BR112020015958A2 - Proteína tolerante a herbicida, gene tolerante a herbicida, cassete de expressão, vetor recombinante, métodos, sistema de plantio para controlar o crescimento de ervas daninhas, método ou sistema de plantio, uso de uma proteína tolerante a herbicida - Google Patents

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Abstract

a presente invenção se refere a uma proteína tolerante a herbicida, um gene de codificação desta e o uso deste, em que a proteína tolerante a herbicida compreende: uma proteína (a) tendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na seq id no: 1, e tendo uma substituição de alanina pelo menos na posição 176 e/ou tendo uma substituição de valina na posição 178 da seq id no: 1; ou (b) tendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na seq id no: 3; ou (c) tendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na seq i d no: 5; ou (d) tendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na seq id no: 7; ou (e) sendo derivada de (a) por meio da sequência de aminoácidos de (a) sendo submetida a substituição e/ou deleção e/ou adição de um ou vários aminoácidos, e tendo a atividade de tifensulfuron hidrolase. a proteína tolerante a herbicida da presente invenção possui uma ampla gama de aplicações em plantas.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção PROTEÍNA TOLERANTE A HERBICIDA, GENE TOLERANTE A HERBICIDA, CASSETE DE EXPRESSÃO, VETOR RECOMBINANTE, MÉTODOS, SISTEMA DE PLANTIO PARA CONTROLAR O CRESCIMENTO DE ERVAS DANINHAS, MÉTODO OU SISTEMA DE PLANTIO, USO DE UMA
PROTEÍNA TOLERANTE A HERBICIDA Campo da Invenção
[0001] A presente invenção refere-se a uma proteína tolerante a herbicida, um gene que a codifica e uso destes e, em particular, a uma proteína tolerante a herbicida de sulfonilureia, um gene que a codifica e uso destes. Antecedentes da Invenção
[0002] As ervas daninhas podem esgotar nutrientes valiosos exigidos pelas culturas e outras plantas de interesse no solo rapidamente. Atualmente, existem muitos tipos de herbicidas usados para controlar ervas daninhas, dentre as quais um herbicida particularmente popular é glifosato. As culturas resistentes ao glifosato foram desenvolvidas, tais como milho, soja, algodão, beterraba sacarina, trigo e arroz. Portanto, o glifosato pode ser pulverizado sobre o campo onde culturas resistentes ao glifosato são plantadas, de forma a controlar ervas daninhas sem danos significativos às culturas.
[0003] O glifosato foi amplamente usado no mundo por mais do que 20 anos, resultando em um excesso de confiança em glifosato e tecnologias de cultura tolerante ao glifosato, assim como aplicação de uma alta pressão de seleção a plantas que são naturalmente mais tolerantes ao glifosato ou desenvolveram uma atividade resistente ao glifosato em espécies de ervas daninhas selvagens. Foi relatado que algumas ervas daninhas desenvolveram resistência ao glifosato, incluindo ervas daninhas de folhas largas e ervas daninhas gramíneas, tais como Lolium rigidium, Lolium multiflorum, Eleusine indica Gaertn, Ambrosia artemisiifolia, Conyza canadensis, Conyza bonariensis e Plantago lanceolata. Além disso, as ervas daninhas que não foram problemas agrícolas antes do uso amplo de culturas tolerantes ao glifosato se tornaram prevalentes gradualmente e são difíceis de controlar com culturas tolerantes ao glifosato, em que estas ervas daninhas aparecem principalmente com (mas não somente com) ervas daninhas de folhas largas difíceis de controlar, tais como as espécies Amaranthus, Chenopodium, Taraxacum e Commelinaceae.
[0004] Em áreas onde ervas daninhas resistentes ao glifosato ou espécies de erva daninha difíceis de controlar estão presentes, cultivadores podem compensar a fraqueza do glifosato pela mistura de tanque ou alternando com outros herbicidas que podem controlar as ervas daninhas perdidas, tais como herbicidas de sulfonilureia. Os herbicidas de sulfonilureia se tornaram o terceiro herbicida mais popular após os herbicidas de organofósforo e acetamida, com vendas anuais globais de mais do que $3 bilhões. A área de aplicação anual de herbicidas de sulfonilureia em nosso país foi mais do que 2 milhões de hectares e ainda mostra uma tendência a expansão.
[0005] Com a emergência de ervas daninhas resistentes ao glifosato e a aplicação crescente de herbicidas de sulfonilureia, há uma necessidade de mais genes capazes de degradação de herbicidas de sulfonilureia e para a introdução dos genes em plantas de interesse que são sensíveis a herbicidas de sulfonilureia de modo a aumentar a tolerância das plantas a herbicidas de sulfonilureia. Sumário da Invenção
[0006] O objetivo da presente invenção é prover uma proteína tolerante a herbicida, um gene que a codifica e uso destes, em que uma proteína tolerante a herbicida é capaz degradar melhor herbicidas de sulfonilureia e produzir as plantas, dentro das quais o gene de codificação da proteína tolerante a herbicida é introduzido, têm maior tolerância a herbicidas de sulfonilureia.
[0007] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção provê uma proteína tolerante a herbicida, compreendendo: (a) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 1, e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 176 e/ou uma substituição de valina na posição 178 da SEQ ID NO: 1; ou (b) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 19, e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 140 e/ou uma substituição de valina na posição 142 da SEQ ID NO: 19; ou (c) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 35, e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 140 e/ou uma substituição de valina na posição 142 da SEQ ID NO: 35; ou (d) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 51, e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 131 e/ou uma substituição de valina na posição 133 da SEQ ID NO: 51; ou (e) uma proteína que é derivada de (a) até (d) pela substituição e/ou deleção e/ou adição de um ou mais aminoácidos nas sequências de aminoácidos de (a) até (d), e possui atividade de tifensulfuron hidrolase.
[0008] Além disso, a dita proteína tolerante a herbicida compreende: (f) uma sequência de aminoácidos de (a), em que a sequência de aminoácidos de (a) também tem uma substituição de arginina na posição 80 e/ou uma substituição de alanina na posição 81 e/ou uma substituição de arginina na posição 182 da SEQ ID NO: 1; ou (g) uma sequência de aminoácidos de (b), em que a sequência de aminoácidos de (b) também tem uma substituição de arginina na posição 44 e/ou uma substituição de alanina na posição 45 e/ou uma substituição de arginina na posição 146 da SEQ ID NO: 19; ou (h) uma sequência de aminoácidos de (c), em que a sequência de aminoácidos de (c) também tem uma substituição de arginina na posição 44 e/ou uma substituição de alanina na posição 45 e/ou uma substituição de arginina na posição 146 da SEQ ID NO: 35; ou
(i) uma sequência de aminoácidos de (d), em que a sequência de aminoácidos de (d) também tem uma substituição de arginina na posição 35 e/ou uma substituição de alanina na posição 36 e/ou uma substituição de arginina na posição 137 da SEQ ID NO: 51; ou (j) uma proteína que é derivada de (a) até (d) pela substituição e/ou deleção e/ou adição de um ou mais aminoácidos nas sequências de aminoácidos de (f) até (i), e possui atividade de tifensulfuron hidrolase.
[0009] Além disso, a proteína tolerante a herbicida compreende: (k) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 15; ou (l) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 31; ou (m) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 47; ou (n) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59 ou SEQ ID NO: 63.
