ES2319346T3 - Plantas transgenicas tolerantes a los herbicidas en las cuales el herbicida inhibe la biosintesis de la porfirina. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A PLANTAS RESISTENTES A COMPUESTOS PARA EL CONTROL DE LAS MALAS HIERBAS, LAS CUALES SE PRODUCEN MEDIANTE LA INTRODUCCION DE UN GEN QUE CODIFICA PARA UNA PROTEINAS QUE TIENE LAS SIGUIENTES CARACTERISTICAS (A) A (C): (A) TIENE UNA AFINIDAD ESPECIFICA PARA UNA SUSTANCIA RELACIONADA CON LA ACTIVIDAD DE CONTROL DE LAS MALAS HIERBAS DE UN COMPUESTO DE CONTROL DE LAS MISMAS; (B) PRACTICAMENTE NO TIENE CAPACIDAD DE MODIFICACION DE UNA SUSTANCIA PARA LA CUAL DICHA PROTEINA TIENE UNA ACTIVIDAD ESPECIFICA; Y (C) ESTA PRACTICAMENTE EXENTA DE REGIONES ESTRUCTURALES DE LAS REGIONES VARIABLES DE UNA INMUNOGLOBULINA, EN UNA CELULA VEGETAL; Y LA EXPRESION DE DICHO GEN.
Description
Plantas transgénicas tolerantes a los herbicidas
en las cuales el herbicida inhibe la biosíntesis de la
porfirina.
La presente invención se refiere a un método
para proporcionar a las plantas resistencia a compuestos para el
control de malas hierbas.
El control de las malas hierbas es un trabajo
muy importante para mejorar los rendimientos y la calidad de las
plantas cultivadas. Para este fin, se utilizan principalmente
compuestos para el control de las malas hierbas tales como los
herbicidas. Sin embargo, para utilizar compuestos para el control de
las malas hierbas, no siempre es fácil distinguir las plantas
cultivadas de las malas hierbas de especies aliadas para controlar
selectivamente sólo las malas hierbas. En ese caso, se ha intentado
la producción de plantas que tienen resistencia a los compuestos
para el control de las malas hierbas (en adelante referida como
resistencia al compuesto de control de las malas hierbas) y se han
puesto en uso práctico algunas plantas resistentes.
Recientemente, se han utilizado técnicas de
ingeniería genética para producir plantas que tienen resistencia a
compuestos para el control de las malas hierbas. En cuanto a
semejante técnica, por ejemplo, Hinchee, M.A.W. et al.
describen un método para producir una planta que tiene resistencia a
un herbicida, glifosato, donde el gen
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) que es una enzima diana del glifosato es sometido a
mutagénesis de manera que se reduce la afinidad por el glifosato, y
el gen es introducido en una planta [Hinchee, M.A.W. et al.,
BIO/TECHNOLOGY, 6: pág. 915 (1988)].
Las variedades de métodos conocidos para
proporcionar resistencia a compuestos para el control de las malas
hierbas a las plantas no son necesariamente suficientes y se ha
deseado desarrollar diversas clases adicionales de métodos para
proporcionar resistencia a compuestos para el control de las malas
hierbas a plantas.
El objeto principal de la presente invención es
proporcionar una nueva clase de método para proporcionar resistencia
a compuestos para el control de las malas hierbas a plantas.
Este objeto así como otros objetos y ventajas de
la presente invención se harán evidentes para los expertos en la
técnica a partir de la siguiente descripción con referencia a los
dibujos adjuntos.
La Fig. 1 es un mapa de restricción del plásmido
pETBCH. bchH es un gen de la subunidad de unión a la protoporfirina
IX de la magnesio quelatasa de una bacteria fotosintética
Rhodobacter sphaeroides. T7 pro representa la secuencia
promotora del fago T7, y T7 ter representa la secuencia terminadora
del fago T7. Amp^{r} es el gen de resistencia a ampicilina,
lacI^{q} es un gen de la proteína represora de un operón lactosa,
y ori es el origen de replicación.
La Fig. 2 es el mapa de restricción del plásmido
pACYCSP. PPO es el gen de la protoporfirinógeno oxidasa IX de soja
y lac pro representa la secuencia promotora de un operón lactosa.
Cm^{r} es un gen resistente a cloranfenicol y ori es el origen de
replicación.
La Fig. 3 es el mapa de restricción del plásmido
pTVBCH. bchH es el gen de la subunidad de unión a la protoporfirina
IX de la magnesio quelatasa de la bacteria fotosintética
Rhodobacter sphaeroides. lac pro representa la secuencia
promotora de un operón lactosa. Amp^{r} es un gen resistente a
ampicilina y ori es el origen de replicación.
La Fig. 4 es el mapa de restricción del plásmido
pBIBCH. bchH es el gen de la subunidad de unión a la protoporfirina
IX de la magnesio quelatasa de la bacteria fotosintética
Rhodobacter sphaeroides. NP es la secuencia promotora de un
gen de la nopalina sintasa, NT es la secuencia terminadora del gen
de la nopalina sintasa, y 35S es el promotor de 35S del virus del
mosaico de la coliflor. NPTII representa un gen resistente a la
kanamicina, y RB y LB representan las secuencias limítrofes derecha
e izquierda del ADN-T respectivamente.
La Fig. 5 es el mapa de restricción del plásmido
pNO. NP es la secuencia promotora de un gen de la nopalina sintasa,
NT es la secuencia terminadora del gen de la nopalina sintasa, y 35S
es el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor. NPTII
representa un gen de resistencia a la kanamicina, y RB y LB
representan las secuencias limítrofes derecha e izquierda del
ADN-T, respectivamente.
La Fig. 6 es el mapa de restricción del plásmido
pTCHLH. TCHLH es el gen de la subunidad de unión a protoporfirina
IX de la magnesio quelatasa de tabaco cuya señal de tránsito a
cloroplastos ha sido suprimida. lac pro representa la secuencia
promotora de un operón lactosa. Am^{r} es un gen de resistencia a
ampicilina, Km^{r} es un gen de resistencia a kanamicina y ori es
el origen de replicación.
La Fig. 7 es el mapa de restricción del plásmido
pBITCHLH. TCHLH es la subunidad de unión a la protoporfirina IX de
la magnesio quelatasa de tabaco cuya señal de tránsito a
cloroplastos ha sido suprimida. NP es la secuencia promotora de la
nopalina sintasa, NT es la secuencia terminadora de la nopalina
sintasa y 35S es el promotor de 35S del virus del mosaico de la
coliflor. NPTII representa un gen de resistencia a la kanamicina, y
RB y LB representan las secuencias limítrofes derecha e izquierda
del ADN-T, respectivamente.
La Fig. 8 es el mapa de restricción del plásmido
pTVGMP. GMP es el gen de la protoporfirinógeno IX oxidasa de soja
cuya señal de tránsito a cloroplastos y cuya secuencia de unión a
FAD han sido suprimidas. lac pro representa la secuencia promotora
de un operón lactosa. Amp^{r} representa un gen de resistencia a
ampicilina y ori es el origen de replicación.
La Fig. 9 es el mapa de restricción del plásmido
pBIGMP. GMP es el gen de la protoporfirinógeno oxidasa de soja cuya
señal de tránsito a cloroplastos y cuya secuencia FAD han sido
suprimidas. NP es la secuencia promotora de una nopalina sintasa y
NT es la secuencia terminadora de una nopalina sintasa, y 35S es el
promotor de 35S del virus del mosaico de la coliflor. NPTII es un
gen de resistencia a la kanamicina, y RB y LB las secuencias
limítrofes derecha e izquierda del ADN-T,
respectivamente.
La Fig. 10 es el mapa de restricción del
plásmido pTVCRP. CRP es el gen de la protoporfirinógeno oxidasa de
Chlamydomonas reinhardtii cuya señal de tránsito a
cloroplastos y cuya secuencia FAD han sido suprimidas. lac pro
representa la secuencia promotora de un operón lactosa. Amp^{r} es
un gen de resistencia a ampicilina y ori es el origen de
replicación.
La Fig. 11 es el mapa de restricción del
plásmido, pBICRP. CRP es el gen de la protoporfirinógeno oxidasa de
Chlamydomonas reinhardtii cuya señal de tránsito a
cloroplastos y cuya secuencia de unión a FAD han sido suprimidas.
NP es la secuencia promotora de una nopalina sintasa y NT es la
secuencia terminadora de una nopalina sintasa, y 35S es el promotor
de 35S del virus del mosaico de la coliflor. NPTII es un gen de
resistencia a la kanamicina, y RB y LB son las secuencias limítrofes
derecha e izquierda del ADN-T, respectivamente.
La Fig. 12 es el mapa de restricción del
plásmido pTVHVF1. HVF el gen de la ferroquelatasa de la cebada cuya
secuencia señal ha sido suprimida. lac pro representa la secuencia
promotora de un operón lactosa. Amp^{r} representa un gen de
resistencia a ampicilina y ori es el origen de replicación.
La Fig. 13 es el mapa de restricción del
plásmido pBIHVF. HVF es el gen de la ferroquelatasa de la cebada
cuya secuencia señal ha sido suprimida. NP es la secuencia promotora
de una nopalina sintasa y NT es la secuencia terminadora de una
nopalina sintasa, y 35S es el promotor de 35S del virus del mosaico
de la coliflor. NPTII es un gen de resistencia a la kanamicina, y
RB y LB son las secuencias limítrofes derecha e izquierda del
ADN-T, respectivamente.
La Fig. 14 es el mapa de restricción del
plásmido pTVCSF. CSF es el gen de la ferroquelatasa de pepino cuya
secuencia señal ha sido suprimida. lac pro representa la secuencia
promotora de un operón lactosa. Amp^{r} es un gen de resistencia
a ampicilina, y ori es el origen de replicación.
La Fig. 15 es el mapa de restricción del
plásmido pBICSF. CSF es el gen de la ferroquelatasa de pepino cuya
secuencia señal ha sido suprimida. NP es la secuencia promotora de
una nopalina sintasa y NT es la secuencia terminadora de una
nopalina sintasa, y 35S es el promotor de 35S del virus del mosaico
de la coliflor. NPTII es un gen de resistencia a la kanamicina, y
RB y LB son las secuencias limítrofes derecha e izquierda del
ADN-T, respectivamente.
La Fig. 16 es el mapa de restricción del
plásmido pHEMF. HEMF es el gen de la coproporfirinógeno III oxidasa
(hemF) de Escherichia coli. lac pro es la secuencia promotora
de un operón lactosa. Amp^{r} es un gen de resistencia a
ampicilina, y ori es el origen de replicación.
La Fig. 17 es el mapa de restricción del
plásmido pBIHEMF. HEMF es el gen de la coproporfirinógeno III
oxidasa (hemF) de Escherichia coli. NP es la secuencia
promotora de una nopalina sintasa y NT es la secuencia terminadora
de una nopalina sintasa, y 35S es el promotor de 35S del virus del
mosaico de la coliflor. NPTII es un gen de resistencia a la
kanamicina, y RB y LB son las secuencias limítrofes derecha e
izquierda del ADN-T, respectivamente.
La Fig. 18 es el mapa de restricción del
plásmido pBIHASYS8. HASYS8 es un gen que codifica la proteína
MG(HASYS)_{8}. NP es la secuencia promotora de una
nopalina sintasa y NT es la secuencia terminadora de una nopalina
sintasa, y 35S es el promotor de 35S del virus del mosaico de la
coliflor. NPTII es un gen de resistencia a la kanamicina, y RB y LB
son las secuencias limítrofes derecha e izquierda del
ADN-T, respectivamente.
La Fig. 19 es el mapa de restricción del
plásmido pBIRASSL8. RASSL8 es la proteína
MG(RASSL)_{8}. NP es la secuencia promotora de una
nopalina sintasa y NT es la secuencia terminadora de una nopalina
sintasa, y 35S es el promotor de 35S del virus del mosaico de la
coliflor. NPTII es un gen de resistencia a la kanamicina, y RB y LB
son las secuencias limítrofes derecha e izquierda del
ADN-T, respectivamente.
En estas circunstancias, los autores de la
presente invención han estudiado intensamente con el fin de
desarrollar una nueva clase de métodos para proporcionar
resistencia a los compuestos para el control de las malas hierbas a
las plantas. Como resultado, han descubierto que se puede
proporcionar resistencia a los compuestos para el control de las
malas hierbas a las plantas permitiendo que las plantas produzcan
cierta proteína en las células de la planta. De este modo, se ha
completado la presente invención.
Esto es, la presente invención proporciona los
siguientes apartados:
- 1.
- Un método para elaborar plantas resistentes a compuestos para el control de las malas hierbas que comprende las etapas de
- (a)
- introducir en una célula vegetal un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en:
- \quad
- magnesio quelatasa de tipo activo o inactivo que tiene afinidad por la protoporfirina IX;
- \quad
- ferroquelatasa de tipo activo o inactivo que tiene afinidad por la protoporfirina IX;
- \quad
- cobalto quelatasa de tipo activo o inactivo que tiene afinidad por la protoporfirina IX,
- \quad
- un péptido que tiene afinidad por la protoporfirina IX, compuesto por 6 a 100 aminoácidos, estando dicho péptido sustancialmente libre de regiones marco de regiones variables de una inmunoglobulina;
- \quad
- protoporfirinógeno IX oxidasa de tipo inactivo que tiene afinidad por el protoporfirinógeno IX; y coproporfirinógeno III oxidasa de tipo activo o inactivo que tiene afinidad por el protoporfirinógeno IX,
- \quad
- no teniendo sustancialmente dicha proteína capacidad de modificar el protoporfirinógeno IX; y
- (b)
- expresar el gen.
- 2.
- El método de acuerdo con el apartado 1, donde el compuesto para el control de las malas hierbas está inhibiendo la biosíntesis de porfirina de una planta.
- 3.
- El método de acuerdo con el apartado 1 o 2, donde el compuesto para el control de las malas hierbas es un compuesto herbicida de tipo inhibidor de la proto-porfirinógeno IX oxidasa.
- 4.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 3, donde la proteína es una magnesio quelatasa o una variante de dicha proteína que tiene una afinidad específica por la protoporfirina IX.
- 5.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 3, donde la proteína es la proteína de la subunidad de unión a protoporfirina IX de la magnesio quelatasa, o una variante de dicha proteína que tiene afinidad específica por la protoporfirina IX.
- 6.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 5, donde la magnesio quelatasa deriva de un microorganismo fotosintético o una planta.
- 7.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 6, donde la magnesio quelatasa deriva de tabaco.
- 8.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 3, donde la proteína es una protoporfirinógeno IX oxidasa variante que no tiene capacidad para oxidar el protoporfirinógeno IX y que tiene afinidad específica por el protoporfirinógeno IX.
- 9.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 3, donde la proteína es protoporfirinógeno IX oxidasa variante que no tiene capacidad para oxidar el protoporfirinógeno IX y que tiene una afinidad específica por el compuesto herbicida de tipo inhibidor de la protoporfirinógeno IX oxidasa.
- 10.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 3, 8 o 9, donde la protoporfirinógeno IX oxidasa deriva de una planta.
- 11.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 3 u 8 a 10, donde la protoporfirinógeno IX oxidasa deriva de soja.
\newpage
- 12.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 3, 8 o 9, donde la protoporfirinógeno IX oxidasa deriva de algas.
- 13.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 3, 8, 9 o 12, donde la protoporfirinógeno IX oxidasa deriva de Chlamydomonas.
- 14.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 3, donde la proteína es ferroquelatasa o una variante de dicha proteína que tiene una afinidad específica por la protoporfirina IX.
- 15.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 3 o 14, donde la ferroquelatasa deriva de una planta.
- 16.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 3, 14 o 15, donde la ferroquelatasa deriva de cebada o pepino.
- 17.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 3, donde el péptido comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, o SEQ ID NO: 60.
- 18.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 3, o 17, donde el péptido comprende la repetición de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 53, 55, 57 o 59 cuatro veces u ocho veces.
- 19.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 3, donde la proteína es coproporfirinógeno III oxidasa o una variante de dicha proteína que tiene afinidad específica por el protoporfirinógeno IX.
- 20.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 3 o 19, donde la coproporfirinógeno III oxidasa deriva de un microorganismo.
- 21.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 3, 19 o 20, donde la coproporfirinógeno III oxidasa deriva de Escherichia coli.
- 22.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 21, donde el gen es introducido en la célula vegetal de forma que está ligado operablemente a un promotor y un terminador ambos los cuales son funcionales en la célula vegetal.
- 23.
- El método del apartado 1, donde el compuesto para el control de las malas hierbas está inhibiendo la trasferencia de electrones en la fotosíntesis, la biosíntesis de carotenoides, la biosíntesis de aminoácidos, la biosíntesis de lípidos o la biosíntesis de pared celular, influyendo en la biosíntesis de proteínas, la biosíntesis de ácidos nucleicos o la división celular o tiene una actividad antagónica de la auxina.
- 24.
- El método del apartado 23, donde el compuesto para el control de las malas hierbas que inhibe la transferencia de electrones en la fotosíntesis es un compuesto que inhibe la transferencia de electrones del sistema fotoquímico I o II o que inhibe la 4-hidroxifenil-piruvato dioxigenasa (4-HPPD); el que inhibe la biosíntesis de carotenoides es un compuesto que inhibe la fitoeno-desaturasa (PDS); el que inhibe la biosíntesis de aminoácidos es un compuesto que inhibe EPSPS, acetolactato sintasa (ALS), glutamina sintetasa (GS) o dihidropteroato sintasa (DHP); el que inhibe la biosíntesis de lípidos es un compuesto que inhibe la acetil CoA carboxilasa (ACC); el que inhibe la biosíntesis de la pared celular es un compuesto que inhibe la biosíntesis de celulosa; el que influye en la biosíntesis de proteínas, la biosíntesis de ácidos nucleicos o la división de la pared celular es un compuesto que inhibe la formación de microtúbulos; o el que tiene actividad antagónica de auxina es un compuesto que potencia la elongación y diferenciación celular.
- 25.
- El método del apartado 24, donde el compuesto que inhibe la transferencia de electrones en el sistema fotosintético I es paracuat o dicuat; el que inhibe la transferencia de electrones en el sistema fotoquímico II es un compuesto de triazina, un compuesto de urea o un compuesto de nitrilo; el que inhibe 4-HPPD es un isoxazol, pirazol o tricetona; el que inhibe la PDS es norflurazon, flurocloridon, fluridona, flurtamona o diflufenican; el que inhibe la EPSPS es glifosato; el que inhibe la ALS es una sulfonilurea, una imidazolinona, un pirimidiniltiobenzoato o una triazolopirimidina; el que inhibe la GS es bialafos o glufosinato; el que inhibe la DHP es asulam; el que inhibe la ACC es una ciclohexanediona o un ariloxifenoxipropionato; o el que inhibe celulosa es diclobenilo.
- 26.
- El método de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 22, donde el compuesto para el control de las malas hierbas es un compuesto herbicida de tipo inhibidor de protoporfirinógeno IX oxidasa seleccionado entre los compuestos de los apartados (1) a (3) de más abajo:
- (1)
- clormetoxinil, bifenox, clornitrofen, acifluorfeno y su éster etílico, acifluorfen-sodio, oxifluorfen, oxadiazon, 2-[4-cloro-2-fluoro-5-(prop-2-iniloxi)fenil]-2,3,4,5,6,7-hexahidro-1H-isoindol-1,3-diona, clorftalim, TNPP-etilo, o N3-(1-feniletil)-2,6-dimetil-5-propionilnicotinamida;
- (2)
- un compuesto representado por la fórmula general: J-G (I), donde G es un grupo representado por una cualquiera de las siguientes fórmulas generales G-1 a G-9 y J es un grupo representado por una cualquiera de las siguientes fórmulas generales J-1 a J-30:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- donde las líneas discontinuas de las fórmulas J-5, J-6, J-12 y J-24 representan que el anillo de la izquierda contiene solamente enlaces sencillos, o un enlace en el anillo es un doble enlace entre átomos de carbono;
- X es un átomo de oxígeno o un átomo azufre;
- Y es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre;
- R^{1} es un átomo de hidrógeno o un átomo de halógeno;
- R^{2} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{8}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{8}, un átomo de halógeno, un grupo OH, un grupo OR^{27}, un grupo SH, un grupo S(O)_{p}R^{27}, un grupo OR^{27}, un grupo CO_{2}R^{27}, un grupo C(O)SR^{27}, un grupo C(O)NR^{29}R^{30}, un grupo CHO, un grupo CR^{27}=NOR^{36}, un grupo CH=CR^{37}CO_{2}R^{27}, un grupo CH_{2}CHR^{37} CO_{2}R^{27}, un grupo CO_{2}N=CR^{31}R^{32}, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo NHSO_{2}R^{33}, un grupo NHSO_{2}NHR^{33}, un grupo NR^{27}R^{38}, un grupo NH_{2} o un grupo fenilo opcionalmente sustituido con uno o más grupos alquilo C_{1}-C_{4} iguales o diferentes;
- p es 0, 1 o 2;
- R^{3} es un grupo alquilo C_{1}-C_{2}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{2}, un grupo OCH_{3}, un grupo SCH_{3}, un grupo OCHF_{2}, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo nitro;
- R^{4} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{3} o un átomo de halógeno;
- R^{5} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3}, un átomo de halógeno, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{3}, grupo ciclopropilo, un grupo vinilo, un grupo alquinilo C_{2}, un grupo ciano, un grupo C(O)R^{38}, un grupo CO_{2}R^{38}, un grupo C(O)NR^{38}R^{39}, un grupo CR^{34}R^{35}CN, un grupo CR^{34}R^{35}C(O)R^{38}, un grupo CR^{30}R^{35}CO_{2}R^{38}, un grupo CR^{34}R^{35}C(O)NR^{38}R^{39}, un grupo CHR^{34}OH, un grupo CHR^{34}OC(O)R^{38} o un grupo OCHR^{34}OC(O)NR^{38}R^{39}, o, cuando G es G-2 o G-6, R^{4} y R^{5} pueden formar un grupo C=O junto con el átomo de carbono al que están anclados;
- R^{6} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alcoxialquilo C_{2}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6} o un grupo alquinilo C_{3}-C_{6};
- X^{1} es un enlace sencillo, un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo NH, un grupo N(alquilo C_{1}-C_{3}), un grupo N(haloalquilo C_{1}-C_{3}) o un grupo N(alilo);
- R^{7} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un átomo de halógeno, un grupo S(O)_{2}(alquilo C_{1}-C_{6}) o un grupo C(=O)R^{40};
- R^{8} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{8}, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{8}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{8}, un grupo alcoxialquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alcoxialcoxialquilo C_{3}-C_{8}, un grupo alcoxialquinilo C_{3}-C_{8}, un grupo haloalquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquilsulfonilo C_{1}-C_{8}, un grupo haloalquilsulfonilo C_{1}-C_{8}, un grupo alcoxicarbonilalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo S(O)_{2}NH(alquilo C_{1}-C_{8}), un grupo C(O)R^{41} o un grupo bencilo cuyo anillo de fenilo puede estar sustituido con R^{42};
- n y m son independientemente 0, 1, 2 o 3 y m + n es 2 o 3;
- Z es un grupo CR^{9}R^{10}, un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo S(O), un grupo S(O)2 o un grupo N(alquilo C_{1}-C_{4});
- cada R^{9} es independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3}, un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo alquilcarboniloxi C_{2}-C_{6} o un grupo haloalquilcarboniloxi C_{2}-C_{6};
- cada R^{10} es independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3}, y un grupo hidroxilo o un átomo de halógeno;
- R^{11} y R^{12} son independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6} o un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6};
- R^{13} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6}, un grupo haloalquenilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6}, un grupo haloalquinilo C_{3}-C_{6}, un grupo HC(=O), un grupo (alquilo C_{1}-C_{4})C(=O) o un grupo NH_{2};
- R^{14} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquil(C_{1}-C_{6})tio, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6} o un grupo N(CH_{3})_{2};
- W es un átomo de nitrógeno o CR^{15};
- R^{15} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un átomo de halógeno, o un grupo fenilo opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, uno o dos átomos de halógeno, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6} o un grupo CF3;
- cada Q es independientemente un átomo de oxígeno o un átomo de azufre;
- Q^{1} es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre;
- Z^{1} es un grupo CR^{16}R^{17}, un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo S(O), un grupo S(O)2 o un grupo N(alquilo C_{1}-C_{4});
- cada R^{16} es independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo alquilcarboniloxi C_{2}-C_{6} o un grupo haloalquilcarboniloxi C_{2}-C_{6};
- cada R^{17} es independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un átomo de halógeno;
- R^{18} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un átomo de halógeno o un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6};
- R^{19} y R^{20} son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, o un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6};
- Z^{2} es un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo NR^{9} o un grupo CR^{9}R^{10};
- R^{21} y R^{22} son independientemente un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6}, un grupo haloalquenilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6} o un grupo haloalquinilo C_{3}-C_{6};
- R^{23} es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo ciano;
- R^{24} es un grupo alquil(C_{1}-C_{6})sulfonilo, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo haloalcoxi C_{1}-C_{6} o un átomo de halógeno;
- R^{25} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6} o un grupo alquinilo C_{3}-C_{6};
- R^{26} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6} o un grupo fenilo opcionalmente sustituido con C_{1}-C_{6} alquilo, uno o dos átomos de halógeno, uno o dos grupos nitro, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6} o un grupo CF3;
- W^{1} es un átomo de nitrógeno o un grupo CH;
- T es un grupo representado por una cualquiera de las siguientes fórmulas generales T-1, T-2 y T-3;
- (donde E^{1}, E^{2}, E^{3}, E^{4}, E^{5}, E^{6}, E^{7}, E^{8}, E^{9}, E^{10}, E^{11} y E^{12} son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{3});
- R^{27} es un grupo alquilo C_{1}-C_{8}, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{8}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{8}, un grupo alcoxialquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquiltioalquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquilsulfinil-alquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquilsulfonilalquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquilsulfonilo C_{1}-C_{8}, un grupo fenilsulfonilo cuyo anillo de fenilo puede estar sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno y un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alcoxialcoxialquilo C_{4}-C_{8}, un grupo cicloalquilalquilo C_{4}-C_{8}, un grupo cicloalcoxialquilo C_{6}-C_{8}, un grupo alqueniloxialquilo C_{4}-C_{8}, un grupo alquiniloxialquilo C_{4}-C_{8}, un grupo haloalcoxialquilo C_{3}-C_{8}, un grupo haloalqueniloxialquilo C_{3}-C_{8}, un grupo haloalquiniloxialquilo C_{3}-C_{8}, un grupo cicloalquiltioalquilo C_{6}-C_{8}, un grupo alqueniltioalquilo C_{4}-C_{8}, un grupo alquiniltioalquilo C_{4}-C_{8}, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} cuyo anillo está sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3} y un grupo haloalquilo C_{1}-C_{3}, un grupo benciloxi cuyo anillo está sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3} y un grupo haloalquilo C_{1}-C_{3}, un grupo trialquilsililalquilo C_{4}-C_{8}, un grupo cianoalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo halocicloalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo haloalquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alcoxialquenilo C_{5}-C_{8}, un grupo haloalcoxialquenilo C_{5}-C_{8}, un grupo alquiltioalquenilo C_{5}-C_{8}, un grupo alcoxialquinilo C_{3}-C_{8}, un grupo alcoxialquinilo C_{5}-C_{8}, un grupo haloalcoxialquinilo C_{5}-C_{8}, un grupo alquiltioalquinilo C_{5}-C_{8}, un grupo alquilcarbonilo C_{2}-C_{8}, un grupo bencilo cuyo anillo está sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3} y un grupo haloalquilo C_{1}-C_{3}, un grupo CHR^{34}COR^{28}, un grupo CHR^{34}COOR^{28}, un grupo CHR^{34}P(O)(OR^{28})_{2}, CHR^{34}P(S)(OR^{28})_{2}, un grupo CHR^{34}C(O)NR^{29}R^{30} o un grupo CHR^{34}C(O)NH_{2};
- R^{28} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6} o un grupo tetrahidrofuranilo;
- R^{29} y R^{31} son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{30} y R^{32} son independientemente un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un grupo fenilo cuyo anillo puede estar sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3} y un grupo haloalquilo C_{1}-C_{3}; o,
- R^{29} y R^{30} pueden formar juntos -(CH_{2})_{5}-, -(CH_{2})_{4}- o -CH_{2}CH_{2}OCH_{2}CH_{2}-, o el anillo formado de este modo puede estar sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo C_{1}-C_{3}, un grupo fenilo y un grupo bencilo; o,
- R^{31} y R^{32} pueden formar un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{8} junto con el átomo de carbono al que están anclados;
- R^{33} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{4} o un grupo alquenilo C_{3}-C_{6};
- R^{34} y R^{35} son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{36} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6} o un grupo alquinilo C_{3}-C_{6};
- R^{37} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un átomo de halógeno;
- R^{38} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6}, un grupo alcoxialquilo C_{2}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo fenilo cuyo anillo puede estar sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} y un grupo alcoxi C_{1}-C_{4}, un grupo -CH_{2}CO_{2}(alquilo C_{1}-C_{4}) o un grupo -CH(CH_{3})CO_{2-}(alquilo C_{1}-C_{4});
- R^{39} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{2} o un grupo C(O)O(alquilo C_{1}-C_{4});
- R^{40} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6} o un grupo NH(alquilo C_{1}-C_{6});
- R^{41} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo NH(alquilo C_{1}-C_{6}), un grupo fenilo cuyo anillo puede estar sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un grupo R^{42}, un grupo bencilo y un grupo dialquilamino C_{2}-C_{8}; y
- R^{42} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, uno o dos átomos de halógeno, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6} o un grupo CF3;
- (3)
- un compuesto de fórmula (II):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- o nipilacrofeno,
- donde R^{43} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{44} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alquil(C_{1}-C_{4})tio, un grupo alcoxi C_{1}-C_{4}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{4}, un grupo haloalquil(C_{1}-C_{4})tio o un grupo haloalcoxi C_{1}-C_{4};
- R^{43} y R^{44} pueden formar juntos -(CH_{2})_{3}- o -(CH_{2})_{4}-;
- R^{45} es un átomo de hidrógeno o un átomo de halógeno;
- R^{46} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{47} es un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo -COOR^{49}, un grupo -C(=X)NR^{50}R^{51} o un grupo -C(=X^{2})R^{52};
- R^{48} es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo ciano, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno y un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C_{1}-C_{4}, un grupo fenilo opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{4} y un grupo haloalquilo C_{1}-C_{4}, un grupo pirrolilo, un grupo alquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{8}, un grupo alcoxi C_{3}-C_{8}, un grupo seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{8} y un grupo alcoxi C_{3}-C_{8} en el que al menos se inserta un átomo de oxígeno, o uno cualquiera de los grupos representados por las siguientes fórmulas:
- donde R^{49}, R^{50} y R^{52} son, iguales o diferentes, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{50} y R^{51} pueden formar un anillo de 5 o 6 miembros alicíclico saturado junto con un átomo de nitrógeno al que están anclados;
- R^{52} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un grupo alquilo C_{1}-C_{4} sustituido con al menos un átomo de halógeno;
- R^{53} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo fenilo opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo cianometilo, o un grupo R^{63}CO-;
- R^{54} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo fenilo opcionalmente sustituido con átomo de halógeno, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo cianometilo, un grupo alcoxi(C_{1}-C_{4})alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo dialquil(C_{1}-C_{4})aminoalquilo C_{1}-C_{4}, un grupo tetrahidrofurfurilo, un grupo alquinil(C_{3}-C_{6})alquilo C_{1}-C_{4}, bencilo cuyo anillo puede estar sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{4} y un grupo haloalquilo C_{1}-C_{4}, un grupo -C(=X^{2})R^{63}, un grupo -(CH_{2})_{a}-(O)_{d}-R^{70}, un grupo -(CH_{2})_{a}-O-(CH_{2})_{b}-R^{70}, un grupo -(CH_{2})_{a}-X^{2}-R^{76};
- R^{53} y R^{54} junto con un átomo de nitrógeno al que están anclados pueden formar un anillo de 3, 5 o 6 miembros alicíclico saturado o un anillo de 5 o 6 miembros aromático en el que un átomo de carbono puede ser opcionalmente remplazado por un átomo de oxígeno;
- R^{55} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6} o un grupo alquinilo C_{3}-C_{6}, o R^{55} y R^{56} pueden formar juntos -(CH_{2})_{e}-;
- R^{56} y R^{57} son independientemente un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, alquinilo C_{3}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno o un grupo fenilo opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un átomo de hidrógeno, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6}, un grupo -XR^{60} o un grupo -NR^{61}R^{62};
- R^{58} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquilcarbonilo C_{1}-C_{4}, un grupo cianoalquilo C_{1}-C_{3}, un grupo alcoxicarbonil(C_{1}-C_{4})alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo dialcoxicarbonil(C_{1}-C_{4})alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo bencilo, un grupo alcoxil(C_{1}-C_{4})alquinilo C_{1}-C_{4}, un grupo -(CH_{2})_{a}-R^{75}, un grupo -(CH_{2})_{a}-X^{2}-R^{72}, un grupo -(CH_{2})_{a}-X^{2}-(CH_{2})_{b}-R^{72} o un grupo -(CH_{2})_{a}-X^{2}-(CH_{2})_{b}-X^{2}-(CH_{2})_{c}-R^{72};
- R^{59} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6}, un grupo cianoalquilo C_{1}-C_{3}, un grupo alquil(C_{1}-C_{4})carbonilalquilo C_{1}-C_{3} o un grupo fenilo;
- R^{60} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno;
- R^{61} y R^{62} son, iguales o diferentes, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{63} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alcoxi(C_{1}-C_{4})alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alquil(C_{1}-C_{4})tioalquilo C_{1}-C_{4}, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6}, un grupo fenilo cuyo anillo puede estar sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{4} y un grupo haloalquilo C_{1}-C_{4}, un grupo -NR^{73}R^{74} o un grupo -(CH_{2})_{a}-(O)_{d}-R^{75};
- R^{64} es un grupo alcoxicarbonilo C_{1}-C_{4} o un grupo carboxilo;
- R^{65} es un grupo clorometilo, un grupo cianometilo, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6} en el que al menos un átomo de oxígeno puede ser insertado, o un grupo alcoxicarbonil(C_{1}-C_{4})-alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{66} es un grupo hidroxilo o un grupo -NR^{67}R^{68};
- A es un grupo -NR^{67}R^{68} o un grupo -S(O)_{f}-R^{69};
- R^{67} y R^{68} son, iguales o diferentes, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{69} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un grupo haloalquilo C_{1}-C_{4};
- R^{70} es un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un grupo alcoxi C_{1}-C_{4}, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6} en el que al menos un átomo de oxígeno puede ser insertado, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6} opcionalmente sustituido con uno o dos grupos metilo, un grupo furilo, un grupo tienilo o un grupo -C(=O)R^{71};
- R^{71} y R^{72} son, iguales o diferentes, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un grupo alcoxi C_{1}-C_{4};
- R^{73} y R^{74} son, iguales o diferentes, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un grupo fenilo;
- R^{75} es cicloalquilo C_{3}-C_{6} en el que al menos un átomo de oxígeno puede ser insertado, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6} opcionalmente sustituido con uno o dos grupos metilo, un grupo furilo, un grupo tienilo o un grupo -C(=O)R^{71};
- R^{76} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- a, b y c son independientemente 1, 2 o 3;
- d es 0 o 1;
- e es 2 o 3;
- f es 1 o 2; y
- X^{2} es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre.
