CN118086336A

CN118086336A - 一种影响棉花耐盐性的基因GhbHLH137及其应用

Info

Publication number: CN118086336A
Application number: CN202410401838.5A
Authority: CN
Inventors: 李生梅; 张茹; 庞博; 高文伟; 耿世伟; 李静
Original assignee: Xinjiang Agricultural Vocational Technical College
Current assignee: Xinjiang Agricultural Vocational Technical College
Priority date: 2024-04-03
Filing date: 2024-04-03
Publication date: 2024-05-28

Abstract

本发明适用于基因工程技术领域，提供了一种影响棉花耐盐性的基因GhbHLH137及其应用，所述GhbHLH137基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，GhbHLH137基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明通过进行基因沉默和过表达等实验，证实了GhbHLH137基因在调控棉花耐盐性中的功能，为棉花耐盐遗传改良提供理论基础和基因资源。

Description

一种影响棉花耐盐性的基因GhbHLH137及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种影响棉花耐盐性的基因GhbHLH137及其应用。

背景技术

土壤的盐渍化是全球性的问题，据估计，全球约有五分之一的灌溉土地遭受了盐碱土壤的负面影响。土壤盐碱化严重限制了植物的生长发育，影响了作物产量。根据耐盐性可将植物分为盐生植物或糖生植物，随着盐浓度的升高，植物所受的影响会逐渐升高，尤其许多作物都是甜土植物，很难在高浓度的盐环境下生存，大约在100-200mM浓度的NaCl条件下其生长就会受到抑制甚至死亡。因此，开发能够在盐碱化土壤中正常生长的作物是解决这个问题的基础。

棉花是重要的经济作物，也是盐碱地的先锋作物，但是长期高盐胁迫会减少棉花气孔的开放，进而导致光合作用和碳水化合物的供应下降，从而影响棉花纤维品质和产量。因此，近年来，科学家们对棉花的耐盐性进行了广泛研究，初步揭示了棉花耐盐机理，不但有助于提高棉花耐盐碱性，同时提高土地利用率，解决粮棉争地等问题。

bHLH(Basic helix-loop-helix)转录因子是真核生物中一个广泛存在的大型蛋白家族，它们在从酵母到植物和动物的各种生物中都有发现，在植物的生长发育、代谢活动以及在非生物胁迫中发挥重要作用。bHLH蛋白质包含两个关键功能域，位于N端的碱性区域负责DNA结合，位于C端的螺旋-环-螺旋(HLH)区域则促进蛋白间的相互作用。目前，已经鉴定并克隆了许多bHLH转录因子。例如，SlbHLH068被发现可以正向调节番茄中的铁稳态；NtbHLH123、MfbHLH38和BvbHLH93等基因被报道参与了盐胁迫响应。PebHLH35通过调节气孔发育和光合作用，提高拟南芥对干旱胁迫的耐受性。以上研究表明，bHLH转录因子家族在植物的非生物胁迫中起重要作用，但关于该蛋白质的功能和调节作用还有很多仍需了解。为此我们提出一种影响棉花耐盐性的基因GhbHLH137及其应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种影响棉花耐盐性的基因GhbHLH137及其应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种影响棉花耐盐性的基因GhbHLH137，所述GhbHLH137基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示，GhbHLH137基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步的，将所述GhbHLH137基因连接到载体pTRV2，得到重组质粒TRV2-GhbHLH137；将所述GhbHLH137基因连接到载体pCAMBIA3301，得到重组质粒pCAMBIA3301-GhbHLH137；将所述GhbHLH137基因连接到载体pCAMBIA1304，得到重组质粒pCAMBIA1304-GhbHLH137；将所述GhbHLH137基因连接到载体pGBKT7，得到重组质粒pGBKT7-GhbHLH137。

一种根据上述所述的基因GhbHLH137在影响棉花耐盐性中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过进行基因沉默和过表达等实验，证实了GhbHLH137基因在调控棉花耐盐性中的功能，为棉花耐盐遗传改良提供理论基础和基因资源。

附图说明

图1为GhbHLH137基因克隆。其中，A为GhbHLH137基因的PCR扩增；B为克隆菌落PCR电泳检测，M：DL2000 bp DNA Marker；1～12：菌液PCR产物。

图2为GhbHLH137菌液测序比对。

图3为GhbHLH137基因的结构分析。其中，A为亲疏水值；B为跨膜结构预测；C为蛋白信号肽分析；D为磷酸化位点预测；E为结构域分析；F为二级结构预测；G为三级结构预测。

