Asp Pro 260 265 270 cgt ctg cca aaa cca aaa ggt cag act gtt gga tct ttc cgg aag gga 864 Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly 275 280 285 ctt acc atg ttg cct gat gca att tct gcc aga cta ggc aac aaa gta 912 Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Lys Val 290 295 300 aag tta tct tgg aag ctt tca agt att agt aaa ctg gat agt gga gag 960 Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys Leu Asp Ser Gly Glu 305 310 315 320 tac agt ttg aca tat gaa aca cca gaa gga gtg gtt tct ttg cag tgc 1008 Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Leu Gln Cys 325 330 335 aaa act gtt gtc ctg acc att cct tcc tat gtt gct agt aca ttg ctg 1056 Lys Thr Val Val Leu Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Thr Leu Leu 340 345 350 cgt cct ctg tct gct gct gct gca gat gca ctt tca aag ttt tat tac 1104 Arg Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr 355 360 365 cct cca gtt gct gca gtt tcc ata tcc tat cca aaa gaa gct att aga 1152 Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg 370 375 380 tca gaa tgc ttg ata gat ggt gag ttg aag ggg ttt ggt caa ttg cat 1200 Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His 385 390 395 400 cca cgt agc caa gga gtg gaa aca tta gga act ata tac agc tca tca 1248 Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser 405 410 415 cta ttc ccc aac cga gca cca cct gga agg gtt cta ctc ttg aat tac 1296 Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr 420 425 430 att gga gga gca act aat act gga att tta tcg aag acg gac agt gaa 1344 Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Asp Ser Glu 435 440 445 ctt gtg gaa aca gtt gat cga gat ttg agg aaa atc ctt ata aac cca 1392 Leu Val Glu Thr Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Ile Leu Ile Asn Pro 450 455 460 aat gcc cag gat cca ttt gta gtg ggg gtg aga ctg tgg cct caa gct 1440 Asn Ala Gln Asp Pro Phe Val Val Gly Val Arg Leu Trp Pro Gln Ala 465 470 475 480 att cca cag ttc tta gtt ggc cat ctt gat ctt cta gat gtt gct aaa 1488 Ile Pro Gln Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Val Ala Lys 485 490 495 gct tct atc aga aat act ggg ttt gaa ggg ctc ttc ctt ggg ggt aat 1536 Ala Ser Ile Arg Asn Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn 500 505 510 tat gtg tct ggt gtt gcc ttg gga cga tgc gtt gag gga gcc tat gag 1584 Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu 515 520 525 gta gca gct gaa gta aac gat ttt ctc aca aat aga gtg tac aaa t 1630 Val Ala Ala Glu Val Asn Asp Phe Leu Thr Asn Arg Val Tyr Lys 530 535 540 ag 1632 <210> 6 <211> 543 <212> PRT <213> Glycine max var. Williams82 <400> 6 Met Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro Pro Asn Gln Thr Leu 1 5 10 15 Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr 20 25 30 Arg Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile 35 40 45 Ala Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr Arg Asp Ser Ala Pro 50 55 60 Val Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Val Ser Gly Leu Cys Ile Ala 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Ala Asn Ala Asn Val Val Val Thr Glu 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Met Glu Arg Asp Gly 100 105 110 Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met 115 120 125 Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly 130 135 140 Asp Pro Asp Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro 145 150 155 160 Val Pro Gly Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile 165 170 175 Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro 180 185 190 Pro Pro Gly His Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu 195 200 205 Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val 210 215 220 Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys 225 230 235 240 Val Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe 245 250 255 Lys Ala Ile Gln Glu Arg Asn Gly Ala Ser Lys Pro Pro Arg Asp Pro 260 265 270 Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly 275 280 285 Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Lys Val 290 295 300 Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys Leu Asp Ser Gly Glu 305 310 315 320 Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Leu Gln Cys 325 330 335 Lys Thr