- 27.
- Una célula de una planta transgénica obtenible mediante el método de uno cualquiera de los apartados 1 a 26.
- 28.
- Una planta transgénica o un tejido de una planta que comprende la célula de la planta del apartado 27.
- 29.
- La planta transgénica del apartado 28, que es resistente a al menos un compuesto definido en el apartado 25 o 26.
- 30.
- Partes cosechables o material de propagación de una planta del apartado 28 o 29 que comprende la célula de la planta del apartado 27.
- 31.
- El uso de un gen definido en uno cualquiera de los apartados 1 a 22 para producir una planta resistente a al menos uno de los compuestos definidos en el apartado 25 o 26, la célula de la planta del apartado 27 o la planta del apartado 28 o 29.
- 32.
- Un método para proteger una planta que comprende aplicar el compuesto para el control de las malas hierbas a una zona de crecimiento de la planta del apartado 28 o 29.
- 33.
- Un método para seleccionar una planta que comprende aplicar un compuesto para el control de las malas hierbas al cual es resistente la planta del apartado 28 o 29 a una zona de crecimiento de la planta del apartado 28 o 29 y otras plantas, y seleccionar cualquier planta basándose en la diferencia de crecimiento entre las plantas.
- 34.
- Un método para seleccionar una célula de una planta que comprende aplicar un compuesto para el control de las malas hierbas al cual es resistente la célula de la planta del apartado 27 en una zona de crecimiento de la célula de la planta del apartado 27 y otras células de plantas, y seleccionar cualquier célula de la planta basándose en la diferencia de crecimiento entre las células de las plantas.
En el método de la presente invención, las
sustancias que están relacionadas con las actividades de control de
las malas hierbas de los compuestos para el control de las malas
hierbas (en adelante referidas como sustancias para el control de
las malas hierbas) son aquellas que constituyen una parte de los
sistemas de reacción metabólicos en organismos que son responsables
de las actividades de control de las malas hierbas tras la
aplicación de los compuestos a las plantas. Los ejemplos de las
mismas incluyen los propios compuestos para el control de las malas
hierbas, las sustancias endógenas de las plantas, y similares.
Específicamente, en cuanto a tales sustancias endógenas en las
plantas, por ejemplo, existen sustratos de enzimas diana sobre los
cuales actúan los compuestos para el control de las malas hierbas,
o precursores o metabolitos de los sustratos que ocasionan la
disfunción celular tras la acumulación en las células de la planta;
sustancias producidas por las sustancias anteriores en las células
de la planta que ocasionan una disfunción celular; y similares. Más
específicamente, se ha sabido que, cuando un compuesto que tiene
actividad herbicida (en adelante referido como compuesto herbicida)
que inhibe la actividad de la protoporfirinógeno IX oxidasa (EC
1.3.3.4, en adelante referido como PPO) se aplica a una planta, el
protoporfirinógeno IX que es el sustrato de la PPO se acumula en las
células de la planta y es metabolizado para formar la
protoporfirina X, seguido de la formación de oxígeno activo en
presencia tanto de protoporfirina X como de luz en las células, lo
que daña las funciones celulares [Junshi MIYAMOTO ed., Atarashii
Noyaku no Kagaku (Chemistry of New Agrochemicals), Capítulo 3,
Sección 3.3, pág. 106 (1993), Hirokawa Shoten, Tokyo]. De este
modo, el protoporfirinógeno IX, la protoporfirina IX y el oxígeno
activo de estos sistemas, y similares pueden ser ejemplificados
como estas sustancias.
En el método de la presente invención, los
compuestos para el control de las malas hierbas incluyen compuestos
que tienen actividades herbicidas, actividades reguladoras del
crecimiento de las plantas, y similares.
Los ejemplos de los compuestos herbicidas
incluyen compuestos que inhiben la biosíntesis de porfirina,
compuestos que inhiben la transferencia de electrones en la
fotosíntesis, compuestos que inhiben la biosíntesis de
carotenoides, compuestos que inhiben la biosíntesis de aminoácidos,
compuestos que inhiben la biosíntesis de lípidos, compuestos que
inhiben la biosíntesis de la pared celular, compuestos que influyen
en la biosíntesis de proteínas, biosíntesis de ácido nucleico y
división celular, compuestos que tienen actividad antagónica de
auxinas, y similares. Más específicamente, en cuanto a los
compuestos que inhiben la biosíntesis de porfirina, por ejemplo,
existen compuestos que inhiben la actividad de PPO (compuesto
herbicida de tipo inhibidor de PPO), y similar. En cuanto a los
compuestos que inhiben la transferencia de electrones en la
fotosíntesis, por ejemplo, existen compuestos que inhiben la
transferencia de electrones del sistema fotoquímico I o II,
compuestos que inhiben la 4-hidroxifenilpiruvato
dioxigenasa (EC 1.13.11.27; en adelante referida como
4-HPPD) que influyen en la biosíntesis de
plastoquinona que transfiere electrones, y similares. En cuanto a
los compuestos que inhiben la biosíntesis de carotenoides, por
ejemplo, existen compuestos que inhiben la fitoeno desaturasa (en
adelante referida como PDS), y similares. En cuanto a los
compuestos que inhiben la biosíntesis de aminoácidos, por ejemplo,
existen compuestos que inhiben la EPSPS, la acetolactato sintasa
(EC 4.1.3.18; en delante referida como ALS), la glutamina sintetasa
(EC 6.3.1.2; en adelante referida como GS), la dihidropteroato
sintasa (EC 2.5.1.15; en adelante referida como DHP), y similares.
En cuanto a los compuestos que inhiben la biosíntesis de lípidos,
por ejemplo, existen compuestos que inhiben la acetil CoA
carboxilasa (EC 6.4.1.2; en adelante referida como ACC), y
similares. En cuanto a los compuestos que inhiben la biosíntesis de
la pared celular, por ejemplo, existen compuestos que inhiben la
biosíntesis de celulosa, y similares. En cuanto a los compuestos que
influyen en la biosíntesis de proteínas, la biosíntesis de ácidos
nucleicos o la división celular, por ejemplo, existen compuestos que
inhiben la formación de microtúbulos, y similares.
Los ejemplos de los compuestos que tienen
actividades reguladoras del crecimiento de las plantas incluyen
compuestos que tienen actividades antagónicas de las hormonas
vegetales que potencian la elongación y diferenciación celular, y
similares. Específicamente, por ejemplo, existen
2,4-D, ácido fenoxialcanocarboxílico, derivados de
ácido benzoico, derivados de ácido picolínico, y similares.
En cuanto a los compuestos herbicidas de tipo
inhibidor de PPO descritos anteriormente, por ejemplo, existen los
compuestos descritos por Duke, S.O., Rebeiz, C.A., ACS Symposium
Series 559, Porphyric Pesticides, Chemistry, Toxicology, and
Pharmaceutical Applications, American Chemical Society, Washington
DC (1994), y similares. Específicamente, los ejemplos de los mismos
incluyen los siguientes compuestos:
- (1)
- clormetoxinil, bifenox, clornitrofeno (CNP), acifluorfeno (ácido 5-[2-cloro-4-(trifluorometil)-fenoxi]-2-nitrobenzoico) y su éster etílico, acifluorfen-sodio, oxifluorfeno (2-cloro-1-(3-etoxi-4-nitrofenoxi)-4-trifluorobenzeno), oxadiazon (3-[2,4-dicloro-5-(1-metiletoxi)fenil]-5-(1,1-dimetiletil)-1,3,4-oxidiazol-2-(3H)- ona), 2-[4-cloro-2-fluoro-5-(prop-2-iniloxi)fenil]-2,3,4,5,6,7-hexahidro-1H-isoindol-1,3-diona, clorfalim, (N-(4-clorofenil)-3,4,5,6-tetrahidroftalimida), TNPP-etilo (2-[1-(2,3,4-triclorofenil)-4-nitropirazolil-5-oxi]propionato de etilo), o N3-(1-feniletil)-2,6-dimetil-5-propionilnicotinamida;
- (2)
- un compuesto representado por la fórmula general: J-G (I), donde G es un grupo representado por una cualquiera de las siguientes fórmulas generales G-1 a G-9 y J es un grupo representado por una cualquiera de las siguientes fórmula generales J-1 a J-30:
- \quad
- donde las líneas discontinuas de las fórmulas J-5, J-6, J-12 y J-24 representan que el anillo de la izquierda contiene solamente enlaces sencillos, o que el enlace del anillo es un doble enlace entre átomos de carbono;
- X es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre;
- Y es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre;
- R^{1} es un átomo de hidrógeno o un átomo de halógeno;
- R^{2} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{8}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{8}, un átomo de halógeno, un grupo OH, un grupo OR^{27}, un grupo SH, un grupo S(O)_{p}R^{27}, un grupo COR^{27}, un grupo CO_{2}R^{27}, un grupo C(O)SR^{27}, un grupo C(O)NR^{29}R^{30}, un grupo CHO,un grupo CR^{27}=NOR^{36}, un grupo CH=CR^{37}CO_{2}R^{27}, un grupo CH_{2}CHR^{37}CO_{2}R^{27}, un grupo CO_{2}N=CR^{31}R^{32}, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo NHSO_{2}R^{33}, un grupo NHSO_{2}NHR^{33}, un grupo NR^{27}R^{38}, un grupo NH_{2} o un grupo fenilo opcionalmente sustituido con uno o más grupos alquilo C_{1}-C_{4} iguales o diferentes;
- p es 0, 1 o 2;
- R^{3} es un grupo alquilo C_{1}-C_{2}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{2}, un grupo OCH3, un grupo SCH_{3}, un grupo OCHF_{2}, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo nitro;
- R^{4} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{3} o un átomo de halógeno;
- R^{5} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3}, un átomo de halógeno, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{3}, grupo ciclopropilo, un grupo vinilo, un grupo alquinilo C_{2}, un grupo ciano, un grupo C(O)R^{38}, un grupo CO_{2}R^{38}, un grupo C(O)NR^{38}R^{39}, un grupo CR^{34}R^{35}CN, un grupo CR^{34}R^{35}C(O)R^{38}, un grupo CR^{34}R^{35}CO_{2}R^{38}, un grupo CR^{34}R^{35}C(O)NR^{38}R^{39}, un grupo CHR^{34}OH, un grupo CHR^{34}OC(O)R^{38} o un grupo OCHR^{34}OC(O)NR^{38}R^{39}, o, cuando G es G-2 o G-6, R^{4} y R^{5} pueden formar un grupo C=O junto con el átomo de carbono al que están anclados;
- R^{6} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alcoxialquilo C_{2}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6} o un grupo alquinilo C_{3}-C_{6};
- X^{1} es un enlace sencillo, un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo NH, un grupo N(alquilo C_{1}-C_{3}), un grupo N(haloalquilo C_{1}-C_{3}) o un grupo N(alilo);
- R^{7} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un átomo de halógeno, un grupo S(O)_{2}(alquilo C_{1}-C_{6}) o un grupo C(=O)R^{40};
- R^{8} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{8}, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{8}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{8}, un grupo alcoxialquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alcoxialcoxialquilo C_{3}-C_{8}, un grupo alcoxialquinilo C_{3}-C_{8}, un grupo haloalquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquilsulfonilo C_{1}-C_{8}, un grupo haloalquilsulfonilo C_{1}-C_{8}, un grupo alcoxicarbonilalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo S(O)_{2}NH(alquilo C_{1}-C_{8}), un grupo C(O)R^{41} o un grupo bencilo cuyo anillo de fenilo puede estar sustituido con R^{42};
- n y m son independientemente 0, 1, 2 o 3 y m + n es 2 o 3;
- Z es un grupo CR^{9}R^{10}, un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo S(O), un grupo S(O)2 o un grupo N(alquilo C_{1}-C_{4});
- cada R^{9} es independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3}, un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo alquilcarboniloxi C_{2}-C_{6} o un grupo haloalquilcarboniloxi C_{2}-C_{6};
- cada R^{10} es independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3}, un grupo hidroxilo o un átomo de halógeno;
- R^{11} y R^{12} son independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6} o un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6};
- R^{13} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6}, un grupo haloalquenilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquinilo C_{3}-C_{6}, un grupo HC(=O), un grupo (alquilo C_{1}-C_{4})C(=O) o un grupo NH_{2};
- R^{14} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquil(C_{1}-C_{6})tio, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6} o un grupo N(CH_{3})_{2}:
- W es un átomo de nitrógeno o CR^{15};
- R^{15} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un átomo de halógeno, o un grupo fenilo opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, uno o dos átomos de halógeno, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6} o un grupo CF3;
- cada Q es independientemente un átomo de oxígeno o un átomo de azufre;
- Q^{1} es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre;
- Z^{1} es un grupo CR^{16}R^{17}, un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo S(O), un grupo S(O)_{2} o un grupo N(alquilo C_{1}-C_{4});
- cada R^{16} es independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo alquilcarboniloxi C_{2}-C_{6} o un grupo haloalquilcarboniloxi C_{2}-C_{6};
- cada R^{17} es independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un átomo de halógeno;
- R^{18} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un átomo de halógeno o un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6};
- R^{19} y R^{20} son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, o un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6};
- Z^{2} es un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo NR9 o un grupo CR^{9}R^{10};
- R^{21} y R^{22} son independientemente un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6}, un grupo haloalquenilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6} o un grupo haloalquinilo C_{3}-C_{6};
- R^{23} es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo ciano;
- R^{24} es un grupo alquil(C_{1}-C_{6})sulfonilo, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo haloalcoxi C_{1}-C_{6} o un átomo de halógeno;
- R^{25} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6} o un grupo alquinilo C_{3}-C_{6};
- R^{26} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6} o un grupo fenilo opcionalmente sustituido con C_{1}-C_{6} alquilo, uno o dos átomos de halógeno, uno o grupos nitro, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6} o un grupo CF_{3};
- W^{1} es un átomo de nitrógeno o un grupo CH;
- T es un grupo representado por una cualquiera de las siguientes fórmulas generales T-1, T-2 y T-3;
- (donde E^{1}, E^{2}, E^{3}, E^{4}, E^{5}, E^{6}, E^{7}, E^{8}, E^{9}, E^{10}, E^{11} y E^{12} son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{3});
- R^{21} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{8}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{8}, un grupo alcoxialquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquiltioalquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquilsulfinilalquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquilsulfonilalquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquil-sulfonilo C_{1}-C_{8}, un grupo fenilsulfonilo cuyo anillo de fenilo puede estar sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno y un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alcoxialcoxialquilo C_{4}-C_{8}, un grupo cicloalquilalquilo C_{4}-C_{8}, un grupo cicloalcoxialquilo C_{6}-C_{8}, un grupo alqueniloxialquilo C_{4}-C_{8}, un grupo alquiniloxialquilo C_{4}-C_{8}, un grupo haloalcoxialquilo C_{3}-C_{8}, un grupo haloalqueniloxialquilo C_{4}-C_{9}, un grupo haloalquiniloxialquilo C_{3}-C_{8}, un grupo cicloalquiltioalquilo C_{6}-C_{8}, un grupo alqueniltioalquilo C_{4}-C_{8}, un grupo alquiniltioalquilo C_{4}-C_{8}, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} cuyo anillo está sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3} y un grupo haloalquilo C_{1}-C_{3}, un grupo benciloxi cuyo anillo está sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{3} y un grupo haloalquilo C_{1}-C_{3}, un grupo trialquilsililalquilo C_{1}-C_{8}, un grupo cianoalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo halocicloalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo haloalquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alcoxialquenilo C_{5}-C_{8}, un grupo haloalcoxialquenilo C_{5}-C_{8}, un grupo alquiltioalquenilo C_{5}-C_{8}, un grupo alcoxialquinilo C_{3}-C_{8}, un grupo alcoxialquinilo C_{5}-C_{8}, un grupo haloalcoxialquinilo C_{5}-C_{8}, un grupo alquiltioalquinilo C_{5}-C_{8}, un grupo alquilcarbonilo C_{2}-C_{3}, un grupo bencilo cuyo anillo está sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3} y un grupo haloalquilo C_{1}-C_{3}, un grupo CHR^{34}COR^{28}, un grupo CHR^{34}COOR^{28}, un grupo CHR^{34}P(O)(OR^{28})_{2}, un grupo CHR^{34}P(S)(OR^{28})_{2}, un grupo CHR^{34}C(O)NR^{29}R^{30} o un grupo CHR^{34}C(O)NH_{2};
- R^{28} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6} o un grupo tetrahidrofuranilo;
- R^{29} y R^{31} son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{30} y R^{32} son independientemente un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un grupo fenilo cuyo anillo puede estar sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3} y un grupo haloalquilo C_{1}-C_{3}; o,
- R^{29} y R^{30} pueden formar juntos -(CH_{2})_{5}-, -(CH_{2})_{4}- o -CH_{2}CH_{2}OCH_{2}CH_{2}-, o el anillo formado de este modo puede estar sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en grupo alquilo C_{1}-C_{3}, un grupo fenilo y un grupo bencilo; o,
- R^{31} y R^{32} pueden formar un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{8} junto con el átomo de carbono al que están anclados;
- R^{33} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{4} o un grupo alquenilo C_{3}-C_{6};
- R^{34} y R^{35} son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{36} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6} o un grupo alquinilo C_{3}-C_{6};
- R^{37} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un átomo de halógeno;
- R^{38} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6}, un grupo alcoxialquilo C_{2}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo fenilo cuyo anillo puede estar sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} y un grupo alcoxi C_{1}-C_{4}, un grupo -CH_{2}CO_{2}(alquilo C_{1}-C_{4}) o un grupo -CH(CH_{3})CO_{2}(alquilo C_{1}-C_{4});
- R^{39} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{2} o un grupo C(O)O(alquilo C_{1}-C_{4});
- R^{40} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6} o un grupo NH(alquilo C_{1}-C_{6});
- R^{41} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo NH(alquilo C_{1}-C_{6}), un grupo fenilo cuyo anillo puede estar sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un grupo R^{42}, un grupo bencilo y un grupo un grupo dialquilamino C_{2}-C_{8}; y
- R^{42} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, uno o dos átomos de halógeno, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6} o un grupo CF_{3};
- (3)
- un compuesto de fórmula (II):
- \quad
- o nipilacrofeno,
- donde R^{43} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{14} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alquil(C_{1}-C_{4})tio , un grupo alcoxi C_{1}-C_{4}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{4}, un grupo haloalquil(C_{1}-C_{4})tio o un grupo haloalcoxi C_{1}-C_{4};
- R^{43} y R^{44} pueden formar juntos -(CH_{2})]- o -(CH_{2})_{4}-;
- R^{45} es un átomo de hidrógeno o un átomo de halógeno;
- R^{46} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{47} es un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo -COOR^{49}, un grupo -C(=X)NR^{50}R^{51} o un grupo -C(=X^{2})R^{52};
- R^{48} es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo ciano, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno y un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C_{1}-C_{4}, un grupo fenilo opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{4} y un grupo haloalquilo C_{1}-c4, un grupo pirrolilo, un grupo alquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{8}, un grupo alcoxi C_{3}-C_{8}, un grupo seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{8} y un grupo alcoxi C_{3}-C_{8} en el que al menos un átomo de oxígeno es insertado, o uno cualquiera de los grupos representados por las siguientes fórmulas:
- donde R^{49}, R^{50} y R^{52} son, iguales o diferentes, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
\global\parskip0.900000\baselineskip
- R^{50} y R^{51} pueden formar un anillo de 5 o 6 miembros alicíclico saturado junto con un átomo de nitrógeno al que están anclados;
- R^{52} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un grupo alquilo C_{1}-C_{4} sustituido con al menos un átomo de halógeno;
- R^{53} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo fenilo opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo cianometilo, o un grupo R^{63}CO-;
- R^{54} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo fenilo opcionalmente sustituido con átomo de halógeno, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo cianometilo, un grupo alcoxi(C_{1}-C_{4})alquilo C_{1}-C_{5}, un grupo dialquilamino(C_{1}-C_{4})alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo tetrahidrofurfurilo, un grupo alquinil(C_{3}-C_{6})-oxi alquilo C_{1}-C_{4}, bencilo cuyo anillo puede estar sustituido un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{4} y un grupo haloalquilo C_{1}-C_{4}, un grupo -C(=X^{2})R^{63}, un grupo -(CH_{2})_{a}-(O)_{d}-R^{70}, un grupo -(CH_{2})_{a}-O-(CH_{2})_{b}-R^{70}, un grupo -(CH_{2})_{a}-X^{2}-R^{76};
- R^{53} y R^{54} junto con un átomo de nitrógeno al que están anclados pueden formar un anillo de 3, 5 o 6 miembros alicíclico saturado o un anillo de 5 o 6 miembros aromático en el que un átomo de carbono puede ser opcionalmente remplazado por un átomo de oxígeno;
- R^{55} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alquenilo C_{1}-C_{6} o un grupo alquinilo C_{1}-C_{6}, o R^{55} y R^{56} pueden formar juntos -(CH_{2})_{e}-;
- R^{56} y R^{57} son independientemente un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, alquinilo C_{3}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno o un grupo fenilo opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un átomo de hidrógeno, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6}, un grupo -XR^{60} o un grupo -NR^{61}R^{62};
- R^{58} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquilcarbonilo C_{1}-C_{4}, un grupo cianoalquilo C_{1}-C_{3}, un grupo alcoxicarbonil(C_{1}-C_{4})alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo dialcoxicarbonil(C_{1}-C_{4})alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo bencilo, un grupo alcoxil(C_{1}-C_{4})alquinilo C_{1}-C_{4}, un grupo -(CH_{2})_{a}-R^{75}, un grupo -(CH_{2})_{a}-X^{2}-R^{72}, un grupo -(CH_{2})_{a}-X^{2}-(CH_{2})_{b}-R^{72} o un grupo -(CH_{2})_{a}-X^{2}-(CH_{2})_{b}-X^{2}-(CH_{2})_{c}-R^{72};
- R^{59} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6}, un grupo cianoalquilo C_{1}-C_{3}, un grupo alquil(C_{1}-C_{4})carbonilalquilo C_{1}-C_{3} o un grupo fenilo;
- R^{60} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno;
- R^{61} y R^{62} son, iguales o diferentes, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{63} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alcoxi(C_{1}-C_{4})alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alquil(C_{1}-C_{4})tioalquilo C_{1}-C_{4}, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6}, un grupo fenilo cuyo anillo puede estar sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo nitro, un grupo ciano un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{4} y un grupo haloalquilo C_{1}-C_{4}, un grupo -NR^{73}R^{74} o un grupo -(CH_{2})_{a}-(O)_{d}-R^{75};
- R^{64} es un grupo alcoxicarbonilo C_{1}-C_{4} o un grupo carboxilo;
- R^{65} es un grupo clorometilo, un grupo cianometilo, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6} en el que al menos un átomo de oxígeno puede ser insertado, o un grupo alcoxicarbonil(C_{1}-C_{4})alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{66} es un grupo hidroxilo o un grupo -NR^{67}R^{68};
- A es un grupo -NR^{67}R^{68} o un grupo -S(O)_{f}-R^{69};
- R^{67} y R^{69} son, iguales o diferentes, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{69} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un grupo haloalquilo C_{1}-C_{4};
- R^{70} es un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un grupo alcoxi C_{1}-C_{4}, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6} en el que al menos un átomo de oxígeno puede ser insertado, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6} opcionalmente sustituido con uno o dos grupos metilo, un grupo furilo, un grupo tienilo o un grupo -C(=O)R^{71};
- R^{71} y R^{72} son, iguales o diferentes, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un grupo alcoxi C_{1}-C_{4};
- R^{73} y R^{74} son, iguales o diferentes, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un grupo fenilo;
- R^{75} es cicloalquilo C_{3}-C_{6} en el que al menos un átomo de oxígeno puede ser insertado, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6} opcionalmente sustituido con uno o dos grupos metilo, un grupo furilo, un grupo tienilo o un grupo -C(=O)R^{71};
- R^{76} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- a, b y c es independientemente 1, 2 o 3;
- d es 0 o 1;
- e es 2 o 3;
- f es 1 o 2; y
- X^{2} es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre.