图4为不同物种bHLH137蛋白序列比对示意图。

图5为不同物种bHLH137基因蛋白序列进化树。

图6为GhbHLH137在棉花不同组织的表达情况。其中，***：P＜0.001，t检验。

图7为在盐处理下不同组织中GhbHLH137的表达模式。其中，A为在根中表达量；B为在茎中表达量；C为在叶片中表达量。

图8为pCAMBIA1304-GhbHLH137载体示意图。

图9为pCAMBIA1304-GhbHLH137菌液PCR电泳检测。

图10为pCAMBIA1304-GhbHLH137融合蛋白的亚细胞定位。其中，第一排为转化GFP空载的烟草叶肉细胞，第二排为转化融合载体的烟草叶肉细胞；Merged代表荧光和明场的融合视野，GFP代表荧光视野，Bright代表明场。

图11为pGBKT7-GhbHLH137载体示意图。

图12为pGBKT7-GhbHLH137基因菌液PCR电泳检测。其中，M：DL2000 bp DNAMarker；1：菌液PCR结果。

图13为GhbHLH137转录激活活性验证。

图14为T₁代阳性转基因拟南芥株系筛选。

图15为T₂代转基因拟南芥PCR验证。其中，M：DL2000bp DNA Marker；1-5：转基因拟南芥PCR产物；6：阴性对照。

图16为盐胁迫下GhbHLH137过表达拟南芥和野生型拟南芥的表型鉴定。

图17为TRV2-GhbHLH137基因菌液PCR电泳检测。其中，M：DL2000bp DNA Marker；1～5：菌液PCR结果。

图18为CLA1白化表型图。

图19为目的基因沉默效果检测。其中，***：P＜0.001，t检验。

图20为沉默GhbHLH137基因后的抗逆表型鉴定。

图21为丙二醛含量。

图22为超氧化物歧化酶含量。

图23为过氧化物酶含量。

图24为沉默植株和对照植株叶中耐盐基因表达分析。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

本发明一个实施例提供的一种影响棉花耐盐性的基因GhbHLH137，所述GhbHLH137基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，GhbHLH137基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

作为本发明的一种实施例，将所述GhbHLH137基因连接到载体pTRV2，得到重组质粒TRV2-GhbHLH137；将所述GhbHLH137基因连接到载体pCAMBIA3301，得到重组质粒pCAMBIA3301-GhbHLH137；将所述GhbHLH137基因连接到载体pCAMBIA1304，得到重组质粒pCAMBIA1304-GhbHLH137；将所述GhbHLH137基因连接到载体pGBKT7，得到重组质粒pGBKT7-GhbHLH137。

本发明一个实施例提供的一种根据上述所述的基因GhbHLH137在影响棉花耐盐性中的应用。

实施例1、1.1基因克隆；使用NCBI网站查询目的基因的CDS序列。表1中GhbHLH137代表扩增目的基因CDS全长的引物，设计方法为从基因5’端起始密码子开始设计一段上游引物，从基因3’端终止密码子开始设计一段下游引物。扩增基因GhbHLH137的方法，使用的引物见表1(GhbHLH137-F和GhbHLH137-R)。通过NCBI在线网站设计qRT-PCR特异性引物，引物序列如表1中GhbHLH137-RT所示，内参基因为GhUBQ7。引物由上海生工生物有限公司合成。

表1.PCR和qRT-PCR引物

使用获得的cDNA为模板，扩增目的基因。扩增体系见表2，扩增体系程序见表3。

表2.PCR扩增体系

表3.PCR扩增程序

基于菌液测序的结果，用DNAMAN 8.0进行了目的基因的序列比对，并翻译成氨基酸序列进行比对，利用表4分析该蛋白的结构和功能。

表4.生物信息学网站网址

1.2 GhbHLH137基因表达模式分析；使用收集的材料，按照实验方法获取其cDNA，用无酶水将cDNA稀释10倍后作为qRT-PCR的样本。使用NCBI设计目标基因的特异性引物，qRT-PCR所用引物见表1，以GhUBQ7作为内参基因，以2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

(1)在离心管中配制反应混合液，体系如表5所示：

表5.qRT-PCR体系

将上述体系置于荧光定量PCR仪中，进行qRT-PCR反应。反应程序如表6所示。

表6.qRT-PCR扩增程序

实施例2、GhbHLH137基因的亚细胞定位；

将目的基因的终止密码子去掉，设计亚细胞定位的引物，酵母自激活实验表达的引物，可以克隆基因的CDS全长(见表7)。通过CE Design设计引物。引物由上海生工生物有限公司合成。