[0010] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção provê ainda um gene tolerante a herbicida, compreendendo: (o) uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína tolerante a herbicida de acordo com (a)-(n); ou (p) uma sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17 ou 18; ou (q) uma sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 33 ou 34; ou (r) uma sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 40, 41, 42, 44, 45, 46, 48, 49 ou 50.
[0011] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção provê ainda um cassete de expressão, em que o cassete de expressão compreende o gene tolerante a herbicida sob a regulamentação de uma sequência reguladora vinculada de modo eficaz.
[0012] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção provê ainda um vetor recombinante contendo o gene tolerante a herbicida ou o cassete de expressão.
[0013] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um método para a produção de uma proteína tolerante a herbicida, compreendendo:  obtenção de uma célula de um organismo hospedeiro transgênico contendo o gene tolerante a herbicida ou o cassete de expressão;  cultivo da célula do organismo hospedeiro transgênico sob condições que permitem a produção de uma proteína tolerante a herbicida; e  recuperação da proteína tolerante a herbicida.
[0014] Além disso, o organismo hospedeiro transgênico compreende plantas, animais, bactérias, leveduras, baculovírus, nematódeos ou algas.
[0015] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção provê ainda um método para o aumento de faixas de tolerância a herbicida, compreendendo coexpressão da proteína tolerante a herbicida ou da proteína tolerante a herbicida codificada pelo cassete de expressão com pelo menos uma segunda proteína que é diferente da proteína tolerante a herbicida ou da proteína tolerante a herbicida codificada pelo cassete de expressão em uma planta.
[0016] Além disso, a segunda proteína é 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase, glifosato oxidorredutase, glifosato-N-acetiltransferase, glifosato descarboxilase, glufosinato acetiltransferase, dioxigenase dependente de α-cetoglutarato, dicamba monooxigenase, 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase, acetolactate sintase, proteínas do tipo citocromo e/ou protoporfirinogênio oxidase.
[0017] A expressão da proteína tolerante a herbicida da presente invenção em uma planta transgênica pode ser acompanhada pela expressão de uma ou mais outras proteínas tolerantes a herbicida (glifosato ou glufosinato). Esta coexpressão de mais do que uma proteína tolerante a herbicida na mesma planta transgênica pode ser alcançada ao deixar a planta compreender e expressar um gene desejado através da engenharia genética. Além disso, uma planta (a primeira planta-mãe) pode expressar a proteína tolerante a herbicida da presente invenção através de manipulação de engenharia genética e uma segunda planta (a segunda planta-mãe) podem expressar proteínas tolerantes a outros herbicidas (glifosato ou glufosinato) através de manipulação de engenharia genética. Plantas descendentes que expressam todos os genes introduzidos dentro da primeira planta-mãe e da segunda planta-mãe são obtidas pela hibridização da primeira planta-mãe com a segunda planta-mãe.
[0018] A fim de atingir o objetivo acima, a presente invenção também provê um método para selecionar células de planta transformadas, caracterizado por compreender: transformação de uma pluralidade de células de planta com o gene tolerante a herbicida ou com o cassete de expressão, e cultivo das células sob uma concentração de herbicida que permite o crescimento das células transformadas que expressam o gene tolerante a herbicida ou o cassete de expressão, enquanto elimina-se as células não transformadas ou inibe-se o crescimento das células não transformadas, em que o herbicida é um herbicida de sulfonilureia.
[0019] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um método para o controle de ervas daninhas, compreendendo a aplicação de uma dose eficaz de um herbicida de sulfonilureia a um campo para o plantio de uma planta-alvo, a planta contendo o gene tolerante a herbicida ou o cassete de expressão.
[0020] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um método para a proteção de uma planta contra danos causados por herbicidas de sulfonilureia, compreendendo a introdução do gene tolerante a herbicida, do cassete de expressão ou do vetor recombinante dentro de uma planta para fazer a planta resultante produzir uma quantidade suficiente de proteínas tolerantes a herbicida para a proteção da planta contra danos causados por herbicidas de sulfonilureia.
[0021] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um método para o controle de ervas daninhas resistentes ao glifosato em um campo para uma planta tolerante ao glifosato, compreendendo a aplicação de dose eficaz de um herbicida de sulfonilureia a um campo para o plantio de uma planta tolerante ao glifosato, a planta tolerante ao glifosato contendo o gene tolerante a herbicida ou o cassete de expressão.
[0022] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um método para conferir tolerância a herbicida de sulfonilureia a uma planta, compreendendo a introdução do gene tolerante a herbicida, do cassete de expressão ou do vetor recombinante dentro da planta.
[0023] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um método para a produção de uma planta tolerante a herbicida de sulfonilureia, compreendendo a introdução do gene tolerante a herbicida, do cassete de expressão ou do vetor recombinante dentro do genoma da planta.
[0024] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um método para o cultivo de uma planta tolerante a herbicida de sulfonilureia, compreendendo:  plantio de pelo menos um propágulo vegetal, cujo genoma contém o gene tolerante a herbicida ou o cassete de expressão;  permissão para que o propágulo vegetal cresça dentro de uma planta;  aplicação de uma dose eficaz de um herbicida de sulfonilureia ao ambiente de crescimento de uma planta compreendendo pelo menos a planta, e colheita da planta que apresenta danos reduzidos e/ou um maior rendimento de planta em comparação com outras plantas que não contêm o gene tolerante a herbicida ou o cassete de expressão.
[0025] Além disso, a planta é uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea.
[0026] Preferivelmente, a planta é milho, soja, Arabidopsis thaliana, algodão, colza, arroz, sorgo, trigo, cevada, milhete, cana-de-açúcar ou aveia.
[0027] Com base na solução técnica acima mencionada, o herbicida de sulfonilureia é tribenuron-metil, sulfometuron-metil, halosulfuron-metil,
pirazosulfuron-etil, tifensulfuron-metil, bensulfuron-metil, metsulfuron-metil, etametsulfuron-metil ou clorimuron-etil.
[0028] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um sistema de plantio para o controle do crescimento de erva daninha, compreendendo um herbicida de sulfonilureia e um ambiente de crescimento da planta no qual pelo menos uma planta-alvo existe, em que a planta contém o gene tolerante a herbicida ou o cassete de expressão.
[0029] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um sistema de plantio para o controle de ervas daninhas resistentes ao glifosato em um campo de uma planta tolerante ao glifosato, compreendendo um herbicida de sulfonilureia, um herbicida de glifosato e um campo para o plantio de pelo menos uma planta tolerante ao glifosato, em que a planta tolerante ao glifosato contém o gene tolerante a herbicida ou o cassete de expressão.
[0030] Além disso, a planta é uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea.
[0031] Preferivelmente, a planta é milho, soja, Arabidopsis thaliana, algodão, colza, arroz, sorgo, trigo, cevada, milhete, cana-de-açúcar ou aveia.
[0032] Com base na solução técnica acima mencionada, o herbicida de sulfonilureia é tribenuron-metil, sulfometuron-metil, halosulfuron-metil, pirazosulfuron-etil, tifensulfuron-metil, bensulfuron-metil, metsulfuron-metil, etametsulfuron-metil ou clorimuron-etil.
[0033] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê o uso de uma proteína tolerante a herbicida para a degradação de herbicidas de sulfonilureia, em que a proteína tolerante a herbicida compreende:
[0034] (1) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 1, e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 176 e/ou uma substituição de valina na posição 178 da SEQ ID NO: 1; ou
[0035] (2) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 19, e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 140 e/ou uma substituição de valina na posição 142 da SEQ ID NO: 19; ou
[0036] (3) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 35, e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 140 e/ou uma substituição de valina na posição 142 da SEQ ID NO: 35; ou
[0037] (4) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 51, e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 131 e/ou uma substituição de valina na posição 133 da SEQ ID NO: 51; ou
[0038] (5) uma proteína que é derivada de (1) até (4) pela substituição e/ou deleção e/ou adição de um ou mais aminoácidos nas sequências de aminoácidos de (1) até (4), e possui atividade de tifensulfuron hidrolase.
