KR20190024972A - 제초제 내성을 갖는 형질전환 식물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피록시술폰 등의 이속사졸린 유도체에 대한 대사·해독 활성화를 나타내는 글루타티온-S-트란스퍼라제를 특정한다. 이하의 (a) 또는 (b)의 단백질을 암호화하는 핵산을 도입한 형질전환 식물을 이속사졸린 유도체의 존재하에서 재배하는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물의 재배방법:
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한 단백질;
(b) 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질.

Description

제초제 내성을 갖는 형질전환 식물
본 발명은 피록사술폰(pyroxasulfone) 및 페녹사술폰(fenoxasulfone) 등 이속사졸린(isoxazoline) 유도체에 대한 내성을 갖는 형질전환 식물체에 관한 것이다.
이속사졸린 골격을 갖는 화합물(즉, 이속사졸린 유도체)은 제초제 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 또한, "이속사졸린 골격(isoxazoline moiety)"은 "이소옥사졸린 골격(isooxazoline moiety)"으로도 불려진다. 이속사졸린 유도체로는 비특허문헌 1에 기재된 바와 같이, 우수한 제초효과와 작물·잡초 간의 선택성을 가지는 것으로 피록사술폰 등의 화합물이 개발되고 있다. 피록사술폰(pyroxasulfone)은 식물 표피의 왁스층과 세포막의 스핑고 지질(sphingolipid)의 주성분인 초장쇄 지방산의 생합성을 촉매하는 초장쇄 지방산 신장효소(VLCFAE: very-long-chain fatty acid elongase)를 작용점으로 하는 제초제이다.
피록사술폰은 벼과 잡초(Gramineae weed)와 광엽 잡초(broadleaf weed) 뿐만 아니라, 기존의 저항성 잡초에 대해서도 높은 제초효과를 나타내는 밭 작물(upland crop) 제초제인 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1). 특히, 피록사술폰은 밀 등의 작물에 안전성을 가지고 있다. 한편, 유채, 보리, 벼 등은 피록사술폰에 대한 감수성이 높은 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1 및 2). 따라서, 유채, 보리, 벼 등에 대해 피록사술폰은 제초제 농약으로 등록이 이루어지고 있지는 않았다.
또한, 피록사술폰은 글루타티온-S-트랜스퍼라제(glutathione-S-transferase, GST)에 의한 약물대사와 밀에서의 내성(밀 선택성)이 관련될 가능성이 제시되고 있다(비특허문헌 3). 일반적으로 농약의 글루타티온 포합(glutathione conjugation)에 의한 대사·해독에 대해 많이 보고되어 왔다(비특허문헌 4~7). 특히 글루타티온 포합에 의한 대사·해독은 피록사술폰 뿐만 아니라, VLCFAE 저해형 제초제인 클로로아세트아미드(chloroacetamide) 계 화합물의 작물 잡초 간의 선택성에 관여하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 8~10).
GST는 식물에 여러 분자종이 존재하는 것으로 알려져 있다. 비특허문헌 11에는 옥수수 유래의 GST(GSTI, ZmM16901)는 클로로아세트아미드 계의 알라클로르(alachlor)에 대해 높은 포합 활성(conjugation activity)을 나타내는 반면, 구조가 매우 유사한 메톨라클로르(metolalachlor) 포합활성을 나타내지 않는 것으로 개시되어 있다. 또한, 비특허문헌 12에는 ZmGSTI과 가장 상동성이 높은(아미노산 서열의 상동성은 약 56%) ZmGST8(ZmQ9FQD1)이 알라클로르에 포합활성을 나타내지 않는 것이 개시되어 있다. 이와 같이, GST의 기질 특이성이 높기 때문에 특정 약제를 대사하는 GST의 분자종을 동정하는 것은, 상술한 약제에 유사한 화합물을 기질로 하는 GST가 공지되어 있다 하더라도 매우 곤란하다.
또한, 식물 GST는 직접적으로 산화 스트레스를 감소시켜(비특허문헌 13), 소금, 건조 온도, 제초제 등의 다양한 스트레스에 내성을 부여하는 것으로 알려져 있지만(비특허문헌 14), 제초제 내성 및 고온 내성을 동시에 부여하는 유전자에 관한 보고예는 없다. 또한, GST 및 GPX(글루타티온 퍼옥시다제)를 모두 도입하여 식물에 고온 내성을 부여하였다는 보고는 존재하지만(비특허문헌 15), GST 독자적으로 고온 내성을 부여하였다는 보고예는 존재하지 않는다.
미합중국 특허 US 6,730,828
비특허문헌 1: Y. Tanetani 등, Pestic. Biochem. Physiol. 95, 47-55(2009) 비특허문헌 2: Y. Tanetani 등, J. Pestic. Sci. 36, 221-228(2011) 비특허문헌 3: Y. Tanetani 등, J. Pestic. Sci. 38, 152-156(2013) 비특허문헌 4: E. Boyland 등, Adv. Enzymol. Relat. Areas. Mol. Biol. 32, 173-219(1969) 비특허문헌 5: B. Mannervik Adv. Enzymol. Relat. Areas. Mol. Biol. 57, 357-417(1985) 비특허문헌 6: PJ Hatton 등, Pestic. Sci. 46, 267-275(1996). 비특허문헌 7: DP Dixon 등, Genome Biol. 3, 1-10(2002) 비특허문헌 8: GL Lamoureux 등, J. Agric. Food Chem. 19, 346-350(1971). 비특허문헌 9: JRC Leavitt 등, J. Agric. Food. Chem. 27, 533-536(1979). 비특허문헌 10: T. Mozer 등, Biochemistry 22, 1068-1072(1983) 비특허문헌 11: M. Karavangeli 등, Biomolecular Engineering 22, 121 -128(2005) 비특허문헌 12: I. Cummins 등, Plant Mol. Biol. 52, 591-603(2003) 비특허문헌 13: I. Cummins 등, Plant J. 18, 285-292(1999) 비특허문헌 14: R Edwars & DP Dixson, Methods Enzymo l. 401, 169-186(2005) 비특허문헌 15: VP Roxas 등, Plant Cell Physiol. 41, 1229-1234(2000)
따라서, 본 발명은 피록사술폰 등의 이속사졸린 유도체에 대한 대사·해독 활성을 나타내는 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 특정하고, 상기 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 이용하여 이속사졸린 유도체에 대한 내성을 갖는 형질전환 식물을 제공하는 동시에, 상기 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 발현하는 식물에 이속사졸린 유도체를 제초제로 이용하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상술한 목적을 달성하기 위해 본 발명자들이 예의 검토한 결과, 피록사술폰 등의 이속사졸린 유도체에 대한 대사·해독 활성을 나타내는 밀에 존재하는 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 동정하는데 성공하고, 상기 글루타티온-S-트랜스퍼라제의 이속사졸린 유도체에 대한 기질 특이성이 매우 높다는 사실과, 놀랍게도 그 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)를 도입한 형질전환 식물이 우수한 스트레스 내성을 획득하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 다음을 포함한다.
(1) 이하의 (a) 또는 (b)의 단백질을 암호화하는 핵산을 도입한 형질전환 식물을 이속사졸린 유도체의 존재하에 재배하는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물의 재배방법:
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(b) 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질.
(2) 이속사졸린 유도체는 피록사술폰 및/또는 페녹사술폰인 것을 특징으로 하는 (1)항 기재의 재배방법.
(3) 형질전환 식물은 이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 갖는 식물 유래인 것을 특징으로 하는 (1)항 기재의 재배방법.
(4) 이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 가진 식물은 벼과 식물인 것을 특징으로 하는 (3)항 기재의 재배방법.
(5) 벼과 식물은 벼인 것을 특징으로 하는 (4)항 기재의 재배방법.
(6) 이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 가진 식물은 십자화과 (Brassicaceae), 콩과(Leguminosae), 미나리과(Umbelliferae), 비름과 (Amaranthaceae), 꿀풀과(Labiatae), 명아주과(Chenopodiaceae), 장미과(Rosaceae), 국화과(Compositae), 가지과(Solanaceae) 또는 아욱과(Malvaceae) 식물인 것을 특징으로 하는 (3)항 기재의 재배방법.
(7) 십자화과 식물은 유채(Brassica napus) 또는 애기장대(Arabidopsis thaliana)인 것을 특징으로 하는 (6)항 기재의 재배방법.
(8) 이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 갖는 식물에 대하여 이하의 (a) 또는 (b)의 단백질을 암호화하는 핵산을 도입하는 것을 특징으로 하는 이속사졸린 유도체에 대한 내성 부여방법:
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(b) 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질.
(9) 이속사졸린 유도체는 피록사술폰 및/또는 페녹사술폰인 것을 특징으로 하는 (8)항 기재의 내성 부여방법.
(10) 이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 가진 식물은 벼과 식물인 것을 특징으로 하는 (8)항 기재의 내성 부여방법.
(11) 벼과 식물은 벼인 것을 특징으로 하는 (10)항 기재의 내성 부여방법.
(12) 이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 가진 식물은 십자화과 (Brassicaceae), 콩과(Leguminosae), 미나리과(Umbelliferae), 비름과 (Amaranthaceae), 꿀풀과 (Labiatae), 명아주과(Chenopodiaceae), 장미과(Rosaceae), 국화과(Compositae), 가지과(Solanaceae) 또는 아욱과(Malvaceae) 식물인 것을 특징으로 하는 (8)항 기재의 내성 부여방법.
(13) 십자화과 식물은 유채(Brassica napus) 또는 애기장대(Arabidopsis thaliana)인 것을 특징으로 하는 (12)항 기재의 내성 부여방법.
(14) 식물에 대하여 이하의 (a) 또는 (b)의 단백질을 암호화하는 핵산을 도입하는 것을 특징으로 하는 환경 스트레스에 대한 내성 부여방법:
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(b) 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질.
(15) 환경 스트레스는 고온 스트레스인 것을 특징으로 하는 (14)항 기재의 내성 부여방법.
(16) 식물은 이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 갖는 식물인 것을 특징으로 하는 (14)항 기재의 내성 부여방법.
(17) 이속사졸린 유도체는 피록사술폰 및/또는 페녹사술폰인 것을 특징으로 하는 (16)항 기재의 내성 부여방법.
(18) 식물은 벼과 식물인 것을 특징으로 하는 (14)항 기재의 내성 부여방법.
(19) 벼과 식물은 벼인 것을 특징으로 하는 (18)항 기재의 내성 부여방법.
(20) 식물은 십자화과(Brassicaceae), 콩과(Leguminosae), 미나리과 (Umbelliferae), 비름과(Amaranthaceae), 꿀풀과(Labiatae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 장미과(Rosaceae), 국화과(Compositae), 가지과(Solanaceae) 또는 아욱과(Malvaceae) 식물인 것을 특징으로 하는 (14)항 기재의 내성 부여방법.
(21) 십자화과 식물은 유채(Brassica napus) 또는 애기장대(Arabidopsis thaliana)인 것을 특징으로 하는 (20)항 기재의 내성 부여방법.
(22) 이하의 (a) 또는 (b)의 단백질을 암호화하는 핵산을 도입한 형질전환 식물:
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(b) 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질.
(23) 이속사졸린 유도체에 대한 내성 및/또는 환경 스트레스에 대한 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 (22)항 기재의 형질전환 식물.
(24) 이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 갖는 식물에 대하여 상기 핵산을 도입한 것을 특징으로 하는 (22)항 기재의 형질전환 식물.
(25) 이속사졸린 유도체는 피록사술폰 및/또는 페녹사술폰인 것을 특징으로 하는 (23)항 또는 (24)항 기재의 형질전환 식물.
(26) 환경 스트레스는 고온 스트레스인 것을 특징으로 하는 (23)항 기재의 형질전환 식물.
(27) 이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 가진 식물은 벼과 식물인 것을 특징으로 하는 (24)항 기재의 형질전환 식물.
(28) 벼과 식물은 벼인 것을 특징으로 하는 (28)항 기재의 형질전환 식물.
(29) 이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 가진 식물은 십자화과 (Brassicaceae), 콩과(Leguminosae), 미나리과(Umbelliferae), 비름과 (Amaranthaceae), 꿀풀과(Labiatae), 명아주과(Chenopodiaceae), 장미과(Rosaceae), 국화과(Compositae), 가지과(Solanaceae) 또는 아욱과(Malvaceae) 식물인 것을 특징으로 하는 (24)항 기재의 형질전환 식물.
(30) 상기 십자화과 식물은 유채(Brassica napus) 또는 애기장대(Arabidopsis thaliana)인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물.
이하의 (a) 또는 (b)의 단백질을 암호화하는 핵산을 도입한 형질전환 식물을 이속사졸린 유도체의 존재하에 재배하는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물의 재배방법.
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
(b) 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본국 특허출원 제2016-132689호의 상세한 설명 및/또는 도면에 개시된 내용을 포함하고 있다.
본 발명에 의하면, 피록사술폰 및 페녹사술폰 등 이속사졸린 유도체에 대한 내성 및/또는 고온 스트레스 등 환경 스트레스 내성을 획득한 형질전환 식물을 제공한다. 즉, 본 발명에 따르면, 상기 이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 갖는 식물에 대하여, 이속사졸린 유도체 내성을 부여하며, 또한, 식물에 대해 환경 스트레스 내성을 부여한다.
따라서, 본 발명에 따른 형질전환 식물은 상기 이속사졸린 유도체 존재 하에서도 생육이 가능하기 때문에, 이속사졸린 유도체를 이용함으로써 안정적인 재배생산이 가능해진다.

[도 1] TaQ8GTC0 단백질의 대장균 발현체를 나타내는 개략 구성도이다.
[도 2] TaQ8GTC0 단백질을 확인하는 전기영동 사진이다.
[도 3] 글루타티온 포합활성(conjugation activity)을 시험한 VLCFAE 저해형 제초제의 화학식이다.
[도 4] 피록사술폰과 글루타티온 사이의 포합반응(conjugation reaction) 및 VLCFAE 저해형 제초제로 피록사술폰을 사용했을 때의 HPLC 차트를 나타내는 특성도이다.
[도 5] TaQ8GTC0 유전자의 벼 형질전환용 벡터를 나타내는 개략 구성도이다.
[도 6] TaQ8GTC0 유전자가 도입된 벼의 배양세포를 선택배지에서 배양한 상태를 나타내는 사진이다.
[도 7a] #3-13 계통 및 야생형 벼를 VLCFAE 저해형 제초제를 함유하는 배지에서 재배했을 때의 상태를 나타내는 특성도이다.
[도 7b] #3-13 계통 및 야생형 벼를 VLCFAE 저해형 제초제를 함유하는 배지에서 재배했을 때의 상태를 나타내는 특성도이다.
[도 7c] #3-13 계통 및 야생형 벼를 VLCFAE 저해형 제초제를 함유하는 배지에서 재배했을 때의 상태를 나타내는 특성도이다.
[도 7d] #3-13 계통 및 야생형 벼를 VLCFAE 저해형 제초제를 함유하는 배지에서 재배했을 때의 상태를 나타내는 특성도이다.
[도 7e] #3-13 계통 및 야생형 벼를 VLCFAE 저해형 제초제를 함유하는 배지에서 재배했을 때의 상태를 나타내는 특성도이다.
[도 7f] #3-13 계통 및 야생형 벼를 VLCFAE 저해형 제초제를 함유하는 배지에서 재배했을 때의 상태를 나타내는 특성도이다.
[도 8] TaQ8GTC0 유전자의 애기장대(Arabidopsis thaliana) 형질전환용 벡터를 나타내는 개략 구성도이다.
[도 9] TaQ8GTC0 유전자를 도입한 애기장대 식물체에서 채취한 종자를 재배 한 상태를 나타내는 사진이다.
[도 10] 애기장대에 도입된 TaQ8GTC0 유전자를 확인한 전기영동 사진이다.
[도 11] 야생형 애기장대(Columbia-0)에 대해 피록사술폰 감수성 시험결과를 나타내는 특성도이다.
[도 12] TaQ8GTC0 유전자가 도입된 애기장대에 대해 피록사술폰 감수성 시험결과를 나타내는 특성도이다.
[도 13] TaQ8GTC0 유전자가 도입된 애기장대에 대해 VLCFAE 저해형 제초제에 대한 약제 감수성을 시험한 결과를 나타내는 특성도이다.
[도 14] TaQ8GTC0 유전자가 도입된 애기장대에 대해 VLCFAE 저해형 제초제에 대한 약제 감수성을 시험한 결과를 나타내는 특성도이다.
[도 15] TaQ8GTC0 유전자 도입 벼에 대해 고온 스트레스 내성을 시험한 결과를 나타내는 특성도이다.
[도 16] TaQ8GTC0 및 TaQ8GTC0에 대해 높은 상동성을 갖는 GST를 포함하는 분지 계통수(phylogenetic tree)이다.
[도 17] 각종 GST를 발현하는 벼 형질전환용 벡터를 나타내는 개략 구성도이다.
[도 18] 피록사술폰산 함유 배지에서 배양한 2종류의 식물 GST 유전자 도입 벼의 배양세포 및 대조구 벼 배양세포, 및 약제처리하지 않은 대조구 벼 배양세포에서 지방산 함량을 측정한 결과를 나타내는 특성도이다.
[도 19] 피록사술폰산 함유 배지에서 배양한 3종류의 식물 GST 유전자 도입 벼의 배양세포 및 대조구 벼 배양세포, 및 약제처리하지 않은 대조구 벼 배양세포에서 지방산 함량을 측정한 결과를 나타내는 특성도이다.
[도 20] 피록사술폰산 함유 배지에서 배양한 2종류의 식물 GST 유전자 도입 벼의 배양세포 및 대조구 벼 배양세포에서 지방산 함량을 측정한 결과를 나타내는 특성도이다.
[도 21] 옥수수 GST 유전자를 발현하는 벼 형질전환용 벡터를 나타내는 개략 구성도이다.
[도 22] 옥수수 GST 유전자를 도입한 벼 배양세포를 보여주는 사진이다.
[도 23] 옥수수 GST 유전자를 도입한 벼 배양세포에 대해 피록사술폰에 대한 내성을 시험한 결과를 나타내는 사진이다.
[도 24] TaQ8GTC1-R 유전자 복제를 나타내는 개략 구성도이다.
[도 25] 본 실험에서 결정한 TaQ8GTC1-R 유전자의 염기서열(윗줄, 서열번호 31)과 데이터베이스에 등록되어 있는 TaQ8GTC1 유전자의 염기서열(아랫줄, 서열번호 33)을 비교한 결과를 나타내는 특성도이다.
[도 26] 본 실험에서 결정한 TaQ8GTC1-R 유전자가 코딩하는 아미노산 서열(윗줄, 서열번호 32)과 데이터베이스에 등록되어 있는 TaQ8GTC1 유전자가 코딩하는 아미노산 서열(아랫줄, 서열번호 34)을 비교한 결과를 나타내는 특성도이다.
[도 27] TaQ8GTC1-R 단백질의 대장균 발현체를 나타내는 개략 구성도이다.
[도 28] TaQ8GTC1-R 단백질을 확인하는 전기영동 사진이다.
[도 29] 피록사술폰과 글루타티온사이의 포합반응 및 VLCFAE 저해형 제초제로 피록사술폰을 사용했을 때의 HPLC 차트를 나타내는 특성도이다.
[도 30] 각종 식물의 GST간 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타내는 특성도이다. 첫째 줄: AtGSTF2(서열번호 37), 둘째 줄: PttGSTF1(서열번호 38), 셋째 줄: ZmGSTF1(서열번호 39), 넷째 줄: TaGSTF1(서열번호 40), 다섯째 줄: TaGSTF2-R(서열번호 32), 여섯째 줄: TaGSTF3(서열번호 2), 일곱째 줄: TaGSTF4(서열번호 41), 여덟째 줄: TaGSTF5(서열번호 42) 및 아홉째 줄: TaGSTF6(서열번호 43)
[도 31] TaQ8GTC1-R 유전자의 벼 형질전환용 벡터를 나타내는 개략 구성도이다.
[도 32] TaQ8GTC1-R 유전자가 도입된 벼의 배양세포를 선택배지에서 선발하여 배양한 상태를 나타내는 사진이다.
[도 33] TaQ8GTC1-R 유전자 도입 벼의 피록사술폰에 대한 내성시험의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 34] TaQ8GTC0 유전자의 유채 형질전환용 벡터를 나타내는 개략 구성도이다.
[도 35] TaQ8GTC0 유전자가 도입된 유채 배양세포를 선발하여 배양한 상태를 나타내는 사진이다.
[도 36] TaQ8GTC0 유전자가 도입된 재조합 유채인지 PCR로 확인한 결과를 나타내는 전기영동 그림의 사진이다.
[도 37] 야생형 유채(품종: Westar) 및 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채에 대해 피록사술폰 발아 전 토양처리 시험의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 38] 야생형 유채(품종: Westar) 및 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채에 대해 피록사술폰의 발아 전 토양처리 시험의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 39] 야생형 유채(품종: Westar) 및 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채에 대해 피록사술폰의 발아 전 토양처리 시험의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 40] 야생형 유채(품종: Westar) 및 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채에 대해 한천배지에서의 생육저해 시험의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 41] 야생형 유채(품종: Westar) 및 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채에 대해 한천배지에서의 생육저해 시험의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 42] 야생형 유채(품종: Westar) 및 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채에 대해 한천배지에서의 생육저해 시험의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 43] 야생형 유채(품종: Westar) 및 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채에 대해 한천배지에서의 생육저해 시험의 결과를 나타내는 특성도이다.
[도 44] 야생형 유채(품종: Westar) 및 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채에 대해 한천배지에서의 고온 내성시험의 결과를 나타내는 특성도이다.
이하에서는, 본 발명을 상세히 설명한다.
[본 발명의 글루타티온-S-트랜스퍼라제]
본 발명의 글루타티온-S-트랜스퍼라제(이하에서는, 편의상 "GST"로 약칭하기도 한다)는 이하의 (a) 또는 (b) 단백질로 정의될 수 있다:
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
(b) 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질
여기에서, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 밀(Triticum aestivum) 유래의 GST 중 "GST F3"로 호칭되는 것이며, 등록번호: Q8GTC0로 특정되는 것이다. 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열은 등록번호: AJ440792_1으로 CDS서열(서열번호 1)과 함께 특정된다.
본 발명에서 사용가능한 GST는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질에 한정되지 않고, 상기 (b)에 기재된 바와 같이 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 97% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질이어도 무방하다.
또한, 아미노산 서열 동일성의 값은 BLAST 알고리즘을 구현한 BLASTN이나 BLASTX 프로그램에 의해 산출할 수 있다(기본 설정). 또한, 동일성의 값은 한 쌍의 아미노산 서열을 짝 정열(pairwise alignment) 분석했을 때, 정확히 일치하는 아미노산 잔기를 산출하여 비교한 전체 아미노산 잔기 중의 비율로 산출된다.
또한, 본 발명에서 사용가능한 GST는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질에 한정되지 않고, 서열번호 2의 아미노산 서열에 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 가지고, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질이어도 좋다. 여기서 수개는 예를 들어, 2~30개, 바람직하게는 2~20개, 보다 바람직하게는 2~15개, 더욱 바람직하게는 2~10개, 가장 바람직하게는 2~5개이다.
또한, 본 발명에서 사용가능한 GST는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 DNA의 상보사슬의 전부 또는 일부에 대하여 엄격한 조건(stringent condition) 하에서 잡종화하는 DNA에 의해 암호화되고, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질이어도 무방하다. "엄격한 조건(stringent condition)"이란 소위 특이적 하이브리드(specific hybrid)가 형성되며, 비특이적 하이브리드(non-specific hybrid)가 형성되지 않는 조건을 의미하며, 예를 들어 Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)을 참조하여 적절히 결정할 수 있다. 구체적으로는 서던 하이브리드화(Southern hybridization)의 온도와 용액에 포함된 염 농도 및 서던 하이브리드화의 세척시 온도와 용액에 포함된 염 농도에 따라 엄격도(stringency)를 설정할 수 있다. 보다 상세하게는 엄격한 조건으로는, 예를 들어 나트륨 농도가 25~500mM, 바람직하게는 25~300mM이며, 온도는 42~68℃, 바람직하게는 42~65℃이다. 보다 구체적으로, 염 농도는 5xSSC(83mM NaCl, 83mM 구연산 나트륨), 온도는 42℃이다.
특히, 본 발명에서 사용가능한 GST는 후술하는 이속사졸린 유도체에 대한 글루타티온 포합활성을 가지고 있다. 즉, 본 발명에서 사용가능한 GST는 이속사졸린 유도체와 글루타티온을 결합하는 활성을 가진다.
