JP7010819B2 - 除草剤耐性を有する形質転換植物 - Google Patents
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Description
(b)配列番号2のアミノ酸配列に対して80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
(2)上記イソキサゾリン誘導体はピロキサスルホン及び/又はフェノキサスルホンであることを特徴とする(1)記載の栽培方法。
(b)配列番号2のアミノ酸配列に対して80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
(9)上記イソキサゾリン誘導体はピロキサスルホン及び/又はフェノキサスルホンであることを特徴とする(8)記載の耐性付与方法。
(b)配列番号2のアミノ酸配列に対して80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
(15)上記環境ストレスは、高温ストレスであることを特徴とする(14)記載の耐性付与方法。
(b)配列番号2のアミノ酸配列に対して80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
(23)イソキサゾリン誘導体に対する耐性及び/又は環境ストレスに対する耐性を有することを特徴とする(22)記載の形質転換植物。
〔本発明に係るグルタチオン-S-トランスフェラーゼ〕
本発明に係るグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(以下、GSTと略称する場合がある)は、以下の(a)又は(b)のタンパク質として規定することができる。
(b)配列番号2のアミノ酸配列に対して80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
ここで、配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質は、コムギ(Triticum aestivum)由来のGSTのうちGST F3とも呼称されるものであり、アクセッションコード:Q8GTC0として特定されるものである。また、配列番号2のアミノ酸配列については、アクセッション番号:AJ440792_1としてCDS配列(配列番号1)とともに特定されている。
本発明に係る形質転換植物は、所定の植物(植物体、植物細胞)に上述したGSTをコードする遺伝子を発現可能に導入したものである。本発明に係る形質転換植物は、上述したGSTをコードする遺伝子を発現することで、詳細を後述するイソキサゾリン誘導体に対する耐性及び環境ストレスに対する耐性を獲得する。
本発明において、イソキサゾリン誘導体とは、イソキサゾリン骨格を有する化合物及びその塩を含む意味である。イソキサゾリン誘導体の除草活性については、例えば、特開平8-225548号公報、特開平9-328477号公報及び特開平9-328483号公報等に報告されている。すなわち、これら既報のイソキサゾリン誘導体は除草剤として使用することができる。
(1)一般式[I]を有するイソオキサゾリン誘導体又はその薬理上許容される塩:
R1及びR2は、同一又は異なって、水素原子、C1~C10アルキル基、C3~C8シクロアルキル基又はC3~C8シクロアルキルC1~C3アルキル基を示すか、或いはR1とR2とが一緒になって、これらの結合した炭素原子と共にC3~C7のスピロ環を示し、
R3及びR4は、同一又は異なって、水素原子、C1~C10アルキル基又はC3~C8シクロアルキル基を示すか、或いはR3とR4とが一緒になって、これらの結合した炭素原子と共にC3~C7のスピロ環を示し、さらにR1、R2、R3及びR4はこれらの結合した炭素原子と共に5~8員環を形成することもでき、
R5及びR6は、同一又は相異なって、水素原子又はC1~C10アルキル基を示し、
Yは窒素原子、酸素原子及び硫黄原子より選択される任意のヘテロ原子を有する5~6員の芳香族ヘテロ環基又は芳香族ヘテロ縮合環基を示し、これらのヘテロ環基は置換基群αより選択される、0~6個の同一又は相異なる基で置換されていてもよく、又、隣接したアルキル基同士、アルコキシ基同士、アルキル基とアルコキシ基、アルキル基とアルキルチオ基、アルキル基とアルキルスルホニル基、アルキル基とモノアルキルアミノ基又はアルキル基とジアルキルアミノ基が2個結合して1~4個のハロゲン原子で置換されてもよい5~8員環を形成されていてもよく、又、これらのヘテロ環基のヘテロ原子が窒素原子の時は酸化されてN-オキシドになってもよく、
nは0~2の整数を示し、
以下の置換基群中の「置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいフェノキシ基、置換されていてもよいフェニルチオ基、置換されていてもよい芳香族ヘテロ環基、置換されていてもよい芳香族ヘテロ環オキシ基、置換されていてもよい芳香族ヘテロ環チオ基、置換されていてもよいフェニルスルフィニル基、置換されていてもよいフェニルスルホニル基、置換されていてもよい芳香族ヘテロ環スルホニル基、置換されていてもよいフェニルスルホニルオキシ基、置換されていてもよいベンジルカルボニル基、置換されていてもよいベンゾイル基、置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル基、置換されていてもよいフェノキシカルボニル基、置換されていてもよいベンジルカルボニルオキシ基、置換されていてもよいベンゾイルオキシ基」における「置換されていてもよい」は、当該置換基がハロゲン原子、C1~C10アルキル基、C1~C4ハロアルキル基、C1~C10アルコキシアルキル基、C1~C10アルコキシ基、C1~C10アルキルチオ基、C1~C10アルキルスルホニル基、アシル基、C1~C10アルコキシカルボニル基、シアノ基、カルバモイル基(該基の窒素原子は同一又は異なって、C1~C10アルキル基で置換されていてもよい)、ニトロ基、又はアミノ基(該基の窒素原子は同一又は異なって、C1~C10アルキル基、C1~C6アシル基、C1~C4ハロアルキルカルボニル基、C1~C10アルキルスルホニル基、又はC1~C4ハロアルキルスルホニル基で置換されていてもよい)で置換されていてもよいことを示す。
「置換基群α」
水酸基、チオール基、ハロゲン原子、C1~C10アルキル基、置換基群βより選択される任意の基でモノ置換されたC1~C10アルキル基、C1~C4ハロアルキル基、C3~C8シクロアルキル基、C1~C10アルコキシ基、置換基群γより選択される任意の基でモノ置換されたC1~C10アルコキシ基、C1~C4ハロアルコキシ基、C3~C8シクロアルキルオキシ基、C3~C8シクロアルキルC1~C3アルキルオキシ基、C1~C10アルキルチオ基、置換基群γより選択される任意の基でモノ置換されたC1~C10アルキルチオ基、C1~C4ハロアルキルチオ基、C2~C6アルケニル基、C2~C6アルケニルオキシ基、C2~C6アルキニル基、C2~C6アルキニルオキシ基、C1~C10アルキルスルフィニル基、置換基群γより選択される任意の基でモノ置換されたC1~C10アルキルスルフィニル基、C1~C10アルキルスルホニル基、置換基群γより選択される任意の基でモノ置換されたC1~C10アルキルスルホニル基、C1~C4ハロアルキルスルフィニル基、置換基群γより選択される任意の基でモノ置換されたC1~C10アルキルスルホニルオキシ基、C1~C4ハロアルキルスルホニル基、C1~C10アルキルスルホニルオキシ基、C1~C4ハロアルキルスルホニルオキシ基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいフェノキシ基、置換されていてもよいフェニルチオ基、置換されていてもよい芳香族ヘテロ環基、置換されていてもよい芳香族ヘテロ環オキシ基、置換されていてもよい芳香族ヘテロ環チオ基、置換されていてもよいフェニルスルフィニル基、置換されていてもよいフェニルスルホニル基、置換されていてもよい芳香族ヘテロ環スルホニル基、置換されていてもよいフェニルスルホニルオキシ基、アシル基、C1~C4ハロアルキルカルボニル基、置換されていてもよいベンジルカルボニル基、置換されていてもよいベンゾイル基、カルボキシル基、C1~C10アルコキシカルボニル基、置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル基、置換されていてもよいフェノキシカルボニル基、シアノ基、カルバモイル基(該基の窒素原子は同一又は異なって、C1~C10アルキル基又は置換されていてもよいフェニル基で置換されていてもよい。)、C1~C6アシルオキシ基、C1~C4ハロアルキルカルボニルオキシ基、置換されていてもよいベンジルカルボニルオキシ基、置換されていてもよいベンゾイルオキシ基、ニトロ基、アミノ基(該基の窒素原子は同一又は異なって、C1~C10アルキル基、置換されていてもよいフェニル基、C1~C6アシル基、C1~C4ハロアルキルカルボニル基、置換されていてもよいベンジルカルボニル基、置換されていてもよいベンゾイル基、C1~C10アルキルスルホニル基、C1~C4ハロアルキルスルホニル基、置換されていてもよいベンジルスルホニル基又は置換されていてもよいフェニルスルホニル基で置換されていてもよい。)。
