以下，對本發明加以詳細說明。[本發明之麩胱甘肽-S-轉移酶]本發明之麩胱甘肽-S-轉移酶(以下有時簡稱為GST)可規定為以下之(a)或(b)之蛋白質。(a)包含序列編號2之胺基酸序列之蛋白質(b)具有相對於序列編號2之胺基酸序列具有80%以上之同一性之胺基酸序列，且具有麩胱甘肽-S-轉移酶活性之蛋白質此處，包含序列編號2之胺基酸序列的蛋白質亦被稱為源自小麥(Triticum aestivum)之GST中之GST F3，其係特定為寄存編碼：Q8GTC0者。又，序列編號2之胺基酸序列係與CDS序列(序列編號1)一併被特定為寄存編號：AJ440792_1。但是，能夠於本發明中使用之GST並不限定於包含序列編號2之胺基酸序列的蛋白質，亦可為如上述(b)所記載般，具有相對於序列編號2之胺基酸序列具有80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上、進而較佳為95%以上、最佳為97%以上之同一性的胺基酸序列，且具有麩胱甘肽-S-轉移酶活性之蛋白質。再者，胺基酸序列間之同一性之值可藉由裝有BLAST演算法之BLASTN或BLASTX程式而算出(缺省設定)。再者，同一性之值係算出對一對胺基酸序列進行配對-比對分析時完全一致之胺基酸殘基，算出其於進行比較之所有胺基酸殘基中之比例。又，能夠於本發明中使用之GST並不限定於包含序列編號2之胺基酸序列的蛋白質，亦可為具有相對於序列編號2之胺基酸序列而置換、缺失、插入或附加有1或數個胺基酸之胺基酸序列，且具有麩胱甘肽-S-轉移酶活性之蛋白質。此處，所謂數個例如為2～30個、較佳為2～20個、更佳為2～15個、進而較佳為2～10個、進而較佳為2～5個。進而，能夠於本發明中使用之GST亦可為由如下DNA所編碼，且具有麩胱甘肽-S-轉移酶活性之蛋白質，該DNA係於嚴格條件下與包含序列編號1之鹼基序列之DNA之互補鏈之全部或一部分進行雜交而成。所謂「嚴格條件」係表示形成所謂特異性雜種，且未形成非特異性雜種之條件，例如可參照細胞選殖實驗室手冊(第三版)(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Third Edition))而適當確定。具體而言，可藉由南方雜交時之溫度或溶液中所含之鹽濃度、及南方雜交之洗淨步驟時之溫度或溶液中所含之鹽濃度而設定嚴格度。更詳細而言，作為嚴格條件，例如為鈉濃度為25～500 mM、較佳為25～300 mM，溫度為42～68℃、較佳為42～65℃。更具體而言為5×SSC(83 mM之NaCl、83 mM之檸檬酸鈉)、溫度42℃。尤其是，能夠於本發明中使用之GST具有下文所詳述之對於異㗁唑啉衍生物之麩胱甘肽結合活性。即，能夠於本發明中使用之GST具有使異㗁唑啉衍生物與麩胱甘肽結合之活性。更詳細而言，能夠於本發明中使用之GST若於植物內表現，則能夠促進對於異㗁唑啉衍生物之麩胱甘肽結合，而減低因異㗁唑啉衍生物引起之超長鏈脂肪酸延長酶抑制。因此，能夠於本發明中使用之GST若於植物內表現，則可對該植物賦予異㗁唑啉衍生物耐受性。即，上述之麩胱甘肽-S-轉移酶活性可換稱為對於異㗁唑啉衍生物之麩胱甘肽結合活性、或對異㗁唑啉衍生物結合麩胱甘肽之活性。又，如上所述，即便為包含與序列編號2之胺基酸序列不同之胺基酸序列的蛋白質，能夠於本發明中使用之GST亦可稱為除了上述之麩胱甘肽-S-轉移酶活性以外，具有減低因異㗁唑啉衍生物引起之超長鏈脂肪酸延長酶抑制之作用的GST、進而對植物賦予異㗁唑啉衍生物耐受性之GST。[轉形植物]本發明之轉形植物係對特定植物(植物體、植物細胞)導入有能夠表現編碼上述GST之基因者。本發明之轉形植物藉由表現編碼上述GST之基因而獲得下文所詳述之對於異㗁唑啉衍生物之耐受性及對於環境壓力之耐受性。此處，所謂獲得對於異㗁唑啉衍生物之耐受性係表示與導入上述GST之前之植物的對於異㗁唑啉衍生物之感受性相比，導入上述GST之後之植物的對於異㗁唑啉衍生物之感受性於統計學上有意義地降低。換言之，所謂獲得對於異㗁唑啉衍生物之耐受性係表示對於導入上述GST之後之植物的因異㗁唑啉衍生物引起之抑制效果，與導入該GST之前之植物的同一抑制效果相比，於統計學上有意義地變低。再者，作為因異㗁唑啉衍生物引起之抑制效果可使用所謂50%抑制濃度等指標而進行評價。又，所謂獲得環境壓力耐受性係表示與導入上述GST之前之植物的對於環境壓力之感受性相比，導入上述GST之後之植物的對於同一環境壓力之感受性於統計學上有意義地降低。換言之，所謂獲得環境壓力耐受性係表示於負擔特定之環境壓力之條件下栽培導入上述GST之後之植物及導入同一GST之前之植物時，導入GST之後之植物之生長速度於統計學上有意義地較快。再者，植物之生長速度例如可使用作物高度之長度、根重量等指標而進行評價。此處，作為環境壓力，並無特別限定，可列舉：高溫壓力、高鹽濃度壓力、乾燥壓力及低溫壓力。該等各種環境壓力中，本發明之轉形植物尤其是對於高溫壓力之耐受性優異。此處，導入上述GST之對象植物並無特別限定，可為任意植物。即便為任意植物，亦可藉由導入上述GST而獲得高溫壓力耐受性等環境壓力耐受性。尤其是作為導入上述GST之對象植物，較佳為設為下文所詳述之具有對於異㗁唑啉衍生物之感受性的植物。藉由對具有對於異㗁唑啉衍生物之感受性的植物導入上述GST，該植物可獲得對於異㗁唑啉衍生物之耐受性。此處，所謂具有對於異㗁唑啉衍生物之感受性的植物意指於使用異㗁唑啉衍生物作為除草劑時之最佳濃度範圍內生長得到抑制之植物。例如，可設為於作為異㗁唑啉衍生物之派羅克殺草碸相關之50%抑制濃度為200 nM以下、較佳為100 nM以下、更佳為50 nM以下之情形時，對於派羅克殺草碸具有感受性之植物。更具體而言，作為對異㗁唑啉衍生物具有感受性之植物，並無特別限定，可列舉：稻、大麥、高粱、燕麥、杜蘭小麥、玉米等禾本科植物；油菜(Brassica rapa)、西洋油菜(Brassica napus)、捲心菜、芥花、羽衣甘藍、白芥、蕪菁、阿拉伯芥等十字花科植物；紫苜蓿、四季豆、大豆、紅豆、綠豆、白三葉等豆科植物；蒔蘿、茴香、洋芹等香芹科植物；菠菜、甜菜等莧科植物；羅勒等唇形科植物；菾菜等藜科植物；西洋李等薔薇科植物；萵苣等菊科植物；番茄等茄科植物；棉花等錦葵科植物。藉由對該等具體地例示列舉之植物導入上述GST，可對該植物賦予對於異㗁唑啉衍生物之耐受性，且可使環境壓力耐受性提高。尤其是上述GST對於VLCFAE抑制型除草劑中之異㗁唑啉衍生物之結合活性亦較高，與I. Cummins等人，Plant Mol. Biol. 52, 591-603 (2003) 中所報告之對於莫多草之結合活性相比，於統計學上亦有意義地較高。因此，導入有上述GST之轉形植物可使用VLCFAE抑制型除草劑中之異㗁唑啉衍生物作為除草劑而進行栽培。又，導入有上述GST之轉形植物由於環境壓力耐受性優異，故而即使在先前因環境壓力而發生生長不良之環境下亦可進行栽培。尤其是導入有上述GST之轉形植物對於環境壓力中之高溫壓力亦顯示出優異之耐受性。因此，導入有上述GST之轉形植物可於先前之氣溫較高而不適合生長之土地或時期進行栽培。再者，本發明之轉形植物之製作方法並無特別限定，概略而言可藉由將編碼上述GST之核酸組入至表現載體中，將所獲得之表現載體導入至植物中之方法，而製作表現上述GST之轉形植物。表現載體係以包含能夠於植物內表現之啟動子、及編碼上述GST之核酸之方式構建。作為成為表現載體之母體的載體，可使用先前公知之各種載體。例如，可使用質體、噬菌體、或黏接質體等，可根據所導入之植物細胞或導入方法而適當選擇。具體而言，例如可列舉：pBR322、pBR325、pUC19、pUC119、pBluescript、pBluescriptSK、pBI系之載體等。尤其於對植物體之載體導入法為使用土壤桿菌之方法之情形時，較佳為使用pBI系之雙偶載體。作為pBI系之雙偶載體，具體而言例如可列舉：pBIG、pBIN19、pBI101、pBI121等。啟動子若為能夠於植物體內表現編碼上述GST之核酸的啟動子，則無特別限定，可適宜地使用公知之啟動子。尤其作為啟動子，較佳為使用於植物體內恆常地表現下游基因之恆常表現啟動子。作為該啟動子，例如可列舉花椰菜嵌紋病毒35S啟動子(CaMV35S)、各種肌動蛋白基因啟動子、各種泛蛋白基因啟動子、胭脂鹼合成酶基因之啟動子、煙草之PR1a基因啟動子、番茄之核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小次單元基因啟動子、Napin基因啟動子等。其中，可更佳地使用花椰菜嵌紋病毒35S啟動子、肌動蛋白基因啟動子或泛蛋白基因啟動子。若使用上述各啟動子，則變得能夠於導入至植物細胞內時使任意基因較強地表現。又，作為啟動子，亦可使用具有於植物中之部位特異性地進行表現之功能者。作為此種啟動子，可使用先前公知之任意啟動子。可使用此種啟動子而部位特異性地表現上述GST。再者，表現載體除了啟動子及編碼上述GST之核酸以外，亦可進而包含其他DNA片段。該其他DNA片段並無特別限定，可列舉：終止子、篩選標記物、促進子、用以提高轉譯效率之鹼基序列等。又，上述表現載體亦可進而具有T-DNA區域。T-DNA區域尤其於使用土壤桿菌將上述重組表現載體導入至植物體之情形時，可提高基因導入之效率。轉錄終止子若具有作為轉錄終止部位之功能，則無特別限定，可為公知者。例如，具體而言可較佳地使用胭脂鹼合成酶基因之轉錄終止區域(Nos終止子)、花椰菜嵌紋病毒35S之轉錄終止區域(CaMV35S終止子)等。其中可更佳地使用Nos終止子。於上述表現載體中，藉由將轉錄終止子配置於適當之位置，可防止發生如下情況：於導入至植物細胞中之後，合成出超過所需限度而較長之轉錄物。作為轉形體篩選標記物，例如可使用抗藥性基因。作為該抗藥性基因之具體一例，例如可列舉針對潮黴素、博萊黴素、康黴素、建它黴素、氯黴素等之抗藥性基因。由此，可藉由選擇於含有上述抗生素之培養基中生長之植物體而容易地對經轉形之植物體加以篩選。又，作為轉形體篩選標記物，亦可使用對於特定之藥劑賦予抗性之變異型乙醯乳酸合成酶基因。關於表現載體之構建方法，亦無特別限定，可向適當選擇之成為母體之載體中，以成為特定順序之方式導入上述啟動子及編碼上述GST之核酸以及視需要之上述其他DNA片段。例如，可將編碼上述GST之核酸與啟動子(視需要之轉錄終止子等)加以連結而構建表現盒，將其導入至載體中。於表現盒之構建中，例如將各DNA片段之切斷部位設為相互互補之突出末端，利用接合酶使之反應，由此變得可規定該DNA片段之順序。再者，於表現盒中含有終止子之情形時，自上游起成為啟動子、編碼上述GST之核酸、終止子之順序即可。又，關於用以構建表現載體之試劑類、即限制酶或接合酶等之種類，亦無特別限定，可適當選擇使用市售者。又，上述表現載體之增殖方法(生產方法)亦無特別限定，可使用先前公知之方法。一般而言，可將大腸桿菌作為主體而於該大腸桿菌內使進行增殖。此時，可根據載體之種類而選擇較佳之大腸桿菌之種類。上述表現載體可藉由一般轉形方法而導入至對象之植物內。將表現載體導入至植物細胞中之方法(轉形方法)並無特別限定，可使用與植物細胞相應之適宜之先前公知之方法。具體而言，例如可使用：使用土壤桿菌之方法或直接導入至植物細胞中之方法。作為將表現載體直接導入至植物細胞中之方法，例如可使用顯微注射法、電穿孔法(electroporation method)、聚乙二醇法、粒子槍法、原生質體融合法、磷酸鈣法等。又，若採用將DNA直接導入至植物細胞中之方法，則使用包含對象基因之表現所需之轉錄單元、例如啟動子或轉錄終止子、與編碼上述GST之核酸的DNA便足夠，並非必須具有載體功能。進而，即便為不具有轉錄單元而僅包含上述GST之編碼區域的DNA，將其可整合於宿主之轉錄單元內而表現成為對象之GST即可。作為欲導入含有上述表現載體、或不含表現載體且編碼成為對象之GST之核酸的表現盒之植物細胞，例如可列舉：花、葉、根等植物器官中之各組織之細胞、愈傷組織、懸浮培養細胞等。此處，表現載體可根據所欲生產之種類之植物體而適當構建恰當者，但亦可預先構建通用之表現載體而將其導入至植物細胞中。轉形之結果所獲得之腫瘤組織或胚芽、鬚根等可直接用於細胞培養、組織培養或器官培養，且可使用先前已知之植物組織培養法，藉由投予適當濃度之植物激素(生長激素、細胞分裂素、赤黴素、脫落酸、乙烯、芸苔素內酯等)等而於植物體中再生。作為再生方法，可採用將愈傷組織狀之轉形細胞移至改變了激素之種類、濃度之培養基中進行培養，形成不定胚，而獲得完全之植物體的方法。作為所使用之培養基，可例示LS培養基、MS培養基等。又，本發明之轉形植物係亦包括如下後代植物在內之含義，該後代植物係將包含編碼上述GST之核酸的表現載體導入至宿主細胞中而獲得轉形植物細胞，由該轉形植物細胞再生轉形植物體，由所獲得之轉形植物體獲得植物種子，由該植物種子而獲得。為了由轉形植物體獲得植物種子，例如自生根培養基採取轉形植物體，將其移植至放入有含水土之盆中，使其於一定溫度下生長，形成花，從而最終形成種子。又，於由種子生產植物體中，例如於轉形植物體上所形成之種子成熟時，將其單離而播種至含水土中，於一定溫度、照度下使其生長，藉此生產植物體。如上所述而生產之植物由於表現上述GST，故而顯示出對於異㗁唑啉衍生物之耐受性及對於環境壓力之耐受性。[異㗁唑啉衍生物]於本發明中，所謂異㗁唑啉衍生物係包括具有異㗁唑啉骨架之化合物及其鹽在內之含義。關於異㗁唑啉衍生物之除草活性，例如於日本專利特開平8-225548號公報、日本專利特開平9-328477號公報及日本專利特開平9-328483號公報等中有報告。即，該等已報告之異㗁唑啉衍生物可用作除草劑。又，於日本專利第4465133號公報中揭示有異㗁唑啉衍生物中、尤其是具有除草效果與作物/雜草間之選擇性的一群化合物。日本專利第4465133號公報中所揭示之異㗁唑啉衍生物包含派羅克殺草碸(化合物名：3-[5-(二氟甲氧基)-1-甲基-3-(三氟甲基)吡唑-4-基甲基磺醯基]-4,5-二氫-5,5-二甲基-1,2-㗁唑)。詳細而言，日本專利第4465133號公報中揭示有以下(1)～(17)中所示之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物。(1)一種異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物或其藥理上所許可之鹽，其具有通式[I]：[化1]