더욱 상세하게는, 본 발명에서 사용가능한 GST는 식물 내에서 발현하면 이속사졸린 유도체에 대한 글루타티온 포합(glutathione conjugation)을 촉진하고 이속사졸린 유도체에 의한 초장쇄 지방산 신장효소의 활성저해를 줄일 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용가능한 GST는 식물 내에서 발현하면 상기 식물에 이속사졸린 유도체 내성을 부여할 수 있다.
다시 말해, 상술한 글루타티온-S-트랜스퍼라제 활성은 이속사졸린 유도체에 대한 글루타티온 포합활성 혹은 이속사졸린 유도체에 대한 글루타티온의 결합활성이라고 할 수 있다.
또한, 상술한 바와 같이, 서열번호 2의 아미노산 서열과 다른 아미노산 서열을 포함하는 단백질도 본 발명에서 사용가능한 GST는 상술한 글루타티온-S-트랜스퍼라제 활성 이외에 이속사졸린 유도체에 의한 초장쇄 지방산 신장효소 활성의 저해를 저감하는 작용을 갖는 GST, 나아가서는 식물에 이속사졸린 유도체 내성을 부여하는 GST일 수도 있다.
[형질전환 식물]
본 발명에 따른 형질전환 식물은 소정의 식물(식물체, 식물세포)에 상술한 GST를 암호화하는 유전자를 발현 가능하도록 도입한 것이다. 본 발명에 따른 형질전환 식물은 상술한 GST를 암호화하는 유전자를 발현하여 후술하는 이속사졸린 유도체에 대한 내성 및 환경 스트레스에 대한 내성을 획득한다.
여기에서 이속사졸린 유도체에 대한 내성(resistance)을 획득한다는 것은, 상술한 GST를 도입하기 전에 식물의 이속사졸린 유도체에 대한 감수성과 비교하여 상술한 GST를 도입한 후 식물의 이속사졸린 유도체에 대한 감수성이 통계적으로 의미있게 감소하는 것을 말한다. 즉, 이속사졸린 유도체에 대한 내성을 획득한다는 것은, 상술한 GST를 도입한 후 식물에 대한 이속사졸린 유도체에 의한 저해효과가 상기 GST를 도입하기 전에 식물의 동 저해효과에 비해 통계적으로 의미있게 낮아지는 것을 말한다. 또한, 이속사졸린 유도체에 의한 저해효과는 50% 저해농도 등의 지표를 이용하여 평가할 수 있다.
또한, 환경 스트레스에 대한 내성을 획득한다는 것은, 상술한 GST를 도입하기 전에 식물의 환경 스트레스에 대한 감수성과 비교하여 상술한 GST를 도입한 후 식물체에서 같은 환경 스트레스에 대한 감수성이 통계적으로 의미있게 감소하는 것을 말한다. 즉, 환경 스트레스 내성을 획득하기는 소정의 환경 스트레스를 부하 조건에서 상술한 GST를 도입한 후 식물 및 동 GST를 도입하기 전에 식물을 재배할 때, GST를 도입한 후 식물의 성장 속도가 통계적으로 의미하게 빠른 것을 말한다. 또한, 식물의 성장 속도는 예를 들어 초장의 길이, 뿌리 무게 등의 지표를 이용하여 평가할 수 있다.
여기에서, 환경 스트레스는 특별히 한정되지 않지만, 고온 스트레스, 높은 염농도 스트레스, 건조 스트레스 및 저온 스트레스를 들 수 있다. 이러한 각종 환경 스트레스 중에서도, 본 발명에 따른 형질전환 식물은 특히 고온 스트레스에 대한 내성이 우수하다.
그런데, 상술한 GST를 도입하는 대상 식물은 특별히 한정되지 않고, 어떠한 식물이라도 무방하다. 어떠한 식물이라도 상술한 GST를 도입함으로써 고온 스트레스 내성 등의 환경 스트레스 내성을 획득할 수 있다. 특히, 상술한 GST를 도입하는 대상 식물로는 후술하는 이속사졸린 유도체에 대한 감수성을 가진 식물인 것이 바람직하다. 이속사졸린 유도체에 대한 감수성을 갖는 식물에 상술한 GST를 도입함으로써, 상기 식물은 이속사졸린 유도체에 대한 내성을 획득할 수 있다.
여기서 "이속사졸린 유도체에 대한 감수성을 가지는 식물"은 이속사졸린 유도체를 제초제로 사용하는 경우의 최적 농도에서 생육이 저해되는 식물을 의미한다. 예를 들어, 이속사졸린 유도체로 피록사술폰에 대한 50% 저해농도(IC50)가 200nM 이하, 바람직하게는 100nM 이하, 보다 바람직하게는 50nM 이하인 경우, 피록사술폰에 대해 감수성을 갖는 식물이라고 할 수 있다.
보다 구체적으로, 이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 가진 식물로는 특별히 한정되지 않지만, 벼, 보리, 수수, 귀리, 듀럼 밀(durum wheat), 옥수수 등의 벼과 식물(Gramineae); 유채(Brassica rapa), 유채씨(Brassica napus), 양배추, 카놀라, 케일, 백겨자(white mustard), 순무, 애기장대 등 십자화과 식물(Brassicaceae); 알팔파, 강낭콩(bush bean), 대두(soybean), 팥(adzuki bean), 녹두(mung bean), 토끼풀 등 콩과 식물(Leguminosae); 딜(Anethum graveolens), 회향(fennel), 파슬리 등 미나리과 식물(Umbelliferae); 시금치, 사탕무 등 비름과 식물(Amaranthaceae); 바질 등 꿀풀과 식물(Labiatae); 근대 등 명아주과 식물(Chenopodiaceae); 자두 등 장미과 식물(Rosaceae), 상추 등 국화과 식물(Compositae); 토마토 등 가지과 식물(Solanaceae); 면화 등 아욱과 식물(Malvaceae)을 열거할 수 있다.
이렇듯 구체적으로 예시 열거한 식물에 대해 상술한 GST를 도입함으로써 상기 식물에 이속사졸린 유도체에 대한 내성을 부여할 수 있으며, 또한, 환경 스트레스 내성을 향상시킬 수 있다.
특히, 상술한 GST는 VLCFAE 저해형 제초제 중에서도 이속사졸린 유도체에 대한 포합활성이 높고, I. Cummins 등, Plant Mol. Biol. 52, 591-603(2003)에 보고된 메톨라클로(metolachlor)에 대한 포합활성과 비교하여 통계적으로 유의미하게 높다. 따라서, 상술한 GST를 도입한 형질전환 식물은 VLCFAE 저해형 제초제 중 이속사졸린 유도체를 제초제로 사용하여 재배할 수 있다.
또한, 상술한 GST를 도입한 형질전환 식물 환경 스트레스 내성이 우수하기 때문에 기존 환경 스트레스에 의해 생육 불량이 발생했던 환경에서도 재배할 수 있다. 특히, 상술한 GST를 도입한 형질전환 식물은 환경 스트레스 중에서도 고온 스트레스에 대해 우수한 내성을 나타낸다. 따라서, 상술한 GST를 도입한 형질전환 식물은 기존의 기온이 높고 생육에 부적합한 토지와 시기에 재배할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 형질전환 식물의 작제방법은 특별히 한정되지 않고, 대략 상술한 GST를 암호화하는 핵산을 발현벡터에 재조합하여 수득한 발현벡터를 식물에 도입하는 등의 방법으로, 상술한 GST를 발현하는 형질전환 식물을 작제할 수 있다.
발현벡터는 식물에서 발현을 가능하게 하는 프로모터와, 상술한 GST를 암호화하는 핵산을 포함하도록 구축한다. 발현벡터의 모체가 되는 벡터로는 종래의 공지된 다양한 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드, 파지 또는 코스미드 등을 사용할 수 있으며, 도입되는 식물세포 및 도입방법에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 구체적으로 예를 들면, pBR322, pBR325, pUC19, pUC119, pBluescript, pBluescriptSK, pBI계 벡터 등을 사용할 수 있다. 특히 식물체에 벡터의 도입법이 아그로박테리움을 이용하는 경우에는 pBI계의 바이너리 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. pBI계의 바이너리 벡터로는 구체적으로 예를 들어, pBIG, pBIN19, pBI101, pBI121 등을 포함한다.
프로모터(promotor)는 식물 체내에서 상기 GST를 암호화하는 핵산을 발현시킬 수 있는 프로모터면 특별히 한정되는 것은 아니고, 공지의 프로모터를 바람직하게 사용할 수 있다. 특히 프로모터로는 식물 체내에서 하류의 유전자를 항시적으로 발현시키는 항시 발현 프로모터(constitutive expression promoter)를 사용하는 것이 바람직하다. 관련된 프로모터로는, 예를 들면, 꽃 양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터(CaMV35S), 각종 액틴 유전자 프로모터, 각종 유비퀴틴 유전자 프로모터, 노팔린 합성효소 유전자 프로모터, 담배 PR1a 유전자 프로모터, 토마토 리불로스 1,5-이인산 카복실라제/옥시다제 작은 서브유닛 유전자 프로모터, 나핀(napin) 유전자 프로모터 등을 들 수 있다. 이 중에서도 꽃 양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 액틴 유전자 프로모터, 또는 유비퀴틴 유전자 프로모터를 보다 바람직하게 사용할 수 있다. 상기 각 프로모터를 이용하면 식물세포 내에 도입되었을 때, 어떠한 유전자라도 강하게 발현시킬 수 있게 된다.
또한, 프로모터로 식물의 부위 특이적으로 발현시키는 기능을 갖는 것을 사용할 수도 있다. 이러한 프로모터로는 종래의 공지된 어떠한 프로모터를 사용할 수 있다. 이러한 프로모터를 사용하여 상기 GST를 부위 특이적으로 발현시킬 수 있다.
아울러, 발현벡터(expression vector)는 프로모터 및 상기 GST를 암호화하는 핵산 이외에 또 다른 DNA 단편을 포함하여도 무방하다. 상기 다른 DNA 단편은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 터미네이터, 선별마커, 인핸서, 번역 효율을 높이기 위한 염기서열 등을 들 수 있다. 또한, 상기 발현벡터는 T-DNA 영역을 갖고 있어도 좋다. T-DNA 영역은 특히 아그로박테리움을 이용하여 상기 재조합 발현벡터를 식물체에 도입하는 경우에 유전자 도입효율을 높일 수 있다.
전사 터미네이터(transcription terminator)는 전사종결 부위로서의 기능을 갖고 있으면 특별히 한정되는 것은 아니고, 공지의 것이라도 무방하다. 예를 들어, 구체적으로 노팔린 합성효소 유전자의 전사종결 영역(Nos 터미네이터), 꽃 양배추 모자이크 바이러스 35S 전사종결 영역(CaMV35S 터미네이터) 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 이 중에서도 Nos 터미네이터를 보다 바람직하게 사용할 수 있다. 상기 발현벡터에서, 전사 터미네이터를 적당한 위치에 배치하여 식물세포에 도입된 후 불필요하게 긴 전사물을 합성하는 것을 방지할 수 있다.
형질전환체 선별마커(transformation selection marker)로는, 예를 들면 약제내성 유전자를 이용할 수 있다. 관련된 약제내성 유전자의 구체적인 예로서는, 예를 들어, 하이그로마이신, 블레오마이신, 카나마이신, 겐타마이신, 클로람페니콜 등에 대한 약제내성 유전자를 들 수 있다. 따라서, 상기 항생제를 포함하는 배지에서 생육하는 식물체를 선택하여 형질전환된 식물체를 쉽게 선별할 수 있다. 또한, 형질전환체 선별마커로는 소정의 약제에 대하여 저항성을 부여하는 변이형 아세토락테이트 합성효소 유전자를 사용할 수도 있다.
발현벡터의 구축방법에 대해서도 특별히 한정되는 것이 아니라, 적절하게 선택된 모체가 되는 벡터에 상기 프로모터 및 상기 GST를 암호화하는 핵산 및 필요에 따라 상기 다른 DNA 단편을 소정의 순서가 되도록 도입하면 된다. 예를 들어, 상기 GST를 암호화하는 핵산과 프로모터(필요에 따라 전사 터미네이터 등)를 연결하여 발현 카세트를 구축하고, 이를 벡터에 도입하면 된다. 발현 카세트의 구축은 예를 들어, 각 DNA 단편의 절단부위를 서로 상보적인 돌출 말단(protruding end)으로 두고 결합효소 반응시킴으로써 상기 DNA 단편의 순서를 규정하는 것이 가능해진다. 또한, 발현 카세트에 터미네이터가 포함된 경우에는, 상류로부터 프로모터, 상기 GST를 암호화하는 핵산, 터미네이터의 순서가 되면 된다. 또한, 발현벡터를 구축하기 위한 시약, 즉 제한효소와 결합효소 등의 종류에 대해서도 특별히 한정되는 것이 아니고, 시판되는 것을 적절히 선택하여 사용하면 된다.
또한, 상기 발현벡터의 증식방법(생산방법)도 특별히 한정되는 것이 아니라, 종래의 공지된 방법을 이용할 수 있다. 일반적으로 대장균을 숙주로 상기 대장균에서 증식시키면 된다. 이때 벡터의 종류에 따라 선호하는 대장균의 종류를 선택하고 있다.
상술한 발현벡터는 일반적인 형질전환 방법에 의해 대상 식물에 도입된다. 발현벡터를 식물세포에 도입하는 방법(형질전환 방법)은 특별히 한정되는 것이 아니라, 식물세포에 따라 적절한 종래의 공지된 방법을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 아그로박테리움을 이용하는 방법과 직접 식물세포에 도입하는 방법을 사용할 수 있다. 발현벡터를 직접 식물세포에 도입하는 방법으로는 예를 들어, 마이크로인젝션법(microinjection), 전기천공법(electroporation), 폴리에틸렌글리콜법(polyethylene glycol method), 파티클 건법(particle gun method), 원형질체 융합법(protoplast fusion), 인산칼슘법(calcium phosphate method) 등을 이용할 수 있다.
또한, DNA를 직접 식물세포에 도입하는 방법을 채택한다면, 대상으로 하는 유전자의 발현에 필요한 전사 유닛(transcriptional unit), 예를 들어 프로모터 및 전사 터미네이터와 상기 GST를 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA면 충분하고, 벡터 기능은 필수는 아니다. 또한, 전사 유닛을 갖지 않는 상기 GST의 코드 영역만을 포함하는 DNA라도 숙주의 전사 유닛 내에 집적화하여 대상 GST를 발현할 수 있으면 사용될 수 있다.
상기 발현벡터 및 발현벡터를 제외 대상이 되는 GST를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 카세트가 도입되는 식물세포로는, 예를 들어, 꽃, 잎, 뿌리 등의 식물 기관에서 각 조직의 세포, 캘러스, 현탁 배양세포 등을 들 수 있다. 여기에서 발현벡터는 생산하고자 하는 종류의 식물체에 따라 적절한 것을 적절하게 구축될 수 있으나, 일반적인 발현벡터를 미리 구축해두고, 그것을 식물세포에 도입하여도 무방하다.
형질전환의 결과 수득한 종양조직(tumor tissue)이나 슛(shoot), 모상근(hairy root) 등은 그 자체로 세포배양, 조직배양 또는 기관배양에 사용하는 것이 가능하며, 또한, 종래의 공지된 식물 조직배양법을 이용하여 적당한 농도의 식물 호르몬(옥신(auxin), 사이토카이닌(cytokinin), 지베렐린(gibberellin), 아부시신산(abscisic acid), 에틸렌(ethylene), 브라시노라이드(brassinoride) 등)의 투여 등에 의해 식물체에 재생시킬 수 있다.
재생방법은 캘러스 모양의 형질전환 세포를 호르몬의 종류, 농도를 달리하는 배지에 옮겨 배양하고 부정 배아(adventitious embryo)를 형성시켜 완전한 식물체를 얻는 방법이 채택된다. 사용하는 배지로는 LS 배지, MS 배지 등이 예시된다.
또한, 본 발명에 따른 형질전환 식물은 상기 GST를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환 식물세포를 얻고, 상기 형질전환 식물세포에서 형질전환 식물체를 재생시켜 수득한 형질전환 식물체에서 식물종자를 얻어, 상기 식물종자로부터 얻은 후대의 식물도 포함한다. 형질전환 식물체에서 식물종자를 얻으려면, 예를 들면, 형질전환 식물체를 발근배지(rooting medium)에서 채취한 물을 포함하는 흙을 넣은 포트에 이식하여 일정 온도에서 생육시켜 꽃을 형성시켜 종자를 형성시킨다. 또한, 종자로부터 식물체를 생산하려면, 예를 들어, 형질전환 식물체에서 형성된 종자가 성숙한 곳에서 단리하여 물을 포함하는 토양에 파종하여 일정한 온도, 조도 하에서 생육시킴으로써 식물체를 생산한다. 이렇게 작제된 식물은 상술한 GST를 발현하기 위해, 이속사졸린 유도체에 대한 내성 및 환경 스트레스에 대한 내성을 나타낸다.
[이속사졸린 유도체]
본 발명에서 이속사졸린 유도체는 이속사졸린 골격을 갖는 화합물과 그 염을 포함한다. 이속사졸린 유도체의 제초활성에 대해서는 예를 들면, 특개평 제8-225548호 공보, 특개평 제9-328477호 공보 및 특개평 제9-328483호 공보 등에 보고되어 있으며, 이들 이미 보고된 이속사졸린 유도체를 제초제로 사용할 수 있다.
또한, 특허 제4465133호 공보에는 이속사졸린 유도체 중에서도 특히 제초효과와 작물·잡초 간의 선택성을 갖는 일군의 화합물이 개시되어 있다. 특허 제4465133 호 공보에 개시된 이속사졸린 유도체는 피록사술폰(화합물명: 3-[5-(디플루오로메톡시)-1-메틸-3-(트리플루오로메틸)피라졸-4-일메틸술포닐-4,5-디히드로-5,5-디메틸-1, 2-옥사졸)을 포함한다.
구체적으로, 특허 제4465133호 공보에는 이하의 (1)~(17)항에 기재된 이속사졸린 유도체가 개시되어 있다.
(1) 일반식[I]로 나타내는 이속사졸린 유도체 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염:
Figure pct00001
상기 식에서,
R1 및 R2는 동일하거나 상이하고, 각각 수소원자, C1~C10 알킬기, C3-C8 시클로알킬기 또는 C3-C8 시클로알킬 C1~C3 알킬기를 나타내거나, 혹은 R1 및 R2가 결합하여 이들이 결합된 탄소원자와 함께 C3-C7의 스피로환(spiro ring)을 나타내고;
R3 및 R4는 동일하거나 상이하고, 각각 수소원자, C1~C10 알킬기 또는 C3-C8 시클로알킬기를 나타내거나, R3 및 R4가 결합하여 이들이 결합된 탄소원자와 함께 C3-C7의 스피로환을 나타내거나, 혹은 R1, R2, R3 및 R4가 이들이 결합된 탄소원자와 함께 5~8원환을 형성할 수도 있으며;
R5 및 R6은 동일하거나 상이하고, 각각 수소원자 또는 C1~C10 알킬기를 나타내고;
Y는 질소원자, 산소원자 및 황원자로부터 선택되는 임의의 헤테로원자를 갖는 5~6원 방향족 헤테로환기(aromatic heterocyclic group) 또는 방향족 헤테로 축합환기(condensed aromatic heterocyclic group)를 나타내고, 이들 헤테로환기는 후술하는 치환기군 α로부터 선택되는 0~6개의 동일 또는 상이한 기로 치환되어도 좋고, 또한 인접하는 알킬기끼리, 알콕시기끼리, 알킬기와 알콕시기, 알킬기와 알킬티오기, 알킬기와 알킬술포닐기, 알킬기와 모노알킬아미노기, 또는 알킬기와 디알킬아미노기가 2개 결합하여 1~4개의 할로겐원자로 치환가능한 5~8원환을 형성하여도 좋고, 또한, 이들 헤테로환기의 헤테로원자가 질소원자의 경우에는 산화되어 N-옥사이드를 형성하여도 좋으며; 및,
n은 0~2의 정수를 나타낸다.
다음 치환기군 중 "치환가능한 페닐기, 치환가능한 페녹시기, 치환가능한 페닐티오기, 치환가능한 방향족 헤테로환기, 치환가능한 방향족 헤테로환 옥시기, 치환가능한 방향족 헤테로환 티오기, 치환가능한 페닐술피닐기, 치환가능한 페닐술포닐기, 치환가능한 방향족 헤테로환 술포닐기, 치환가능한 페닐술포닐옥시기, 치환가능한 벤질카보닐기, 치환가능한 벤조일기, 치환가능한 벤질옥시카보닐기, 치환가능한 페녹시카보닐기, 치환가능한 벤질카보닐옥시기, 또는 치환가능한 벤조일 옥시기"에서 "치환가능한"의 의미는 상기 치환기가 할로겐원자, C1~C10 알킬기, C1~C4 할로알킬기, C1~C10 알콕시알킬기, C1~C10 알콕시기, C1~C10 알킬티오기, C1~C10 알킬술포닐기, 아실기, C1~C10 알콕시카보닐기, 시아노기, 카바모일기(상기 기의 질소원자는 동일 또는 상이한 C1~C10 알킬기로 치환되어도 무방하다), 니트로기 또는 아미노기(상기 기의 질소원자는 동일 또는 상이한, C1~C10 알킬기, C1~C6 아실기, C1~C4 할로알킬카보닐기, C1~C10 알킬술포닐기, 또는 C1~C4 할로알킬술포닐기로 치환되어도 무방하다)로 치환되어도 좋다는 것을 나타낸다.
"치환기군 α"
수산기, 티올기, 할로겐원자, C1~C10 알킬기, 치환기군 β로부터 선택되는 임의의 기로 모노치환된 C1~C10 알킬기, C1~C4 할로알킬기, C3~C8 시클로알킬기, C1~C10 알콕시기, 치환기군 γ로부터 선택되는 임의의 기로 모노치환된 C1~C10 알콕시기, C1~C4 할로알콕시기, C3-C8 시클로알킬옥시기, C3~C8 시클로알킬 C1~C3 알킬옥시기, C1~C10 알킬티오기, 치환기군 γ로부터 선택되는 임의의 기로 모노치환된 C1~C10 알킬티오기, C1~C4 할로알킬티오기, C2-C6 알케닐기, C2-C6 알케닐옥시기, C2-C6 알키닐기, C2-C6 알키닐옥시기, C1~C10 알킬술피닐기, 치환기군 γ로부터 선택되는 임의의 기로 모노치환된 C1~C10 알킬술피닐기, C1~C10 알킬술포닐기, 치환기군 γ로부터 선택되는 임의의 기로 모노치환된 C1~C10 알킬술포닐기, C1~C4 할로알킬술피닐기, 치환기군 γ로부터 선택되는 임의의 기로 모노치환된 C1~C10 알킬술포닐옥시기, C1~C4 할로알킬술포닐기, C1~C10 알킬술포닐옥시기, C1~C4 할로알킬술포닐옥시기, 치환가능한 페닐기, 치환가능한 페녹시기, 치환가능한 페닐티오기, 치환가능한 방향족 헤테로환기, 치환가능한 방향족 헤테로환 옥시기, 치환가능한 방향족 헤테로환 티오기, 치환가능한 페닐술피닐기, 치환가능한 페닐술포닐기, 치환가능한 방향족 헤테로환 술포닐기, 치환가능한 페닐술포닐옥시기, 아실기, C1~C4 할로알킬카보닐기, 치환가능한 벤질카보닐기, 치환가능한 벤조일, 카르복실기, C1~C10 알콕시카보닐기, 치환가능한 벤질옥시카보닐기, 치환가능한 페녹시카보닐기, 시아노기, 카바모일기(상기 기의 질소원자는 동일 또는 상이한, C1~C10 알킬기 또는 치환가능한 페닐기로 치환되어도 무방하다), C1~C6 아실옥시기, C1~C4 할로알킬카보닐옥시기, 치환가능한 벤질카보닐옥시기, 치환가능한 벤조일옥시기 니트로기, 아미노기(상기 기의 질소원자는 동일 또는 상이한, C1~C10 알킬기, 치환가능한 페닐기, C1~C6 아실기, C1~C4 할로알킬카보닐기, 치환가능한 벤질카보닐기, 치환가능한 벤조일기, C1~C10 알킬술포닐기, C1~C4 할로알킬술포닐기, 치환가능한 벤질술포닐기 또는 치환가능한 페닐술포닐기로 치환되어도 무방하다).