「置換基群β」
水酸基、C3~C8シクロアルキル基(該基はハロゲン原子又はアルキル基で置換されてもよい)、C1~C10アルコキシ基、C1~C10アルキルチオ基、C1~C10アルキルスルホニル基、C1~C10アルコキシカルボニル基、C2~C6ハロアルケニル基、アミノ基(該基の窒素原子は同一又は異なって、C1~C10アルキル基、C1~C6アシル基、C1~C4ハロアルキルカルボニル基、C1~C10アルキルスルホニル基、C1~C4ハロアルキルスルホニル基で置換されていてもよい)、カルバモイル基(該基の窒素原子は同一又は異なって、C1~C10アルキル基で置換されていてもよい)、C1~C6アシル基、C1~C4ハロアルキルカルボニル基、C1~C10アルコキシイミノ基、シアノ基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいフェノキシ基。
「置換基群γ」
C1~C10アルコキシカルボニル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよい芳香族ヘテロ環基、シアノ基、カルバモイル基(該基の窒素原子は同一又は異なって、C1~C10アルキル基で置換されていてもよい。)。
(2)0~6個の同一又は相異なる基で置換されていてもよいヘテロ環上の置換基群αが水酸基、ハロゲン原子、C1~C10アルキル基、置換基群βより選択される任意の基でモノ置換されたC1~C10アルキル基、C1~C4ハロアルキル基、C3~C8シクロアルキル基、C1~C10アルコキシ基、置換基群γより選択される任意の基でモノ置換されたC1~C10アルコキシ基、C1~C4ハロアルコキシ基、C3~C8シクロアルキルオキシ基、C3~C8シクロアルキルC1~C3アルキルオキシ基、C1~C10アルキルチオ基、置換基群γより選択される任意の基でモノ置換されたC1~C10アルキルチオ基、C1~C4ハロアルキルチオ基、C2~C6アルケニル基、C2~C6アルケニルオキシ基、C2~C6アルキニル基、C2~C6アルキニルオキシ基、C1~C10アルキルスルホニル基、C1~C4ハロアルキルスルホニル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいフェノキシ基、置換されていてもよいフェニルチオ基、置換されていてもよい芳香族ヘテロ環基、置換されていてもよい芳香族ヘテロ環オキシ基、置換されていてもよい芳香族ヘテロ環チオ基、置換されていてもよいフェニルスルホニル基、置換されていてもよい芳香族ヘテロ環スルホニル基、C1~C6アシル基、C1~C4ハロアルキルカルボニル基、置換されていてもよいベンジルカルボニル基、置換されていてもよいベンゾイル基、カルボキシル基、C1~C10アルコキシカルボニル基、シアノ基、カルバモイル基(該基の窒素原子は同一又は異なって、C1~C10アルキル基又は置換されていてもよいフェニル基で置換されていてもよい。)、ニトロ基、アミノ基(該基の窒素原子は同一又は異なって、C1~C10アルキル基、置換されていてもよいフェニル基、C1~C6アシル基、C1~C4ハロアルキルカルボニル基、置換されていてもよいベンジルカルボニル基、置換されていてもよいベンゾイル基、C1~C10アルキルスルホニル基、C1~C4ハロアルキルスルホニル基、置換されていてもよいベンジルスルホニル基又は置換されていてもよいフェニルスルホニル基で置換されていてもよい。)であるか、或いは隣接したアルキル基同士、アルコキシ基同士、アルキル基とアルコキシ基、アルキル基とアルキルチオ基、アルキル基とアルキルスルホニル基、アルキル基とモノアルキルアミノ基又はアルキル基とジアルキルアミノ基が2個結合して1~4個のハロゲン原子で置換されてもよい5~8員環を形成されていてもよい上記(1)記載のイソオキサゾリン誘導体。
(3)0~6個の同一又は相異なる基で置換されていてもよいヘテロ環上の置換基群αがハロゲン原子、C1~C10アルキル基、C1~C4ハロアルキル基、C1~C10アルコキシC1~C3アルキル基、C3~C8シクロアルキル基(該基はハロゲン原子又はアルキル基で置換されてもよい)、C1~C10アルコキシ基、C1~C4ハロアルコキシ基、C3~C8シクロアルキルC1~C3アルキルオキシ基、置換されていてもよいフェノキシ基、C1~C10アルキルチオ基、C1~C10アルキルスルホニル基、アシル基、C1~C4ハロアルキルカルボニル基、C1~C10アルコキシカルボニル基、シアノ基又はカルバモイル基(該基の窒素原子は同一又は異なってC1~C10アルキル基で置換されていてもよい)である上記(2)記載のイソオキサゾリン誘導体。
(4)R1及びR2が、同一又は異なってメチル基もしくはエチル基、R3、R4、R5及びR6が水素原子である上記(1)、(2)又は(3)記載のイソオキサゾリン誘導体。
(5)Yが窒素原子、酸素原子及び硫黄原子より選択される任意のヘテロ原子を有する5員環又は6員環の芳香族ヘテロ環基である上記(1)、(2)、(3)又は(4)記載のイソオキサゾリン誘導体。
(6)Yがチエニル基、ピラゾリル基、イソキサゾリル基、イソチアゾリル基、ピリジル基又はピリミジニル基である上記(5)記載のイソオキサゾリン誘導体。
(7)Yがチオフェン-3-イル基、ピラゾール-4-イル基、ピラゾール-5-イル基、イソオキサゾール-4-イル基、イソチアゾール-4-イル基、ピリジン-3-イル基又はピリミジン-5-イル基である上記(6)記載のイソオキサゾリン誘導体。
(8)Yがチオフェン-3-イル基で、置換基群αがチオフェン環の2及び4位に必ず置換した上記(7)記載のイソオキサゾリン誘導体。
(9)Yがピラゾール-4-イル基で、置換基群αがピラゾール環の3及び5位に、さらに1位に水素原子、C1~C10アルキル基、置換基群βより選択される任意の基でモノ置換されたC1~C10アルキル基、C1~C4ハロアルキル基、C3~C8シクロアルキル基、C2~C6アルケニル基、C2~C6アルキニル基、C1~C10アルキルスルフィニル基、C1~C10アルキルスルホニル基、置換基群γより選択される任意の基でモノ置換されたC1~C10アルキルスルホニル基、C1~C4ハロアルキルスルホニル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよい芳香族ヘテロ環基、置換されていてもよいフェニルスルホニル基、置換されていてもよい芳香族ヘテロ環スルホニル基、アシル基、C1~C4ハロアルキルカルボニル基、置換されていてもよいベンジルカルボニル基、置換されていてもよいベンゾイル基、C1~C10アルコキシカルボニル基、置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル基、置換されていてもよいフェノキシカルボニル基、カルバモイル基(該基の窒素原子は同一又は異なって、C1~C10アルキル基又は置換されていてもよいフェニル基で置換されていてもよい)、アミノ基(該基の窒素原子は同一又は異なって、C1~C10アルキル基、置換されていてもよいフェニル基、アシル基、C1~C4ハロアルキルカルボニル基、置換されていてもよいベンジルカルボニル基、置換されていてもよいベンゾイル基、C1~C10アルキルスルホニル基、C1~C4ハロアルキルスルホニル基、置換されていてもよいベンジルスルホニル基又は置換されていてもよいフェニルスルホニル基で置換されていてもよい)が必ず置換した上記(7)記載のイソオキサゾリン誘導体。