表7.PCR引物

2.1 pCAMBIA1304-GhbHLH137融合表达载体的构建；

2.1.1质粒提取：

首先将100μL大肠杆菌菌液加入到含有Kana+(终浓度为50μL/mL)的5mL LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床中培养过夜，使用北京天根生化(TIANGEN Biotech)科技公司的TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒进行质粒提取，详细步骤如下：

(1)向吸附柱CP3中加500μL平衡液，12000rpm离心1min，弃废液。

(2)将5mL过夜培养的菌液，4000rpm离心10min，吸除上清。

(3)向管内沉淀加250μL P1(RNaseA已加)，使用移液器或者涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀，转移至2ml离心管中。

(4)向离心管中加入250μL P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

(6)向离心管中加入350μL P3，温和地上下翻转6-8次，充分混匀，12000rpm离心10min。

(6)将上一步收集的上清液用移液器移到吸附柱CP3中，12000rpm离心1min，弃废液。

(7)向吸附柱中加600μL漂洗液PW(无水乙醇已加)，12000rpm离心1min，弃废液。

(8)重复操作上一步骤。

(9)空离，12000rpm离心2min，开盖晾干。

(10)将吸附柱放入新的离心管中，向膜中央滴加50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

(11)利用微量分光光度计检测质粒浓度，并进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测其条带位置。

2.1.2酶切载体：使用限制性内切酶Nco I，将质粒载体线性化。在离心管中配制酶切体系，成分与其用量如表8所示。

表8.酶切体系

将酶切体系混匀，瞬时离心后，37℃孵育30min，80℃孵育20min。使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收酶切后的线性化载体。

2.1.3 PCR产物和线性载体的连接和转化：

(1)连接：将目的基因与线性化载体按照表9的用量，制备连接体系，吸打混匀，短暂离心，之后将连接体系37℃水浴30min，然后放在冰上冷却，得到重组产物。

表9.连接体系

(2)转化大肠杆菌：A.将大肠杆菌DH5α感受态细胞置于冰上解冻。B.吸取50μL的大肠感受态细胞，加入到上述重组产物中，用手指轻弹离心管管壁(不要振荡)，使重组产物和感受态细胞均匀混合，然后于冰上静置30min。C.放入42℃水浴锅中热激45s，立即置于冰上静置2min。D.向离心管中加入300μL的LB液体培养基(不加抗生素)，置于37℃摇床中220rpm振荡培养1h。E.培养完成后，取200μL菌液涂布于含有Kana+(终浓度为50μg/mL)的LB固体培养基上，37℃倒置培养12-16h。F.用灭菌的枪头挑取单菌落，在添加了Kana+的LB液体培养基中，置于37℃摇床中220rpm振荡培养4-6h。G.进行菌液PCR检测，配制PCR扩增体系其用量如表10所示，将PCR扩增体系混匀，瞬时离心，置于PCR仪中，以表11中的扩增程序进行扩增。H.使用1％琼脂糖凝胶电泳检测菌液PCR扩增产物，挑选条带正确的菌液。I.吸取200μL菌液进行测序，测序公司为上海生工生物有限公司。

表10.PCR扩增体系

表11.PCR扩增程序

2.1.4 PCR阳性重组质粒的获取：使用SnapGene软件，将上述测序结果与目的基因的碱基序列进行比对，比对结果一致没有碱基突变的单克隆，即为阳性单克隆。提取阳性单克隆的质粒，用1％琼脂糖凝胶电泳检验质粒质量。

2.1.5重组质粒转化农杆菌：

(1)采用冻融法进行转化，取-80℃保存的GV3101农杆菌感受态细胞于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

(2)无菌条件下，50μL感受态细胞中加入5μL质粒DNA，轻轻混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。

(3)无菌条件下加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养2-3h，菌体复苏；

(4)6000rpm离心1min收菌，留100μL左右上清，轻轻吹打重悬菌体涂布于含Kana+和Rif+(终浓度为50μg/mL)的LB平板上，于28℃培养箱中倒置培养48-72h。

(5)挑取单克隆进行PCR检测，其PCR体系和程序同上述大肠杆菌菌液PCR一致。挑取阳性单克隆加入到含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rpm摇菌6h后，向每1mL菌液中加入1mL的50％甘油，存放于-80℃冰箱保存。