"치환기군 β"
수산기, C3-C8 시클로알킬기(상기 기는 할로겐원자 또는 알킬기로 치환되어 도 무방하다), C1~C10 알콕시기, C1~C10 알킬티오기, C1~C10 알킬술포닐기, C1~C10 알콕시카보닐기, C2-C6 할로알케닐, 아미노기(상기 기의 질소원자는 동일 또는 상이한, C1~C10 알킬기, C1~C6 아실기, C1~C4 할로알킬카보닐기, C1~C10 알킬술포닐기, C1~C4 할로알킬술포닐기로 치환되어도 무방하다), 카바모일기(상기 기의 질소원자는 동일 또는 상이한 C1~C10 알킬기로 치환되어도 무방하다), C1~C6 아실기, C1~C4 할로알킬카보닐기, C1~C10 알콕시이미노기, 시아노기, 치환가능한 페닐기, 치환가능한 페녹시기.
"치환기군 γ"
C1~C10 알콕시카보닐기, 치환가능한 페닐기, 치환가능한 방향족 헤테로환기, 시아노기, 카바모일기(상기 기의 질소원자는 동일 또는 상이한 C1~C10 알킬기로 치환되어도 무방하다).
(2) 0~6개의 동일 또는 상이한 기로 치환가능한 헤테로환의 치환기군 α가 수산기, 할로겐원자, C1~C10 알킬기, 치환기군 β로부터 선택되는 임의의 기로 모노치환된 C1~C10 알킬기, C1~C4 할로알킬기, C3-C8 시클로알킬기, C1~C10 알콕시기, 치환기군 γ로부터 선택되는 임의의 기로 모노치환된 C1~C10 알콕시기, C1~C4 할로알콕시기, C3-C8 시클로알킬옥시기, C3-C8 시클로알킬 C1~C3 알킬옥시기, C1~C10 알킬티오기, 치환기군 γ로부터 선택되는 임의의 기로 치환된 C1~C10 알킬티오기, C1~C4 할로알킬티오기, C2-C6 알케닐기, C2-C6 알케닐옥시기, C2-C6 알키닐기, C2-C6 알키닐옥시기, C1~C10 알킬술포닐기, C1~C4 할로알킬술포닐기, 치환가능한 페닐기, 치환가능한 페녹시기, 치환가능한 페닐티오기, 치환가능한 방향족 헤테로환기, 치환가능한 방향족 헤테로환 옥시기, 치환가능한 방향족 헤테로환 티오기, 치환가능한 페닐술포닐기, 치환가능한 방향족 헤테로환 술포닐기, C1~C6 아실기, C1~C4 할로알킬카보닐기, 치환가능한 벤질카보닐기, 치환가능한 벤조일, 카르복실기, C1~C10 알콕시카보닐기, 시아노기, 카바모일기(상기 기의 질소원자는 동일 또는 상이한, C1~C10 알킬기 또는 치환가능한 페닐기로 치환되어도 무방하다), 니트로기, 아미노기(상기 기의 질소원자는 동일 또는 상이한, C1~C10 알킬기, 치환가능한 페닐기, C1~C6 아실기, C1~C4 할로알킬카보닐기, 치환가능한 벤질카보닐기, 치환가능한 벤조일기, C1~C10 알킬술포닐기, C1~C4 할로알킬술포닐기, 치환가능한 벤질술포닐기 또는 치환가능한 페닐술포닐기로 치환되어도 무방하다)이거나, 혹은 인접한 알킬기끼리, 알콕시기끼리, 알킬기와 알콕시기, 알킬기와 알킬티오기, 알킬기와 알킬술포닐기, 알킬기와 모노알킬아미노기 또는 알킬기와 디알킬아미노기가 2개 결합하여 1~4개의 할로겐원자로 치환가능한 5~8원환을 형성하여도 좋은 상기 (1)항에 기재된 이속사졸린 유도체.
(3) 0~6개의 동일 또는 상이한 기로 치환가능한 헤테로환의 치환기군 α가 할로겐원자, C1~C10 알킬기, C1~C4 할로알킬기, C1~C10 알콕시 C1~C3 알킬기, C3-C8 시클로알킬기(상기 기는 할로겐원자 또는 알킬기로 치환되어도 무방하다), C1~C10 알콕시기, C1~C4 할로알콕시기, C3-C8 시클로알킬 C1~C3 알킬옥시기, 치환가능한 페녹시기, C1~C10 알킬티오기, C1~C10 알킬술포닐기, 아실기, C1~C4 할로알킬카보닐기, C1~C10 알콕시카보닐기, 시아노기 또는 카바모일기(상기 기의 질소원자는 동일 또는 상이한 C1~C10 알킬기로 치환되어도 무방하다)인 상기 (2) 항에 기재된 이속사졸린 유도체.
(4) R1 및 R2는 동일 또는 상이한, 메틸기 또는 에틸기이고, R3, R4, R5 및 R6가 수소원자인 상기 (1), (2) 또는 (3)항에 기재된 이속사졸린 유도체.
(5) Y가 질소원자, 산소원자 및 황원자로부터 선택되는 임의의 헤테로원자를 갖는 5원환 또는 6원환의 방향족 헤테로환기인 상기 (1), (2), (3) 또는 (4)항에 기재된 이속사졸린 유도체.
(6) Y가 티에닐기, 피라졸릴기, 이속사졸릴기, 이소티아졸릴기, 피리딜기 또는 피리미디닐기인 상기 (5)항에 기재된 이속사졸린 유도체.
(7) Y가 티오펜-3-일기, 피라졸-4-일기, 피라졸-5-일기, 이속사졸-4-일기, 이소티아졸-4-일기, 피리딘-3-일기 또는 피리미딘-5-일기인 상기 (6)항에 기재된 이속사졸린 유도체.
(8) Y가 티오펜-3-일기이고, 티오펜환의 2 및 4번 위치가 반드시 치환기군 α로 치환되는 상기 (7)항에 기재된 이속사졸린 유도체.
(9) Y가 피라졸-4-일기이고, 피라졸환의 3 및 5번 위치가 반드시 치환기군 α로 치환되고, 또한 1번 위치가 반드시 수소원자, C1~C10 알킬기, 치환기군 β로부터 선택되는 임의의 기로 모노치환된 C1~C10 알킬기, C1~C4 할로알킬기, C3-C8 시클로알킬기, C2-C6 알케닐기, C2-C6 알키닐기, C1~C10 알킬술피닐기, C1~C10 알킬술포닐기, 치환기군 γ로부터 선택되는 임의의 기로 모노치환된 C1~C10 알킬술포닐기, C1~C4 할로알킬술포닐기, 치환가능한 페닐기, 치환가능한 방향족 헤테로환기, 치환가능한 페닐술포닐기, 치환가능한 방향족 헤테로환 술포닐기, 아실기, C1~C4 할로알킬카보닐기, 치환가능한 벤질카보닐기, 치환가능한 벤조일기, C1~C10 알콕시카보닐기, 치환가능한 벤질옥시카보닐기, 치환가능한 페녹시카보닐기, 카바모일기(상기 기의 질소원자는 동일 또는 상이한, C1~C10 알킬기 또는 치환가능한 페닐기로 치환되어도 무방하다), 아미노기(상기 기의 질소원자는 동일 또는 상이한, C1~C10 알킬기, 치환가능한 페닐기, 아실기, C1~C4 할로알킬카보닐기, 치환가능한 벤질카보닐기, 치환가능한 벤조일기, C1~C10 알킬술포닐기, C1~C4 할로알킬술포닐기, 치환가능한 벤질술포닐기 또는 치환가능한 페닐술포닐기로 치환되어도 무방하다)로 치환되는 상기 (7)항에 기재된 이속사졸린 유도체.
(10) Y가 피라졸-5-일기이고, 피라졸환의 4번 위치가 반드시 치환기군 α로 치환되고, 또한 1번 위치가 반드시 수소원자, C1~C10 알킬기, 치환기군 β로부터 선택되는 임의의 기로 모노치환된 C1~C10 알킬기, C1~C4 할로알킬기, C3-C8 시클로알킬기, C2-C6 알케닐기, C2-C6 알키닐기, C1~C10 알킬술피닐기, C1~C10 알킬술포닐기, 치환기군 γ로부터 선택되는 임의의 기로 모노치환된 C1~C10 알킬술포닐기, C1~C4 할로알킬술포닐기, 치환가능한 페닐기, 치환가능한 방향족 헤테로환기, 치환가능한 페닐술포닐기, 치환가능한 방향족 헤테로환 술포닐기, 아실기, C1~C4 할로알킬카보닐기, 치환가능한 벤질카보닐기, 치환가능한 벤조일기, C1~C10 알콕시카보닐기, 치환가능한 벤질옥시카보닐기, 치환가능한 페녹시카보닐기, 카바모일기(상기 기의 질소원자는 동일 또는 상이한 C1~C10 알킬기 또는 치환가능한 페닐기로 치환되어도 무방하다), 아미노기(상기 기의 질소원자는 동일 또는 상이한, C1~C10 알킬기, 치환가능한 페닐기, 아실기, C1~C4 할로알킬카보닐기, 치환가능한 벤질카보닐기, 치환가능한 벤조일기, C1~C10 알킬술포닐기, C1~C4 할로알킬술포닐기, 치환가능한 벤질술포닐기 또는 치환가능한 페닐술포닐기로 치환되어도 무방하다)로 치환된 상기 (7)항에 기재된 이속사졸린 유도체.
(11) Y가 이소옥사졸-4-일기이고, 이소옥사졸환의 3번 위치 및 5번 위치가 반드시 치환기군 α로 치환된 상기 (7)항에 기재된 이속사졸린 유도체.
(12) Y가 이소티아졸-4-일기이고, 이소티아졸환의 3번 위치 및 5번 위치가 반드시 치환기군 α로 치환된 상기 (7)항에 기재된 이속사졸린 유도체.
(13) Y가 피리딘-3-일기이고, 피리딘환의 2번 위치 및 4번 위치가 반드시 치환기군 α로 치환된 상기 (7)항에 기재된 이속사졸린 유도체.
(14) Y가 피리미딘-5-일기이고, 피리미딘환의 4번 위치 및 6번 위치가 반드시 치환기군 α로 치환된 상기 (7)항에 기재된 이속사졸린 유도체.
(15) n이 정수 2인 상기 (1)~(14) 중 어느 한 항에 기재된 이속사졸린 유도체.
(16) n이 정수 1인 상기 (1)~(14) 중 어느 한 항에 기재된 이속사졸린 유도체.
(17) n은 정수 0인 상기 (1)~(14) 중 어느 한 항에 기재된 이속사졸린 유도체.
아울러, 특허 제4299483호 공보에도 이속사졸린 유도체 중에서 특히 제초효과와 작물·잡초 간의 선택성을 갖는 일군의 화합물이 개시되어 있다. 특허 제4299483호 공보에 개시된 이속사졸린 유도체는 페녹사술폰(화합물명: 3-[(2,5-디클로로-4-에톡시벤질)술포닐]-4,5-디히드로-5,5-디메틸-1,2-옥사졸)을 포함한다.
구체적으로, 특허 제4299483호 공보에는 이하의 (18)~(20)항에 기재된 이속사졸린 유도체 및 그의 염이 개시되어 있다.
　(18) 일반식 [I]로 표시되는 이속사졸린 유도체 및 그들의 염.
Figure pct00002
상기 식에서,
Q는 기 -S(O)n-(CR5R6)m-를 나타내고, n은 0~2의 정수를 나타내며, m은 1~3의 정수를 나타내고, R5 및 R6은 서로 독립적으로 수소원자, 시아노기, 알콕시카보닐기 또는 C1~C6 알킬기를 나타내고;
R1 및 R2는 수소원자(단, R1 및 R2가 동시에 수소원자일 수 없다), [C3-C8 시클로알킬기, C1~C6 알콕시기, C1~C6 알킬카보닐기, C1~C6 알킬티오기, C1~C6 알킬술피닐기, C1-6 알킬술포닐기, C1~C6 알킬아미노기, 디(C1~C6 알킬)아미노기, 시아노기, C1~C6 알콕시카보닐기, C1~C6 알킬아미노카보닐기, 디(C1~C6 알킬)아미노카보닐기, (C1~C6 알킬티오)카보닐기, 카르복실기, (할로겐원자, C1~C6 알킬기 또는 C1~C6 알콕시기가 1~5개 치환되어도 무방한) 벤질옥시기, (할로겐원자, C1~C6 알킬기 또는 C1~C6 알콕시기 1~5개 치환되어도 무방한) 페녹시기 또는 (할로겐원자, C1~C6 알킬 또는 C1~C6 알콕시기가 1~5개 치환되어도 무방한) 페닐기로 치환될 수 있는] C1~C8 알킬기, C3-C8 시클로알킬기, C1~C6 알콕시카보닐기, C1~C6 알킬아미노카보닐기, 디(C1~C6 알킬)아미노카보닐기, (C1~C6 알킬티오)카보닐기, 카르복실기 또는 (할로겐원자, C1~C6 알킬 또는 C1~C6 알콕시기 1~5개 치환되어도 무방한) 페닐기를 나타내고, 또는 R1 및 R2는 이들의 결합 탄소원자와 함께 C3-C7의 스피로환을 형성할 수 있으며;
R3 및 R4는 수소원자, (동일 또는 상이한, 1~3개의 할로겐 원자, C3-C8 시클로알킬기 또는 C1~C6 알콕시기로 치환되어도 무방한) C1~C8 알킬기 또는 C3-C8 시클로알킬기를 나타내고, R3 및 R4는 이들의 결합 탄소원자와 함께 C3-C7의 스피로환을 형성할 수 있으며, 또는 R1, R2, R3 및 R4는 이들의 결합 탄소원자와 함께 5~8원환을 형성하여도 좋고;
Y는 수소원자, C1~C6 알콕시카보닐기, C2-C6 알케닐기, [동일 또는 상이한, 1 내지 3개의 할로겐원자, C1~C6 알콕시기, C2-C6 알케닐옥시기, C2-C6 알키닐옥시기(할로겐원자, C1~C6 알킬 또는 C1~C6 알콕시기가 1~5개 치환되어도 무방한) 벤질옥시기, C1~C6 알콕시카보닐기, 카르복실기, 수산기 또는 메티오닌기로 치환될 수 있는] C1~C10 알킬기 또는 (1~5개의 동일 또는 상이한 R7로 치환된) 페닐기를 나타내며; 및,
R7은 수소원자, [동일 또는 상이한, 1 내지 3개의 할로겐원자, C1~C6 알콕시기, 수산기, C1~C6 알킬티오기, C1~C6 알킬술피닐기, C1~C6 알킬술포닐기, C1~C6 알킬아미노기, 디(C1~C6)알킬아미노기, 시아노기 또는 (할로겐원자, C1~C6 알킬 또는 C1~C6 알콕시기가 1~5개 치환되어도 무방한) 페녹시로 치환될 수 있는] C1~C6 알킬기, (동일 또는 상이한, 1 내지 3개의 할로겐원자, C1~C6 알콕시기, C2-C6 알케닐기, C2-C6 알키닐기, C1~C6 알콕시카보닐기, C1~C6 알킬카보닐기 또는 C3-C8 시클로알킬기로 치환되어도 무방한) C1~C6 알콕시기, C2-C6 알케닐기, C3-C8 시클로알킬옥시기(동일 또는 상이한, 1 내지 3개의 할로겐원자 또는 C1~C6 알콕시기로 치환되어도 무방한) C1~C6 알킬티오기, (동일 또는 상이한, 1 내지 3개의 할로겐원자 또는 C1~C6 알콕시기로 치환되어도 무방한) C1~C6 알킬술피닐기, (동일 또는 상이한, 1 내지 3개의 할로겐원자 또는 C1~C6 알콕시기로 치환되어도 무방한) C1~C6 알킬술포닐기, (할로겐원자, C1~C6 알킬 또는 C1~C6 알콕시기 1~5개 치환되어도 무방한) 벤질 옥시기, (C1~C6 알킬기, C1~C6 알킬술포닐기, C1~C6 알킬카보닐(C1~C6 알킬)기 또는 C1~C6 알킬술포닐(C1~C6 알킬)기로 치환되어도 무방한) 아미노기, 디(C1~C6 알킬) 아미노기, 할로겐원자, 시아노기, 니트로기, C 1~C6 알콕시카보닐기, C3-C8 시클로알킬옥시카보닐기, 카르복실기, C2-C6 알케닐옥시카보닐기, C2-C6 알키닐옥시카보닐기(할로겐원자, C1~C6 알킬 또는 C1~C6 알콕시기가 1~5개 치환되어도 무방한) 벤질옥시카보닐기(할로겐원자, C1~C6 알킬 또는 C1~C6 알콕시기 1~5개 치환되어도 무방한) 페녹시카보닐기 또는 C1~C6 알킬카보닐옥시기를 나타낸다.
(19) 상기 (18)항의 일반식 [I]로 표시되는 이속사졸린 유도체 및 그들의 염:
상기 식에서,
Q는 -S(O)n-(CR5R6)m-를 나타내고(여기서, n은 0~2의 정수이고, m은 1이며, R5 및 R6는 수소원자이다);
R1 및 R2는 수소원자(단, R1 및 R2가 동시에 수소원자일 수 없다), (C3-C8 시클로알킬기 또는 C1~C6 알콕시기로 치환되어도 무방한) C1~C8 알킬기 또는 C3-C8 시클로알킬기를 나타내거나, 혹은 R1 및 R2는 이들의 결합 탄소원자와 함께 C3-C7의 스피로환을 형성할 수 있으며;
R3 및 R4는 수소원자 또는 (동일 또는 상이한, 1 내지 3개의 할로겐원자, C3-C8 시클로알킬기 또는 C1~C6 알콕시기로 치환되어도 무방한) C1~C8 알킬기를 나타내며, R3 및 R4는 이들의 결합 탄소원자와 함께 C3-C7의 스피로환을 형성할 수 있거나, 혹은 R1, R2, R3 및 R4는 이들의 결합 탄소원자와 함께 5~8원환을 형성하여도 좋고;
Y는(1~5개의 동일 또는 상이한 R7로 치환된) 페닐기를 나타내며;
R7은 수소원자, [동일 또는 상이한, 1~3개의 할로겐원자, C1~C6 알콕시기, 수산기, C1~C6 알킬티오기, C1~C6 알킬술피닐기, C1~C6 알킬술포닐기, C1~C6 알킬아미노기, 디(C1~C6)알킬아미노기, 시아노기 또는 (할로겐원자, C1~C6 알킬 또는 C1~C6 알콕시기 1~5개로 치환되어도 무방한) 페녹시로 치환될 수 있는] C1~C6 알킬기, (동일 또는 상이한, 1 내지 3개의 할로겐원자, C1~C6 알콕시기, C2-C6 알케닐기, C2-C6 알키닐기, C1~C6 알콕시카보닐기, C1~C6 알킬 카보닐기 또는 C3-C8 시클로알킬기로 치환되어도 무방한) C1~C6 알콕시기, C3-C8 시클로알킬옥시기 또는 할로겐원자를 나타낸다.
(20) 상기 (18)항의 일반식 [I]로 표시되는 이속사졸린 유도체 및 그들의 염:
상기 식에서,
Q는 -S(O)n-(CR5R6)m-를 나타내고(여기서, n은 0~2의 정수이고, m은 1이며, R5 및 R6는 수소원자이다);
R1 및 R2 는 C1~C8 알킬기를 나타내며;
R3 및 R4 는 수소원자를 나타내고;
Y는 (1~5개 동일 또는 상이한 R7로 치환된) 페닐기를 나타내며; 및,
R7은 수소원자, (동일 또는 상이한, 1 내지 3개의 할로겐원자 또는 C1~C6 알콕시기로 치환되어도 무방한) C1~C6 알킬기, (동일 또는 상이한, 1 내지 3개의 할로겐원자 또는 C1~C6 알콕시기로 치환되어도 무방한) C1~C6 알콕시기, 또는, 할로겐원자를 나타낸다.
상술한 GST는 이미 보고된 이속사졸린 유도체에 대한 포합활성을 가진다. 따라서, GST를 도입한 형질전환 식물은 이러한 이미 보고된 이속사졸린 유도체에 대한 내성을 가지게 된다.
특히, 상술한 GST는 특허 제4465133호 공보에 개시된 이속사졸린 유도체(즉, 상기 (1)~(17)항에 기재된 이속사졸린 유도체) 및 특허 제4299483호 공보에 개시된 이속사졸린 유도체(즉, 상기 (18)~(20)항에 기재된 이속사졸린 유도체)에 대해 아주 우수한 포합활성을 가진다. 따라서, 상술한 GST를 도입한 형질전환 식물은 특허 제4465133호 공보에 개시된 이속사졸린 유도체 및 특허 제4299483호에 개시된 이속사졸린 유도체에 대하여 더욱 증대된 내성을 가지게 된다.
더욱이, 상술한 GST는 피록사술폰 및 페녹사술폰에 대해 아주 우수한 포합활성을 가진다. 따라서, 상술한 GST를 도입한 형질전환 식물은 피록사술폰 및 페녹사술폰에 대해 더욱 증가된 내성을 가지게 된다.
상술한 이속사졸린 유도체를 제초제로 사용하는 경우, 상술한 GST를 도입한 형질전환 식물을 제외한 각종 잡초의 생육을 방제할 수 있다. 이러한 잡초로는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 좀돌피(Echinochloa crus - galli (L.) Beauv . var. crus-galli), 바랭이(Digitaria ciliaris (Retz .) Koeler), 강아지풀(Setaria viridis (L.) Beauv .), 새포아풀(Poa annua L.), 무망시리아수수새(Sorghum halepense (L.) Pers .), 뚝새풀(Alopecurus aequalis Sobol . var. amurensis (Komar.) Ohwi), 야생 귀리(wild oats) 등의 벼과 잡초(Gramineae weed)를 비롯하여, 흰여뀌(Polygonum lapathifolium L. nodosum (Pers .) Kitam .), 청비름(Amaranthus viridis L.), 명아주(Chenopodium album L.), 별꽃(Stellaria media (L.) Villars), 어저귀(Abutilon avicennae), 공단풀(Sida spinosa), 결명자꽃(Cassia obtusifolia), 돼지풀(Ambrosia artemisiifolia L. var. elatior (L.) Desc .), 나팔꽃(morning glory) 등의 광엽 잡초(broadleaf weed), 향부자(Cyperus rotundus L.), 기름골(cyperus esculentus), 파대가니(Kyllinga brevifolia Rottb . subsp . leiolepis (Fraxch. et Savat .) T. Koyama), 금방동사니(Cyperus microiria Steud .), 참방동사니(Cyperus iria L.) 등의 다년생/1년생 잡초(perennial or annual cyperaceous weed)를 들 수 있다. 또한, 이속사졸린 유도체를 제초제로 논에 사용하는 경우, 강피(Echinochloa oryzicola Vasing .), 알방동사니(Cyperus difformis L.), 물달개비(Monochoria vaginalis (Burm . f.) Presl . var. plantaginea (Roxb .) Solms -Laub.), 밭뚝 외풀(Lindernia pyxidara L.) 등의 일년생 잡초 (annual weed), 및 너도방동사니(Cyperus serotinus Rottb.), 올방개(Eleocharis kuroguwai Ohwi), 올챙이고랭이(Scirpus juncoides Roxb . subsp . hotarui (Ohwi) T. Koyama) 등 다년생 잡초(perennial weed)도 발아 전부터 성장시기의 넓은 범위에 걸쳐 낮은 약제량(dose)으로 방제할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 실시예에서는, 밀의 GST 중에서 등록번호: Q8GTC0로 지정된 GST(본 실시예에서는 "TaQ8GTC0"이라 함)에 대해 VLCFAE 저해형 제초제에 대한 글루타티온 포합활성(conjugation activity)을 분석하였다.
<TaQ8GTC0 단백질의 대장균 발현체의 구축>
도 1에 TaQ8GTC0 단백질의 대장균 발현체를 구축하는 구성을 나타내었다. 우선, 밀(농림 61호)의 경엽부(shoot)로부터 제조한 RNA를 주형으로 하여 역전사 반응으로 cDNA를 합성하였다. 수득한 cDNA를 주형으로 TaQ8GTC0~H(서열번호 3) 및 TaQ8GTC0~D(서열번호 4) 프라이머 세트를 이용한 PCR 반응을 수행하여, 5' 말단에 NdeI 인식부위, 3' 말단에 BamHI 인식부위를 가지는 TaQ8GTC0 유전자 단편을 얻었다.
그런 다음, 수득한 TaQ8GTC0 유전자 단편을 NdeI 및 BamHI로 처리하여 TaQ8GTC0 유전자 단편을 인서트(insert)로 하고, 마찬가지로 NdeI 및 BamHI 처리한 pET22b(+)를 벡터(vector)로 하였다. 이러한 인서트 및 벡터에 대하여 연결반응(ligation)을 수행하였다. 연결반응 후 반응액을 사용하여 반응액에 포함된 벡터를 대장균 JM109 주에 도입하였다. 이어, 콜로니 PCR(colony PCR)에 의해 표적 플라스미드(target plasmid)의 도입을 확인한 콜로니로부터 플라스미드를 제조하였다. 서열분석에 의해 NdeI 및 BamHI 절단부위 사이에 존재하는 TaQ8GTC0 유전자의 염기서열을 PCR에 의한 오류가 없는지 확인하였다. 수득한 플라스미드를 대장균 BL21(DE3) 주에 도입하여, TaQ8GTC0 단백질을 발현하는 대장균 발현체(KLB-606)를 구축하였다.