(10)Yがピラゾール-5-イル基で、置換基群αがピラゾール環の4位に、さらに1位に水素原子、C1~C10アルキル基、置換基群βより選択される任意の基でモノ置換されたC1~C10アルキル基、C1~C4ハロアルキル基、C3~C8シクロアルキル基、C2~C6アルケニル基、C2~C6アルキニル基、C1~C10アルキルスルフィニル基、C1~C10アルキルスルホニル基、置換基群γより選択される任意の基でモノ置換されたC1~C10アルキルスルホニル基、C1~C4ハロアルキルスルホニル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよい芳香族ヘテロ環基、置換されていてもよいフェニルスルホニル基、置換されていてもよい芳香族ヘテロ環スルホニル基、アシル基、C1~C4ハロアルキルカルボニル基、置換されていてもよいベンジルカルボニル基、置換されていてもよいベンゾイル基、C1~C10アルコキシカルボニル基、置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル基、置換されていてもよいフェノキシカルボニル基、カルバモイル基(該基の窒素原子は同一又は異なって、C1~C10アルキル基又は置換されていてもよいフェニル基で置換されていてもよい)、アミノ基(該基の窒素原子は同一又は異なって、C1~C10アルキル基、置換されていてもよいフェニル基、アシル基、C1~C4ハロアルキルカルボニル基、置換されていてもよいベンジルカルボニル基、置換されていてもよいベンゾイル基、C1~C10アルキルスルホニル基、C1~C4ハロアルキルスルホニル基、置換されていてもよいベンジルスルホニル基又は置換されていてもよいフェニルスルホニル基で置換されていてもよい)が必ず置換した上記(7)記載のイソオキサゾリン誘導体。
(11)Yがイソオキサゾール-4-イル基で、置換基群αがイソオキサゾール環の3位及び5位に必ず置換した上記(7)記載のイソオキサゾリン誘導体。
(12)Yがイソチアゾール-4-イル基で、置換基群αがイソチアゾール環の3位及び5位に必ず置換した上記(7)記載のイソオキサゾリン誘導体。
(13)Yがピリジン-3-イル基で、置換基群αがピリジン環の2位及び4位に必ず置換した上記(7)記載のイソオキサゾリン誘導体。
(14)Yがピリミジン-5-イル基で、置換基群αがピリミジン環の4位及び6位に必ず置換した上記(7)記載のイソオキサゾリン誘導体。
(15)nが2の整数である上記(1)~(14)いずれかに記載のイソオキサゾリン誘導体。
(16)nが1の整数である上記(1)~(14)いずれかに記載のイソオキサゾリン誘導体。
(17)nが0の整数である上記(1)~(14)いずれかに記載のイソオキサゾリン誘導体。
R1及びR2は水素原子、[C3~C8シクロアルキル基、C1~C6アルコキシ基、C1~C6アルキルカルボニル基、C1~C6アルキルチオ基、C1~C6アルキルスルフィニル基、C1~C6アルキルスルホニル基、C1~C6アルキルアミノ基、ジ(C1~C6アルキル)アミノ基、シアノ基、C1~C6アルコキシカルボニル基、C1~C6アルキルアミノカルボニル基、ジ(C1~C6アルキル)アミノカルボニル基、(C1~C6アルキルチオ)カルボニル基、カルボキシル基、(ハロゲン原子、C1~C6アルキル基又はC1~C6アルコキシ基が1~5個置換されていてもよい)ベンジルオキシ基、(ハロゲン原子、C1~C6アルキル基又はC1~C6アルコキシ基が1~5個置換されていてもよい)フェノキシ基若しくは(ハロゲン原子、C1~C6アルキル基又はC1~C6アルコキシ基が1~5個置換されていてもよい)フェニル基で置換されていてもよい]C1~C8アルキル基、C3~C8シクロアルキル基、C1~C6アルコキシカルボニル基、C1~C6アルキルアミノカルボニル基、ジ(C1~C6アルキル)アミノカルボニル基、(C1~C6アルキルチオ)カルボニル基、カルボキシル基又は(ハロゲン原子、C1~C6アルキル基又はC1~C6アルコキシ基が1~5個置換されていてもよい)フェニル基を表し、或いはR1及びR2はこれらの結合した炭素原子と共にC3~C7のスピロ環を形成してもよく、
但しR1とR2が同時に水素原子であることはなく、
R3及びR4は水素原子、(同一若しくは相異なる1~3個のハロゲン原子、C3~C8シクロアルキル基又はC1~C6アルコキシ基で置換されていてもよい)C1~C8アルキル基又はC3~C8シクロアルキル基を表し、R3及びR4はこれらの結合した炭素原子と共にC3~C7のスピロ環を形成してもよく、或いはR1、R2、R3及びR4はこれらの結合した炭素原子と共に5~8員環を形成してもよく、
Yは水素原子、C1~C6アルコキシカルボニル基、C2~C6アルケニル基、[同一若しくは相異なる1~3個のハロゲン原子、C1~C6アルコキシ基、C2~C6アルケニルオキシ基、C2~C6アルキニルオキシ基、(ハロゲン原子、C1~C6アルキル基又はC1~C6アルコキシ基が1~5個置換されていてもよい)ベンジルオキシ基、C1~C6アルコキシカルボニル基、カルボキシル基、水酸基又はホルミル基で置換されていてもよい]C1~C10アルキル基或いは(1~5個の同一若しくは相異なるR7で置換された)フェニル基を表し、
R7は水素原子、[同一若しくは相異なる1~3個のハロゲン原子、C1~C6アルコキシ基、水酸基、C1~C6アルキルチオ基、C1~C6アルキルスルフィニル基、C1~C6アルキルスルホニル基、C1~C6アルキルアミノ基、ジ(C1~C6)アルキルアミノ基、シアノ基又は(ハロゲン原子、C1~C6アルキル基又はC1~C6アルコキシ基が1~5個置換されていてもよい)フェノキシで置換されていてもよい]C1~C6アルキル基、(同一若しくは相異なる1~3個のハロゲン原子、C1~C6アルコキシ基、C2~C6アルケニル基、C2~C6アルキニル基、C1~C6アルコキシカルボニル基、C1~C6アルキルカルボニル基又はC3~C8シクロアルキル基で置換されていてもよい)C1~C6アルコキシ基、C2~C6アルケニル基、C3~C8シクロアルキルオキシ基、(同一若しくは相異なる1~3個のハロゲン原子又はC1~C6アルコキシ基で置換されていてもよい)C1~C6アルキルチオ基、(同一若しくは相異なる1~3個のハロゲン原子又はC1~C6アルコキシ基で置換されていてもよい)C1~C6アルキルスルフィニル基、(同一若しくは相異なる1~3個のハロゲン原子又はC1~C6アルコキシ基で置換されていてもよい)C1~C6アルキルスルホニル基、(ハロゲン原子、C1~C6アルキル基又はC1~C6アルコキシ基が1~5個置換されていてもよい)ベンジルオキシ基、(C1~C6アルキル基、C1~C6アルキルスルホニル基、C1~C6アルキルカルボニル(C1~C6アルキル)基又はC1~C6アルキルスルホニル(C1~C6アルキル)基で置換されていてもよい)アミノ基、ジ(C1~C6アルキル)アミノ基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、C1~C6アルコキシカルボニル基、C3~C8シクロアルキルオキシカルボニル基、カルボキシル基、C2~C6アルケニルオキシカルボニル基、C2~C6アルキニルオキシカルボニル基、(ハロゲン原子、C1~C6アルキル基又はC1~C6アルコキシ基が1~5個置換されていてもよい)ベンジルオキシカルボニル基、(ハロゲン原子、C1~C6アルキル基又はC1~C6アルコキシ基が1~5個置換されていてもよい)フェノキシカルボニル基或いはC1~C6アルキルカルボニルオキシ基を表す。}で示されるイソオキサゾリン誘導体及びその塩。
(19)上記(18)における一般式[I]で、
{式中、Qは基-S(O)n-(CR5R6)m-を表し、nは0~2の整数を表し、mは1を表し、R5及びR6は水素原子を表し、
R1及びR2は水素原子、(C3~C8シクロアルキル基若しくはC1~C6アルコキシ基で置換されていてもよい)C1~C8アルキル基又はC3~C8シクロアルキル基を表し、或いはR1及びR2はこれらの結合した炭素原子と共にC3~C7のスピロ環を形成してもよく、
但しR1とR2が同時に水素原子であることはなく、
R3及びR4は水素原子又は(同一若しくは相異なる1~3個のハロゲン原子、C3~C8シクロアルキル基又はC1~C6アルコキシ基で置換されてもよい)C1~C8アルキル基を表し、R3及びR4はこれらの結合した炭素原子と共にC3~C7のスピロ環を形成してもよく、或いはR1、R2、R3及びR4はこれらの結合した炭素原子と共に5~8員環を形成してもよく、
Yは(1~5個の同一若しくは相異なるR7で置換された)フェニル基を表し、
R7は水素原子、[同一若しくは相異なる1~3個のハロゲン原子、C1~C6アルコキシ基、水酸基、C1~C6アルキルチオ基、C1~C6アルキルスルフィニル基、C1~C6アルキルスルホニル基、C1~C6アルキルアミノ基、ジ(C1~C6)アルキルアミノ基、シアノ基又は(ハロゲン原子、C1~C6アルキル基又はC1~C6アルコキシ基が1~5個置換されていてもよい)フェノキシで置換されていてもよい]C1~C6アルキル基、(同一若しくは相異なる1~3個のハロゲン原子、C1~C6アルコキシ基、C2~C6アルケニル基、C2~C6アルキニル基、C1~C6アルコキシカルボニル基、C1~C6アルキルカルボニル基又はC3~C8シクロアルキル基で置換されていてもよい)C1~C6アルコキシ基、C3~C8シクロアルキルオキシ基或いはハロゲン原子を表す。}で示されるイソオキサゾリン誘導体及びその塩。