式中，R
1
及R
2
相同或不同，表示氫原子、C1～C10烷基、C3～C8環烷基或C3～C8環烷基C1～C3烷基，或者R
1
與R
2
一併與該等所鍵結之碳原子共同表示C3～C7之螺環，R
3
及R
4
相同或不同，表示氫原子、C1～C10烷基或C3～C8環烷基，或者R
3
與R
4
一併與該等所鍵結之碳原子共同表示C3～C7之螺環，進而R
1
、R
2
、R
3
及R
4
亦可與該等所鍵結之碳原子共同形成5～8員環，R
5
及R
6
相同或不同，表示氫原子或C1～C10烷基，Y表示具有選自氮原子、氧原子及硫原子之任意雜原子之5～6員之芳香族雜環基或芳香族縮合雜環基，該等雜環基亦可經選自取代基群α之0～6個相同或不同之基取代，又，鄰接之烷基彼此、烷氧基彼此、烷基與烷氧基、烷基與烷硫基、烷基與烷基磺醯基、烷基與單烷基胺基或烷基與二烷基胺基亦可2個鍵結而形成可經1～4個鹵素原子取代之5～8員環，又，於該等雜環基之雜原子為氮原子時，亦可經氧化而成為N-氧化物，n表示0～2之整數，以下之取代基群中之「可經取代之苯基、可經取代之苯氧基、可經取代之苯硫基、可經取代之芳香族雜環基、可經取代之芳香族雜環氧基、可經取代之芳香族雜環硫基、可經取代之苯基亞磺醯基、可經取代之苯基磺醯基、可經取代之芳香族雜環磺醯基、可經取代之苯基磺醯氧基、可經取代之苄基羰基、可經取代之苯甲醯基、可經取代之苄氧基羰基、可經取代之苯氧基羰基、可經取代之苄基羰氧基、可經取代之苯甲醯氧基」中之「可經取代」係表示該取代基可經鹵素原子、C1～C10烷基、C1～C4鹵化烷基、C1～C10烷氧基烷基、C1～C10烷氧基、C1～C10烷硫基、C1～C10烷基磺醯基、醯基、C1～C10烷氧基羰基、氰基、胺甲醯基(該基之氮原子可經相同或不同之C1～C10烷基取代)、硝基、或胺基(該基之氮原子可經相同或不同之C1～C10烷基、C1～C6醯基、C1～C4鹵化烷基羰基、C1～C10烷基磺醯基、或C1～C4鹵化烷基磺醯基取代)取代。「取代基群α」羥基、巰基、鹵素原子、C1～C10烷基、經選自取代基群β之任意基單取代之C1～C10烷基、C1～C4鹵化烷基、C3～C8環烷基、C1～C10烷氧基、經選自取代基群γ之任意基單取代之C1～C10烷氧基、C1～C4鹵化烷氧基、C3～C8環烷氧基、C3～C8環烷基C1～C3烷氧基、C1～C10烷硫基、經選自取代基群γ之任意基單取代之C1～C10烷硫基、C1～C4鹵化烷硫基、C2～C6烯基、C2～C6烯氧基、C2～C6炔基、C2～C6炔氧基、C1～C10烷基亞磺醯基、經選自取代基群γ之任意基單取代之C1～C10烷基亞磺醯基、C1～C10烷基磺醯基、經選自取代基群γ之任意基單取代之C1～C10烷基磺醯基、C1～C4鹵化烷基亞磺醯基、經選自取代基群γ之任意基單取代之C1～C10烷基磺醯氧基、C1～C4鹵化烷基磺醯基、C1～C10烷基磺醯氧基、C1～C4鹵化烷基磺醯氧基、可經取代之苯基、可經取代之苯氧基、可經取代之苯硫基、可經取代之芳香族雜環基、可經取代之芳香族雜環氧基、可經取代之芳香族雜環硫基、可經取代之苯基亞磺醯基、可經取代之苯基磺醯基、可經取代之芳香族雜環磺醯基、可經取代之苯基磺醯氧基、醯基、C1～C4鹵化烷基羰基、可經取代之苄基羰基、可經取代之苯甲醯基、羧基、C1～C10烷氧基羰基、可經取代之苄氧基羰基、可經取代之苯氧基羰基、氰基、胺甲醯基(該基之氮原子可經相同或不同之C1～C10烷基或可經取代之苯基取代)、C1～C6醯氧基、C1～C4鹵化烷基羰基氧基、可經取代之苄基羰氧基、可經取代之苯甲醯氧基、硝基、胺基(該基之氮原子可經相同或不同之C1～C10烷基、可經取代之苯基、C1～C6醯基、C1～C4鹵化烷基羰基、可經取代之苄基羰基、可經取代之苯甲醯基、C1～C10烷基磺醯基、C1～C4鹵化烷基磺醯基、可經取代之苄基磺醯基或可經取代之苯基磺醯基取代)。「取代基群β」羥基、C3～C8環烷基(該基可經鹵素原子或烷基取代)、C1～C10烷氧基、C1～C10烷硫基、C1～C10烷基磺醯基、C1～C10烷氧基羰基、C2～C6鹵化烯基、胺基(該基之氮原子可經相同或不同之C1～C10烷基、C1～C6醯基、C1～C4鹵化烷基羰基、C1～C10烷基磺醯基、C1～C4鹵化烷基磺醯基取代)、胺甲醯基(該基之氮原子可經相同或不同之C1～C10烷基取代)、C1～C6醯基、C1～C4鹵化烷基羰基、C1～C10烷氧基亞胺基、氰基、可經取代之苯基、可經取代之苯氧基。「取代基群γ」C1～C10烷氧基羰基、可經取代之苯基、可經取代之芳香族雜環基、氰基、胺甲醯基(該基之氮原子可經相同或不同之C1～C10烷基取代)。(2)如上述(1)所記載之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物，其中可經0～6個相同或不同之基取代之雜環上之取代基群α為羥基、鹵素原子、C1～C10烷基、經選自取代基群β之任意基單取代之C1～C10烷基、C1～C4鹵化烷基、C3～C8環烷基、C1～C10烷氧基、經選自取代基群γ之任意基單取代之C1～C10烷氧基、C1～C4鹵化烷氧基、C3～C8環烷氧基、C3～C8環烷基C1～C3烷氧基、C1～C10烷硫基、經選自取代基群γ之任意基單取代之C1～C10烷硫基、C1～C4鹵化烷硫基、C2～C6烯基、C2～C6烯氧基、C2～C6炔基、C2～C6炔氧基、C1～C10烷基磺醯基、C1～C4鹵化烷基磺醯基、可經取代之苯基、可經取代之苯氧基、可經取代之苯硫基、可經取代之芳香族雜環基、可經取代之芳香族雜環氧基、可經取代之芳香族雜環硫基、可經取代之苯基磺醯基、可經取代之芳香族雜環磺醯基、C1～C6醯基、C1～C4鹵化烷基羰基、可經取代之苄基羰基、可經取代之苯甲醯基、羧基、C1～C10烷氧基羰基、氰基、胺甲醯基(該基之氮原子可經相同或不同之C1～C10烷基或可經取代之苯基取代)、硝基、胺基(該基之氮原子可經相同或不同之C1～C10烷基、可經取代之苯基、C1～C6醯基、C1～C4鹵化烷基羰基、可經取代之苄基羰基、可經取代之苯甲醯基、C1～C10烷基磺醯基、C1～C4鹵化烷基磺醯基、可經取代之苄基磺醯基或可經取代之苯基磺醯基取代)，或鄰接之烷基彼此、烷氧基彼此、烷基與烷氧基、烷基與烷硫基、烷基與烷基磺醯基、烷基與單烷基胺基或烷基與二烷基胺基亦可2個鍵結而形成可經1～4個鹵素原子取代之5～8員環。(3)如上述(2)所記載之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物，其中可經0～6個相同或不同之基取代之雜環上之取代基群α為鹵素原子、C1～C10烷基、C1～C4鹵化烷基、C1～C10烷氧基C1～C3烷基、C3～C8環烷基(該基可經鹵素原子或烷基取代)、C1～C10烷氧基、C1～C4鹵化烷氧基、C3～C8環烷基C1～C3烷氧基、可經取代之苯氧基、C1～C10烷硫基、C1～C10烷基磺醯基、醯基、C1～C4鹵化烷基羰基、C1～C10烷氧基羰基、氰基或胺甲醯基(該基之氮原子可經相同或不同之C1～C10烷基取代)。(4)如上述(1)、(2)或(3)所記載之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物，其中R
1
及R
2
相同或不同，為甲基或乙基，R
3
、R
4
、R
5
及R
6
為氫原子。(5)如上述(1)、(2)、(3)或(4)所記載之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物，其中Y為具有選自氮原子、氧原子及硫原子之任意雜原子的5員環或6員環之芳香族雜環基。(6)如上述(5)所記載之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物，其中Y為噻吩基、吡唑基、異㗁唑基、異噻唑基、吡啶基或嘧啶基。(7)如上述(6)所記載之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物，其中Y為噻吩-3-基、吡唑-4-基、吡唑-5-基、異㗁唑-4-基、異噻唑-4-基、吡啶-3-基或嘧啶-5-基。(8)如上述(7)所記載之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物，其中Y為噻吩-3-基，且取代基群α必取代在噻吩環之2及4位。(9)如上述(7)所記載之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物，其中Y為吡唑-4-基，且取代基群α必取代在吡唑環之3及5位，進而1位必取代有氫原子、C1～C10烷基、經選自取代基群β之任意基單取代之C1～C10烷基、C1～C4鹵化烷基、C3～C8環烷基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C1～C10烷基亞磺醯基、C1～C10烷基磺醯基、經選自取代基群γ之任意基單取代之C1～C10烷基磺醯基、C1～C4鹵化烷基磺醯基、可經取代之苯基、可經取代之芳香族雜環基、可經取代之苯基磺醯基、可經取代之芳香族雜環磺醯基、醯基、C1～C4鹵化烷基羰基、可經取代之苄基羰基、可經取代之苯甲醯基、C1～C10烷氧基羰基、可經取代之苄氧基羰基、可經取代之苯氧基羰基、胺甲醯基(該基之氮原子可經相同或不同之C1～C10烷基或可經取代之苯基取代)、胺基(該基之氮原子可經相同或不同之C1～C10烷基、可經取代之苯基、醯基、C1～C4鹵化烷基羰基、可經取代之苄基羰基、可經取代之苯甲醯基、C1～C10烷基磺醯基、C1～C4鹵化烷基磺醯基、可經取代之苄基磺醯基或可經取代之苯基磺醯基取代)。(10)如上述(7)所記載之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物，其中Y為吡唑-5-基，且取代基群α必取代在吡唑環之4位，進而1位必取代有氫原子、C1～C10烷基、經選自取代基群β之任意基單取代之C1～C10烷基、C1～C4鹵化烷基、C3～C8環烷基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C1～C10烷基亞磺醯基、C1～C10烷基磺醯基、經選自取代基群γ之任意基單取代之C1～C10烷基磺醯基、C1～C4鹵化烷基磺醯基、可經取代之苯基、可經取代之芳香族雜環基、可經取代之苯基磺醯基、可經取代之芳香族雜環磺醯基、醯基、C1～C4鹵化烷基羰基、可經取代之苄基羰基、可經取代之苯甲醯基、C1～C10烷氧基羰基、可經取代之苄氧基羰基、可經取代之苯氧基羰基、胺甲醯基(該基之氮原子可經相同或不同之C1～C10烷基或可經取代之苯基取代)、胺基(該基之氮原子可經相同或不同之C1～C10烷基、可經取代之苯基、醯基、C1～C4鹵化烷基羰基、可經取代之苄基羰基、可經取代之苯甲醯基、C1～C10烷基磺醯基、C1～C4鹵化烷基磺醯基、可經取代之苄基磺醯基或可經取代之苯基磺醯基取代)。(11)如上述(7)所記載之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物，其中Y為異㗁唑-4-基，且取代基群α必取代在異㗁唑環之3位及5位。(12)如上述(7)所記載之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物，其中Y為異噻唑-4-基，且取代基群α必取代在異噻唑環之3位及5位。(13)如上述(7)所記載之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物，其中Y為吡啶-3-基，且取代基群α必取代在吡啶環之2位及4位。(14)如上述(7)所記載之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物，其中Y為嘧啶-5-基，且取代基群α必取代在嘧啶環之4位及6位。(15)如上述(1)～(14)中任一項所記載之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物，其中n為2之整數。(16)如上述(1)～(14)中任一項所記載之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物，其中n為1之整數。(17)如上述(1)～(14)中任一項所記載之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物，其中n為0之整數。進而，日本專利第4299483號公報中亦揭示有異㗁唑啉衍生物中、尤其是具有除草效果與作物/雜草間之選擇性的一群化合物。日本專利第4299483號公報中所揭示之異㗁唑啉衍生物包括芬諾沙磺隆(化合物名：3-[(2,5-二氯-4-乙氧基苄基)磺醯基]-4,5-二氫-5,5-二甲基-1,2-㗁唑)。詳細而言，日本專利第4299483號公報中揭示有以下之(18)～(20)中所示之異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物及其鹽。(18)一種異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物及其鹽，其以通式[I]表示：[化2]