<TaQ8GTC0 단백질의 제조>
작제한 대장균 BL21(DE3) 주(KLB-606)를 이용하여 TaQ8GTC0 단백질을 발현시켰다. 단일 콜로니를 50ppm 앰피실린 함유 LB 액체배지에 접종한 후, 하룻밤 시험관에서 배양한 용액을 전 배양액(preculture solution)으로 사용하였다. 2.5ml의 전 배양액을 250ml의 50ppm 앰피실린 함유 LB 액체배지(1L 짜리 삼각 플라스크)에 가하고, 37℃, 200rpm의 조건으로 OD600 = 0.5~0.6이 될 때까지 배양하였다. 이어, 얼음에서 5분간 냉각시킨 후 IPTG를 최종 1mM이 되도록 가하고, 27℃, 200rpm의 조건에서 21시간 TaQ8GTC0 단백질을 발현유도시킨 후, 집균(4℃, 6000 x g의 조건에서 10분간 원심분리)하고 균체를 -80℃에서 저장하였다. 냉동보관된(cryopreserved) 균체(0.5L 배양분)에 30ml의 PBS 완충용액(0.14M NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH 7.3)을 가하고 초음파 처리(TAITEC VP-30S 마이크로 칩, 아웃풋 3, 15초 콘스탄트 x 7~8회)한 후, 4℃, 15,000 x g의 조건에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 그 조효소 용액을 PBS 완충용액으로 평형화한 GSTrap 4B 컬럼(bed vol. 1ml)에 유속 1ml/min으로 로딩하고 20ml 이상의 PBS 완충용액으로 글루타티온 친화성 컬럼을 세척한 후, 2mL의 용출용 완충용액(50mM Tris-HCl, 10mM 환원형 글루타티온, pH 8.0)을 컬럼에 주입하여 TaQ8GTC0 단백질을 용출시켰다(도 2). 이 단백질 용액을 Nanosep(10K)을 이용한 한외여과에 의해 PBS 완충용액으로 치환하고, -80℃에서 저장하였다. 단백질의 농도는 브래드포드(Bradford) 방법으로 TaKaRa Bradford Protein Assay Kit(Takara) 메뉴얼에 따라 측정하였다. 도 2에서, M은 분자량 마커이다. 도 2의 결과에서, 조효소(crude enzyme)와 관통분액(pass-through fraction)의 레인에는 총 단백질 8.0μg을 가하였다. 도 2에서, 조효소는 균체를 초음파 처리하여 원심분리한 상등액이며, 관통분액은 조효소액을 친화성 컬럼에 로딩하여 채취한 용액이다.
<VLCFAE 저해형 제초제에 대한 글루타티온 포합활성 분석>
본 실시예에서 사용된 모든 VLCFAE 저해형 제초제는 아세톤 용액 형태로 반응액에 가하였다. VLCFAE 저해형 제초제에 대한 포합반응은 50㎕의 100mM 인산칼륨 완충용액(pH 6.8), 10㎕의 1mM VLCFAE 저해형 제초제, 20㎕의 10mM 환원형 글루타티온(pH 7.0), 6㎕의 TaQ8GTC0 단백질(전체 378ng, PBS 완충용액) 및 114㎕의 PBS 완충용액을 포함하여 전체 200㎕로 만들고, 30℃에서 15분간 반응시킨 후 0.2μm의 필터를 사용하여 여과한 용액 50㎕를 HPLC에 주입하였다. 이하는 HPLC 분석조건을 나타낸다.
장치: Agilent 1100 series
컬럼: CAPCELL PAK C18 AQ 4.6mmI.D.x250mm(SHISEIDO)
이동상: 아세토니트릴/물 = 5/95(5분간 유지) →(4분) → 40/60(4분간 유지) →(4분) → 90/10(8분간 유지) →(1분) → 5/95(4분간 유지)(각 용매는 0.5% 초산을 포함)
온도: 35℃
유속: 1.0ml/min
검출: 254nm
<결과 및 고찰>
TaQ8GTC0 단백질의 글루타티온 포합활성 시험한 VLCFAE 저해형 제초제를 도 3에 나타내었다. 각 VLCFAE 저해형 제초제에 대한 글루타티온 포합활성을 분석할 때 반응액 중의 VLCFAE 저해형 제초제의 감소량으로 글루타티온 포합체(GS 포합체)의 생성량을 측정하였다. 각 VLCFAE 저해형 제초제에 대한 TaQ8GTC0 단백질의 글루타티온 포합활성을 이하의 표 1에 나타내었다.
제초제 유형 효소활성 (mmol/mg 단백질/15분)a)
Pyroxasulfone Isoxazoline 11.7 ± 3.7
Fenoxasulfone 19.5 ± 8.4
Metolachlor Chloroacetanilide 2.2 ± 0.8
Alachlor 1.5 ± 0.1
Flufenacet Oxyacetamide n.d.b)
Mefenacet n.d.
Anilofos Dithiophosphoric acid n.d.
Piperophos n.d.
Fentrazamide Tetrazolinone 0.93 ± 0.2
Cafenstrole Triazole 0.46 ± 0.1
Indanofan Oxirane n.d.b)
a) 효소활성은 피록사술폰에 대해서는 7회 실험, 다른 약제에 대해서는 4회 실험 평균±표준 편차로 나타내었다.
b) 무검출(not detected)
하나의 실례로서 피록사술폰과 글루타티온의 포합반응 및 VLCFAE 저해형 제초제로 피록사술폰을 사용했을 때 얻어진 HPLC 크로마토그램을 도 4에 나타내었다. 도 4에 도시된 HPLC 크로마토그램 중 상단은 TaQ8GTC0 단백질을 포함하는 글루타티온 포합활성 시험결과, 중간은 TaQ8GTC0 단백질을 포함하지 않는 글루타티온 포합활성 시험결과, 하단은 TaQ8GTC0 단백질과 글루타티온을 포함하지 않는 글루타티온 포합활성 시험결과를 각각 나타낸다.
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, TaQ8GTC0 단백질은 VLCFAE 저해형 제초제 중에서도 이속사졸린 골격을 갖는 피록사술폰 및 페녹사술폰에 대한 포합활성이 특이적으로 높은 것으로 밝혀졌다. 한편, 이속사졸린 골격 이외의 구조를 갖는 VLCFAE 저해형 제초제의 경우는, TaQ8GTC0 단백질에 의한 글루타티온 포합활성이 현저히 낮은 것으로 밝혀졌다. 또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 피록사술폰을 기질로 사용한 반응액에서는 피록사술폰의 GS 포합체(M-15)의 피크가 확인되었다. 이것은 반응액에 첨가한 피록사술폰 전량 10nmol 중 4.81nmol 상당량이 GS 포합체가 된 것을 나타낸다.
본 실시예에서 카펜스트롤(cafenstrole)에 대한 포합활성은 이 제초제의 글루타티온 포합에 의해 유리되는 화합물을 정량하여 측정하였다. 또한, 8개의 제초제(메톨라클로, 알라클로, 플루페나셋, 메페나셋, 펜톨라자미드, 인다노판, 아닐로포스, 및 피페로포스)의 글루타티온 포합체의 피크가 불분명하였으므로, 이들 약제의 글루타티온 포합활성을 분석할 때 먼저 반응조건을 바꾸어(반응액에 첨가하는 효소량을 늘리거나 반응시간을 길게 한다), 글루타티온 포합체(GS 포합체)를 생성시켜 LC/MS로 피크를 동정하였다.
본 실시예에서는 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 형질전환 벼를 작제하고, 상기 형질전환 벼의 VLCFAE 저해형 제초제에 대한 감수성을 시험하였다.
<형질전환 벼의 작제>
본 실시예에서는 도 5에 나타낸 바와 같이, TaQ8GTC0 유전자의 벼 형질전환용 벡터(R-5-TaQ8GTC0)를 작제하였다.
구체적으로, 먼저 밀(농림 61호)의 경엽부로부터 제조한 RNA를 주형으로 역전사 반응으로 cDNA를 합성하였다. 수득한 cDNA를 주형으로 하고 TaQ8GTC0~M(서열번호 5), TaQ8GTC0~N(서열번호 6)의 프라이머 세트를 이용한 PCR 반응을 수행하여, 5' 말단에 SalI 인식부위, 3' 말단에 NotI 인식부위를 가지는 TaQ8GTC0 유전자의 유전자 단편을 수득하였다.
그런 다음, 수득한 TaQ8GTC0 유전자 단편을 SalI 및 NotI 처리한 후 TaQ8GTC0 유전자 단편을 인서트로 사용하고, 마찬가지로 SalI 및 NotI을 처리한 pENTR-1A (Thermo Fisher Scientific Inc.)를 벡터로 사용하였다. 이러한 인서트 및 벡터를 사용하여 결합반응을 수행하였다. 이렇게 작제된 엔트리 클론(pENTR1A-TaQ8GTC0)을 형질전환하여 대장균 JM109 주에 도입하였다. 그런 다음, 콜로니 PCR에 의해 표적 플라스미드의 도입이 확인된 콜로니로부터 플라스미드를 제조하였다. 서열분석에 의해 SalI 및 NotI 절단부위 사이에 존재하는 TaQ8GTC0 유전자의 염기서열을 PCR에 의한 오류가 없는지 확인하였다.
이어, 작제된 엔트리 클론(pENTR1A-TaQ8GTC0)(KLB-649)과 목적 벡터 (destination vector)인 PalSelect R-5(Inplanta Innovations Inc.)과 LR 반응을 실시하여 작제한 발현벡터(PalSelect R-5의 attB 서열 사이에 TaQ8GTC0 유전자를 삽입한 벼 형질전환용 벡터)를 형질전환에 의해 대장균 HST02주에 도입하였다. 그런 다음, 콜로니 PCR에 의해 표적 플라스미드의 도입이 확인된 콜로니에서 플라스미드를 제조하여, 서열분석에 의해 attB 서열 사이에 삽입된 TaQ8GTC0 유전자의 염기서열이 올바른지 확인하였다(KLB-650).
<형질전환에 의한 TaQ8GTC0 유전자의 벼에 도입>
작제한 벼의 형질전환용 벡터 KLB-650(PalSelect R-5-TaQ8GTC0)을 전기천공법 (electroporation)으로 아그로박테리움(EHA105)에 도입하였다(KLB-654). 이어, 아그로박테리움법(S. Toki Plant Mol. Biol. Rep. 15 16-21(1997))에 의해 TaQ8GTC0 유전자를 벼의 배양세포에 도입한 후, 비스피리백 나트륨염(BS)으로 선발하였다.
TaQ8GTC0 유전자를 형질전환하여 벼에 도입하고 1개월간 0.25μM의 비스피리백 나트륨염(BS)으로 TaQ8GTC0 유전자가 도입된 벼의 배양세포를 선발한 결과, 선발배지에서 형질전환 벼의 배양세포가 KLB-279(TaQ8GTC0 유전자 대신 GFP 유전자가 도입된 양성 대조구)에서와 마찬가지로 확인되었다(도 6). 이러한 형질전환 벼의 배양세포를 약제 무첨가 재분화 배지에 이식한 후, 수득한 식물체에 대해서 순차적으로 격리 온실에서 재배하였다. 격리 온실에서의 재배 개시로부터 평균 2개월에 모든 식물체에서 출수(ear emergence)가 확인되어, 이러한 식물체로부터 후대 종자(T1)를 채종하였다.
<TaQ8GTC0 유전자 도입 벼의 피록사술폰 내성>
18 계통의 벼 식물체에 대하여 겔란 검(gellan gum)을 배지로 하는 발아 생육저해 시험으로 피록사술폰에 대한 내성을 조사하였다.
호그랜드 믹스(Hoagland's mix)와 3g의 겔란 검을 1L의 증류수에 현탁시킨 후, 전자레인지에서 따뜻하게 충분히 용해시켰다. 그것의 15ml를 식기 전에 관형 병(tubular bottle)에 주입하였다(플레이트에는 30ml를 주입). 젤란 검 배지를 관형 병 또는 플레이트에 주입과 동시에 약제를 가하여 잘 혼합하였다. 벼의 겨(rice hull)를 50배 희석한 차아염소산나트륨 용액(antiformin, Wako)에 20분 정도 담근 후 잘 세척하였다. 멸균처리한 종자를 증류수에 담가 27℃에서 최아(germination)할 때까지 방치하였다(약 2일). 최아된 종자를 새싹을 위로 향하게 하여 0.25μM BS를 포함하는 겔란 검 배지(플레이트)에 가볍게 이식하였다. 이들과 증류수를 넣은 비이커를 함께 투명한 케이스에 넣고, 랩으로 뚜껑을 덮어 27℃, 형광등 조명 하(명기 14시간, 암기 10시간)에서 2일간 생육시켰다. 그런 다음, 근부 신장(root elongation)을 지표로 BS 내성을 가지는 것으로 판단된 벼의 종자를 피록사술폰(최종 농도 10-8, 10-7, 10-6, 10-5M)을 함유하는 겔란 검 배지(관형 병)에 이식하였다. 이어, 이들과 증류수를 넣은 비이커를 함께 투명한 케이스에 넣고 랩으로 뚜껑을 덮고, 27℃, 형광등 조명 하(명기 14시간, 암기 10시간)에서 4~5일간 생육시킨 후 초장(plant height)을 측정하였다. 약제의 저해는 초장을 지표로 약제 무첨가구에 대한 생육저해율을 산출하고, 50% 생육저해 농도(IC50 값)는 프로빗(Probit) 법에 의해 측정하였다.
상술한 TaQ8GTC0 유전자 도입 벼의 피록사술폰에 대한 내성시험의 결과를 이하의 표 2에 나타내었다.
계통 IC50(nM) 피록사술폰 내성1 )
Wild 39 -
#1-3 1139 29
#1-4 1306 33
#1-7 969 25
#1-10 510 13
#2-6 968 25
#2-9 1091 28
#3-4 1720 44
#3-9 1007 26
#3-12 67 2
#3-13 13751 353
#4-1 496 13
#4-3 4315 111
#4-7 7146 183
#4-10 2118 54
#4-13 3852 99
#4-14 45 1
#5-1 968 25
#5-11 983 25
표 2에서 1)은 IC50(형질전환 벼)/IC50(야생형 벼)의 값이다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 시험에 사용한 18계통 중 16계통이 야생형에 비해 피록사술폰에 대해 10배 이상의 내성을 보였으며, 가장 강한 계통(#3-13)에서는 약 350배의 내성이 확인되었다.
<야생형 벼의 생육을 저해하는 VLCFAE 저해형 제초제의 최소농도의 결정>
TaQ8GTC0 유전자 도입 벼의 약제내성 여부는 야생형 벼와 감수성 차이를 지표로 판단하기 때문에, 글루타티온 포합활성 시험 대상 VLCFAE 저해형 제초제에 대한 야생형 벼(Nipponbare)의 감수성 시험을 다음과 같이 실시하였다.
겔란 검을 배지로 하여 발아 생육억제 시험을 실시하였다. 호그랜드 믹스 3g의 겔란 검을 1L의 증류수에 현탁시킨 후, 전자레인지로 가열하여 충분히 용해시켰다. 그중 15ml를 식기 전에 관형 병에 주입하였다. 약제(아세톤 용액)를 관형 병에 주입시에는 동시에 첨가하여 잘 혼합하였다(최종 아세톤 농도는 0.1%). 벼의 겨를 50배 희석한 차아염소산나트륨 용액(antiformin, Wako)에 20분 정도 담근 후 잘 세척하였다. 멸균처리한 종자를 증류수에 담가 27℃의 온도조건으로 최아 때까지 방치하였다(약 2일). 최아된 종자를 새싹 쪽을 위로하여 약제 함유 겔란 검 배지(관형 병)에 이식하였다. 이어, 이들과 증류수를 넣은 비이커를 함께 투명한 케이스에 넣고 랩으로 뚜껑을 덮어 27℃, 형광등 조명 하(명기 14시간, 암기 10시간)에서 1주일 생육시킨 후 식물체를 샘플링하여 초장을 측정하였다. 약제의 저해는 초장을 지표로 약제 무첨가구에 대한 생육저해율을 산출하고, 50% 생육저해 농도(IC50 값)는 프로빗(Probit) 법에 의해 측정하였다.
글루타티온 포합활성을 시험한 VLCFAE 저해형 제초제에 대한 야생형 벼(Nipponbare)의 감수성을 시험하였다. 시험결과로부터 밝혀진 각 약제의 야생형 벼의 생육에 대한 IC50 값 및 생육을 저해하는 최소농도를 이하의 표 3에 나타내었다.
약 제 IC50 (nM) 저해 최소농도 (mM)
Pyroxasulfone 48 0.075
Fenoxasulfone 54 0.05
Flufenacet 42 0.075
Mefenacet 388 0.75
Alachlor 332 0.5
Metolachlor 636 0.75
Anilofos 377 0.5
Piperophos 1311 2.5
Fentrazamide 46 0.5
Indanofan 61 0.25
Cafenstrole 131 0.75
<TaQ8GTC0 유전자 도입 벼의 VLCFAE 저해형 제초제에 대한 내성시험>
TaQ8GTC0 유전자 도입 벼의 VLCFAE 저해형 제초제에 대한 내성시험을 상술한 피록사술폰 내성시험과 동일한 방법으로 실시하였다. 본 시험예에서는 표 4에 나타낸 바와 같이, 야생형 벼(Nipponbare)의 생육을 완전히 저해하는 최소농도(x1), 최소농도의 4배 농도(x4), 최소농도의 16배 농도(x16)의 총 3개의 농도에서 VLCFAE 저해형 제초제에 대한 내성시험을 실시하였다.
약 제 시험 농도 (mM)
x 1a) x 4b) x 16c)
Pyroxasulfone 0.075 0.30 1.2
Fenoxasulfone 0.05 0.20 0.8
Flufenacet 0.075 0.30 1.2
Mefenacet 0.75 3.0 12
Alachlor 0.5 2.0 8.0
Metolachlor 0.75 3.0 12
Anilofos 0.5 2.0 8.0
Piperophos 2.5 10 40
Fentrazamide 0.5 2.0 8.0
Indanofan 0.25 1.0 4.0
Cafenstrole 0.75 3.0 12
표 4에서, a)는 야생형 벼(Nipponbare)의 생육을 저해하는 최소농도를 나타내고, b)는 a)의 4배 농도를 나타내며, c)는 a)의 16배 농도를 나타낸다.
본 시험예에서는 야생형 벼를 비교 대조구로하여, 피록사술폰에 강한 내성을 나타낸 #3-13 계통 TaQ8GTC0 유전자 도입 벼를 사용하였다. 결과를 도 7a~도 7f에 나타내었다. 또한, 도 7a~도 7f에서는 좌에서 우로 가면서, 약제 농도 0μM, 표 4의 최소농도(x1), 표 4의 최소농도의 4배 농도(x4), 표 4의 최소농도 16배 농도(x16)를 나타낸다.
피록사술폰 및 페녹사술폰 처리구에서는, 시험의 최고농도(최소농도의 16배 농도)에서도 TaQ8GTC0 유전자 도입 벼의 생육에 영향은 보이지 않으면서 강한 내성을 나타낸 것에 반하여(도 7a), 6개의 약제(플루페나셋, 아닐로포스, 피페로포스, 카펜스트롤, 인다노팬, 휀트라자미드)의 처리구에서는, 최소농도에서도 생육이 저해되고 있으며, 이러한 약제에 대해서 TaQ8GTC0 유전자 도입 벼는 내성을 보이지 않았다(도 7b~도 7d). 또한, 3개의 약제(메톨라클로, 알라클로, 메페나셋)에 대해서는 최소농도에서는 생육에 영향을 미치지 않으나 최소농도의 4배 농도(x4)에서는 생육이 저해되는 것으로부터, 이 세가지 약제에 대한 TaQ8GTC0 유전자 도입 벼의 내성은 실용적 수준에 도달하지 않은 매우 약한 것으로 판단되었다(도 7e 및 도 7f).
또한, 데이터는 제시하지 않았지만, 피록사술폰에 대하여 #3-13 계통과 대등하게 강한 내성을 나타낸 #4-7 계통의 각종 약제에 대한 감수성 강도는 #3-13과 동일하였다.
상술한 바와 같이, TaQ8GTC0 유전자 도입 벼는 VLCFAE 저해형 제초제 중 이속사졸린계 제초제에 특이적으로 내성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 또한, 본 형질전환 벼의 약제내성은 TaQ8GTC0 단백질의 글루타티온 포합활성과 대체로 상관관계가 있었다.
본 실시예에서는 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 형질전환 애기장대를 작제하고, 상기 형질전환 애기장대에 있어서의 VLCFAE 저해형 제초제에 대한 감수성을 시험하였다.
<형질전환 애기장대의 작제>
먼저, 도 8에 나타낸 바와 같이, TaQ8GTC0 유전자를 갖는 애기장대 형질전환용 벡터(A-3-TaQ8GTC0)를 작제하였다. 구체적으로, pENTR1A(Thermo Fisher Scientific Inc.)의 attL1과 attL2 사이에 TaQ8GTC0 유전자(ORF)를 삽입한 엔트리 클론(pENTR1A-TaQ8GTC0, KLB-649)과 목적 벡터(destination vector)인 PalSelect A-3(Inplanta Innovations Inc.)과 LR 반응에 의해 애기장대 형질전환용 벡터를 작제하였다. 이 애기장대 형질전환용 벡터는 PalSelect A-3의 attB 서열 사이에 TaQ8GTC0 유전자를 삽입한 것이다. 이어, 작제된 애기장대 형질전환용 벡터를 형질전환에 의해 대장균 HST02주에 도입하였다. 그런 다음, 콜로니 PCR에 의해 표적 플라스미드의 도입을 확인한 콜로니에서 플라스미드를 제조하여, 서열분석에 의해 attB 서열 사이에 삽입한 TaQ8GTC0 유전자의 염기서열이 올바른지 확인하였다(KLB-707).
<형질전환에 의한 TaQ8GTC0 유전자의 애기장대에 도입>
상술한 바와 같이 작제한 애기장대 형질전환용 벡터(PalSelect A-3-TaQ8GTC0)를 전기천공법으로 아그로박테리움(EHA105)에 도입하였다(KLB-718). 이어, 플로랄 딥(Floral dip) 법(S.J. Clough 등, Plant J. 16 735-743(1998))에 의해 TaQ8GTC0 유전자를 애기장대에 도입한 후, 비스피리백 나트륨염(BS)으로 선발하였다.
<형질전환 애기장대의 유전자 확인>
상술한 바와 같이 수득한 형질전환 애기장대 식물체에서 Ampdirect Plus 샘플 용액(Shimadzu)[20mM Tris-HCl(pH 8.0), 5mM EDTA, 400mM NaCl, 0.3% SDS, 200μg/ml Proteinase K]를 이용하여 간단한 방법으로 게놈 DNA를 추출하였다. 이를 주형으로 KAPA 3G DNA 중합효소(KAPA BIOSYSTEMS)를 이용하여, 이하의 조건으로 PCR에 의해 유전자의 도입을 확인하였다.
PCR은 총 50㎕의 반응액(0.4㎕ 주형, 0.3㎕ 50μM 센스 프라이머 (Sequence(TaQ8GTC0)-2: 서열번호 7), 0.3㎕ 50μM 안티센스 프라이머(NOSter-13: 서열번호 8), 25㎕ KAPA Plant PCR 완충용액, 0.4㎕ KAPA 3G DNA 중합효소, 23.6㎕ 멸균수)로 행하였다. PCR은 초기 변형: 95℃에서 20초, 변형: 95℃에서 20초, 연결: 58℃에서 15초, 연장: 72℃에서 30초(40사이클), 최종 연장: 72℃에서 4분으로 행하였다.