(20)上記(18)における一般式[I]で、
{式中、Qは基-S(O)n-(CR5R6)m-を表し、nは0~2の整数を表し、mは1を表し、R5及びR6は水素原子を表し、
R1及びR2はC1~C8アルキル基を表し、
R3及びR4は水素原子を表し、
Yは(1~5個の同一又は相異なるR7で置換された)フェニル基を表し、
R7は水素原子、(同一若しくは相異なる1~3個のハロゲン原子又はC1~C6アルコキシ基で置換されていてもよい)C1~C6アルキル基、(同一若しくは相異なる1~3個のハロゲン原子又はC1~C6アルコキシ基で置換されていてもよい)C1~C6アルコキシ基又はハロゲン原子を表す。}で示されるイソオキサゾリン誘導体及びその塩。
〔実施例1〕
本実施例では、コムギにおけるGSTのうちアクセッションコード:Q8GTC0として特定されるGST(本実施例ではTaQ8GTC0と称する)について、VLCFAE阻害型の除草剤に対するグルタチオン抱合活性を解析した。
図1にTaQ8GTC0タンパク質の大腸菌発現コンストラクトを構築する構成を示した。先ず、コムギ(農林61号)茎葉部から調製したRNAを鋳型として逆転写反応によりcDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型にしてTaQ8GTC0-H(配列番号3)及びTaQ8GTC0-D(配列番号4)のプライマーセットでPCRを行い、5’末端にNdeI認識部位、3’末端にBamHI認識部位を付加したTaQ8GTC0遺伝子の遺伝子断片を得た。
作製した大腸菌BL21(DE3)株(KLB-606)を用いてTaQ8GTC0タンパク質の発現を行った。シングルコロニーを50ppmアンピシリン含有LB液体培地に植菌した後、一晩試験管で振とう培養した溶液を前培養液として用いた。2.5mlの前培養液を250 mLの50ppmアンピシリン含有LB液体培地(1 L容三角フラスコ) に添加し、37℃、200rpmでOD600 = 0.5~0.6になるまで培養した。続いて、氷上で5分間冷却した後、IPTGを最終1mMとなるように添加し、27℃、200rpmで21時間TaQ8GTC0タンパク質の発現誘導を行った後、集菌 (4℃、6000×gで10分間遠心) し、菌体を-80℃で保存した。フリーズストックした菌体(0.5L培養分)に30 mL のPBSバッファー (0.14 M NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4, pH7.3)を加え、超音波処理 (TAITEC VP-30S、マイクロチップ、アウトプット 3、15秒コンスタント×7~8回) した後、4℃、15,000×gで20分間遠心して上清を得た。その粗酵素溶液をPBSバッファーで平衡化したGSTrap 4Bカラム (bed vol. 1 mL)に流速1 mL/minでロードし、20ml以上のPBSバッファーでグルタチオンアフィニティーカラムを洗浄した後、2 mLの溶出バッファー (50 mM Tris-HCl、10 mM 還元型グルタチオン、pH8.0) をカラムに注入し、TaQ8GTC0タンパク質を溶出させた(図2)。このタンパク溶液をNanosep (10 K)を用いた限外ろ過によりPBSバッファーに置換し、-80℃で保存した。なお、タンパク質の濃度測定はBradfordの方法で、TaKaRa Bradford Protein Assay Kit (Takara)のマニュアルに従い行った。なお、図2中、Mは分子量マーカーである。また、図2の結果において、粗酵素及び素通り画分のレーンには総タンパク質8.0μgをアプライした。なお、粗酵素は菌体を超音波処理後、遠心した上清であり、素通りは粗酵素液のアフィニティーカラムへのロード中に採取した溶液である。
本実施例で使用した全てのVLCFAE阻害型除草剤はアセトン溶液として反応系に添加した。VLCFAE阻害型除草剤に対する抱合反応は50μlの100mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.8)、10μlの1mM VLCFAE阻害型除草剤、20μlの10mM 還元型グルタチオン(pH 7.0)、6μlのTaQ8GTC0タンパク質(全378 ng、PBSバッファー溶液)、114μlのPBSバッファーを含む全200μlの系で行い、30℃で15分反応させた後、0.2μmのフィルターを用いて濾過した溶液50μlをHPLCにインジェクトした。以下にHPLC分析条件を示した。
装置:Agilent 1100 series
カラム:CAPCELL PAK C18 AQ 4.6mmI.D.×250mm (SHISEIDO)
移動相:アセトニトリル/ 水 = 5/95 (5min hold) → (4 min) → 40/60 (4min hold) → (4min) → 90/10 (8min hold)→(1min)→5/95(4min hold) (各溶媒0.5%酢酸を含む)
温度:35℃
流速:1.0 mL/min
検出:254 nm
TaQ8GTC0タンパク質のグルタチオン抱合活性試験に供試したVLCFAE阻害型除草剤を図3に示した。各VLCFAE阻害型除草剤に対するグルタチオン抱合活性を解析する際には、反応液中のVLCFAE阻害型除草剤の減少量からグルタチオン抱合体(GS抱合体)の生成量を求めた。各VLCFAE阻害型除草剤に対するTaQ8GTC0タンパク質のグルタチオン抱合活性を表1に示した。
b) 検出限界以下
なお、一例としてピロキサスルホンとグルタチオンとの抱合反応、及びVLCFAE阻害型除草剤としてピロキサスルホンを使用したときのHPLCチャートを図4に示した。なお、図4に示すHPLCチャートのうち上段はTaQ8GTC0タンパク質を含むグルタチオン抱合活性試験の結果、中段はTaQ8GTC0タンパク質を含まないグルタチオン抱合活性試験の結果、及び下段はTaQ8GTC0タンパク質及びグルタチオンを含まないグルタチオン抱合活性試験の結果を示している。
本実施例では、TaQ8GTC0遺伝子を導入した形質転換イネを作出し、当該形質転換イネにおけるVLCFAE阻害型除草剤に対する感受性を試験した。
本実施例では、図5に示すように、TaQ8GTC0遺伝子のイネ形質転換用ベクター(R-5-TaQ8GTC0)を作製した。
作製したイネ形質転換用ベクターKLB-650 (PalSelect R-5-TaQ8GTC0)をエレクトロポレーション法でアグロバクテリウム(EHA105)に導入した(KLB-654)。続いて、アグロバクテリウム法(S. Toki Plant Mol. Biol. Rep. 15 16-21(1997))によりTaQ8GTC0遺伝子をイネ培養細胞に導入した後、ビスピリバックナトリウム塩(BS)で選抜した。
18系統について、ゲランガムを培地とする発芽生育阻害試験によりピロキサスルホンに対する耐性を調べた。
TaQ8GTC0遺伝子導入イネの薬剤耐性の有無は、野生型イネとの感受性差を指標に判断することから、グルタチオン抱合活性試験に供試したVLCFAE阻害型除草剤に対する野生型イネ(日本晴)の感受性試験を以下の方法で行った。
TaQ8GTC0遺伝子導入イネのVLCFAE阻害型除草剤に対する耐性試験を上述したピロキサスルホン耐性試験と同様な方法で行った。本例では、表4に示すように、野生型イネ植物体(日本晴)の生育を完全に阻害する最小濃度(×1)、最小濃度の4倍濃度(×4)、最小濃度の16倍濃度(×16)の全3濃度でVLCFAE阻害型除草剤に対する耐性試験を行った。
本実施例では、TaQ8GTC0遺伝子を導入した形質転換シロイヌナズナを作出し、当該形質転換シロイヌナズナにおけるVLCFAE阻害型除草剤に対する感受性を試験した。
先ず、図8に示すように、TaQ8GTC0遺伝子を有するシロイヌナズナ形質転換用ベクター(A-3-TaQ8GTC0)を作製した。詳細には、pENTR-1A(Thermo Fisher Scientific Inc.)のattL1とattL2の間にTaQ8GTC0遺伝子(ORF)を挿入したエントリークローン(pENTR1A-TaQ8GTC0, KLB-649)とデスティネーションベクターであるPalSelect A-3((株)インプランタイノベーションズ)とのLR反応を行うことで、シロイヌナズナ形質転換用ベクターを作製した。このシロイヌナズナ形質転換用ベクターは、PalSelect A-3のattB配列間にTaQ8GTC0遺伝子を挿入したものである。次に、作製したシロイヌナズナ形質転換用ベクターを形質転換により大腸菌HST02株に導入した。その後、コロニーPCRにより目的プラスミドの導入を確認したコロニーからプラスミドを調製してシークエンス解析によりattB配列間に挿入したTaQ8GTC0遺伝子の塩基配列が正しいことを確認した(KLB-707)。