{式中，Q表示基-S(O)n-(CR
5
R
6
)m-，n表示0～2之整數，m表示1～3之整數，R
5
及R
6
相互獨立地表示氫原子、氰基、烷氧基羰基或C1～C6烷基，R
1
及R
2
表示氫原子、[可經C3～C8環烷基、C1～C6烷氧基、C1～C6烷基羰基、C1～C6烷硫基、C1～C6烷基亞磺醯基、C1～C6烷基磺醯基、C1～C6烷基胺基、二(C1～C6烷基)胺基、氰基、C1～C6烷氧基羰基、C1～C6烷基胺基羰基、二(C1～C6烷基)胺基羰基、(C1～C6烷硫基)羰基、羧基、(可經1～5個鹵素原子、C1～C6烷基或C1～C6烷氧基取代之)苄氧基、(可經1～5個鹵素原子、C1～C6烷基或C1～C6烷氧基取代之)苯氧基或(可經1～5個鹵素原子、C1～C6烷基或C1～C6烷氧基取代之)苯基取代之]C1～C8烷基、C3～C8環烷基、C1～C6烷氧基羰基、C1～C6烷基胺基羰基、二(C1～C6烷基)胺基羰基、(C1～C6烷硫基)羰基、羧基或(可經1～5個鹵素原子、C1～C6烷基或C1～C6烷氧基取代之)苯基，或者R
1
及R
2
亦可與該等所鍵結之碳原子共同形成C3～C7之螺環，其中，R
1
與R
2
不同時為氫原子，R
3
及R
4
表示氫原子、(可經相同或不同之1～3個鹵素原子、C3～C8環烷基或C1～C6烷氧基取代之)C1～C8烷基或C3～C8環烷基，R
3
及R
4
亦可與該等所鍵結之碳原子共同形成C3～C7之螺環，或者R
1
、R
2
、R
3
及R
4
亦可與該等所鍵結之碳原子共同形成5～8員環，Y表示氫原子、C1～C6烷氧基羰基、C2～C6烯基、[可經相同或不同之1～3個鹵素原子、C1～C6烷氧基、C2～C6烯氧基、C2～C6炔氧基、(可經1～5個鹵素原子、C1～C6烷基或C1～C6烷氧基取代之)苄氧基、C1～C6烷氧基羰基、羧基、羥基或甲醯基取代之]C1～C10烷基或(可經1～5個相同或不同之R
7
取代之)苯基，R
7
表示氫原子、[可經相同或不同之1～3個鹵素原子、C1～C6烷氧基、羥基、C1～C6烷硫基、C1～C6烷基亞磺醯基、C1～C6烷基磺醯基、C1～C6烷基胺基、二(C1～C6)烷基胺基、氰基或(可經1～5個鹵素原子、C1～C6烷基或C1～C6烷氧基取代之)苯氧基取代之]C1～C6烷基、(可經相同或不同之1～3個鹵素原子、C1～C6烷氧基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C1～C6烷氧基羰基、C1～C6烷基羰基或C3～C8環烷基取代之)C1～C6烷氧基、C2～C6烯基、C3～C8環烷氧基、(可經相同或不同之1～3個鹵素原子或C1～C6烷氧基取代之)C1～C6烷硫基、(可經相同或不同之1～3個鹵素原子或C1～C6烷氧基取代之)C1～C6烷基亞磺醯基、(可經相同或不同之1～3個鹵素原子或C1～C6烷氧基取代之)C1～C6烷基磺醯基、(可經1～5個鹵素原子、C1～C6烷基或C1～C6烷氧基取代之)苄氧基、(可經C1～C6烷基、C1～C6烷基磺醯基、C1～C6烷基羰基(C1～C6烷基)或C1～C6烷基磺醯基(C1～C6烷基)取代之)胺基、二(C1～C6烷基)胺基、鹵素原子、氰基、硝基、C1～C6烷氧基羰基、C3～C8環烷氧基羰基、羧基、C2～C6烯氧基羰基、C2～C6炔氧基羰基、(可經1～5個鹵素原子、C1～C6烷基或C1～C6烷氧基取代之)苄氧基羰基、(可經1～5個鹵素原子、C1～C6烷基或C1～C6烷氧基取代之)苯氧基羰基或C1～C6烷基羰基氧基}。(19)一種異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物及其鹽，其以上述(18)中之通式[I]表示：{式中，Q表示基-S(O)n-(CR
5
R
6
)m-，n表示0～2之整數，m表示1，R
5
及R
6
表示氫原子，R
1
及R
2
表示氫原子、(可經C3～C8環烷基或C1～C6烷氧基取代之)C1～C8烷基或C3～C8環烷基，或者R
1
及R
2
亦可與該等所鍵結之碳原子共同形成C3～C7之螺環，其中，R
1
與R
2
不同時為氫原子，R
3
及R
4
表示氫原子或(可經相同或不同之1～3個鹵素原子、C3～C8環烷基或C1～C6烷氧基取代之)C1～C8烷基，R
3
及R
4
亦可與該等所鍵結之碳原子共同形成C3～C7之螺環，或者R
1
、R
2
、R
3
及R
4
亦可與該等所鍵結之碳原子共同形成5～8員環，Y表示(可經1～5個相同或不同之R
7
取代之)苯基，R
7
表示氫原子、[可經相同或不同之1～3個鹵素原子、C1～C6烷氧基、羥基、C1～C6烷硫基、C1～C6烷基亞磺醯基、C1～C6烷基磺醯基、C1～C6烷基胺基、二(C1～C6)烷基胺基、氰基或(可經1～5個鹵素原子、C1～C6烷基或C1～C6烷氧基取代之)苯氧基取代之]C1～C6烷基、(可經相同或不同之1～3個鹵素原子、C1～C6烷氧基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C1～C6烷氧基羰基、C1～C6烷基羰基或C3～C8環烷基取代之)C1～C6烷氧基、C3～C8環烷氧基或鹵素原子}。(20)一種異㗁唑啉(isoxazoline)衍生物及其鹽，其以上述(18)中之通式[I]表示：{式中，Q表示基-S(O)n-(CR
5
R
6
)m-，n表示0～2之整數，m表示1，R
5
及R
6
表示氫原子，R
1
及R
2
表示C1～C8烷基，R
3
及R
4
表示氫原子，Y表示(經1～5個相同或不同之R
7
取代之)苯基，R
7
表示氫原子、(可經相同或不同之1～3個鹵素原子或C1～C6烷氧基取代之)C1～C6烷基、(可經相同或不同之1～3個鹵素原子或C1～C6烷氧基取代之)C1～C6烷氧基或鹵素原子}。上述GST具有對於該等已報告之異㗁唑啉衍生物之結合活性。因此，導入上述GST而成之轉形植物變得具有對於該等已報告之異㗁唑啉衍生物之耐受性。其中，上述GST對於日本專利第4465133號公報中所揭示之異㗁唑啉衍生物(詳細而言為上述(1)～(17)所記載之異㗁唑啉衍生物)及日本專利第4299483號公報中所揭示之異㗁唑啉衍生物(詳細而言為上述(18)～(20)所記載之異㗁唑啉衍生物)具有優異之結合活性。因此，導入上述GST而成之轉形植物變得對於日本專利第4465133號公報中所揭示之異㗁唑啉衍生物及日本專利第4299483號中所揭示之異㗁唑啉衍生物具有更優異之耐受性。進而又，上述GST對於派羅克殺草碸及芬諾沙磺隆具有更優異之結合活性。因此，導入上述GST而成之轉形植物變得對於派羅克殺草碸及芬諾沙磺隆具有更優異之耐受性。於使用上述異㗁唑啉衍生物作為除草劑之情形時，可防止除導入有上述GST之轉形植物以外之各種雜草之生長。作為此種雜草，並無特別限定，例如以稗、馬唐、狗尾草、早熟禾、強生草、麥娘、野生燕麥等禾本科雜草為代表，亦可列舉早苗蓼、皺果莧、白藜、繁縷、茼麻、刺黃花稔、田菁、豕草、牽牛花之闊葉雜草，香附子、油莎草、短葉水蜈蚣、具芒碎米莎草、碎米莎草等多年生及一年生具芒碎米莎草科雜草。進而，於水田中使用異㗁唑啉衍生物作為除草劑之情形時，關於稗草、異型莎草、鴨舌草、陌上草等一年生雜草及水莎草、荸薺、細稈螢藺等多年生雜草，亦可在發芽前至生長期之較廣範圍內以低藥劑量進行防除。[實施例]以下，藉由實施例對本發明加以更詳細之說明，但本發明之技術範圍並不限定於以下之實施例。[實施例1]於本實施例中，關於小麥中之GST中之特定為寄存編碼：Q8GTC0之GST(於本實施例中稱為TaQ8GTC0)，分析其對於VLCFAE抑制型除草劑之麩胱甘肽結合活性。＜TaQ8GTC0蛋白質之大腸桿菌表現構建物之構建＞圖1中表示構建TaQ8GTC0蛋白質之大腸桿菌表現構建物的構成。首先，將由小麥(農林61號)莖葉部所製備之RNA作為模板，藉由反轉錄反應而合成cDNA。將所獲得之cDNA作為模板，利用TaQ8GTC0-H(序列編號3)及TaQ8GTC0-D(序列編號4)之引子組進行PCR，而獲得於5'末端附加有NdeI識別部位、於3'末端附加有BamHI識別部位之TaQ8GTC0基因之基因片段。其次，對所獲得之TaQ8GTC0基因片段進行NdeI及BamHI處理，將處理後之TaQ8GTC0基因片段作為插入物，將同樣地進行NdeI及BamHI處理之pET22b(+)作為載體。使用該等插入物及載體進行接合反應。使用接合反應後之反應液，將反應液中所含之載體導入至大腸桿菌JM109株中。其後，由藉由菌落PCR確認導入有目標質體之菌落而製備質體。藉由序列分析確認到於NdeI及BamHI切斷部位之間所存在之TaQ8GTC0基因之鹼基序列中並無因PCR產生之錯誤(error)。將所獲得之質體導入至大腸桿菌BL21(DE3)株中，而構建表現TaQ8GTC0蛋白質之大腸桿菌表現構建物(KLB-606)。＜TaQ8GTC0蛋白質之製備＞使用所製作之大腸桿菌BL21(DE3)株(KLB-606)進行TaQ8GTC0蛋白質之表現。將單菌落植菌於含有50 ppm安比西林之LB液體培養基中之後，利用試管進行一夜振盪培養，使用所獲得之溶液作為前培養液。將2.5 ml之前培養液添加至250 mL之含有50 ppm安比西林之LB液體培養基(1 L容量之錐形瓶)中，於37℃、200 rpm下進行培養直至成為OD
600
＝0.5～0.6。繼而，於冰上進行5分鐘冷卻後，以最終成為1 mM之方式添加IPTG，於27℃、200 rpm下進行21小時之TaQ8GTC0蛋白質之表現誘導，然後進行集菌(於4℃、6000×g下進行10分鐘離心)，於-80℃下保存菌體。於冷凍存儲之菌體(0.5 L培養成分)中加入30 mL之PBS緩衝液(0.14 M NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na
2
HPO
4
、1.8 mM KH
2
PO
4
，pH值為7.3)，進行超音波處理(TAITEC VP-30S、微晶片、輸出3、15秒恆定×7～8次)之後，於4℃、15,000×g下進行20分鐘之離心而獲得上清液。將該粗酶溶液以1 mL/min之流速載入至利用PBS緩衝液進行平衡化之GSTrap 4B管柱(bed vol. 1 mL)中，利用20 ml以上之PBS緩衝液對麩胱甘肽親和管柱進行洗淨後，將2 mL之溶出緩衝液(50 mM之Tris-HCl、10 mM之還原型麩胱甘肽、pH值為8.0)注入至管柱中，使TaQ8GTC0蛋白質溶出(圖2)。藉由使用Nanosep(10 K)之超過濾將該蛋白質溶液置換至PBS緩衝液中，並於-80℃下進行保存。再者，蛋白質之濃度測定係藉由Bradford之方法，依照TaKaRa Bradford蛋白質測定套組(Takara)之手冊而進行。再者，圖2中，M係分子量標記物。又，於圖2之結果中，於粗酶及流穿液(flow through)部分之泳道中塗覆有8.0 μg總蛋白質。再者，粗酶係對菌體進行超音波處理後，進行離心而成之上清液，流穿液係於將粗酶液載入至親和管柱之過程中所採取之溶液。＜對於VLCFAE抑制型除草劑之麩胱甘肽結合活性之分析＞本實施例中所使用之所有VLCFAE抑制型除草劑係以丙酮溶液之形式添加至反應系中。對於VLCFAE抑制型除草劑之結合反應係於包含50 μl之100 mM之磷酸鉀緩衝液(pH值6.8)、10 μl之1 mM VLCFAE抑制型除草劑、20 μl之10 mM之還原型麩胱甘肽(pH值7.0)、6 μl之TaQ8GTC0蛋白質(總共378 ng、PBS緩衝液溶液)、114 μl之PBS緩衝液的總共200 μl之系中進行，於30℃下進行15分鐘之反應後，將使用0.2 μm之過濾器進行過濾而獲得之溶液50 μl注入至HPLC中。以下，揭示HPLC分析條件。裝置：Agilent 1100系列管柱：CAPCELL PAK C18 AQ 4.6 mmI.D.×250 mm(資生堂)流動相：乙腈/水＝5/95(保持5 min)→(4 min)→40/60(保持4 min)→(4 min)→90/10(保持8 min)→(1 min)→5/95(保持4 min)(各溶劑含有0.5%之乙酸)溫度：35℃流速：1.0 mL/min檢測：254 nm＜結果與考察＞將供於TaQ8GTC0蛋白質之麩胱甘肽結合活性試驗中的VLCFAE抑制型除草劑示於圖3。於分析對於各VLCFAE抑制型除草劑之麩胱甘肽結合活性時，根據反應液中之VLCFAE抑制型除草劑之減少量而求出麩胱甘肽結合物(GS結合物)之生成量。將對於各VLCFAE抑制型除草劑之TaQ8GTC0蛋白質之麩胱甘肽結合活性示於表1。[表1]