[0039] Além disso, a dita proteína tolerante a herbicida compreende:
[0040] (6) uma sequência de aminoácidos de (1), em que a sequência de aminoácidos de (1) tem uma substituição de arginina na posição 80 e/ou uma substituição de alanina na posição 81 e/ou uma substituição de arginina na posição 182 da SEQ ID NO: 1; ou
[0041] (7) uma sequência de aminoácidos de (2), em que a sequência de aminoácidos de (2) tem uma substituição de arginina na posição 44 e/ou uma substituição de alanina na posição 45 e/ou uma substituição de arginina na posição 146 da SEQ ID NO: 19; ou
[0042] (8) uma sequência de aminoácidos de (3), em que a sequência de aminoácidos de (3) tem uma substituição de arginina na posição 44 e/ou uma substituição de alanina na posição 45 e/ou uma substituição de arginina na posição 146 da SEQ ID NO: 35; ou
[0043] (9) uma sequência de aminoácidos de (4), em que a sequência de aminoácidos de (4) tem uma substituição de arginina na posição 35 e/ou uma substituição de alanina na posição 131 e/ou uma substituição de valina na posição 133 da SEQ ID NO: 51; ou
[0044] (10) uma proteína que é derivada de (6) até (9) pela substituição e/ou deleção e/ou adição de um ou mais aminoácidos nas sequências de aminoácidos de (6) até (9), e possui atividade de tifensulfuron hidrolase.
[0045] Além disso, a proteína tolerante a herbicida compreende:
[0046] (11) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 15; ou
[0047] (12) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 31; ou
[0048] (13) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 47; ou
[0049] (14) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59 ou SEQ ID NO: 63.
[0050] Preferivelmente, o herbicida de sulfonilureia é tribenuron-metil, sulfometuron-metil, halosulfuron-metil, pirazosulfuron-etil, tifensulfuron-metil, bensulfuron-metil, metsulfuron-metil, etametsulfuron-metil ou clorimuron-etil.
[0051] O sulfometuron-metil na presente invenção se refere a 2-(4,6-dimetilpirimidin-2-ilcarbamoilaminossulfonil)benzoato de metila como um sólido branco. As formas de dosagem comumente usadas são 10% de pó umectável de sulfometuron-metil e 10% de suspensão de sulfometuron-metil (também conhecida como suspensão seca). As formulações comerciais de sulfometuron-metil incluem, entre outros, Oust e Sencaojing.
[0052] A dose eficaz de sulfometuron-metil de acordo com a presente invenção é 9 a 120 g de ai/ha, incluindo 10-100 g de ai/ha, 15-90 g de ai/ha, 20-80 g de ai/ha, 25-70 g de ai/ha, 30-60 g de ai/ha ou 40-50 g de ai/ha.
[0053] O tribenuron-metil na presente invenção se refere a 2-[N-(4-metóxi-6-metil-1,3,5-triazin-2-il)-N-metilcarbamoilaminossulfonil]benzoat o de metila e como um sólido branco. As formas de dosagem comumente usadas são 10% de pó umectável de tribenuron-metil e 75% de suspensão de tribenuron-metil (também conhecida como suspensão seca). As formulações comerciais de tribenuron-metil incluem, entre outros, GRANSTAR e kuoyejing.
[0054] A dose eficaz de tribenuron-metil de acordo com a presente invenção é 9 a 144 g de ai/ha, incluindo 15-120 g de ai/ha, 30-110 g de ai/ha, 40-100 g de ai/ha, 50-90 g de ai/ha, 60-80 g de ai/ha ou 65-75 g de ai/ha.
[0055] O gene tolerante a herbicida, o cassete de expressão ou o vetor recombinante de acordo com a presente invenção é introduzido dentro de uma planta. A fim de introduzir o DNA exógeno em células de plantas na presente invenção, os métodos de transformação convencionais incluem, entre outros, a transformação mediada por Agrobacterium, bombardeio de microprojéteis, a absorção direta de DNA dentro do protoplasto, eletroporação ou introdução de DNA mediada por lâmina de silício.
[0056] O gene tolerante a herbicida e a subsequente cultura resistente a herbicida de acordo com a presente invenção provêem uma escolha excelente para o controle de espécies de erva daninha de folhas largas resistentes ao glifosato (ou altamente tolerantes e sucessivas) na cultura. Os herbicidas de sulfonilureia têm um amplo espectro e são herbicidas potentes para ervas daninhas de folhas largas e proveriam excelente utilidade para plantadores se a tolerância à cultura mais forte pudesse ser provida em ambos os dicotiledôneos e monocotiledôneo da mesma forma. Uma planta dicotiledônea transgênica com uma tolerância a herbicida de sulfonilureia também tem maiores flexibilidades no tempo e quantidade de aplicação. Outro uso do traço resistente a herbicida de sulfonilureia é que ele pode ser usado para a prevenção de culturas normalmente sensíveis contra o dano causado pela deriva, volatização, conversão (ou outro movimento a uma longa distância), uso indevido, destruição, etc., dos herbicidas de sulfonilureia. O uso do gene tolerante a herbicida de acordo com a presente invenção em uma planta pode prover proteção contra um amplo espectro de herbicidas de sulfonilureia, dessa forma, melhorando a flexibilidade e espectros de ervas daninhas que podem ser controladas, e pode prover proteção contra o dano causado pela deriva de uma faixa total de herbicidas de sulfonilureia comercialmente disponíveis ou causado por outros herbicidas de sulfonilureia a uma longa distância.
[0057] Foi agora identificado que o gene tolerante a herbicida de acordo com a presente invenção tem a característica de deixar o uso de herbicidas de sulfonilureia em plantas após ser geneticamente modificado para a expressão nas plantas, em que a ausência ou falta de tolerância inerente nas plantas não permite o uso destes herbicidas. Além disso, o gene tolerante a herbicida da presente invenção pode prover proteção contra os herbicidas de sulfonilureia em plantas onde a tolerância natural é insuficiente quanto à seletividade. Atualmente, as plantas contendo somente o gene tolerante a herbicida da presente invenção, podem ser tratadas sequencialmente ou misturadas no tanque com um, dois ou uma combinação de vários herbicidas de sulfonilureia. A quantidade de aplicação de cada herbicida de sulfonilureia para o controle de um amplo espectro de ervas daninhas dicotiledôneas varia de 7,5 a 150 g de ai/ha, mais geralmente de 20 a 50 g de ai/ha. O uso dos herbicidas de diferentes categorias químicas e tendo diferentes modos e faixas de ações no mesmo campo em combinação (sequencialmente ou misturados no tanque) pode prover controle para ervas daninhas mais potenciais que precisam ser controladas pelos herbicidas.