Val Val Leu Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Thr Leu Leu 340 345 350 Arg Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr 355 360 365 Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg 370 375 380 Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His 385 390 395 400 Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser 405 410 415 Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr 420 425 430 Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Asp Ser Glu 435 440 445 Leu Val Glu Thr Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Ile Leu Ile Asn Pro 450 455 460 Asn Ala Gln Asp Pro Phe Val Val Gly Val Arg Leu Trp Pro Gln Ala 465 470 475 480 Ile Pro Gln Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Val Ala Lys 485 490 495 Ala Ser Ile Arg Asn Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn 500 505 510 Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu 515 520 525 Val Ala Ala Glu Val Asn Asp Phe Leu Thr Asn Arg Val Tyr Lys 530 535 540 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify bchH gene <400> 7 gacatctagt ctagacgacc atatgcacgg tgaagtctc 39 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify bchH gene <400> 8 acggaagctt ggtacctcac tcggcggcaa t 31 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having partial sequence of tobacco chlH gene <400> 9 ccaatgtaat gctatggtac ctatgttatt cactc 35 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having partial sequence of tobacco chlH gene <400> 10 gagatcattc tttttgctgt cgacttatcg atcg 34 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having partial sequence of soybean PPO gene <400> 11 ggcggaggcg tcaccatggt ctgcatcgcc caggcc 36 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having partial sequence of soybean PPO gene <400> 12 gcctgcaggt cgacaactgc tactatttgt acactc 36 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having partial sequence of soybean PPO gene <400> 13 cacaggaaag gtaccatggt ctgcatcgcc cag 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having partial sequence of soybean PPO gene <400> 14 cctgcagctc gagagctcct actatttgta cac 33 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify Chlamydomonas PPO gene <400> 15 aatgatgttg acccagactc ctgggacc 28 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify Chlamydomonas PPO gene <400> 16 tactacacat cccagcaagc gccaatg 27 <210> 17 <211> 1838 <212> DNA <213> Chlamydomonas reinhardtii CC407 <220> <221> CDS <222> (2)..(1690) <400> 17 a atg atg ttg acc cag act cct ggg acc gcc acg gct tct agc 43 Met Met Leu Thr Gln Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ala Ser Ser 1 5 10 cgg cgg tcg cag atc cgc tcg gct gcg cac gtc tcc gcc aag gtc gcg 91 Arg Arg Ser Gln Ile Arg Ser Ala Ala His Val Ser Ala Lys Val Ala 15 20 25 30 cct cgg ccc acg cca ttc tcg gtc gcg agc ccc gcg acc gct gcg agc 139 Pro Arg Pro Thr Pro Phe Ser Val Ala Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ser 35 40 45 ccc gcg acc gcg gcg gcc cgc cgc aca ctc cac cgc act gct gcg gcg 187 Pro Ala Thr Ala Ala Ala Arg Arg Thr Leu His Arg Thr Ala Ala Ala 50 55 60 gcc act ggt gct ccc acg gcg tcc gga gcc ggc gtc gcc aag acg ctc 235 Ala Thr Gly Ala Pro Thr Ala Ser Gly Ala Gly Val Ala Lys Thr Leu 65 70 75 gac aat gtg tat gac gtg atc gtg gtc ggt gga ggt ctc tcg ggc ctg 283 Asp Asn Val Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Gly Gly Leu Ser Gly Leu 80 85 90 gtg acc ggc cag gcc ctg gcg gct cag cac aaa att cag aac ttc ctt 331 Val Thr Gly Gln Ala Leu Ala Ala Gln His Lys Ile Gln Asn Phe Leu 95 100 105 110 gtt acg gag gct cgc gag cgc gtc ggc ggc aac att acg tcc atg tcg 379 Val Thr Glu Ala Arg Glu Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Ser Met Ser 115 120 125 ggc gat ggc tac gtg tgg gag gag ggc ccg aac agc ttc cag ccc aac 427 Gly Asp Gly Tyr Val Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Asn 130 135 140 gat agc atg ctg cag att gcg gtg gac tct ggc tgc gag aag gac ctt 475 Asp Ser Met Leu Gln Ile Ala Val Asp Ser Gly Cys Glu Lys Asp Leu 145 150 155 gtg ttc ggt gac ccc acg gct ccc cgc ttc gtg tgg tgg gag ggc aag 523 Val Phe Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe Val Trp Trp Glu Gly Lys 160 165 170 ctg cgc ccc gtg ccc tcg ggc ctg gac gcc ttc