Además, en cuanto a otros pirazoles
N-sustituidos, existen los
2-aril-4,5,6,7-tetrahidro-indazoles
sustituidos en la posición 3 descritos por Lyga et al.,
Pesticide Sci., 42: pág. 29 (1994), y similares.
Como ejemplos específicos de los compuestos que
inhiben la transferencia de electrones en el sistema fotoquímico I,
por ejemplo, existen paraquat, diquat, y similares. Como ejemplos
específicos de los compuestos que inhiben la transferencia de
electrones en el sistema fotoquímico II, por ejemplo, existen
compuestos de triazina (p. ej., atrazina, etc.), compuestos de urea
(p. ej., diuron, etc.), compuestos de nitrilo (p. ej., bromoxinilo
e ioxinilo) y similares. Como ejemplos específicos de los compuestos
que inhiben la 4-HPPD, por ejemplo, existen
isoxazoles (p. ej., isoxaflutol), pirazoles, tricetonas, y
similares. Como ejemplos específicos de los compuestos que inhiben
la PDS, por ejemplo, existen norflurazon, flurocloridona, fluridona,
flurtamona, diflufenican, y similares. Como ejemplos específicos de
los compuestos que inhiben la EPSPS, por ejemplo, existen glifosato,
y similares. Como ejemplos específicos de los compuestos que
inhiben la ALS, por ejemplo, existen sulfonilureas, imidazolinonas,
pirimidiniltiobenzoatos, triazolopirimidinas, y similares. Como
ejemplos específicos de los compuestos que inhiben la GS, por
ejemplo, existen bialafos, glufosinato, y similares. Como ejemplos
específicos de los compuestos que inhiben la DHP, por ejemplo,
existen asulam, y similares. Como ejemplos específicos de los
compuestos que inhiben ACC, por ejemplo, existen ciclohexanedionas,
ariloxifenoxipropionatos, y similares. Como ejemplos específicos de
los compuestos que inhiben la celulosa, por ejemplo, existen
diclobenilo, y similares.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En las siguientes estructuras químicas se
muestran diversos ejemplos de los compuestos para el control de las
malas hierbas útiles en la presente invención:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\newpage
\newpage
Los genes utilizados en el método de la presente
invención para elaborar plantas resistentes a los compuestos para
el control de las malas hierbas son aquellos que codifican proteínas
seleccionadas del grupo que consiste en:
- magnesio quelatasa de tipo activo o inactivo que tiene afinidad por la protoporfirina IX,
- ferroquelatasa de tipo activo o inactivo que tiene afinidad por la protoporfirina IX, cobalto quelatasa de tipo activo o inactivo que tiene afinidad por la protoporfirina IX,
- un péptido que tiene afinidad por la protoporfirina IX, compuesto por 6 a 100 aminoácidos, estando dicho péptido esencialmente libre de regiones marco de regiones variables en una inmunoglobulina,
- protoporfirinógeno IX oxidasa de tipo inactivo que tiene afinidad por el protoporfirinógeno IX, y
- coproporfirinógeno III oxidasa de tipo inactivo o activo que tiene afinidad por el protoporfirinógeno IX;
no teniendo dichas proteínas
esencialmente capacidad para modificar el protoporfirinógeno
IX.
En el primer aspecto del método de la presente
invención, los genes que se van a utilizar son aquellos que
codifican proteínas seleccionadas del grupo, donde las proteínas
seleccionadas pueden estar caracterizadas por las siguientes
características (a) a (c) (en adelante algunas veces referidas como
proteínas objetivo):
- (a)
- tienen una afinidad específica por las sustancias para el control de las malas hierbas;
- (b)
- no tienen esencialmente capacidad para codificar sustancias para las cuales dicha proteína tiene una afinidad específica; y
- (c)
- están esencialmente libres de regiones marco de regiones variables de una inmunoglobulina.
El término "afinidad específica" por
sustancias para el control de las malas hierbas de la característica
(a) anterior significa que una enzima (la proteína objetivo) y un
sustrato (la sustancia para el control de las malas hierbas), o una
enzima (la proteína objetivo) y un inhibidor o un regulador de la
actividad de la enzima (la sustancia para el control de las malas
hierbas) se unen entre sí, enzimáticamente; o que la proteína
objetivo y la sustancia para el control de las malas hierbas se unen
entre sí basándose en la afinidad y la especificidad, tales como
las mostradas en un enlace químico al receptor, por ejemplo, un
enlace entre un receptor y un ligando, y similares. Las proteínas
objetivo pueden ser proteínas de origen natural; variantes de las
mismas obtenidas mediante la introducción de sustituciones,
adiciones, deleciones, modificaciones y similares de un aminoácido
en proteínas de origen natural: y proteínas sintetizadas
artificialmente que tienen secuencias de aminoácidos al azar
seleccionadas con la orientación de su afinidad por las sustancias
para el control de las malas hierbas, con tal que tengan
estructuras que se unan específicamente a las sustancias para el
control de las malas hierbas.
El término "que no tiene esencialmente
capacidad de modificar" en la característica (b) representa que
la reactividad enzimática con sustancias para las cuales dicha
proteína tiene una afinidad específica es esencialmente inactiva o
no existe (excepto la afinidad específica por las sustancias para el
control de las malas hierbas de la característica (a)). Los
Ejemplos de esto incluyen un caso en el que la proteína objetivo no
tiene ninguna capacidad de convertir una sustancia para la cual
dicha proteína tiene una afinidad específica tal como una cierta
sustancia para el control de las malas hierbas o una sustancia que
tiene una parte esencial de la estructura de los sustratos
basándose en una afinidad específica para dicha proteína, y
similares a una sustancia que tiene una estructura química
diferente, de la de la sustancia para la cual dicha proteína tiene
una afinidad específica. La proteína "que no tiene esencialmente
capacidad para modificar" puede ser identificada, por ejemplo
verificando la no recuperación del crecimiento de un microorganismo
cuyo gen que codifica dicha proteína es suprimido y de este modo no
puede crecer en condiciones normales en el caso en el que el gen que
codifica la proteína mencionada es introducido en el microorganismo
en un estado tal que el gen introducido es expresado en el
microorganismo.
El término "esencialmente libre de las
regiones marco de las regiones variables de una inmunoglobulina"
en la característica (c) significa que la proteína objetivo no
forma una estereoestructura específica para las regiones variables
de una inmunoglobulina. El término "regiones marco de las regiones
variables de una inmunoglobulina" representa regiones que quedan
después de separar las regiones hipervariables de las regiones
variables de la cadena H y la cadena L que son las constitutivas de
la molécula de inmunoglobulina. En estas regiones, la conservación
de las secuencias de aminoácidos es relativamente elevada y estas
regiones, funcionan manteniendo la estereoestructura altamente
conservada de las regiones variables. Debido a la formación de la
estereoestructura anterior, las regiones hipervariables localizadas
separadamente en tres sitios sobre la respectiva cadena H y cadena
L son recogidas en la estereoestructura para formar un sitio de
unión al antígeno [Alberts, B., et al. ed. (1983), Molecular
Biology of the Cell, p 979, Garland Publishing, Inc., New York].
La proteína objetivo que tiene la característica
(c) anterior puede ser seleccionada basándose, por ejemplo, en las
secuencias de aminoácidos de las proteínas. Como ejemplos
específicos de la proteína, existe una proteína que no contiene
ninguna secuencia de aminoácidos compuesta por aproximadamente 30
aminoácidos o más y que tiene una homología de aproximadamente 60%
o más con las secuencias de aminoácidos conocidas de las regiones
marco de las regiones variables de una inmunoglobulina, y similares.
Por ejemplo, la presencia o ausencia de las regiones marco
anteriores puede ser confirmada mediante PCR utilizando un gen que
codifica la proteína como molde y los ADN que tienen secuencias de
nucleótidos que codifican las regiones variables derivadas de la
cadena H o la cadena L de la inmunoglobulina como cebadores de
amplificación, por ejemplo, los cebadores VH1BACK y
VH1FOR-2, o VK2BACK y VK4FOR descritos por Clackson,
T. et al., Nature 352; p 624 (1991), o los cebadores
contenidos en un kit disponible en el mercado para clonar genes de
anticuerpos recombinantes, por ejemplo, mezcla de cebadores Heavy o
mezcla de cebadores Light de Recombinant Phage Antibody System
(Pharmacia Biotech) para analizar la presencia o ausencia de la
amplificación de ADN que tiene una longitud dada. Los ejemplos de
las proteínas de unión que tienen una afinidad específica por
sustancias para el control de las malas hierbas también incluyen
péptidos que tienen afinidad por las sustancias para el control de
las malas hierbas.
Los ejemplos específicos de las proteínas
objetivo que tienen las características (a) a (c) anteriores
incluyen proteínas de unión de tipo inactivo que tienen afinidad
por la protoporfirina IX [p. ej., magnesio quelatasa de tipo
inactivo cuyo sustrato es la protoporfirina IX (sustancias para el
control de las malas hierbas de tipo ferroquelatasa inactiva
(protohemo ferroliasa; EC 4.9.9.1), cobalto quelatasa de tipo
inactivo que cataliza una reacción de quelación de un ión cobalto
con un compuesto que tiene un anillo de tetrapirrol como sustrato,
péptidos que tienen afinidad por la protoporfirina IX, esto es,
proteínas compuestas por 6 a 100 aminoácidos (por ejemplo, el
péptido HASYS que tiene una afinidad por la protoporfirina IX, p.
ej., una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ
ID NO: 53 y una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del
SEQ ID NO: 54; el péptido RASSL que tiene afinidad por la
protoporfirina IX, p. ej., una proteína que comprende la secuencia
de aminoácidos del SEQ ID NO: 55 y una proteína que tiene la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 56; el péptido YAGY que
tiene afinidad por los compuestos de porfirina, p. ej., una proteína
que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 57 y una
proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 58;
el péptido YAGF que tiene afinidad por compuestos de porfirina, p.
ej., una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ
ID NO: 59 y una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del
SEQ ID NO: 60; y similares)], proteínas de unión de tipo inactivo
que tienen afinidad por el protoporfirinógeno IX (p. ej., PPO de
tipo inactivo, coproporfirinógeno III oxidasa de tipo inactivo),
y
similares.
similares.
Las proteínas de unión de tipo inactivo
anteriores incluyen las variantes de las mismas cuyas actividades
se han perdido por sustitución, adición, deleción, modificación y
similares de aminoácidos de proteínas activas de origen natural en
condiciones naturales o artificiales.
La disfunción celular causada por las sustancias
para el control de las malas hierbas puede ser evitada mediante la
unión de estas proteínas de unión a las sustancias para el control
de las malas hierbas en células vegetales para mostrar la
resistencia al compuesto para el control de las malas hierbas
deseado.
La magnesio quelatasa de tipo inactivo es la
proteína de la subunidad de unión a la protoporfirina IX de la
magnesio quelatasa, o su variante que tiene una afinidad de unión
específica por la protoporfirina IX, y los ejemplos específicos de
la misma incluyen la proteína de la subunidad de la cual se ha
suprimido la secuencia señal de tránsito a los orgánulos, y
similares.
La ferroquelatasa de tipo inactivo es su
variante que no tiene capacidad de modificar la protoporfirina IX y
que tiene una afinidad específica por la protoporfirina IX, y los
ejemplos específicos de la misma incluyen una variante de
ferroquelatasa en la cual se ha modificado una región que se presume
que es un sitio de unión al ión Fe de la ferroquelatasa, y
similares.
La cobalto quelatasa de tipo inactivo es una
proteína de la subunidad de unión al sustrato de la cobalto
quelatasa, o su variante que no tiene capacidad de modificación de
la protoporfirina IX y que tiene afinidad específica por la
protoporfirina IX.
La PPO de tipo inactivo es su variante que no
tiene capacidad de oxidar el protoporfirinógeno IX y que tiene
afinidad específica por el protoporfirinógeno IX, y los ejemplos
específicos de la misma incluyen una variante de PPO en la cual ha
sido suprimida una región que se supone que es un sitio de unión a
FAD de PPO (una región que tiene la secuencia de aminoácidos GXGXXG
donde X es cualquier aminoácido, p. ej., una región que comprende
los aminoácidos 63º a 68º desde el extremo N de la PPO localizada en
el cloroplasto de la oruga (Arabidopsis thaliana) y que
tiene la secuencia de aminoácidos GGGISG), y similares. La
coproporfirinógeno III oxidasa de tipo inactivo es su variante que
no tiene capacidad de oxidar el protoporfirinógeno IX y que tiene
afinidad específica por el protoporfirinógeno IX.
Los genes que codifican las proteínas anteriores
se pueden obtener, por ejemplo, como sigue.
En cuanto a los genes que codifican la proteína
de de la subunidad de unión a protoporfirina IX de la magnesio
quelatasa, por ejemplo, se conocen aquellas derivadas de la bacteria
fotosintética, Rhodobacter capsulatus (Acceso Genebank
M74001), oruga (Acceso Genebank Z68495), cebada (Acceso Genebank
U96216), boca de dragón (Antirrhinum majus) (Acceso Genebank
U26916), Synechocystis P.C.C. 6803 (Acceso Genebank U29131) y
similares. Para aislar semejante gen conocido (se conoce su
secuencia de nucleótidos), se puede llevar a cabo una PCR
utilizando ADN genómico o ADNc de un organismo que tiene el gen
deseado como molde y cebadores producidos basándose en las
secuencias de nucleótidos correspondientes aproximadamente a las de
los extremos N y C de la proteína codificada por el gen para
amplificar el gen deseado. Adicionalmente, se pueden obtener los
genes que codifican la proteína de la subunidad de unión a
protoporfirina IX de la magnesio quelatasa a partir de organismos
fotosintéticos distintos de los anteriores. Por ejemplo, primero, se
construye una colección de ADNc obteniendo ARNm del organismo
fotosintético deseado, sintetizando ADNc utilizando el ARNm como
molde con una transcriptasa inversa, e integrando el ADNc en un
vector de fagos tal como ZAPII, etc. o un vector plasmídico tal
como pUC, etc. Para amplificar un fragmento de ADNc que contiene al
menos una parte del gen que codifica la proteína de la subunidad de
unión a protoporfirina IX de la magnesio quelatasa, se puede llevar
a cabo la PCR utilizando la colección de ADNc construida antes como
molde y cebadores diseñados y sintetizados basándose en las
secuencias de nucleótidos bien conservadas entre los genes conocidos
tales como los genes descritos anteriormente. El escrutinio de la
colección de ADNc se puede llevar a cabo utilizando el fragmento de
ADN, obtenido de este modo como sonda para seleccionar clones
positivos. El gen de la proteína de la subunidad de unión a
protoporfirina IX de la magnesio quelatasa deseado puede ser
confirmado mediante la determinación de la secuencia de la
secuencia de nucleótidos del clon seleccionado.
Para obtener el gen que codifica una variante de
la proteína de la subunidad de unión a protoporfirina IX de la
magnesio quelatasa que tiene una afinidad específica por la
protoporfirina IX, por ejemplo, se mutageniza el gen que codifica
la proteína de la subunidad mediante introducción de una
sustitución, adición, deleción, modificación y similares de
nucleótidos, seguido de introducción del gen resultante en la cepa
BL21(DE3) de Escherichia coli de acuerdo con el
método descrito por Gibson, L.C. D. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 92; pág. 1941 (1995) y similares para obtener
transformantes, y cultivar los transformantes en condiciones tales
que se produzca una elevada expresión del gen así producido. El gen
deseado que codifica una variante de la proteína de la subunidad
que tiene una afinidad específica por la protoporfirina IX se puede
obtener seleccionando una cepa cuyas células cultivadas se han
vuelto rojas y que tienen una absorción de fluorescencia que
muestra acumulación de protoporfirina IX (longitud de onda de
excitación 405 nm, longitud de onda de emisión 630 nm).
En cuanto a los genes que codifican la
ferroquelatasa, por ejemplo, se conocen aquellos derivados de
Escherichia coli (Acceso Genebank D90259), Bacillus
subtilis (Acceso Genebank M97208), Bradyrhizobium
japonicuim (Acceso Genebank M92427), levadura Saccharomyces
cerevisiae (Acceso Genebank J05395), ratón (Acceso Genebank
J05697), ser humano (Acceso Genebank D00726), cebada (Acceso
Genebank D26105), pepino (Acceso Genebank D26106), y similares.
Para aislar semejante gen conocido (se conoce su secuencia de
nucleótidos), se lleva a cabo una PCR utilizando ADN genómico o
ADNc de un organismo que tiene el gen deseado como molde y cebadores
producidos basándose en las secuencias de nucleótidos
correspondientes a aproximadamente las de los extremos N y C de la
proteína codificada por el gen para amplificar el gen deseado.
Adicionalmente, para obtener otros genes que codifican la
ferroquelatasa, por ejemplo, primero, se construye una colección de
ADNc obteniendo ARNm a partir del organismo deseado, sintetizando
ADNc mediante la utilización de ARNm como molde con una
transcriptasa inversa, e integrando el ADNc en un vector de fagos
tal como ZAPII, etc. o un vector plasmídico tal como pUC, etc. La
colección de ADNc puede ser introducida en una cepa de
Escherichia coli VS200 mutante carente de ferroquelatasa
descrita por Miyamoto, K, et al., Plant Physiol., 105; pág.
769 (1994), sometiéndola después a un ensayo de complementación
para seleccionar clones que contienen el gen de la ferroquelatasa
derivado del organismo deseado. Adicionalmente, para amplificar un
fragmento de ADN, se puede llevar a cabo una PCR utilizando la
colección de ADNc construida anteriormente como molde y cebadores
preparados basándose en las secuencias de nucleótidos bien
conservadas entre genes conocidos tales como los genes descritos
anteriormente. El escrutinio de la colección de ADNc se puede
llevar a cabo utilizando el fragmento de ADN obtenido de ese modo
como sonda para seleccionar los clones positivos. El gen de la
Ferroquelatasa deseado se puede confirmar mediante determinación de
la secuencia de la secuencia de nucleótidos del clon
seleccionado.
\newpage
Para obtener el gen que codifica una variante de
ferroquelatasa que no tiene capacidad para modificar la
protoporfirina IX y que tiene una afinidad específica por la
protoporfirina IX (por ejemplo, el gen que codifica una variante de
la ferroquelatasa en la cual la región que se presupone que es el
sitio de unión a Fe de la ferroquelatasa está modificado), se puede
llevar a cabo una PCR preparando un cebador de mutagénesis para la
introducción de una mutación en la región basándose en la secuencia
de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos cerca de la
región, y utilizando un kit de mutagénesis dirigida al sitio
asequible comercialmente (Mutan-Super Express,
Takara Shuzo) para obtener el gen que codifica la variante anterior.
Específicamente, se inserta un gen de ferroquelatasa de tipo
salvaje en el sitio de clonación del vector plasmídico pKF19K y se
lleva a cabo la PCR utilizando el ADN plasmídico resultante como
molde, el cebador de mutagénesis descrito anteriormente y un
cebador de selección para la restauración de la mutación ámbar
localizada en el gen de resistencia a la kanamicina de pKF19K. El
gen amplificado por PCR se introduce en Escherichia coli
MV1184 (cepa sin supresor) y los transformantes se escrutan de
acuerdo con la resistencia a kanamicina para aislar la
Escherichia coli que tiene el gen de la ferroquelatasa en el
que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de
aminoácidos que constituye la región deseada ha sido modificada. El
gen aislado puede ser confirmado como el gen que codifica la
proteína deseada analizando la secuencia de nucleótidos del ADN
plasmídico de la Escherichia coli.
Los genes que codifican los péptidos que tienen
afinidad por la protoporfirina IX, esto es, las proteínas
compuestas por 6 a 100 aminoácidos pueden ser obtenidos sintetizando
una colección peptídica, por ejemplo, de acuerdo con el método de
la química combinatoria descrito por Sugimoto, N., Nakano, S.,
Chem., Lett., pág. 939 (1997) y similares, seleccionando un péptido
que tiene afinidad por la sustancia para el control de las malas
hierbas, analizando la secuencia de aminoácidos del péptido así
seleccionado con un secuenciador peptídico, diseñando un gen que
contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de
aminoácidos, y sintetizando la secuencia de nucleótidos con un
sintetizador de ADN o similar.
Adicionalmente, se puede seleccionar un clon de
fago que presenta un péptido que tiene afinidad por la sustancia
para el control de las malas hierbas de una colección de fagos de
acuerdo con el método de presentación en fagos. Específicamente,
por ejemplo, se construye una colección de fagos que presentan una
proteína que tiene una secuencia de aminoácidos al azar sobre la
superficie de partículas del fago M13 insertando una secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína que tiene la secuencia de
aminoácidos al azar aguas arriba de la región que codifica la
proteína de la envoltura pIII del gen del fago M13. Por otra parte,
la sustancia para el control de las malas hierbas marcada con
biotina se une a una placa recubierta con avidina o estreptavidina
para preparar un soporte recubierto con la sustancia para el
control de las malas hierbas. Se puede aislar un fago que presenta
la proteína deseada que tiene afinidad por la sustancia para el
control de las malas hierbas escrutando la colección de fagos
anterior sobre la placa recubierta con la sustancia para el control
de las malas hierbas y se puede obtener el gen de la proteína
deseada a partir del fago
aislado.
aislado.
El gen que codifica una proteína que contiene la
repetición de la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ
ID NO: 53, 55, 57 o 59 cuatro veces u ocho veces puede ser
producido, por ejemplo, seleccionando una secuencia de nucleótidos
en la que la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de
aminoácidos anterior se repite las veces dadas después del codón de
iniciación ATG, sintetizando un oligonucleótido que comprende la
secuencia de nucleótidos seleccionada y un oligonucleótido que
comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la
secuencia de nucleótidos seleccionada por medio de un sintetizador
de ADN, y sometiéndolos después a hibridación. Adicionalmente, los
genes que codifican la secuencia de aminoácidos representada por el
SEQ ID NO: 54, 56, 58 o 60 pueden ser producidos seleccionado una
secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos,
sintetizando un oligonucleótido que comprende la secuencia de
nucleótidos seleccionada y otro oligonucleótido que comprende una
secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de
nucleótidos seleccionada por medio de un sintetizador de ADN, y
sometiéndolos después a hibridación. Con respecto a esto, para
seleccionar la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia
de aminoácidos dada, por ejemplo, se prefiere seleccionar codones
utilizados frecuentemente en genes derivados de plantas.
En cuanto a los genes de PPO, por ejemplo, se
conocen aquellos derivados de Escherichia coli (Acceso
Genebank X68660), Bacillus subtilis (Acceso Genebank
M97208), Haemophilus influenzae (Acceso Genebank L42023),
ratón (Acceso Genebank D45185), ser humano (Acceso Genebank D38537),
oruga (Acceso Genebank D83139), tabaco (Acceso Genebank Y13465,
Y13466) y similares. Para aislar semejante gen conocido (se conoce
su secuencia de nucleótidos), se lleva a cabo la PCR utilizando ADN
genómico o ADNc de un organismo que tiene el gen deseado como molde
y cebadores producidos basándose en secuencias de nucleótidos
correspondientes a aquellas cercanas a los extremos N y C de la
proteína codificada por el gen para amplificar el gen deseado.
Adicionalmente, para obtener otros genes de PPO, por ejemplo,
primero, se construye una colección de ADNc a partir de un organismo
que tiene el gen deseado de acuerdo con el método descrito
anteriormente. La colección de ADNc puede ser introducida en la
cepa mutante de Escherichia coli deficiente en PPO VSR800
descrita por Narita, S., et al., Gene, 182; pág. 169 (1996),
sometiéndola después a un ensayo de complementación para seleccionar
clones que contienen el gen PPO derivado del organismo deseado.
Adicionalmente, para amplificar un fragmento de ADN, se puede llevar
a cabo una PCR utilizando la colección de ADNc construida
anteriormente como molde y cebadores preparados basándose en las
secuencias de nucleótidos bien conservadas entre los genes conocidos
tales como los genes descritos anteriormente. El escrutinio de la
colección de ADNc se puede llevar a cabo utilizando el fragmento de
ADN obtenido de este modo como sonda para seleccionar los clones
positivos. El gen PPO deseado puede ser confirmado mediante
determinación de la secuencia de la secuencia de nucleótidos del
clon seleccionado.