2.2 pCAMBIA1304-GhbHLH137瞬时表达具体操作步骤如下：

(1)选择本氏烟草做为瞬时表达分析的受体植物。营养土种植本氏烟草，选择正常生长30d左右的烟草叶片进行实验。

(2)从-80℃中取出保存的甘油农杆菌并用枪头刮取少量甘油菌液混合物，放置于5mL的液体LB培养基中(提前加入50μg/mL的Rif+和50μg/mL的Kana+)，28℃，200rpm培养16h左右。

(3)吸取1mL步骤(2)中活化的菌液至20mL含有两种相同抗性的LB液体培养基里，同步骤(2)的条件培养约10h，检测菌液的OD600，待OD600至1.2左右停止摇菌。

(4)将上述菌液倒入无菌的50mL离心管中，4000rpm离心10min，弃掉上清，保留菌体沉淀。

(5)向含有沉淀的离心管中，加入一定量的重悬液混匀后随时检测菌液的吸光度值，保证OD600为0.8左右，然后将混合液置于室温黑暗放置3h左右。重悬液配方如表12所示。

(6)选择合适的烟草叶片，标记好对照组和处理组，用1mL注射器将重悬的菌体混合液，在烟草叶片背面缓慢推射。

(7)将感染的烟草植株放在暗室中约24h，之后将植株移到16h光照/8h黑暗的光照下生长约24h。

(8)用激光共聚焦显微镜采集荧光信号(尼康)。

表12.重悬液配方

实施例3、pGBKT7-GhbHLH137酵母菌株自激活；

3.1 pGBKT7-GhbHLH137载体的构建：构建重组质粒pGBKT7-GhbHLH137所使用的引物见表7(GhbHLH137-BD-F和GhbHLH137-BD-R)，使用的内切酶为Sma I、BamH I，pGBKT7载体的抗性为卡那抗性。具体实验步骤同2.1。

3.2 pGBKT7-GhbHLH137酵母菌株自激活验证：

(1)Carrier DNA的预处理：将Carrier DNA插入浮漂中95℃水浴3min，加热后快速插入冰中，重复一次。

(2)取100μl冰上融化的AH109感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5μg，预处理后的Carrier DNA 10μl，PEG 500μl并吸打几次混匀，30℃水浴30min(15min时翻转6-8次混匀)。

(3)将管放42℃水浴15min(7.5min时翻转6-8次混匀)。

(4)5000rpm离心40s弃上清，ddH₂O 400μl重悬，离心30s弃上清。

(5)ddH₂O 50μL重悬，涂板，29℃培养48-96h。

实施例4、4.1转基因拟南芥的受体材料为哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsisthaliana，Co1-0)，由实验室保存。VIGS实验的植物材料为本实验长期保存并严格自交的棉花品种陆地棉军棉一号。

表13.PCR引物

4.2植物pCAMBIA3301-GhbHLH137基因沉默载体的构建：转基因拟南芥的构建方法，构建重组质粒pCAMBIA3301-GhbHLH137使用的引物见表13(GhbHLH137-35s-F和GhbHLH137-35s-R)，使用的内切酶为Nco I，pCAMBIA3301-GhbHLH137载体的抗性为卡那抗性。具体实验步骤同2.1。

4.3浸花法转化拟南芥：

(1)拟南芥消毒：将适量的野生型拟南芥种子装入1.5mL离心管中，用70％的乙醇漂洗3min(漂洗全程在振荡器上进行)，10000rpm离心30s，将管中液体吸除，之后重复操作一次；加入无菌水漂洗1min，离心30s，吸干残液，重复漂洗3次；加入浓度为0.5％的NaClO漂洗10-15min，离心30s，吸干剩余液体；加入无菌水漂洗1min，离心30s，吸干残液；

(2)4℃纯化2天，用灭菌枪头均匀点播在MS培养基上。当拟南芥在培养基上生长出3-4片叶子时，用镊子轻轻地将小苗夹起，移入营养土中(营养土∶蛭石＝1∶1)，并覆盖保鲜膜，置于温室培养(22℃、光照16h/8h)，移栽4天后揭掉保鲜膜。

(3)待拟南芥生长至盛花期，可以开始转化拟南芥。转化前，剪掉已授粉的花和果荚，留下没有开放的花苞，在转化前一天对拟南芥浇水。

(4)农杆菌的活化：吸取100μL含有pCAMBIA3301-GhbHLH137的农杆菌菌液，加入含有Kan+和Rif+的5mL LB液体培养基中，28℃，200rpm过夜培养。

(5)将活化的菌液以1∶50的比例，加入到50mL含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rmp过夜培养，使OD600＝1.5。