a)派羅克殺草碸之酶活性以7個連續值之平均±標準偏差表示，其他藥劑之派羅克殺草碸以4個連續值之平均±標準偏差表示。b)檢測極限以下再者，作為一例，將派羅克殺草碸與麩胱甘肽之結合反應、及使用派羅克殺草碸作為VLCFAE抑制型除草劑時之HPLC圖示於圖4。再者，圖4中所示之HPLC圖中之上段表示含有TaQ8GTC0蛋白質之麩胱甘肽結合活性試驗之結果，中段表示不含TaQ8GTC0蛋白質之麩胱甘肽結合活性試驗之結果，及下段表示不含TaQ8GTC0蛋白質及麩胱甘肽之麩胱甘肽結合活性試驗之結果。如表1所示，明確TaQ8GTC0蛋白質對於VLCFAE抑制型除草劑中之具有異㗁唑啉骨架之派羅克殺草碸及芬諾沙磺隆的結合活性亦特異性地較高。相對於此，明確對於具有異㗁唑啉骨架以外之結構的VLCFAE抑制型除草劑，因TaQ8GTC0蛋白質產生之麩胱甘肽結合活性明顯較低。又，如圖4所示，於使用派羅克殺草碸之系中，於酶添加區確認到派羅克殺草碸之GS結合物(M-15)之波峰。此情況表示添加至反應系中之派羅克殺草碸之所有量10 nmol中，相當於4.81 nmol之量成為GS結合物。再者，於本實施例中，對於唑草胺之結合活性係藉由定量因該藥劑之麩胱甘肽結合而游離之化合物而求出。又，8種藥劑(莫多草、拉草、氟噻草胺、滅芬草、四唑醯草胺、茚草酮、莎稗磷、哌草磷)之麩胱甘肽結合物之波峰不明，因此於分析該等藥劑之麩胱甘肽結合活性時，首先改變反應條件(使添加至反應系中之酶量變多、或使反應時間變長)，生成麩胱甘肽結合物(GS結合物)，並藉由LC/MS進行波峰之鑑定。[實施例2]於本實施例中，製作導入有TaQ8GTC0基因之轉形稻，試驗該轉形稻對於VLCFAE抑制型除草劑之感受性。＜轉形稻之製作＞於本實施例中，如圖5所示製作TaQ8GTC0基因之稻轉形用載體(R-5-TaQ8GTC0)。具體而言，首先，將由小麥(農林61號)莖葉部製備之RNA作為模板，藉由反轉錄反應而合成cDNA。將所獲得之cDNA作為模板，於TaQ8GTC0-M(序列編號5)、TaQ8GTC0-N(序列編號6)之引子組中進行PCR，而獲得於5'末端附加有SalI識別部位、於3'末端附加有NotI識別部位之TaQ8GTC0基因之基因片段。其次，對所獲得之TaQ8GTC0基因片段進行SalI及NotI處理，將處理後之TaQ8GTC0基因片段作為插入物，將同樣地進行SalI及NotI處理之pENTR-1A(Thermo Fisher Scientific Inc.)作為載體。使用該等插入物及載體進行接合反應。將由此製作之入門選殖(pENTR1Α-TaQ8GTC0)藉由轉形而導入至大腸桿菌JM109株中。其後，由藉由菌落PCR確認導入有目標質體之菌落而製備質體。藉由序列分析確認到於SalI及NotI切斷部位之間所存在的TaQ8GTC0基因之鹼基序列中並無因PCR引起之錯誤。繼而，進行所製作之入門選殖(pENTR1Α-TaQ8GTC0) (KLB-649)與目標載體PalSelect R-5(Inplanta Innovations股份有限公司)之LR反應，藉由轉形將所製作之表現載體(於PalSelect R-5之attB序列間插入有TaQ8GTC0基因之稻轉形用載體)導入至大腸桿菌HST02株中。其後，由藉由菌落PCR確認導入有目標質體之菌落而製備質體，藉由序列分析確認到attB序列間所插入之TaQ8GTC0基因之鹼基序列正確(KLB-650)。＜藉由轉形將TaQ8GTC0基因導入至稻中＞藉由電穿孔法將所製作之稻轉形用載體KLB-650 (PalSelect R-5-TaQ8GTC0)導入至土壤桿菌(EHA105)中(KLB-654)。繼而，藉由土壤桿菌法(S. Toki Plant Mol. Biol. Rep. 15 16-21(1997))將TaQ8GTC0基因導入至稻培養細胞中，然後利用雙草醚(BS，bispyribac-sodium)進行選拔。若藉由轉形將TaQ8GTC0基因導入至稻中1個月，並利用0.25 μM之雙草醚(BS)選擇導入有TaQ8GTC0基因之稻培養細胞，則與KLB-279(導入GFP基因代替TaQ8GTC0基因之陽性對照)同樣地確認到於選拔培養基中增殖之重組稻培養細胞(圖6)。因此，於將該等轉形稻培養細胞移植至未添加藥劑之再分化培養基中之後，關於所獲得之植物體，依次進行於隔離溫室中之栽培。自隔離溫室中之栽培開始起平均2個月對所有植物體確認出穗，自該等植物體採集後代種子(T1)。＜TaQ8GTC0基因導入稻之派羅克殺草碸耐受性＞針對18個系統，藉由以結冷膠為培養基之發芽生長抑制試驗而調查對於派羅克殺草碸之耐受性。使Hoagland mix與3 g結冷膠懸浮於1 L蒸餾水中之後，於微波爐中加溫而使其充分溶解。將所獲得之懸浮液15 ml在尚未冷卻之前注入至管瓶中(於培養盤中注入30 ml)。於混練藥劑時，於注入至管瓶或培養盤中之時同時添加並進行充分混合。將稻穀於稀釋50倍之次氯酸鈉溶液(安替福民)(和光)中浸漬20分鐘左右之後，充分水洗。將經滅菌處理之種子浸於蒸餾水中，於27℃下進行靜置直至催芽(約2日)。使催芽種子之芽朝上，輕輕地埋入至含有0.25 μM BS之結冷膠培養基(培養盤)中。將該等與放入有蒸餾水之燒杯一同放入至透明盒子中，利用保鮮膜封蓋並於27℃、螢光燈照明下(光期14小時、暗期10小時)下使其生長2日。其後，將以根部之延伸為指標而判斷具有BS耐受性之稻種子移植至含有派羅克殺草碸(最終濃度為10
-8
、10
-7
、10
-6
、10
-5
M)之結冷膠培養基(管瓶)中。繼而，將該等與放入有蒸餾水之燒杯一同放入至透明盒子中，利用保鮮膜封蓋並於27℃、螢光燈照明下(光期14小時、暗期10小時)使其生長4～5日，然後測定作物高度。藥劑之抑制係以作物高度為指標而算出相對於藥劑未添加區之生長抑制率，生長抑制50%濃度(I
50
值)係藉由Probit法而求出。將上述TaQ8GTC0基因導入稻對於派羅克殺草碸之耐受性試驗之結果示於表2。[表2]
表2中，1)係I
50
(重組稻)/I
50
(野生型稻)之值。如表2所示，供於試驗中之18個系統中之16個系統與野生型相比，對派羅克殺草碸顯示出10倍以上之耐受性，於最強之系統(#3-13)中見到約350倍之耐受性。＜抑制野生型稻生長之VLCFAE抑制型除草劑之最小濃度之確定＞TaQ8GTC0基因導入稻之抗藥性有無係以與野生型稻之感受性差為指標而進行判斷，因此藉由以下方法進行野生型稻(日本晴)對於供於麩胱甘肽結合活性試驗之VLCFAE抑制型除草劑的感受性試驗。以結冷膠為培養基進行發芽生長抑制試驗。使Hoagland mix與3 g結冷膠懸浮於1 L蒸餾水中之後，於微波爐中加溫而使其充分溶解。將所獲得之懸浮液15 ml在尚未冷卻之前注入至管瓶中。於混練藥劑(丙酮溶液)時，於注入至管瓶中之時同時添加並進行充分混合(最終丙酮濃度為0.1%)。將稻穀於稀釋50倍之次氯酸鈉溶液(安替福民)(和光)中浸漬20分鐘左右之後，充分水洗。將經滅菌處理之種子浸於蒸餾水中，於27℃下進行靜置直至催芽(約2日)。使催芽種子之芽朝上而移植於含有藥劑之結冷膠培養基(管瓶)中。繼而，將該等與放入有蒸餾水之燒杯一同放入至透明盒子中，利用保鮮膜封蓋並於27℃、螢光燈照明下(光期14小時、暗期10小時)下使其生長1週，然後對植物體進行取樣，並測定作物高度。藥劑之抑制係以作物高度為指標而算出相對於藥劑未添加區之生長抑制率，生長抑制50%濃度(I
50
值)係藉由Probit法而求出。進行野生型稻(日本晴)對於供於麩胱甘肽結合活性試驗中之VLCFAE抑制型除草劑之感受性試驗。將由試驗結果明確之各藥劑對於野生型稻生長之I
50
值及抑制生長之最小濃度示於表3。[表3]
＜TaQ8GTC0基因導入稻對於VLCFAE抑制型除草劑之耐受性試驗＞藉由與上述之派羅克殺草碸耐受性試驗相同之方法進行TaQ8GTC0基因導入稻對於VLCFAE抑制型除草劑之耐受性試驗。於本例中，如表4所示，於完全抑制野生型稻植物體(日本晴)生長之最小濃度(×1)、最小濃度之4倍濃度(×4)、最小濃度之16倍濃度(×16)總共3種濃度下進行對於VLCFAE抑制型除草劑之耐受性試驗。[表4]
表4中，a)表示抑制野生型稻(日本晴)生長之最小濃度，b)表示a)之4倍濃度，c)表示a)之16倍濃度。於本例中，將日本晴作為比較對照，使用對派羅克殺草碸顯示出較強之耐受性之#3-13系統TaQ8GTC0基因導入稻。將結果示於圖7-1～圖7-6。再者，於圖7-1～圖7-6中，自左側起依次表示藥劑濃度0 μM、表4之最小濃度(×1)、表4之最小濃度之4倍濃度(×4)、表4之最小濃度之16倍濃度(×16)。於派羅克殺草碸及芬諾沙磺隆處理區(圖7-1)，於試驗之最高濃度(最小濃度之16倍濃度)下亦顯示出對於TaQ8GTC0基因導入稻之生長未見影響之較強之耐受性，相對於此，於6種藥劑(氟噻草胺、莎稗磷、哌草磷、唑草胺、茚草酮、四唑醯草胺)之處理區(圖7-2～圖7-4)，即便是最小濃度亦抑制生長，對於該等藥劑，TaQ8GTC0基因導入稻不顯示耐受性。又，關於3種藥劑(莫多草、拉草、滅芬草)，雖然於最小濃度下，未見對生長之影響，但於最小濃度之4倍濃度(×4)下抑制生長，TaQ8GTC0基因導入稻對於該等3種藥劑之耐受性未達到實用水準而極弱(圖7-5及圖7-6)。再者，雖然並未揭示資料，但關於對於派羅克殺草碸顯示出與#3-13系統同等強之耐受性之#4-7系統，對於各種藥劑之感受性之強度亦與#3-13相同。如上所述，明確TaQ8GTC0基因導入稻對於VLCFAE抑制型除草劑中之異㗁唑啉係除草劑特異性地顯示耐受性。又，本重組稻之抗藥性基本上與TaQ8GTC0蛋白質之麩胱甘肽結合活性相關。[實施例3]於本實施例中，製作導入有TaQ8GTC0基因之轉形阿拉伯芥，試驗該轉形阿拉伯芥對於VLCFAE抑制型除草劑之感受性。＜轉形阿拉伯芥之製作＞首先，如圖8所示製作具有TaQ8GTC0基因之阿拉伯芥轉形用載體(Α-3-TaQ8GTC0)。詳細而言，藉由進行於pENTR-1A(Thermo Fisher Scientific Inc.)之attL1與attL2之間插入有TaQ8GTC0基因(ORF)之入門選殖(pENTR1Α-TaQ8GTC0，KLB-649)與目標載體PalSelect Α-3(Inplanta Innovations股份有限公司)之LR反應，而製作阿拉伯芥轉形用載體。該阿拉伯芥轉形用載體係於PalSelect Α-3之attB序列間插入有TaQ8GTC0基因者。其次，藉由轉形將所製作之阿拉伯芥轉形用載體導入至大腸桿菌HST02株中。其後，由藉由菌落PCR確認導入有目標質體之菌落而製備質體，藉由序列分析確認到於attB序列間所插入之TaQ8GTC0基因之鹼基序列正確(KLB-707)。＜藉由轉形將TaQ8GTC0基因導入至阿拉伯芥中＞藉由電穿孔法將藉由上述方式製作之阿拉伯芥轉形用載體(PalSelect Α-3-TaQ8GTC0)導入至土壤桿菌(EHA105)中(KLB-718)。繼而，藉由Floral dip法(S. J. Clough等人，Plant J. 16 735-743(1998))將TaQ8GTC0基因導入至阿拉伯芥中之後，利用雙草醚(BS)進行選拔。＜對轉形阿拉伯芥導入基因之確認＞由藉由上述方式獲得之轉形阿拉伯芥植物體，使用Ampdirect Plus樣品溶解液(Shimadzu)[20 mM之Tris-HCl(pH值8.0)、5 mM之EDTA、400 mM之NaCl、0.3% SDS、200 μg/ml蛋白酶K]而簡易地製備基因組DNA。將該等作為模板，使用KAPA 3G DNA聚合酶(KAPA BIOSYSTEMS)，於以下之條件下藉由PCR確認到基因導入。PCR係於總共50 μl之反應系(0.4 μl模板、0.3 μl之50 μM正義引子(序列(TaQ8GTC0)-2：序列編號7)、0.3 μl之50 μM反義引子(NOSter-13：序列編號8)、25 μl之KAPA植物PCR緩衝液、0.4 μl之KAPA 3G DNA聚合酶、23.6 μl滅菌水)中進行。PCR係採用如下條件，初期變性：於95℃下進行20 sec，變性：於95℃下進行20 sec，退火：於58℃下進行15 sec，延伸：於72℃下進行30 sec (40循環)，最終延伸：於72℃下進行4 min。繼而，使用導入有阿拉伯芥轉形用載體(PalSelect Α-3-TaQ8GTC0)之土壤桿菌(KLB-718)，藉由轉形將TaQ8GTC0基因導入至阿拉伯芥中。其後，將自經轉形之阿拉伯芥植物體所採取之種子(總共約50,000粒)播種於含有0.1 μM之BS之選拔培養基中，以有無選拔標記物(W574L/S653I變異型阿拉伯芥ALS)為指標而選擇轉形體。