[0058] O glifosato é amplamente usado, visto que ele controla um espectro muito amplo de espécies de ervas daninhas de folhas largas e gramíneas. No entanto, a reutilização de glifosato em culturas tolerantes ao glifosato e aplicações não cultura selecionou (e ainda selecionará) fazer as ervas daninhas evoluírem em espécies naturalmente mais tolerantes ou biotipos tolerantes de glifosato. A maioria das estratégias de gerenciamento da tolerância a herbicida sugere o uso de uma quantidade eficaz de parceiros herbicida misturados no tanque como um meio de retardar a emergência de ervas daninhas tolerantes, em que os parceiros herbicida provêem controle das mesmas espécies, mas têm modos de ação diferentes. O empilhamento do gene tolerante a herbicida de acordo com o gene da presente invenção com um traço de tolerância ao glifosato (e/ou outro traço de tolerância a herbicida) pode alcançar o controle de espécies de erva daninha tolerantes ao glifosato (espécies de erva daninha de folhas largas controladas por um ou mais herbicidas de sulfonilureia) em culturas tolerantes ao glifosato permitindo o uso seletivo de glifosato e herbicidas de sulfonilureia na mesma cultura. A aplicação destes herbicidas pode ser realizada pelo uso simultâneo em uma mistura no tanque contendo dois ou mais herbicidas com modos de ação diferentes, ou uso de uma composição herbicida única sozinha em uso contínuo (por exemplo, antes do plantio ou antes ou após a emergência) (com um faixa de intervalo de tempo de uso sendo de 2 horas a 3 meses) ou, alternativamente, pode ser realizada pelo uso de uma combinação de qualquer número de herbicidas representativos de cada categoria de composto aplicável a qualquer momento (de qualquer momento dentro de 7 meses após o plantio de uma cultura até o momento quando a cultura é colhida (ou o intervalo pré-colheita para um único herbicida, com o mais curto sendo tomado)).
[0059] A flexibilidade no controle de ervas daninhas de folhas largas é muito importante, isto é, tempo de aplicação, quantidade de aplicação única de herbicida e capacidades de controlar as ervas daninhas persistentes ou resistentes. A faixa de aplicação de glifosato empilhado com um gene tolerante ao glifosato/o gene tolerante a herbicida da presente invenção em culturas pode ser de 200 a 1600 g de ai/ha; e aquela de (um ou mais) herbicidas de sulfonilureia pode ser de 7,5 a 150 g de ai/ha. A combinação ótima de tempo para estas aplicações depende das condições, espécies e ambientes específicos.
[0060] Uma preparação de herbicida (por exemplo, uma fórmula de éster, ácido ou sal ou concentrado solúvel, concentrado emulsificante ou líquido solúvel) e um aditivo da mistura no tanque (por exemplo, um adjuvante ou compatibilizador) podem afetar significativamente o controle de erva daninha de um dado herbicida ou uma combinação de um ou mais herbicidas. Qualquer combinação química de qualquer um dos herbicidas anteriores está dentro do escopo da presente invenção.
[0061] É bem-conhecido por um técnico no assunto que os benefícios de uma combinação de dois ou mais mecanismos de ação na melhoria do espectro controlado de erva daninha e/ou espécies naturalmente mais tolerantes ou espécies de erva daninha resistentes também podem ser estendidos para a produção artificial (transgênica ou não transgênica) de produtos químicos tolerantes a herbicida, além disso, a culturas tolerantes ao glifosato em culturas. De fato, os traços que codificam as seguintes resistências podem ser empilhados sozinhos ou em múltiplas combinações para prover a capacidade de controlar ou prevenir de modo eficaz que as ervas daninhas desenvolvam tolerância a quaisquer das categorias de herbicidas acima: 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), glifosato oxidorredutase (GOX), glifosato-N-acetiltransferase (GAT), glifosato descarboxilase, glufosinato acetiltransferase (PAT), dioxigenase dependente de α-cetoglutarato (AAD), dicamba monooxigenase (DMO), 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD), acetolactato sintase (ALS), proteínas do tipo citocromo (P450) e/ou protoporfirinogênio oxidase (Protox).
[0062] Além disso, o gene tolerante a herbicida da presente invenção sozinho ou o gene tolerante a herbicida da presente invenção empilhado com outras características de culturas tolerantes a herbicida podem ser empilhados com um ou mais outros traços de entrada (por exemplo, tolerância a insetos, tolerância a fungos ou tolerância a estresse) ou traços de saída (por exemplo, rendimento aumentado, quantidade de óleo melhorada ou qualidade da fibra aumentada). Portanto, a presente invenção pode ser usada para prover as capacidades para controlar flexivelmente e economicamente qualquer número de pragas agrícolas e soluções agrícolas completas para a melhoria das qualidades das culturas.
[0063] O gene tolerante a herbicida da presente invenção pode degradar um herbicida de sulfonilureia e é uma base importante de culturas tolerantes a herbicida e a possibilidade de selecionar recursos de marcador.
[0064] A expressão transgênica pode ser realizada na presente invenção e quase todas as combinações de herbicidas para ervas daninhas de folhas largas podem ser controladas. O gene tolerante a herbicida da presente invenção como um traço excelente de culturas tolerantes a herbicida pode ser empilhado com, por exemplo, outros traços de culturas tolerantes a herbicida (por exemplo, tolerância ao glifosato, tolerância a glufosinato, tolerância a outro inibidor de ALS (por exemplo, imidazolinonas e triazolopirimidinil sulfonamidas), tolerância a bromoxinila, tolerância ao inibidor de HPPD, tolerância ao inibidor de PPO e os similares) e traços de tolerância a inseto (Cry1Ab, Cry1F, Vip3, outras proteínas de Bacillus thuringiensis ou proteínas tolerantes a insetos derivadas de espécies bacterianas não bacilo, etc.). Além disso, o gene tolerante a herbicida da presente invenção pode ser usado como um marcador seletivo para a seleção assistente de transformantes primários de plantas geneticamente modificadas com outro gene ou grupo de genes.
[0065] Os traços de culturas tolerantes a herbicida da presente invenção podem ser usados em uma nova combinação com outros traços (incluindo, entre outros, tolerância ao glifosato) de culturas tolerantes a herbicida. Um novo método para o controle das espécies de erva daninha pode ser produzido pela combinação destes traços devido à tolerância recentemente obtida ou tolerância inerente a um herbicida (por exemplo, glifosato). Portanto, exceto pelos traços de culturas tolerantes a herbicida, o escopo da presente invenção inclui o novo método para o controle de ervas daninhas com herbicidas, em que a tolerância aos herbicidas pode ser produzida pela enzima nas culturas transgênicas.
[0066] A presente invenção pode ser aplicada a vários tipos de plantas e a planta dicotiledônea inclui, entre outros, alfafa, feijão, couve-flor, couve, cenoura, aipo, algodão, pepino, berinjela, alface, melão, ervilha, pimentão, abobrinha, rabanete, colza, espinafre, soja, abóboras, tomates, Arabidopsis thaliana ou melancias; preferivelmente, a planta dicotiledônea se refere a sojas, Arabidopsis thaliana, tabaco, algodão ou colza. A planta monocotiledônea inclui, entre outros, milho, arroz, sorgo, trigo, cevada, centeio, milhete, cana-de-açúcar, aveia ou grama; preferivelmente, a planta monocotiledônea se refere a milho, arroz, sorgo, trigo, cevada, milhete, cana-de-açúcar ou aveia. O gene tolerante a herbicida de acordo com a presente invenção pode ser usado mais positivamente em culturas gramíneas com tolerância moderada e, assim, a tolerância melhorada obtida por tais traços pode fornecer aos plantadores a possibilidade de usar estes herbicidas com uma quantidade de aplicação mais eficaz e um tempo de aplicação mais amplo sem riscos de dano à cultura.