(6)4000rpm室温离心10min，弃上清，收集菌体沉淀。

(7)配制重悬液：蔗糖50g/L，MS 2.15g/L，Silwet-77 200μL/L。

(8)重悬菌体：将收集到的菌体与配制好的重悬液混合，使OD600＝0.8-1.0。

(9)将浸染液倒入培养皿中，把花苞浸泡在浸染液中1min。

(10)将浸染过的拟南芥黑暗培养24h，之后正常培养，成熟后收取T₀代种子。

4.4拟南芥盐胁迫表型观察：培养皿上萌发种子，待第1片真叶长出后将其移植于含蛭石和营养土的培养钵中，正常培养30d。在保证野生型和转基因株系植株里挑选生长状态一致的情况下，浇灌250mM NaCl溶液，每2d浇一次，观察盐胁迫的表型并拍照记录生长状态。

4.5植物TRV2-GhbHLH137基因沉默载体的构建：转基因棉花的构建方法，构建重组质粒TRV2-GhbHLH137使用的引物见表13(GhbHLH137-VIGS-F和GhbHLH137-VIGS-R)，TRV2-GhbHLH137载体的抗性为卡那抗性，使用的限制性内切酶为EcoR I、BamH I。具体实验步骤同2.1。

4.6注射法转化棉花：

(1)棉花的种植：挑选饱满的种子，将种子埋在装有营养土的花盆中(营养土与蛭石混合的比例为1∶1)，每个花盆种四粒种子，放置于温室生长(播种后覆膜，发芽后揭膜)，发芽四天后剔苗，每盆留下两棵长势一致的幼苗继续生长。

(2)农杆菌的活化：吸取100μL含有TRV2-GhbHLH137、TRV2空载、TRV1的农杆菌菌液，分别加入到含有Kana+和Rif+的5mL LB液体培养基中，28℃，200rpm过夜培养。

(3)将活化的菌液以1∶50的比例，加入到50mL含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rmp过夜培养，使OD600＝1.5。

(4)4000rpm室温离心10min，弃上清，收集菌体沉淀。

(5)配制重悬液：200μM AS：200μL，10mM MES：100mL，10mM MgCl₂ 6H₂O：10mL，加无菌水定容至1000mL。

(6)重悬菌体：将收集到的菌体与配制好的重悬液混合，使OD600＝1.2-1.5，室温暗处静止3h。静置完成后将各个菌株重悬液分别与TRV1辅助菌株重悬液1∶1混合。

(7)选取生长至两片子叶完全展开且真叶刚露芽时的棉花幼苗幼苗，用无菌针头在叶片背部划一微小伤口，再用无菌注射器对准伤口将重悬液注射进叶片，注满为止。将注射后的棉株在室温下暗处理16-24h，后转移至恒温培养室中培养。

4.7沉默效率检测与盐处理方式：当植株出现白化表型后一周，分别提取空载植株、基因沉默植株的单株的RNA，进行qRT-PCR，检测GhbHLH137基因的表达量。

检测沉默效率并且基因沉默成功后，将350mM NaCl溶液浇灌在托盘中，使植株根系从下往上吸水，之后观察盐胁迫下各株系的表型以及测定各生化指标。

4.8生理指标的测定；

4.8.1丙二醛含量(MAD)的测定：称0.1g新鲜叶片，剪碎放入2mL离心管中，加钢珠液氮冷冻(冷冻时间不宜太长，小心爆管)，放入打样机打碎(打两次，每次1.5min)，离心机离心(12000rpm，4℃，10min)，取上清1mL(上清液为样品提取液；对照加1mL蒸馏水)，加入1mL 0.6％TBA(硫代巴比妥酸)(用10％的TCA溶液配制)溶液，加塞，摇匀，沸水浴15min(不盖盖子)，取出离心管冷却，再次离心10min，取上清液至酶标板上测定450nm、532nm、600nm波长处OD值，3-5次重复。设对照为1mL蒸馏水+1mL TBA。

4.8.2超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定：

采用NBT光化还原法：称取新鲜材料0.1g，剪碎加入到2mL的离心管中；液氮冷冻打样机打碎；加入2mL酶提取缓冲液，12000rpm、4℃离心15min，此上清液即为酶提取液，4℃冰箱保存备用。取上清10μL直接加入酶标板(冰上操作)；加290μL的反应体系对照设不照光(PBS 20μL+580μL反应体系)放入离心管中置于暗处15min；照光对照：(PBS 10μL+290μL反应体系)放入酶标板。混匀后将其中一支对照管与样品管放置于4000lx(25℃，光度8)日光灯下反应15min，同时将另一支对照管置于暗处。反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定560nm波长处其它各管的OD值，5次重复。