其結果為，總共長出30株個體(圖9)。再者，圖9中所示之照片係表示播種後14日後之情況，表示於選拔培養基中長出之總共30株個體之轉形體中之3株個體。繼而，於該等中選出10株個體，將自該等之葉簡易提取之基因組DNA作為模板進行PCR，結果確認到導入有目標小麥GST基因(圖10)。再者，於圖10中，泳道1～10係表示自選拔培養基中長出之總共30株個體中選出10株個體，將自各個體簡易提取之基因組DNA作為模板之PCR之結果。於PCR中，利用上述之序列(TaQ8GTC0)-2與Noster-13之引子組對區域A進行(563bp)擴增。又，於圖10之電泳照片中，左端之泳道係100bp DNA梯狀條帶。＜TaQ8GTC0基因導入阿拉伯芥之派羅克殺草碸耐受性試驗＞為了調查TaQ8GTC0基因導入阿拉伯芥之派羅克殺草碸耐受性，如下所示製作培養基。首先，將Murashige-Skoog(MS)培養基(1袋)、鹽酸硫胺素(3 mg)、煙鹼酸(5 mg)、吡哆醇鹽酸鹽(0.5 mg)、蔗糖(10 g)加入至1 L燒杯中，將pH值調整為5.7並定容至1 L後，加入8 g(0.8%)瓊脂。對其進行高壓蒸氣滅菌後，冷卻至室溫並添加派羅克殺草碸(丙酮溶液)。將其於角2培養盤中分注30 ml，而製備含有特定濃度之派羅克殺草碸的MS培養基。使用該等培養基，藉由以下之方法進行轉形阿拉伯芥之派羅克殺草碸感受性試驗。將必須量之阿拉伯芥之乾燥種子於70%乙醇中進行2分鐘攪拌，於次氯酸(0.02% Triton-X-100)中進行15分鐘攪拌，利用滅菌水洗淨10次。繼而，使種子懸浮於經高壓蒸氣滅菌之0.1%瓊脂溶液1 ml中，將該溶液充分混合至均一，逐粒接種至培養基表面，總共30粒。利用醫用膠帶加以密封，於4℃下放置2日後，移至22℃使之發芽。將對野生型阿拉伯芥(Columbia-0)進行試驗之結果示於圖11，將對TaQ8GTC0基因導入阿拉伯芥進行試驗之結果示於圖12。再者，圖11及12中所示之照片係於22℃下生長14日後所拍攝之照片。如圖11所示，野生型阿拉伯芥於派羅克殺草碸濃度為100 nM時生長稍受抑制，於1 μM以上時基本上完全受到抑制。相對於此，如圖12所示，TaQ8GTC0基因導入阿拉伯芥於派羅克殺草碸濃度為1 μM時，不僅與藥劑未添加區(對照)同樣地生長，而且於10 μM時與1 μM相比亦可見生長稍受抑制，但充分地生長，得知其對派羅克殺草碸顯示出較強之耐受性。於本例中供試之總共7個系統之TaQ8GTC0基因導入阿拉伯芥與野生型(Columbia-0)相比顯示出至少10倍之派羅克殺草碸耐受性。再者，於圖12中表示顯示出特別強之耐受性之轉形阿拉伯芥(KLB-718 1-1-5)之結果。根據該等結果明確，小麥GST(TaQ8GTC0)對於阿拉伯芥亦發揮功能，賦予對於派羅克殺草碸之耐受性。＜阿拉伯芥植物體對於VLCFAE抑制型除草劑之感受性試驗＞於本例中，亦藉由與上述之TaQ8GTC0基因導入阿拉伯芥之派羅克殺草碸耐受性試驗相同之方法進行野生型阿拉伯芥對於VLCFAE抑制型除草劑之感受性試驗。首先，將確定較強地抑制野生型阿拉伯芥生長之VLCFAE抑制型除草劑濃度之結果示於表5。[表5]
其次，採用該等之試驗濃度，調查TaQ8GTC0基因導入阿拉伯芥對於VLCFAE抑制型除草劑之藥劑感受性。將結果示於圖13及14。再者，圖13及14中所示之照片係於22℃下生長14日後所拍攝之照片。由圖13及14得知，TaQ8GTC0基因導入阿拉伯芥(供試耐受性最強之KLB-718 1-1-5)對於異㗁唑啉系之派羅克殺草碸及芬諾沙磺隆顯示出較強之耐受性(圖13)。另外，關於其他9種藥劑，TaQ8GTC0基因導入阿拉伯芥之生長與野生型同樣地受到較強地抑制(圖13及14)。根據以上之結果明確，TaQ8GTC0基因導入阿拉伯芥對於異㗁唑啉系除草劑顯示出特異性之耐受性。又，TaQ8GTC0基因導入阿拉伯芥之抗藥性基本上與TaQ8GTC0蛋白質對於藥劑之麩胱甘肽結合活性相關。[實施例4]於本實施例中，試驗導入有TaQ8GTC0基因之轉形稻對於高溫壓力之耐受性。首先，藉由與TaQ8GTC0基因導入稻之派羅克殺草碸耐受性試驗相同之方法，將根據於結冷膠培養基(培養盤)中之根部之延伸而判斷具有BS耐受性之TaQ8GTC0基因導入稻種子移植至塑膠杯中(對於日本晴，將於未添加BS之結冷膠培養基中生長之個體移植至塑膠杯中)。於隔離溫室中生長1週後進行高溫處理(50℃、2小時半)，進而於隔離溫室中生長1週，測定稻之作物高度及根重。再者，於本實施例中，使用實施例2中所製作之TaQ8GTC0基因導入稻中之#4-7及#3-13。由於在總共3次試驗中獲得相同之結果，故而將其中1次試驗結果示於圖15。試驗之結果係與日本晴相比，TaQ8GTC0基因導入稻之作物高度及根重因高溫處理所受到之影響均較小，明確所製作之TaQ8GTC0基因導入稻具有高溫壓力耐受性。[比較例1]於本比較例中，針對與TaQ8GTC0具有較高之同源性之其他植物GST分析派羅克殺草碸代謝活性，該TaQ8GTC0於實施例1～4中與對於異㗁唑啉衍生物之耐受性及對於高溫壓力之耐受性相關。具體而言，圖16中表示TaQ8GTC0、與該TaQ8GTC0具有較高之同源性之源自小麥及玉米之GST之11個分子種類，對相同作用性之莫多草具有代謝活性之源自稻之GST之3個分子種類(I. Cummins等人，Plant Mol. Biol. 52, 591-603 (2003)、B. McGonigle等人，Plant Physiol. 124, 1105-1120 (2000)、H. Y. Cho等人，Pestic. Biochem. Physiol. 83, 29-36 (2005)、H. Y. Cho等人，Pestic. Biochem. Physiol. 86, 110-115 (2006)及H. Y. Cho等人，J. Biochem. Mol. Biol. 40, 511-516 (2007))總共14個植物GST。於本例中，製作分別導入有該等植物GST基因之稻培養細胞，驗證有無對於派羅克殺草碸之耐受性。再者，於圖16中，括號內之數字表示相對於小麥GST(TaQ8GTC0)之胺基酸序列的同源性。具體而言，關於7種基因，以於含有派羅克殺草碸之培養基進行液體培養之稻培養細胞之脂肪酸含量為指標而分析有無代謝活性，關於2種基因，以於含有藥劑之培養盤中之稻培養細胞之增殖為指標而分析有無代謝活性。＜以稻培養細胞中之脂肪酸含量為指標的派羅克殺草碸代謝活性之分析＞首先，如圖17所示製作稻轉形用載體。於本例中，利用由稻(日本晴)、小麥(農林61號)及玉米(先驅物32K61)莖葉部所製備之RNA之反轉錄反應，而分別製備cDNA。將所獲得之cDNA作為模板，藉由PCR將於5'末端賦予有XbaI之限制酶部位且於3'末端賦予有AflII之限制酶部位之各GST基因之全長加以擴增。其後，對該等之3'末端進行AflII處理，利用T4DNA聚合酶進行平滑化，對5'末端進行XbaI處理。繼而，對於PalSelect R-4(Inplanta Innovations股份有限公司)之MCS之區域導入有CSP(稻愈傷組織特異性啟動子：基因座Os10g0207500)::GUS::NOSt之構建物的KLB-224進行SacI處理，然後利用T4DNA聚合酶進行平滑化而進行XbaI處理，從而製成載體片段。將上述之GST基因片段與載體片段接合，藉由轉形將所製作之載體導入至大腸桿菌(HST-02株)中。將轉形反應液之一部分塗佈於含有50 ppm壯觀黴素之LB固體培養基上，於37℃下徹夜培養，藉由將長出之複數個菌落作為模板之PCR而選出導入有目標載體之菌落。將該菌落植菌於含有50 ppm壯觀黴素之YM液體培養基上，於37℃下徹夜培養，由菌體製備質體。繼而，分析進行序列反應而導入至載體中之目標基因之所有序列與5'、3'之兩末端部分之鹼基序列。以下，表示插入有各GST基因之稻轉形用載體之製作時所使用之引子之鹼基序列。對於源自稻之OsGSTF5，使用以下之引子組。OsGSTF5-1：5'-AAAAAATCTAGAAAAGTGCAGGGCAAATTC-3'(正義：序列編號9)OsGSTF5-2：5'-AAAAAACTTAAGCTATGGTATGTTCCCACT-3'(反義：序列編號10)對於源自稻之OsGSTU5，使用以下之引子組。OsGSTU5-1：5'-AAAAAATCTAGAATCTTCTTCTCCGACGAG-3'(正義：序列編號11)OsGSTU5-2：5'-AAAAAACTTAAGCTACTTGGCGCCAAACTT-3'(反義：序列編號12)對於源自小麥之TaQ8GTB9，使用以下之引子組。TaQ8GTB9(GSTF4)-1：5'-AAAAAATCTAGAATGGAGCCTATGAAGGTG-3'(正義：序列編號13)TaQ8GTB9(GSTF4)-2：5'-AAAAAACTTAAGTCATGGTATTCTCCCGCT-3'(反義：序列編號14)對於源自玉米之ZmB6T8R4，使用以下之引子組。ZmB6T8R4(Corn)-3：5'-AAAAAATCTAGATCGTTTCGAGGCCGAT-3'(正義：序列編號15)ZmB6T8R4(Corn)-2：5'-AAAAAACTTAAGTCACTTGGCCCCGAACTT-3'(反義：序列編號16)對於源自玉米之ZmQ9ZP61，使用以下之引子組。ZmQ9ZP61(GST6)-3：5'-AAAAAATCTAGATACCAGCCACGTCGCTT-3'(正義：序列編號17)ZmQ9ZP61(GST6)-2：5'-AAAAAACTTAAGTCACTTGGCCCCGAACTT-3'(反義：序列編號18)對於源自玉米ZmM16901，使用以下之引子組。M16901(GSTI)-3：5'-AAAAAATCTAGAGTTGGGTCTGGGACAC-3'(正義：序列編號19)M16901(GSTI)-2：5'-AAAAAACTTAAGTCAAGCAGATGGCTTCAT-3'(反義：序列編號20)對於源自玉米之ZmY12862，使用以下之引子組。ZmY12862(GST5)-1：5'-AAAAAATCTAGAATGGCCGAGGAGAAGAAG-3'(正義：序列編號21)ZmY12862(GST5)-2：5'-AAAAAACTTAAGCTACTCGATGCCCAGCCT-3'(反義：序列編號22)即，針對圖16中所示之總共14種基因中之7種基因，分別製作稻轉形用載體(PalSelect R-4-GST)。再者，關於數種基因，插入至載體中之序列與資料庫上之序列不同。將該等之差異示於表6。[表6]
再者，表6中，「-」表示無胺基酸序列上之差異。又，關於OsGSTF5、OsGSTU5、ZmQ9ZP61，與資料庫上之序列完全一致。＜藉由轉形將GST基因導入至稻中＞藉由電穿孔法將藉由上述方式製作之具有各種GST基因之稻轉形用載體(PalSelect R-4-GST)導入至土壤桿菌(EHA105)中。繼而，藉由土壤桿菌法(S. Toki Plant Mol. Biol. Rep. 15 16-21(1997))將GST基因導入至稻培養細胞中，然後利用雙草醚(BS)進行選拔。＜稻轉形培養細胞之液體培養＞於派羅克殺草碸之存在下對藉由上述方式製作之稻轉形培養細胞進行液體培養。派羅克殺草碸係以丙酮溶液之形式添加至液體培養基中。最終丙酮濃度為0.1%。於進行液體培養時，將利用KLB-279(於PalSelect R-4之MCS部分組入有Act1p(稻肌動蛋白1啟動子)::sGFP::NOSt之質體)進行轉形之稻培養細胞作為對照。藉由以下之方法進行液體培養。將Murashige-Skoog培養基用混合鹽類(MS無機鹽)1袋、10 mg/ml之鹽酸硫胺素1 ml、5 mg/ml之煙鹼酸1 ml、10 mg/ml之吡哆醇鹽酸鹽1 ml、2 mg/ml之甘胺酸1 ml、0.2 mg/ml之2,4-D 1 ml、30 g之蔗糖(sucrose)、50 mg/ml之肌醇1 ml放入至1 L之燒杯中，使pH值成為5.7，利用蒸餾水準確地設為1000 ml後，進行高壓蒸氣滅菌。於放入有50 ml該液體培養基之200 ml錐形瓶中添加0.05 ml之派羅克殺草碸後，添加以與上述相同之組成而於含有3 g之結冷膠及0.25 μM BS之固體培養基中進行增殖之對照稻培養細胞及藉由上述方式製作之稻轉形培養細胞約0.5 g，並培養14～17日。培養後將液體培養基除去，並回收稻培養細胞。進行轉形1個月，利用0.25 μM之雙草醚(BS)而選拔導入有GST基因之稻培養細胞。繼而，將於選拔培養基中增殖之新鮮稻培養細胞於錐形燒杯中大量培養約1個月後，供於利用含有派羅克殺草碸之培養基之液體培養。關於進行液體培養時之藥劑濃度，設為派羅克殺草碸不會對稻培養細胞中之脂肪酸含量產生影響之10
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M或10
-6