acc ttc gac ctc atg 571 Leu Arg Pro Val Pro Ser Gly Leu Asp Ala Phe Thr Phe Asp Leu Met 175 180 185 190 tcc atc ccc ggc aag atc cgc gcc ggg ctg ggc gcc atc ggc ctc atc 619 Ser Ile Pro Gly Lys Ile Arg Ala Gly Leu Gly Ala Ile Gly Leu Ile 195 200 205 aac gga gcc atg ccc tcc ttc gag gag agt gtg gag cag ttc atc cgc 667 Asn Gly Ala Met Pro Ser Phe Glu Glu Ser Val Glu Gln Phe Ile Arg 210 215 220 cgc aac ctg ggc gat gag gtg ttc ttc cgc ctg atc gag ccc ttc tgc 715 Arg Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Phe Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys 225 230 235 tcc ggc gtg tac gcg ggc gac ccc tcc aag ctg tcc atg aag gcg gcc 763 Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala 240 245 250 ttc aac agg atc tgg att ctg gag aag aac ggc ggc agc ctg gtg gga 811 Phe Asn Arg Ile Trp Ile Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Leu Val Gly 255 260 265 270 ggt gcc atc aag ctg ttc cag gaa cgc cag tcc aac ccg gcc ccg ccg 859 Gly Ala Ile Lys Leu Phe Gln Glu Arg Gln Ser Asn Pro Ala Pro Pro 275 280 285 cgg gac ccg cgc ctg ccg ccc aag ccc aag ggc cag acg gtg ggc tcg 907 Arg Asp Pro Arg Leu Pro Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser 290 295 300 ttc cgc aag ggc ctg aag atg ctg ccg gac gcc att gag cgc aac atc 955 Phe Arg Lys Gly Leu Lys Met Leu Pro Asp Ala Ile Glu Arg Asn Ile 305 310 315 ccc gac aag atc cgc gtg aac tgg aag ctg gtg tct ctg ggc cgc gag 1003 Pro Asp Lys Ile Arg Val Asn Trp Lys Leu Val Ser Leu Gly Arg Glu 320 325 330 gcg gac ggg cgg tac ggg ctg gtg tac gac acg ccc gag ggc cgt gtc 1051 Ala Asp Gly Arg Tyr Gly Leu Val Tyr Asp Thr Pro Glu Gly Arg Val 335 340 345 350 aag gtg ttt gcc cgc gcc gtg gct ctg acc gcg ccc agc tac gtg gtg 1099 Lys Val Phe Ala Arg Ala Val Ala Leu Thr Ala Pro Ser Tyr Val Val 355 360 365 gcg gac ctg gtc aag gag cag gcg ccc gcc gcc gcc gag gcc ctg ggc 1147 Ala Asp Leu Val Lys Glu Gln Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ala Leu Gly 370 375 380 tcc ttc gac tac ccg ccg gtg ggc gcc gtg acg ctg tcg tac ccg ctg 1195 Ser Phe Asp Tyr Pro Pro Val Gly Ala Val Thr Leu Ser Tyr Pro Leu 385 390 395 agc gcc gtg cgg gag gag cgc aag gcc tcg gac ggg tcc gtg ccg ggc 1243 Ser Ala Val Arg Glu Glu Arg Lys Ala Ser Asp Gly Ser Val Pro Gly 400 405 410 ttc ggt cag ctg cac ccg cgc acg cag ggc atc acc act ctg ggc acc 1291 Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Thr Gln Gly Ile Thr Thr Leu Gly Thr 415 420 425 430 atc tac agc tcc agc ctg ttc ccc ggc cgc gcg ccc gag ggc cac atg 1339 Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Gly Arg Ala Pro Glu Gly His Met 435 440 445 ctg ctg ctc aac tac atc ggc ggc acc acc aac cgc ggc atc gtc aac 1387 Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Thr Thr Asn Arg Gly Ile Val Asn 450 455 460 cag acc acc gag cag ctg gtg gag cag gtg gac aag gac ctg cgc aac 1435 Gln Thr Thr Glu Gln Leu Val Glu Gln Val Asp Lys Asp Leu Arg Asn 465 470 475 atg gtc atc aag ccc gac gcg ccc aag ccc cgt gtg gtg ggc gtg cgc 1483 Met Val Ile Lys Pro Asp Ala Pro Lys Pro Arg Val Val Gly Val Arg 480 485 490 gtg tgg ccg cgc gcc atc ccg cag ttc aac ctg ggc cac ctg gag cag 1531 Val Trp Pro Arg Ala Ile Pro Gln Phe Asn Leu Gly His Leu Glu Gln 495 500 505 510 ctg gac aag gcg cgc aag gcg ctg gac gcg gcg ggg ctg cag ggc gtg 1579 Leu Asp Lys Ala Arg Lys Ala Leu Asp Ala Ala Gly Leu Gln Gly Val 515 520 525 cac ctg ggg ggc aac tac gtc agc ggt gtg gcc ctg ggc aag gtg gtg 1627 His Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Lys Val Val 530 535 540 gag cac ggc tac gag tcc gca gcc aac ctg gcc aag agc gtg tcc aag 1675 Glu His Gly Tyr Glu Ser Ala Ala Asn Leu Ala Lys Ser Val Ser Lys 545 550 555 gcc gca gtc aag gcc taagcggctg cagcagtagc agcagcagca tcgggctgta 1730 Ala Ala Val Lys Ala 560 gctggtaaat gccgcagtgg caccggcagc agcaattggc aagcacttgg ggcaagcgga 1790 gtggaggcga ggggggggct accattggcg cttgctggga tgtgtagt 1838 <210> 18 <211> 563 <212> PRT <213> Chlamydomonas reinhardtii CC407 <400> 18 Met Met Leu Thr Gln Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ala Ser Ser Arg Arg 1 5 10 15 Ser Gln Ile Arg Ser Ala Ala His Val Ser Ala Lys Val Ala Pro Arg 20 25 30 Pro Thr Pro Phe Ser Val Ala Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ser Pro Ala 35 40 45 Thr Ala