4.8.3过氧化物酶(POD)活性的测定：采用愈创木酚法：称取新鲜材料0.1g，剪碎加入到2mL的离心管中；液氮冷冻打样机打碎；加入2mL PBS，12000rpm、4℃，离心15min，此上清液即为酶提取液，4℃冰箱保存备用。取上清200μL酶液加入旧的酶标板(洗干净的)；新酶标板中加入140μL POD反应混合液；从旧板中(使用10μL的排枪加20μL酶液到新板中)设置UV1800紫外/可见分光光度计为“动力学”模式，测定周期为5min。在比色杯中加反应混合液(100mmol/L PH＝6.0磷酸缓冲液50mL，加入愈创木酚28mL，加热搅拌，直至愈创木酚溶解。待溶液冷却后，加入30％过氧化氢19μL，混合均匀保存于冰箱中)KH₂PO₄溶液作为对照，样品杯则加酶提取液，立即开始测定470nm波长处OD值，最后记录ΔA470/min，5次重复。

对照组：KH₂PO₄酶提取液+140μL POD反应液；POD活性单位以每分钟OD470值变化1.0表示一个酶活单位。

实施例1-实施例4的结果与分析如下：

1)GhbHLH137基因的克隆；以棉花品种“军棉一号”幼叶的cDNA为模版扩增目的基因GhbHLH137，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶检测结果见图1中A。结果显示，GhbHLH137基因CDS序列全长为1002bp，菌液PCR扩增结果跟序列测序结果与目标基因完全相同(图1中B、图2)，表明基因克隆成功。

2)GhbHLH137基因的结构分析；对GhbHLH137进行生物信息学分析，结果显示，GhbHLH137的预测分子式为C₁₆₁₈H₂₅₇₆N₄₆₄O₅₂₁S₁₅，蛋白质分子量为37345.95，理论等电点是8.33，原子数为5194，丝氨酸(Ser)占氨基酸总数的含量最多，达到11.1％，不稳定系数为52.90，为不稳定蛋白，脂肪系数为64.98。GhbHLH137蛋白在14位的疏水性值最强为1.733，在142位亲水性值最强为-3.089，亲疏水性总平均值为-0.742，属于亲水性蛋白(图3中A)。利用TMHMM软件进行跨膜结构预测，预测显示GhbHLH137蛋白无跨膜结构(图3中B)。利用SignalP-5分析蛋白信号肽，预测显示GhbHLH137蛋白无信号肽(图3中C)。利用NetPhos 3.1进行磷酸化位点预测(图3中D)，结果显示GhbHLH137含有1个络氨酸(Tyr)位点，14个苏氨酸(Thr)位点，27个丝氨酸(Ser)位点，总的磷酸位点有42个。利用NCBI Conserved domains进行结构域分析，预测显示GhbHLH137属于bHLH_SF超家族(图3中E)。利用SOPMA和SWISS-MODEL对GhbHLH137的二级结构(图3中F)和三级结构进行预测(图3中G)，结果显示二级结构由无规则卷曲结构、α-螺旋、延伸链、β-折叠4种结构所组成，结构值分别为63.36％，22.22％，10.21％，4.20％。

3)GhbHLH137的氨基酸序列分析及系统进化树构建；利用NCBI中的blastp在线网站对GhbHLH137氨基酸的同源序列进行同源性比对，找到了相似度最高的15个其他物种。利用DNAMAN8软件进行氨基酸多序列比对，依据氨基酸序列多重比对结果将该蛋白与表14中的bHLH137蛋白序列做多序列比对(图4)，发现GhbHLH137基因编码的蛋白序列与其他物种的相似序列的相似性如表14，其中与夏威夷棉bHLH137蛋白同源性最大，与蓖麻bHLH137蛋白同源性最小。利用Mega11软件对不同物种bHLH137氨基酸序列进行进化树构建(图5)，陆地棉GhbHLH137蛋白和夏威夷棉、海岛棉蛋白聚集在同一分支上，表明在生物进化过程中，陆地棉GhbHLH137蛋白与夏威夷棉、海岛棉亲缘关系较近，与蓖麻亲缘关系较远。

表14.GhbHLH137氨基酸序列与其他物种相似性

4)GhbHLH137基因的表达模式分析；通过qRT-PCR检测GhbHLH137基因在陆地棉不同组织中的表达量。结果显示GhbHLH137基因在陆地棉叶片中的表达量最高，其次是茎，在根中的表达量最低，几乎不表达(图6)。