이어, 애기장대 형질전환용 벡터(PalSelect A-3-TaQ8GTC0)를 도입한 아그로박테리움(KLB-718)을 이용하여, 형질전환에 의하여 애기장대에 TaQ8GTC0 유전자를 도입하였다. 그런 다음, 형질전환한 애기장대 식물체에서 채취한 종자(총 약 50,000 개)를 0.1μM BS를 포함하는 선발배지에 파종하여 선발 마커(W574L/S653I 돌연변이 애기장대 ALS)의 유무를 지표로 형질전환체를 선발하였다. 그 결과, 총 30개체가 생육하고 있음을 확인하였다(도 9). 도 9에 나타낸 사진은 파종 후 14일 후 모습을 나타내고, 선발배지에서 생육시킨 총 30개체의 형질전환체 중 3개체를 나타낸다. 또한, 이들 중 10개체를 선택하고, 이들 잎에서 간이추출한 게놈 DNA를 주형으로 PCR 반응을 실시한 결과, 목적으로 하는 밀 GST 유전자의 도입이 확인되었다(도 10). 도 10에서, 레인 1~10은 선발배지에서 생육시킨 전체 30개체에서 10개체를 선택하고, 각 개체에서 간이추출한 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR 결과를 보여준다. 상술한 Sequence(TaQ8GTC0)-2와 Noster-13의 프라이머 세트를 이용하여, PCR로 영역 A를 (563bp) 증폭시켰다. 도 10의 전기영동 사진에서, 왼쪽 레인은 100bp DNA 래더(ladder)이다.
<TaQ8GTC0 유전자가 도입된 애기장대의 피록사술폰 내성시험>
TaQ8GTC0 유전자가 도입된 애기장대의 피록사술폰 내성을 알아보기 위하여, 다음과 같이 배지를 제조하였다: 먼저, 무라시게-스쿡(Murashige-Skoog, MS) 배지(1봉지), 티아민 하이드로클로라이드(3mg), 니코틴산(5mg), 피리독신 하이드로클로라이드(0.5mg), 수크로스(10g)을 1L 비이커에 가한 다음, pH를 5.7로 조정하고 부피를 1L로 맞춘 후 8g(0.8%)의 아가를 가하였다. 이것을 고압살균한 다음, 실온까지 냉각시키고 피록사술폰(아세톤 용액)을 가하였다. 이의 30ml 분획을 2번 각 플레이트(No. 2 square plate)에 분주하고, 소정 농도의 피록사술폰이 포함된 MS 배지를 준비하였다.
이러한 배지를 이용하여 형질전환 애기장대의 피록사술폰 감수성 시험을 다음과 같이 실시하였다: 필요량의 애기장대의 건조 종자를 70% 에탄올 중에 2분, 차아 염소산(0.02% Triton-X-100) 중에서 15분 교반하고, 멸균수로 10회 세척하였다. 이어, 종자를 고압살균한 0.1% 한천 용액 1ml에 현탁시키고, 이 용액을 잘 혼합하여 균일하게 만든 다음, 배지 표면에 1개씩 총 30개를 치상(置床)하였다. 서지컬 테이프로 밀봉하여 4℃에서 2일간 방치한 후 22℃로 옮겨 발아시켰다.
야생형 애기장대(Columbia-0)에 대한 시험결과를 도 11에 나타내었으며, TaQ8GTC0 유전자가 도입된 애기장대에 대한 시험결과를 도 12에 나타내었다. 또한, 도 11 및 도 12에 나타낸 사진은 22℃에서 14일간 생육시킨 후 촬영한 사진이다.
도 11에서 보듯이, 야생형 애기장대는 피록사술폰 농도가 100nM에서 생육이 다소 억제되고, 1μM 이상에서는 거의 완전히 억제되었다. 이에 대해, 도 12에서 보듯이, TaQ8GTC0 유전자가 도입된 애기장대는 피록사술폰 농도가 1μM에서 약제 무첨가구(control)와 동일하게 생육하고 있을 뿐만 아니라, 10μM에서도 1μM에 비해 다소 생육억제는 인정되지만 충분히 생육하고 피록사술폰에 대해 강한 내성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 본 시험예에서는 시험한 7 계통의 TaQ8GTC0 유전자가 도입된 애기장대가 야생형(Columbia-0)에 비해 적어도 10배 피록사술폰 내성을 나타내었다. 또한, 도 12는 특히 강한 내성을 나타내는 형질전환 애기장대(KLB-718 1-1-5)의 결과를 보여준다. 이러한 결과로부터, 밀의 GST(TaQ8GTC0)는 애기장대에서 기능을 하고, 피록사술폰에 내성을 부여하는 것으로 밝혀졌다.
<애기장대 식물체의 VLCFAE 저해형 제초제에 대한 감수성 시험>
본 시험예에서는 야생형 애기장대의 VLCFAE 저해형 제초제에 대한 감수성 시험을 상술한 TaQ8GTC0 유전자가 도입된 애기장대의 피록사술폰 내성시험과 동일한 방법으로 행하였다.
우선, 야생형 애기장대의 생육이 강하게 저해되는 VLCFAE 저해형 제초제 농도를 결정한 결과를 표 5에 나타내었다.
약 제 시험 농도 (mM)
Pyroxasulfone 1
Fenoxasulfone 1
Flufenacet 1
Mefenacet 100
Alachlor 100
Metolachlor 100
Anilofos 10
Piperophos 100
Fentrazamide 10
Indanofan 100
Cafenstrole 1
이어, 이러한 시험 농도를 채용하여 VLCFAE 저해형 제초제에 대한 TaQ8GTC0 유전자가 도입된 애기장대의 약제 감수성을 조사하고, 그 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다. 도 13 및 도 14에 나타낸 사진은 22℃의 온도조건에서 14일간 생육시킨 후 촬영한 사진이다. 도 13 및 도 14에서 보듯이, TaQ8GTC0 유전자가 도입된 애기장대(가장 내성이 강한 KLB-718 1-1-5을 시험)에서는 이속사졸린계의 피록사술폰 (pyroxasulfone) 및 페녹사술폰(fenoxasulfone)에 대해 강한 내성을 나타내었다(도 13). 한편, 다른 9 종류의 약제에 대해서는 TaQ8GTC0 유전자가 도입된 애기장대의 생육이 야생형과 마찬가지로 강력하게 저해되고 있었다(도 13 및 도 14).
이상의 결과로부터 TaQ8GTC0 유전자가 도입된 애기장대는 이속사졸린계 제초제에 특이적인 내성을 나타내는 것이 밝혀졌다. 또한, TaQ8GTC0 유전자가 도입된 애기장대의 약제내성은 TaQ8GTC0 단백질의 약제에 대한 글루타티온 포합활성과 대체로 상관관계가 있었다.
본 실시예에서는 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 형질전환 벼의 고온 스트레스에 대한 내성을 시험하였다.
우선, TaQ8GTC0 유전자가 도입된 벼의 피록사술폰 내성시험과 동일한 방법으로, 겔란 검 배지(플레이트)의 뿌리 부분의 신장으로 BS 내성을 가지고 있는 것으로판단된 TaQ8GTC0 유전자 도입 벼 종자를 플라스틱 컵에 이식하였다(야생형 벼는 BS 무첨가 겔란 검 배지에서 생육된 개체를 플라스틱 컵에 이식하였다). 격리 온실에서 1주간 생육시킨 후 고온처리(50℃, 2시간 30분)하고, 격리 온실에서 1주간 생육시킨 후, 벼의 초장(plant height)과 근중(root weight)을 측정하였다. 또한, 본 실시예에서는 실시예 2에서 작제한 TaQ8GTC0 유전자 도입 벼 중 #4-7 및 #3-13을 사용하였다.
총 3회의 시험에서 비슷한 결과를 얻을 수 있었기 때문에, 그 중 1회 시험결과를 도 15에 나타내었다. 시험결과 초장과 근중 모두 야생형 벼에 비해 TaQ8GTC0 유전자 도입 벼 쪽이 고온처리에 의해 받는 영향은 작고, 작제한 TaQ8GTC0 유전자 도입 벼는 고온 스트레스 내성을 가지고 있음이 밝혀졌다.
비교예 1
본 비교예에서는 실시예 1 내지 실시예 4에서 이속사졸린 유도체에 대한 내성 및 고온 스트레스에 대한 내성에 관여하는 TaQ8GTC0과 높은 상동성을 갖는 다른 식물의 GST 대하여 피록사술폰 대사활성을 분석하였다.
구체적으로, 도 16에 TaQ8GTC0와 상기 TaQ8GTC0과 높은 상동성을 갖는, 밀 및 옥수수 유래 GST가 11개 분자종, 같은 작용성의 메톨라클로 대사활성을 가지는 벼 유래 GST의 3개 분자종(I. Cummins 등, Plant Mol. Biol. 52, 591-603(2003); B. McGonigle 등, Plant Physiol. 124, 1105-1120(2000); HY Cho 등 Pestic. Biochem. Physiol. 83, 29-36(2005); HY Cho 등 Pestic. Biochem. Physiol. 86, 110~115 (2006); 및, HY Cho 등 J. Biochem. Mol. Biol. 40, 511-516(2007))의 총 14개 식물의 GST를 나타낸다. 본 비교예에서는 이러한 식물 GST 유전자를 각각 도입한 벼 배양세포를 작제하고, 피록사술폰에 대한 내성 유무를 확인하였다. 또한, 도 16에서 괄호 안의 숫자는 밀 GST(TaQ8GTC0)의 아미노산 서열에 대한 상동성을 나타낸다.
구체적으로, 7 유전자에 대해서는 피록사술폰산 함유 배지에서 액체배양한 벼 배양세포의 지방산 함유량, 2 유전자에 대해서는 약제 함유 플레이트에서 벼 배양세포의 증식을 지표로 대사활성의 유무를 분석하였다.
<벼 배양세포에서 지방산 함량을 지표로 한 피록사술폰 대사활성 분석>
먼저, 도 17에 나타낸 바와 같이, 벼 형질전환용 벡터를 작제하였다. 본 예에서는 벼(Nipponbare), 밀(농림 61호)와 옥수수(Pioneer 32K61) 경엽부로부터 제조한 RNA의 역전사 반응으로 cDNA를 각각 준비하였다. 수득한 cDNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 5' 말단에 XbaI, 3' 말단에 AflII 제한효소 부위를 부여한 각 GST 유전자의 전장을 증폭하였다. 그런 다음, 그 3' 말단을 AflII 처리하고 T4 DNA 효소에 의해 평활화한 다음, 5' 말단을 제한효소 XbaI으로 처리하였다. 이어, PalSelect R-4 (Inplanta Innovations Inc)의 MCS 영역에 CSP(벼의 캘러스 특이적 프로모터: Gene Locus Os10g0207500)::GUS::NOSt의 구조체가 도입된 KLB-224을 SacI 처리한 후, T4 DNA 효소에 의해 평활화하고 XbaI 처리하여 벡터 단편을 수득하였다.
위의 GST 유전자 단편과 벡터 단편을 결합하여 작제한 벡터를 형질전환에 의해 대장균(HST-02주)에 도입하였다. 형질전환 반응액의 일부를 50ppm 스펙티노마이신 함유 LB 고체배지에 도포하고 37℃에서 하룻밤 배양하여, 생육시킨 여러 콜로니를 주형으로 한 PCR에 의해 목적하는 벡터가 도입된 콜로니를 선택하였다. 상기 콜로니를 50ppm 스펙티노마이신 함유 YM 액체배지에 접종하고 37℃에서 하룻밤 배양한 다음, 균체로부터 플라스미드를 제조하였다. 이어, 서열분석을 통해 벡터에 삽입한 목적 유전자의 전체서열과 5' 및 3'의 양말단 부분의 염기서열을 분석하였다. 이하에는 각 GST 유전자를 삽입한 벼 형질전환용 벡터 작제시 사용된 프라이머의 염기서열을 나타내었다.
벼 유래의 OsGSTF5에 대해 이하의 프라이머 세트를 사용하였다.
OsGSTF5-1: 5'-AAAAAATCTAGAAAAGTGCAGGGCAAATTC-3'(센스: 서열번호 9)
OsGSTF5-2: 5'-AAAAAACTTAAGCTATGGTATGTTCCCACT-3'(안티센스: 서열번호 10)
벼 유래의 OsGSTU5에 대해 이하의 프라이머 세트를 사용하였다.
OsGSTU5-1: 5'-AAAAAATCTAGAATCTTCTTCTCCGACGAG-3'(센스: 서열번호 11)
OsGSTU5-2: 5'-AAAAAACTTAAGCTACTTGGCGCCAAACTT-3'(안티센스: 서열번호 12)
밀 유래 TaQ8GTB9에 대해 이하의 프라이머 세트를 사용하였다.
TaQ8GTB9(GSTF4)-1: 5'-AAAAAATCTAGAATGGAGCCTATGAAGGTG-3'(센스: 서열번호 13)
TaQ8GTB9(GSTF4)-2: 5'-AAAAAACTTAAGTCATGGTATTCTCCCGCT-3'(안티센스: 서열번호 14)
옥수수 유래의 ZmB6T8R4에 대해 다음 프라이머 세트를 사용하였다.
ZmB6T8R4(Corn)-3: 5'-AAAAAATCTAGATCGTTTCGAGGCCGAT-3'(센스: 서열번호 15)
ZmB6T8R4(Corn)-2: 5'-AAAAAACTTAAGTCACTTGGCCCCGAACTT-3'(안티센스: 서열번호 16)
옥수수 유래의 ZmQ9ZP61에 대해 이하의 프라이머 세트를 사용하였다.
ZmQ9ZP61(GST6)-3: 5'-AAAAAATCTAGATACCAGCCACGTCGCTT-3'(센스: 서열번호 17)
ZmQ9ZP61(GST6)-2: 5'-AAAAAACTTAAGTCACTTGGCCCCGAACTT-3'(안티센스: 서열번호 18)
옥수수 유래의 ZmM16901에 대해 이하의 프라이머 세트를 사용하였다.
M16901(GSTI)-3: 5'-AAAAAATCTAGAGTTGGGTCTGGGACAC-3'(센스: 서열번호 19)
M16901(GSTI)-2: 5'-AAAAAACTTAAGTCAAGCAGATGGCTTCAT-3'(안티센스: 서열번호 20)
옥수수 유래의 ZmY12862에 대해 다음 프라이머 세트를 사용하였다.
ZmY12862(GST5)-1: 5'-AAAAAATCTAGAATGGCCGAGGAGAAGAAG-3'(센스: 서열번호 21)
ZmY12862(GST5)-2: 5'-AAAAAACTTAAGCTACTCGATGCCCAGCCT-3'(안티센스: 서열번호 22)
즉, 도 16에 나타낸 총 14 유전자 중 7 유전자에 대해 각각 벼 형질전환용 벡터(PalSelect R-4-GST)를 작제하였다. 또한, 일부 유전자에 관해서는 벡터에 삽입한 서열이 데이터베이스의 서열은 상이하였다. 이러한 차이를 표 6에 나타내었다.
GST 유전자 염기서열의 차이 아미노산 서열의 차이
TaQ8GTB9 C->G, 84번 위치 Asp(D)->Glu(E)
T->G, 178번 위치 Tyr(Y)->Asp(D)
C->G, 315번 위치 His(H)->Gln(Q)
ZmM16901 C->A, 207번 위치 -
G->T, 363번 위치 -
T->C, 528번 위치 -
ZmB6T8R4 A->G, 532번 위치 Ile(I)->Val(V)
G->C, 565번 위치 Ala(A)->Pro(P)
G->C, 603번 위치 -
C->A, 604번 위치 Leu(L)->Met(M)
G->A, 629번 위치 Gly(G)->Glu(E)
ZmY12862 A->C, 79번 위치 Met(M)->Leu(L)
G->A, 124번 위치 Gly(G)->Arg(R)
C->A, 251번 위치 Ala(A)->Glu(E)
C->G, 333번 위치 -
C->T, 453번 위치 -
표 6에서 "-"는 아미노산 서열에 차이가 없음을 의미한다. OsGSTF5, OsGSTU5, ZmQ9ZP61의 경우, 데이터베이스의 서열과 완전히 일치하였다.
<형질전환에 의한 GST 유전자의 벼에의 도입>
상술한 바와 같이 작제한 각종 GST 유전자를 갖는 벼 형질전환용 벡터 (PalSelect R-4-GST)를 전기천공법에 의해 아그로박테리움(EHA105)에 도입하였다. 이어, 아그로박테리움법(S. Toki Plant Mol. Biol. Rep. 15 16-21(1997))에 따라 GST 유전자를 벼 배양세포에 도입한 후, 비스피리백 나트륨염(BS)으로 선발하였다.
<벼 형질전환 배양세포의 배양>
상술한 바와 같이 작제한 벼 형질전환 배양세포를 피록사술폰산의 존재하에 배양하였다. 피록사술폰은 아세톤 용액으로 액체배지에 첨가하였다. 최종 아세톤 농도는 0.1%로 하였다. 배양시에는 KLB-279(PalSelect R-4의 MCS 부분에 Act1p(벼의 액틴 1프로모터): sGFP:: NOSt을 포함하는 플라스미드)로 형질전환된 벼의 배양세포를 대조구로 하였다. 이하의 방법으로 배양하였다.
무라시게·스쿡(Murashige-Skoog) 배지용 혼합 염류(MS 무기염) 1봉지, 10mg/ml의 티아민 염산염 1ml, 5mg/ml의 니코틴산 1ml, 10mg/ml의 피리독신 염산염1ml, 2mg/ml의 글리신 1ml, 0.2mg/ml의 2,4-D 1ml, 30g의 자당(수크로스), 50mg/ml의 myo-이노시톨 1ml를 1L의 비이커에 넣고, pH를 5.7로 맞추고 증류수로 정확히 1000ml로 만든 후 고압살균하였다. 이 액체배지를 50ml 넣은 200ml 삼각 플라스크에 피록사술폰을 0.05ml를 가한 후, 위와 같은 조성으로 3g의 겔란 검 및 0.25μM BS를 포함하는 고체배지에서 증식된 대조구 벼 배양세포 및 위와 같이 작제한 벼 형질전환 배양세포를 약 0.5g 첨가하여 14~17일간 배양하였다. 배양 후에 액체배지를 제거하고 벼 배양세포를 회수하였다.
형질전환하여 1개월간 0.25μM의 비스피리백 나트륨염(BS)에서 GST 유전자가 도입된 벼의 배양세포를 선발하였다. 이어, 선발배지에서 증식된 신선한 벼의 배양세포를 약 1개월간 원뿔형 비이커에서 대량 배양한 후, 피록사술폰산 함유 배지에서 배양하였다. 배양시 약제 농도는 벼 배양세포에서 지방산 함유량에 피록사술폰이 영향을 미치도록 10-7M 또는 10-6M로 만들었다(Y. Tanetani 등, Pestic. Biochem. Physiol. 95 47-55(2009)). 또한, 돌연변이 ALS가 벼 배양세포에서 기능하는 경우에 지방산 함유량에 영향을 미칠 가능성을 고려하고, 대조구(control)로 KLB-279 (PalSelect R-4의 MCS 부분에 Act1p:: sGFP:: NOSt을 포함하는 플라스미드)로 형질전환된 벼 배양세포를 사용하였다.
<벼 배양세포에서 지방산 함량을 지표로 한 피록사술폰 대사활성 분석>
지방산은 운데센산(C11:1)을 내부 표준물질로 추출하였다. 분석 표준품으로 C14:0, C16:0, C16:1, C18:0, C18:1, C18:2, C18:3, C20:0, C22:0, C22:1, C24:0을 포함하는 슈펠코(Supelco)사의 FAME mix 및 기타 지방산 메틸에스테르(C11:1, C15:0, C20:1, C26:0)를 이용하여 각각의 검량선(calibration curve)을 작성하고 정량하였다. 각 지방산 메틸에스테르는 가스크로마토그래피(GC)의 유지시간 및 질량 스펙트럼으로 동정하였다. 또한, 정량 및 정성은 메틸에스테르로 행하였는데, 정량분석에서는 분자량을 기준으로 지방산의 양을 환산하였다.
배양세포 1g에 대하여 물 10ml, 메탄올 25ml, 클로로포름 12.5ml 외에도 마이크로테크 니티온(Microtec Nition)사의 히스코트론(Hiscotron)을 사용하여 배양세포를 분쇄하였다. 이때, 클로로포름에 용해된 내부표준(internal standard)(10~운데센산(C11:1))을 0.1mg 가하였다. 파쇄에 사용한 용액을 진공흡입 여과하여 분액 깔때기(separatory funnel)에 넣고, 40ml의 클로로포름 및 50ml의 포화 황산암모늄 수용액을 가한 후 충분히 지방산 지질을 추출하기 위해 30분 정도 방치하고, 클로로포름에 의한 지질의 추출 조작을 2회(총 3회) 반복하였다. 회수된 클로로포름층을 분액 깔때기에 넣고 물로 세척한 후 클로로포름층을 가지 플라스크에 회수하여 증발기에서 농축하였다. 감압건고시킨 용기에 6ml의 25% 수산화칼륨, 9ml의 에탄올을 첨가하고 65℃에서 1시간 가열한 후, 실온에서 10% 염산을 가하여 산성(pH 2 정도)으로 만들었다. 그 용액을 분액 깔때기에 넣고 50ml의 헥산을 가하여 잘 교반하여 유기층을 회수하는 조작을 2회 반복한 후, 고체 무수황산 마그네슘에 의해 탈수하여 회수하였다. 이 헥산 층을 증발기로 농축한 후 2ml의 혼합용매(톨루엔/메탄올=4/1, v/v)에 용해시키고, 몇 방울의 진한 황산을 반응액에 적하하여 80℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 종료 후 실온에서 포화 중조수로 중화한 것을 pH 시험지로 확인 후 유기층을 회수하였다. 그 유기층을 필터가 있는 에펜도르프 튜브에 200㎕ 주입하고, 원심분리 후의 용액의 2㎕를 GC로 분석하였다. 이하에서는 GC분석 조건을 나타내었다.
장치: Agilent 6890 Series GC System
컬럼: Supelco, Omegawax250 (30m 길이, 0.25mm 내경, 필름 두께 0.25μm)
주입온도: 250℃
초기온도: 100℃
초기시간: 5min
속도: 4℃/min
최후온도: 220℃
최후시간: 25min
분석기: FID
분석온도: 250℃
분석결과로부터, 피록사술폰산 함유 배지에서 배양한 7종류의 식물 GST 유전자 도입 벼의 배양세포 및 대조구 벼 배양세포, 및 약제처리하지 않은 대조구 벼 배양세포에서 지방산 함유량을 도 18 내지 도 20에 나타내었다. 도 18 내지 도 20에 표시된 데이터는 모든 일련의 데이터이다. 또한, 도 18 내지 도 20은 각 GST 유전자에 대해 2계통(계통 1, 계통 2) 벼의 배양세포에 대한 지방산을 분석한 결과를 나타낸다.
피록사술폰산을 포함하는 액체배지에서 배양한 벼 배양세포에서는 피록사술폰의 VLCFAE 저해작용에 의해, 초장쇄 지방산(VLCFA) 함유량이 크게 감소하는 반면, C15:0(펜타데칸산) 함유량이 현저하게 축적되었다(Y. Tanetani 등, Pestic. Biochem. Physiol. 95, 47-55(2009)). 이 연구 결과를 바탕으로, 각 GST의 피록사술폰 대사활성의 유무를 판단하였다. 그 결과, 7종류의 식물 GST(TaQ8GTB9, ZmM16901, ZmB6T8R4, ZmQ9ZP61, ZmY12862, OsGSTF5, OsGSTU5) 유전자를 각각 도입한 벼의 배양세포 중 C15:0 및 VLCFA 함유량은 모든 약제 처리구의 대조구 벼의 배양세포와 같았고, 이들 GST는 피록사술폰 대사활성을 가지고 있지 않다고 판단되었다. 또한, 2종류의 OsGST 유전자(F5, U5) 도입 벼의 배양세포는 10-6M 처리구에서의 결과이며, 약제무처리 대조구 벼의 배양세포로부터의 데이터는 없지만, VLCFA 및 C15:0 함유량으로부터 두 GST 모두 대사활성이 없는 것으로 판단되었다.
<벼 배양세포의 배지에서 증식을 지표로 한 피록사술폰 대사활성 분석>
다음으로, 도 21에 나타낸 바와 같이, 옥수수 GST 유전자를 갖는 벼 형질전환용 벡터를 작제하였다. 또한, 본 시험예에서 2종류의 옥수수 GST 유전자(ZmQ9FQD1 및 ZmB8A3K0)에 대해 각각 벼 형질전환용 벡터를 작제하였으나, 작제 프로토콜은 동일하므로, 이하에서는 ZmQ9FQD1 유전자에 대해 벼 형질전환용 벡터의 작제순서를 기재하였다.