Para obtener el gen que codifica una variante de
PPO que no tiene capacidad para oxidar el protoporfirinógeno IX y
que tiene una afinidad específica por el protoporfirinógeno IX, por
ejemplo, se mutageniza el gen PPO introduciendo una sustitución,
adición, deleción, modificación, etc. de nucleótidos y el gen
modificado resultante se introduce en la Escherichia coli
anterior cuyo crecimiento es inhibido de una forma dependiente de
la luz mediante tratamiento con un compuesto herbicida de tipo
inhibidor de PPO. Un gen que codifica una proteína que tiene
capacidad de unión a protoporfirinógeno IX puede ser seleccionado
cultivando la Escherichia coli obtenida de este modo en
presencia de hemina, ácido aminolevulínico y un compuesto herbicida
de tipo inhibidor de PPO para seleccionar un clon que puede crecer
incluso en la luz. Se puede seleccionar un gen que codifica una
proteína que no tiene capacidad para oxidar el protoporfirinógeno IX
expresando el gen modificado seleccionado de este modo en un
anfitrión tal como Escherichia coli, etc. para preparar una
proteína codificada por el gen, y midiendo su capacidad para oxidar
el protoporfirinógeno IX de acuerdo con el método descrito por
Jacobs, N.J. y Jacobs, J.M. (1982) Enzyme, 28,
206-219. y similares. Más específicamente, el gen
modificado antes se inserta en un vector de expresión para
Escherichia coli y se introduce en el mutante deficiente del
gen PPO (locus hemG) de Escherichia coli tal como la cepa BT3
de Escherichia coli descrito por Yamamoto, F., et
al., Japanese J. Genet., 63; pág. 237 (1988) y similares. La
Escherichia coli se cultiva en un medio de cultivo que
contiene hemina y ácido aminolevulínico además del inhibidor del
crecimiento celular correspondiente al marcador de selección del
vector introducido en la Escherichia coli para obtener
transformantes. La proteína codificada por el gen modificado puede
ser producida a partir del transformante. Adicionalmente, un gen
que no complementa la deficiencia en el gen PPO de su célula
anfitriona puede ser obtenido cultivando el transformante en un
medio de cultivo esencialmente libre de hemina y ácido
aminolevulínico para identificar una cepa que no crece. Este último
método también puede ser utilizado para la selección del gen que
codifica una proteína que no tiene capacidad para oxidar el
protoporfirinógeno IX.
Adicionalmente, para obtener el gen que codifica
una variante de PPO en la cual la región que se presume que es un
sitio de unión de FAD de PPO (la región que tiene la secuencia de
aminoácidos GXGXXG, donde X es cualquier aminoácido) está
suprimida, primero, se prepara un cebador de mutagénesis para la
introducción de la mutación por deleción de la región basándose en
la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos
cerca de la región. Después, se lleva a cabo la PCR utilizando el
cebador de mutagénesis y un kit de mutagénesis dirigida al sitio
disponible en el mercado (Mutan-Super Express,
Takara Shuzo) como se ha descrito anteriormente para obtener el gen
que codifica la proteína variante anterior en la cual se ha
suprimido la región.
Los genes que codifican las proteínas peptídicas
tales como los péptidos HASYS y RASSL que tienen afinidad por la
protoporfirina IX, y los péptidos YAGA y YAGF que tienen afinidad
por los compuestos de porfirina, y similares pueden ser obtenidos
sometiendo los oligonucleótidos sintetizados mediante un
sintetizador de ADN a hibridación.
Además, los genes que codifican las proteínas
peptídicas desconocidas que tienen afinidades por otras sustancias
para el control de las malas hierbas pueden ser producidos mediante
los siguientes métodos y similares. Por ejemplo, se pueden
construir diversas colecciones peptídicas de acuerdo, por ejemplo,
con el método de química combinatoria descrito por Sugimoto, N.,
Nakano, S., Chem., Lett., p 939 (1997), y similares. Los péptidos
se seleccionan a partir de las colecciones peptídicas construidas de
este modo con las pautas de las afinidades por las sustancias para
el control de las malas hierbas, seguido del análisis de las
secuencias de aminoácidos de los péptidos con un secuenciador
peptídico. De este modo, se pueden sintetizar los genes que
codifican los péptidos por medio de un sintetizador de ADN.
Alternativamente, se pueden obtener clones de fagos que presentan
péptidos que tienen afinidades por las sustancias para el control de
las malas hierbas seleccionando colecciones de fagos de acuerdo con
el método de presentación en fagos. Específicamente, por ejemplo, se
construye una colección de fagos que presentan una proteína que
tiene una secuencia de aminoácidos al azar sobre la superficie de
partículas del fago M13 insertando una secuencia de nucleótidos que
codifica la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos al azar
aguas arriba de la región que codifica la proteína de la envoltura
pIII del gen del fago M13. Por otra parte, la sustancia para el
control de las malas hierbas marcada con biotina se une a una placa
recubierta con avidina o estreptavidina para preparar un soporte
recubierto con la sustancia para el control de las malas hierbas.
Se puede aislar un fago que presenta la proteína deseada que tiene
afinidad por la sustancia para el control de las malas hierbas
escrutando la colección de fagos anterior sobre la placa recubierta
con la sustancia para el control de las malas hierbas y se puede
obtener el gen de la proteína deseada a partir del fago
aislado.
En cuanto a los genes que codifican por ejemplo
la coproporfirinógeno III oxidasa, por ejemplo, se conocen aquellos
derivados de Escherichia coli (Acceso Genebank X75413),
Salmonella typhimurium (Acceso Genebank L19503), levadura
Saccharomyces cerevisiae (Acceso Genebank J03873), ratón
(Acceso Genebank D1633), ser humano (Acceso Genebank D16333), soja
(Acceso Genebank X71083), cebada (Acceso Genebank X82830), tabaco
(Acceso Genebank X82831) y similares. Para aislar semejante gen
conocido (se conoce su secuencia de nucleótidos), se lleva a cabo
la PCR utilizando ADN genómico o ADNc de un organismo que tiene el
gen deseado como molde y cebadores producidos basándose en las
secuencias de nucleótidos correspondientes a las cercanas a los
extremos N y C de la proteína codificada por el gen para amplificar
el gen deseado. Adicionalmente, para obtener los genes de la
coproporfirinógeno III oxidasa, por ejemplo, primero, se construye
una colección de ADNc de un organismo que tiene el gen deseado
preparando ARNm del organismo deseado, sintetizando ADNc utilizando
el ARNm como molde con una transcriptasa inversa e integrando este
en un vector plasmídico tal como pRS313 descrito por Sikorski,
R.S., et al., Genetics, 122; pág. 19 (1989), y similares. La
colección ADNc puede ser introducida en cepa mutante HEM13 carente
de coproporfirinógeno III oxidasa de levadura descrita por Troup,
B., et al., Bacteriol., 176; pág. 673 (1994), sometiéndola
después a ensayo de complementación para seleccionar clones que
contienen coproporfirinógeno III oxidasa derivada del organismo
deseado. Adicionalmente, para amplificar un fragmento de ADN, se
puede llevar a cabo una PCR utilizando la colección de ADNc
construida anteriormente como molde y cebadores preparados
basándose en las secuencias de nucleótidos bien conservadas entre
los genes conocidos tales como los genes descritos antes. El
escrutinio de la colección de ADNc se puede llevar a cabo
utilizando el fragmento de ADN obtenido de este modo como sonda para
seleccionar los clones positivos. El gen de la coproporfirinógeno
III oxidasa deseado se puede confirmar mediante determinación de la
secuencia de la secuencia de nucleótidos del clon seleccionado.
Para obtener el gen que codifica una variante de
la coporfirinógeno III oxidasa que no tiene capacidad para oxidar
el protoporfirinógeno IX y que tiene una afinidad específica por el
protoporfirinógeno IX, por ejemplo, se mutageniza el gen de la
coproporfirinógeno III oxidasa introduciendo una sustitución,
adición, deleción, modificación, etc. de nucleótidos y el gen
resultante se introduce en la Escherichia coli anterior cuyo
crecimiento es inhibido de una manera dependiente de la luz mediante
tratamiento con un compuesto herbicida de tipo inhibidor de PPO. Se
puede seleccionar un gen que codifica una proteína que tiene
capacidad de unión a protoporfirinógeno IX cultivando la
Escherichia coli obtenida de este modo en presencia de
hemina, ácido aminolevulínico y un herbicida de tipo inhibidor de
PPO para seleccionar un clon que puede crecer incluso en la luz. Se
puede seleccionar un gen que codifica una proteína que no tiene
capacidad para oxidar el protoporfirinógeno IX expresando el gen
modificado de este modo en un anfitrión tal como Escherichia
coli, etc. para preparar una proteína codificada por el gen, y
medir su capacidad para oxidar el protoporfirinógeno IX de acuerdo
con el método descrito por Jacobs, N.J. y Jacobs, J.M. (1982)
Enzyme, 28, 206-219 y similares.
Los genes utilizados en el segundo aspecto del
método de la presente invención para elaborar plantas resistentes a
los compuestos para el control de las malas hierbas son aquellos que
codifican las proteínas seleccionadas del grupo que consiste
en:
- magnesio quelatasa de tipo activo o inactivo que tiene afinidad por la protoporfirina IX,
- ferroquelatasa de tipo activo o inactivo que tiene afinidad por la protoporfirina IX,
- un péptido que tiene afinidad por la protoporfirina IX, compuesto por 6 a 100 aminoácidos, estando dichos péptidos esencialmente libres de regiones marco de regiones variables de una inmunoglobulina,
- protoporfirinógeno IX oxidasa de tipo inactivo que tiene afinidad por el protoporfirinógeno IX, y
- coproporfirinógeno III oxidasa de tipo activo o inactivo que tiene afinidad por el protoporfirinógeno IX;
- no teniendo esencialmente dichas proteínas capacidad para modificar el protoporfirinógeno IX;
donde las proteínas seleccionadas también pueden
estar caracterizadas por las siguientes características (a) a
(c):
- (a)
- tener una afinidad específica por la protoporfirina IX;
- (b)
- no tener esencialmente capacidad para modificar el protoporfirinógeno IX; y
- (c)
- estar sustancialmente libre de regiones marco de regiones variables de inmunoglobulinas.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "afinidad específica" por la
protoporfirina IX en la característica (a) es esencialmente lo mismo
que en el primer aspecto del método de la presente invención y
significa que la proteína y la protoporfirina IX se unen entre sí,
enzimáticamente o la proteína y la protoporfirina IX se unen entre
sí basándose en la afinidad y especificidad como las mostradas en
el enlace químico del receptor tal como el enlace entre un receptor
y un ligando y similares. Las proteínas pueden ser proteínas de
origen natural; variantes de las mismas en las cuales se introduce
una sustitución, adición, deleción, modificación y similares de
aminoácidos en proteínas de origen natural; y proteínas
sintetizadas artificialmente que tienen secuencias de aminoácidos
al azar que se seleccionan con las pautas de una afinidad por la
protoporfirina IX con tal que tengan estructuras que se unen
específicamente a la protoporfirina IX.
El término "que no tiene esencialmente
capacidad para modificar" el protoporfirinógeno IX en la
característica (b) significa que la reactividad enzimática con el
protoporfirinógeno IX de la proteína es esencialmente inactiva o no
existe. Por ejemplo, esto significa que la proteína no tiene
capacidad para convertir el protoporfirinógeno IX en una sustancia
que tiene una estructura química diferente de la del
protoporfirinógeno IX.
El término "esencialmente libre de regiones
marco de regiones variables de inmunoglobulinas" significa lo
mismo que en el primer aspecto anterior del método de la presente
invención y la proteína no forma la estereoestructura específica de
las regiones variables de la inmunoglobulina como se ha descrito
aquí anteriormente.
Como ejemplos específicos de las proteínas que
tienen las características (a) a (c) anteriores, existen proteínas
de unión de tipo activo o inactivo que tienen afinidad por la
protoporfirina IX [p. ej., magnesio quelatasa de tipo activo o
inactivo cuyo sustrato es la protoporfirina IX, ferroquelatasa de
tipo activo o inactivo, cobalto quelatasa de tipo activo o inactivo
que cataliza una reacción de quelación de un ión cobalto con un
compuesto que tiene un anillo de tetrapirrol como sustrato,
péptidos, esto es, proteínas compuestas por 4 a 100 aminoácidos,
que tienen afinidad por la protoporfirina IX (por ejemplo, proteínas
que contienen al menos un péptido seleccionado entre el péptido
HASYS que tiene afinidad por la protoporfirina IX, p. ej., una
proteína que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:
53 y una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID
NO: 54; el péptido RASSL que tiene afinidad por la protoporfirina
IX, esto es, una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos
del SEQ ID NO: 55 y una proteína que tiene la secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 56; el péptido YAGY que tiene afinidad
por compuestos de porfirina, p. ej., una proteína que comprende la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 57 y una proteína que tiene
la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 58; el péptido YAGF que
tiene afinidad por compuestos de porfirina, esto es, una proteína
que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 59 y una
proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 60; y
similares)], y similares.
Los genes que codifican las proteínas anteriores
pueden ser obtenidos, por ejemplo, como sigue.
Las magnesio quelatasas de tipo activo están
compuestas por tres proteínas subunitarias heterogéneas, esto es,
la proteína de la subunidad unión a protoporfirina IX (proteína de
la subunidad H), la proteína de la subunidad I y la proteína de la
subunidad D, todas ellas esenciales para la actividad catalítica.
Tres proteínas de subunidades independientes están codificadas por
genes diferentes. Los genes de la proteína de la subunidad de unión
a protoporfirina IX pueden ser obtenidos mediante PCR o escrutinio
de la colección de ADNc como se ha descrito aquí anterior-
mente.
mente.
En cuanto al gen que codifica la proteína de la
subunidad I de una magnesio quelatasa, por ejemplo, se conocen
aquellas derivadas de la bacteria fotosintética, Rhodobacter
sphaeroides (Acceso Genebank AF017642), Rhodobacter
capsulatus (Acceso Genebank Z11165), Arabidopsis (Acceso
Genebank D49426), cebada (Acceso Genebank U26545), soja (Acceso
Genebank D45857), tabaco (Acceso Genebank AF14053),
Synechocystis P.C.C.6803 (Acceso Genebank U35144) y
similares. Para aislar semejante gen conocido (se conoce su
secuencia de nucleótidos), se puede llevar a cabo la PCR utilizando
ADN genómico o ADN de un organismo que tiene el gen deseado como
molde y cebadores producidos basándose en las secuencias de
nucleótidos correspondientes a aquellas cercanas a los extremos N y
C de la proteína codificada por el gen deseado. Adicionalmente, los
genes que codifican la proteína de la subunidad I de una magnesio
quelatasa pueden ser obtenidos a partir de organismos fotosintéticos
distintos de los anteriores. Por ejemplo, se construye primero una
colección de ADNc obteniendo ARNm de los organismos fotosintéticos
deseados, sintetizando el ADNc utilizando el ARNm como molde con una
transcriptasa inversa, e integrando el ADNc en un vector de fago
tal como ZAPII, etc. o un vector plasmídico tal como pUC, etc. Para
amplificar un fragmento de ADN que contiene al menos una parte del
gen que codifica la proteína de la subunidad I de una magnesio
quelatasa, se puede llevar a cabo una PCR utilizando la colección de
ADNc construida anteriormente como molde y cebadores diseñados y
sintetizados basándose en las secuencias de nucleótidos bien
conservadas entre los genes conocidos tales como los genes
descritos anteriormente. El escrutinio de la colección de ADNc se
puede llevar a cabo utilizando el fragmento de ADN obtenido de este
modo como sonda para seleccionar clones positivos. El gen deseado
de la proteína de la subunidad I de una magnesio quelatasa puede ser
confirmado mediante la determinación de la secuencia de nucleótidos
del clon seleccionado.
En cuanto al gen que codifica la proteína de la
subunidad D de una magnesio quelatasa, por ejemplo, se conocen
aquellos derivados de la bacteria fotosintética, Rhodobacter
sphaeroides (Acceso Genebank AJ001690), Rhodobacter
capsulatus (Acceso Genebank Z11165), guisante (Acceso Genebank
AFO14399), tabaco (Acceso Genebank Y10022), Synechocystis
P.C.C.6803 (Acceso Genebank X96599) y similares. El aislamiento de
semejante gen conocido (su secuencia de nucleótidos es conocida) o
de genes distintos de los anteriores se puede llevar a cabo de la
misma manera que se ha descrito en el del gen que codifica la
proteína de la subunidad I de la magnesio quelatasa.
Los genes utilizados en el tercer aspecto, del
método de la presente invención para elaborar plantas resistentes a
los compuestos para el control de las malas hierbas son aquellos que
codifican proteínas seleccionadas del grupo que consiste en:
- magnesio quelatasa de tipo activo o inactivo que tiene afinidad por la protoporfirina IX,
- ferroquelatasa de tipo activo o inactivo que tiene afinidad por la protoporfirina IX
- un péptido que tiene afinidad por la protoporfirina IX, compuesto por 6 a 100 aminoácidos, estando dichos péptidos esencialmente libres de regiones marco de regiones variables de inmunoglobulina,
- Protoporfirinógeno IX oxidasa de tipo inactivo que tiene afinidad por el protoporfirinógeno IX, y
- coproporfirinógeno III oxidasa de tipo activo o inactivo que tiene afinidad por el protoporfirinógeno IX;
- no teniendo esencialmente dichas proteínas capacidad para modificar el protoporfirinógeno IX;
donde las proteínas seleccionadas también pueden
estar caracterizadas por las siguientes características (a) a
(c):
- (a)
- tener una afinidad específica por el protoporfirinógeno IX;
- (b)
- tener la capacidad de modificar el coproporfirinógeno III; y
- (c)
- estar esencialmente libre de regiones marco de regiones variables de inmunoglobulinas.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "una afinidad específica" por el
protoporfirinógeno IX de la característica (a) es esencialmente el
mismo que el del primer o segundo aspecto anteriores del método de
la presente invención y significa que la proteína y el
protoporfirinógeno IX se unen entre sí, enzimáticamente o la
proteína y el protoporfirinógeno IX se unen entre sí basándose en
la afinidad y la especificidad mostradas en el enlace
receptor-compuesto químico tal como un enlace entre
un receptor y un ligando y similares. Las proteínas pueden ser
proteínas de origen natural; variantes de las mismas en las cuales
se introduce una sustitución, adición, deleción, modificación y
similares de aminoácidos en las proteínas de origen natural; y
proteínas sintetizadas artificialmente que tienen secuencias de
aminoácidos al azar que se seleccionan con las pautas de afinidad
por el protoporfirinógeno IX con tal que tengan estructuras que se
unen específicamente al protoporfirinógeno IX.
El término "que no tiene la capacidad de
modificar" el coproporfirinógeno III de la característica (b)
significa que la reactividad enzimática con el coproporfirinógeno
III de las proteínas está inactiva. Por ejemplo, esto significa que
la proteína tiene la capacidad de convertir el coproporfirinógeno
III en una sustancia que tiene una estructura química diferente de
la del coproporfirinógeno III.
El término "esencialmente libre de regiones
marco de regiones variables de inmunoglobulinas" significa lo
mismo que en el primer o segundo aspecto anterior del método de la
presente invención y la proteína no forma la estereoestructura
específica para las regiones variables de la inmunoglobulina como se
ha descrito aquí antes.
Como ejemplos específicos de las proteínas que
tienen las características (a) a (c) anteriores, se encuentran las
proteínas de unión de tipo activo o inactivo que tienen afinidad por
el proporfirinógeno IX, por ejemplo, la coproporfirinógeno III
oxidasa de tipo activo cuyo sustrato es el proporfirinógeno IX, y
similares.
Como referencia, la actividad de una magnesio
quelatasa, una ferroquelatasa o una coproporfirinógeno III oxidasa
se mide, por ejemplo, utilizando el siguiente método.
Los genes que codifican tres proteínas de
subunidades independientes se utilizan para detectar la actividad
magnesio quelatasa de acuerdo con el método de Gibson, L.C.D., et
al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92; pág. 1941 (1995)) y
similares.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede detectar una actividad ferroquelatasa,
por ejemplo, de acuerdo con el método de Porra, R.J. (Anal.
Biochem., 68; pág. 289 (1975)) y similares.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede detectar una actividad
coproporfirinógeno III oxidasa, por ejemplo, de acuerdo con el
método de Yoshinaga, T., Sano, S., et al. (J. Biol. Chem.,
255; pág. 4722 (1980)) y similares.
En el método (incluyendo el primer y el segundo
aspecto anteriores) de la presente invención, para introducir el
gen que codifica la proteína mencionada en la presente memoria, se
puede introducir un gen que codifica una proteína. Adicionalmente,
se pueden introducir genes plurales que codifican proteínas
diferentes en una célula vegetal. Semejante introducción de genes
en células vegetales se puede llevar a cabo mediante técnicas
convencionales de ingeniería genética, por ejemplo, infección con
Agrobacterium (JP-B 2-58917 y
JP-A 60-70070), electroporación en
protoplastos (JP-A 60-251887 y
JP-A 5-68575), métodos de pistola
génica (JP-A 5-508316 y
JP-A 63-258525), y similares.
Preferiblemente, el gen que se va a introducir en una célula vegetal
es integrado en un vector que tiene un gen marcador de selección
tal como un gen que puede proporcionar resistencia al inhibidor del
crecimiento celular a la célula vegetal.
Para la expresión del gen en la célula vegetal,
se puede introducir el gen en el cromosoma de una célula vegetal
mediante recombinación homóloga [Fraley, R.T. et al., pro.
Natl. Acad. Sci. USA, 80; pág. 4803 (1983)] para seleccionar la
célula vegetal que expresa el gen. Alternativamente, se puede
introducir el gen en una célula vegetal de forma que esté ligado
operablemente a un promotor y a un terminador ambos los cuales
pueden funcionar en la célula vegetal.
El término "ligado operablemente" utilizado
en la presente memoria significa que el promotor y el terminador
anteriores está unidos en un estado tal que el gen introducido es
expresado en la célula vegetal bajo el control del promotor y el
terminador.
En cuanto al promotor que puede funcionar en una
célula vegetal, por ejemplo, existen promotores constitutivos
derivados de ADN T tales como el promotor del gen de la nopalina
sintasa, el promotor del gen de la octopina sintasa, etc.,
promotores derivados de virus vegetales tales como los promotores de
19S y 35S derivados del virus del mosaico de la coliflor, etc.,
promotores inductivos tales como el promotor del gen de la
fenilalanina amoníaco-liasa, el promotor del gen de
la chalcona sintasa, el promotor del gen de la proteína relacionada
con la patogénesis, etc., y similares. El promotor no está limitado
a estos promotores y se pueden utilizar otros promotores
vegetales.
En cuanto al terminador que puede funcionar en
una célula vegetal, por ejemplo, existen terminadores derivados de
ADN T tales como el terminador de la nopalina sintasa, etc.,
terminadores derivados de virus vegetales tales como terminadores
derivados de virus del ajo GV1, GV2, etc., y similares. El
terminador no está limitado a estos terminadores y se pueden
utilizar otros terminadores vegetales.
En cuanto a las células vegetales en las que se
introducen los genes, por ejemplo, existen tejidos vegetales,
plantas completas, células cultivadas, semillas y similares. Los
ejemplos de las especies de plantas en las cuales se introducen los
genes incluyen dicotiledóneas tales como tabaco, algodón, colza,
remolacha azucarera, oruga, canola, lino, girasol, patata, alfalfa,
lechuga, banana, soja, guisante, legumbres, pinos, chopos, manzano,
uva, frutos cítricos, nueces, etc.; y monocotiledóneas tales como
maíz, arroz, trigo, cebada, ballico, avena, sorgo, caña de azúcar,
césped,
etc.
etc.
Las células vegetales transformantes que
expresan el gen que codifica la proteína de unión mencionada en la
presente memoria se pueden obtener cultivando células en las cuales
el gen es transferido a un medio de cultivo de selección
correspondiente a un marcador de selección unido al locus del gen,
por ejemplo, un medio de cultivo que contiene un inhibidor del
crecimiento celular, o similar, y aislando un clon capaz de crecer
en el medio de cultivo. Alternativamente, las células vegetales
transformantes anteriores pueden ser seleccionadas cultivando
células vegetales en las que el gen es introducido en un medio de
cultivo que contiene el compuesto para el control de las malas
hierbas a las que se proporciona resistencia, y aislando clones
capaces de crecer en el medio de cultivo. La planta resistente al
compuesto para el control de las malas hierbas deseada se puede
obtener a partir de células transformantes obtenidas de este modo
regenerando la planta completa de acuerdo con un método de cultivo
de células vegetales convencional, por ejemplo, el descrito en Plant
Gene Manipulation Manual, Method for Producing Transgenic Plants,
UCHIMIYA, Kodansha Scientific (1996). De este modo, se pueden
obtener plantas transformadas tales como tejidos vegetales, plantas
completas, células cultivadas, semillas y similares.
Por ejemplo, se pueden obtener arroz y oruga que
expresan el gen que codifica la proteína anterior de acuerdo con el
método descrito en Experimental Protocol of Model Plants, Rice y
Mouse-Ear Cress Edition, (Supervisores: Koh
SHIMAMOTO y Kiyotaka OKADA, Shujun-sha, 1996),
Capítulo 4. Adicionalmente, de acuerdo con el método descrito en la
solicitud de patente Japonesa 3-291501, se puede
obtener soja que expresa el gen que codifica la proteína de unión
introduciendo el gen en embrión adventicio de soja con una pistola
de partículas. Del mismo modo, de acuerdo con el método descrito
por Fromm, M.E., et al., Bio/Technology, 8; pág. 838 (1990),
se puede obtener maíz que expresa el gen que codifica la proteína
anterior introduciendo el gen en embrión adventicio con una pistola
de partículas. Se puede obtener trigo que expresa el gen que
codifica la proteína anterior introduciendo el gen un escutelo
inmaduro de trigo cultivado en condiciones estériles con una
pistola de partículas de acuerdo con un método convencional
descrito por TAKUMI et al., Journal of Breeding Society
(1995), 44: Extra Vol. 1, pág. 57. Del mismo modo, de acuerdo con
un método convencional descrito por HAGIO, et al., Journal
of Breeding Society (1995), 44; Extra Vol. 1, pág. 67, se puede
obtener cebada que expresa el gen que codifica la proteína anterior
introduciendo el gen en escutelo inmaduro de cebada cultivado en
condiciones estériles con una pistola de partículas.
Para la confirmación de la resistencia al
compuesto para el control de las malas hierbas de la planta que
expresa el gen que codifica la proteína anterior, preferiblemente,
la planta se reproduce aplicando el compuesto para el control de
las malas hierbas al cual se proporciona resistencia para evaluar el
grado de reproducción de la planta. Para una confirmación más
cuantitativa, por ejemplo, en el caso de la resistencia a un
compuesto que tiene actividad herbicida de tipo inhibidor de PPO,
preferiblemente, se sumergen porciones de hojas de la planta en
soluciones acuosas que contienen el compuesto que tiene actividad
herbicida de tipo inhibidor de PPO a diferentes concentraciones, o
las soluciones acuosas que contienen el compuesto que tiene
actividad herbicida se pulverizan sobre porciones de hojas de la
planta, dejando estar después sobre medio de agar con luz a la
temperatura ambiente. Después de varios días, se extrae la clorofila
de las hojas de la planta de acuerdo con el método descrito por
Mackenney, G., J. Biol. Chem., 140; pág. 315 (1941) para determinar
el contenido de clorofila.
Puesto que las plantas resistentes al compuesto
para el control de las malas hierbas (p. ej., tejidos de plantas,
plantas completas, células cultivadas, semillas, etc.) obtenidas
mediante el método de la presente invención (incluyendo los
aspectos primero a tercero) muestran resistencia a los compuestos
para el control de las malas hierbas, incluso en el caso en el que
se aplica un compuesto de control de las malas hierbas a una zona de
crecimiento (p. ej., una zona de cultivo, una zona de
proliferación, etc.), la planta puede crecer. Por lo tanto, cuando
se aplica un compuesto para el control de las malas hierbas a una
zona de crecimiento de la planta resistente al compuesto para el
control de las malas hierbas deseada, la planta deseada puede ser
protegida de las plantas sin resistencia respecto a la planta para
el control de las malas hierbas. Por ejemplo, se pueden controlar
eficazmente las malas hierbas aplicando un compuesto para el control
de las malas hierbas sobre una zona de crecimiento de la planta que
tiene resistencia al compuesto para el control de las malas
hierbas.