棉花生长过程中会受到不同的非生物胁迫，引起一些抗逆基因的表达。为了验证盐胁迫是否会引起GhbHLH137基因的表达，对陆地棉进行了200mM NaCl处理，通过qRT-PCR检测基因表达量(图7)。结果显示，随着盐胁迫时间的增加，在根中，GhbHLH137基因表达量呈现先上升后下降的趋势，在6h达到最大值(图7中A)；在茎中，GhbHLH137基因表达量急速下降，在24h达到最小值(图7中B)；在叶片中，GhbHLH137基因表达量呈现先下降后上升的趋势，在12h表达量最低，在24h表达量最高(图7中C)。

5)GhbHLH137基因的亚细胞定位；

51)pCAMBIA1304-GhbHLH137融合表达载体的构建；构建重组质粒pCAMBIA1304-GhbHLH137所用的引物见表7(GhbHLH137-GFP-F和GhbHLH137-GFP-R)，根据棉花GhbHLH137的编码区，使用Nco I单酶切，采用诺唯赞无缝克隆的方法构建pCAMBIA1304-GhbHLH137融合表达载体(图8)。构建的pCAMBIA1304-GhbHLH137经过引物检验，扩增的目的基因条带大小正确(图9)，将菌液送出测序验证，测序结果跟所需目标基因的相同，pCAMBIA1304-GhbHLH137载体构建成功。

52)pCAMBIA1304-GhbHLH137重组蛋白的亚细胞定位；构建pCAMBIA1304-GhbHLH137融合载体，通过农杆菌瞬时转化一月龄的烟草，以转化空载pCAMBIA1304的烟草为对照，在激光共聚焦显微镜下观察GFP荧光位置。结果显示，注射空载GFP的植株中荧光信号定位在细胞核与细胞膜上，注射pCAMBIA1304-GhbHLH137融合载体的植株中荧光信号位于细胞核中(图10)，说明GhbHLH137为核定位蛋白。

6)pGBKT7-GhbHLH137酵母菌株自激活；

61)pGBKT7-GhbHLH137酵母表达载体的构建；根据棉花GhbHLH137的编码区，使用Sma I、BamH I双酶切，采用诺唯赞无缝克隆的方法构建pGBKT7-GhbHLH137酵母表达载体(图11)。构建的pGBKT7-GhbHLH137经过引物检验，扩增的目的基因条带大小正确(图12)，将菌液送出测序验证，测序结果跟所需目标基因的相同，pGBKT7-GhbHLH137载体构建成功。

62)pGBKT7-GhbHLH137酵母菌株自激活验证；为了确定GhbHLH137是否具有转录活性，我们检测了酵母中GhbHLH137的转录激活活性。我们将GhbHLH137的CDS克隆到pGBKT7载体中。以pGBKT7作为阴性对照。将对照组以及pGBKT7-GhbHLH137转化到AH109酵母细胞中。含有pGBKT7-GhbHLH137的酵母细胞在SD/-Trp-His-Ade培养基上不能正常生长，而转化空质粒的酵母细胞也没有生长(图13)。该结果表明GhbHLH137不具有自激活活性。

7)转基因拟南芥T₁代筛选；用Basta喷施3d后观察植株存活情况，结果如图14，转基因拟南芥生长正常，而非转基因植株叶片变黄。

8)转基因拟南芥T₂代筛选及检测；从含有除草剂抗性的培养基上筛选出5株阳性转基因植株，将挑出的阳性转基因植株移到土中，15天后提取阳性单株叶片DNA，利用特异性引物bar-F/R，进行PCR检测(图15)，片段大小为475bp。

9)转基因拟南芥在苗期对盐的耐受性；NaCl处理组中野生型拟南芥生长严重受阻，其莲座叶窄小、发黄，而GhbHLH137基因过表达拟南芥的生长仅受到轻微抑制(图16)。

10)TRV2-GhbHLH137沉默载体的构建；参考棉花GhbHLH137基因的CDS序列，利用在线工具SGN-VIGS设计抑制目的基因表达的沉默片段，将扩增后得到的产物，进行胶回收、连接载体TRV2，转至大肠感受态内，并对连接后涂布并挑菌，再通过PCR聚合酶链式反应进行验证，获得了正确目的基因条带(图17)，将菌液送出测序验证，测序结果跟所需目标基因的相同，TRV2-GhbHLH137载体构建成功。