上述のように作製したシロイヌナズナ形質転換用ベクター(PalSelect A-3-TaQ8GTC0)をエレクトロポレーション法でアグロバクテリウム(EHA105)に導入した(KLB-718)。続いて、Floral dip法(S. J. CloughらPlant J. 16 735-743(1998))によりTaQ8GTC0遺伝子をシロイヌナズナに導入した後、ビスピリバックナトリウム塩(BS)で選抜した。
上述のように得られた形質転換シロイヌナズナ植物体からAmpdirect Plusサンプル溶解液(Shimadzu) [20mM Tris-HCl (pH8.0)、5mM EDTA、400mM NaCl、0.3% SDS、200μg/ml Proteinase K]を用いて簡易的にゲノムDNAを調製した。これらを鋳型とし、KAPA 3G DNA Polymerase (KAPA BIOSYSTEMS)を用いて以下の条件でPCRにより遺伝子導入を確認した。
TaQ8GTC0遺伝子導入シロイヌナズナのピロキサスルホン耐性を調べるため、以下のように培地を作製した。まず、Murashige-Skoog (MS) media(1袋)、Thiamin hydrochloride (3mg)、Nicotinic acid (5mg)、Pyridoxin hydrochloride (0.5mg)、Sucrose (10g) を1Lビーカーに加え、pHを5.7に調製して1Lにメスアップした後、8g(0.8%)のAgarを加えた。これをオートクレーブした後、室温まで冷やしてピロキサスルホン(アセトン溶液)を添加した。これを角2プレートに30ml分注し、所定濃度のピロキサスルホンを含むMS培地を準備した。
本例においても、野生型シロイヌナズナにおけるVLCFAE阻害型除草剤に対する感受性試験を、上述したTaQ8GTC0遺伝子導入シロイヌナズナのピロキサスルホン耐性試験と同様な手法で行った。
本実施例では、TaQ8GTC0遺伝子を導入した形質転換イネにおける高温ストレスに対する耐性を試験した。
本比較例では、実施例1~4においてイソキサゾリン誘導体に対する耐性及び高温ストレスに対する耐性に関与するTaQ8GTC0に高い相同性を有する他の植物GSTについて、ピロキサスルホン代謝活性を解析した。
先ず、図17に示すように、イネ形質転換用ベクターを作製した。本例では、イネ(日本晴)、コムギ(農林61号)およびトウモロコシ(パイオニア32K61)茎葉部から調製したRNAの逆転写反応によりcDNAをそれぞれ調製した。得られたcDNAを鋳型とし、PCRによって5’末端にXbaI、3’末端にAflIIの制限酵素サイトを付与した各GST遺伝子全長を増幅した。その後、それらの3’末端をAflII処理してT4DNAポリメラーゼにより平滑化し、5’末端をXbaI処理した。続いて、PalSelect R-4((株)インプランタイノベーションズ)のMCSの領域にCSP(イネカルス特異的プロモーター:Gene Locus Os10g0207500)::GUS::NOStのコンストラクトが導入されたKLB-224をSacI処理後、T4DNAポリメラーゼにより平滑化してXbaI処理し、ベクター断片とした。
OsGSTF5-1:5'-AAAAAATCTAGAAAAGTGCAGGGCAAATTC-3' (sense:配列番号9)
OsGSTF5-2:5'-AAAAAACTTAAGCTATGGTATGTTCCCACT-3' (antisense:配列番号10)
イネ由来のOsGSTU5に対して以下のプライマーセットを使用した。
OsGSTU5-1:5'-AAAAAATCTAGAATCTTCTTCTCCGACGAG-3' (sense:配列番号11)
OsGSTU5-2:5'-AAAAAACTTAAGCTACTTGGCGCCAAACTT-3' (antisense:配列番号12)
コムギ由来のTaQ8GTB9に対して以下のプライマーセットを使用した。
TaQ8GTB9(GSTF4)-1:5'-AAAAAATCTAGAATGGAGCCTATGAAGGTG-3' (sense:配列番号13)
TaQ8GTB9(GSTF4)-2:5'-AAAAAACTTAAGTCATGGTATTCTCCCGCT-3' (antisense:配列番号14)
トウモロコシ由来のZmB6T8R4に対して以下のプライマーセットを使用した。
ZmB6T8R4(Corn)-3:5'-AAAAAATCTAGATCGTTTCGAGGCCGAT-3' (sense:配列番号15)
ZmB6T8R4(Corn)-2:5'-AAAAAACTTAAGTCACTTGGCCCCGAACTT-3' (antisense:配列番号16)
ZmQ9ZP61(GST6)-3:5'-AAAAAATCTAGATACCAGCCACGTCGCTT-3' (sense:配列番号17)
ZmQ9ZP61(GST6)-2:5'-AAAAAACTTAAGTCACTTGGCCCCGAACTT-3' (antisense:配列番号18)
M16901(GSTI)-3:5'-AAAAAATCTAGAGTTGGGTCTGGGACAC-3' (sense:配列番号19)
M16901(GSTI)-2:5'-AAAAAACTTAAGTCAAGCAGATGGCTTCAT-3' (antisense:配列番号20)
トウモロコシ由来のZmY12862に対して以下のプライマーセットを使用した。
ZmY12862(GST5)-1:5'-AAAAAATCTAGAATGGCCGAGGAGAAGAAG-3' (sense:配列番号21)
ZmY12862(GST5)-2:5'-AAAAAACTTAAGCTACTCGATGCCCAGCCT-3' (antisense:配列番号22)
上述のように作製した各種GST遺伝子を有するイネ形質転換用ベクター(PalSelect R-4-GST)をエレクトロポレーション法でアグロバクテリウム(EHA105)に導入した。続いて、アグロバクテリウム法(S. Toki Plant Mol. Biol. Rep. 15 16-21(1997))によりGST遺伝子をイネ培養細胞に導入した後、ビスピリバックナトリウム塩(BS)で選抜した。
上述のように作製したイネ形質転換培養細胞をピロキサスルホンの存在下に液体培養した。ピロキサスルホンはアセトン溶液として液体培地に添加した。最終アセトン濃度は0.1%とした。液体培養する際には、KLB-279(PalSelect R-4のMCS部分にAct1p(イネアクチン1プロモーター)::sGFP::NOStを組み込んだプラスミド)で形質転換したイネ培養細胞をControlとした。以下の方法で液体培養を行った。
脂肪酸の抽出はウンデセン酸(C11:1)を内部標準物質として行った。分析標準品として、C14:0、C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C20:0、C22:0、C22:1、C24:0を含むSupelco社のFAME mix及びその他の脂肪酸メチルエステル(C11:1, C15:0, C20:1, C26:0)を用い、各々の検量線を作成して定量した。各脂肪酸メチルエステルの同定はガスクロマトグラフィー(GC)の保持時間とマススペクトルから判断した。なお、定量及び定性はメチルエステル体で行ったが、定量する際には分子量を基に脂肪酸量に換算した。
Apparatus: Agilent 6890 Series GC System
Column: Supelco, Omegawax250 (30m long, 0.25mm I.d., film thickness 0.25μm)
Injection Temp: 250℃
Initial Temp: 100℃
Initial Time: 5min
Rate: 4℃/min
Final Temp: 220℃
Final Time: 25 min
Detector: FID
Detector Temp: 250℃
次に、図21に示すように、トウモロコシGST遺伝子を有するイネ形質転換用ベクターを作製した。なお、本例では、2種類のトウモロコシGST遺伝子(ZmQ9FQD1及びZmB8A3K0)についてそれぞれイネ形質転換用ベクターを作製したが、作製プロトコールは同一であるため、以下、ZmQ9FQD1遺伝子についてイネ形質転換用ベクターの作製手順を記載する。
ZmB8A3K0-X:5'-AAAAAAGTCGACATGGCGGCGGCGGCGGAG-3' (sense:配列番号23)
ZmB8A3K0-Y:5'-AAAAAAGCGGCCGCTCACTTGGCCCCGAACTTG-3' (antisense:配列番号24)