Adicionalmente, aplicando un compuesto para el
control de las malas hierbas a una zona de crecimiento de la planta
resistente al compuesto para el control de las malas hierbas
obtenida mediante el método de la presente invención (incluyendo
los aspectos primero a tercero) y otras plantas (p. ej., aquellas
que no tienen resistencia o tienen una resistencia débil al
compuesto para el control de las malas hierbas), se puede
seleccionar una de las plantas basándose en la diferencia en el
crecimiento entre las plantas. Por ejemplo, aplicando (añadiendo)
un compuesto para el control de las malas hierbas a una zona de
cultivo (medio de cultivo) de la planta resistente al compuesto
para el control de las malas hierbas obtenida mediante el método de
la presente invención y otras células vegetales (p. ej., aquellas
que no tienen resistencia o tiene una resistencia débil al compuesto
para el control de las malas hierbas), se puede seleccionar una de
las células vegetales eficazmente basándose en la diferencia en el
crecimiento entre las plantas.
Los siguientes Ejemplos ilustran adicionalmente
la presente invención con detalle pero no se debe considerar que
limitan el alcance de la misma.
Se preparó ADN genómico de la bacteria
fotosintética Rhodobacter sphaeroides ATCC17023 utilizando el
kit ISOPLANT para la preparación de ADN genómico (fabricado por
Nippon Gene). Después, de acuerdo con la descripción de Gibson,
L.C.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. URSA, 92; pág. 1941
(1995), se llevó a cabo la PCR utilizando aproximadamente 1 \mug
de dicho ADN genómico como molde, y 10 pmoles de un oligonucleótido
compuesto por la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ
ID NO: 1 y 10 pmoles de un oligonucleótido compuesto por la
secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 2 como
cebadores para amplificar el fragmento de ADN que contenía el gen
de la proteína de la subunidad de unión a protoporfirina IX
bchH de la magnesio quelatasa. Los oligonucleótidos se
prepararon con un sintetizador de ADN (PE Applied Biosystems;
sintetizador de ADN/ARN Modelo 394) y se purificaron con un
cartucho para la purificación de oligonucleótidos (PE Applied
Biosystems; cartucho OPC). La PCR se llevó a cabo manteniendo a 94ºC
durante 2 minutos, a 96ºC durante 40 segundos y después a 68ºC
durante 7 minutos, repitiendo un ciclo de mantenimiento a 96ºC
durante 40 segundos y después a 68ºC durante 7 minutos 28 veces, y
manteniendo finalmente a 96ºC durante 40 segundos, a 68ºC durante 7
minutos y después a 72ºC durante 10 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la descripción de Gibson, L.C.D.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92; pág. 1941 (1995), se
digirió el fragmento de ADN que contenía el gen bchH
preparado en el Ejemplo 1 con las enzimas de restricción NdeI y
BglII. El fragmento de ADN resultante se insertó entre el sitio de
restricción NdeI y el sitio de restricción BamHI del vector de
expresión pET11a (fabricado por Stratagene) para obtener el plásmido
pETBCH (Fig. 1). Este plásmido pETBCH se introdujo en células
competentes de la cepa BL21(DE3) de E. coli (fabricado
por Stratagene) de acuerdo con el manual adjunto a las células
competentes para obtener la cepa BL21(DE3)/pETBCH de E.
coli. La cepa se inoculó en 1,5 ml de medio de cultivo líquido
LB (triptona al 1%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 0,5%) que
contenía 100 \mug/ml de ampicilina en un tubo (14 x 10 mm), y el
tubo se cubrió con papel de aluminio (referido en adelante como
condiciones de oscuridad), se cultivó con sacudimiento a 37ºC a la
luz de una lámpara fluorescente (aproximadamente 8000 lux). Cuando
la absorbancia a 600 nm del medio de cultivo líquido llegó a 0,6,
se añadió
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) al medio de cultivo líquido de manera que la concentración
final fuera de 0,4 mM, y el cultivo continuó durante aproximadamente
20 horas más. En ese momento, la Escherichia coli viró a
color rojo y se observó absorbancia fluorescente (longitud de onda
de excitación 405 nm, longitud de onda de emisión 630 nm) que
demostró la acumulación de protoporfirina IX en E. coli.
Cuando se cultivó la cepa BL21(DE3)/pETBCH de E. coli
de la misma manera excepto que no se añadió IPTG, la E. coli
no viró a color rojo y no se detectó la absorbancia fluorescente
anterior. En contraste con esto, cuando se cultivó la cepa
BL21(DE3)/pETHCH de E. coli de la misma manera (con
IPTG) excepto que el tubo no estaba cubierto con papel de aluminio
(referido en adelante como condiciones de luz), E. coli
creció y viró a color rojo como antes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembró soja (Glycine max var. Williams 82) y
se cultivó a 25ºC durante 20 días y se recogieron hojas verdes. Las
hojas verdes recogidas se congelaron con nitrógeno líquido y las
hojas congeladas se trituraron con una mano y un mortero. De las
hojas trituradas, se extrajo el ARN utilizando el reactivo para la
extracción de ARN ISOGEN (fabricado por Nippon Gene) de acuerdo con
el manual adjunto. El extracto líquido con ARN resultante se
sometió a precipitación con etanol para recoger el ARN total,
después el ARN total se fraccionó utilizando el kit de
fraccionamiento de ADN poli (A) BIOMAG mRNA Purification Kit
(fabricado por Perceptive Bio System) de acuerdo con el manual
adjunto para recoger la fracción de ARN poli(A). Utilizando 1
\mug de esta fracción de ARN poli(A) como molde, se
sintetizó ADNc con el reactivo sintético de ADNc contenido en el kit
de amplificación de ADNc Marathon (fabricado por Clontech) de
acuerdo con el manual adjunto. La PCR se llevó a cabo utilizando el
ADNc resultante como molde, y el oligonucleótido compuesto por la
secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 3 y el oligonucleótido
compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 4 como
cebadores para amplificar el fragmento de ADN que contiene el gen
de la protoporfirinógeno IX oxidasa de tipo cloroplasto. Los
oligonucleótidos anteriores se prepararon con un sintetizador de
ADN (PE Applied Biosystems; sintetizador de ADN/ARN Modelo 394) y
se purificaron con un cartucho de purificación de oligonucleótidos
(PE Applied Biosystems; cartucho OPC). La PCR se llevó a cabo
manteniendo a 94ºC durante 1 minuto y después a 65ºC durante 5
minutos, repitiendo un ciclo de mantenimiento a 94ºC durante 15
segundos y después a 65ºC durante 5 minutos 29 veces. Después de la
PCR, el fragmento de ADN amplificado se purificó filtrando la mezcla
de reacción con MicroSpin S-400HR (fabricado por
Pharmacia Biotech), y el fragmento de ADN se ligó al plásmido pCR2.1
(fabricado por Invitrogen) escindido por la enzima de restricción
SalI para obtener el plásmido pSPPO-P. Después, se
introdujo el plásmido en células competentes de la cepa
INV\alphaF' de E. coli (fabricada por Invitrogen) y se
seleccionaron las cepas resistentes a ampicilina. Después, el
plásmido contenido en las cepas resistentes a ampicilina
seleccionadas se secuenciaron utilizando el kit de Secuenciación
Dye Terminator Cycle Sequencing (fabricado por PE Applied
Biosystems) y el secuenciador de ADN 3735 (fabricado por PE applied
Biosystems). Como resultado, se revelo la secuencia de nucleótidos
del SEQ ID NO: 5, confirmando de ese modo que el plásmido
pSPPO-P contenía el gen de la protoporfirinógeno IX
oxidasa de tipo cloroplasto de
soja.
soja.
Se digirió el plásmido pSPPO-P
con la enzima de restricción PshBI, se volvieron romos los extremos
del fragmento de ADN resultante utilizando ADN polimerasa de T4 y
adicionalmente se digirieron con SphI para aislar el fragmento de
ADN que contenía el gen de PPO de tipo cloroplasto de la soja y el
promotor lac. Después, se digirió el plásmido pACYC_{1}84
(fabricado por Nippon Gene) con las enzimas de restricción NruI y
SphI para separar el fragmento de 410 pb y se insertó el fragmento
de ADN anterior en su lugar para obtener el plásmido pACYCSP (Fig.
2). Después, se introdujo el plásmido pACYCSP en la cepa BT3 de
E. coli carente del gen PPO (locus del gen hemG) (descrito
por Yamamoto, F. et al., Japanese J. Genet., 63; pág. 237
(1988) etc.) de acuerdo con el método descrito por Hanahan, D.J.,
Mol. Biol., 166; pág. 557 (1983). La E. coli resultante se
cultivó en medio YPT (5 g/litro de extracto de levadura, 5 g/litro
de triptona, 5 g/litro de peptona, 10 g/litro de NaCl, pH 7,0) que
contenía 15 \mug/ml de cloramfenicol y 10 \mug/ml de kanamicina
para seleccionar la cepa BT3/pACYCSP de E. coli resistente a
cloramfenicol y kanamicina cuya carencia de gen hemG fue
complementada por el gen derivado de la soja.
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Se inoculó la cepa BT3/pACYCSP de E. coli
preparada en el Ejemplo 3 en medio YPT que contenía 10 o 1 ppm de
compuesto herbicida de tipo inhibidor de PPO representado por la
Estructura 8 anterior, 10 \mug/ml de hemina, 50 \mug/ml de
ácido aminolevulínico, 15 \mug/ml de cloramfenicol y 10 \mug/ml
de kanamicina, se cultivó en condiciones de oscuridad o en
condiciones de luz de la misma manera que en el Ejemplo 2. Como
control, se cultivó la cepa BT3/pACYCSP de E. coli en el
mismo medio que antes sin los compuestos herbicidas en las mismas
condiciones. Luego, a las 18 horas del inicio del cultivo, se midió
la absorbancia del medio de cultivo líquido a 600 nm. Tomando la
absorbancia del medio sin el compuesto herbicida como 1, se calculó
el valor relativo de la absorbancia del medio que contenía el
compuesto herbicida. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó el plásmido pTVBCH (Fig. 3)
mediante amplificación del fragmento de ADN que contenía el gen bchH
derivado de la bacteria fotosintética Rhodobacter
sphaeroides utilizando un oligonucleótido compuesto por la
secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1 y el oligonucleótido
compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 2 de la
misma manera que en el Ejemplo 1, digestión del fragmento de ADN
resultante con las enzimas de restricción NcoI y BgIII e
introducción del fragmento de ADN digerido entre el sitio de
restricción NcoI y el sitio de restricción BamHI del plásmido
pTV118N (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.).
Se introdujeron los plásmidos pTVBCH y pTV118N
respectivamente en la cepa BT3/pACYCSP de E. coli preparada
en el Ejemplo 3 de acuerdo con el método descrito por Hanahan, D.J.,
Mol. Biol., 166; pág. 557 (1983). La E. coli resultante se
cultivó en medio YPT que contenía 100 \mug/ml de ampicilina, 15
\mug/ml de cloramfenicol y 10 \mug/ml de kanamicina para
obtener la cepa BT3/pACYCSP+pTVBCH de E. coli que portaba los
plásmidos pACYCSP y pTVBCH, y la cepa BT3/pACYCSP+pTV118N de E.
coli que portaba los plásmidos pACYCSP y pTV118N.
Estas cepas se inocularon en medio YPT que
contenía 10 o 1 ppm del compuesto herbicida de tipo inhibidor de
PPO representado por la Estructura 8 anterior, 100 \mug/ml de
ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol, 10 \mug/ml de
kanamicina, 10 \mug/ml de hemina y 50 \mug/ml ácido
aminolevulínico, se cultivaron en condiciones de oscuridad o
condiciones de luz de la misma manera que en el Ejemplo 2. Después,
a las 18 del inicio del cultivo, se midió la absorbancia del medio
de cultivo líquido a 600 nm. Tomando la absorbancia del medio sin
el compuesto herbicida como 1, se calculó el valor relativo de la
absorbancia del medio que contenía el compuesto herbicida. Los
resultados se muestran en la Tabla 2.
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Adicionalmente, estas cepas se inocularon en
medio YPT que contenía compuestos herbicidas de tipo inhibidor de
PPO representados por las Estructuras 1, 14, 15,
18-22, 29, 32, 33, 34 y 36, anteriores,
respectivamente, 100 \mug/ml de ampicilina, 15 \mug/ml de
cloramfenicol, 10 \mug/ml de kanamicina, de 10 \mug/ml hemina y
de 50 \mug/ml ácido aminolevulínico, se cultivaron en condiciones
de oscuridad o en condiciones de luz similares a las del Ejemplo 2.
Después, a las 18 horas del inicio del cultivo, se midió la
absorbancia del medio de cultivo líquido a 600 nm. Tomando la
absorbancia del medio sin compuesto herbicida como 1, se calculó el
valor relativo de la absorbancia del medio que contenía el compuesto
herbicida. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
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Se construyó un plásmido para introducir el gen
bchH en una planta mediante el método de infección con
Agrobacterium. Primero, se digirió el vector binario pBI121
(fabricado por Clontech) con la enzima de restricción SacI, y se
insertó el conector Kpn I (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.)
para preparar el plásmido pBIK en el que se separó el sitio de
reconocimiento SacI de pBI121 y se añadió el sitio de reconocimiento
de Kpn I. Por otra parte, de la misma manera que en el Ejemplo 1,
se llevó a cabo la PCR utilizando el ADN genómico de la bacteria
fotosintética Rhodobacter sphaeroides como molde, y el
cebador oligonucleotídico compuesto por la secuencia de nucleótidos
del SEQ ID NO: 7 y el cebador oligonucleotídico compuesto por la
secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 8 para amplificar el
fragmento de ADN que contenía el gen bchH. Después, se digirió el
plásmido pBIK anterior con las enzimas de restricción XbaI y KpnI
para separar el gen de la \beta-glucuronidasa, y
en lugar de ello, se insertó un fragmento de ADN que se obtuvo
digiriendo el fragmento de ADN anterior que contenía el gen bchH
con las enzimas de restricción XbaI y KpnI para producir el plásmido
pBIBCH (Fig. 4) en el que se unía el gen bchH aguas abajo del
promotor de 35S. El vector binario pBI121 (fabricado por Clontech)
también se digirió con las enzimas de restricción BamHI y SacI para
separar el gen de la \beta-glucuronidasa, se
volvieron romos los extremos del fragmento de ADN resultante
utilizando ADN polimerasa de T4, seguido de
auto-ciclación con ADN ligasa de T4 para construir
el plásmido pNO (Fig. 5). Se utilizó el plásmido como vector
control del plásmido de expresión de bchH pBIBCH.
Se introdujeron el plásmido pBIBCH y pNO en
Agrobacterium tumefaciens LBA4404, respectivamente. Las cepas
de Agrobacterium que portaban pBIBCH y que portaban pNO se
aislaron cultivando los transformantes resultantes en un medio que
contenía 300 \mug/ml de estreptomicina, 100 \mug/ml de
rifampicina y 25 \mug/ml de kanamicina y seleccionando los
transformantes deseados.
Después, de acuerdo con el método descrito en el
Manual para la Manipulación Génica de Plantas (de Hirofumi
UCHIMIYA, Kodan-sha Scientific, 1992), se introdujo
el gen en tabaco. Se cultivó la cepa de Agrobacterium que
portaba el plásmido pBIBCH a 28ºC durante la noche en medio LB y
luego se sumergieron trozos de hoja de tabaco cultivado en
condiciones estériles en el medio de cultivo líquido. Los trozos de
hoja se cultivaron a la temperatura ambiente durante 2 días en
medio Murashige-Skoog (medio MS, descrito por
Murasige T. y Skoog F., Physiol. Plant. (1962) 15, pág. 473) que
contenía agar al 0,8%, 0,1 mg/litro de ácido naftalenoacético y 1,0
mg/litro de bencilaminopurina. Después, se lavaron trozos de hoja
con agua esterilizada y se cultivaron durante 7 días en medio MS
que contenía agar al 0,8%, 0,1 mg/litro de ácido naftalenoacético,
1,0 mg/litro de bencilaminopurina y 500 \mug/ml de cefotaxima. Se
transplantaron los trozos de hoja a medio MS que contenía agar al
0,8%, 0,1 mg/litro de ácido naftalenoacético, 1,0 mg/litro de
bencilaminopurina, 500 \mug/ml de cefotaxima y 100 \mug/ml de
kanamicina (referido en adelante como medio MS selectivo) y se
cultivaron sobre medio continuamente durante 4 meses transplantando
los trozos de hoja de tabaco sobre medio MS selectivo reciente cada
mes. Durante el cultivo, aparecieron brotes diferenciados de tallo y
hoja a partir de los trozos de hoja de tabaco; estos brotes se
transplantaron a medio MS que contenía agar al 0,8%, 300 \mug/ml
de cefotaxima y 50 \mug/ml de kanamicina para inducir raíces para
obtener plantas regeneradas. La planta regenerada resultante se
transplantó y se cultivó sobre medio MS con agar al 0,8% y 50
\mug/ml de kanamicina para obtener plantas de tabaco en las
cuales se introdujo el gen bchH. De un modo similar, se infectaron
trozos de hojas de tabaco con una cepa de Agrobacterium que
portaba pNO para obtener plantas regeneradas a partir de los trozos
de hoja de tabaco y plantas de tabaco (referidas en adelante como
tabaco recombinante de control).
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogieron las hojas de tabaco en las cuales
se había introducido el gen bchH y las hojas de tabaco recombinante
de control obtenidas en el Ejemplo 5 y cada hoja se dividió en
trozos equivalentes derecho e izquierdo a lo largo del nervio
principal, respectivamente. A un trozo se le aplicó una solución
acuosa que contenía 0,3 ppm de compuesto herbicida de tipo
inhibidor de PPO de Estructura 8, mientras, al otro trozo no se le
aplicó el compuesto. Estos trozos de hoja se colocaron en medio MS
que contenía agar al 0,8% y se dejaron estar a la temperatura
ambiente durante 7 días en un lugar con luz. Después, se trituró
cada trozo de hoja con una mano y un mortero en 5 ml de solución
acuosa de acetona al 80% para extraer la clorofila. El líquido del
extracto se diluyó con solución acuosa de acetona al 80% y se midió
la absorbancia a 750 nm, 663 nm y 645 nm para calcular el contenido
total de clorofila de acuerdo con el método descrito por Macknney
G., J. Biol. Chem. (1941) 140, pág. 315. Los resultados obtenidos
de 4 clones de tabaco en los que se introdujo el gen bchH (BCH1 a 4)
y del tabaco recombinante de control se muestran en la Tabla 4. En
la tabla, se representó el nivel de resistencia al compuesto
herbicida por medio de porcentajes del contenido total de clorofila
de los trozos de hoja tratados con compuesto herbicida con respecto
a los de los trozos de hoja no tratados.
El clon de tabaco en el que se había introducido
el gen bchH y el tabaco recombinante de control también se trataron
de la misma manera con la solución que contenía el compuesto
herbicida de tipo inhibidor de PPO representado por la Estructura
3, 7, 10, 11, 13, 17, 23, 24, 25, 27, 28, 30 o 35 anterior, y se
midió el nivel de resistencia a cada compuesto herbicida. Los
resultados se muestran en la Tabla 5. En la tabla, los niveles de
resistencia al compuesto herbicida se representaron como
porcentajes del contenido de clorofila total de los trozos de hoja
tratados con el compuesto herbicida con respecto al de los trozos de
hoja no tratados.
Los ARN totales se prepararon a partir de tejido
de hoja de tabaco (Nicotiana tabacum cv. SR1) utilizando el
kit RNeasy Plant (fabricado por QIAGEN) de acuerdo con el manual
adjunto. El fragmento de ADN que contenía el gen que codifica la
proteína de la subunidad de unión a protoporfirina IX de la magnesio
quelatasa de tabaco cuya señal de tránsito a cloroplastos ha sido
suprimida (referida en adelante como subunidad de la quelatasa de
tabaco variante) se obtuvo utilizando el Kit RNA LA PCR (AMV) Ver
1.1 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) de acuerdo con el manual
adjunto. Primero, se sintetizó la 1ª hebra de ADN utilizando los ARN
totales de tabaco como moldes y el Oligo dT-Adaptor
Primer contenido en el kit anterior como cebador con la
transcriptasa inversa contenida en el kit anterior. Después, se
llevó a cabo la PCR utilizando la 1ª hebra de ADNc como molde y LA
Taq polimerasa contenida en el kit anterior para amplificar el
fragmento de ADN que contenía el gen que codificaba la proteína de
la subunidad de la quelatasa de tabaco variante. En esta PCR, se
utilizaron el cebador oligonucleotídico compuesto por la secuencia
de nucleótidos del SEQ ID NO: 9 y el cebador oligonucleotídico
compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 10. Estos
oligonucleótidos se sintetizaron utilizando un sintetizador de ADN
(PE Applied Biosystems; Sintetizador de ADN/ARN Modelo 394) y se
purificaron con el cartucho de purificación de oligonucleótidos (PE
Applied Biosystems; cartucho OPC). La PCR se llevó a cabo
manteniendo a 94ºC durante 2 minutos y repitiendo después un ciclo
de mantenimiento a 94ºC durante 30 segundos, a 50ºC durante 30
segundos y después a 72ºC durante 7 minutos 30 veces. Después de la
PCR, el fragmento de ADN amplificado mediante la PCR se clonó en el
plásmido pCR2.1 utilizando el Kit TA Cloning (fabricado por
Invitrogen) de acuerdo con el manual adjunto. El plásmido resultante
se digirió con la enzima de restricción KpnI y se analizó mediante
electroforesis en gel de agarosa. El plásmido a partir del cual se
detectó el fragmento de ADN de 8,0 kb tenía el nombre pTCHLH. El
plásmido tenía una estructura en la que el gen que codifica la
subunidad de la quelatasa de tabaco variante había sido insertado en
la dirección expresable bajo el control del promotor lac. El
plásmido pTCHLH se digirió con la enzima de restricción KpnI seguido
de auto-ligación para obtener el plásmido pTCHLH1
(Fig. 6) en el que el fragmento de ADN compuesto por aproximadamente
60 nucleótidos había sido suprimido del plásmido pTCHLH.
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Se introdujeron el plásmido pTCHLH1 y pCR2.1
preparado en el Ejemplo 7 en la cepa BT3/pACYCSP de E. coli
preparada en el Ejemplo 3, respectivamente de acuerdo con el método
descrito por Hanahan, D.J., Mol. Biol., 166; pág. 557 (1983). Se
obtuvieron la cepa BT3/pACYCSP+pTCHLH1 de E. coli que portaba
los plásmidos pACYCSP y pTCHLH1, y la cepa BT3/pACYCSP+pCR2.1 de
E. coli que portaba los plásmido pACYCSP y pCR2.1 cultivando
las cepas anteriores en medio YPT que contenía 100 \mug/ml de
ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol y 50 \mug/ml de
kanamicina, respectivamente.
Estas cepas de E. coli se inocularon en
medio YPT que contenía 10 o 1 ppm del compuesto herbicida de tipo
inhibidor de PPO representado por la Estructura 8, 100 \mug/ml de
ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol, 50 \mug/ml de
kanamicina, 10 \mug/ml de hemina y 50 \mug/ml de ácido
aminolevulínico, se cultivaron en condiciones de oscuridad o en
condiciones de luz de la misma manera que en el Ejemplo 2. Después,
a las 18 horas del inicio del cultivo, se midió la absorbancia del
medio de cultivo líquido a 600 nm. Tomando la absorbancia del medio
sin compuesto herbicida como 1, se calculó el valor relativo de la
absorbancia del medio que contenía el compuesto herbicida. Los
resultados se muestran en la Tabla 6.
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Se construyó un plásmido para introducir el gen
que codifica una proteína de la subunidad de la magnesio quelatasa
de tabaco variante en tabaco mediante el método de infección con
Agrobacterium. Primero, se preparó un fragmento de ADN que
contenía el gen que codificaba la proteína de la subunidad de la
magnesio quelatasa de tabaco variante digiriendo el plásmido
pTCHLH1 preparado en el Ejemplo 7 con las enzimas de restricción
KpnI y SalI. Por otra parte, se digirió el vector binario pBI121
(fabricado por Clonetech) con la enzima de restricción SmaI y se
insertó el conector KpnI (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) en
esta porción para preparar el plásmido pBI121K en el cual se había
separado el sitio de reconocimiento SmaI de pBI121 y se había
añadido el sitio de reconocimiento de KpnI. Se digirió el plásmido
pBI121K con la enzima de restricción SacI volviendo después romos
los extremos del ADN añadiendo nucleótidos al espacio del ADN de
doble hebra con ADN polimerasa I. Después, se desfosforiló el ADN
con fosfatasa alcalina derivada de intestino de ternera y se cicló
insertando el conector de SalI fosforilado (4680P, fabricado por
Takara Shuzo Co., Ltd.) para construir el plásmido pBI121KS. Se
digirió el vector binario pBI121KS con las enzimas de restricción
KpnI y SalI para separar el gen de la
\beta-glucuronidasa y se insertó el gen que
codificaba la proteína de la subunidad de la magnesio quelatasa de
tabaco variante en esta porción para preparar el plásmido pBITCHLH
(Fig. 7).
Se introdujo el plásmido pBITCHLH en
Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Los transformantes
resultantes se cultivaron en un medio que contenía 300 \mug/ml de
estreptomicina, 100 \mug/ml de rifampicina y 25 \mug/ml de
kanamicina, seguido de la selección de los transformantes deseados
para aislar una cepa de Agrobacterium que portara
pBITCHLH.
pBITCHLH.
Se infectaron trozos de hoja de tabaco cultivado
en condiciones estériles con la cepa de Agrobacterium y, de
la misma manera que en el Ejemplo 5, se obtuvo tabaco en el que se
había introducido el gen que codificaba la proteína de la subunidad
de la magnesio quelatasa de tabaco variante.
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Los niveles de resistencia a los compuestos
herbicidas se confirman cuantitativamente sometiendo a ensayo el
tabaco en el que se ha introducido el gen que codifica la proteína
de la subunidad de la magnesio quelatasa de tabaco variante
preparado en el Ejemplo 9 de la misma manera que en el Ejemplo
6.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la PCR utilizando el plásmido
pSPPO-P preparado en el Ejemplo 3 como molde y un
oligonucleótido compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ
ID NO: 11 y un oligonucleótido compuesto por la secuencia de
nucleótidos del SEQ ID NO: 12 como cebadores para amplificar el
fragmento de ADN que codificaba la PPO de soja cuya señal de
tránsito a cloroplastos y secuencia de unión a FAD habían sido
suprimidas (referido en adelante como PPO de soja variante). Los
oligonucleótidos se prepararon con un sintetizador de ADN (PE
Applied Biosystems); sintetizador de ADN/ARN Modelo 394) y se
purificaron con un cartucho de purificación de oligonucleótidos (PE
Applied Biosystems; Cartucho OPC). La PCR se llevó a cabo repitiendo
un ciclo de mantenimiento a 94ºC durante 1 minuto, a 55ºC durante 2
minutos y a 72ºC durante 3 minutos 30 veces. Los fragmentos de ADN
amplificados se digirieron con las enzimas de restricción NcoI y
SalI, y se introdujeron entre el sitio de restricción NcoI y el
sitio de restricción SalI del plásmido pTV118N (fabricado por Takara
Shuzo Co., Ltd.) para construir el plásmido pTVGMP (Fig. 8).
El plásmido pTVGMP se introdujo en la cepa BT3
mutante carente del gen PPO de E. coli de acuerdo con el
método descrito por Hanahan, D.J., Mol. Biol., 166; pág. 557 (1983).
Cuando la E. coli resultante se cultivó en medio YPT que
contenía 100 \mug/ml de ampicilina y 10 \mug/ml de kanamicina,
no se obtuvo ningún clon con el crecimiento complementado.