Ala Ala Arg Arg Thr Leu His Arg Thr Ala Ala Ala Ala Thr 50 55 60 Gly Ala Pro Thr Ala Ser Gly Ala Gly Val Ala Lys Thr Leu Asp Asn 65 70 75 80 Val Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Gly Gly Leu Ser Gly Leu Val Thr 85 90 95 Gly Gln Ala Leu Ala Ala Gln His Lys Ile Gln Asn Phe Leu Val Thr 100 105 110 Glu Ala Arg Glu Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Ser Met Ser Gly Asp 115 120 125 Gly Tyr Val Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Asn Asp Ser 130 135 140 Met Leu Gln Ile Ala Val Asp Ser Gly Cys Glu Lys Asp Leu Val Phe 145 150 155 160 Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe Val Trp Trp Glu Gly Lys Leu Arg 165 170 175 Pro Val Pro Ser Gly Leu Asp Ala Phe Thr Phe Asp Leu Met Ser Ile 180 185 190 Pro Gly Lys Ile Arg Ala Gly Leu Gly Ala Ile Gly Leu Ile Asn Gly 195 200 205 Ala Met Pro Ser Phe Glu Glu Ser Val Glu Gln Phe Ile Arg Arg Asn 210 215 220 Leu Gly Asp Glu Val Phe Phe Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly 225 230 235 240 Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Asn 245 250 255 Arg Ile Trp Ile Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Leu Val Gly Gly Ala 260 265 270 Ile Lys Leu Phe Gln Glu Arg Gln Ser Asn Pro Ala Pro Pro Arg Asp 275 280 285 Pro Arg Leu Pro Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg 290 295 300 Lys Gly Leu Lys Met Leu Pro Asp Ala Ile Glu Arg Asn Ile Pro Asp 305 310 315 320 Lys Ile Arg Val Asn Trp Lys Leu Val Ser Leu Gly Arg Glu Ala Asp 325 330 335 Gly Arg Tyr Gly Leu Val Tyr Asp Thr Pro Glu Gly Arg Val Lys Val 340 345 350 Phe Ala Arg Ala Val Ala Leu Thr Ala Pro Ser Tyr Val Val Ala Asp 355 360 365 Leu Val Lys Glu Gln Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ser Phe 370 375 380 Asp Tyr Pro Pro Val Gly Ala Val Thr Leu Ser Tyr Pro Leu Ser Ala 385 390 395 400 Val Arg Glu Glu Arg Lys Ala Ser Asp Gly Ser Val Pro Gly Phe Gly 405 410 415 Gln Leu His Pro Arg Thr Gln Gly Ile Thr Thr Leu Gly Thr Ile Tyr 420 425 430 Ser Ser Ser Leu Phe Pro Gly Arg Ala Pro Glu Gly His Met Leu Leu 435 440 445 Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Thr Thr Asn Arg Gly Ile Val Asn Gln Thr 450 455 460 Thr Glu Gln Leu Val Glu Gln Val Asp Lys Asp Leu Arg Asn Met Val 465 470 475 480 Ile Lys Pro Asp Ala Pro Lys Pro Arg Val Val Gly Val Arg Val Trp 485 490 495 Pro Arg Ala Ile Pro Gln Phe Asn Leu Gly His Leu Glu Gln Leu Asp 500 505 510 Lys Ala Arg Lys Ala Leu Asp Ala Ala Gly Leu Gln Gly Val His Leu 515 520 525 Gly Gly Asn Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Lys Val Val Glu His 530 535 540 Gly Tyr Glu Ser Ala Ala Asn Leu Ala Lys Ser Val Ser Lys Ala Ala 545 550 555 560 Val Lys Ala <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having partial sequence of Chlamydomonas PPO gene <400> 19 ggtcggtgga ggggatccga tgctggtgac cg 32 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having partial sequence of Chlamydomonas PPO gene <400> 20 gctactgctg cgagctctta ggccttgact gc 32 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having partial sequence of cucumber ferrochelatase gene <400> 21 gctttagaat cggatcctat ggcagtggat gac 33 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having partial sequence of cucumber ferrochelatase gene <400> 22 ggtgaacttc tatttgagct ctcaggtaaa tataag 36 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify Esherichia coli hemF gene <400> 23 gctgaaggcg tgatcagtta tttcc 25 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify Esherichia coli hemF gene <400> 24 catcagcctg cagtgcgaaa agtg 24 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify Esherichia coli hemF gene <400> 25 cgaaaaaggg atccgttatg aaaccc 26 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify Esherichia coli hemF gene <400> 26 gctgttttcc gagctcccgt cac 23 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotides to synthesize genes encoding random peptides comprising 5 amino acids <400> 27 tggccnnknn knnknnknnk gc 22 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotides to synthesize genes encoding random peptides comprising 5 amino acids <400> 28 ggccgcmnnm nnmnnmnnmn nggccagct 29 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide HASYS <400> 29 tggcccatgc tagttagtcg gc 22 