ZmQ9FQD1-X:5'-AAAAAAGTCGACATGGCGCCGCCGATGAAG-3' (sense:配列番号25)
ZmQ9FQD1-Y:5'-AAAAAAGCGGCCGCCTATGGTATGTTCCCGCTG-3' (antisense:配列番号26)
上述のように作製した2種類のトウモロコシ由来GST遺伝子に関する、イネ形質転換用ベクター(PalSelect R-5-ZmGST)をエレクトロポレーション法でアグロバクテリウム(EHA105)に導入した。続いて、アグロバクテリウム法(S. Toki Plant Mol. Biol. Rep. 15 16-21(1997))によりTaQ8GTC0遺伝子をイネ培養細胞に導入した後、ビスピリバックナトリウム塩(BS)で選抜した。
上述のようにして得られた2系統のトウモロコシGST遺伝子導入イネ培養細胞及びKLB-279形質転換イネ培養細胞(比較対照)をN6D培地に置床して2週間後、各イネ培養細胞の増殖を指標にしてピロキサスルホンに対する耐性を調べた。ピロキサスルホンはアセトン溶液として供試し、培地に添加する際の最終アセトン濃度は1%、薬剤の最終濃度は10-4Mとした。
本比較例では、TaQ8GTC0に最もアミノ酸の相同性が高いコムギGST(TaQ8GTC1)(品種:Hunter、Accession No.:AJ440791、相同性は78%)について、グルタチオン抱合活性の解析を行った。
本比較例では、ゆめかおり、ハナマンテン、ユメセイキ、農林61号、Apache及びGatalinaの6品種のコムギを用いた。これら6品種のコムギのそれぞれについて、茎葉部から調製したRNAの逆転写反応により合成したcDNAを鋳型とし、PCRによって5’末端にXbaI認識部位、3’末端にEcoRI認識部位を付加したTaQ8GTC1遺伝子のORFを得た。その遺伝子断片をXbaI及びEcoRI処理したTaQ8GTC1遺伝子をインサートとし、同制限酵素処理したpBI121をベクターとした。それらのインサート及びベクターを用いてライゲーションを行い、その反応液を用いて作製したベクターを形質転換により大腸菌JM109株に導入した。その後、コロニーPCRにより目的プラスミドの導入を確認したコロニーからプラスミドを調製した。引き続き、シークエンス反応を行ってベクターに挿入した目的遺伝子の塩基配列を解析した。
TaQ8GTC1-3:5'-AAAAAATCTAGAGATCTTCAAGAAGCGGAA-3' (sense:配列番号27)
TaQ8GTC1-4:5'-AAAAAAGAATTCTCACTTCTCTGCCTTCTTTCCGA-3'(antisense:配列番号28)
以下に、シークエンス解析で用いたプライマーセットを示した。
Sequence (TaQ8GTC1)-2:5'-GACCTCACCATCTTCGAGTC-3' (sense:配列番号29)
Sequence (TaQ8GTC1)-3:5'-CTCGTACACGTCGAACAG-3' (antisense:配列番号30)
上記6品種から得られたTaQ8GTC1遺伝子は、全て同一の塩基配列であったが、データベースに登録された配列とは異なっていた。具体的に、本実験で決定した塩基配列とデータベースに登録されている塩基配列とは、ORFを構成する675bpの内、25塩基が異なっていた。そのうち13箇所がアミノ酸変異を伴う相違であった。以下、本実験で決定した塩基配列の遺伝子をTAQ8GTC1-R遺伝子と記載する。
コムギ(農林61号)茎葉部から調製したRNAの逆転写反応により合成したcDNAを鋳型にして、TaQ8GTC1-Z及びTaQ8GTC1-4のプライマーセット(下記参照)でPCRを行い、5’末端にNdeI認識部位、3’末端にEcoRI認識部位を付加したTaQ8GTC1-R遺伝子のORFを得た。本断片をNdeI及びEcoRI処理したTaQ8GTC1-R遺伝子をインサートとし、同制限酵素処理したpET22b(+)をベクターとした。それらのインサート及びベクターを用いてライゲーションを行い、その反応液を用いて作製したベクターを形質転換により大腸菌JM109株に導入した。
TaQ8GTC1-Z:5'-AAAAAACATATGGCGGCGCCGGCGGTGAAGGTG-3' (sense:配列番号35)
TaQ8GTC1-4:5'-AAAAAAGAATTCTCACTTCTCTGCCTTCTTTCCGA-3'(antisense:配列番号36)
作製した大腸菌BL21(DE3)株(KLB-862)を用いてTaQ8GTC1-Rタンパク質の発現を行った。シングルコロニーを50ppmのアンピシリンを含む液体LB培地に植菌した後、一晩試験管で振とう培養した溶液を前培養液として用いた。2.5mlの前培養液を50ppmのアンピシリンを含む250mLの液体LB培地(1L容三角フラスコ) に添加し、37℃、200rpmでOD600=0.5~0.6になるまで培養した。続いて、氷上で5分間冷却した後、IPTGを最終1mMとなるように添加し、27℃、200rpmで21時間 TaQ8GTC1-Rタンパク質の発現誘導を行い、集菌 (4oC、6000×gで10分間遠心) して菌体を-80oCで保存した。フリーズストックした菌体(0.5L培養分)に30mLのPBSバッファー (0.14M NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、pH7.3)を加え、超音波処理 (TAITEC VP-30S、マイクロチップ、アウトプット 3、15秒コンスタント×7~8回) した後、4℃、15,000×gで20分間遠心して上清を得た。その粗酵素溶液をPBSバッファーで平衡化したGSTrap FFカラム及びGSTrap 4Bカラム (共にbed vol. 1mL)に流速1mL/minでロードし、20ml以上のPBSバッファーで両グルタチオンアフィニティーカラムを洗浄した後、2mLの溶出バッファー (50mM Tris-HCl、10mM 還元型グルタチオン、pH8.0) をカラムに注入し、TaQ8GTC1-Rタンパク質を溶出させた(図28)。このタンパク溶液をNanosep (10K)を用いた限外ろ過によりPBSバッファーに置換し、-80℃で保存した。なお、タンパク質の濃度測定はBradfordの方法で、TaKaRa Bradford Protein Assay Kit (Takara)のマニュアルに従い行った。
本実験では、精製したTaQ8GTC1-Rタンパク質のCDNB(2,4-dinitrochlorobenzene)及びピロキサスルホンに対するグルタチオン抱合反応を解析した。
装置:Agilent 1100 series
カラム:CAPCELL PAK C18 AQ 4.6mmI.D.×250mm (SHISEIDO)
移動相:アセトニトリル/水=5/95 (5min hold)→(4 min)→40/60 (4min hold)→(4min)→90/10 (8min hold)→(1min)→5/95(4min hold) (各溶媒0.5%酢酸を含む)
温度:35℃
流速:1.0mL/min
検出:254nm
<結果と考察>
先ず、本実験で精製したTaQ8GTC1-Rタンパク質がGST活性を有しているかを調べるため、標準基質のCDNB (1-chloro-2,4-dinitrobenzene)に対するグルタチオン抱合活性を調べた。その結果、CDNBに対する活性は2.17μmol/min/mg protein (n=2)となり、精製酵素はGST活性を有していることが明らかとなった。
本比較例では、比較例2でクローニングしたTaQ8GTC1-R遺伝子を導入した組換えイネの作出及び当該組換えイネに関する薬剤耐性の解析を行った。
コムギ(農林61号)茎葉部から調製したRNAの逆転写反応により合成したcDNAを鋳型にしてTaQ8GTC1-X、TaQ8GTC1-YのプライマーセットでPCRを行い、TaQ8GTC1-R遺伝子(ORF)を得た。本断片の5’末端をSalI処理、3’末端をNotI処理したTaQ8GTC1-R遺伝子断片をインサートとし、同制限酵素処理したpENTR-1Aをベクターとした。それらのインサート及びベクターを用いてライゲーションを行い、作製したエントリークローン(pENTR1A-TaQ8GTC1-R)を形質転換により大腸菌JM109株に導入した。その後、コロニーPCRにより目的プラスミドの導入を確認したコロニーからプラスミドを調製してシークエンス解析によりSalI及びNotI切断サイトの間に挿入したTaQ8GTC1-R遺伝子の塩基配列が正しいことを確認した。
TaQ8GTC1-X:5'-AAAAAAGTCGACATGGCGGCGCCGGCGGTGAAGG-3' (sense:配列番号44)