M(Y. Tanetani等人，Pestic. Biochem. Physiol. 95, 47-55 (2009))。再者，考慮到於變異型ALS於稻培養細胞中發揮功能之情形時會對脂肪酸含量產生影響之可能性，使用利用KLB-279(於PalSelect R-4之MCS部分組入有Act1p::sGFP::NOSt之質體)進行轉形之稻培養細胞作為比較對照(control)。＜以稻培養細胞中之脂肪酸含量為指標之派羅克殺草碸代謝活性之分析＞脂肪酸之提取係將十一碳烯酸(C11：1)作為內部標準物質而進行。作為分析標準品，使用含有C14：0、C16：0、C16：1、C18：0、C18：1、C18：2、C18：3、C20：0、C22：0、C22：1、C24：0之Supelco公司之FAME mix及其他脂肪酸甲酯(C11：1，C15：0，C20：1，C26：0)，製作各自之校準曲線而進行定量。各脂肪酸甲酯之鑑定係根據氣相層析法(GC)之保持時間與質譜而進行判斷。再者，定量及定性係利用甲酯體而進行，但定量時係基於分子量而換算為脂肪酸量。相對於培養細胞1 g，加入水10 ml、甲醇25 ml、氯仿12.5 ml，利用Microtec Nition公司之Physcotron(均質機)將培養細胞破碎。此時，加入溶解於氯仿中之內部標準[10-十一碳烯酸(C11：1)] 0.1 mg。對經破碎之溶液進行抽氣過濾後，放入至分液漏斗中，加入40 ml之氯仿及50 ml之飽和硫酸銨水溶液後，為了充分地進行脂肪酸/脂質之提取而放置30分鐘左右，進而反覆進行2次(共3次)利用氯仿之脂質之提取操作。將所回收之氯仿層放入至分液漏斗中，利用水洗淨後，將氯仿層回收至茄形燒瓶中，利用蒸發器進行濃縮。於減壓乾燥之容器中加入6 ml之25%氫氧化鉀、9 ml之乙醇，於65℃下進行1小時加熱後，恢復至室溫，加入10%鹽酸而使其成為酸性(pH值2左右)。將該溶液放入至分液漏斗中，加入50 ml之己烷並充分攪拌，反覆進行2次回收有機層之操作後，利用固體之無水硫酸鎂進行脫水而回收。將該己烷層利用蒸發器加以濃縮後，使其溶解於2 ml之混合溶劑(甲苯/甲醇＝4/1，v/v)中，將數滴濃硫酸滴加至反應系中，於80℃下使其反應1小時。於反應結束後，恢復至室溫，用pH值試紙確認已利用飽和碳酸氫鈉溶液進行中和後，回收有機層。將200 μl該有機層注入至附帶過濾器之微量離心管中，將離心後之溶液2 μl供於GC。以下，揭示GC分析條件。設備：Agilent 6890系列GC系統管柱：Supelco, Omegawax250 (長度30 m、0.25 mm I.d.、膜厚0.25 μm)注入溫度：250℃初始化溫度：100℃初始化時間：5 min速率：4℃/min最終溫度：220℃最終時間：25 min檢測器：FID檢測器溫度：250℃作為分析之結果，將於含有派羅克殺草碸之培養基中進行了液體培養之7種植物GST基因導入稻培養細胞及對照稻培養細胞、以及未進行藥劑處理之對照稻培養細胞中之脂肪酸含量示於圖18～20。再者，圖18～20中所示之資料均為一系列資料。又，圖18～20中表示針對各GST基因，對2個系統(系統1、系統2)之稻培養細胞進行脂肪酸分析之結果。於含有派羅克殺草碸之液體培養基中進行培養之稻培養細胞中，由於派羅克殺草碸之VLCFAE抑制作用，超長鏈脂肪酸(VLCFA)含量大幅度減少，相對於此，C15：0(十五酸)含量顯著蓄積(Y. Tanetani等人，Pestic. Biochem. Physiol. 95, 47-55 (2009))。基於該見解而判斷各GST有無派羅克殺草碸代謝活性。其結果為，分別導入有7種植物GST(TaQ8GTB9、ZmM16901、ZmB6T8R4、ZmQ9ZP61、ZmY12862、OsGSTF5、OsGSTU5)基因之稻培養細胞中之C15：0及VLCFA含量均與藥劑處理區之對照稻培養細胞相同，判斷該等GST不具有派羅克殺草碸代謝活性。再者，關於2種OsGST基因(F5、U5)導入稻培養細胞，其係10
-6
M處理區之結果，並無未進行藥劑處理之對照稻培養細胞之資料，但根據VLCFA及C15：0含量而判斷兩種GST均無代謝活性。＜以稻培養細胞於培養基中之增殖為指標的派羅克殺草碸代謝活性之分析＞其次，如圖21所示製作具有玉米GST基因之稻轉形用載體。再者，於本例中，對2種玉米GST基因(ZmQ9FQD1及ZmB8A3K0)分別製作稻轉形用載體，但製作操作流程相同，因此以下記載關於ZmQ9FQD1基因之稻轉形用載體之製作程序。利用由玉米(先驅物32K61)莖葉部所製備之RNA之反轉錄反應而合成cDNA。以所合成之cDNA為模板，利用ZmQ9FQD1-X、ZmQ9FQD1-Y之引子組進行PCR，而獲得ZmQ9FQD1基因片段。其次，對ZmQ9FQD1基因片段進行SalI及NotI處理，將處理後之ZmQ9FQD1基因片段作為插入物，將同樣地進行SalI及NotI處理之pENTR-1A作為載體。使用該等插入物及載體進行接合反應。將藉由上述方式製作之入門選殖(pENTR1Α-ZmQ9FQD1)導入至大腸桿菌JM109株中。其後，由藉由菌落PCR確認導入有目標質體之菌落而製備質體。藉由序列分析確認所插入之ZmQ9FQD1基因之鹼基序列正確。繼而，進行所製作之入門選殖(pENTR1Α-ZmQ9FQD1)與目標載體PalSelect R-5(Inplanta Innovations股份有限公司)之LR反應，製作表現載體(PalSelect R-5-ZmQ9FQD1)。藉由轉形將該表現載體(PalSelect R-5-ZmQ9FQD1)導入至大腸桿菌HST02株中。其後，由藉由菌落PCR確認導入有目標質體之菌落而製備質體。藉由序列分析而確認所插入之ZmQ9FQD1基因之鹼基序列。再者，2種基因均於插入至PalSelect R-5中之序列方面不同於資料庫上之序列，因此將該等之差異示於表7。[表7]
再者，表7中，「-」表示無胺基酸序列上之差異。又，以下，揭示PCR中所使用之引子組。ZmB8A3K0-X：5'-AAAAAAGTCGACATGGCGGCGGCGGCGGAG-3'(正義：序列編號23)ZmB8A3K0-Y：5'-AAAAAAGCGGCCGCTCACTTGGCCCCGAACTTG-3'(反義：序列編號24)ZmQ9FQD1-X：5'-AAAAAAGTCGACATGGCGCCGCCGATGAAG-3'(正義：序列編號25)ZmQ9FQD1-Y：5'-AAAAAAGCGGCCGCCTATGGTATGTTCCCGCTG-3'(反義：序列編號26)＜藉由轉形將GST基因導入至稻中＞藉由電穿孔法將藉由上述方式製作之2種與源自玉米之GST基因相關之稻轉形用載體(PalSelect R-5-ZmGST)導入至土壤桿菌(EHA105)中。繼而，藉由土壤桿菌法(S. Toki Plant Mol. Biol. Rep. 15 16-21(1997))將TaQ8GTC0基因導入至稻培養細胞中之後，利用雙草醚(BS)進行選拔。藉由轉形將2種玉米GST基因分別導入至稻中1個月，利用0.25 μM之雙草醚(BS)選拔導入有GST基因之稻培養細胞。結果與KLB-279(導入GFP基因代替TaQ8GTC0基因之陽性對照)同樣地確認在選拔培養基中活躍地增殖之個體，因此判斷成功地製作出2個系統之玉米GST基因導入稻培養細胞(圖22)。＜以稻培養細胞於培養基中之增殖為指標之派羅克殺草碸代謝活性之分析＞將藉由上述方式獲得之2個系統之玉米GST基因導入稻培養細胞及KLB-279轉形稻培養細胞(比較對照)接種至N6D培養基中2週後，以各稻培養細胞之增殖為指標而調查對於派羅克殺草碸之耐受性。派羅克殺草碸係以丙酮溶液之形式供於試驗，添加至培養基中時之最終丙酮濃度為1%，藥劑之最終濃度為10
-4
M。將結果示於圖23。圖23中所表示之照片係於100 μM(10
-4
M)之含有派羅克殺草碸之培養基中之稻轉形培養細胞增殖之情況。根據圖23，接種2週後，2個系統之GST基因稻培養細胞僅與比較對照同樣地肥大化。如上所述，ZmB8A3K0基因導入稻培養細胞、ZmQ9FQD1基因導入稻培養細胞與比較對照同樣地未增殖，未對派羅克殺草碸顯示出耐受性。因此，根據本例之結果判斷，2種源自玉米之GST不具有派羅克殺草碸代謝活性。以上，根據本比較例之結果明確，已知參與和派羅克殺草碸之作用機構相同之藥劑代謝的稻GST或與TaQ8GTC0同源性高之小麥及玉米GST不具有派羅克殺草碸代謝活性。因此，明確實施例1～4中所示之TaQ8GTC0對於派羅克殺草碸之代謝活性係無法根據公知資訊而容易地想到之特異性者。[比較例2]於本比較例中，針對與TaQ8GTC0胺基酸同源性最高之小麥GST(TaQ8GTC1)(品種：Hunter、寄存編號：AJ440791、同源性為78%)進行麩胱甘肽結合活性之分析。＜TaQ8GTC1基因之選殖(圖24)＞於本比較例中，使用夢香、花滿天、夢世紀、農林61號、Apache及Gatalina之6個品種之小麥。針對該等6個品種之小麥分別將利用由莖葉部製備之RNA之反轉錄反應所合成之cDNA作為模板，藉由PCR而獲得於5'末端附加有XbaI識別部位且於3'末端附加有EcoRI識別部位的TaQ8GTC1基因之ORF。將對該基因片段進行XbaI及EcoRI處理而成之TaQ8GTC1基因作為插入物，將經該限制酶處理之pBI121作為載體。使用該等插入物及載體進行接合，藉由轉形將使用該反應液所製作之載體導入至大腸桿菌JM109株中。其後，由藉由菌落PCR確認導入有目標質體之菌落而製備質體。繼而，進行序列反應而分析插入至載體中之目標基因之鹼基序列。以下，揭示PCR中所使用之引子組。TaQ8GTC1-3：5'-AAAAAATCTAGAGATCTTCAAGAAGCGGAΑ-3'(正義：序列編號27)TaQ8GTC1-4：5'-AAAAAAGAATTCTCACTTCTCTGCCTTCTTTCCGΑ-3'(反義：序列編號28)以下，揭示序列分析中所使用之引子組。序列(TaQ8GTC1)-2：5'-GACCTCACCATCTTCGAGTC-3'(正義：序列編號29)序列(TaQ8GTC1)-3：5'-CTCGTACACGTCGAACAG-3'(反義：序列編號30)由上述6個品種所獲得之TaQ8GTC1基因均為相同之鹼基序列，但與資料庫中所登記之序列不同。具體而言，本實驗中所確定之鹼基序列與資料庫中所登記之鹼基序列於構成ORF之675bp中之25個鹼基方面不同。其中13處係伴有胺基酸變異之差異。以下，將本實驗中所確定之鹼基序列之基因記載為TaQ8GTC1-R基因。將比較本實驗中所確定之鹼基序列與資料庫中所登記之鹼基序列之結果示於圖25，將以胺基酸序列進行比較之結果示於圖26。圖25中，將TaQ8GTC1-R(上段)與資料庫上之TaQ8GTC1之鹼基序列(下段)間之不同之25個鹼基括於方框中。圖26中，將藉由序列分析而明確之TaQ8GTC1-R(上段)與資料庫上之TaQ8GTC1之胺基酸序列(下段)間之不同之13個胺基酸括於方框中。又，將本實驗中所確定之鹼基序列與資料庫中所登記之鹼基序列之差異彙總於表8。再者，表8中，「-」表示雖然存在鹼基序列之差異，但胺基酸殘基相同。[表8]
再者，將藉由本實驗中所確定之鹼基序列(即TaQ8GTC1-R基因之鹼基序列)及該鹼基序列編碼之胺基酸序列分別表示於序列編號31及32。又，將資料庫中所登記之TaQ8GTC1基因之鹼基序列及由該鹼基序列所編碼之胺基酸序列分別表示於序列編號33及34。＜TaQ8GTC1-R蛋白質之大腸桿菌表現構建物之構建(圖27)＞將利用由小麥(農林61號)莖葉部製備之RNA之反轉錄反應所合成之cDNA作為模板，利用TaQ8GTC1-Z及TaQ8GTC1-4之引子組(參照下述)進行PCR，而獲得於5'末端附加有NdeI識別部位且於3'末端附加有EcoRI識別部位之TaQ8GTC1-R基因之ORF。將對本片段進行NdeI及EcoRI處理而成之TaQ8GTC1-R基因作為插入物，將經該限制酶處理之pET22b(+)作為載體。使用該等插入物及載體進行接合，藉由轉形將使用該反應液所製作之載體導入至大腸桿菌JM109株中。其後，由藉由菌落PCR確認導入有目標質體之菌落而製備質體。藉由序列分析而確認於NdeI及EcoRI切斷部位之間所插入之TaQ8GTC1-R基因之鹼基序列並無因PCR引起之錯誤，將該質體導入至大腸桿菌BL21(DE3)株中，而構建TaQ8GTC1-R蛋白質之大腸桿菌表現系(KLB-862)。以下，揭示PCR中所使用之引子組。TaQ8GTC1-Z：5'-AAAAAACATATGGCGGCGCCGGCGGTGAAGGTG-3'(正義：序列編號35)TaQ8GTC1-4：5'-AAAAAAGAATTCTCACTTCTCTGCCTTCTTTCCGΑ-3'(反義：序列編號36)＜TaQ8GTC1-R蛋白質之製備＞使用所製作之大腸桿菌BL21(DE3)株(KLB-862)進行TaQ8GTC1-R蛋白質之表現。將單菌落植菌於含有50 ppm安比西林之液體LB培養基中之後，利用試管振盪培養一夜，使用所獲得之溶液作為前培養液。將2.5 ml之前培養液添加至含有50 ppm安比西林之250 mL之液體LB培養基(1 L容量之錐形瓶)中，於37℃下以200 rpm進行培養直至OD
600
＝0.5～0.6。繼而，於冰上冷卻5分鐘後，以最終成為1 mM之方式添加IPTG，於27℃下以200 rpm進行21小時之TaQ8GTC1-R蛋白質之表現誘導，進行集菌(於4ºC、6000×g下進行10分鐘離心)，於-80ºC下保存菌體。對冷凍存儲之菌體(0.5 L培養成分)加入30 mL之PBS緩衝液(0.14 M NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na