\newpage
Se introdujeron los plásmidos pTVGMP y pTV118N
preparados en el Ejemplo 11 en la cepa BT3/pACYCSP de E.
coli preparada en el Ejemplo 3 respectivamente de acuerdo con el
método descrito por Hanahan, D.J., Mol. Biol., 166; pág. 557
(1983). La cepa BT3/pACYCSP+pTVGMP de E. coli que portaba los
plásmidos pACYCSP y pTVGMP, y la cepa BT3/pACYCSP+ pTV118N de E.
coli que portaba los plásmidos pACYCSP y pTV118N se obtuvieron
cultivando las cepas anteriores en medio YPT que contenía 100
\mug/ml de ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol y 10
\mug/ml de kanamicina.
Estas cepas de E. coli se inocularon en
medio YPT que contenía 10 o 1 ppm de compuesto herbicida de tipo
inhibidor de PPO representado por la Estructura 8, 100 \mug/ml de
ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol, 10 \mug/ml de
kanamicina, 10 \mug/ml de hemina y 50 \mug/ml de ácido
aminolevulínico, se cultivaron en condiciones de oscuridad o en
condiciones de luz de la misma manera que en el Ejemplo 2. Después,
a las 18 horas del inicio del cultivo, se midió la absorbancia del
medio de cultivo líquido a 600 nm. Tomando la absorbancia del medio
de cultivo sin compuesto herbicida como 1, se calculó el valor
relativo de la absorbancia del medio que contenía el compuesto
herbicida. Los resultados se muestran en la Tabla 7.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó un plásmido para introducir el gen
que codificaba PPO de soja variante en una planta mediante el
método de infección con Agrobacterium. La PCR se llevó a cabo
utilizando el plásmido pSPPO-P preparado en el
Ejemplo 3 como molde, un cebador oligonucleotídico compuesto por la
secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 13 y un cebador
oligonucleotídico compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ
ID NO: 14 para amplificar el fragmento de ADN que contenía el gen
que codificaba PPO de soja variante. Después, se digirió el
plásmido pBI121K preparado en el Ejemplo 9 con las enzimas de
restricción KpnI y SacI para separar el gen de la
\beta-glucuronidasa, y se insertó el fragmento de
ADN que se obtuvo digiriendo el fragmento de ADN que contenía el
gen anterior que codificaba PPO de soja variante con las enzimas de
restricción KpnI y Sac I en esta porción para preparar el plásmido
pBIGMP (Fig. 9) en el cual el gen se unía aguas abajo del promotor
de 35S.
El plásmido pBIGMP se introdujo en
Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Los transformantes
resultantes se cultivaron en un medio que contenía 300 \mug/ml de
estreptomicina, 100 \mug/ml de rifampicina y 25 \mug/ml de
kanamicina, seguido de la selección de los transformantes deseados
para aislar la cepa de Agrobacterium que portaba pBIGMP.
Se infectaron trozos de hoja de tabaco cultivado
en condiciones estériles con la cepa de Agrobacterium y, de
la misma manera que en el Ejemplo 5, se obtuvo tabaco en el que se
había introducido el gen que codificaba PPO de soja variante.
\vskip1.000000\baselineskip
El nivel de resistencia a un compuesto herbicida
de tipo inhibidor de PPO representado por la Estructura 8 se
confirmó cuantitativamente sometiendo a ensayo el tabaco en el que
se había introducido el gen que codificaba PPO de soja variante
preparado en el Ejemplo 13 de la misma manera que en el Ejemplo 6.
Los resultados obtenidos de 4 clones (GMP 1-4) de
tabaco en los que se había introducido el gen que codificaba PPO de
soja variante y tabaco recombinante de control se muestran en la
Tabla 8. En la tabla, el nivel de resistencia al compuesto
herbicida se representa mediante el porcentaje del contenido de
clorofila total de trozos de hoja tratados con el compuesto
herbicida con respecto al de los trozos de hoja no tratados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo la cepa CC407 de Chlamydomonas
reinhardtii de Chlamydomonas Genetics Center (dirección: DCMB
Group, Department of Botany, Box 91000, Duke University, Durham, NC
27708-1000, USA), se cultivó en 200 \muE/m^{2}/s
de luz activa para fotosíntesis durante 5 días en medio de cultivo
líquido TAP (E. H. Harris, The Chlamydomonas Sourcebook, Academic
Press, San Diego, 1989, p 576-577) que contenía
NH_{4}Cl 7 mM, MgSO_{4} 7H_{2}O 0,4 mM,
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O 0,34 mM, fosfato de potasio 25 mM, Tris
0,5 mM (pH 7,5), 1 ml/litro de elemento mineral Hatner y 1 ml/litro
de ácido acético glacial para obtener 200 ml (1,0 x 10^{6}
células/ml) de medio de cultivo líquido que contenía células en una
fase de crecimiento estacionaria temprana.
Se prepararon ARN totales a partir de estas
células utilizando ISOGEN (fabricado por Nippon Gene) de acuerdo
con el manual adjunto. Asimismo, se fraccionó ARN poli(A)
utilizando el Kit de Purificación de ARNm BioMag (fabricado por
Perceptive Bio System) de acuerdo con el manual adjunto. Se
sintetizó ADNc a partir del ARN poli(A) utilizando el Kit de
Amplificación de ADNc Marathon (fabricado por Clontech) de acuerdo
con el manual adjunto y se utilizó el ADNc como molde para la
PCR.
En cuanto a los cebadores de la PCR, se
prepararon un oligonucleótido compuesto por la secuencia de
nucleótidos del SEQ ID NO: 15 y un oligonucleótido compuesto por la
secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 16. Los oligonucleótidos se
prepararon con un sintetizador de ADN (PE Applied Biosystems;
sintetizador de ADN/ARN Modelo 394) y se purificaron con un
cartucho de purificación de oligonucleótidos (PE Applied Biosystems;
cartucho
OPC).
OPC).
Se llevó a cabo la PCR preparando un líquido de
reacción utilizando el kit para PCR de ADNc Advantage (fabricado
por Clontech) de acuerdo con el manual adjunto, y después, tras
mantener a 94ºC durante 1 minuto y luego a 65ºC durante 5 minutos,
repitiendo un ciclo de mantenimiento a 94ºC durante 15 segundos y a
65ºC durante 5 minutos 29 veces. Después de la PCR, se purificaron
los fragmentos de ADN amplificados filtrando el líquido de reacción
con MicroSpin S-400HR (fabricado por Pharmacia
Biotech), y se clonó el fragmento de ADN en el plásmido pCR2.1
utilizando el Kit de Clonación TA (fabricado por Invitrogen) de
acuerdo con el manual adjunto para construir el plásmido pCPPO.
Se determinó la secuencia de nucleótidos del
fragmento de ADN contenido en el plásmido pCPPO resultante
utilizando el kit de secuenciación Dye Terminator (fabricado por PE
applied Biosystems) y el secuenciador de ADN 373S (fabricado por PE
applied Biosystems). Como resultado, se reveló la secuencia de
nucleótidos del SEQ ID NO: 17, confirmando de ese modo que el
plásmido pCPPO contenía el ADNc de PPO completo de Chlamydomonas
reinhardtii.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la PCR utilizando el plásmido
cCPPO preparado en el Ejemplo 15 como molde, y un oligonucleótido
compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 19 y un
oligonucleótido compuesto por el nucleótido del SEQ ID NO: 20 como
cebadores para amplificar el fragmento de ADN que codifica PPO de
Chlamydomonas reinhardtii cuya señal de tránsito a
cloroplastos y secuencia de unión a FAD habían sido suprimidas
(referido en adelante como PPO de Chlamydomonas reinhardtii
variante). Los oligonucleótidos se prepararon con un sintetizador
de ADN (PE Applied Biosystems; sintetizador de ADN/ARN Modelo 394) y
se purificaron con un cartucho de purificación de oligonucleótidos
(PE Applied Biosystems; Cartucho OPC). La PCR se llevó a cabo
repitiendo un ciclo para mantener a 94ºC durante 1 minuto, a 55ºC
durante 2 minutos y después a 72ºC durante 3 minutos 30 veces. El
fragmento de PCR amplificado se digirió con las enzimas de
restricción BamHI y SacI, y se insertó entre el sitio de
restricción BamHI y el sitio de restricción SacI del plásmido
pTV119N (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) para construir el
plásmido pTVCRP (Fig. 10).
Se introdujo el plásmido pTVCRP en la cepa BT3
mutante carente del gen PPO de E. coli de acuerdo con el
método descrito por Hanahan, D. J., Mol. Biol., 166; pág. 557
(1983). Cuando se cultivó la E. coli resultante en medio YPT
que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y 10 \mug/ml de
kanamicina, no se obtuvo ningún clon con crecimiento
complementado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se introdujeron los plásmidos pTVCRP y pTV118N
preparados en el Ejemplo 16 en la cepa BT3/pACYCSP de E.
coli preparada en el Ejemplo 3 respectivamente de acuerdo con el
método descrito por Hanahan, D. J., Mol. Biol., 166; pág. 557
(1983). Los plásmidos que portaban la cepa BT3/pACYCSP+pTVCRP de
E. coli, pACYCSP y pTVCRP, y los plásmidos que portaban la
cepa BT3/pACYCSP+pTV118N de E. coli, pACYCSP y pTV118N se
obtuvieron cultivando las cepas anteriores en medio YPT que
contenía 100 \mug/ml de ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol
y 10 \mug/ml de kanamicina.
Estas cepas de E. coli se inocularon en
medio YPT que contenía 10 o 1 ppm del compuesto herbicida de tipo
inhibidor de PPO representado por la Estructura 8, 100 \mug/ml de
ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol, 10 \mug/ml de
kanamicina, 10 \mug/ml de hemina y 50 \mug/ml de ácido
aminolevulínico, se cultivaron en condiciones de oscuridad o en
condiciones de luz de la misma manera que en el Ejemplo 2. Después,
a las 18 horas del inicio del cultivo, se midió la absorbancia del
medio de cultivo líquido a 600 nm. Tomando la absorbancia del medio
que no contenía compuesto herbicida como 1, se calculó el valor
relativo de la absorbancia del medio que contenía el compuesto
herbicida. Los resultados se muestran en la Tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó un plásmido para introducir el gen
que codificaba la PPO de Chlamydomonas reinhardtii variante
en una planta mediante el método de infección con
Agrobacterium. El fragmento de ADN que contenía el gen que
codificaba la PPO de Chlamydomonas reinhardtii variante se
preparó digiriendo el plásmido pTVCRP preparado en el Ejemplo 16
con las enzimas de restricción BamHI y SacI. Se digirió el vector
binario pBI121 (fabricado por Clontech) con las enzimas de
restricción BamHI y SacI para separar el gen de la
\beta-glucuronidasa y el gen anterior que
codificaba la PPO de Chlamydomonas reinhardtii variante se
insertó en esta porción para preparar el plásmido pBICRP
(fig. 11).
(fig. 11).
Se introdujo el plásmido pBICRP en
Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Los transformantes
resultantes se cultivaron en un medio que contenía 300 \mug/ml de
estreptomicina, 100 \mug/ml de rifampicina y 25 \mug/ml de
kanamicina, seguido de la selección de los transformantes deseados
para aislar la cepa de Agrobacterium que portaba pBICRP.
Se infectaron trozos de hoja de tabaco cultivado
en condiciones estériles con la cepa de Agrobacterium y, de
la misma manera que en el Ejemplo 5, se obtuvo tabaco en el que se
había introducido el gen que codificaba la PPO de Chlamydomonas
reinhardtii variante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se confirmó cuantitativamente el nivel de
resistencia al compuesto herbicida de tipo inhibidor de PPO
representado por la Estructura 8 sometiendo a ensayo el tabaco en
el que se había introducido el gen que codificaba la PPO de
Chlamydomonas reinhardtii variante preparado en el Ejemplo 18
de la misma manera que en el Ejemplo 6. Los resultados obtenidos de
4 clones (CRP 1-4) de tabaco en los que se había
introducido el gen que codificaba la PPO de Chlamydomonas
reinhardtii variante y el tabaco recombinante de control se
muestran en la Tabla 10. En la tabla, los niveles de resistencia al
compuesto herbicida se representan por medio de los porcentajes del
contenido total de clorofila de los trozos de hoja tratados con el
compuesto herbicida con respecto a los trozos de hoja no
tratados.
tratados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó un plásmido que portaba el gen de la
ferroquelatasa de cebada mediante el método descrito por Miyamoto,
K. et al., Plant Physiol. 105; pág. 769 (1994). El plásmido
resultante se digirió con las enzimas de restricción NspI y EcoRI
para obtener el fragmento de ADN que contenía el gen que codificaba
la ferroquelatasa de cebada cuya secuencia señal había sido
suprimida (referida en adelante como ferroquelatasa de cebada
variante). Este fragmento de ADN se insertó entre el sitio de
restricción SphI y el sitio de restricción EcoRI del plásmido
pTV119N (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) para construir el
plásmido pTVHVF1 (Fig. 12).
Los plásmidos pTVHVF1 y pTV118N se introdujeron
en las cepas BT3/pACYCSP de E. coli preparadas en el Ejemplo
3 respectivamente de acuerdo con el método descrito por Hanahan,
D.J., Mol. Biol., 166; pág. 557 (1983). Se obtuvieron el plásmido
que portaba la cepa BT3/pACYCSP+pTVHVF1 de E. coli, pACYCSP y
pTVHVF1, y el plásmido que portaba la cepa BT3/pACYCSP+pTV118N de
E. coli, pACYCSP y pTV118N cultivando las cepas anteriores
en medio YPT que contenía 100 \mug/ml de ampicilina, 15 \mug/ml
de cloramfenicol y 10 \mug/ml de
kanamicina.
kanamicina.
Estas cepas de E. coli se inocularon en
medio YPT que contenía 10 o 1 ppm del compuesto herbicida de tipo
inhibidor de PPO representado por la Estructura 8, 100 \mug/ml de
ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol, 10 \mug/ml de
kanamicina, 10 \mug/ml de hemina y 50 \mug/ml de ácido
aminolevulínico, se cultivaron en condiciones de oscuridad o en
condiciones de luz de la misma manera que en el Ejemplo 2. Después,
a las 18 horas del inicio del cultivo, se midió la absorbancia del
medio de cultivo líquido a 600 nm. Tomando la absorbancia del medio
sin compuesto herbicida como 1, se calculó el valor relativo de la
absorbancia del medio que contenía el compuesto herbicida. Los
resultados se muestran en la Tabla 11.
Se construyó un plásmido para introducir el gen
que codificaba la ferroquelatasa de cebada en tabaco por medio del
método de infección con Agrobacterium. Se digirió el plásmido
pTVHVF1 descrito en el Ejemplo 20 con la enzima de restricción Nco
I volviendo después romos los extremos del ADN con ADN polimerasa I
añadiendo nucleótidos al espacio del ADN de doble hebra. Luego, se
desfosforiló el ADN con fosfatasa alcalina derivada de intestino de
ternera y se cicló insertando el conector BamHI fosforilado (4610P,
fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) para construir el plásmido.
Después, se digirió pTVHVF2 con la enzima de estricción EcoRI
volviendo después romos los extremos del ADN con ADN polimerasa I
añadiendo nucleótidos al espacio de ADN de doble hebra.
Adicionalmente, se desfosforiló el ADN con fosfatasa alcalina
derivada de intestino de ternera y se cicló insertando el conector
SalI fosforilado (4680P, fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) para
construir el plásmido pTVHVF3. El plásmido pBI121KS preparado en el
Ejemplo 9 se digirió con las enzimas de restricción BamHI y SalI
para separar el gen de la \beta-glucuronidasa. El
fragmento de ADN que contenía el gen que codificaba la
ferroquelatasa de cebada variante se preparó digiriendo el pTVHVF3
anterior con las enzimas de restricción BamHI y SalI. El fragmento
de ADN resultante se insertó en el plásmido pBI121KS remplazando el
gen de la \beta-glucuronidasa para preparar el
plásmido pBIHVF (Fig. 13) en el que el gen de la cebada variante se
unía aguas abajo del promotor de 35S.
Se introdujo el plásmido pBIHVF en
Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Los transformantes
resultantes se cultivaron en un medio que contenía 300 \mug/ml de
estreptomicina, 100 \mug/ml de rifampicina y 25 \mug/ml de
kanamicina, seguido de selección de los transformantes deseados para
aislar la cepa de Agrobacterium que portaba pBIHVF.
Se infectaron trozos de hoja de tabaco cultivado
en condiciones estériles con dicha cepa de Agrobacterium y,
de la misma manera que en el Ejemplo 5, se obtuvo tabaco en el que
se había introducido el gen que codificaba la ferroquelatasa de
cebada variante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se confirmó el nivel de resistencia al compuesto
herbicida de tipo inhibidor de PPO representado por la Estructura 8
cuantitativamente sometiendo a ensayo el tabaco en el que se había
introducido el gen que codificaba la ferroquelatasa de cebada
variante preparada en el Ejemplo 21 de la misma manera que en el
Ejemplo 6. Los resultados obtenidos de 4 clones (HVF
1-4) de tabaco con el gen que codifica la
ferroquelatasa de cebada variante introducido y tabaco recombinante
de control se muestran en la tabla 12. En la tabla, se representan
los niveles de resistencia al compuesto herbicida por medio de
porcentajes del contenido total de clorofila de los trozos de hoja
tratados con compuesto herbicida con respecto a los trozos de las
hojas no tratados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la PCR utilizando un clon de
ADNc de ferroquelatasa de pepino aislado mediante el método descrito
por Miyamoto, K. et al., Plant Physiol., 105; pág. 769
(1994) como molde, un oligonucleótido compuesto por la secuencia de
nucleótidos del SEQ ID NO: 21 y un oligonucleótido compuesto por la
secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 22 como cebadores para
amplificar el fragmento de ADN que codificaba la ferroquelatasa de
pepino cuya secuencia señal había sido suprimida (en adelante
referida como ferroquelatasa de pepino variante). Los
oligonucleótidos se prepararon con un sintetizador de ADN (PE
Applied Biosystems; sintetizador de ADN/ARN Modelo 394) y se
purificaron con un cartucho de purificación de oligonucleótidos (PE
Applied Biosystems; Cartucho OPC). La PCR se llevó a cabo
repitiendo un ciclo de mantenimiento a 94ºC durante 1 minuto, a 55ºC
durante 2 minutos y después a 72ºC durante 3 minutos 30 veces. Los
fragmentos de ADN amplificados fueron digeridos con las enzimas de
restricción BamHI y SacI, e insertados entre el sitio de restricción
BamHI y el sitio de restricción SacI del plásmido pTV119N
(fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) para construir el plásmido
pTVCSF (Fig. 14).
Se introdujeron los plásmidos pTVCSF y pTV118N
en la cepa BT3/pACYCSP de E. coli preparada en el Ejemplo 3
respectivamente de acuerdo con el método descrito por Hanahan, D.J.,
Mol. Biol., 166; pág. 557 (1983). La cepa BT3/pACYCSP+ pTVCSF de
E. coli que porta el plásmido pACYCSP y pTVCSF, y la cepa
BT3/pACYCSP+
pTV118N de E. coli que porta el plásmido pACYCSP y pTV118N fueron obtenidas cultivando las cepas anteriores en medio YPT que contenía 100 \mug/ml de ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol y 10 \mug/ml de kanamicina.
pTV118N de E. coli que porta el plásmido pACYCSP y pTV118N fueron obtenidas cultivando las cepas anteriores en medio YPT que contenía 100 \mug/ml de ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol y 10 \mug/ml de kanamicina.
Estas cepas de E. coli fueron inoculadas
en medio YPT que contenía 10 o 1 ppm del compuesto herbicida de
tipo inhibidor de PPO representado por la Estructura 8, 100
\mug/ml de ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol, 10 de
\mug/ml kanamicina, 10 \mug/ml de hemina y 50 \mug/ml de ácido
aminolevulínico, cultivadas en condiciones de oscuridad o en
condiciones de luz de la misma manera que en el Ejemplo 2. Después,
a las 18 horas del inicio del cultivo, se midió la absorbancia del
medio de cultivo líquido a 600 nm. Tomando la absorbancia del medio
sin el compuesto herbicida como 1, se calculó el valor relativo de
la absorbancia del medio que contenía el compuesto herbicida. Los
resultados se muestran en la Tabla 13.
Se construyó un plásmido para introducir el gen
que codificaba la ferroquelatasa de pepino modificada en tabaco por
medio del método de infección con Agrobacterium. Se digirió
el plásmido pBI121 (fabricado por Clontech) con las enzimas de
restricción BamHI y SacI para separar el gen de la
\beta-glucuronidasa. Se preparó un fragmento de
ADN que contenía el gen que codificaba la ferroquelatasa de pepino
variante digiriendo el plásmido pTVCSF descrito en el Ejemplo 23
con las enzimas de restricción BamHI y SacI. El fragmento de ADN
resultante se introdujo en el plásmido pBI121 remplazando el gen de
la \beta-glucuronidasa para preparar el plásmido
pBICSF (Fig. 15) en el que el gen de la ferroquelatasa de pepino
variante se unía aguas abajo del promotor de 35S.
El plásmido pBICSF se introdujo en
Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Los transformantes
resultantes se cultivaron en un medio que contenía 300 \mug/ml de
estreptomicina, 100 \mug/ml de rifampicina y 25 \mug/ml de
kanamicina, seguido de selección de los transformantes deseados para
aislar la cepa de Agrobacterium que portaba la cepa
pBICSF.
Se infectaron trozos de hoja de tabaco cultivado
en condiciones estériles con dicha cepa de Agrobacterium
para obtener tabaco con el gen que codifica la ferroquelatasa de
pepino variante introducido de la misma manera que en el Ejemplo
5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se confirma el nivel de resistencia a los
compuestos herbicidas de tipo inhibidor de PPO cuantitativamente
sometiendo a ensayo el tabaco con el gen que codifica la
ferroquelatasa de pepino variante introducido preparado en el
Ejemplo 24 de la misma manera que en el Ejemplo 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó ADN genómico a partir de la cepa
LE392 de E. coli utilizando el Kit ISOPLANT para la
preparación de ADN del genoma (fabricado por Nippon Gene). Se
sintetizaron un cebador oligonucleotídico compuesto por la
secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 23 y un cebador
oligonucleotídico compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ
ID NO: 24 de acuerdo con las secuencias de nucleótidos de sus
regiones 5' y 3' del gen hemF de E. coli registradas en
GenBank (Acceso X75413). Los oligonucleótidos fueron preparados con
un sintetizador de ADN (PE Applied Biosystems; sintetizador de
ADN/ARN Modelo 394) y se purificaron con un cartucho para la
purificación de oligonucleótidos (PE Applied Biosystems; Cartucho
OPC). La PCR se llevó a cabo utilizando aproximadamente 1 \mug de
ADN genómico de la cepa LE392 de E. coli como molde y los
oligonucleótidos anteriores (10 pmoles de cada uno) como cebadores
para amplificar el fragmento de ADN que contenía el gen hemF de
E. coli. Se llevó a cabo la PCR repitiendo un ciclo para
mantener a 96ºC durante 1 minuto, a 55ºC durante 2 minutos y
después a 72ºC durante 3 minutos 30 veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Se digirió el fragmento de ADN que contenía el
gen hemF amplificado mediante el método descrito en el Ejemplo 26
con las enzimas de restricción FbaI y PstI, y se insertó entre el
sitio de restricción BamHI y el sitio de restricción PstI del
plásmido asequible comercialmente pUC118N (fabricado por Takara
Shuzo Co., Ltd.) para construir el plásmido pHEMF (Fig. 16).
Se introdujeron los plásmidos pHEMF y pTV118N en
la cepa BT3/pACYCSP de E. coli preparada en el Ejemplo 3
respectivamente de acuerdo con el método descrito por Hanahan, D.
J., Mol. Biol., 166; pág. 557 (1983). Se obtuvieron la cepa
BT3/pACYCSP+ pHEMF de E. coli que portaba el plásmido pACYCSP
y pHEMF, y la cepa BT3/pACYCSP+pTV118N de E. coli que
portaba el plásmido pACYCSP y pTV118N cultivando las cepas
anteriores en medio YPT que contenía 100 \mug/ml de ampicilina,
15 \mug/ml de cloramfenicol y 10 \mug/ml de kanamicina.
Estas cepas de E. coli se inocularon en
medio YPT que contenía 10 o 1 ppm del compuesto herbicida de tipo
inhibidor de PPO representado por la Estructura 8, 100 \mug/ml de
ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol, 10 \mug/ml de
kanamicina, 10 \mug/ml de hemina y 50 \mug/ml de ácido
aminolevulínico, se cultivaron en condiciones de oscuridad o en
condiciones de luz de la misma manera que en el Ejemplo 2. Después,
a las 18 horas del inicio del cultivo, se midió la absorbancia del
medio de cultivo líquido a 600 nm. Tomando la absorbancia del medio
sin el compuesto herbicida como 1, se calculó el valor relativo de
la absorbancia del medio que contenía el compuesto herbicida. Los
resultados se muestran en la Tabla 14.
Se construyó un plásmido para introducir el gen
hemF de E. coli en una planta mediante el método de
infección con Agrobacterium. Primero, para obtener el gen
hemF de E. coli, se sintetizaron un cebador
oligonucleotídico compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ
ID NO: 25 y un cebador oligonucleotídico compuesto por la secuencia
de nucleótidos del SEQ ID NO: 26 con un sintetizador de ADN (PE
Applied Biosystems; sintetizador de ADN/ARN Modelo 394) y se
purificaron con un cartucho para la purificación de oligonucleótidos
(PE Applied Biosystems; Cartucho OPC). La PCR se llevó a cabo
utilizando los cebadores oligonucleotídicos de la misma manera que
en el Ejemplo 26 para amplificar el fragmento de ADN que contenía el
gen hemF de E. coli.
El plásmido pBI121 (fabricado por Clontech) fue
digerido con las enzimas de restricción BamHI y SacI para separar
el gen de la \beta-glucuronidasa. El fragmento de
ADN que contenía el gen que codificaba el gen hemF de E.
coli se preparó mediante digestión del fragmento de ADN
amplificado por PCR anterior con las enzimas de restricción BamHI y
SacI. El fragmento de ADN resultante se introdujo en el plásmido
pBI121 remplazando el gen de la
\beta-glucuronidasa para preparar el plásmido
pBIHEMF (Fig. 17) en el que el gen hemF de E. coli se unía
aguas abajo del promotor de 35S.
Se introdujo el plásmido pBIHEMF en
Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Los transformantes
resultantes se cultivaron en un medio que contenía 300 \mug/ml de
estreptomicina, 100 \mug/ml de rifampicina y 25 \mug/ml de
kanamicina, seguido de selección de los transformantes deseados para
aislar la cepa de Agrobacterium que portaba pBIHEMF.
Se infectaron trozos de hoja de tabaco cultivado
en condiciones estériles con la cepa de Agrobacterium para
obtener tabaco con el gen hemF de E. coli introducido de la
misma manera que en el Ejemplo 5.
\vskip1.000000\baselineskip
El nivel de resistencia a los compuestos
herbicidas de tipo inhibidor de PPO se confirma cuantitativamente
sometiendo a ensayo el tabaco con el gen hemF de E. coli
introducido (preparado en el Ejemplo 28) de la misma manera que en
el Ejemplo 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon una colección de fagos que
presentaban una proteína que contenía una secuencia de aminoácidos
compuesta por 5 aminoácidos al azar y un clon de fago que presentaba
una proteína que contenía una secuencia de aminoácidos HASYS o
RASSL (donde H es histidina, A es alanina, S es serina, Y es
tirosina, R es arginina y L es leucina) que se puede unir
específicamente al compuesto de porfirina
5,10,15,20-tetrakis(N-metilpiridinio-4-il)-21H,23H-porfina
(H_{2}TMpyP) de acuerdo con el método descrito por KITANO et
al., Nihon Kagakukai (Sociedad Química Japonesa) 74º Encuentro
Anual de Primavera Resúmenes Pre-Publicados de
Presentación II, pág. 1353, 4G511 (1998).
Primero, se construyó la colección de fagos que
presentaban una proteína que contenía una secuencia de aminoácidos
compuesta por 5 aminoácidos al azar.