TaQ8GTC1-Y:5'-AAAAAAGCGGCCGCTCACTTCTCTGCCTTCTT-3' (antisense:配列番号45)
作製したTaQ8GTC1-R遺伝子をPalSelect R-5に挿入したイネ形質転換用ベクター(PalSelect R-5-TaQ8GTC1-R)をエレクトロポレーション法でアグロバクテリウム(EHA105)に導入した(KLB-872)。続いて、アグロバクテリウム法によりTaQ8GTC1-R遺伝子をイネ培養細胞に導入した後、ビスピリバックナトリウム塩(BS)で選抜した。
2系統(KLB-872#3-11及びKLB-872#2-4)について、ゲランガムを培地とする発芽生育阻害試験によりピロキサスルホンに対する耐性を調べた。先ず、ホグラントmixと3gのゲランガムを1Lの蒸留水に懸濁させた後、電子レンジで温め十分に溶解させた。その15mlを冷めないうちに管ビンに注入した(プレートには30mlを注入)。薬剤を練り込む際には、管ビンあるいはプレートへの注入時に同時添加してよく混ぜた。イネもみを50倍希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液(アンチホルミン)(Wako)中で20分ほど浸した後、よく水洗いした。滅菌処理した種子を蒸留水中に浸し、27℃で催芽するまで静置した(約2日間)。催芽種子を芽の方を上にして、0.25μMのBSを含むゲランガム培地(プレート)に軽く埋め込んだ。これらと蒸留水を入れたビーカーを一緒に透明なケースに入れ、ラップで蓋をして27℃、蛍光灯照明下 (明期14時間、暗期10時間) で2日間生育させた。その後、根部の伸長を指標にBS耐性を有していると判断されたイネ種子をピロキサスルホン(最終濃度10-8、10-7、10-6、10-5)含有ゲランガム培地(管ビン)に移植した。続いて、これらと蒸留水を入れたビーカーを一緒に透明なケースに入れ、ラップで蓋をして27℃、蛍光灯照明下 (明期14時間、暗期10時間) で4~5日間生育させた後に草丈を測定した。薬剤の阻害は草丈を指標に薬剤無添加区に対する生育阻害率を算出し、生育阻害50%濃度(I50値)はProbit法により求めた。
上述したTaQ8GTC1-R遺伝子導入イネ(KLB-872#3-11及びKLB-872#2-4)のピロキサスルホンに対する耐性試験の結果を図33に示した。試験に供試した2系統共にピロキサスルホン感受性は野生型と同等であった。この結果から、TaQ8GTC1-R遺伝子導入イネはピロキサスルホンに耐性を示さないことが推察された。
本実施例では、実施例1~3においてピロキサスルホンに対する抱合活性を有することが示されたTaQ8GTC0遺伝子を導入した形質転換セイヨウアブラナ(Brassica napus)を作出し、当該形質転換セイヨウアブラナにおけるピロキサスルホンに対する感受性を試験した。
コムギ(農林61号)茎葉部から調製したRNAの逆転写反応により合成したcDNAを鋳型にしてTaQ8GTC0-IF-Blunt End(XbaI)、TaQ8GTC0-IF-Blunt End(SacI)のプライマーセットでPCRを行い、TaQ8GTC0遺伝子のORFを得た。本遺伝子断片とXbaI及びSacI処理した後に、T4 DNA Polymeraseで平滑化したpBI121を用いてIn-Fusion反応を行い、作成したセイヨウアブラナ形質転換用プラスミド(TaQ8GTC0 in pBI121)を形質転換により大腸菌JM109株に導入した。その後、コロニーPCRにより目的プラスミドの導入を確認したコロニーからプラスミドを調製してシークエンス解析によりXbaI及びSacI切断サイトの間に挿入したTaQ8GTC0遺伝子の塩基配列が正しいことを確認した。以下にPCRで用いたプライマーを記載した。
TaQ8GTC0-IF-Blunt End(XbaI):
5'-CACGGGGGACTCTAGATGGCGCCGGCGGTGAAGGT-3' (sense:配列番号46)
TaQ8GTC0-IF-Blunt End(SacI):
5'-GATCGGGGAAATTCGCTACTCTGCTTTCTTTCCAA-3' (antisense:配列番号47)
作製したTaQ8GTC0遺伝子をpBI121に挿入したセイヨウアブラナ形質転換用ベクター(pBI121-TaQ8GTC0)をエレクトロポレーション法でアグロバクテリウム(GV3101)に導入した(KLB-858)。続いて、アグロバクテリウム法によりTaQ8GTC0遺伝子をセイヨウアブラナに導入した後、カナマイシンで選抜した。
DNeasy Plant Mini Kitを用いて組換えセイヨウアブラナのゲノムDNAを調製した。その後、本ゲノムDNAを鋳型としたPCRにより目的コンストラクトの導入を確認した。PCRは全25μlの反応系(2μlの鋳型、0.25μlの50μMセンスプライマー、0.25μlの50μMアンチセンスプライマー、2.5μlの2mM dNTP mixture、5μlのPhire Reaction Buffer、0.5μlのPhire Hot Start DNA Polymerase、14.5μlの滅菌水)で行った。PCRは初期denature:98℃で20sec、denature:98℃で20sec、annealing:58℃で15sec、elongation:72℃で30sec (40cycles)、最終elongation:72で4minで行った。また、T-DNA領域の導入を確認する際に使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
NOSP-2:5'-CGCCTAAGGTCACTATCAGCTAGC-3' (antisense:配列番号48)
Linker (pBI121)-2:5'-GAACTCCAGCATGAGATC-3' (antisense:配列番号49)
CAM35S-1:5'-AGAGGACCTAACAGAACTCGCC-3' (sense:配列番号50)
TaQ8GTC0-2:5'-AAAAAACTTAAGCTACTCTGCTTTCTTTCC-3' (antisense:配列番号51)
〔セイヨウアブラナ感受性試験1(播種後出芽前土壌処理)〕
セイヨウアブラナ感受性試験1には、野生型セイヨウアブラナ(品種:Westar)及びコムギGST遺伝子導入セイヨウアブラナを供試し、試験規模は角白プラスチックポット(長さ8cm、幅8cm、高さ6cm)、供試土壌はフジノ土(砂壌土)、1ポットにつき野生型セイヨウアブラナ種子を4粒、組換えセイヨウアブラナ種子8粒を播種した(播種深度1cm)。薬剤として、50%のピロキサスルホンを含む顆粒水和剤を供試し、1、4、16、63、250 g a.i./haの5薬量で3反復とした。処理直後に降雨装置にて約1mmの降雨を人工的に行った後、ポット下方より水を給水させた。その後はポット表面が乾燥した時点で適宜ポット下方より給水させた。
ピロキサスルホンの発芽前土壌処理試験(温度22℃、蛍光灯)を行い、草丈と作用症状及び子葉の生育の観点からコムギGST組換えセイヨウアブラナのピロキサスルホン耐性の有無を解析した。具体的には、セイヨウアブラナ種子の播種及び薬剤散布の2週間後に各処理区で生育した植物体の草丈を測定し、セイヨウアブラナ生育に対する阻害率を算出した(n=4~12)。試験結果を図37~図39に示した。図37~図39において「TaGST」はTaQ8GTC0遺伝子組換えセイヨウアブラナを意味する。図38に示した表の数値は平均±標準偏差(n=4~12)を意味する。
上述した播種後発芽前土壌処理試験の結果から、TaG8QGTC0遺伝子導入セイヨウアブラナがピロキサスルホンに耐性を示すことが明らかとなった。そこで、このTaG8QGTC0遺伝子導入セイヨウアブラナが何倍程度の耐性を有しているかを調べるため、薬剤の影響を直接的に解析できる寒天培地でのセイヨウアブラナ生育阻害試験を行った。野生型セイヨウアブラナ(品種:Westar)及びTaQ8GTC0遺伝子導入セイヨウアブラナを供試して寒天培地での生育阻害試験を行い、ピロキサスルホンに対する耐性を調べた。
複数濃度(0.1μM、1μM、10μM、100μM)のピロキサスルホンを含む寒天培地でセイヨウアブラナの感受性試験を行った。試験結果を図40~図43に示した。図40は野生型セイヨウアブラナを用いた結果であり、表に示す数値は平均±標準偏差(n=4~5)である。図41~43はTaG8QGTC0遺伝子導入セイヨウアブラナ(図中TaGSTと記載)を用いた結果である。図41及び42の表に示す数値は均±標準偏差(n=4~5)である。図43に示す数値は平均値(n=4~5)である。
本実施例では、TaQ8GTC0遺伝子を導入した形質転換シロイヌナズナ(実施例3参照)における高温ストレスに対する耐性を試験した。