[0067] O sistema de plantio na presente invenção se refere a uma combinação de uma planta e qualquer tolerância a herbicida destes e/ou um tratamento herbicida disponível em diferentes estágios de desenvolvimento da planta, assim, produzindo plantas com altos rendimentos e/ou dano reduzido.
[0068] Na presente invenção, as ervas daninhas se referem a plantas que competem com as plantas-alvo cultivadas no ambiente de crescimento da planta.
[0069] O termo “controle” e/ou “prevenção” na presente invenção se refere a pelo menos uma aplicação direta (por exemplo, por pulverização) de uma dose eficaz de um herbicida de sulfonilureia ao ambiente de crescimento da planta, de modo a minimizar o desenvolvimento da erva daninha e/ou impedir o crescimento das ervas daninhas. Ao mesmo tempo, as plantas-alvo cultivadas devem ser morfologicamente normais e podem ser cultivadas sob métodos convencionais para o consumo e/ou produção do produto; e preferivelmente comparadas a plantas do tipo selvagem não transgênicas, as plantas cultivadas reduziram o dano às plantas e/ou um rendimento de plantas aumentado. Os desempenhos específicos do dano reduzido às plantas incluem, entre outros, uma resistência melhorada do caule e/ou um peso aumento do grão. O efeito do “controle” e/ou “prevenção” da proteína tolerante a herbicida da presente invenção sobre ervas daninhas pode existir independentemente e não será diminuído e/ou perdido devido à presença de outras substâncias que podem “controlar” e/ou “prevenir” as ervas daninhas. Especificamente, se qualquer tecido de uma planta transgênica (contendo o gene tolerante a herbicida da presente invenção) tiver e/ou produzir a proteína tolerante a herbicida da presente invenção e/ou outra substância que possa controlar ervas daninhas simultaneamente e/ou separadamente, então a presença da outra substância não afetará o efeito do “controle” e/ou “prevenção” da proteína tolerante a herbicida da presente invenção sobre as ervas daninhas, nem resultará no fato de que o efeito do “controle” e/ou “prevenção” é alcançado completamente e/ou parcialmente pela outra substância e não tem nada a ver com a proteína tolerante a herbicida da presente invenção.
[0070] O genoma de uma planta, tecido de planta ou célula de planta na presente invenção se refere a qualquer material genético dentro da planta, tecido de planta ou célula de planta, e inclui genoma nuclear celular, de plastídeo e mitocondrial.
[0071] O termo “propágulo vegetal” na presente invenção inclui, entre outros, propágulos sexuais da planta e propágulos vegetativos da planta. Os propágulos sexuais da planta incluem, entre outros, sementes de planta; e os propágulos vegetativos da planta se referem a órgãos vegetativos ou um tecido específico de uma planta, que pode gerar uma nova planta sob condições ex vivo. Os órgãos vegetativos ou o tecido específico incluem, entre outros, raízes, caules e folhas; por exemplo, plantas com raízes como os propágulos vegetativos incluem morangos, batata doce e similares; plantas com caules como os propágulos vegetativos incluem cana-de-açúcar, batatas (tubérculos) e similares; e plantas com folhas como os propágulos vegetativos incluem aloe, begônias e similares.
[0072] A “resistência” na presente invenção é hereditária e permite que uma planta cresça e se propague no caso onde um tratamento eficaz por um herbicida geral é realizado em uma dada planta. Como reconhecido por um técnico no assunto, mesmo se um certo grau de dano de uma planta tratada com um herbicida for aparente, a planta pode ser ainda considerada “resistente”. O termo “tolerância” na presente invenção é mais extensivo do que o termo “resistência” e inclui “resistência” e uma capacidade melhorada de uma planta particular de resistir a vários graus de dano induzidos por um herbicida e, geralmente, danos a uma planta do tipo selvagem com o mesmo genótipo podem ser causados na mesma dose do herbicida.
[0073] O polinucleotídeo e/ou nucleotídeo na presente invenção formam um “gene” completo, que codifica uma proteína ou um polipeptídeo em uma célula hospedeira desejada. Um técnico no assunto apreciará prontamente que o polinucleotídeo e/ou nucleotídeo na presente invenção pode ser colocado sob o controle de uma sequência reguladora em um hospedeiro de interesse.
[0074] Como é bem-conhecido por um técnico no assunto, DNA está tipicamente presente em uma forma de filamento duplo. Nesta disposição, um filamento é complementar com o outro e vice-versa. O filamento complementar adicional de DNA é produzido à medida que o DNA é replicado em uma planta. Como tal, a presente invenção inclui o uso dos polinucleotídeos como exemplificado na listagem de sequências e filamentos complementares destes. O termo “filamento de codificação” comumente usado na técnica se refere a um filamento ligado a um filamento sentissenso. A fim de expressar uma proteína in vivo, um filamento de DNA é tipicamente transcrito para um filamento complementar de RNAm, que atua como um modelo para a tradução da proteína. De fato, o RNAm é transcrito do filamento “antissenso” de DNA. O filamento de “senso” ou “codificação” tem uma série de códons (um códon é composto por três nucleotídeos e um aminoácido específico pode ser produzido pela leitura dos três códons de uma vez), que pode ser lida como um quadro de leitura aberto (ORF) para formar uma proteína ou peptídeo de interesse. A presente invenção também inclui RNA tendo uma função equivalente para o DNA exemplar.
[0075] A molécula de ácido nucleico ou um fragmento destes na presente invenção hibridiza com o gene tolerante a herbicida da presente invenção sob condições rigorosas. Qualquer método de hibridização ou amplificação de ácido nucléico convencional pode ser usado para identificar a presença do gene tolerante a herbicida da presente invenção. Uma molécula de ácido nucleico ou um fragmento destes é capaz de especificamente hibridizar com outras moléculas de ácido nucleico sob determinadas circunstâncias. Na presente invenção, se duas moléculas de ácido nucleico puderem formar uma estrutura de ácido nucléico de filamento duplo antiparalela, então, pode-se considerar que estas duas moléculas de ácido nucleico podem ser especificamente hibridizadas uma com a outra. Se duas moléculas de ácido nucleico exibirem uma complementaridade completa, então, diz-se que uma molécula de ácido nucleico das duas é o “complemento” da outra molécula de ácido nucleico. Na presente invenção, quando cada nucleotídeo de uma molécula de ácido nucleico é complementar ao nucleotídeo correspondente de outra molécula de ácido nucleico, então, diz-se que estas duas moléculas de ácido nucleico exibem uma “complementaridade completa”. Se duas moléculas de ácido nucleico puderem ser hibridizadas uma com a outra com uma estabilidade suficiente tal que elas sejam aneladas e ligadas uma à outra pelo menos sob condições convencionais de “baixo rigor”, então, diz-se que estas duas moléculas de ácido nucleico são “minimamente complementares”. Similarmente, se duas moléculas de ácido nucleico puderem ser hibridizadas uma com a outra com uma estabilidade suficiente tal que elas são aneladas e ligadas uma a outra sob condições convencionais de “alto rigor”, então, diz-se que estas duas moléculas de ácido nucleico são “complementares”. O desvio de uma complementaridade completa é permissível, desde que este desvio não impeça completamente duas moléculas de formarem uma estrutura de filamento duplo. A fim de permitir que uma molécula de ácido nucleico atue como um iniciador ou sonda, assegurar que a molécula de ácido nucleico tenha uma complementaridade suficiente em sua sequência para permitir que uma estrutura de filamento duplo estável seja formada no caso do solvente particular e concentração de sal usada.