11)沉默效率检测；对注射TRV2-GhbHLH137(实验组)及TRV2空载(阴性对照)的棉花叶片各取三个重复组，提取叶片RNA，将其反转录生成cDNA，以棉花GhUBQ7作为内参基因，进行qRT-PCR分析。注射CLA1白化载体的植株，在注射8天左右开始出现白化表型(图18)，20天后仍然存在白化表型，说明基因沉默成功，并且效果稳定。利用qRT-PCR检测TRV2-GhbHLH137和TRV2-00植株中GhbHLH137在根和真叶中的表达量。注射TRV2-GhbHLH137载体的植株中基因的表达量显著低于TRV2-00空载植株(图19)，且沉默效率都达到95％，说明基因沉默成功。

12)GhbHLH137基因的沉默降低了棉花的耐盐性；检测基因沉默效率后，用350mMNaCl处理注射空载的植株(TRV2-00)以及注射TRV2-GhbHLH137的植株，将350mM NaCl溶液浇灌在托盘中，使植株根系从下往上吸水，之后观察盐胁迫下各株系的表型以及测定各生化指标。350mM NaCl处理前，各株系的植株生长情况一致(图20)；在盐处理72h的时候，各株系的叶片出现不同程度的萎蔫。两个对照株系的叶片萎蔫程度低，TRV2-GhbHLH137株系的叶片萎蔫严重，这些现象表明GhbHLH137基因表达的沉默，导致了植株耐盐性减弱。

13)VIGS棉花在盐胁迫条件下的生化指标测定；

131)丙二醛含量(MAD)的测定；在逆境下植物其体内MDA含量会积累的越来越多，从而导致细胞膜收到损害，使植株耐盐性减弱。通过对盐处理和正常处理下基因沉默组与对照组植株中MDA含量的检测可知(图21)，正常处理(CK)下，基因沉默组植株的MDA含量与对照组相比无差异性；而在盐处理后，基因沉默组与对照组植株的MDA含量均增多，且基因沉默组植株的MDA含量极显著高于对照组。表明，在棉花中抑制GhbHLH137基因表达降低了植株的耐盐性。

132)超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定；SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，在保护细胞免受正常细胞代谢活动期间产生的活性氧或各种环境压力产生的毒性作用方面发挥着核心作用。通过对盐处理和正常处理下基因沉默组与对照组植株中SOD活性的检测可知(图22)，正常处理(CK)下，基因沉默组植株的SOD活性与对照组相比无差异性；而在盐处理后，对照组植株的SOD活性明显增多，基因沉默组植株的SOD活性极显著低于对照组。

133)过氧化物酶(POD)活性的测定；POD是植物组织防御系统中最关键的清除酶之一，在逆境下能够有效的清除细胞内过氧化氢氧化自由基对细胞膜系统的破坏。通过对盐处理和正常处理下基因沉默组与对照组植株中POD活性的检测可知(图23)，正常处理(CK)下，基因沉默组植株与对照组植株的POD活性基本一致，且含量不高；而在盐处理后，基因沉默组植株的POD活性基本不变，而对照组植株的POD活性增加，表现出上升趋势，与基因沉默组植株的POD活性存在显著差异。

14)VIGS处理后耐盐相关基因的表达分析；qRT-PCR检测各沉默植株及对照植株叶中耐盐基因的表达情况，结果显示(图24)：GhbHLH137基因沉默植株中耐盐基因的表达量GhGASA1显著增高，GhMYB73、GhCNGC32、GhCNGC35、GhC3H20、GhADC2、GhNAC4、GhUBC10、GhSRS21、GhFB15均显著降低。其中，ABA响应基因(GhMYB73、GhCNGC32、GhCNGC35、GhC3H20、GhNAC4)和ROS响应基因(GhUBC10-2、GhSRS21、GhFB15)均下调表达，表明GhbHLH137可能通过调节ABA信号通路和ROS反应影响棉花耐盐性。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些均不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims

1.一种影响棉花耐盐性的基因GhbHLH137，其特征在于，所述GhbHLH137基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，GhbHLH137基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的影响棉花耐盐性的基因GhbHLH137，其特征在于，将所述GhbHLH137基因连接到载体pTRV2，得到重组质粒TRV2-GhbHLH137；

将所述GhbHLH137基因连接到载体pCAMBIA3301，得到重组质粒pCAMBIA3301-GhbHLH137；

将所述GhbHLH137基因连接到载体pCAMBIA1304，得到重组质粒pCAMBIA1304-GhbHLH137；

将所述GhbHLH137基因连接到载体pGBKT7，得到重组质粒pGBKT7-GhbHLH137。

3.一种根据权利要求1所述的基因GhbHLH137在影响棉花耐盐性中的应用。