옥수수(Pioneer 32K61)의 경엽부로부터 제조한 RNA의 역전사 반응으로 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 ZmQ9FQD1-X와 ZmQ9FQD1-Y의 프라이머 세트로 PCR 반응을 수행하여 ZmQ9FQD1 유전자 단편을 얻었다. 그런 다음, ZmQ9FQD1 유전자 단편을 SalI 및 NotI 처리한 후 ZmQ9FQD1 유전자 단편을 인서트로 사용하고, 마찬가지로 SalI 및 NotI 처리한 pENTR-1A를 벡터로 사용하였다. 이러한 인서트 및 벡터에 대하여 결합반응을 수행하였다. 이렇게 작제된 엔트리 클론(pENTR1A-ZmQ9FQD1)을 대장균 JM109 주에 도입하였다. 이어, 콜로니 PCR에 의해 표적 플라스미드의 도입을 확인한 콜로니에서 플라스미드를 제조하였다. 서열분석을 통해 삽입한 ZmQ9FQD1 유전자의 염기서열이 올바른지 확인하였다.
이어 작제한 엔트리 클론(pENTR1A-ZmQ9FQD1)과 목적 벡터인 PalSelect R-5 (Inplanta Innovations Inc)와의 LR 반응을 수행하여, 발현벡터(PalSelect R-5-ZmQ9FQD1)를 작제하였다. 이 발현벡터(PalSelect R-5-ZmQ9FQD1)를 형질전환에 의해 대장균 HST02주에 도입하였다. 그런 다음, 콜로니 PCR에 의해 표적 플라스미드의 도입을 확인한 콜로니에서 플라스미드를 제조하였다. 서열분석을 통해 삽입한 ZmQ9FQD1 유전자의 염기서열을 확인하였다. 또한, 두 유전자 모두 PalSelect R-5에 삽입한 서열이 데이터베이스의 서열은 상이하였으므로, 이러한 차이를 표 7에 나타내었다.
GST 유전자 염기서열의 차이 아미노산 서열의 차이
ZmQ9FQD1 T->C, 189번 위치 -
G->C, 381번 위치 Glu(E) ->Asp(D)
T->C, 476번 위치 Val(V)->Ala(A)
G->C, 477번 위치 -
A->T, 485번 위치 Asp(D)->Val(V)
ZmB8A3K0 C->T, 438번 위치 -
A->G, 532번 위치 Ile(I)->Val(V)
G->C, 567번 위치 -
T->C, 573번 위치 -
G->C, 603번 위치 -
C->A, 604번 위치 Leu(L)->Met(M)
표 7에서, "-"는 아미노산 서열에 차이가 없음을 의미한다.
이하에서는 PCR에 이용한 프라이머 세트를 나타내었다.
ZmB8A3K0~X: 5'-AAAAAAGTCGACATGGCGGCGGCGGCGGAG-3'(센스: 서열번호 23)
ZmB8A3K0~Y: 5'-AAAAAAGCGGCCGCTCACTTGGCCCCGAACTTG-3'(안티센스: 서열번호 24)
ZmQ9FQD1-X: 5'-AAAAAAGTCGACATGGCGCCGCCGATGAAG-3'(센스: 서열번호 25)
ZmQ9FQD1-Y: 5'-AAAAAAGCGGCCGCCTATGGTATGTTCCCGCTG-3'(안티센스: 서열번호 26)
<형질전환에 의한 GST 유전자의 벼에 도입>
상술한 바와 같이 작제한 2 종류의 옥수수 유래 GST 유전자에 관한 벼 형질전환용 벡터(PalSelect R-5-ZmGST)을 전기천공법으로 아그로박테리움(EHA105)에 도입하였다. 이어, 아그로박테리움법(S. Toki Plant Mol. Biol. Rep. 15 16-21(1997))에 의해 TaQ8GTC0 유전자를 벼 배양세포에 도입한 후, 비스피리백 나트륨염(BS)으로 선발하였다.
2종류의 옥수수 GST 유전자를 형질전환하여 벼에 각각 도입하고 한 달간 0.25μM의 비스피리백 나트륨염(BS)으로 GST 유전자가 도입된 벼의 배양세포를 선발하였다. 그 결과, KLB-279(TaQ8GTC0 유전자 대신 GFP 유전자가 도입된 양성 대조구)와 마찬가지로 선발배지에서 활발하게 증식하는 개체가 확인된 것으로부터, 2계통의 옥수수 GST 유전자 도입 벼 배양세포를 작제할 수 있음을 알 수 있었다(도 22).
<벼의 배양세포 배지에서 증식을 지표로 한 피록사술폰 대사활성 분석>
상술한 바와 같이 수득한 2개의 옥수수 GST 유전자 도입 벼의 배양세포 및 KLB-279 형질전환 벼의 배양세포(비교 대조)를 N6D 배지에 치상(置床)하고 2주 후 각 벼 배양세포의 증식을 지표로 하여 피록사술폰에 대한 내성을 조사하였다. 피록사술폰은 아세톤 용액으로 시험하고, 배지에 첨가하는 마지막 아세톤 농도는 1%, 약제의 최종 농도는 10-4M로 하였다.
결과를 도 23에 나타내었다. 도 23의 사진은 100μM(10-4M)의 피록사술폰산 함유 배지에서의 벼 형질전환 배양세포가 증식하는 모습을 나타낸다. 도 23에서 보듯이, 치상하고 2주 후 2계통의 GST 유전자 벼 배양세포는 비교 대조군처럼 비대화되었다. 이처럼 ZmB8A3K0 유전자 도입 벼 배양세포, ZmQ9FQD1 유전자 도입 벼 배양세포는 비교 대조구와 마찬가지로 증식하지도 않고, 피록사술폰에 내성을 보이지 않았다. 따라서, 본 비교예의 결과로부터 두 종류의 옥수수 유래의 GST는 피록사술폰 대사활성을 가지고 있지 않는 것으로 판단되었다.
이상, 본 비교예의 결과로부터 피록사술폰산과 같은 작용기구의 약제 대사에 관여하는 것으로 알려져 있는 벼 GST와 TaQ8GTC0과 상동성이 높은 밀 및 옥수수 GST가 피록사술폰 대사활성을 가지고 않은 것으로 밝혀졌다. 따라서, 실시예 1 내지 실시예 4에 나타낸, TaQ8GTC0의 피록사술폰 대한 대사활성은 공지 정보에서 쉽게 예상할 수 없는 특이적인 것임이 밝혀졌다.
비교예 2
본 비교예에서는 TaQ8GTC0에 가장 아미노산 상동성이 높은 밀의 GST(TaQ8GTC1) (품종: Hunter, Accession No.:AJ440791, 상동 78%)에 대해 글루타티온 포합활성을 분석하였다.
<TaQ8GTC1 유전자의 클로닝(도 24)>
본 비교예에서는 6개 품종의 밀(즉, 유메가오리(Yumekaori), 하나만텐 (Hanamanten), 유메세이키(Yumeseiki), 농림 61호(Nohrin No. 61), 아파치(Apache) 및 가탈리나(Gatalina))을 사용하였다. 이러한 6개 품종의 밀 각각의 경엽부로부터 제조한 RNA의 역전사 반응에 의해 합성한 cDNA를 주형으로 하여, PCR에 의해 5' 말단에 XbaI 인식부위, 3' 말단에 EcoRI 인식부위를 부가한 TaQ8GTC1 유전자 ORF를 얻었다. 그 유전자 단편을 XbaI 및 EcoRI 처리한 TaQ8GTC1 유전자를 인서트로 사용하고, 동 제한효소 처리한 pBI121을 벡터로 사용하였다. 이러한 인서트 및 벡터를 결합하고, 그 반응액을 이용하여 작제한 벡터를 형질전환하여 대장균 JM109 주에 도입하였다. 그런 다음, 콜로니 PCR에 의해 표적 플라스미드의 도입을 확인한 콜로니에서 플라스미드를 제조하였다. 이어, 서열분석 반응을 수행하여 벡터에 삽입한 목적 유전자의 염기서열을 분석하였다.
이하에서는, PCR에 이용한 프라이머 세트를 나타내었다.
TaQ8GTC1-3: 5'-AAAAAATCTAGAGATCTTCAAGAAGCGGAA-3'(센스: 서열번호 27)
TaQ8GTC1-4: 5'-AAAAAAGAATTCTCACTTCTCTGCCTTCTTTCCGA-3'(안티센스: 서열번호 28)
이하에서는, 서열분석에 사용한 프라이머 세트를 나타내었다.
Sequence(TaQ8GTC1)-2: 5'-GACCTCACCATCTTCGAGTC-3'(센스: 서열번호 29)
Sequence(TaQ8GTC1)-3: 5'-CTCGTACACGTCGAACAG-3'(안티센스: 서열번호 30)
　
상기 6개 품종에서 얻은 TaQ8GTC1 유전자는 모두 동일한 염기서열이었지만, 데이터베이스에 등록된 서열과는 상이하였다. 구체적으로, 본 실험에서 결정된 염기서열과 데이터베이스에 등록된 염기서열은 ORF를 구성하는 675bp 중 25염기가 상이하였다. 그 차이는 13개 아미노산 변이를 수반하였다. 이하에서는, 본 실험에서 결정된 염기서열의 유전자를 "TAQ8GTC1-R 유전자"라고 기재하였다.
본 실험에서 결정된 염기서열과 데이터베이스에 등록된 염기서열을 비교한 결과를 도 25에 나타낸 아미노산 서열을 비교한 결과를 도 26에 나타내었다. 도 25에서, TaQ8GTC1-R(상단)과 데이터베이스의 TaQ8GTC1의 염기서열(하단) 사이의 차이인 25 염기를 박스로 둘러쌓다. 도 26에서 서열분석에 의해 밝혀진 TaQ8GTC1-R(상단)과 데이터베이스의 TaQ8GTC1의 아미노산 서열(하단) 간에 서로 다른 13 아미노산을 박스로 둘러쌓다. 또한, 본 실험에서 결정된 염기서열과 데이터베이스에 등록되어 있는 염기서열의 차이를 표 8에 정리하였다. 표 8에서 "-"는 염기서열은 상이하나, 아미노산 잔기는 동일한 것을 의미한다.
염기서열의 차이 아미노산 서열의 차이
T->C, 25번 위치 Tyr (T)→His (H), 9번 위치
C->T, 61번 위치 -
C->G, 138번 위치 -
C→A, 151번 위치 -
G→A, 207번 위치 -
A->G, 246번 위치 -
T->A, 287번 위치 Met (M)→Lys (K), 96번 위치
C->G, 315번 위치 -
C->G, 348번 위치 -
C->G, 382번 위치 Gln (Q)→Glu (E), 128번 위치
G->A, 394번 위치 Ala (A)→Thr (T), 132번 위치
T->G, 429번 위치 Asn (N)→Lys (K), 143번 위치
C→G, 453번 위치 -
T→C, 474번 위치 -
G→C, 483번 위치 Glu (E)→Asp (D), 161번 위치
G→T, 484번 위치 Ala (A)→Ser (S), 162번 위치
G→C, 486번 위치
G→C, 487번 위치 Val (V)→Leu (L), 163번 위치
G→C, 498번 위치 -
T→C, 517번 위치 Phe (F)→Leu (L), 173번 위치
A→C, 525번 위치 -
A→T, 560번 위치 Glu (E)→Val (V), 187번 위치
C→T, 581번 위치 Ala (A)→Val (V), 194번 위치
T→C, 595번 위치 Phe (F)→Leu (L), 199번 위치
C→G, 606번 위치 Ser (S)→Arg (R), 202번 위치
또한, 본 실험에서 결정된 염기서열(즉, TaQ8GTC1-R 유전자의 염기서열) 및 그 염기서열로 암호화되는 아미노산 서열을 각각 서열번호 31 및 32에 나타내었다. 또한, 데이터베이스에 등록된 TaQ8GTC1 유전자의 염기서열 및 그 염기서열로 암호화되는 아미노산 서열을 각각 서열번호 33 및 34로 나타내었다.
<TaQ8GTC1-R 단백질의 대장균 발현체의 구축(도 27)>
밀(농림 61호)의 경엽부로부터 제조한 RNA의 역전사 반응에 의해 합성한 cDNA를 주형으로 하여 TaQ8GTC1-Z 및 TaQ8GTC1-4 프라이머 세트(아래 참조)로 PCR 반응을 수행하여 5' 말단에 NdeI 인식부위, 3' 말단에 EcoRI 인식부위를 부가한 TaQ8GTC1-R 유전자의 ORF를 얻었다. 이 단편을 NdeI 및 EcoRI 처리한 TaQ8GTC1-R 유전자를 인서트로 사용하고, 동 제한효소를 처리한 pET22b(+)를 벡터로 사용하였다. 그 인서트 및 벡터를 결합하고, 그 반응액을 이용하여 작제한 벡터를 형질전환하여 대장균 JM109 주에 도입하였다.
그런 다음, 콜로니 PCR에 의해 표적 플라스미드의 도입을 확인한 콜로니에서 플라스미드를 제조하였다. 서열분석에 의해 NdeI 및 EcoRI 절단부위 사이에 삽입한 TaQ8GTC1-R 유전자의 염기서열을 PCR에 의한 오류가 없는지 확인하고, 그 플라스미드를 대장균 BL21(DE3) 주에 도입하여 TaQ8GTC1-R 단백질의 대장균 발현체(KTLB-862)를 구축하였다. 이하에서는, PCR에 이용한 프라이머 세트를 나타내었다.
TaQ8GTC1-Z: 5'-AAAAAACATATGGCGGCGCCGGCGGTGAAGGTG-3'(센스: 서열번호 35)
TaQ8GTC1-4: 5'-AAAAAAGAATTCTCACTTCTCTGCCTTCTTTCCGA-3'(안티센스: 서열번호 36)
<TaQ8GTC1-R 단백질의 조제>
작제한 대장균 BL21(DE3) 주(KLB-862)를 이용하여 TaQ8GTC1-R 단백질을 발현시켰다. 단일 콜로니를 50ppm의 앰피실린을 포함하는 액체 LB 배지에 접종한 후 하룻밤 시험관에서 배양한 용액을 전 배양액(preculture solution)으로 사용하였다. 2.5ml의 전 배양액을 50ppm의 앰피실린을 포함하는 250mL 액체 LB 배지(1L 용 삼각 플라스크)에 가하고, 37℃, 200rpm의 조건에서 OD600=0.5~0.6이 될 때까지 배양하였다. 이어, 얼음에 5분간 냉각시킨 후, IPTG를 최종 1mM이 되도록 첨가하고, 27℃, 200rpm으로 21시간 동안 TaQ8GTC1-R 단백질의 발현을 유도한 다음, 집균(4℃, 6000 x g의 조건에서 10분간 원심분리)하여 균체를 -80℃에서 보관하였다. 저온보존된 균체(0.5L 배양액)에 30mL의 PBS 완충용액(0.14M NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH 7.3)을 가하고 초음파 처리(TAITEC VP-30S 마이크로 칩, 아웃풋 3, 15초 콘스탄트, 7~8회)한 후, 4℃, 15,000xg의 조건으로 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 그 조효소 용액을 PBS 완충용액으로 평형화한 GSTrap FF 컬럼 및 GSTrap 4B 컬럼(모두 bed vol. 1mL)에 유속 1mL/min로 로딩하고 20ml 이상의 PBS 완충용액으로 두 글루타티온 친화성 컬럼을 세척한 후, 2mL 용출용 완충용액(50mM Tris-HCl, 10mM 환원형 글루타티온, pH 8.0)을 컬럼에 주입하여 TaQ8GTC1-R 단백질을 용출시켰다(도 28). 이 단백질 용액을 Nanosep(10K)을 이용한 한외여과에 의해 PBS 완충용액로 치환하고, -80℃에서 저장하였다. 단백질 농도는 브래드포드(Bradford) 방법으로 TaKaRa Bradford Protein Assay Kit(Takara) 메뉴얼에 따라 측정하였다.
<TaQ8GTC1-R 단백질의 글루타티온 포합활성 분석>
본 실험에서는 정제한 TaQ8GTC1-R 단백질의 CDNB(2,4-dinitrochlorobenzene) 및 피록사술폰에 대한 글루타티온 포합반응을 분석하였다.
CDNB 대한 활성은 634㎕의 100mM 인산칼륨 완충액(pH 7.6), 300㎕의 3.3mM 환원형 글루타티온, 33㎕의 정제효소(20% 글리세롤을 함유하는 PBS 용액), 33㎕의 30mM CDNB(에탄올 용액)를 포함하는 총 1ml의 반응액에서 측정하였다. CDNB를 제외한 반응액를 조제한 후, 마지막에 30mM CDNB을 첨가하여 효소반응을 시작하고 340nm에서의 흡광도를 30℃에서 측정하였다. 활성은 분자 흡광계수 9.6mM-1cm-1에 의해 계산하였다. 효소 대신에 20% 글리세롤을 포함하는 PBS를 첨가한 반응액를 음성 대조군(비-효소 반응구)으로 본 반응액에서의 생성량을 비-효소 생성량으로 하였다.
피록사술폰에 대한 활성의 측정은 50㎕의 100mM 인산칼륨 완충액(pH 6.8), 10㎕의 1mM 피록사술폰(아세톤 용액), 20㎕의 10mM 환원형 글루타티온(pH 7.0), 120㎕의 TaQ8GTC1-R 단백질(20% 글리세롤을 포함하는 PBS 용액)을 포함하는 총 200㎕ 반응 혼합물에서 행하여 30℃에서 1시간 반응시킨 후, 반응물을 0.2μm의 필터를 사용하여 여과하여 그 중 50㎕를 HPLC에 주입하였다. 효소 무첨가구(TaQ8GTC1-R 단백질 대신 20% 글리세롤을 포함하는 PBS를 첨가)와 효소 및 글루타티온 무첨가구 (TaQ8GTC1-R 단백질 대신 20% 글리세롤과 PBS, 글루타티온 대신 멸균수를 첨가)를 대조군으로 하였다. 아래 기술한 HPLC 조건에서, 유지시간은 피록사술폰, M-15(피록사술폰의 글루타티온 포합체)가 각각 19.0분, 11.0분이었다.
장치: Agilent 1100 series
컬럼: CAPCELL PAK C18 AQ 4.6mm(I.D.)x250mm(SHISEIDO)
이동상: 아세토니트릴/물=5/95(5분간 유지) →(4분) → 40/60(4분간 유지) →(4분) → 90/10(8분간 유지) →(1분) → 5/95(4분간 유지)(각 용매는 0.5% 초산을 포함)
온도: 35℃
유속: 1.0mL/min
검출: 254nm
<결과 및 고찰>
우선, 본 실험에서 정제된 TaQ8GTC1-R 단백질이 GST 활성을 가지고 있는지 알아보기 위하여 표준기질 CDNB(1-chloro-2,4-dinitrobenzene)에 대한 글루타티온 포합활성을 조사하였다. 그 결과, CDNB에 대한 활성은 2.17μmol/min/mg protein(n=2)로, 정제효소는 GST 활성을 가지고 있음이 밝혀졌다.
이어, TaQ8GTC1-R 단백질의 피록사술폰에 대한 포합활성을 조사하였다. 포합활성 시험은 효소 첨가구(효소적 및 비-효소적으로 글루타티온 포합체를 생성), 효소 무첨가구(비-효소적으로 글루타티온 포합체를 생성), 효소 및 글루타티온 무첨가구(친화합물(parent compound) 상태로 유지)의 3개의 반응액에서 실시하였다. 효소 첨가구에 첨가하는 단백질량은, 약 400ng의 TaQ8GTC0(실시예 1 참조)의 포합활성을 동일한 조건으로 조사한 경우, 첨가한 제초제의 총 10nmol 중 약 50%가 글루타티온 포합체로 변환된 것을 근거로 500ng으로 결정하였다.
TaQ8GTC1-R 단백질에 의한 포합활성 시험결과, 피록사술폰을 기질로 한 경우에는 효소 첨가구와 효소 무첨가구에서 생성된 글루타티온 포합체는 같았다(반응액에 첨가한 피록사술폰산의 약 3%가 M-15로 변환)(도 29). 이와 같이, 효소 첨가구와 효소 무첨가구에서 글루타티온 포합체의 생성량에 유의한 차이는 없는 것으로부터, 본 시험예에서 정제된 TaQ8GTC1-R 단백질은 피록사술폰에 포합활성을 가지고 않은 것으로 밝혀졌다. 실시예 1 등에 나타낸 바와 같이, TaQ8GTC1-R과 약 80%의 아미노산 상동성을 갖는 TaQ8GTC0는 VLCFAE 억제제 중에서 피록사술폰에 대해 특히 높은 포합활성을 나타낸 반면, TaQ8GTC1-R 단백질은 활성을 나타내지 않았다.
이처럼 비교적 유사성이 높은 GST 에서조차 피록사술폰에 대한 포합활성이 없었으므로, 실시예 1 내지 실시예 3에서 나타낸 TaQ8GTC0의 피록사술폰 포합활성은 특이성이 높은 것으로 간주하였다.
한편, 실시예 1 내지 실시예 3에서 나타낸 밀 유래 GST에서 피록사술폰 대사활성을 갖는 TaQ8GTC0(TaGSTF3)와 같은 Phi 클래스로 분류된 식물 GST의 기질 인식에 관여하는 아미노산 잔기에 관해서는, 기질과 GST 복합체의 X선 결정 구조해석에 의해 밝혀졌다(P Reinemer 등, J. Mol. Biol. 255, 289-309(1996); T. Neuefeind 등, J. Mol. Biol. 274, 446-453(1997); H. Pegeot 등, Frontiers in Plant Science 5, 1-15(2014); 및, T. Neuefeind 등, J. Mol. Biol. 274, 446-453(1997)). 각종 식물 GST 아미노산 서열의 다중 정렬(multiple alignment)에 있어서 추정 기질 인식부위 (putative substrate recognition site)를 도 30에 나타내고, 위 논문에서 밝혀진 기질 인식부위를 구성하는 아미노산을 표 9에 정리하였다. 도 30에서, 2개소의 추정 기질 인식부위를 박스로 묶고, 추정 기질 인식부위를 구성하는 아미노산을 굵은 글씨(밑줄과 함께)로 나타내었다.
또한, 도 30에 도시된 애기장대 유래 AtGSTF2의 아미노산 서열을 서열번호 37로, 포플러 유래 PttGSTF1의 아미노산 서열을 서열번호 38로, 옥수수 유래의 ZmGSTF1의 아미노산 서열을 서열번호 39로, 밀 유래 TaGSTF1의 아미노산 서열을 서열번호 40로, 밀 유래 TaGSTF4의 아미노산 서열을 서열번호 41로, 밀 유래 TaGSTF5의 아미노산 서열을 서열번호 42로, 밀 유래 TaGSTF6의 아미노산 서열을 서열번호 43로 각각 표시하였다. 또한, 도 30에서 밀 유래 TaGSTF2-R의 아미노산 서열은 서열번호 32로, 밀 유래 TaGSTF3의 아미노산 서열은 서열번호 2로 각각 표시하였다.
식물체 GST 기질인식 부위를 구성하는 아미노산
AtGSTF2 1) I12, L35, S115, F119, F123
AtGSTF2 2) H8, A10, S11, L35, F119, F123, Y127, Y178
ZmGSTF1 2) M10, W12, N13, F35, F114, I118
ZmGSTF1 3) M10, W12, F114, I118, M121, L122,
PttGSTF1 4) L12, T14, L37, H119, F123
상기 표 9에서, 1)는 Structure 6, 1445-1452(1998), 2)는 J. Mol. Biol. 255, 289-309(1996), 3)은 J. Mol. Biol. 274, 446-453(1997), 및 4)는 Frontiers in Plant Science 5, 1-15(2014)이다. 도 30 및 표 9를 보면, 기질인식에 관여하는 아미노산(TaGSTF3(TaQ8GTC0)의 아미노산 서열에 대응)은 주로 GST의 5~15번째 부근의 영역 1과 115~125번째 부근의 영역 2에 분포하고 있음을 알 수 있다. 따라서, 이들 두 영역을 GST의 기질인식 부위로 추정하고, 각 영역(영역 1은 10 아미노산, 영역 2는 12 아미노산)에 대해 TaGSTF3(TaQ8GTC0)의 아미노산 서열과의 상동성을 조사하였다.
그 결과, 영역 1에서 TaGSTF3(TaQ8GTC0)와, TaGSTF1, TaGSTF2-R TaGSTF4, TaGSTF5 및 TaGSTF6 간의 상동성은 각각 40%, 80%, 80%. 40%와 50%였다. 또한, 영역 2에서는 TaGSTF3(TaQ8GTC0)와, TaGSTF1, TaGSTF2-R TaGSTF4, TaGSTF5 및 TaGSTF6 간의 상동성이 각각 45%, 64%, 55%. 45%와 18%였다. TaGSTF1, TaGSTF2-R TaGSTF3(TaQ8GTC0), TaGSTF4, TaGSTF5 및 TaGSTF6는 I. Cummins 등, Plant Mol. Biol. 52, 591-603(2003)에 Phi 클래스로 분류되는 밀 유래 GST를 개시한 것이다.