[0076] Na presente invenção, uma sequência substancialmente homóloga é uma molécula de ácido nucleico, em que a molécula de ácido nucleico pode ser especificamente hibridizada com o filamento complementar de uma molécula de ácido nucleico correspondente sob condições de alto rigor. As condições rigorosas adequadas que promovem a hibridização de DNA são bem-conhecidas por um técnico no assunto; por exemplo, as condições rigorosas adequadas podem ser alcançadas pelo tratamento com 6,0 x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) sob condições de aproximadamente 45 °C, e então lavagem com 2,0 x SSC sob condições de 50 °C. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada da condição de baixo rigor de cerca de 2,0 x SSC e 50 °C até a condição de alto rigor de cerca de 0,2 x SSC e 50 °C. Além disso, a condição da temperatura na etapa de lavagem pode crescer da condição de baixo rigor de temperatura ambiente (cerca de 22 °C) até a condição de alto rigor de cerca de 65 °C. A condição da temperatura e a concentração de sal podem ambos variar, e também é possível que uma das duas permaneça inalterada, enquanto a outra variável varia. Preferivelmente, as condições rigorosas na presente invenção podem ser alcançadas ao hibridizar especificamente uma sequência com o gene tolerante a herbicida na presente invenção em uma solução 6 x SSC, 0,5% de SDS a 65 °C e então lavagem da membrana uma vez com 2 x SSC, 0,1% de SDS e uma vez com 1 x SSC, 0,1% de SDS.
[0077] Consequentemente, as sequências que têm a atividade tolerante a herbicida e são hibridizadas com o gene tolerante a herbicida da presente invenção sob condições rigorosas são incluídas na presente invenção. Estas sequências são pelo menos aproximadamente 40%-50% homólogas ou, aproximadamente, 60%, 65% ou 70% homólogas ou mesmo pelo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais à sequência da presente invenção.
[0078] A presente invenção provê uma proteína funcional. Na presente invenção, o termo “atividade funcional” (ou “atividade”) significa que a proteína/enzima usada na presente invenção (sozinha ou em combinação com outras proteínas) tem a capacidade de degradar um herbicida de sulfonilureia ou diminuir a atividade de um herbicida de sulfonilureia. Uma planta que produz a proteína tolerante a herbicida da presente invenção preferivelmente produz um “quantidade eficaz” da proteína, de modo que quando a planta é tratada com um herbicida, o nível de expressão da proteína é suficiente para conferir a uma planta uma resistência ou tolerância ao herbicida de sulfonilureia completa ou parcial (a menos que especificado o contrário, em uma quantidade geral). O herbicida pode ser usado em uma quantidade que usualmente mataria uma planta-alvo ou em uma quantidade e concentração de campo normal. Preferivelmente, a célula de planta e a planta da presente invenção são protegidas contra a inibição do crescimento ou dano causado pelo tratamento com o herbicida. A planta e célula de planta transformadas da presente invenção têm preferivelmente tolerância ou resistência a herbicidas de sulfonilureia; ou seja, a planta e célula de planta transformadas podem crescer na presença de uma quantidade eficaz de herbicidas de sulfonilureia.
[0079] O gene e a proteína na presente invenção não somente compreendem uma sequência exemplar específica, mas também compreendem uma porção e/ou um fragmento (incluindo uma deleção interna e/ou deleção terminal comparado à proteína de comprimento total), uma variante, um mutante, um substituto (uma proteína tendo aminoácidos substituídos), uma quimera e uma proteína de fusão, que retêm a atividade de tolerância a herbicida característica da proteína exemplar específica. O termo “variante” ou “variação” se refere a uma sequência de nucleotídeos que codifica a mesma proteína ou codifica uma proteína equivalente tendo uma atividade de resistência a herbicida. O termo “proteína equivalente” se refere a uma proteína tendo a mesma ou substancialmente a mesma bioatividade de tolerância a herbicida como a proteína reivindicada.
[0080] O termo “fragmento” ou “truncamento” de uma molécula de DNA ou sequência de proteína na presente invenção se refere a uma porção do DNA original ou sequência de proteína (nucleotídeos ou aminoácidos) ou uma forma modificada artificialmente destes (por exemplo, uma sequência adequada para a expressão da planta), em que o comprimento das sequências anteriores pode variar, mas o comprimento é suficiente para assegurar que a proteína (codificada) seja uma proteína tolerante a herbicida.
[0081] Devido à degeneração do códon genético, uma variedade de sequências de DNA diferentes pode codificar a mesma sequência de aminoácido. Está dentro da habilidade de um técnico no assunto produzir estas sequências de DNA alternativas que codificam a mesma ou substancialmente a mesma proteína. Estas sequências de DNA diferentes são incluídas no escopo da presente invenção. O termo “substancialmente a mesma” sequência mencionada acima se refere a uma sequência com uma substituição, deleção, adição ou inserção de aminoácido que não afeta substantivamente a atividade de tolerância a herbicida e inclui um fragmento retendo a atividade de tolerância a herbicida.
[0082] A substituição, deleção ou adição de uma sequência de aminoácidos na presente invenção é uma técnica convencional na técnica. Preferivelmente, esta mudança de aminoácido é uma pequena mudança de característica, ou seja, uma substituição de aminoácido conservativa que não afeta significativamente a dobra e/ou atividade de uma proteína; uma pequena deleção, tipicamente, uma deleção de cerca de 1-30 aminoácidos; uma pequena extensão amino ou carboxila terminal, por exemplo, um resíduo de metionina que se estende no término amino; ou um pequeno peptídeo ligante, por exemplo, cerca de 20-25 resíduos em comprimento.
[0083] Exemplos de substituições conservativas são substituições que ocorrem dentro dos grupos aminoácido a seguir: aminoácidos básicos (por exemplo, arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (por exemplo, ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (por exemplo, glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (por exemplo, leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (por exemplo, fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidos de moléculas pequenas (por exemplo, glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Aquelas substituições de aminoácido que geralmente não alteram a atividade específica são bem-conhecidas na técnica e foram descritas por, por exemplo, N. Neurath e R. L. Hill em Protein, publicado por Academic Press em New York em 1979. As substituições mais comuns são Ala/Ser, Val/Ile,
Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly, assim como as substituições reversas destes.
[0084] Como será aparente a um técnico no assunto, esta substituição pode ocorrer fora da região que é importante para funções moleculares e ainda produz um polipeptídeo ativo. Os resíduos de aminoácido que são essenciais para a atividade do polipeptídeo da presente invenção e são, assim, escolhidos não para serem substituídos podem ser identificados de acordo com métodos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura de alanina (vide, por exemplo, Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). A última técnica é introduzir uma mutação em cada resíduo carregado positivamente em uma molécula e detectar a atividade de resistência a herbicida da molécula mutante resultante para determinar os resíduos de aminoácido que são importantes para a atividade molecular. Os locais de interação substrato-enzima também podem ser determinados pela análise da estrutura tridimensional destes, em que esta estrutura tridimensional pode ser determinada por análise de ressonância magnética nuclear, cristalografia, rotulagem de fotoafinidade e outras técnicas (vide, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; e Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).
[0085] A sequência reguladora na presente invenção inclui, entre outros, um promotor, um peptídeo de trânsito, um terminador, um intensificador, uma sequência líder, um íntron e outras sequências reguladoras ligadas operavelmente ao gene tolerante a herbicida da presente invenção.