実施例3で作出したTaQ8GTC0遺伝子を導入した形質転換シロイヌナズナにおける高温耐性を調べるための培地は以下のように作製した。先ず、Murashige-Skoog (MS) media(1袋)、Thiamin hydrochloride (3mg)、Nicotinic acid (5mg)、Pyridoxin hydrochloride (0.5mg)、Sucrose (10g) を1Lビーカーに加え、pHを5.7に調製して1Lにメスアップした後、8g(0.8%)のAgarを加えた。これをオートクレーブした後、室温まで冷やし、これをプレートに30ml分注した。
野生型シロイヌナズナ(Columbia-0)を比較対照として高温ストレス処理した後、植物体の表現型を指標にしてTaQ8GTC0遺伝子導入シロイヌナズナの高温耐性の有無を調べた。試験には、野生型及び3系統の組換えシロイヌナズナ(1-1-3、1-1-5、1-2-12)を供試した。その結果、高温処理により白化(完全枯死)した植物体の割合は野生型では74%(26/35)であるのに対して、TaQ8GTC0遺伝子導入組換え体では1-1-3、1-1-5、1-2-12の順に0%(0/11)、24%(8/34)、26%(10/38)となった(括弧内は白化した個体数/試験に供試した個体数)。これらの結果から、TaQ8GTC0遺伝子導入導入シロイヌナズナは野生型に比べて高温処理により受ける影響が小さく、作出したTaQ8GTC0遺伝子導入シロイヌナズナは高温ストレス耐性を有していることが明らかとなった。従って、実施例4に示したようにTaQ8GTC0遺伝子導入イネが高温耐性を有していることを踏まえると、TaQ8GTC0遺伝子は単子葉から双子葉まで幅広い植物で機能し、除草剤耐性だけでなく高温ストレス耐性も付与することが示された。
本実施例では、実施例5で作出したTaQ8GTC0遺伝子を導入した形質転換セイヨウアブラナ(Brassica napus)について、高温耐性の有無を試験した。
実施例5で作出したTaQ8GTC0遺伝子を導入した形質転換セイヨウアブラナの高温耐性を調べるための培地は以下のように作製した。先ず、Murashige-Skoog (MS) media(1袋)、Thiamin hydrochloride (3mg)、Nicotinic acid (5mg)、Pyridoxin hydrochloride (0.5mg)、Sucrose (10g) を1Lビーカーに加え、pHを5.7に調製して1Lにメスアップした後、8g(0.8%)のAgarを加えた。これをオートクレーブした後、室温まで冷やし、これをプラントボックスに70ml分注した。
野生型セイヨウアブラナ(Westar)を比較対照として高温ストレス処理した後、TaQ8GTC0遺伝子導入セイヨウアブラナの高温耐性の有無を調べた。その結果、試験1(50℃で1時間処理)では、TaQ8GTC0遺伝子導入セイヨウアブラナの草丈が野生型に比べて有意に大きかった(図44)。なお、図44に示した表の値は、平均±標準偏差(n=3~7)を示している。また、試験2(50℃で2時間半処理)では、白化(完全枯死)した個体の割合は野生型セイヨウアブラナ、TaQ8GTC0遺伝子導入セイヨウアブラナの順に75%(3/4)、20%(1/5)となり、TaQ8GTC0遺伝子導入セイヨウアブラナの白化する割合は野生型セイヨウアブラナに比べて有意に小さかった(括弧内は白化した個体数/試験に供試した個体数)。これらの結果から、2つの試験でそれぞれ草丈、白化した個体の割合を指標にすると、TaQ8GTC0遺伝子導入セイヨウアブラナは野生型セイヨウアブラナに比べて高温処理により受ける影響が小さく、実施例5で作出したTaQ8GTC0遺伝子導入セイヨウアブラナは高温ストレス耐性を有していることが明らかとなった。従って、コムギ由来のTaQ8GTC0遺伝子はセイヨウアブラナでも機能し、除草剤耐性だけでなく高温ストレス耐性も付与することが示された。
Claims (27)
- 以下(a)又は(b)のタンパク質をコードする核酸を導入した形質転換植物をイソキサゾリン誘導体の存在下に栽培することを特徴とする形質転換植物の栽培方法。
(a)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質 - 上記イソキサゾリン誘導体はピロキサスルホン及び/又はフェノキサスルホンであることを特徴とする請求項1記載の栽培方法。
- 上記形質転換植物は、上記イソキサゾリン誘導体に対して感受性を有する植物由来であることを特徴とする請求項1記載の栽培方法。
- 上記イソキサゾリン誘導体に対して感受性を有する植物は、イネ科植物であることを特徴とする請求項3記載の栽培方法。
- 上記イネ科植物はイネであることを特徴とする請求項4記載の栽培方法。
- 上記イソキサゾリン誘導体に対して感受性を有する植物は、アブラナ科、マメ科、セリ科、ヒユ科、シソ科、アカザ科、バラ科、キク科、ナス科又はアオイ科植物であることを特徴とする請求項3記載の栽培方法。
- 上記アブラナ科植物はセイヨウアブラナ(Brassica napus)又はシロイヌナズナであることを特徴とする請求項6記載の栽培方法。
- イソキサゾリン誘導体に対して感受性を有する植物に対して、以下(a)又は(b)のタンパク質をコードする核酸を導入することを特徴とするイソキサゾリン誘導体に対する耐性付与方法。
(a)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質 - 上記イソキサゾリン誘導体はピロキサスルホン及び/又はフェノキサスルホンであることを特徴とする請求項8記載の耐性付与方法。
- 上記イソキサゾリン誘導体に対して感受性を有する植物は、イネ科植物であることを特徴とする請求項8記載の耐性付与方法。
- 上記イネ科植物はイネであることを特徴とする請求項10記載の耐性付与方法。
- 上記イソキサゾリン誘導体に対して感受性を有する植物は、アブラナ科、マメ科、セリ科、ヒユ科、シソ科、アカザ科、バラ科、キク科、ナス科又はアオイ科植物であることを特徴とする請求項8記載の耐性付与方法。
- 上記アブラナ科植物はセイヨウアブラナ(Brassica napus)又はシロイヌナズナであることを特徴とする請求項12記載の耐性付与方法。
- 植物に対して、以下(a)又は(b)のタンパク質をコードする核酸を導入することを特徴とする高温ストレスに対する耐性付与方法。
(a)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質 - 上記植物は、イソキサゾリン誘導体に対して感受性を有する植物であることを特徴とする請求項14記載の耐性付与方法。
- 上記イソキサゾリン誘導体はピロキサスルホン及び/又はフェノキサスルホンであることを特徴とする請求項15記載の耐性付与方法。
- 上記植物は、イネ科植物であることを特徴とする請求項14記載の耐性付与方法。
- 上記イネ科植物はイネであることを特徴とする請求項17記載の耐性付与方法。
- 上記植物は、アブラナ科、マメ科、セリ科、ヒユ科、シソ科、アカザ科、バラ科、キク科、ナス科又はアオイ科植物であることを特徴とする請求項14記載の耐性付与方法。
- 上記アブラナ科植物はセイヨウアブラナ(Brassica napus)又はシロイヌナズナであることを特徴とする請求項19記載の耐性付与方法。
- 以下(a)又は(b)のタンパク質をコードする核酸を導入した、イソキサゾリン誘導体に対する耐性及び/又は高温ストレスに対する耐性を有する形質転換植物。
(a)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質 - イソキサゾリン誘導体に対して感受性を有する植物に対して上記核酸を導入したものであることを特徴とする請求項21記載の形質転換植物。
- 上記イソキサゾリン誘導体はピロキサスルホン及び/又はフェノキサスルホンであることを特徴とする請求項21又は22記載の形質転換植物。
- 上記イソキサゾリン誘導体に対して感受性を有する植物は、イネ科植物であることを特徴とする請求項22記載の形質転換植物。
- 上記イネ科植物はイネであることを特徴とする請求項24記載の形質転換植物。
- 上記イソキサゾリン誘導体に対して感受性を有する植物は、アブラナ科、マメ科、セリ科、ヒユ科、シソ科、アカザ科、バラ科、キク科、ナス科又はアオイ科植物であることを特徴とする請求項22記載の形質転換植物。
- 上記アブラナ科植物はセイヨウアブラナ(Brassica napus)又はシロイヌナズナであることを特徴とする請求項26記載の形質転換植物。
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