2
HPO
4
、1.8 mM KH
2
PO
4
、pH值為7.3)，進行超音波處理 (TAITEC VP-30S、微晶片、輸出3、恆定15秒×7～8次)之後，於4℃、15,000×g下進行20分鐘離心而獲得上清液。將該粗酶溶液以1 mL/min之流速載入至利用PBS緩衝液進行平衡化之GSTrap FF管柱及GSTrap 4B管柱(均為bed vol. 1 mL)中，利用20 ml以上之PBS緩衝液將兩個麩胱甘肽親和管柱洗淨後，將2 mL之溶出緩衝液(50 mM之Tris-HCl、10 mM之還原型麩胱甘肽、pH值為8.0)注入至管柱中，使TaQ8GTC1-R蛋白質溶出(圖28)。藉由使用Nanosep (10 K)之超過濾，將該蛋白質溶液置換至PBS緩衝液中，於-80℃下進行保存。再者，蛋白質之濃度測定係採用Bradford之方法，依照TaKaRa Bradford蛋白質測定套組(Takara)之手冊而進行。＜TaQ8GTC1-R蛋白質之麩胱甘肽結合活性之分析＞於本實驗中，分析經純化之TaQ8GTC1-R蛋白質對於CDNB(2,4-二硝基氯苯)及派羅克殺草碸之麩胱甘肽結合反應。對於CDNB之活性測定係於含有634 μl之100 mM磷酸鉀緩衝液(pH值為7.6)、300 μl之3.3 mM還原型麩胱甘肽、33 μl之純化酶(含有20%甘油之PBS溶液)、33 μl之30 mM CDNB(乙醇溶液)的總共1 ml之反應系中進行。於製備除CDNB以外之反應系後，最後添加30 mM之CDNB而開始酶反應，於30℃下測定340 nm之吸光度。活性係根據分子吸光係數9.6 mM
-1
cm
-1
而算出。將添加含有20%甘油之PBS代替酶之反應系作為陰性對照區(非酶反應區)，將本反應系中之生成量作為非酶性生成量。對於派羅克殺草碸之活性測定係於包含50 μl之100 mM磷酸鉀緩衝液(pH值為6.8)、10 μl之1 mM派羅克殺草碸(丙酮溶液)、20 μl之10 mM還原型麩胱甘肽(pH值為7.0)、120 μl之TaQ8GTC1-R蛋白質(含有20%甘油之PBS溶液)的總共200 μl之系統中進行，於30℃下使其反應1小時後，將使用0.2 μm之過濾器而過濾獲得之溶液50 μl注入至HPLC中。將酶未添加區(添加含有%甘油之PBS代替TaQ8GTC1-R蛋白質)與酶及麩胱甘肽未添加區(添加含有20%甘油之PBS代替TaQ8GTC1-R蛋白質，添加滅菌水代替麩胱甘肽)作為對照區。關於下述之HPLC條件下之保持時間，派羅克殺草碸、M-15(派羅克殺草碸之麩胱甘肽結合物)依序為19.0分鐘、11.0分鐘。裝置：Agilent 1100系列管柱：CAPCELL PAK C18 AQ 4.6 mmI.D.×250 mm(資生堂)流動相：乙腈/水＝5/95(保持5 min)→(4 min)→40/60(保持4 min)→(4 min)→90/10(保持8 min)→(1 min)→5/95(保持4 min)(各溶劑含有0.5%乙酸)溫度：35℃流速：1.0 mL/min檢測：254 nm＜結果與考察＞首先，為了調查本實驗中所純化之TaQ8GTC1-R蛋白質是否具有GST活性，調查其對於標準受質CDNB(1-氯-2,4-二硝基苯)之麩胱甘肽結合活性。結果明確，對於CDNB之活性成為2.17 μmol/min/mg蛋白質(n＝2)，純化酶具有GST活性。繼而，調查TaQ8GTC1-R蛋白質對於派羅克殺草碸之結合活性。結合活性試驗係於酶添加區(酶性、非酶性地生成麩胱甘肽結合物)、酶未添加區(非酶性地生成麩胱甘肽結合物)、酶及麩胱甘肽未添加區(作為母化合物而殘存)之3個反應系中進行。關於酶添加區所添加之蛋白質量，於相同條件下調查約400 ng之TaQ8GTC0(參照實施例1)之結合活性之情形時，所添加之除草劑之總共10 nmol中之約50%轉化為麩胱甘肽結合物，據此設為500 ng。進行TaQ8GTC1-R蛋白質之結合活性試驗，結果於將派羅克殺草碸作為受質之情形時，於酶添加區及酶未添加區所生成之麩胱甘肽結合物同等(於反應系中所添加之派羅克殺草碸之約3%轉化為M-15)(圖29)。如上所述，酶添加區與酶未添加區之麩胱甘肽結合物之生成量並無有意義之差，由此顯示本例中所純化之TaQ8GTC1-R蛋白質對於派羅克殺草碸不具有結合活性。如實施例1等所述，與TaQ8GTC1-R具有約80%之胺基酸同源性之TaQ8GTC0對於VLCFAE抑制劑中之派羅克殺草碸顯示出特別高之結合活性，相對於此，TaQ8GTC1-R蛋白質未顯示活性。如此，甚至類似度相對較高之GST亦無對於派羅克殺草碸之結合活性，因此認為實施例1～3中所示之TaQ8GTC0之派羅克殺草碸結合活性之特異性較高。另一方面，關於參與如下植物GST之受質識別之胺基酸殘基，可藉由受質與GST複合體之X射線晶體結構分析而明確(P Reinemer等人，J. Mol. Biol. 255, 289-309 (1996)、T. Neuefeind等人，J. Mol. Biol. 274, 446-453 (1997)、H. Pegeot等人，flontiers in Plant Science 5, 1-15 (2014)及T. Neuefeind等人，J. Mol. Biol. 274, 446-453 (1997))，該植物GST係與實施例1～3中所示之源自小麥之GST中之具有派羅克殺草碸代謝活性之TaQ8GTC0(TaGSTF3)同樣地被分類為Phi型。於各種植物GST胺基酸序列之多重比對中，將推定受質識別部位示於圖30，將由上述論文明確之形成受質識別部位之胺基酸彙總於表9。再者，於圖30中，2處之推定受質識別部位括於方框中，用粗字(附下劃線)表示構成推定受質識別部位之胺基酸。再者，將圖30中所示之源自阿拉伯芥之AtGSTF2之胺基酸序列示於序列編號37，將源自楊樹(poplar)之PttGSTF1之胺基酸序列示於序列編號38，將源自玉米之ZmGSTF1之胺基酸序列示於序列編號39，將源自小麥之TaGSTF1之胺基酸序列示於序列編號40，將源自小麥之TaGSTF4之胺基酸序列示於序列編號41，將源自小麥之TaGSTF5之胺基酸序列示於序列編號42，將源自小麥之TaGSTF6之胺基酸序列示於序列編號43。再者，將圖30中之源自小麥之TaGSTF2-R之胺基酸序列示於序列編號32，將源自小麥之TaGSTF3之胺基酸序列示於序列編號2。[表9]
表9中，1)係Structure 6, 1445-1452 (1998)、2)係J. Mol. Biol. 255, 289-309 (1996)、3)係J. Mol. Biol. 274, 446-453 (1997)及4)係Flontiers in Plant Science 5, 1-15 (2014)。根據圖30及表9得知，與受質識別相關之胺基酸(與TaGSTF3(TaQ8GTC0)之胺基酸序列對應)主要分佈於GST之第5～15號附近之區域11與第115～125號附近之區域2。因此，將該等2個區域推定為GST之受質識別部位，關於各區域(區域1為10個胺基酸、區域2為12個胺基酸)，調查與TaGSTF3(TaQ8GTC0)之胺基酸序列之同源性。其結果為，關於區域1，TaGSTF3(TaQ8GTC0)與TaGSTF1、TaGSTF2-R、TaGSTF4、TaGSTF5及TaGSTF6之間之同源性分別為40%、80%、80%、40%及50%。又，關於區域2，TaGSTF3(TaQ8GTC0)與TaGSTF1、TaGSTF2-R、TaGSTF4、TaGSTF5及TaGSTF6之間之同源性分別為45%、64%、55%、45%及18%。再者，TaGSTF1、TaGSTF2-R、TaGSTF3(TaQ8GTC0)、TaGSTF4、TaGSTF5及TaGSTF6係於I. Cummins等人，Plant Mol. Biol. 52, 591-603 (2003)中揭示為被分類為Phi型之源自小麥之GST者。得知關於區域1及2，相對於TaQ8GTC0(TaGSTF3)之胺基酸同源性最高者均為TaGSTF2-R(TaQ8GTC1-R)。根據TaGSTF2-R(TaQ8GTC1-R)不顯示派羅克殺草碸代謝活性之情況，認為實施例1～3中所示之TaGSTF3(TaQ8GTC0)非常特異性地代謝派羅克殺草碸。[比較例3]於本比較例中，進行導入有比較例2中所選殖之TaQ8GTC1-R基因的重組稻之製作及與該重組稻相關之抗藥性之分析。＜TaQ8GTC1-R基因之稻轉形用載體(R-5-TaQ8GTC1-R)之製作(圖31)＞將利用由小麥(農林61號)莖葉部製備之RNA之反轉錄反應所合成之cDNA作為模板，利用TaQ8GTC1-X、TaQ8GTC1-Y之引子組進行PCR，而獲得TaQ8GTC1-R基因(ORF)。將對該片段之5'末端進行SalI處理且對3'末端進行NotI處理之TaQ8GTC1-R基因片段作為插入物，將經該限制酶處理之pENTR-1A作為載體。使用該等插入物及載體進行接合，藉由轉形將所製作之入門選殖(pENTR1Α-TaQ8GTC1-R)導入至大腸桿菌JM109株中。其後，由藉由菌落PC確認導入有目標質體之菌落而製備質體，藉由序列分析而確認於SalI及NotI切斷部位之間所插入之TaQ8GTC1-R基因之鹼基序列正確。繼而，進行所製作之入門選殖(pENTR1Α-TaQ8GTC1-R)與目標載體R-5 (PalSelect pSTARA)之LR反應，藉由轉形將所製作之表現載體(於R-5之attB序列間插入有TaQ8GTC1-R基因之稻轉形用載體)導入至大腸桿菌HST02株中。其後，由藉由菌落PCR確認導入有目標質體之菌落而製備質體，藉由序列分析確認到於attB序列間所插入之TaQ8GTC1-R基因之鹼基序列正確。以下，揭示PCR中所使用之引子組。TaQ8GTC1-X：5'-AAAAAAGTCGACATGGCGGCGCCGGCGGTGAAGG-3'(正義：序列編號44)TaQ8GTC1-Y：5'-AAAAAAGCGGCCGCTCACTTCTCTGCCTTCTT-3'(反義：序列編號45)＜藉由轉形將TaQ8GTC1-R基因導入至稻中＞將所製作之TaQ8GTC1-R基因插入至PalSelect R-5中，將所獲得之稻轉形用載體(PalSelect R-5-TaQ8GTC1-R)藉由電穿孔法而導入至土壤桿菌(EHA105)中(KLB-872)。繼而，藉由土壤桿菌法將TaQ8GTC1-R基因導入至稻培養細胞中之後，利用雙草醚(BS)進行選拔。藉由轉形將TaQ8GTC1-R基因導入至稻中1個月，利用0.25 μM之雙草醚(BS)選拔導入有TaQ8GTC1-R基因之稻培養細胞，確認到於選拔培養基中增殖之重組稻培養細胞(圖32)。因此，於將該等轉形稻培養細胞移植於未添加藥劑之再分化培養基中之後，針對所獲得之植物體，依次進行於隔離溫室中之栽培。自隔離溫室中之栽培開始起平均2個月，所有植物體確認到出穗，自該等植物體採集後代種子(T1)。＜TaQ8GTC1-R基因導入稻對於派羅克殺草碸之感受性試驗＞針對2個系統(KLB-872#3-11及KLB-872#2-4)，藉由以結冷膠為培養基之發芽生長抑制試驗而調查對於派羅克殺草碸之耐受性。首先，使Hoagland mix與3 g之結冷膠懸浮於1 L之蒸餾水中之後，利用微波爐進行加溫而使之充分溶解。將所獲得之懸浮液15 ml在尚未冷卻之前注入至管瓶中(於培養盤中注入30 ml)。於混練藥劑時，於注入至管瓶或培養盤中之時同時添加並進行充分混合。將稻穀於稀釋50倍之次氯酸鈉溶液(安替福民)(和光)中浸漬20分鐘左右之後，充分水洗。將經滅菌處理之種子浸於蒸餾水中，於27℃下進行靜置直至催芽(約2日)。使催芽種子之芽朝上，輕輕地埋入至含有0.25 μM BS之結冷膠培養基(培養盤)中。將該等與放入有蒸餾水之燒杯一同放入至透明盒子中，利用保鮮膜封蓋並於27℃、螢光燈照明下(光期14小時、暗期10小時)下使其生長2日。其後，將以根部之延伸為指標而判斷具有BS耐受性之稻種子移植至含有派羅克殺草碸(最終濃度為10
-8
、10
-7
、10
-6
、10
-5
)之結冷膠培養基(管瓶)中。繼而，將該等與放入有蒸餾水之燒杯一同放入至透明盒子中，利用保鮮膜封蓋並於27℃、螢光燈照明下(光期14小時、暗期10小時)使其生長4～5日，然後測定作物高度。藥劑之抑制係以作物高度為指標而算出相對於藥劑未添加區之生長抑制率，生長抑制50%濃度(I
50
值)係藉由Probit法而求出。＜結果與考察＞將上述TaQ8GTC1-R基因導入稻(KLB-872#3-11及KLB-872#2-4)對於派羅克殺草碸之耐受性試驗之結果示於圖33。供於試驗之2個系統均於派羅克殺草碸感受性方面與野生型同等。由該結果推測，TaQ8GTC1-R基因導入稻對派羅克殺草碸不顯示耐受性。[實施例5]於本實施例中，製作導入有TaQ8GTC0基因之轉形西洋油菜(Brassica napus)，試驗該轉形西洋油菜對於派羅克殺草碸之感受性，上述TaQ8GTC0基因於實施例1～3中顯示出具有對於派羅克殺草碸之結合活性。＜TaQ8GTC0基因之西洋油菜轉形用載體之製作(圖34)＞將利用由小麥(農林61號)莖葉部製備之RNA之反轉錄反應所合成之cDNA作為模板，利用TaQ8GTC0-IF-Blunt End(XbaI)、TaQ8GTC0-IF-Blunt End(SacI)之引子組進行PCR，而獲得TaQ8GTC0基因之ORF。與該基因片段進行XbaI及SacI處理之後，使用利用T