Se sintetizaron los oligonucleótidos mezclados
compuestos por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 27 y los
oligonucleótidos mezclados compuestos por la secuencia de
nucleótidos del SEQ ID NO: 28. Los oligonucleótidos mezclados se
sintetizaron con un sintetizador de ADN (PE Applied Biosystems;
Sintetizador de ADN/ARN Modelo 394) y se purificaron con un
cartucho de purificación de oligonucleótidos (PE Applied Biosystems;
Cartucho OPC). Los oligonucleótidos mezclados anteriores (50 pmoles
cada uno) se fosforilaron en el extremo 5' tratando con ADN quinasa
de T4 respectivamente. Se mezclaron y, después de calentar a 70ºC
durante 10 minutos, se sometieron a hibridación enfriando
lentamente a la temperatura ambiente a una velocidad de
0,5ºC/minuto. Se digirió el plásmido pCANTAB5E (fabricado por
Pharmacia Biotech) con las enzimas de restricción SfiI y NotI para
separar el ScFv del gen del anticuerpo recombinante. El par
anterior de oligonucleótidos fosforilados e hibridados se insertó
en la porción del ScFv del gen del anticuerpo recombinante anterior
para preparar un plásmido que contenía una secuencia de nucleótidos
que codificaba una proteína compuesta por una secuencia de 5
aminoácidos al azar aguas arriba de una proteína que comprendía una
secuencia de aminoácidos de la proteína de la envoltura del fago
M13. El plásmido se introdujo en la cepa TG-1 de
E. coli de acuerdo con el método descrito por Hanahan, D.J.,
Mol. Biol. 166; pág. 557 (1983) y se cultivó en 2 x medio YT (10
g/litro de extracto de levadura, 15 g/litro de triptona y 5 g/litro
de NaCl, pH 7,2) que contenía 100 \mug/ml de ampicilina para
obtener una cepa TG-1 de E. coli
recombinante. La cepa TG-1 de E. coli
recombinante se inoculó en medio 2 x YT que contenía 100 \mug/ml
de ampicilina y se cultivó con sacudimiento a 37ºC. Después, al cabo
de 1 hora de inicio del cultivo, se inocularon 6 x 10^{10} ufp de
fago coadyuvante M13K07 (fabricado por Pharmacia Biotech) en el
medio, y el cultivo continuó durante 18 horas más con sacudimiento.
Luego, se centrifugó el medio de cultivo líquido a 1.000 x g
durante 20 minutos para recoger la colección de fagos que
presentaban una proteína que contenía la secuencia de aminoácidos
compuesta por 5 aminoácidos al azar.
Para preparar el clon del fago que presentaba
una proteína que contenía la secuencia de aminoácidos HASYS (SEQ ID
NO: 53), se sintetizaron un oligonucleótido compuesto por la
secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 29 y un oligonucleótido
compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 30. Y, para
preparar el clon del fago que presentaba una proteína que contenía
la secuencia de aminoácidos RASSL (SEQ ID No: 55), se sintetizaron
un oligonucleótido compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ
ID NO: 31 y un oligonucleótido compuesto por la secuencia de
nucleótidos del SEQ ID NO: 32. Estos oligonucleótidos se
sintetizaron con un sintetizador de ADN (PE Applied Biosystems;
Sintetizador de ADN/ARN Modelo 394) y se purificaron con un cartucho
de purificación de oligonucleótidos (PE Applied Biosystems;
Cartucho OPC). El clon del fago que presentaba la proteína que
contenía la secuencia de aminoácidos HASYS o RASSL se obtuvo por
medio de la misma operación que antes para obtener la colección de
fagos que presentaban una proteína que contenía la secuencia de
aminoácidos compuesta por 5 aminoácidos al azar.
Se aplicó una suspensión de fagos que contenía
el clon del fago que presentaba la proteína que contenía la
secuencia de aminoácidos HASYS, el clon del fago que presentaba la
proteína que contenía la secuencia de aminoácidos RASSL o la
colección de fagos que presentaba la proteína que contenía la
secuencia de aminoácidos que consistía en 5 aminoácidos al azar
(título 10^{5} ufp) respectivamente en un filtro de nitrocelulosa
(fabricado por Scleicher y Schuell), y después se bloqueó el filtro
de nitrocelulosa sacudiéndolo en tampón PBT (NaCl 137 mM,
Na_{2}HPO_{4} 8,10 mM, KCl 2,68 mM, KH_{2}PO_{4} 1,47 mM,
Tween 20 al 0,05%, pH 7,2) que contenía seralbúmina bovina al 1%.
El filtro de nitrocelulosa se lavó con tampón PBT y se sacudió
durante 18 horas en 2 x tampón SSC (NaCl 0,3 M, sal sódica de ácido
cítrico 0,03M) que contenía protoporfirina IX 10 \muM.
Adicionalmente, dicho filtro de nitrocelulosa se
lavó con 2 x tampón SSC, se secó, y se detectó la fluorescencia
derivada de la protoporfirina IX en luz ultravioleta (365 nm).
Las aplicaciones de la colección de fagos no
mostraron fluorescencia, mientras las aplicaciones de los clones
que presentaban la proteína que contenía la secuencia de aminoácidos
HASYS y la que contenía la secuencia de aminoácidos RASSL mostraban
una clara fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Primero, se preparó un plásmido que podía
expresar el gen que codificaba la proteína que contenía la secuencia
de aminoácidos HASYS (SEQ ID NO: 53), o la secuencia de aminoácidos
RASSL (SEQ ID NO: 55). Para preparar el plásmido capaz de expresar
el gen que codificaba la proteína compuesta por la secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 54 (en adelante referida como proteína
MGHASYS), se sintetizaron un oligonucleótido compuesto por la
secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:33 y un oligonucleótido
compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 34. Los
oligonucleótidos se sintetizaron con un sintetizador de ADN (PE
Applied Biosystems; Sintetizador de ADN/ARN Modelo 394) y se
purificaron con un cartucho para la purificación de oligonucleótidos
(PE Applied Biosystems; Cartucho OPC). Los oligonucleótidos
anteriores (50 pmoles cada uno) se fosforilaron en el extremo 5'
mediante tratamiento con ADN quinasa de T4, respectivamente. Se
mezclaron, y después, tras calentar durante 10 minutos a 70ºC, se
sometieron a hibridación enfriando lentamente a la temperatura
ambiente a una velocidad de 0,5ºC/minuto. El plásmido pTV118N se
digirió con las enzimas de restricción NcoI y EcoRI para separar el
fragmento del gen que consistía en 16 pares de bases. El plásmido
pHASYS capaz de expresar el gen que codifica la proteína MGHASYS se
preparó insertando los pares de oligonucleótidos fosforilados e
hibridados en la posición de los 16 pares de bases anteriores.
Después, para preparar el plásmido capaz de
expresar el gen que codifica la proteína que consiste en la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 56 (en adelante referida
como MGRASSL), se sintetizaron un oligonucleótido compuesto por la
secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 35 y un oligonucleótido
compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 36. Los
oligonucleótidos se sintetizaron con un sintetizador de ADN (PE
Applied Biosystems; Sintetizador de ADN/ARN Modelo 394) y se
purificaron con un cartucho para la purificación de oligonucleótidos
(PE Applied Biosystems; Cartucho OPC). Se preparó el plásmido
pRASSL capaz de expresar el gen que codificaba la proteína MGRASSL
mediante el mismo procedimiento que para el plásmido pHASYS.
Se preparó un plásmido capaz de expresar el gen
que codificaba la proteína que contenía la secuencia de aminoácidos
YAGY o YAGF (donde Y es tirosina, A es alanina, G es glicina, F es
fenilalanina) (Sugimoto, N., Nakano. S., Chem. Lett. pág. 939,
1997) capaz de unirse al compuesto de porfirina H_{2}TMPyP. Para
preparar el plásmido capaz de expresar el gen que codificaba la
proteína que consistía en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID
NO: 58 (en adelante referida como proteína MGYAGY), se sintetizaron
un oligonucleótido compuesto por la secuencia de nucleótidos del
SEQ ID NO: 37 y un oligonucleótido compuesto por la secuencia de
nucleótidos del SEQ ID NO: 38. Para preparar el plásmido capaz de
expresar el gen que codificaba la proteína compuesta por la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 60 (en adelante referida
como proteína MGYAGF), también se sintetizaron un oligonucleótido
compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 39 y un
oligonucleótido compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ
ID NO: 40. Estos oligonucleótidos se sintetizaron con un
sintetizador de ADN (PE Applied Biosystems; Sintetizador de ADN/ARN
Modelo 394) y se purificaron con un cartucho para la purificación de
oligonucleótidos (PE Applied Biosystems; Cartucho OPC). El plásmido
pYAGY capaz de expresar el gen que codifica la proteína MGYAGY y el
plásmido pYAGF capaz de expresar la proteína MGYAGF se prepararon
mediante el mismo procedimiento que para el plásmido pHASYS.
Los plásmidos pHASYS, pRASSL, pYAGY, pYAGF y
pTV118N anteriores se introdujeron en la cepa BT3/
pACYCSP de E. coli preparada en el Ejemplo 3 respectivamente de acuerdo con el método descrito por Hanahan, D. J., Mol. Biol., 166; p 557 (1983). La cepa BT3/pACYCSP+pHASYS de E. coli que portaba el plásmido pACYCSP y pHASYS, la cepa BT3/pACYCSP+pRASSL de E. coli que portaba el plásmido pACYCSP y pRASSL; la cepa BT/pACYCSP+pYAGY de E. coli que portaba el plásmido pACYCSP y pYAGY, la cepa BT3/pACYCSP+pYAGF de E. coli que portaba el plásmido pACYCSP y pYAGF y la cepa BT3/pACYCSP+pTV118N de E. coli que portaba el plásmido pACYCSP y pTV118N se obtuvieron cultivando las cepas anteriores en medio YPT que contenía 100 \mug/ml de ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol y 10 \mug/ml de kanamicina.
pACYCSP de E. coli preparada en el Ejemplo 3 respectivamente de acuerdo con el método descrito por Hanahan, D. J., Mol. Biol., 166; p 557 (1983). La cepa BT3/pACYCSP+pHASYS de E. coli que portaba el plásmido pACYCSP y pHASYS, la cepa BT3/pACYCSP+pRASSL de E. coli que portaba el plásmido pACYCSP y pRASSL; la cepa BT/pACYCSP+pYAGY de E. coli que portaba el plásmido pACYCSP y pYAGY, la cepa BT3/pACYCSP+pYAGF de E. coli que portaba el plásmido pACYCSP y pYAGF y la cepa BT3/pACYCSP+pTV118N de E. coli que portaba el plásmido pACYCSP y pTV118N se obtuvieron cultivando las cepas anteriores en medio YPT que contenía 100 \mug/ml de ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol y 10 \mug/ml de kanamicina.
Estas cepas de E. coli se inocularon en
medio YPT que contenía 1 ppm del compuesto herbicida de tipo
inhibidor de PPO representado por la Estructura 8, 100 \mug/ml de
ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol, 10 \mug/ml de
kanamicina, 10 \mug/ml de hemina y 50 \mug/ml de ácido
aminolevulínico, se cultivaron en condiciones de oscuridad o
condiciones de luz de la misma manera que en el Ejemplo 2. Después,
a las 18 horas del inicio del cultivo, se midió la absorbancia del
medio de cultivo líquido a 600 nm. Tomando la absorbancia del medio
sin el compuesto herbicida como 1, se calculó el valor relativo de
la absorbancia del medio que contenía el compuesto herbicida. Los
resultados se muestran en la Tabla 15.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, se preparó un plásmido capaz de
expresar un gen que codificaba una proteína que contenía una
secuencia de aminoácidos en la que una unidad de las secuencias de
aminoácidos se unía repetidamente. Para preparar el plásmido capaz
de expresar el gen que codificaba la proteína compuesta por la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 61 (en adelante referida
como proteína MG(HASYS)_{4}, (HASYS)_{n}
referida como secuencia en la cual el péptido HASYS se unía
repetidamente entre sí n veces), se sintetizó un oligonucleótido
compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 41, SEQ ID
NO: 42, SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44. Estos oligonucleótidos se
sintetizaron con un sintetizador de ADN (PE Applied Biosystems;
Sintetizador de ADN/ARN Modelo 394) y se purificaron con un
cartucho de purificación de oligonucleótidos (PE Applied Biosystems;
Cartucho OPC). Primero, el oligonucleótido compuesto por la
secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO. 42 y el oligonucleótido
compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 43 se
fosforilaron respectivamente en el extremo 5' mediante tratamiento
con ADN quinasa de T4. Después de eso, el oligonucleótido compuesto
por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 41 y el
oligonucleótido compuesto por la secuencia de nucleótidos
fosforilada del SEQ ID NO: 42 o el oligonucleótido compuesto por la
secuencia de nucleótidos fosforilada del SEQ ID NO: 43 y el
oligonucleótido compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ
ID NO: 44 se mezclaron (300 pmoles cada uno), y después de calentar
durante 5 minutos a 70ºC, se hibridaron enfriando lentamente a la
temperatura ambiente a una velocidad de 0,5ºC/minuto. Los pares de
oligonucleótidos hibridados se mezclaron y se ligaron con ADN ligasa
de T4, luego el fragmento de ADN resultante se fosforiló con ADN
quinasa de T4 en el extremo 5'. Por otra parte, se digirió el
vector pTV118N con las enzimas de restricción NcoI y EcoRI para
separar un fragmento de ADN de 16 pares de bases y se insertó el
fragmento de ADN fosforilado anterior en esta porción para obtener
el plásmido pHASYS4 que expresaba el gen que codificaba la proteína
MG(HASYS)_{4}.
Adicionalmente, para preparar el plásmido capaz
de expresar el gen que codifica la proteína compuesta por la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 62 (en adelante referida
como proteína MG(HASYS)_{8}), se sintetizaron un
oligonucleótido compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID
NO: 45 y un oligonucleótido compuesto por la secuencia de
nucleótidos del SEQ ID NO: 46. Estos oligonucleótidos se
sintetizaron con un sintetizador de ADN (PE Applied Biosystems;
Sintetizador de ADN/ARN Modelo 394) y se purificaron con un cartucho
para la purificación de oligonucleótidos (PE Applied Biosystems;
Cartucho OPC). Primero, se fosforilaron los oligonucleótidos
anteriores en el extremo 5' mediante tratamiento con ADN quinasa de
T4. Después de eso, se mezclaron un oligonucleótido compuesto por
la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 41 y un oligonucleótido
compuesto por la secuencia de nucleótidos fosforilada del SEQ ID
NO: 42 (300 pmoles cada uno), se mezclaron un oligonucleótido
compuesto por la secuencia de nucleótidos fosforilada del SEQ ID
NO: 43 y un oligonucleótido compuesto por la secuencia de
nucleótidos del SEQ ID NO: 44 (300 pmoles cada uno), y
adicionalmente, se mezclaron un oligonucleótido compuesto por la
secuencia de nucleótidos fosforilada del SEQ ID NO: 45 y un
oligonucleótido compuesto por la secuencia de nucleótidos
fosforilada del SEQ ID NO: 46 (600 pmoles cada uno). Estas tres
mezclas se calentaron durante 5 minutos a 70ºC, y se hibridaron
lentamente a la temperatura ambiente a una velocidad de
0,5ºC/minuto, respectivamente. Los tres pares de nucleótidos
hibridados anteriores se mezclaron, y se ligaron con ADN ligasa de
T4, y después el fragmento resultante se fosforiló con ADN quinasa
de T4 en el extremo 5'. Se preparó el plásmido pHASYS8 capaz de
expresar la proteína MG(HASYS)_{8} de la misma
manera que para el plásmido pHASYS4
anterior.
anterior.
Después, para preparar un plásmido capaz de
expresar el gen que codifica la proteína compuesta por la secuencia
de aminoácidos del SEQ ID NO: 63 (en adelante referida como proteína
MG(RASSL)_{4}, (RASSL)_{n} referida como
secuencia en la que el péptido RASSL se unía repetidamente entre sí
n veces), se sintetizaron un oligonucleótido compuesto por la
secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID
NO: 49 o SEQ ID NO: 50. Asimismo, para preparar un plásmido capaz
de expresar el gen que codificaba la proteína compuesta por la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 64 (en adelante referida
como proteína MG(RASSL)_{8}), se sintetizaron un
oligonucleótido compuesto por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID
NO: 51 y un oligonucleótido compuesto por la secuencia de
nucleótidos del SEQ ID No: 52. Estos oligonucleótidos se
sintetizaron con un sintetizador de ADN (PE Applied Biosystems;
Sintetizador de ADN/ARN Modelo 394) y se purificaron con un cartucho
para la purificación de oligonucleótidos (PE Applied Biosystems;
Cartucho OPC).
Se preparó un plásmido pRASSL4 capaz de expresar
la proteína MG(RASSL)_{4} de la misma manera que
para el plásmido pHASYS4 anterior. También se preparó el plásmido
pRASSL8 capaz de expresar la proteína MG(RASSL)_{8}
de la misma manera que para el plásmido pHASYS8 anterior.
Los plásmidos pHASYS4, pHASYS8, pRASSL4, pRASSL8
y pTV118N anteriores se introdujeron en la cepa BT3/pACYCSP de
E. coli. preparada en el Ejemplo 3 respectivamente de acuerdo
con el método descrito por Hanahan, D. J., Mol. Biol., 166; pág.
557 (1983). La cepa BT3/pACYCSP+pHASYS4 de E. coli que
portaba el plásmido pACYCSP y pHASYS4, la cepa BT3/pACYCSP+pHASYS8
de E. coli que portaba el plásmido pACYCSP y pHASYS8, la cepa
BT3/pACYCSP+pRASSL4 de E. coli que portaba el plásmido
pACYCSP y pRASSL4, la cepa HT3/pACYCSP+pRASSL8 de E. coli que
portaba el plásmido pACYCSP y pRASSL8 y la cepa BT3/pACYCSP+
pTV118N de E. coli que portaba el plásmido pACYCSP y pTV118N se obtuvieron cultivando las cepas anteriores en medio YPT que contenía 100 \mug/ml de ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol y 10 \mug/ml de kanamicina.
pTV118N de E. coli que portaba el plásmido pACYCSP y pTV118N se obtuvieron cultivando las cepas anteriores en medio YPT que contenía 100 \mug/ml de ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol y 10 \mug/ml de kanamicina.
Estas cepas de E. coli se inocularon en
medio YPT que contenía 1 ppm del compuesto herbicida de tipo
inhibidor de PPO representado por la Estructura 8, 100 \mug/ml de
ampicilina, 15 \mug/ml de cloramfenicol, 10 \mug/ml de
kanamicina, 10 \mug/ml de hemina y 50 \mug/ml de ácido
aminolevulínico, se cultivaron en condiciones de oscuridad o en
condiciones de luz de la misma manera que en el Ejemplo 2. Después,
a las 18 horas del inicio del cultivo, se midió la absorbancia del
medio de cultivo líquido a 600 nm. Tomando la absorbancia del medio
de cultivo sin compuesto herbicida como 1, se calculó el valor
relativo de la absorbancia del medio de cultivo que contenía el
compuesto herbicida. Los resultados se muestran en la Tabla 16.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó un plásmido para introducir el gen
que codificaba el péptido de unión a protoporfirina IX en tabaco
mediante el método del Agrobacterium. Se digirió el plásmido pHASYS8
preparado en el Ejemplo 31 con la enzima de restricción NcoI
volviendo después romos los extremos del ADN con la ADN polimerasa I
con adición de nucleótidos al espacio de ADN de doble hebra. Luego,
se desfosforiló el ADN con fosfatasa alcalina derivada de intestino
de ternera y se cicló insertando el conector BamHI fosforilado
(4610P, fabricado por Takara Syuzo Co., Ltd.) para construir el
plásmido pHASYS8B. Se digirió el plásmido pBI121 (fabricado por
Clonetech) con las enzimas de restricción BamHI y SacI para separar
el gen de la \beta-glucuronidasa. Por otra parte,
se digirió el plásmido pHASYS8B con las enzimas de restricción
BamHI y SacI para preparar el fragmento de ADN que contenía el gen
que codificaba la proteína MG(HASYS)_{8}, se insertó
el fragmento de ADN resultante en el plásmido pBI121 remplazando el
gen de la \beta-glucuronidasa para preparar el
plásmido pBIHMYS8 (Fig. 18) en el que el gen que codificaba la
proteína de unión a protoporfirina IX MG(HASYS)_{8}
se unía aguas abajo del promotor de 35S.
Se construyó un plásmido para introducir el gen
que codificaba el péptido de unión a protoporfirina IX
MG(RASSL)_{8} en una planta mediante el método de
infección con Agrobacterium. Se preparó el plásmido pBIRASSL8
(Fig. 19) en el cual el gen que codificaba la proteína de unión a
protoporfirina IX MG(RASSL)_{8} se unía aguas abajo
del promotor de 35S a partir de pRASSL8 de acuerdo con el mismo
procedimiento que para pBIHASYS8.
Se introdujeron el plásmido pBIHASYS8 y
pBIRASSL8 anteriores en Agrobacterium tumefaciens LBA4404
respectivamente. Los transformantes resultantes se cultivaron en un
medio que contenía 300 \mug/ml de estreptomicina, 100 \mug/ml
de rifampicina y 25 \mug/ml de kanamicina, seguido de la selección
de los transformantes deseados para aislar cepas de
Agrobacterium que portaban pBIHASYS8 y pBIRASSL8,
respectivamente.
Se infectan trozos de hoja de tabaco cultivado
en condiciones estériles con dichas cepas de Agrobacterium
para obtener tabaco con el gen que codifica la proteína de unión a
protoporfirina IX MG(HASYS)_{8} introducido, y
tabaco con el gen que codifica la proteína de unión a protoporfirina
IX MG(RASSL)_{8} introducido de la misma manera que
en el Ejemplo 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se confirma cuantitativamente el nivel de
resistencia a compuestos herbicidas sometiendo a ensayo el tabaco
con el gen que codifica el péptido de unión a protoporfirina IX
introducido preparado en el Ejemplo 32 de la misma manera que en el
Ejemplo 14.
Como se ha descrito antes, de acuerdo con la
presente invención, se pueden producir plantas resistentes a
compuestos para el control de las malas hierbas.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
1
Oligonucleótido diseñado para amplificar el gen
bchH
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
2
Oligonucleótido diseñado para amplificar el gen
bchH
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
3
Oligonucleótido diseñado para amplificar el gen
PPO de soja
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
4
Oligonucleótido diseñado para amplificar el gen
PPO de soja
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
7
Oligonucleótido diseñado para amplificar el gen
bchH
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
8
Oligonucleótido diseñado para amplificar el gen
bchH
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
9
Oligonucleótido diseñado para amplificar un
fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del gen ch1H de
tabaco
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
10
Oligonucleótido diseñado para amplificar un
fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del gen ch1H de
tabaco
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
11
Oligonucleótido diseñado para amplificar un
fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del gen PPO de
soja
\newpage
SEQ ID NO:
12
Oligonucleótido diseñado para amplificar un
fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del gen PPO de
soja
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
13
Oligonucleótido diseñado para amplificar
Fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del gen PPO de
soja
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
14
Oligonucleótido diseñado para amplificar
Fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del gen PPO de
soja
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
15
Oligonucleótido diseñado para amplificar el gen
PPO de Chlamydomonas
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
16
Oligonucleótido diseñado para amplificar el gen
PPO de Chlamydomonas
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
19
Oligonucleótido diseñado para amplificar un
fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del gen PPO de
Chlamydomonas
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
20
Oligonucleótido diseñado para amplificar un
fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del gen PPO de
Chlamydomonas
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
21
Oligonucleótido diseñado para amplificar un
fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del gen de la
ferroquelatasa de pepino
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
22
Oligonucleótido diseñado para amplificar un
fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del gen de la
ferroquelatasa de pepino
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
23
Oligonucleótido diseñado para amplificar el gen
hemF de Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
24
Oligonucleótido diseñado para amplificar el gen
hemF de Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
25
Oligonucleótido diseñado para amplificar el gen
hemF de Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
26
Oligonucleótido diseñado para amplificar el gen
hemF de Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
27
Oligonucleótidos diseñados para sintetizar genes
que codifican péptidos al azar que comprenden 5 aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
28
Oligonucleótidos diseñados para sintetizar genes
que codifican péptidos al azar que comprenden 5 aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
29
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido HASYS
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
30
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido HASYS
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
31
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido RASSL
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
32
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido RASSL
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
33
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MGHASYS
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
34
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MGHASYS
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
35
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MGRASSL
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
36
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MGRASSL
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
37
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MGYAGY
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
38
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MGYAGY
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
39
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MGYAGF
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
40
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MGYAGF
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
41
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MG(HASYS)4
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
42
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MG(HASYS)4
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
43
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MG(HASYS)4
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
44
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MG(HASYS)4
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
45
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MG(HASYS)8
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
46
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MG(HASYS)8
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
47
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MG(RASSL)4
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
48
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MG(RASSL)4
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
49
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MG(RASSL)4
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
50
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MG(RASSL)4
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
51
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MG(RASSL)8
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
52
Oligonucleótido diseñado para sintetizar el gen
que codifica el péptido MG(RASSL)8
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
53
Proteína de unión a protoporfirina IX HASYS
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
54
Proteína de unión a protoporfirina IX
MGHASYS
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
55
Proteína de unión a protoporfirina IX RASSL
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
56
Proteína de unión a protoporfirina IX
MGRASSL
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
57
Proteína de unión a H_{2}TMpyP YAGY
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
58
Proteína de unión a H_{2}TMpyP MGYAGY
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
59
Proteína de unión a H_{2}TMpyP YAGF
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
60
Proteína de unión a H_{2}TMpyP MGYAGF
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
61
Proteína de unión a protoporfirina IX
MG(HASYS)_{4}
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
62
Proteína de unión a protoporfirina IX
MG(HASYS)_{8}
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
63
Proteína de unión a protoporfirina IX
MG(RASSL)_{4}
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
64
Proteína de unión a protoporfirina IX
MG(RASSL)_{8}
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Hiroki NAKAJIMA et al.;
Sumitomo Chemical Company Limited
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para comunicar resistencia a
compuestos para el control de las malas hierbas a plantas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 10/120553
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-04-30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 10/281127
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-10-02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 10/330981
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-11-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 11/054730
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-03-02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 64
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el gen bchH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacatctaga ggagacgacc atatgcacgg tgaagtctc
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el gen bchH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacggaagctt agatcttcac tcggcggcaa t
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el gen PPO de soja
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgagctcca tggtttccgt cttcaacgag atcctattc
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el gen PPO de soja
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgtcgacaa ctgctactat ttgtacactc tatttg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1632
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max var. Williams82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)... (1632)
\newpage
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<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 543
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max var. Williams82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el gen bchH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacatctagt ctagacgacc atatgcacgg tgaagtctc
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el gen bchH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacggaagctt ggtacctcac tcggcggcaa t
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del
gen ch1H de tabaco
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaatgtaat gctatggtac ctatgttatt cactc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del
gen ch1H de tabaco
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagatcattc tttttgctgt cgacttatcg atcg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del
gen PPO de soja
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcggaggcg tcaccatggt ctgcatcgcc caggcc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del
gen PPO de soja
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcctgcaggt cgacaactgc tactatttgt acactc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del
gen PPO de soja
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacaggaaag gtaccatggt ctgcatcgcc cag
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del
gen PPO de soja
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgcagctc gagagctcct actatttgta cac
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el gen PPO de Chlamydomonas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatgatgttg acccagactc ctgggacc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el gen PPO de Chlamydomonas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptactacacat cccagcaagc gccaatg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1838
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydomonas reinhardtii
CC_{4}07
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)... (1693)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 563
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydomonas reinhardtii
CC_{4}07
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del
gen PPO de Chlamydomonas
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtcggtgga ggggatccga tgctggtgac cg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del
gen PPO de Chlamydomonas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctactgctg cgagctctta ggccttgact gc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del
gen ferroquelatasa de pepino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctttagaat cggatcctat ggcagtggat gac
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el fragmento de ADN que tiene la secuencia parcial del
gen ferroquelatasa de pepino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgaacttc tatttgagct ctcaggtaaa tataag
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el gen hemF de Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgaaggcg tgatcagtta tttcc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el gen hemF de Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcagcctg cagtgcgaaa agtg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el gen hemF de Escherichia coli
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<220>
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<223> Oligonucleótido diseñado para
amplificar el gen hemF de Escherichia coli
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótidos diseñados para
sintetizar genes que codifican péptidos al azar que comprenden 5
aminoácidos
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótidos diseñados para
sintetizar genes que codifican péptidos al azar que comprenden 5
aminoácidos
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido HASYS
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido HASYS
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido RASSL
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido RASSL
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido MGHASYS
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido MGHASYS
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido MGRASSL
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sintetizar el gen que codifica el péptido MGRASSL
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<223> Oligonucleótidos diseñados para
sintetizar el gen que codifica el péptido MGYAGY
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido MGYAGY
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido MGYAGF
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<212> ADN
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<220>
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido MGYAGF
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido
MG(HASYS)4
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido MG (HASYS)4
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido MG(HASYS) 4
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido MG (HASYS)8
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido
MG(HASYS)8
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido
MG(RASSL)4
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido
MG(RASSL)4
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido
MG(RASSL)4
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido
MG(RASSL)4
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<400> 50
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<210> 51
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido
MG(RASSL)8
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Oligonucleótido diseñado para
sintetizar el gen que codifica el péptido
MG(RASSL)8
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<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgcagggaa gatgcgcgca gggaagaagc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de unión a protoporfirina
IX HASYS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de unión a protoporfirina
IX MGHASYS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de unión a protoporfirina
IX RASSL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de unión a protoporfirina
IX MGRASSL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de unión a H_{2}TMpyP
YAGY.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de unión a H_{2}TMpyP
MGYAGY
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de unión a H_{2}TMpyP
YAGF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de unión a H_{2}TMpyP
MGYAGF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de unión a protoporfirina
IX MG (HASYS)_{4}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de unión a protoporfirina
IX MG(HASYS)_{8}
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de unión a protoporfirina
IX MG(RASSL)_{4}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de unión a protoporfirina
IX MG(RASSL)_{8}.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
Claims (34)
1. Un método para elaborar plantas resistentes a
compuestos para el control de las malas hierbas que comprende las
etapas de
- (a)
- introducir en una célula vegetal un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en:
- \quad
- magnesio quelatasa de tipo activo o inactivo que tiene afinidad por la protoporfirina IX;
- \quad
- ferroquelatasa de tipo activo o inactivo que tiene afinidad por la protoporfirina IX; cobalto quelatasa de tipo activo o inactivo que tiene afinidad por la protoporfirina IX,
- \quad
- un péptido que tiene afinidad por la protoporfirina IX, compuesto por 6 a 100 aminoácidos, estando dicho péptido esencialmente libre de regiones marco de regiones variables de una inmunoglobulina;
- \quad
- protoporfirinógeno IX oxidasa de tipo inactivo que tiene afinidad por el protoporfirinógeno IX; y
- \quad
- coproporfirinógeno III oxidasa de tipo activo o inactivo que tiene afinidad por el protoporfirinógeno IX,
- \quad
- no teniendo esencialmente dichas proteínas capacidad de modificar el protoporfirinógeno IX; y
- (b)
- expresar el gen.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde el compuesto para el control de las malas hierbas está
inhibiendo la biosíntesis de porfirina de una planta.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1
o 2, donde el compuesto para el control de las malas hierbas es un
compuesto herbicida de tipo inhibidor de protoporfirinógeno IX
oxidasa.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, donde la proteína es la magnesio
quelatasa o una variante de dicha proteína que tiene afinidad
específica por la protoporfirina IX.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, donde la proteína es una proteína de la
subunidad de unión a protoporfirina IX de la magnesio quelatasa, o
una variante de dicha proteína que tiene afinidad específica por la
protoporfirina IX.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, donde la magnesio quelatasa deriva de
un microorganismo fotosintético o una planta.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, donde la magnesio quelatasa deriva de
tabaco.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, donde la proteína es una variante de la
protoporfirinógeno IX oxidasa que no tiene capacidad para oxidar el
protoporfirinógeno IX y que tiene una afinidad específica por el
protoporfirinógeno IX.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, donde la proteína es una variante de la
protoporfirinógeno IX oxidasa que no tiene capacidad para oxidar el
protoporfirinógeno IX y que tiene afinidad específica por un
compuesto herbicida de tipo inhibidor de la protoporfirinógeno IX
oxidasa.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, 8 o 9, donde la protoporfirinógeno IX
oxidasa deriva de una planta.
11. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 o 8 a 10, donde la protoporfirinógeno IX
oxidasa deriva de soja.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, 8 o 9, donde la protoporfirinógeno IX
oxidasa deriva de algas.
13. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, 8, 9 o 12, donde la protoporfirinógeno
IX oxidasa deriva de Chlamydomonas.
14. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, donde la proteína es ferroquelatasa o
una variante de dicha proteína que tiene afinidad específica por la
protoporfirina IX.
15. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 o 14, donde la ferroquelatasa deriva de
una planta.
16. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, 14 o 15, donde la ferroquelatasa deriva
de cebada o de pepino.
17. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, donde el péptido comprende la secuencia
de aminoácidos del SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ
ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, o SEQ ID
NO: 60.
18. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, o 17, donde el péptido comprende la
repetición de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 53, 55, 57
o 59 cuatro veces u ocho veces.
19. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, donde la proteína es la
coproporfirinógeno III oxidasa o una variante de dicha proteína que
tiene afinidad específica por el protoporfirinógeno IX.
20. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 o 19, donde la coproporfirinógeno III
oxidasa deriva de un microorganismo.
21. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, 19 o 20, donde la coproporfirinógeno
III oxidasa deriva de Escherichia coli.
22. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 21, donde el gen es introducido en la
célula vegetal de forma que está ligado operablemente a un promotor
y un terminador ambos los cuales son funcionales en la célula
vegetal.
23. El método de acuerdo con la reivindicación
1, donde el compuesto para el control de las malas hierbas está
inhibiendo la transferencia de electrones en la fotosíntesis, la
biosíntesis de carotenoides, la biosíntesis de aminoácidos, la
biosíntesis de lípidos o la biosíntesis de la pared celular,
influyendo en la biosíntesis de proteínas, la biosíntesis de ácido
nucleico o la división celular o teniendo una actividad antagonista
de auxinas.
24. El método de la reivindicación 23, donde el
compuesto para el control de las malas hierbas que inhibe la
transferencia de electrones en la fotosíntesis es un compuesto que
inhibe la transferencia de electrones del sistema fotoquímico I o
II o inhibe la
4-hidroxifenilpiruvato-dioxigenasa
(4-HPPD); el que inhibe la biosíntesis de
carotenoides es un compuesto que inhibe la
fitoeno-desaturasa (PDS); el que inhibe la
biosíntesis de aminoácidos es un compuesto que inhibe la EPSPS, la
acetolactato sintasa (ALS), la glutamina sintetasa (GS) o la
dihidropteroato sintasa (DHP); el que inhibe la biosíntesis de
lípidos es un compuesto que inhibe la acetil CoA carboxilasa (ACC);
el que inhibe la biosíntesis de la pared celular es un compuesto que
inhibe la biosíntesis de celulosa; el que influyen en la
biosíntesis de proteínas, la biosíntesis de ácido nucleico o la
división celular es un compuesto que inhibe la formación de
microtúbulos; o el que tiene la actividad antagónica de auxinas es
un compuesto que potencia la elongación y diferenciación
celular.
25. El método de la reivindicación 24, donde el
compuesto que inhibe la transferencia de electrones en el sistema
fotoquímico I es paraquat o diquat; el que inhibe la transferencia
de electrones en el sistema fotoquímico II es un compuesto de
triazina, un compuesto de urea o un compuesto de nitrilo; el que
inhibe la 4-HPPD es un isoxazol, pirazol o
tricetona; el que inhibe la PDS es norflurazon, flurocloridon,
fluridona, flurtamona o diflufenican; el que inhibe la EPSPS es
glifosato; el que inhibe la ALS es una sulfonilurea, imidazolinona,
pirimidiniltiobenzoato o triazolopirimidina; el que inhibe GS es
bialafos o glufosinato; el que inhibe la DHP es asulam; el que
inhibe ACC es una ciclohexanodiona o ariloxifenoxipropionato; o el
que inhibe la celulosa es diclobenilo.
26. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 22, donde el compuesto para el control de
las malas hierbas es un compuesto herbicida de tipo inhibidor de
protoporfirinógeno IX oxidasa seleccionado entre los compuestos (1)
a (3) de más abajo:
- (1)
- clormetoxinil, bifenox, clomitrofeno, acifluorfeno y su éster etílico, acifluorfeno-sodio, oxifluorfeno, oxadiazon, 2-[4-cloro-2-fluoro-5-(prop-2-iniloxi)fenil]-2, 3, 4, 5, 6, 7-hexahidro-1H-isoindol-1,3-diona, clorfalim, TNPP-etilo, o N3-(1-feniletil)-2,6-dimetil-5-propionilnicotinamida;
- (2)
- un compuesto representado por la fórmula general: J-G (I), donde G es un grupo representado por una cualquiera de las siguientes fórmulas generales G-1 a G-9 y J es un grupo representado por una cualquiera de las siguientes fórmulas generales J-1 a J-30:
- \quad
- donde las líneas discontinuas en las fórmulas J-5, J-6, J-12 y J-24 significan que el anillo de la izquierda contiene solamente enlaces sencillos, o un enlace en el anillo de la derecha es un doble enlace entre los átomos de carbono;
- \quad
- X es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre;
- \quad
- Y es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre;
- \quad
- R^{1} es un átomo de hidrógeno o un átomo de halógeno;
- \quad
- R^{2} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{8}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{8}, un átomo de halógeno, un grupo OH, un grupo OR^{27}, un grupo SH, un grupo S(O)_{p}R^{27}, un grupo COR^{27}, un grupo CO_{2}R^{27}, un grupo C(O)SR^{27}, un grupo C(O)NR^{25}R^{30}, un grupo CHO, un grupo CR^{27}=NOR^{36}, un grupo CH=CR^{37}CO_{2}R^{27}, un grupo CH_{2}CHR^{37}CO_{2}R^{27}, un grupo CO_{2}N=CR^{31}R^{32}, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo NHSO_{2}R^{33}, un grupo NHSO_{2}NHR^{33}, un grupo NR^{27}R^{39}, un grupo NH_{2} o un grupo fenilo opcionalmente con uno o más grupos alquilo C_{1}-C_{4} iguales o diferentes;
- \quad
- p es 0, 1 o 2;
- \quad
- R^{3} es un grupo alquilo C_{1}-C_{2}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{2}, un grupo OCH3, un grupo SCH3, un grupo OCHF2, un átomo de halógeno, a grupo ciano o un grupo nitro;
- \quad
- R^{4} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{3} o un átomo de halógeno;
- \quad
- R^{5} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3}, un átomo de halógeno, a grupo haloalquilo C_{1}-C_{3}, grupo ciclopropilo, un grupo vinilo, un grupo alquinilo C_{2}, un grupo ciano, un grupo C(O)R^{38}, CO_{2}R^{38}, un grupo C(O)NR^{38}R^{39}, un grupo CR^{34}R^{35}CN, un grupo CR^{34}R^{35}C(O)R^{38}, un grupo CR^{34}R^{35}CO_{2}R^{38}, un grupo CR^{34}R^{35}C(O)NR^{38}R^{39}, un grupo CHR^{34}OH, un grupo CHR^{34}OC(O)R^{38} o un grupo OCHR^{34}OC(O)NR^{39}R^{39}, o, cuando G es G-2 o G-6, R^{4} y R^{5} pueden formar un grupo C=O junto con el átomo de carbono al que están anclados;
- \quad
- R^{6} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alcoxialquilo C_{2}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6} o un grupo alquinilo C_{3}-C_{6};
- \quad
- X^{1} es un enlace sencillo, un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo NH, un grupo N(alquilo C_{1}-C_{3}), un grupo N(haloalquilo C_{1}-C_{3}) o un grupo N(alilo);
- \quad
- R^{7} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un átomo de halógeno, un grupo S(O)_{2}(alquilo C_{1}-C_{6}) o un grupo C(=O)R^{40};
- \quad
- R^{9} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{8}, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{8}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{8}, un grupo alcoxialquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alcoxialcoxialquilo C_{3}-C_{8}, un grupo alcoxialquinilo C_{3}-C_{8}, un grupo haloalquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquilsulfonilo C_{1}-C_{8}, un grupo haloalquilsulfonilo C_{1}-C_{8}, un grupo alcoxicarbonilalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo S(O)_{2}NH(alquilo C_{1}-C_{8}), un grupo C(O)R^{41} o un grupo bencilo cuyo anillo de fenilo puede estar sustituido con R^{42};
- \quad
- n y m son independientemente 0, 1, 2 o 3 y m + n es 2 o 3;
- \quad
- Z es un grupo CR^{9}R^{10}, un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo S(O), un grupo S(O)2 o un grupo N(alquilo C_{1}-C_{4});
- \quad
- cada R^{9} es independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3}, un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo alquilcarboniloxi C_{2}-C_{6} o un grupo haloalquilcarboniloxi C_{2}-C_{6};
- \quad
- cada R^{10} es independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3}, y un grupo hidroxilo o un átomo de halógeno;
- \quad
- R^{11} y R^{12} son independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6} o un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6};
- \quad
- R^{13} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6}, un grupo haloalquenilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6}, un grupo haloalquinilo C_{3}-C_{6}, un grupo HC(=O), un grupo (alquilo C_{1}-C_{4})C(=O) o un grupo NH_{2};
- \quad
- R^{14} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquil(C_{1}-C_{6})tio, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6} o un grupo N(CH_{3})_{2};
- \quad
- W es un átomo de nitrógeno o CR^{15};
- \quad
- R^{15} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un átomo de halógeno, o grupo fenilo opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, uno o dos átomos de halógeno, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6} o un grupo CF3;
- \quad
- cada Q es independientemente un átomo de oxígeno o un átomo de azufre;
- \quad
- Q^{1} es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre;
- \quad
- Z^{1} es un grupo CR^{16}R^{17}, un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo S(O), un grupo S(O)2 o un grupo N(alquilo C_{1}-C_{4});
- \quad
- cada R^{16} es independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo alquilcarboniloxi C_{2}-C_{6} o un grupo haloalquilcarboniloxi C_{2}-C_{6};
- \quad
- cada R^{17} es independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un átomo de halógeno;
- \quad
- R^{18} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un átomo de halógeno o un grupo haloalquillo C_{1}-C_{5};
- \quad
- R^{19} y R^{20} son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, o un grupo haloalquillo C_{1}-C_{5};
- \quad
- Z^{2} es un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo NR9 o un grupo CR^{9}R^{10};
- \quad
- R^{21} y R^{22} son independientemente un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6}, un grupo haloalquenilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6} o un grupo haloalquinilo C_{3}-C_{6};
- \quad
- R^{13} es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo ciano;
- \quad
- R^{24} es un grupo alquil(C_{1}-C_{6})sulfonilo, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo haloalcoxi C_{1}-C_{6} o un átomo de halógeno;
- \quad
- R^{25} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6} o un grupo alquinilo C_{3}-C_{6};
- \quad
- R^{26} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6} o un grupo fenilo opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, uno o dos átomos de halógeno, uno o dos grupos nitro, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6} o un grupo CF3;
- \quad
- W^{1} es un átomo de nitrógeno o un grupo CH;
- \quad
- T es un grupo representado por una cualquiera de las siguientes fórmulas generales T-1, T-2 y T-3;
- \quad
- (donde E^{1}, E^{2}, E^{3}, E^{4}, E^{5}, E^{6}, E^{7}, E^{8}, E^{9}, E^{10}, E^{11} y E^{12} son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{3});
- \quad
- R^{27} es un grupo alquilo C_{1}-C_{8}, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{8}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{8}, un grupo alcoxialquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquiltioalquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquilsulfinilalquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquilsulfonilalquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquilsulfonilo C_{1}-C_{8}, un grupo fenilsulfonilo cuyo anillo de fenilo puede estar sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno y un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alcoxialcoxialquilo C_{4}-C_{9}, un grupo ciclo-alquilalquilo C_{4}-C_{8}, un grupo cicloalcoxialquilo C_{6}-C_{8}, un grupo alqueniloxialquilo C_{4}-C_{9}, un grupo alquiniloxialquilo C_{4}-C_{8}, un grupo haloalcoxialquilo C_{3}-C_{8}, un grupo haloalqueniloxialquilo C_{3}-C_{8}, un grupo haloalquiniloxialquilo C_{3}-C_{8}, un grupo cicloalquiltioalquilo C_{6}-C_{8}, un grupo alquenil-tioalquilo C_{4}-C_{8}, un grupo alquiniltioalquilo C_{4}-C_{8}, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} sustituido con un grupo fenoxi cuyo anillo está sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3} y grupo haloalquilo C_{1}-C_{3}, un grupo benciloxi cuyo anillo está sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3} y, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{3}, un grupo trialquilsililalquilo C_{4}-C_{8}, un grupo cianoalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo halocicloalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo haloalquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alcoxialquenilo C_{5}-C_{3}, un grupo haloalcoxialquenilo C_{5}-C_{8}, un grupo alquiltioalquenilo C_{5}-C_{8}, un grupo alcoxialquinilo C_{3}-C_{8}, un grupo alcoxialquinilo C_{5}-C_{8}, un grupo haloalcoxialquinilo C_{5}-C_{8}, un grupo alquil(C_{5}-C_{8})tioalquinilo, un grupo alquilcarbonilo C_{2}-C_{8}, un grupo bencilo cuyo anillo está sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3} y un grupo haloalquilo C_{1}-C_{3}, un grupo CHR^{34}COR^{23}, un grupo CHR^{34}COOR^{28}, un grupo CHR^{34}P(O)(OR^{28})_{2}, un grupo CHR^{34}P(S)(OR^{28})_{z}, un grupo CHR^{34}C(O)NR^{29}R^{30} o un grupo CHR^{34}C(O)NH_{2};
- \quad
- R^{28} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6} o un grupo tetrahidrofuranilo;
- \quad
- R^{29} y R^{31} son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- \quad
- R^{30} y R^{32} son independientemente un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un grupo fenilo cuyo anillo puede estar sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{3} y un grupo haloalquilo C_{1}-C_{3}; o,
- \quad
- R^{29} y R^{30} pueden formar juntos -(CH_{2})_{5}-, -(CH_{2})_{4}- o -CH_{2}CH_{2}OCH_{2}CH_{2}-, o el anillo formado de este modo puede estar sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo C_{1}-C_{3}, un grupo fenilo y un grupo bencilo; o,
- \quad
- R^{31} y R^{32} pueden formar un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{8} junto con el átomo de carbono al que están anclados;
- \quad
- R^{33} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{4} o un grupo alquenilo C_{3}-C_{6};
- \quad
- R^{34} y R^{35} son independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- \quad
- R^{36} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{5}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6} o un grupo alquinilo C_{3}-C_{6};
- \quad
- R^{37} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un átomo de halógeno;
- \quad
- R^{38} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6}, un grupo alcoxialquilo C_{2}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, a grupo fenilo cuyo anillo puede estar sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} y un grupo alcoxi C_{1}-C_{4}, un grupo -CH_{2}CO_{2}(alquilo C_{1}-C_{4}) o un grupo -CH(CH_{3})CO_{2}-(alquilo C_{1}-C_{4});
- \quad
- R^{39} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{2} o un grupo C(O)O(alquilo C_{1}-C_{4});
- \quad
- R^{40} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6} o un grupo NH (alquilo C_{1}-C_{6});
- \quad
- R^{41} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6}, un grupo NH(alquilo C_{1}-C_{6}), un grupo fenilo cuyo anillo puede estar sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un grupo R42, un grupo bencilo y un grupo dialquilamino C_{2}-C_{8}; y
- \quad
- R^{12} es un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, uno o dos átomos de halógeno, un grupo alcoxi C_{1}-C_{6} o un grupo CF_{3};
\newpage
- (3)
- un compuesto de fórmula (II):
- \quad
- o nipilacrofeno,
- donde R^{43} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{4} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alquil(C_{1}-C_{4})tio , un grupo alcoxi C_{1}-C_{4}, un grupo haloalquilo C_{1}-C_{4}, un grupo haloalquil(C_{1}-C_{4})tio o un grupo haloalcoxi C_{1}-C_{4};
- R^{43} y R^{44} pueden formar juntos -(CH_{2})_{3}- o (CH_{2})_{4}-;
- R^{45} es un átomo de hidrógeno o un átomo de halógeno;
- R^{46} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{47} es un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo -COOR^{49}, un grupo -C(=X)NR^{50}R^{51} o un grupo -C(=X^{2})R^{52};
- R^{48} es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo ciano, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno y un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C_{1}-C_{4}, un grupo fenilo opcionalmente sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{4} y un grupo haloalquilo C_{1}-c4, un grupo pirrolilo, un grupo alquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{8}, un grupo alcoxi C_{3}-C_{9}, un grupo seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo C_{2}-C_{8}, un grupo alquenilo C_{3}-C_{8}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{8} y un grupo alcoxi C_{3}-C_{8} en el que al menos un átomo de oxígeno es insertado, o uno cualquiera de los grupos representados por las siguientes fórmulas:
\vskip1.000000\baselineskip
- donde R^{49}, R^{50} y R^{52} son, iguales o diferentes, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{50} y R^{51} pueden formar un anillo de 5 o 6 miembros alicíclico saturado junto con un átomo de nitrógeno al que están anclados;
- R^{52} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un grupo alquilo C_{1}-C_{4} sustituido con al menos un átomo de halógeno;
- R^{53} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, a grupo fenilo opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo cianometilo, o un grupo R^{63}CO-;
- R^{54} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, a grupo fenilo opcionalmente sustituido con un átomo de halógeno, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{8}, un grupo cianometilo, C_{1}-C_{4} alkoxi-un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, di-C_{1}-C_{4} alkylamino-un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo tetrahidrofurfurilo, C_{3}-C_{6} alkiniloxi-un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, a bencilo cuyo anillo puede estar sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{4} y un grupo haloalquilo C_{1}-C_{4}, un grupo -C(=X^{2})R^{63}, un grupo (CH_{2})_{a}-(O)_{d}-R^{70}, un grupo -(CH_{2})_{a}-O-(CH_{2})_{b}-R^{70}, un grupo -(CH_{2})_{a}-X^{2}-R^{76};
- R^{53} y R^{54} junto con un átomo de nitrógeno al que están anclados pueden formar un anillo de 3, 5 o 6 miembros alicíclico saturado o un anillo de 5 o 6 miembros aromático en el que un átomo de carbono puede ser opcionalmente remplazado por un átomo de oxígeno;
- R^{35} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6} o un grupo alquinilo C_{3}-C_{6}, o R^{55} y R^{56} pueden formar juntos -(CH_{2})_{e}-;
- R^{56} y R^{57} son independientemente un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno o un grupo fenilo opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un átomo de hidrógeno, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6}, un grupo -XR^{60} o un grupo -NR^{61}R^{62};
- R^{58} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{2}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6}, un grupo alquilcarbonilo C_{1}-C_{4}, un grupo cianoalquilo C_{1}-C_{3}, un grupo alcoxicarbonil(C_{1}-C_{4})alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo dialcoxicarbonil(C_{1}-C_{4})alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo bencilo, un grupo alcoxil(C_{1}-C_{4})alquinilo C_{1}-C_{4}, un grupo -(CH_{2})_{a}-R^{75}, un grupo -(CH_{2})_{a}-X^{2}-R^{72}, un grupo -(CH_{2})_{a}-X^{2}-(CH_{2})_{b}-R^{72} o un grupo -(CH_{2})_{a}-X^{2}-(CH_{2})_{b}-X^{2}-(CH_{2})_{c}-R^{72};
- R^{59} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alquenilo C_{2}-C_{6}, un grupo alquinilo C_{3}-C_{6}, un grupo cianoalquilo C_{1}-C_{3}, un grupo alquil(C_{1}-C_{4})carbonilalquilo C_{1}-C_{3} o un grupo fenilo;
- R^{60} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno;
- R^{61} y R^{62} son, iguales o diferentes, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{53} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un átomo de halógeno, un grupo alcoxi(C_{1}-C_{4})alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alquil(C_{1}-C_{4})tioalquilo C_{1}-C_{4}, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6}, un grupo fenilo cuyo anillo puede estar sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, un grupo alcoxi C_{1}-C_{4} y un grupo haloalquilo C_{1}-C_{4}, un grupo -NR^{73}R^{74} o un grupo -(CH_{2})_{a}-(O)_{d}-R^{75};
- R^{64} es un grupo alcoxicarbonilo C_{1}-C_{4} o un grupo carboxilo;
- R^{65} es un grupo clorometilo, un grupo cianometilo, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6} en el que al menos un átomo de oxígeno puede ser insertado, o un grupo alcoxicarbonil(C_{1}-C_{4})alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{65} es un grupo hidroxilo o un grupo -NR^{67}R^{68};
- A es un grupo NR^{67}R^{68} o un grupo -S(O)_{r}-R^{69};
- R^{67} y R^{63} son, iguales o diferentes, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- R^{69} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un grupo haloalquilo C_{1}-C_{4};
- R^{70} es un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con al menos un grupo alcoxi C_{1}-C_{4}, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6} en el que al menos un átomo de oxígeno puede ser insertado, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6} opcionalmente sustituido con uno o dos grupos metilo, un grupo furilo, un grupo tienilo o un grupo -C(=O)R^{71};
- R^{71} y R^{72} son, iguales o diferentes, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un grupo alcoxi C_{1}-C_{4};
- R^{73} y R^{74} son, iguales o diferentes, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o un grupo fenilo;
- R^{75} es un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6} en el que al menos un átomo de oxígeno puede ser insertado, un grupo cicloalquilo C_{3}-C_{6} opcionalmente sustituido con uno o dos grupos metilo, un grupo furilo, un grupo tienilo o un grupo -C(=O)R^{71};
- R^{76} es un grupo alquilo C_{1}-C_{4};
- a, b y c es independientemente 1, 2 o 3;
- d es 0 o 1;
- e es 2 o 3;
- f es 1 o 2; y
- X^{2} es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre.
27. Una célula de una planta transgénica
obtenible mediante el método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 26.
28. Una planta transgénica o un tejido vegetal
que comprende la célula vegetal de la reivindicación 27.
29. La planta transgénica de la reivindicación
28, que es resistente a al menos un compuesto definido en la
reivindicación 25 o 26.
30. Partes cosechables o material de propagación
de una planta de la reivindicación 28 o 29 que comprenden la célula
vegetal de la reivindicación 27.
31. El uso de un gen definido en una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 22 para producir una planta resistente
a al menos uno de los compuestos definidos en la reivindicación 25 o
26, la célula vegetal de la reivindicación 27 o la planta de la
reivindicación 28 o 29.
32. Un método para proteger una planta que
comprende aplicar el compuesto para el control de las malas hierbas
a una zona de crecimiento de la planta de la reivindicación 28 o
29.
33. Un método para seleccionar una planta que
comprende aplicar un compuesto para el control de las malas hierbas
al cual es resistente la planta de la reivindicación 28 o 29 a una
zona de crecimiento de la planta de la reivindicación 28 o 29 y
otras plantas, y seleccionar cualquier planta basándose en la
diferencia de crecimiento entre las plantas.
34. Un método para seleccionar una célula
vegetal que comprende aplicar un compuesto para el control de las
malas hierbas al cual es resistente la célula vegetal de la
reivindicación 27 a una zona de crecimiento de la célula vegetal de
la reivindicación 27 y otras células vegetales, y seleccionar
cualquier planta basándose en la diferencia de crecimiento entre
las células vegetales.
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