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide HASYS <400> 30 tggcgccgac taactagcat gggccagct 29 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide RASSL <400> 31 tggcccgggc gtcgtcgttg gc 22 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide RASSL <400> 32 ggccgccaac gacgacgccc gggccagct 29 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MGHASYS <400> 33 catgggtcac gcttcttact cctaag 26 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MGHASYS <400> 34 aattcttagg agtaagaagc gtgacc 26 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MGRASSL <400> 35 catgggtcgt gcttcttccc tgtaag 26 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MGRASSL <400> 36 aattcttaca gggaagaagc acgacc 26 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MGYAGY <400> 37 catgggttac gctggctact aag 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MGYAGY <400> 38 aattcttagt agccagcgta acc 23 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MGYAGF <400> 39 catgggttac gctggcttct aag 23 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MGYAGF <400> 40 aattcttaga agccagcgta acc 23 <210> 41 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MG(HASYS)4 <400> 41 catgggtcac gcttcttact cccatgcatc ttac 34 <210> 42 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MG(HASYS)4 <400> 42 gtgggagtaa gatgcatggg agtaagaagc gtgacc 36 <210> 43 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MG(HASYS)4 <400> 43 tcccacgctt cttactccca tgcatcttac tcctaag 37 <210> 44 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MG(HASYS)4 <400> 44 aattcttagg agtaagatgc atgggagtaa gaagc 35 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MG(HASYS)8 <400> 45 tcccacgctt cttactccca tgcatcttac 30 <210> 46 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MG(HASYS)8 <400> 46 gtgggagtaa gatgcatggg agtaagaagc 30 <210> 47 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MG(RASSL)4 <400> 47 catgggtcgt gcttcttccc tgcgcgcatc ttcc 34 <210> 48 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MG(RASSL)4 <400> 48 acgcagggaa gatgcgcgca gggaagaagc acgacc 36 <210> 49 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MG(RASSL)4 <400> 49 ctgcgtgctt cttccctgcg cgcatcttcc ctgtaag 37 <210> 50 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MG(RASSL)4 <400> 50 aattcttaca gggaagatgc gcgcagggaa gaagc 35 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MG(RASSL)8 <400> 51 ctgcgtgctt cttccctgcg cgcatcttcc 30 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene encoding the peptide MG(RASSL)8 <400> 52 acgcagggaa gatgcgcgca gggaagaagc 30 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protoporphyrin IX binding protein HASYS <400> 53 His Ala Ser Tyr Ser 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protoporphyrin IX binding protein MGHASYS <400> 54 Met Gly His Ala Ser Tyr Ser 1 5 <210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protoporphyrin IX binding protein RASSL <400> 55 Arg Ala Ser Ser Leu 1 5 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protoporphyrin IX binding protein MGRASSL <400> 56 Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu 1 5 <210> 57 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H2TMpyP binding protein YAGY <400> 57 Tyr Ala Gly Tyr 1 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H2TMpyP binding protein MGYAGY <400> 58 Met Gly Tyr Ala Gly Tyr 1 5 <210> 59 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H2TMpyP binding protein YAGF <400> 59 Tyr Ala Gly Phe 1 <210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H2TMpyP binding protein MGYAGF <400> 60 Met Gly Tyr Ala Gly Phe 1 5 <210> 61 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protoporphyrin IX binding protein MG(HASYS)4 <400> 61 Met Gly His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Ser His Ala Ser Tyr Ser 20 <210> 62 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protoporphyrin IX binding protein MG(HASYS)8 <400> 62 Met Gly His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser 20 25 30 His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser 35 40 <210> 63 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protoporphyrin IX binding protein MG(RASSL)4 <400> 63 Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser 1 5 10 15 Leu Arg Ala Ser Ser Leu 20 <210> 64 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protoporphyrin IX binding protein MG(RASSL)8 <400> 64 Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser 1 5 10 15 Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu 20 25 30 Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu 35 40