4
DNA 聚合酶進行平滑化之pBI121而進行In-Fusion反應，藉由轉形將所製成之西洋油菜轉形用質體(TaQ8GTC0 in pBI121)導入至大腸桿菌JM109株中。其後，由藉由菌落PCR確認導入有目標質體之菌落而製備質體，藉由序列分析而確認於XbaI及SacI切斷部位之間所插入之TaQ8GTC0基因之鹼基序列正確。以下，記載PCR中所使用之引子。TaQ8GTC0-IF-Blunt End(XbaI)：5'-CACGGGGGACTCTAGATGGCGCCGGCGGTGAAGGT-3'(正義：序列編號46)TaQ8GTC0-IF-Blunt End(SacI)：5'-GATCGGGGAAATTCGCTACTCTGCTTTCTTTCCAΑ-3'(反義：序列編號47)＜藉由轉形將TaQ8GTC0基因導入至西洋油菜中＞將所製作之TaQ8GTC0基因插入至pBI121中，將所獲得之西洋油菜轉形用載體(pBI121-TaQ8GTC0)藉由電穿孔法導入至土壤桿菌(GV3101)中(KLB-858)。繼而，藉由土壤桿菌法將TaQ8GTC0基因導入至西洋油菜中，然後利用康黴素進行選拔。＜於轉形西洋油菜中之基因導入確認＞使用DNeasy Plant迷你套組而製備重組西洋油菜之基因組DNA。其後，藉由以該基因組DNA為模板之PCR而確認目標構建物之導入。PCR係於總共25 μl之反應系(2 μl之模板、0.25 μl之50 μM正義引子、0.25 μl之50 μM反義引子、2.5 μl之2 mM dNTP混合物、5 μl之Phire反應緩衝液、0.5 μl之Phire熱啟動DNA聚合酶、14.5 μl之滅菌水)中進行。CR係初期變性：於98℃下進行20 sec，變性：於98℃下進行20 sec，退火：於58℃下進行15 sec，延伸：於72℃下進行30 sec(40個循環)，最終延伸：於72℃下進行4 min。又，確認T-DNA區域之導入時所使用之引子之鹼基序列如下所示。NOSP-2：5'-CGCCTAAGGTCACTATCAGCTAGC-3'(反義：序列編號48)連接子(pBI121)-2：5'-GAACTCCAGCATGAGATC-3'(反義：序列編號49)CAM35S-1：5'-AGAGGACCTAACAGAACTCGCC-3'(正義：序列編號50)TaQ8GTC0-2：5'-AAAAAACTTAAGCTACTCTGCTTTCTTTCC-3'(反義：序列編號51)其次，使用藉由電穿孔而導入有如下西洋油菜轉形用載體之土壤桿菌GV3101株(KLB-858)，藉由轉形而對西洋油菜導入TaQ8GTC0基因，該西洋油菜轉形用載體係對以康黴素作為選拔試劑之pBI121導入TaQ8GTC0基因而成。其結果為，獲得認為係目標轉形體之1株個體(圖35；圖中，將所獲得之1株個體括於方框中)。因此，以自該重組西洋油菜提取之基因組DNA為模板進行PCR，結果明確導入有T-DNA區域中所含之2個構建物(PNOS::NPTII::TNOS、P35S::TaQ8GTC0::TNOS)，所獲得之個體係目標重組西洋油菜(圖36)。關於該重組西洋油菜，繼續人工氣候室中之栽培，並採取T1種子。＜TaQ8GTC0基因導入西洋油菜之派羅克殺草碸感受性試驗＞[西洋油菜感受性試驗1(播種後出芽前土壤處理)]於西洋油菜感受性試驗1中，供試野生型西洋油菜(品種：Westar)及小麥GST基因導入西洋油菜，試驗規模係於方形白色塑膠盆(長8 cm、寬8 cm、高6 cm)中，供試土壤為富士土(砂壤土)，每1盆中播種野生型西洋油菜種子4粒、重組西洋油菜種子8粒(播種深度為1 cm)。作為藥劑，供試含有50%派羅克殺草碸之顆粒水合劑，以1、4、16、63、250 g a.i./ha之5個劑量重複進行3次。處理後立即用降雨裝置人工進行約1 mm之降雨，然後自盆下方給水。其後，於盆表面乾燥之時間點，適當自盆下方給水。[結果與考察]進行派羅克殺草碸之發芽前土壤處理試驗(溫度22℃、螢光燈)，自作物高度與作用症狀及子葉生長之觀點考慮，分析小麥GST重組西洋油菜有無派羅克殺草碸耐受性。具體而言，於西洋油菜種子之播種及藥劑散佈之2週後，測定各處理區生長出之植物體之作物高度，算出對於西洋油菜生長之抑制率(n＝4～12)。將試驗結果示於圖37～圖39。圖37～圖39中，「TaGST」表示TaQ8GTC0基因重組西洋油菜。圖38中所示之表之數值係表示平均±標準偏差(n＝4～12)。根據所明確之對於野生型及重組西洋油菜之作物高度之抑制率，於處理劑量為4～63 g a.i./ha、尤其是16 g a.i./ha時，派羅克殺草碸對於重組西洋油菜之生長抑制率低於野生型西洋油菜(重組體、野生型依次為48.2%、61.9%)。又，於以作用症狀為指標之情形時，野生型西洋油菜於16 g a.i./ha以上時子葉濃綠化，相對於此，對於重組西洋油菜未確認到該症狀。子葉之生長亦如此，野生型西洋油菜於16 g a.i./ha以上時被完全抑制，相對於此，重組西洋油菜即使為250 g a.i./ha亦相應地生長(圖39)。綜合以上結果而明確，於派羅克殺草碸之播種後出芽前土壤處理試驗(22℃、螢光燈)中，自西洋油菜作物高度與作用症狀及子葉生長之觀點考慮，與野生型西洋油菜相比，所製作之TaG8QGTC0基因導入西洋油菜對於派羅克殺草碸具有耐受性。[西洋油菜感受性試驗2(瓊脂培養基)]根據上述之播種後發芽前土壤處理試驗之結果，明確TaG8QGTC0基因導入西洋油菜對派羅克殺草碸顯示出耐受性。因此，為了調查該TaG8QGTC0基因導入西洋油菜具有多少倍程度之耐受性，進行能夠直接分析藥劑之影響的於瓊脂培養基中之西洋油菜生長抑制試驗。將野生型西洋油菜(品種：Westar)及TaQ8GTC0基因導入西洋油菜供於試驗，進行於瓊脂培養基中之生長抑制試驗，而調查對於派羅克殺草碸之耐受性。於該試驗中，培養基之組成(1 L)係1×Murashige-Skoog(MS)培養基(1袋)、鹽酸硫胺素(3 μg/ml)、煙鹼酸(5 μg/ml)、吡哆醇鹽酸鹽(0.5 μg/ml)、1%(w/v)蔗糖。於1 L燒杯中加入上述組成，將pH值調整為5.7，定容為1 L並加入8 g (0.8%)之瓊脂。其後，進行高壓蒸氣滅菌，冷卻至室溫，添加特定濃度之派羅克殺草碸(丙酮溶液)。將該溶液每次50 ml分注至種植箱中(此時，亦製作分注有30 ml未添加藥劑之溶液的培養盤)。於進行西洋油菜之感受性試驗時，將必須量之西洋油菜乾燥種子於70%乙醇中攪拌2分鐘，於次氯酸(0.02% Triton-X-100)中攪拌15分鐘，利用滅菌水進行10次洗淨。將該等種子於所製作之未添加藥劑之培養盤之培養基表面接種30粒左右，於22℃下、2～3日後，將發芽之幼苗每次5粒埋入至各培養基(種植箱)中。其後，於22℃下使其生長2週後，獲得資料。[結果與考察]於複數種濃度(0.1 μM、1 μM、10 μM、100 μM)之含有派羅克殺草碸之瓊脂培養基中進行西洋油菜之感受性試驗。將試驗結果示於圖40～圖43。圖40係使用野生型西洋油菜之結果，表中所表示之數值係平均±標準偏差(n＝4～5)。圖41～43係使用TaG8QGTC0基因導入西洋油菜(於圖中記載為TaGST)之結果。圖41及42之表中所表示之數值係平均±標準偏差(n＝4～5)。圖43中所表示之數值係平均值(n＝4～5)。根據所明確之對於西洋油菜之作物高度抑制率及真葉之生長抑制率，0.1 μM添加區之對於野生型西洋油菜之抑制率(作物高度抑制率、真葉之生長抑制率依次為8.9±2.8%、8.4±1.4%)與10 μM添加區之對於小麥GST重組西洋油菜之抑制率(作物高度抑制率、真葉之生長抑制率依次為7.8±5.9%、1.2±2.7%)同等。因此，明確TaG8QGTC0基因導入西洋油菜與野生型相比，具有約100倍之派羅克殺草碸耐受性。以上，根據TaG8QGTC0基因導入西洋油菜之對於派羅克殺草碸之感受性試驗(播種後出芽前土壤處理、瓊脂培養基)之結果推測：TaG8QGTC0基因導入西洋油菜與野生型西洋油菜相比，對派羅克殺草碸具有耐受性，其耐受性為約100倍左右。如上所述，明確實施例1～3中已明確具有派羅克殺草碸代謝活性之TaQ8GTC0對於西洋油菜亦發揮功能，對派羅克殺草碸賦予耐受性。[實施例6]於本實施例中，試驗導入有TaQ8GTC0基因之轉形阿拉伯芥(實施例3參照)對於高溫壓力之耐受性。＜TaQ8GTC0基因導入阿拉伯芥的高溫壓力耐受性試驗＞用以調查實施例3中所製作之導入有TaQ8GTC0基因之轉形阿拉伯芥之高溫耐受性的培養基係藉由如下方式製作。首先，將Murashige-Skoog(MS)培養基(1袋)、鹽酸硫胺素(3 mg)、煙鹼酸(5 mg)、吡哆醇鹽酸鹽(0.5 mg)、蔗糖(10 g)加入至1 L燒杯中，將pH值調整為5.7，並定容為1 L之後，加入8 g (0.8%)之瓊脂。對其進行高壓蒸氣滅菌後，冷卻至室溫，將其30 ml分注於培養盤中。使用該等培養基，藉由以下方法進行實施例3中所製作之轉形阿拉伯芥之高溫壓力耐受性試驗。將必須量之阿拉伯芥之乾燥種子於70%乙醇中攪拌2分鐘，於次氯酸(0.02% Triton-X-100)中攪拌15分鐘，利用滅菌水進行10次洗淨。繼而，使種子懸浮於高壓蒸氣滅菌之0.1%瓊脂溶液1 ml中，將該懸浮液接種於培養基表面，藉此每培養盤中播種30粒左右。利用醫用膠帶加以密封，於4℃下放置2日。移至22℃使其生長11日後，進行高溫處理(50℃、40分鐘)，進而使其生長6日。[結果與考察]將野生型阿拉伯芥(Columbia-0)作為比較對照而進行高溫壓力處理後，以植物體之表現型為指標而調查TaQ8GTC0基因導入阿拉伯芥有無高溫耐受性。於試驗中，將野生型及3個系統之重組阿拉伯芥(1-1-3、1-1-5、1-2-12)供於試驗。其結果為，由於高溫處理而白化(完全枯死)之植物體之比例於野生型中為74%(26/35)，相對於此，於TaQ8GTC0基因導入重組體中1-1-3、1-1-5、1-2-12依序為0%(0/11)、24%(8/34)、26%(10/38)(括號內係白化之個體數/供於試驗之個體數)。由該等結果明確：與野生型相比，TaQ8GTC0基因導入阿拉伯芥因高溫處理所受之影響較小，所製作之TaQ8GTC0基因導入阿拉伯芥具有高溫壓力耐受性。因此，根據如實施例4所示TaQ8GTC0基因導入稻具有高溫耐受性之情況，顯示出TaQ8GTC0基因對於單子葉至雙子葉之廣泛植物發揮功能，不僅賦予除草劑耐受性而且亦賦予高溫壓力耐受性。[實施例7]於本實施例中，針對實施例5中所製作之導入有TaQ8GTC0基因之轉形西洋油菜(Brassica napus)，試驗有無高溫耐受性。＜TaQ8GTC0基因導入西洋油菜之高溫壓力耐受性試驗＞用以調查實施例5中所製作之導入有TaQ8GTC0基因之轉形西洋油菜之高溫耐受性的培養基係藉由如下方式製作。首先，將Murashige-Skoog(MS)培養基(1袋)、鹽酸硫胺素(3 mg)、煙鹼酸(5 mg)、吡哆醇鹽酸鹽(0.5 mg)、蔗糖(10 g)加入至1 L燒杯中，將pH值調整為5.7，定容為1 L之後，加入8 g(0.8%)之瓊脂。對其進行高壓蒸氣滅菌後，冷卻至室溫，將其70 ml分注至種植箱中。使用該等培養基，藉由以下方法進行於實施例5中所製作之轉形西洋油菜之高溫壓力耐受性試驗。將必須量之西洋油菜之乾燥種子於70%乙醇中攪拌2分鐘，於次氯酸(0.02% Triton-X-100)中攪拌15分鐘，利用滅菌水進行10次洗淨。繼而，將種子接種於上述所製作之培養基表面5粒左右。利用封口膜進行密封，於22℃下使其生長4日後，進行高溫處理(於50℃下進行1小時或於50℃下進行2.5小時)，進而於隔離溫室中使其生長4日。[結果與考察]將野生型西洋油菜(Westar)作為比較對照進行高溫壓力處理後，調查TaQ8GTC0基因導入西洋油菜有無高溫耐受性。其結果為，於試驗1(於50℃下進行1小時處理)中，TaQ8GTC0基因導入西洋油菜之作物高度與野生型相比顯著較大(圖44)。再者，圖44中所示之表之值係表示平均±標準偏差(n＝3～7)。又，於試驗2(於50℃下進行2小時半處理)中，關於白化(完全枯死)之個體之比例，野生型西洋油菜、TaQ8GTC0基因導入西洋油菜依序為75%(3/4)、20%(1/5)，TaQ8GTC0基因導入西洋油菜白化之比例與野生型西洋油菜相比顯著較小(括號內係白化之個體數/供於試驗之個體數)。根據該等結果，若於2個試驗中分別以作物高度、白化之個體之比例為指標，則明確：與野生型西洋油菜相比，TaQ8GTC0基因導入西洋油菜因高溫處理所受之影響較小，於實施例5中所製作之TaQ8GTC0基因導入西洋油菜具有高溫壓力耐受性。因此，顯示源自小麥之TaQ8GTC0基因對於西洋油菜亦發揮功能，不僅賦予除草劑耐受性而且亦賦予高溫壓力耐受性。