영역 1과 2 모두, TaQ8GTC0(TaGSTF3)에 대한 아미노산 상동성이 가장 높은 것은 TaGSTF2-R(TaQ8GTC1-R)임을 알 수 있다. TaGSTF2-R(TaQ8GTC1-R)가 피록사술폰 대사활성을 나타내지 않는 것을 감안하면, 실시예 1 내지 실시예 3에서 나타낸 TaGSTF3(TaQ8GTC0)가 피록사술폰을 대사하는 것은 매우 특이한 것으로 여겨졌다.
비교예 3
본 비교예에서는 비교예 2에서 클로닝한 TaQ8GTC1-R 유전자를 도입한 형질전환 벼의 작제 및 상기 형질전환 벼에 대한 약제내성을 분석하였다.
<TaQ8GTC1-R 유전자의 벼 형질전환용 벡터(R-5-TaQ8GTC1-R)의 작제(도 31)>
밀(농림 61호)의 경엽부로부터 제조한 RNA의 역전사 반응에 의해 합성한 cDNA를 주형으로 TaQ8GTC1-X와 TaQ8GTC1-Y의 프라이머 세트로 PCR 반응을 수행하여 TaQ8GTC1-R 유전자(ORF)을 얻었다. 이 단편의 5' 말단을 SalI 처리, 3' 말단을 NotI 처리한 TaQ8GTC1-R 유전자 단편을 인서트로 사용하고, 동 제한효소를 처리한 pENTR-1A를 벡터로 사용하였다. 이들 인서트 및 벡터를 결합하여 작제한 엔트리 클론 (pENTR1A-TaQ8GTC1-R)을 형질전환하여 대장균 JM109 주에 도입하였다. 그런 다음, 콜로니 PCR에 의해 표적 플라스미드의 도입을 확인한 콜로니에서 플라스미드를 제조하고, 서열분석에 의해 SalI 및 NotI 절단부위 사이에 삽입한 TaQ8GTC1-R 유전자의 염기서열이 올바른지 확인하였다.
이어 작제한 엔트리 클론(pENTR1A-TaQ8GTC1-R)과 목적 벡터인 R-5(PalSelect pSTARA)과 LR 반응을 수행하여 작제한 발현벡터(R-5의 attB 서열 사이에 TaQ8GTC1-R 유전자를 삽입한 벼 형질전환용 벡터)를 형질전환에 의해 대장균 HST02주에 도입하였다. 그런 다음, 콜로니 PCR에 의해 표적 플라스미드의 도입을 확인한 콜로니에서 플라스미드를 제조하여 서열분석에 의해 attB 서열 사이에 삽입한 TaQ8GTC1-R 유전자의 염기서열이 올바른지 확인하였다. 이하에서는, PCR에 이용한 프라이머 세트를 나타내었다.
TaQ8GTC1-X: 5'-AAAAAAGTCGACATGGCGGCGCCGGCGGTGAAGG-3'(센스: 서열번호 44)
TaQ8GTC1-Y: 5'-AAAAAAGCGGCCGCTCACTTCTCTGCCTTCTT-3'(안티센스: 서열번호 45)
<형질전환에 의한 TaQ8GTC1-R 유전자의 벼에 도입>
작제한 TaQ8GTC1-R 유전자를 PalSelect R-5에 삽입한 벼 형질전환용 벡터 (PalSelect R-5-TaQ8GTC1-R)를 전기천공법으로 아그로박테리움(EHA105)에 도입하였다(KLB-872). 이어, 아그로박테리움법에 의해 TaQ8GTC1-R 유전자를 벼 배양세포에 도입한 후, 비스피리백 나트륨염(BS)으로 선발하였다.
TaQ8GTC1-R 유전자를 형질전환하여 벼에 도입하고 1개월간 0.25μM의 비스피리백 나트륨염(BS)으로 TaQ8GTC1-R 유전자가 도입된 벼의 배양세포를 선발하여, 선발배지에서 증식하는 형질전환 벼의 배양세포를 확인하였다(도 32). 이러한 형질전환 벼의 배양세포를 약제 무첨가 재분화 배지에 이식한 후, 수득한 식물체에 대해서 순차적으로 격리 온실에서 재배하였다. 격리 온실에서 재배 개시부터 평균 2개월에 모든 식물체에서 출수(ear emergence)가 확인된 이러한 식물체에서 후대 종자(T1)를 채종하였다.
<TaQ8GTC1-R 유전자 도입 벼의 피록사술폰에 대한 감수성 시험>
2계통(KLB-872 #3-11 및 KLB-872 #2-4)에 대해 겔란 검을 배지로 하는 발아 생육저해 시험으로 피록사술폰 대한 내성을 조사하였다. 우선, 호그랜드 믹스와 3g의 겔란 검을 1L의 증류수에 현탁시킨 후, 전자레인지에서 따뜻하게 충분히 용해시켰다. 그의 15ml를 식기 전에 관형 병에 주입하였다(플레이트에 30ml를 주입). 겔란 검 배지를 관형 병 또는 플레이트에 주입함과 동시에 약제를 가하여 잘 혼합하였다. 벼의 겨(rice hull)를 50배 희석한 차아염소산나트륨 용액(antiformin, Wako)에서 20분 정도 담근 후 잘 세척하였다. 멸균처리한 종자를 증류수에 담가 27℃에서 최아할 때까지 방치하였다(약 2일). 최아된 종자를 새싹을 위로 향하게 하여 0.25μM BS를 포함하는 겔란 검 배지(플레이트)에 가볍게 이식하였다. 이들과 증류수를 넣은 비이커를 함께 투명한 케이스에 넣고, 랩으로 뚜껑을 덮어 27℃, 형광등 조명 하(명기 14시간, 암기 10시간)에서 2일간 생육시켰다. 그런 다음, 근부의 신장을 지표로 BS 내성을 가지는 것으로 판단되는 벼의 종자를 피록사술폰(최종 농도 10-8, 10-7, 10-6, 10-5M)을 함유하는 겔란 검 배지(관형 병)에 이식하였다. 이어, 이들과 증류수를 넣은 비이커를 함께 투명한 케이스에 넣고 랩으로 뚜껑을 덮어 27℃, 형광등 조명 하(명기 14시간, 암기 10시간)에서 4~5일간 생육시킨 후 초장을 측정하였다. 약제의 저해는 초장을 지표로 약제 무첨가구에 대한 생육저해율을 산출하고, 50% 생육저해 농도(IC50 값)는 프로빗(Probit) 법에 의해 측정하였다.
<결과 및 고찰>
상술한 TaQ8GTC1-R 유전자 도입 벼(KLB-872 #3-11 및 KLB-872 #2-4)의 피록사술폰에 대한 내성시험의 결과를 도 33에 나타내었다. 시험한 2계통 모두 피록사술폰 감수성은 야생형과 같았다. 이러한 결과로부터, TaQ8GTC1-R 유전자 도입 벼는 피록사술폰에 내성을 나타내지 않는 것으로 추측되었다.
본 실시예에서는 실시예 1 내지 실시예 3에서 피록사술폰 대한 포합활성을 갖는 것으로 밝혀진 Q8GTC0 유전자를 도입한 형질전환 유채(Brassica napus)를 작제하고, 상기 형질전환 유채의 피록사술폰에 대한 감수성을 시험하였다.
<TaQ8GTC0 유전자의 유채 형질전환용 벡터의 작제(도 34)>
밀(농림 61호)의 경엽부로부터 제조한 RNA의 역전사 반응에 의해 합성한 cDNA를 주형으로 TaQ8GTC0~IF-Blunt End(XbaI), TaQ8GTC0~IF-Blunt End(SacI)의 프라이머 세트로 PCR 반응을 수행하여 TaQ8GTC0 유전자의 ORF를 얻었다. 이 유전자 단편과 XbaI 및 SacI 처리한 후, T4 DNA 중합효소로 평활화한 pBI121을 이용하여 In-Fusion 반응을 행하고, 작제한 유채 형질전환용 플라스미드(TaQ8GTC0 in pBI121)를 형질전환하여 대장균 JM109 주에 도입하였다. 그런 다음, 콜로니 PCR에 의해 표적 플라스미드의 도입을 확인한 콜로니에서 플라스미드를 제조하여 서열분석에 의해 XbaI 및 SacI 절단부위 사이에 삽입한 TaQ8GTC0 유전자의 염기서열이 올바른지 확인하였다. 이하에서는 PCR에 이용한 프라이머를 기재하였다.
TaQ8GTC0~IF-Blunt End(XbaI):
5'-CACGGGGGACTCTAGATGGCGCCGGCGGTGAAGGT-3'(센스: 서열번호 46)
TaQ8GTC0~IF-Blunt End(SacI):
5'-GATCGGGGAAATTCGCTACTCTGCTTTCTTTCCAA-3'(안티센스: 서열번호 47)
<형질전환에 의한 TaQ8GTC0 유전자의 유채에 도입>
작제한 TaQ8GTC0 유전자를 pBI121에 삽입한 유채 형질전환용 벡터(pBI121-TaQ8GTC0)를 전기천공법으로 아그로박테리움(GV3101)에 도입하였다(KLB -858). 이어, 아그로박테리움법에 의해 TaQ8GTC0 유전자를 유채에 도입한 후, 카나마이신으로 선발하였다.
<형질전환 유채에 유전자 확인>
DNeasy Plant Mini Kit를 이용하여 재조합 유채의 게놈 DNA를 추출하였다. 그런 다음, 이 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR에 의해 목적하는 구조체의 도입을 확인하였다. PCR은 총 25㎕의 반응액(2㎕ 주형, 0.25㎕의 50μM 센스 프라이머, 0.25㎕의 50μM 안티센스 프라이머, 2.5㎕의 2mM dNTP 혼합물, 5㎕의 Phire Reaction Buffer, 0.5㎕의 Phire Hot Start DNA Polymerase 14.5㎕의 멸균수)로 행하였다. PCR은 초기 변형: 98℃에서 20초, 변형: 98℃에서 20초, 연결: 58℃에서 15초, 연장: 72℃에서 30초(40cycles), 최종 연장: 72에서 4분으로 행하였다. 또한, T-DNA 영역의 도입을 확인할 때 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
NOSP-2: 5'-CGCCTAAGGTCACTATCAGCTAGC-3'(안티센스: 서열번호 48)
Linker(pBI121) -2: 5'-GAACTCCAGCATGAGATC-3'(안티센스: 서열번호 49)
CAM35S-1: 5'-AGAGGACCTAACAGAACTCGCC-3'(센스: 서열번호 50)
TaQ8GTC0~2: 5'-AAAAAACTTAAGCTACTCTGCTTTCTTTCC-3'(안티센스: 서열번호 51)
다음은 카나마이신을 선발시약으로 하는 pBI121에 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채 형질전환용 벡터를 전기천공법에 의해 도입된 아그로박테리움 GV3101 주(KLB-858)를 이용하여, 형질전환에 의해 유채에 TaQ8GTC0 유전자를 도입하였다. 그 결과, 목적하는 형질전환체로 여겨지는 1개체를 얻을 수 있었다(도 35, 수득한 1개체를 박스로 묶었다). 본 재조합 유채에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 PCR 반응을 실시한 결과, T-DNA 영역에 포함된 2개의 구조(PNOS:: NPTII: TNOS, P35S:: TaQ8GTC0:: TNOS)가 도입되어, 수득한 개체는 목적으로 하는 재조합 유채인 것으로 밝혀졌다(도 36). 본 재조합 유채에 관해서는, 파이토트론(phytotron)에서 재배를 계속하여, T1 종자를 채취하였다.
<TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채의 피록사술폰 감수성 시험>
[유채 감수성 시험 1(파종후 발아전 토양처리)〕
유채 감수성 시험 1은 야생형 유채(품종: Westar) 및 밀 GST 유전자 도입 유채를 시험하였는데, 시험 규모는 플라스틱 포트(길이 8cm, 폭 8cm, 높이 6cm), 시험 토양은 후지노토(사양토), 1 포트 당 야생형 유채 종자를 4개, 재조합 유채 종자 8 개를 파종하였다(파종 깊이 1cm). 약제로서는, 50%의 피록사술폰산을 포함하는 과립 수화물을 시험하였고, 1, 4, 16, 63, 250 g ai/ha의 5가지 약제량으로 3회 반복하였다. 처리 직후에 강우장치로 약 1mm의 강우량을 인공적으로 강우한 후, 포트 아래쪽에서 물을 급수시켰다. 그 포트 표면이 건조되면 적절히 포트 아래쪽부터 급수시켰다.
[결과 및 고찰]
피록사술폰 발아 전 토양처리 시험(온도 22℃, 형광등)을 실시하고, 초장과 작용 증상 및 자엽의 성장의 관점에서 밀 GST 재조합 유채의 피록사술폰 내성 유무를 분석하였다. 구체적으로, 유채 종자의 파종 및 약제 살포의 2주 후에 각 처리구에서 생육된 식물체 초장을 측정하고, 유채 생육에 대한 저해율을 산출하였다 (n=4~12). 시험결과를 도 37 내지 도 39에 나타내었다. 도 37 내지 도 39에서 "TaGST"는 TaQ8GTC0 유전자 재조합 유채를 의미한다. 도 38에 나타낸 표의 수치는 평균±표준 편차(n=4~12)를 의미한다.
측정한 야생형 및 재조합 유채의 초장에 대한 저해율로부터, 처리 약제량이 4~63 g a.i./ha, 특히 16g a.i./ha에 재조합 유채에 대한 피록사술폰의 생육저해율은 야생형 유채에 비해 낮았다(재조합체, 야생형의 순으로 48.2%, 61.9%). 또한, 작용 증상을 지표로 한 경우, 야생형 유채는 16 g a.i./ha 이상으로 자엽이 짙어지는 반면, 재조합 유채의 경우 이 증상은 확인되지 않았다. 자엽의 생육에 관해서도 야생형 유채는 16 g a.i./ha 이상으로 거의 완전히 억제되는 반면, 재조합 유채는 250 g a.i/ha에서도 상응하게 성장하였다(도 39 ).
이상의 결과를 종합하면, 피록사술폰의 파종후 발아전 토양처리 시험(22℃, 형광등)에서 유채 초장과 작용 증상 및 자엽의 성장의 관점에서 작제된 TaG8QGTC0 유전자를 도입한 유채는 야생형태 유채와 비교하여 피록사술폰에 내성을 가지고 있음이 밝혀졌다.
[유채 감수성 시험 2(한천배지)]
상술한 파종후 발아전 토양처리 시험결과에서 TaG8QGTC0 유전자를 도입한 유채가 피록사술폰에 내성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 여기서 이 TaG8QGTC0 유전자를 도입한 유채가 몇배 정도의 내성을 가지고 있는지 알아보기 위해 약제의 영향을 직접적으로 분석할 수 있는 한천배지에서 유채 생육억제 시험을 실시하였다. 야생형 유채(품종: Westar) 및 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채를 한천배지에서의 생육억제 시험을 실시하여 피록사술폰에 대한 내성을 조사하였다.
이 시험에서의 배지(1L)는 1X 무라시게-스쿡(Murashige-Skoog, MS) 배지(1봉지), 티아민 하이드로클로라이드(3μg/ml), 니코틴산(5μg/ml), 피리독신 하이드로클로라이드(0.5μg/ml), 1%(w/v) 수크로스로 조성하였다. 1L 비이커에 상기 각 성분을 가한 다음, pH를 5.7로 제조하고 1L로 채운 후 8g(0.8%)의 아가를 가하였다. 이어, 고압살균하고 실온까지 냉각하고 소정 농도의 피록사술폰(아세톤 용액)을 첨가하였다. 이 용액을 플랜트 포트에 50ml씩 분주하였다(이때, 약제 무첨가 용액 30ml를 분주한 플레이트도 작제하였다).
유채의 감수성 시험을 할 때 필요량의 유채 건조 종자를 70% 에탄올로 2분, 차아 염소산(0.02% Triton-X-100)에서 15분 교반하고 멸균수로 10회 세척하였다. 이러한 종자를 작제한 약제 무첨가 플레이트의 배지 표면에 30개 정도를 치상(置床)하여 22℃에서 2~3일 후 발아 유묘(幼苗)를 각각의 배지(플랜트 박스) 5개씩 묻었다. 그런 다음, 22℃에서 2주 동안 배양시킨 후, 데이터를 얻었다.
[결과 및 고찰]
여러 농도(0.1μM, 1μM, 10μM, 100μM)의 피록사술폰산을 포함하는 한천배지에서 유채의 감수성 시험을 실시하고, 그 시험결과를 도 40 내지 도 43에 나타내었다. 도 40은 야생형 유채를 이용한 결과이며, 표의 수치는 평균±표준 편차(n=4~5)이다. 도 41~43은 TaG8QGTC0 유전자를 도입한 유채(도면에는 "TaGST"라 기재)를 이용한 결과이다. 도 41과 도 42에서 표에 나타낸 수치는 평균±표준 편차(n=4~5)이다. 도 43에 표시된 수치는 평균값(n=4~5)이다.
측정한 유채에 대한 초장 저해율 및 본엽의 생육저해율로부터, 0.1μM 첨가구에서 야생형 유채에 대한 저해율(초장 저해율, 본엽의 생육저해율의 순으로 8.9±2.8%, 8.4±1.4%)와 10μM 첨가구에서 밀 GST 재조합 유채 대한 저해율(초장 저해율, 본엽의 생육저해율의 순으로 7.8±5.9%, 1.2±2.7%)이 동등하였다. 따라서, TaG8QGTC0 유전자를 도입한 유채는 야생형에 비해 약 100배의 피록사술폰 내성을 가지고 있음이 밝혀졌다.
이상의 TaG8QGTC0 유전자를 도입한 유채의 피록사술폰에 대한 감수성 시험(파종후 발아전 토양처리, 한천배지)의 결과로부터, TaG8QGTC0 유전자를 도입한 유채는 야생형 유채에 비해 피록사술폰에 내성을 가지고 있으며, 그 저항은 약 100배 정도로 추정되었다. 이와 같이, 실시예 1 내지 실시예 3에서 피록사술폰 대사활성을 갖는 것이 밝혀졌다. TaQ8GTC0는 유채에서도 기능하고 피록사술폰에 내성을 부여하는 것으로 밝혀졌다.
본 실시예에서는 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 형질전환 애기장대(실시예 3 참조)의 고온 스트레스에 대한 내성을 시험하였다.
<TaQ8GTC0 유전자가 도입된 애기장대의 고온 스트레스 내성시험>
실시예 3에서 작제한 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 형질전환 애기장대의 고온 내성을 조사하기 위한 배지를 다음과 같이 작제하였다: 먼저 무라시게-스쿡(Murashige-Skoog, MS) 배지(1봉지), 티아민 하이드로클로라이드(3mg), 니코틴산(5mg), 피리독신 하이드로클로라이드(0.5mg), 수크로스(10g)를 1L 비이커에 가하고 pH를 5.7로 제조하여 1L로 채운 후 8g(0.8%)의 아가를 가하였다. 이것을 고압살균한 후 실온까지 냉각하고, 이를 플레이트에 30ml 분주하였다.
이러한 배지를 이용하여 실시예 3에서 작제된 형질전환 애기장대의 고온 스트레스 내성시험을 다음과 같이 실시하였다. 필요량의 애기장대의 건조 종자를 70% 에탄올로 2분, 차아 염소산(0.02% Triton-X-100)에서 15분씩 각각 교반하고 멸균수로 10회 세척하였다. 이어, 종자를 고압살균한 0.1% 한천용액 1ml에 현탁시키고, 이 현탁액을 배지 표면에 치상함으로써 플레이트 당 30개 정도를 파종하였다. 서지컬 테이프로 밀봉하고 4℃에서 2일간 방치하였다. 22℃로 옮겨 11일간 생육시킨 후, 고온스트레스 처리(50℃, 40분)하고, 추가로 6일간 생육시켰다.
[결과 및 고찰]
야생형 애기장대(Columbia-0)를 비교 대조구로서 고온 스트레스 처리한 후, 식물체의 표현형을 지표로 하여 TaQ8GTC0 유전자가 도입된 애기장대의 고온 내성의 유무를 조사하였다. 시험에는 야생형 및 3개의 재조합 애기장대(1-1-3, 1-1-5, 1-2-12)를 사용하였다. 그 결과, 고온처리에 의해 백화(chlorosis, 완전 고사)한 식물체의 비율은 야생형에서는 74%(26/35)인 반면, TaQ8GTC0 유전자 재조합체는 1-1-3, 1-1-5, 1-2-12 순서로 0%(0/11), 24%(8/34), 26%(10/38)이었다(괄호 안은 백화 개체수/시험한 개체수). 이러한 결과로부터, TaQ8GTC0 유전자 도입 애기장대는 야생형에 비해 고온처리에 의해 받는 영향이 작고, 작제한 TaQ8GTC0 유전자가 도입된 애기장대는 고온 스트레스 내성을 가지고 있음이 밝혀졌다. 따라서, 실시예 4에 나타낸 바와 같이 TaQ8GTC0 유전자 도입 벼가 고온 내성을 가지고 있음을 감안하면, TaQ8GTC0 유전자는 단자엽에서 쌍떡잎까지 다양한 식물에서 기능하고, 제초제 내성뿐만 아니라 고온 스트레스 내성도 부여할 수 있음을 알 수 있었다.
본 실시예에서는 실시예 5에서 작제한 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 형질전환 유채(Brassica napus)에 대하여, 고온 내성 유무를 시험하였다.
<TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채의 고온 스트레스 내성시험>
실시예 5에서 작제한 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 형질전환 유채의 고온 내성을 조사하기 위한 배지는 다음과 같이 제조하였다. 먼저, 무라시게-스쿡(Murashige-Skoog, MS) 배지(1봉지), 티아민 하이드로클로라이드(3mg), 니코틴산(5mg), 피리독신 하이드로클로라이드(0.5mg), 수크로스(10g)를 1L 비이커에 가한 다음, pH를 5.7로 제조하고 1L로 채운 후 8g(0.8%)의 아가를 가하였다. 이것을 고압살균한 후 실온까지 냉각하고, 이를 플랜트 포트에 70ml 분주하였다.
이들 배지를 이용하여 실시예 5에서 작제된 형질전환 유채의 고온 스트레스 내성시험을 다음과 같이 실시하였다. 필요량의 유채 건조 종자를 70% 에탄올에서 2분, 차아 염소산(0.02% Triton-X-100)에서 15분씩 각각 교반하고, 멸균수로 10회 세척하였다. 이어, 종자를 위에서 작제한 배지 표면에 5개 정도 치상(置床)하였다. 파라 필름으로 밀봉하여 22℃에서 4일간 생육시킨 후, 고온 스트레스 처리(50℃에서 1시간 또는 50℃에서 2시간 30분)하고, 격리 온실에서 추가로 4일간 생육시켰다.