Claims (13)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 잡초 제거 화합물에 대하여 내성이 있는 식물의 제조 방법:
    (1) (a) FAD 결합 서열이 제거된 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 변형체, 또는 (b) FAD 결합 서열 및 엽록체 트랜지트 시그널이 제거된 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 변형체를 코딩하는 유전자를 식물 세포 내로 도입하고,
    (2) 상기 유전자를 발현시킴.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자가 프로모터와 종결서열에 조작적으로 결찰되는 형태로 식물 세포 내로 도입되는 방법으로서, 상기 프로모터 및 상기 종결서열 모두가 식물 세포 내에서 작용을 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 잡초 제거 화합물이 식물의 포르피린 (porphyrin) 생합성을 억제하는 것인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 잡초 제거 화합물이 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 억제-형 제초 화합물인 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로토포르피리노겐 IX 옥시 다아제 변형체가 식물로부터 유도되는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 변형체가 콩으로부터 유도되는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 변형체가 조류(algae)로부터 유도되는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 4 항, 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 변형체가 클라미도모나스(Chlamydomonas)로부터 유도되는 방법.
  9. 제 1 항의 방법에 의해 얻어진 잡초 제거 화합물-내성 식물로서, (a) FAD 결합 서열이 제거된 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 변형체, 또는 (b) FAD 결합 서열 및 엽록체 트랜지트 시그널이 제거된 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 변형체를 코딩하는 유전자가 도입되고, 발현되는 식물 세포를 함유하는 식물.
  10. 제 9 항의 식물의 성장 지역에 잡초 제거 화합물을 사용하는 것을 포함하는 식물 보호 방법.
  11. 제 9 항의 식물 및 다른 식물의 성장 지역에 제 9 항의 식물이 내성을 갖는 잡초 제거 화합물을 사용하고, 상기 식물들 간의 성장의 차이에 기초하여 두 식물 중 하나를 선택하는 것을 포함하는, 식물의 선택 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 식물이 식물 세포인 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 잡초 제거 화합물이 하기의 (1) 내지 (3)의 화합물로부터 선택된 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 억제-형 제초 화합물인 방법 :
    (1) 클로르메톡시닐, 비페녹스, 클로르니트로펜, 아시플루오르펜 및 이의 에틸 에스테르, 아시플루오르펜-나트륨, 옥시플루오르펜, 옥시디아존, 2-[4-클로로-2-플루오로-5-(프로프-2-이닐옥시)페닐]-2,3,4,5,6,7-헥사히드로-1H-이소인돌-1,3-디온, 클로르프탈림, TNPP-에틸, 또는 N3-(1-페닐에틸)-2,6-디메틸-5-프로피오닐니코틴아미드;
    (2) G 는 하기의 화학식 G-1 내지 G-9 중 하나로 표현되는 기이고, J 는 하기의 화학식 J-1 내지 J-30 중 하나로 표현되는 하기 화학식 J-G (I)로 표현되는 화합물:
    Figure 112007080679067-PAT00021
    Figure 112007080679067-PAT00022
    Figure 112007080679067-PAT00023
    Figure 112007080679067-PAT00024
    [식중, 화학식 J-5, J-6, J-12 및 J-24 에서 점선은 왼쪽 고리가 오로지 단일 결합을 포함하거나, 또는 고리내의 하나의 결합이 탄소 원자 사이의 이중 결합인 것을 나타내고;
    X 는 산소 원자 또는 황 원자이고;
    Y 는 산소 원자 또는 황 원자이고;
    R1 은 수소 원자 또는 할로겐 원자이고;
    R2 는 수소 원자, C1-C8 알킬기, C1-C8 할로알킬기, 할로겐 원자, OH 기, OR27 기, SH 기, S(O)pR27 기, COR27 기, CO2R27 기, C(O)SR27 기, C(O)NR29R30 기, CHO 기, CR27=NOR36 기, CH=CR37CO2R27 기, CH2CHR37CO2R27 기, CO2N=CR31R32 기, 니트로기, 시아노 기, NHSO2R33 기, NHSO2NHR33 기, NR27R38 기, NH2 기 또는 하나 이상의 동일하거나 상이한 C1-C4 알킬기로 치환될 수 있는 페닐기이고;
    p 는 0, 1 또는 2 이고;
    R3 는 C1-C2 알킬기, C1-C2 할로알킬기, OCH3 기, SCH3 기, OCHF2 기, 할로겐 원자, 시아노기 또는 니트로기이고;
    R4 는 수소 원자, C1-C3 알킬기, C1-C3 할로알킬기 또는 할로겐 원자이고;
    R5 는 수소 원자, C1-C3 알킬기, 할로겐 원자, C1-C3 할로알킬기, 시클로프로필기, 비닐기, C2 알키닐기, 시아노기, C(O)R38 기, CO2R38 기, C(O)NR38R39 기, CR34R35CN 기, CR34R35C(O)R38 기, CR34R35CO2R38 기, CR34R35C(O)NR38R39 기, CHR34OH 기, CHR34OC(O)R38 기 또는 OCHR34OC(O)NR38R39 기이거나, 또는 G 가 G-2 또는 G-6 일 때, R4 및 R5 는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 C=O 기를 형성할 수 있으며;
    R6 는 C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C2-C6 알콕시알킬기, C3-C6 알케닐기 또는 C3-C6 알키닐기이고;
    X1 은 단일 결합, 산소 원자, 황 원자, NH 기, N(C1-C3 알킬)기, N(C1-C3 할로알킬)기 또는 N(알릴)기이고;
    R7 는 수소 원자, C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, 할로겐 원자, S(O)2(C1-C6 알킬)기 또는 C(=O)R40 기이고;
    R8 는 수소 원자, C1-C8 알킬기, C3-C8 시클로알킬기, C3-C8 알케닐기, C3-C8 알키닐기, C1-C8 할로알킬기, C2-C8 알콕시알킬기, C3-C8 알콕시알콕시알킬기, C3-C8 할로알키닐기, C3-C8 할로알케닐기, C1-C8 알킬술포닐기, C1-C8 할로알킬술포닐기, C3-C8 알콕시카르보닐알킬기, S(O)2NH(C1-C8 알킬)기, C(O)R41 기, 또는 페닐 고리가 R42 로 치환될 수 있는 벤질기이고;
    n 및 m 은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3 이고 m + n 은 2 또는 3 이며;