[0086] O promotor é um promotor expressível de plantas. O termo “promotor expressível de plantas” se refere a um promotor que assegura a expressão da sequência de codificação ligada ao mesmo em uma célula de planta. O promotor expressível de plantas pode ser um promotor constitutivo. Exemplos dos promotores que direcionam a expressão constitutiva em plantas incluem, entre outros, um promotor 35S derivado de um vírus do mosaico de couve-flor,
promotores de milho Ubi, promotores do gene GOS2 de arroz e os similares. Alternativamente, o promotor expressível de plantas pode ser um promotor específico de tecido; isto é, o promotor direciona a expressão de uma sequência de codificação em vários tecidos, tais como tecidos verdes, em um nível maior do que em outros tecidos da planta (que podem ser medidos através de ensaios de RNA convencionais), tais como um promotor de PEP carboxilase. Alternativamente, o promotor expressível de plantas pode ser um promotor induzível por ferida. O promotor induzível por ferida ou um promotor que direciona um padrão de expressão induzida por ferida significa que quando uma planta sofre de uma ferida causada por um fator mecânico ou o roer de insetos, a expressão da sequência de codificação sob a regulação do promotor é significativamente melhorada em comparação com as condições normais de crescimento. Exemplos do promotor induzível por feridas incluem, entre outros, promotores de genes inibidores de protease de batata e tomate (pin I e pin II) e um gene inibidor de protease de milho (MPI).
[0087] O peptídeo de trânsito (também conhecido como sequência sinal de secreção ou sequência de direcionamento) direciona um produto transgênico a um compartimento de organela ou célula específica. Para uma proteína receptora, o peptídeo de trânsito pode ser heterólogo, por exemplo, direcionamento do cloroplasto usando uma sequência que codifica o peptídeo de trânsito de cloroplasto ou direcionamento do retículo endoplasmático usando uma sequência de retenção ‘KDEL' ou direcionamento do vacúolo usando CTPP de um gene de fitolectina de cevada.
[0088] A sequência líder inclui, entre outros, um sequência líder de pequeno vírus de RNA, tal como uma sequência líder EMCV (uma região de não codificação 5' de vírus da encefalomiocardite); uma sequência líder do grupo Y do vírus da batata, tal como uma sequência líder MDMV (vírus do mosaico anão do milho); proteína de ligação à cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP); uma sequência líder não traduzida da RNAm da proteína de revestimento do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA4); e uma sequência líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV).
[0089] O intensificador inclui, entre outros, um intensificador de vírus do mosaico de couve-flor (CaMV), intensificador de vírus do mosaico da escrofulária (FMV), intensificador de vírus do anel de cravo gravado (CERV), intensificador de vírus do mosaico da veia da mandioca (CsVMV), intensificador de vírus do mosaico mirabilis (MMV), intensificador de vírus do enrolamento das folhas amarelas cestrum (CmILCV), intensificador de vírus Multan do enrolamento das folhas de algodão (CLCuMV), intensificador de vírus commelina do mosqueado amarelo (CoYMV) e intensificador de vírus da faixa clorótica de amendoim (PCLSV).
[0090] Para o uso em uma planta monocotiledônea, o íntron inclui, entre outros, um íntron hsp70 de milho, íntron de ubiquitina de milho, íntron 1 Adh, íntron de sacarose sintase ou íntron Actl de arroz. Para o uso em uma planta dicotiledônea, o íntron inclui, entre outros, um íntron CAT-1, íntron pKANNIBAL, íntron PIV2 e íntron “superubiquitina”.
[0091] O terminador pode ser uma sequência sinal de poliadenilação adequada que funciona em uma planta, incluindo, entre outros, uma sequência sinal de poliadenilação derivada do gene de nopalina sintetase (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, uma sequência sinal de poliadenilação derivada do gene inibidor de protease II (pinII), uma sequência sinal de poliadenilação derivada do gene ssRUBISCO E9 da ervilha e uma sequência sinal de poliadenilação derivada do gene de α-tubulina.
[0092] A “ligação eficaz” na presente invenção indica a ligação de sequências de ácido nucleico, em que a ligação permite que uma sequência forneça uma função exigida para a sequência ligada a ela. A “ligação eficaz” na presente invenção pode ser alcançada pela ligação de um promotor a uma sequência de interesse, de modo que a transcrição da sequência de interesse é controlada e regulada pelo promotor. Quando uma sequência de interesse codifica uma proteína e a expressão da proteína é desejada, “ligação eficaz” significa que um promotor é ligado à sequência de tal maneira que o transcrito resultante seja eficientemente traduzido. Se a ligação de um promotor a uma sequência de codificação for uma fusão de transcrito e expressão da proteína codificada for destinada a ser alcançada, tal ligação é criada que o primeiro códon de iniciação de tradução no transcrito resultante é o códon de iniciação na sequência de codificação. Alternativamente, se a ligação de um promotor a uma sequência de codificação for uma fusão de tradução e a expressão da proteína codificada for destinada a ser alcançada, tal ligação é criada que o primeiro códon de iniciação de tradução contido na sequência não traduzida 5’ é ligado ao promotor de tal maneira que a relação do produto de tradução resultante com o quadro de leitura aberto de tradução que codifica a proteína desejada é in-frame. Sequências de ácido nucleico que podem ser “ligadas eficazmente” incluem, entre outros: sequências que provêem funções de expressão de gene (isto é, elementos de expressão de gene, tais como promotores, regiões não traduzidas 5’, íntrons, regiões de codificação de proteína, regiões não traduzidas 3’, locais de poliadenilação e/ou terminadores de transcrição), sequências que proveem funções de transferência e/ou integração de DNA (isto é, sequências limite de T-DNA, locais de reconhecimento de recombinase específicos do local e locais de reconhecimento de integrase), sequências que provêem funções seletivas (isto é, marcadores de resistência a antibiótico e genes de biossíntese), sequências que provêem funções de pontuação do marcador, sequências que auxiliam na manipulação in vitro ou in vivo da sequência (isto é, sequências poliligantes e sequências de recombinação específicas do local) e sequências que provêem funções de replicação (isto é, origens bacterianas de replicação, sequências de replicação autônoma e sequências centroméricas).
[0093] A presente invenção pode conferir um novo traço de resistência a herbicida a uma planta e nenhum efeito adverso sobre fenótipos (incluindo rendimentos) é observado. A planta na presente invenção pode tolerar, por exemplo, 2x, 3x, 4x ou 8x o nível de aplicação geral de pelo menos um herbicida testado. A melhoria destes níveis de tolerância está dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, a otimização previsível e desenvolvimento adicional podem ser realizados em várias técnicas conhecidas na técnica para aumentar a expressão de um dado gene.
[0094] A proteína tolerante a herbicida da presente invenção pode ser uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 176 e/ou uma substituição de valina na posição 178 da SEQ ID NO: 1, com um exemplo mostrado na SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 15 na listagem de sequências. O gene tolerante a herbicida da presente invenção pode ser um gene de codificação da proteína tolerante a herbicida acima mencionada, com exemplos mostrados na SEQ ID NOs: 8-10, SEQ ID NOs: 12-14 e SEQ ID NOs: 16-18 na listagem de sequências.
[0095] A proteína tolerante a herbicida da presente invenção pode ser uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 19 e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 140 e/ou uma substituição de valina na posição 142 da SEQ ID NO: 19, com um exemplo mostrado na SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 31 na listagem de sequências. O gene tolerante a herbicida da presente invenção pode ser um gene de codificação da proteína tolerante a herbicida acima mencionada, com exemplos mostrados na SEQ ID NOs: 24-26, SEQ ID NOs: 28-30 e SEQ ID NOs: 32-34 na listagem de sequências.