[결과 및 고찰]
야생형 유채(Westar)를 비교 대조로서 고온 스트레스 처리한 후, TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채의 고온 내성 유무를 조사하였다. 그 결과, 시험 1(50℃에서 1시간 처리)에서는 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채의 초장이 야생형에 비해 유의하게 컸다(도 44). 도 44에 나타낸 표의 값은 평균±표준 편차(n=3-7)를 나타낸다. 시험 2 (50℃에서 2시간 30분 처리)에서 백화(완전 고사)한 개체의 비율은 야생형 유채, TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채의 순으로 75%(3/4), 20%(1/5)가 되고, TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채의 백화 비율은 야생형 유채에 비해 유의하게 작았다(괄호 안은 백화 개체수/시험한 개체수). 이러한 결과는 두 시험에서 각각 초장, 백화한 개체의 비율을 지표로 하여 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채는 야생형 유채에 비해 고온처리에 의해 받는 영향이 작고, 실시예 5에서 작제한 TaQ8GTC0 유전자를 도입한 유채는 고온 스트레스 내성을 가지고 있음이 밝혀졌다. 따라서, 밀 유래 TaQ8GTC0 유전자는 유채에서도 기능을 하고, 제초제 내성뿐만 아니라 고온 스트레스 내성도 부여할 수 있음을 알 수 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> Kumiai Chemical Industry Co., Ltd. <120> A transformed plant having herbicide tolerance <130> PH-6982-PCT <150> JP 2016-132689 <151> 2016-07-04 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 669 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> CDS <222> (1)..(669) <400> 1 atg gcg ccg gcg gtg aag gtg tac ggg tgg gcc gtg tcg ccg ttc gtg 48 Met Ala Pro Ala Val Lys Val Tyr Gly Trp Ala Val Ser Pro Phe Val 1 5 10 15 gcg cgc cca ctg ctg tgc ctg gag gag gcc ggc gtc gag tac gag ctc 96 Ala Arg Pro Leu Leu Cys Leu Glu Glu Ala Gly Val Glu Tyr Glu Leu 20 25 30 gtg tcc atg agc cgc gcg gcc ggc gac cac cgc cag ccg gac ttc ctc 144 Val Ser Met Ser Arg Ala Ala Gly Asp His Arg Gln Pro Asp Phe Leu 35 40 45 gcc cgg aac ccc ttc ggc cag gtc ccc gtc ctc gag gac ggc gac ctc 192 Ala Arg Asn Pro Phe Gly Gln Val Pro Val Leu Glu Asp Gly Asp Leu 50 55 60 acc ctc ttc gag tcg cgc gcg atc gcg agg cac gtg ctc cgg aag cac 240 Thr Leu Phe Glu Ser Arg Ala Ile Ala Arg His Val Leu Arg Lys His 65 70 75 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Ala Pro Ala Val Lys Val Tyr Gly Trp Ala Met Ser Pro Phe 1 5 10 15 gtg gcg cgc gcg ctg ctg tgc ctg gag gag gcc ggc gtg gag tac gag 96 Val Ala Arg Ala Leu Leu Cys Leu Glu Glu Ala Gly Val Glu Tyr Glu 20 25 30 ctc gtc ccc atg agc cgc gag gcc ggc gac cac cgc cag ccc gac ttc 144 Leu Val Pro Met Ser Arg Glu Ala Gly Asp His Arg Gln Pro Asp Phe 35 40 45 ctc gcc cgg aac ccc ttc ggc cag gtc ccc gtt ctc gag gac ggc gac 192 Leu Ala Arg Asn Pro Phe Gly Gln Val Pro Val Leu Glu Asp Gly Asp 50 55 60 ctc acc atc ttc gag tcg cgc gcc gtc gcg agg cac gtg ctg cgc aag 240 Leu Thr Ile Phe Glu Ser Arg Ala Val Ala Arg His Val Leu Arg Lys 65 70 75 80 cac aaa ccg gag ctg ctg ggc tcc ggc tcg ccg gag tcg gcg gcg atg 288 His Lys Pro Glu Leu Leu Gly Ser Gly Ser Pro Glu Ser Ala Ala Met 85 90 95 gtg gac gtg tgg ctg gag gtg gag gcc cac cag cac cag acc ccg gcg 336 Val Asp Val Trp Leu Glu Val Glu Ala His Gln His Gln Thr Pro Ala 100 105 110 ggc acc atc gtc atg cag tgc atc ctc acc ccg ttc ctc ggc tgc cag 384 Gly Thr Ile Val Met Gln Cys Ile Leu Thr Pro Phe Leu Gly Cys Gln 115 120 125 cgc gac cag gcc gcc atc gac gag aac gcg gca aag ctg acg aat ctg 432 Arg Asp Gln Ala Ala Ile Asp Glu Asn Ala Ala Lys Leu Thr Asn Leu 130 135 140 ttc gac gtg tac gag gcg cgc ctg tcg gcg tcg agg tac ctt gcc ggg 480 Phe Asp Val Tyr Glu Ala Arg Leu Ser Ala Ser Arg Tyr Leu Ala Gly 145 150 155 160 gag gcg gtc agc ctc gcg gac ctc agc cac ttc ccg ttc atg cga tac 528 Glu Ala Val Ser Leu Ala Asp Leu Ser His Phe Pro Phe Met Arg Tyr 165 170 175 ttc atg gac acc gag tac gcg tcg ctg gtg gag gag cgc ccg cac gtg 576 Phe Met Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Leu Val Glu Glu Arg Pro His Val 180 185 190 aag gcg tgg tgg gag gag ttc aag gcc agc ccg gcg gcg aag agg gtg 624 Lys Ala Trp Trp Glu Glu Phe Lys Ala Ser Pro Ala Ala Lys Arg Val 195 200 205 acg gag ttc atg ccg cca aac ttc ggg ttc gga aag aag gca gag aag 672 Thr Glu Phe Met Pro Pro Asn Phe Gly Phe Gly Lys Lys Ala Glu Lys 210 215 220 tga 675 <210> 34 <211> 224 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 34 Met Ala Ala Pro Ala Val Lys Val Tyr Gly Trp Ala Met Ser Pro Phe 1 5 10 15 Val Ala Arg Ala Leu Leu Cys Leu Glu Glu Ala Gly Val Glu Tyr Glu 20 25 30 Leu Val Pro Met Ser Arg Glu Ala Gly Asp His Arg Gln Pro Asp Phe 35 40 45 Leu Ala Arg Asn Pro Phe Gly Gln Val Pro Val Leu Glu Asp Gly Asp 50 55 60 Leu Thr Ile Phe Glu Ser Arg Ala Val Ala Arg His Val Leu Arg Lys 65 70 75 80 His Lys Pro Glu Leu Leu Gly Ser Gly Ser Pro Glu Ser Ala Ala Met 85 90 95 Val Asp Val Trp Leu Glu Val Glu Ala His Gln His Gln Thr Pro Ala 100 105 110 Gly Thr Ile Val Met Gln Cys Ile Leu Thr Pro Phe Leu Gly Cys Gln 115 120 125 Arg Asp Gln Ala Ala Ile Asp Glu Asn Ala Ala Lys Leu Thr Asn Leu 130 135 140 Phe Asp Val Tyr Glu Ala Arg Leu Ser Ala Ser Arg Tyr Leu Ala Gly 145 150 155 160 Glu Ala Val Ser Leu Ala Asp Leu Ser His Phe Pro Phe Met Arg Tyr 165 170 175 Phe Met Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Leu Val Glu Glu Arg Pro His Val 180 185 190 Lys Ala Trp Trp Glu Glu Phe Lys Ala Ser Pro Ala Ala Lys Arg Val 195 200 205 Thr Glu Phe Met Pro Pro Asn Phe Gly Phe Gly Lys Lys Ala Glu Lys 210 215 220 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 35 aaaaaacata tggcggcgcc ggcggtgaag gtg 33 <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 36 aaaaaagaat tctcacttct ctgccttctt tccga 35 <210> 37 <211> 212 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 37 Met Ala Gly Ile Lys Val Phe Gly His Pro Ala Ser Ile Ala Thr Arg 1 5 10 15 Arg Val Leu Ile Ala Leu His Glu Lys Asn Leu Asp Phe Glu Leu Val 20 25 30 His Val Glu Leu Lys Asp Gly Glu His Lys Lys Glu Pro Phe Leu Ser 35 40 45 Arg Asn Pro Phe Gly Gln Val Pro Ala Phe Glu Asp Gly Asp Leu Lys 50 55 60 Leu Phe Glu Ser Arg Ala Ile Thr Gln Tyr Ile Ala His Arg Tyr Glu 65 70 75 80 Asn Gln Gly Thr Asn Leu Leu Gln Thr Asp Ser Lys Asn Ile Ser Gln 85 90 95 Tyr Ala Ile Met Ala Ile Gly Met Gln Val Glu Asp His Gln Phe Asp 100 105 110 Pro Val Ala Ser Lys Leu Ala Phe Glu Gln Ile Phe Lys Ser Ile Tyr 115 120 125 Gly Leu Thr Thr Asp Glu Ala Val Val Ala Glu Glu Glu Ala Lys Leu 130 135 140 Ala Lys Val Leu Asp Val Tyr Glu Ala Arg Leu Lys Glu Phe Lys Tyr 145 150 155 160 Leu Ala Gly Glu Thr Phe Thr Leu Thr Asp Leu His His Ile Pro Ala 165 170 175 Ile Gln Tyr Leu Leu Gly Thr Pro Thr Lys Lys Leu Phe Thr Glu Arg 180 185 190 Pro Arg Val Asn Glu Trp Val Ala Glu Ile Thr Lys Arg Pro Ala Ser 195 200 205 Glu Lys Val Gln 210 <210> 38 <211> 215 <212> PRT <213> Populus trichocarpa <400> 38 Met Ala Thr Pro Val Thr Ile Tyr Gly Pro Pro Leu Ser Thr Ala Val 1 5 10 15 Ser Arg Val Leu Ala Thr Leu Ile Glu Lys Asp Val Pro Phe His Leu 20 25 30 Val Pro Ile Asp Leu Ser Lys Gly Glu Gln Lys Lys Pro Glu Tyr Leu 35 40 45 Lys Ile Gln Pro Phe Gly Gln Val Pro Ala Phe Lys Asp Glu Ser Ile 50 55 60 Thr Leu Phe Glu Ser Arg Ala Ile Cys Arg Tyr Ile Cys Asp Lys Tyr 65 70 75 80 Ala Asp Lys Gly Asn Arg Ser Leu Tyr Gly Thr Asp Ile Leu Ser Lys 85 90 95 Ala Asn Ile Asp Gln Trp Val Glu Thr Asp Gly Gln Thr Phe Gly Pro 100 105 110 Pro Ser Gly Asp Leu Val His Asp Leu Leu Phe Ser Ser Val Pro Val 115 120 125 Asp Glu Ala Leu Ile Lys Lys Asn Val Asp Lys Leu Ala Lys Val Leu 130 135 140 Asp Ile Tyr Glu Gln Lys Leu Gly Gln Thr Arg Phe Leu Ala Gly Asp 145 150 155 160 Glu Phe Ser Phe Ala Asp Leu Ser His Leu Pro Asn Gly Asp Tyr Leu 165 170 175 Val Asn Ser Thr Asp Lys Gly Tyr Leu Phe Thr Ser Arg Lys Asn Val 180 185 190 Asn Arg Trp Trp Thr Glu Ile Ser Asn Arg Glu Ser Trp Lys Lys Val 195 200 205 Leu Glu Met Arg Lys Asn Ala 210 215 <210> 39 <211> 214 <212> PRT <213> Zea mays <400> 39 Met Ala Pro Met Lys Leu Tyr Gly Ala Val Met Ser Trp Asn Leu Thr 1 5 10 15 Arg Cys Ala Thr Ala Leu Glu Glu Ala Gly Ser Asp Tyr Glu Ile Val 20 25 30 Pro Ile Asn Phe Ala Thr Ala Glu His Lys Ser Pro Glu His Leu Val 35 40 45 Arg Asn Pro Phe Gly Gln Val Pro Ala Leu Gln Asp Gly Asp Leu Tyr 50 55 60 Leu Phe Glu Ser Arg Ala Ile Cys Lys Tyr Ala Ala Arg Lys Asn Lys 65 70 75 80 Pro Glu Leu Leu Arg Glu Gly Asn Leu Glu Glu Ala Ala Met Val Asp 85 90 95 Val Trp Ile Glu Val Glu Ala Asn Gln Tyr Thr Ala Ala Leu Asn Pro 100 105 110 Ile Leu Phe Gln Val Leu Ile Ser Pro Met Leu Gly Gly Thr Thr Asp 115 120 125 Gln Lys Val Val Asp Glu Asn Leu Glu Lys Leu Lys Lys Val Leu Glu 130 135 140 Val Tyr Glu Ala Arg Leu Thr Lys Cys Lys Tyr Leu Ala Gly Asp Phe 145 150 155 160 Leu Ser Leu Ala Asp Leu Asn His Val Ser Val Thr Leu Cys Leu Phe 165 170 175 Ala Thr Pro Tyr Ala Ser Val Leu Asp Ala Tyr Pro His Val Lys Ala 180 185 190 Trp Trp Ser Gly Leu Met Glu Arg Pro Ser Val Gln Lys Val Ala Ala 195 200 205 Leu Met Lys Pro Ser Ala 210 <210> 40 <211> 212 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 40 Met Ala Pro Val Lys Leu Tyr Gly Ala Thr Leu Ser Trp Asn Val Thr 1 5 10 15 Arg Cys Val Ala Ala Leu Glu Glu Ala Gly Val Gln Tyr Glu Ile Val 20 25 30 Pro Ile Asn Phe Gly Thr Gly Glu His Lys Ser Pro Asp His Leu Ala 35 40 45 Arg Asn Pro Phe Gly Gln Val Pro Ala Leu Gln Asp Gly Asp Leu Tyr 50 55 60 Val Phe Glu Ser Arg Ala Ile Cys Lys Tyr Ala Cys Arg Lys Asn Lys 65 70 75 80 Pro Glu Leu Leu Lys Glu Gly Asp Ile Lys Glu Ser Ala Met Val Asp 85 90 95 Val Trp Leu Glu Val Glu Ala His Gln Tyr Thr Ala Ala Leu Ser Pro 100 105 110 Ile Leu Phe Glu Cys Leu Ile His Pro Met Leu Gly Gly Ala Thr Asp 115 120 125 Gln Lys Val Ile Asp Asp Asn Leu Val Lys Ile Lys Asn Val Leu Ala 130 135 140 Val Tyr Glu Ala His Leu Ser Lys Ser Lys Tyr Leu Ala Gly Asp Phe 145 150 155 160 Leu Ser Leu Ala Asp Leu Asn His Val Ser Val Thr Leu Cys Leu Ala 165 170 175 Ala Thr Pro Tyr Ala Ser Leu Phe Asp Ala Tyr Pro His Val Lys Ala 180 185 190 Trp Trp Thr Asp Leu Leu Ala Arg Pro Ser Val Gln Lys Val Ala Ala 195 200 205 Leu Met Lys Pro 210 <210> 41 <211> 222 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 41 Met Glu Pro Met Lys Val Tyr Gly Trp Ala Val Ser Pro Trp Met Ala 1 5 10 15 Arg Val Leu Val Ser Leu Glu Glu Ala Gly Ala Asp Tyr Glu Leu Val 20 25 30 Pro Met Ser Arg Asn Gly Gly Asp His Arg Arg Pro Glu His Leu Ala 35 40 45 Arg Asn Pro Phe Gly Glu Ile Pro Val Leu Glu Tyr Gly Gly Leu Thr 50 55 60 Leu Tyr Gln Ser Arg Ala Ile Ala Arg His Ile Leu Arg Lys His Lys 65 70 75 80 Pro Gly Leu Leu Gly Ala Gly Ser Leu Glu Glu Ser Ala Met Val Asp 85 90 95 Val Trp Val Asp Val Asp Ala His His Leu Glu Pro Val Leu Lys Pro 100 105 110 Ile Val Trp Asn Cys Ile Ile Asn Pro Phe Val Gly Arg Asp Val Asp 115 120 125 Gln Gly Leu Val Asp Glu Ser Val Glu Lys Leu Lys Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Val Tyr Glu Ala Arg Leu Ser Ser Asn Lys Tyr Leu Ala Gly Asp Phe 145 150 155 160 Val Ser Phe Ala Asp Leu Thr His Phe Ser Phe Met Arg Tyr Phe Met 165 170 175 Ala Thr Glu His Ala Val Val Leu Asp Ala Tyr Pro His Val Lys Ala 180 185 190 Trp Trp Lys Ala Leu Leu Ala Arg Pro Ser Val Lys Lys Val Ile Ala 195 200 205 Gly Met Pro Pro Asp Phe Gly Phe Gly Ser Gly Arg Ile Pro 210 215 220 <210> 42 <211> 213 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 42 Met Ala Pro Ile Lys Leu Tyr Gly Met Met Leu Ser Ala Asn Val Thr 1 5 10 15 Arg Val Thr Thr Leu Leu Asn Glu Leu Gly Leu Glu Phe Asp Phe Val 20 25 30 Asp Val Asp Leu Arg Thr Gly Ala His Lys His Pro Asp Phe Leu Lys 35 40 45 Leu Asn Pro Phe Gly Gln Ile Pro Ala Leu Gln Asp Gly Asp Glu Val 50 55 60 Val Phe Glu Ser Arg Ala Ile Asn Arg Tyr Ile Ala Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Ala Ser Leu Leu Pro Thr Pro Ser Ala Lys Leu Glu Ala Trp Leu Glu 85 90 95 Val Glu Ser His His Phe Tyr Pro Pro Ala Arg Thr Leu Val Tyr Glu 100 105 110 Leu Val Ile Lys Pro Met Leu Gly Ala Pro Thr Asp Ala Ala Glu Val 115 120 125 Asp Lys Asn Ala Ala Asp Leu Ala Lys Leu Leu Asp Val Tyr Glu Ala 130 135 140 His Leu Ala Ala Gly Asn Lys Tyr Leu Ala Gly Asp Ala Phe Pro Leu 145 150 155 160 Ala Asp Ala Asn His Met Ser Tyr Leu Phe Met Leu Thr Lys Ser Pro 165 170 175 Lys Ala Asp Leu Val Ala Ser Arg Pro His Val Lys Ala Trp Trp Glu 180 185 190 Glu Ile Ser Ala Arg Pro Ala Trp Ala Lys Thr Val Ala Ser Ile Pro 195 200 205 Leu Pro Pro Ala Val 210 <210> 43 <211> 218 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 43 Met Ala Pro Val Lys Val Phe Gly Pro Ala Met Ser Thr Asn Val Ala 1 5 10 15 Arg Val Leu Val Cys Leu Glu Glu Val Gly Ala Glu Tyr Glu Val Val 20 25 30 Asp Ile Asp Phe Lys Ala Met Glu His Lys Ser Pro Glu His Leu Val 35 40 45 Arg Asn Pro Phe Gly Gln Ile Pro Ala Phe Gln Asp Gly Asp Leu Leu 50 55 60 Leu Phe Glu Ser Arg Ala Ile Ala Arg Tyr Val Leu Arg Lys Tyr Lys 65 70 75 80 Lys Asn Glu Val Asp Leu Leu Arg Glu Gly Asp Leu Lys Glu Ala Ala 85 90 95 Met Val Asp Val Trp Thr Glu Val Asp Ala His Thr Tyr Asn Pro Ala 100 105 110 Ile Ser Pro Ile Val Tyr Glu Cys Ser Ser Thr Ala His Ala Arg Leu 115 120 125 Pro Thr Asn Gln Thr Val Val Asp Glu Ser Leu Glu Lys Leu Lys Asn 130 135 140 Val Leu Glu Val Tyr Glu Ala Arg Leu Ser Lys His Asp Tyr Leu Ala 145 150 155 160 Gly Asp Phe Val Ser Phe Ala Asp Leu Asn His Phe Pro Tyr Thr Phe 165 170 175 Tyr Phe Met Ala Thr Pro His Ala Ala Leu Phe Asp Ser Tyr Pro His 180 185 190 Val Lys Ala Trp Trp Glu Arg Ile Met Ala Arg Pro Ala Val Lys Lys 195 200 205 Leu Ala Ala Gln Met Val Pro Lys Lys Pro 210 215 <210> 44 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 44 aaaaaagtcg acatggcggc gccggcggtg aagg 34 <210> 45 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 45 aaaaaagcgg ccgctcactt ctctgccttc tt 32 <210> 46 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 46 cacgggggac tctagatggc gccggcggtg aaggt 35 <210> 47 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 47 gatcggggaa attcgctact ctgctttctt tccaa 35 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 48 cgcctaaggt cactatcagc tagc 24 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 49 gaactccagc atgagatc 18 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 50 agaggaccta acagaactcg cc 22 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 51 aaaaaactta agctactctg ctttctttcc 30

Claims (30)

  1. 이하의 (a) 또는 (b)의 단백질을 암호화하는 핵산을 도입한 형질전환 식물을 이속사졸린 유도체의 존재하에 재배하는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물의 재배방법:
    (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    이속사졸린 유도체는 피록사술폰 및/또는 페녹사술폰인 것을 특징으로 하는
    재배방법.
  3. 제1항에 있어서,
    형질전환 식물은 이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 갖는 식물 유래인 것을 특징으로 하는
    재배방법.
  4. 제3항에 있어서,
    이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 가진 식물은 벼과 식물인 것을 특징으로 하는
    재배방법.
  5. 제4항에 있어서,
    벼과 식물은 벼인 것을 특징으로 하는
    재배방법.
  6. 제3항에 있어서,
    이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 가진 식물은 십자화과(Brassicaceae), 콩과(Leguminosae), 미나리과(Umbelliferae), 비름과(Amaranthaceae), 꿀풀과 (Labiatae), 명아주과(Chenopodiaceae), 장미과(Rosaceae), 국화과(Compositae), 가지과(Solanaceae) 또는 아욱과(Malvaceae) 식물인 것을 특징으로 하는
    재배방법.
  7. 제6항에 있어서,
    십자화과 식물은 유채(Brassica napus) 또는 애기장대(Arabidopsis thaliana)인 것을 특징으로 하는
    재배방법.
  8. 이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 갖는 식물에 대하여 이하의 (a) 또는 (b)의 단백질을 암호화하는 핵산을 도입하는 것을 특징으로 하는 이속사졸린 유도체에 대한 내성 부여방법:
    (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질.
  9. 제8항에 있어서,
    이속사졸린 유도체는 피록사술폰 및/또는 페녹사술폰인 것을 특징으로 하는
    내성 부여방법.
  10. 제8항에 있어서,
    이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 가진 식물은 벼과 식물인 것을 특징으로 하는
    내성 부여방법.
  11. 제10항에 있어서,
    벼과 식물은 벼인 것을 특징으로 하는
    내성 부여방법.
  12. 제8항에 있어서,
    이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 가진 식물은 십자화과(Brassicaceae), 콩과(Leguminosae), 미나리과(Umbelliferae), 비름과(Amaranthaceae), 꿀풀과 (Labiatae), 명아주과(Chenopodiaceae), 장미과(Rosaceae), 국화과(Compositae), 가지과(Solanaceae) 또는 아욱과(Malvaceae) 식물인 것을 특징으로 하는
    내성 부여방법.
  13. 제12항에 있어서,
    십자화과 식물은 유채(Brassica napus) 또는 애기장대(Arabidopsis thaliana)인 것을 특징으로 하는
    내성 부여방법.
  14. 식물에 대하여 이하의 (a) 또는 (b)의 단백질을 암호화하는 핵산을 도입하는 것을 특징으로 하는 환경 스트레스에 대한 내성 부여방법:
    (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질.
  15. 제14항에 있어서,　
    환경 스트레스는 고온 스트레스인 것을 특징으로 하는
    내성 부여방법.
  16. 제14항에 있어서,
    식물은 이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 갖는 식물인 것을 특징으로 하는
    내성 부여방법.
  17. 제16항에 있어서,
    이속사졸린 유도체는 피록사술폰 및/또는 페녹사술폰인 것을 특징으로 하는
    내성 부여방법.
  18. 제14항에 있어서,
    식물은 벼과 식물인 것을 특징으로 하는
    내성 부여방법.
  19. 제18항에 있어서,
    벼과 식물은 벼인 것을 특징으로 하는
    내성 부여방법.
  20. 제14항에 있어서,
    식물은 십자화과(Brassicaceae), 콩과(Leguminosae), 미나리과 (Umbelliferae), 비름과(Amaranthaceae), 꿀풀과(Labiatae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 장미과(Rosaceae), 국화과(Compositae), 가지과(Solanaceae) 또는 아욱과(Malvaceae) 식물인 것을 특징으로 하는
    내성 부여방법.
  21. 제20항에 있어서,
    십자화과 식물은 유채(Brassica napus) 또는 애기장대(Arabidopsis thaliana)인 것을 특징으로 하는
    내성 부여방법.
  22. 이하의 (a) 또는 (b)의 단백질을 암호화하는 핵산을 도입한 형질전환 식물:
    (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질.
  23. 제22항에 있어서,
    이속사졸린 유도체에 대한 내성 및/또는 환경 스트레스에 대한 내성을 갖는 것을 특징으로 하는
    형질전환 식물.
  24. 제22항에 있어서,
    이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 갖는 식물에 대하여 상기 핵산을 도입한 것을 특징으로 하는
    형질전환 식물.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,　
    이속사졸린 유도체는 피록사술폰 및/또는 페녹사술폰인 것을 특징으로 하는
    형질전환 식물.
  26. 제23항에 있어서,　
    환경 스트레스는 고온 스트레스인 것을 특징으로 하는
    형질전환 식물.
  27. 제24항에 있어서,
    이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 가진 식물은 벼과 식물인 것을 특징으로 하는
    형질전환 식물.
  28. 제27항에 있어서,
    벼과 식물은 벼인 것을 특징으로 하는
    형질전환 식물.
  29. 제24항에 있어서,
    이속사졸린 유도체에 대하여 감수성을 가진 식물은 십자화과(Brassicaceae), 콩과(Leguminosae), 미나리과(Umbelliferae), 비름과(Amaranthaceae), 꿀풀과(Labiatae), 명아주과(Chenopodiaceae), 장미과(Rosaceae), 국화과(Compositae), 가지과(Solanaceae) 또는 아욱과(Malvaceae) 식물인 것을 특징으로 하는
    형질전환 식물.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 십자화과 식물은 유채(Brassica napus) 또는 애기장대(Arabidopsis thaliana)인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물.
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