    Z 는 CR9R10 기, 산소 원자, 황 원자, S(O) 기, S(O)2 기 또는 N(C1-C4 알킬)기이고;
    각 R9 는 독립적으로 수소 원자, C1-C3 알킬기, 할로겐 원자, 히드록시기, C1-C6 알콕시기, C1-C6 할로알킬기, C1-C6 할로알콕시기, C2-C6 알킬카르보닐옥시기 또는 C2-C6 할로알킬카르보닐옥시기이고;
    각 R10 은 독립적으로 수소 원자, C1-C3 알킬기, 및 히드록시기 또는 할로겐원자이고;
    R11 및 R12 는 독립적으로 수소 원자, 할로겐 원자, C1-C6 알킬기, C3-C6 알케닐기 또는 C1-C6 할로알킬기이고;
    R13 는 수소 원자, C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C3-C6 알케닐기, C3-C6 할로알케닐기, C3-C6 알키닐기, C3-C6 할로알키닐기, HC(=O) 기, (C1-C4 알킬)C(=O) 기 또는 NH2 기이고;
    R14 는 C1-C6 알킬기, C1-C6 알킬티오기, C1-C6 할로알킬기 또는 N(CH3)2 기이고;
    W 는 질소 원자 또는 CR15 이고;
    R15 는 수소 원자, C1-C6 알킬기, 할로겐 원자, 또는 C1-C6 알킬기, 하나 또는 두 개의 할로겐 원자, C1-C6 알콕시기 또는 CF3 기로 치환될 수 있는 페닐기이고;
    각 Q 는 독립적으로 산소 원자 또는 황 원자이고;
    Q1 은 산소 원자 또는 황 원자이고;
    Z1 은 CR16R17 기, 산소 원자, 황 원자, S(O) 기, S(O)2 기 또는 N(C1-C4 알킬)기이고;
    각 R16 는 독립적으로 수소 원자, 할로겐 원자, 히드록시기,C1-C6 알콕시기, C1-C6 할로알킬기, C1-C6 할로알콕시기, C2-C6 알킬카르보닐옥시기 또는 C2-C6 할로알킬카르보닐옥시기이고;
    각 R17 은 독립적으로 수소 원자, 히드록시기 또는 할로겐 원자이고;
    R18 은 C1-C6 알킬기, 할로겐 원자 또는 C1-C6 할로알킬기이고;
    R19 및 R20 는 독립적으로 수소 원자, C1-C6 알킬기 또는 C1-C6 할로알킬기이고;
    Z2 은 산소 원자, 황 원자, NR9 기 또는 CR9R10 기이고;
    R21 및 R22 는 독립적으로 C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C3-C6 알케닐기, C3-C6 할로알케닐기, C3-C6 알키닐기 또는 C3-C6 할로알키닐기이고;
    R23 은 수소 원자, 할로겐 원자 또는 시아노기이고;
    R24 는 C1-C6 알킬술포닐기, C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C3-C6 알케닐기, C3-C6 알키닐기, C1-C6 알콕시기, C1-C6 할로알콕시기 또는 할로겐 원자이고;
    R25 는 C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C3-C6 알케닐기 또는 C3-C6 알키닐기이고;
    R26 는 C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, 또는 C1-C6 알킬기, 하나 또는 두 개의 할로겐 원자, 하나 또는 두 개의 니트로기, C1-C6 알콕시기 또는 CF3 기로 치환될 수 있는 페닐기이고;
    W1 는 질소 원자 또는 CH 기이고;
    T 는 하기의 화학식 T-1, T-2 및 T-3 중 하나로 표현되는 기이고 :
    Figure 112007080679067-PAT00025
    (식중, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, E10, E11 및 E12 는 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬기이다);
    R27 는 C1-C8 알킬기, C3-C8 시클로알킬기, C3-C8 알케닐기, C3-C8 알키닐기, C1-C8 할로알킬기, C2-C8 알콕시알킬기, C2-C8 알킬티오알킬기, C2-C8 알킬술피닐알킬 기, C2-C8 알킬술포닐알킬기, C1-C8 알킬술포닐기, 페닐 고리가 할로겐 원자 및 C1-C4 알킬기로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 페닐술포닐기, C4-C8 알콕시알콕시알킬기, C4-C8 시클로알킬알킬기, C6-C8 시클로알콕시알킬기, C4-C8 알케닐옥시알킬기, C4-C8 알키닐옥시알킬기, C3-C8 할로알콕시알킬기, C4-C8 할로알케닐옥시알킬기, C4-C8 할로알키닐옥시알킬기, C6-C8 시클로알킬티오알킬기, C4-C8 알케닐티오알킬기, C4-C8 알키닐티오알킬기, 고리가 할로겐 원자, C1-C3 알킬기 및 C1-C3 할로알킬기로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 치환체로 치환된 페녹시기로 치환된 C1-C4 알킬기, 고리가 할로겐 원자, C1-C3 알킬기 및 C1-C3 할로알킬기로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 치환체로 치환된 벤질옥시기, C4-C8 트리알킬실릴알킬기, C3-C8 시아노알킬기, C3-C8 할로시클로알킬기, C3-C8 할로알케닐기, C5-C8 알콕시알케닐기, C5-C8 할로알콕시알케닐기, C5-C8 알킬티오알케닐기, C3-C8 할로알키닐기, C5-C8 알콕시알키닐기, C5-C8 할로알콕시알키닐기, C5-C8 알킬티오알키닐기, C2-C8 알킬카르보닐기, 고리가 할로겐 원자, C1-C3 알킬기 및 C1-C3 할로알킬기로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 치환체로 치환된 벤질기, CHR34COR28 기, CHR34COOR28 기, CHR34P(0)(OR28)2 기, CHR34P(S)(OR28)2 기 , CHR34C(0)NR29R30 기 또는 CHR34C(0)NH2 기이고;
    R28 는 C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기, C3-C6 알키닐기 또는 테트라히드로푸라닐기이고;
    R29 및 R31 은 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
    R30 및 R32 는 독립적으로 C1-C4 알킬기, 또는 고리가 할로겐 원자, C1-C3 알킬기 및 C1-C3 할로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 페닐기이거나; 또는
    R29 와 R30 은 함께 -(CH2)5-, (CH2)4- 또는 -CH2CH2OCH2CH2- 를 형성할 수 있으며, 또는 이렇게 형성된 고리는 C1-C3 알킬기, 페닐기 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있으며;
    R31 및 R32 는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 C3-C8 시클로알킬기를 형성할 수 있고;
    R33 는 C1-C4 알킬기, C1-C4 할로알킬기 또는 C3-C6 알케닐기이고;
    R34 및 R35 는 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
    R36 은 수소 원자, C1-C6 알킬기, C3-C6 알케닐기 또는 C3-C6 알키닐기이고;
    R37 은 수소 원자, C1-C4 알킬기 또는 할로겐 원자이고;
    R38 은 수소 원자, C1-C6 알킬기, C3-C6 시클로알킬기, C3-C6 알케닐기, C3-C6 알키닐기, C2-C6 알콕시알킬기, C1-C6 할로알킬기, 고리가 할로겐 원자, C1-C4 알킬기 및 C1-C4 알콕시기로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 페닐기, -CH2CO2(C1-C4 알킬)기 또는 -CH(CH3)CO2(C1-C4 알킬)기이고;
    R39 는 수소 원자, C1-C2 알킬기 또는 C(O)O(C1-C4 알킬)기이고;
    R40 은 수소 원자, C1-C6 알킬기, C1-C6 알콕시기 또는 NH(C1-C4 알킬)기이고;
    R41 은 C1-C6 알킬기, C1-C6 할로알킬기, C1-C6 알콕시기, NH(C1-C6 알킬)기, 고리가 R42 기, 벤질기 및 C2-C8 디알킬아미노기로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나의 치환체로 치환될 수 있는 페닐기이고;
    R42 는 C1-C6 알킬기, 하나 또는 두 개의 할로겐 원자, C1-C6 알콕시기 또는 CF3 기이다];
    (3) 하기 화학식 (2) 의 화합물 또는 니필라크로펜:
    [화학식 2]
    Figure 112007080679067-PAT00026
    [식중, R43 은 C1-C4 알킬기이고;
    R44 는 C1-C4 알킬기, C1-C4 알킬티오기, C1-C4 알콕시기, C1-C4 할로알킬기, C1-C4 할로알킬티오기 또는 C1-C4 할로알콕시기이고;
    R43 및 R44 는 함께 -(CH2)3- 또는 -(CH2)4- 를 형성할 수 있고;
    R45 는 수소 원자 또는 할로겐 원자이고;
    R46 은 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
    R47 은 수소 원자, 니트로기, 시아노기, -COOR49기, -C(=X)NR50R51 기 또는 -C(=X2)R52 기이고;
    R48 은 수소 원자, 할로겐 원자, 시아노기, 할로겐 원자 및 히드록시기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기, C1- C4 알콕시기, 할로겐 원자, 니트로기, 시아노기, C1-C4 알킬기, C1-C4 알콕시기 및 할로-C1-C4 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 페닐기, 피롤릴기, C2-C8 알킬기, C3-C8 알케닐기, C3-C8 알키닐기, C3-C8 알콕시기, 하나 이상의 산소 원자가 삽입된 C2-C8 알킬기, C3-C8 알케닐기, C3-C8 알키닐기 및 C3-C8 알콕시기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 기; 또는 하기의 화학식으로 표현되는 기들중 하나이고:
    Figure 112007080679067-PAT00027
    R49, R50 및 R52 는 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
    R50 및 R51 은 이들이 결합된 질소 원자와 함께 포화 지환족 5 또는 6 원 고리를 형성할 수 있으며;
    R52 는 수소 원자, C1-C4 알킬기, 또는 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 C1-C4 알킬기이고;
    R53 은 수소 원자, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C2-C6 알케닐기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C3-C6 알키닐기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 페닐기, C3-C8 시클로알킬기, 시아노메틸기, 또는 R63CO- 기이고;
    R54 는 수소 원자, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C6 알킬기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C2-C6 알케닐기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C3-C6 알키닐기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 페닐기, C3-C8 시클로알킬기, 시아노메틸기, C1-C4 알콕시-C1-C6 알킬기, 디-C1-C4 알킬아미노-C1-C4 알킬기, 테트라히드로푸르푸릴메틸기, C3-C6 알키닐옥시-C1-C4 알킬기, 고리가 할로겐 원자, 니트로기, 시아노기, C1-C4 알킬기, C1-C4 알콕시기 및 할로-C1-C4 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된 치환체로 치환될 수 있는 벤질기, -C(=X2)R63 기, -(CH2)a-(O)d-R70 기, -(CH2)a-O-(CH2)b-R70 기, -(CH2)a-X2-R76 기이고;
    R53 및 R54 는 이들이 결합된 질소 원자와 함께, 하나의 탄소 원자가 산소 원자로 대체될 수도 있는 포화 지환족 3, 5 또는 6 원 고리, 또는 방향족 5 또는 6 원 고리를 형성할 수 있으며;
    R55 는 수소 원자, C1-C4 알킬기, C2-C6 알케닐기 또는 C3-C6 알키닐기이거나, 또는 R55 및 R56 은 함께 -(CH2)e- 를 형성할 수 있으며;
    R56 및 R57 은 독립적으로 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C2-C6 알케닐기, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C3-C6 알키닐기, 또는 하나 이상의 할로겐 원자, 수소 원자, C3-C6 시클로알킬기, -XR60 기 또는 -NR61R62 기로 치환될 수 있는 페닐기이고;
    R58 은 수소 원자, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기, C3-C6 알키닐기, C1-C4 알킬카르보닐기, 시아노-C1-C3 알킬기, C1-C4 알콕시카르보닐-C1-C4 알킬기, 디-C1-C4 알콕시카르보닐-C1-C4 알킬기, 벤질기, C1-C4 알콕시-C1-C4 알키닐기, -(CH2)a-R75 기, -(CH2)a-X2-R72 기, -(CH2)a-X2-(CH2)b-R72 기 또는 -(CH2)a-X2-(CH2)b-X2-(CH2)c-R72 기이고;
    R59 는 수소 원자, C1-C4 알킬기, C2-C6 알케닐기, C3-C6 알키닐기, 시아노-C1-C3 알킬기, C1-C4 알킬카르보닐-C1-C3 알킬기 또는 페닐기이고;
    R60 은 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기이고;
    R61 및 R62 는 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
    R63 은 하나 이상의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기, C1-C4 알콕시-C1-C4 알킬기, C1-C4 알킬티오-C1-C4 알킬기, C3-C6 시클로알킬기, 고리가 할로겐 원자, 니트로기, 시아노기, C1-C4 알킬기, C1-C4 알콕시기 및 할로-C1-C4 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된 치환체로 치환될 수 있는 페닐기, -NR73R74 기 또는 -(CH2)a-(O)d-R75 기이고;
    R64 는 C1-C4 알콕시카르보닐기 또는 카르복실기이고;
    R65 는 클로로메틸기, 시아노메틸기, 하나 이상의 산소 원자가 삽입될 수 있 는 C3-C6 시클로알킬기, 또는 C1-C4 알콕시카르보닐-C1-C4 알킬기이고;
    R66 는 히드록시기 또는 -NR67R68 기이고;
    A 는 -NR67R68 기 또는 -S(0)f-R69 기이고;
    R67 및 R68 은 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기이고;
    R69 는 C1-C4 알킬기 또는 C1-C4 할로알킬기이고;
    R70 은 수소 원자, 히드록시기, 할로겐 원자, 하나 이상의 C1-C4 알콕시기로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬기, 하나 이상의 산소 원자가 삽입될 수 있는 C3-C6 시클로알킬기, 하나 또는 두 개의 메틸기로 치환될 수 있는 C3-C6 시클로알킬기, 푸릴기, 티에닐기 또는 -C(=O)R71 기이고;
    R71 및 R72 는 동일하거나 상이하며, C1-C4 알킬기 또는 C1-C4 알콕시기이고;
    R73 및 R74 는 동일하거나 상이하며, C1-C4 알킬기 또는 페닐기이고;
    R75 는 하나 이상의 산소 원자가 삽입될 수 있는 C3-C6 시클로알킬기, 하나 또는 두 개의 메틸기로 치환될 수 있는 C3-C6 시클로알킬기, 푸릴기, 티에닐기 또는 -C(=O)R71 기이고;
    R76 은 C1-C4 알킬기이고;
    a, b 및 c 는 독립적으로 1, 2 또는 3 이고;
    d 는 0 또는 1 이고;
    e 는 2 또는 3 이고;
    f 는 1 또는 2 이고;
    X2 는 산소 원자 또는 황 원자임].
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