[0096] A proteína tolerante a herbicida da presente invenção pode ser uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 35 e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 140 e/ou uma substituição de valina na posição 142 da SEQ ID NO: 35, com um exemplo mostrado na SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 47 na listagem de sequências. O gene tolerante a herbicida da presente invenção pode ser um gene de codificação da proteína tolerante a herbicida acima mencionada, com exemplos mostrados na SEQ ID NOs: 40-42, SEQ ID NOs: 44-46 e SEQ ID NOs: 48-50 na listagem de sequências.
[0097] A proteína tolerante a herbicida da presente invenção pode ser uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 51 e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 131 e/ou uma substituição de valina na posição 133 da SEQ ID NO: 51, com um exemplo mostrado na SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59 ou SEQ ID NO: 63 na listagem de sequências. O gene tolerante a herbicida da presente invenção pode ser um gene de codificação da proteína tolerante a herbicida acima mencionada, com exemplos mostrados na SEQ ID NOs: 56-58, SEQ ID NOs: 60-62 e SEQ ID NOs: 64-66 na listagem de sequências.
[0098] O gene tolerante a herbicida da presente invenção pode ser usado em plantas; e ele pode conter, além de uma região de codificação do gene tolerante a herbicida da presente invenção, outros elementos tais como uma região de codificação que codifica um peptídeo de trânsito, e uma região de codificação que codifica uma proteína marcadora seletiva ou uma proteína que confere resistência a insetos.
[0099] A proteína tolerante a herbicida da presente invenção tem tolerância à maioria dos herbicidas de sulfonilureia. A planta na presente invenção contém um DNA exógeno em seu genoma, em que o DNA exógeno compreende o gene tolerante a herbicida da presente invenção, e a planta é protegida contra a ameaça de um herbicida de sulfonilureia pela expressão de uma quantidade eficaz da proteína. A quantidade eficaz se refere a uma dose que causa nenhum ou menor dano. Ao mesmo tempo, a planta deve ser morfologicamente normal e pode ser cultivada sob métodos convencionais para o consumo e/ou produção do produto.
[0100] O nível de expressão da proteína tolerante a herbicida em um material da planta pode ser detectado por uma variedade de métodos descritos na técnica, por exemplo, pela quantificação do RNAm que codifica a proteína tolerante a herbicida produzida em um tecido pelo emprego de iniciadores específicos ou, especificamente, detecção da quantidade da proteína tolerante a herbicida produzida diretamente.
[0101] A presente invenção provê uma proteína tolerante a herbicida, um gene de codificação destes e um uso destes, tendo as seguintes vantagens:
[0102] 1. A proteína tolerante a herbicida da presente invenção tem uma forte tolerância a herbicidas de sulfonilureia e pode tolerar concentração de campo oito vezes maior de tribenuron-metil.
[0103] 2. A proteína tolerante a herbicida da presente invenção possui uma ampla gama de aplicações em plantas.
[0104] A solução técnica da presente invenção é descrita ainda em detalhes através das figuras e exemplos abaixo. Breve Descrição das Figuras
[0105] A Figura 1 é um fluxograma de construção de um vetor de clonagem recombinante DBN01-T contendo uma sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 para a proteína tolerante a herbicida, o gene de codificação destes e um uso destes na presente invenção;
[0106] A Figura 2 é um fluxograma de construção de um vetor de expressão recombinante DBN100825 contendo uma sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 para a proteína tolerante a herbicida, o gene de codificação destes e um uso destes na presente invenção;
[0107] A Figura 3 é um diagrama estrutural esquemático de um vetor de expressão recombinante de controle DBN100828N para a proteína tolerante a herbicida, o gene de codificação destes e um uso destes na presente invenção;
[0108] A Figura 4 é um diagrama que mostra a tolerância de uma planta T1 de soja transgênica a ácido benzenossulfônico para a proteína tolerante a herbicida, o gene de codificação destes e um uso destes na presente invenção; A: planta de soja transgênica ALT02-01; B: planta de soja transgênica ALT02M1-01; C: planta de soja transgênica ALT02M2-01; D: planta de soja transgênica ALT02M3-01; E: planta de soja de controle; F: planta de soja do tipo selvagem;
[0109] A Figura 5 é um fluxograma de construção de um vetor de clonagem recombinante DBN02-T contendo uma sequência de nucleotídeos ALT02M1-02 para a proteína tolerante a herbicida, o gene de codificação destes e um uso destes na presente invenção;
[0110] A Figura 6 é um fluxograma de construção de um vetor de expressão recombinante DBN100833 contendo uma sequência de nucleotídeos ALT02M1-02 para a proteína tolerante a herbicida, o gene de codificação destes e um uso destes na presente invenção;
[0111] A Figura 7 é um diagrama estrutural esquemático de um vetor de expressão recombinante de controle DBN100830N para a proteína tolerante a herbicida, o gene de codificação destes e um uso destes na presente invenção e;
[0112] A Figura 8 é um diagrama que mostra a tolerância de uma planta T1 de milho transgênica a ácido benzenossulfônico para a proteína tolerante a herbicida, o gene de codificação destes e um uso destes na presente invenção; A: planta de milho transgênica ALT02-02; B: planta de milho transgênica ALT02M1-02; C: planta de milho transgênica ALT02M2-02; D: planta de milho transgênica ALT02M3-02; E: planta de milho de controle; F: planta de milho do tipo selvagem. Exemplos
[0113] As soluções técnicas da proteína tolerante a herbicida, o gene de codificação destes e uso destes na presente invenção são ainda descritos através de exemplos específicos abaixo.
Exemplo 1. Mutação e triagem do gene ALT1.
1. Síntese do gene ALT
[0114] A sequência de nucleotídeos (1197 nucleotídeos) do gene ALT01 como mostrado na SEQ ID NO: 2 na listagem de sequência foi sintetizada, que codifica a proteína ALT01 (398 aminoácidos) como mostrado na SEQ ID NO: 1 na listagem de sequências. A sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 2) do gene ALT01 sintético foi ligada com um local da enzima de restrição SpeI na extremidade 5’ e um local da enzima de restrição KasI na extremidade 3’. A sequência de nucleotídeos ALT01-01 como mostrado na SEQ ID NO: 3 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à ALT01 foi obtida com base no viés de uso do códon de soja; e a sequência de nucleotídeos ALT01-02 como mostrado na SEQ ID NO: 4 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT01 foi obtida com base no viés de uso do códon de milho.
2. Construção de uma biblioteca de mutantes do gene ALT01.
[0115] O gene ALT01 sintético acima foi amplificado por PCR e então foi clonado no vetor pGEM-T de acordo com o procedimento operacional nas instruções do vetor pGEM-T do produto (Promega, Madison, USA, CAT: A3600) de Promega Corporation. Então, o produto ligado acima foi introduzido em DH5α de Escherichia coli como um modelo para realizar PCR propensa a erros usando iniciador 1 e iniciador 2, de modo que o gene ALT01 foi mutado devido a incompatibilidade de base aleatória. Os iniciadores e o sistema de reação PCR propensa a erros foram como a seguir:
[0116] iniciador 1: ATGGAAACCGATAAAAAAACCG, como mostrado na SEQ ID NO: 5 na listagem de sequências;
[0117] iniciador 2: TCAGCTTTCGTTCTGATCTAAG, como mostrado na SEQ ID NO: 6 na listagem de sequência;
[0118] Sistema de reação de PCR propensa a erros (volume total: 50 μL): 2 x Sistema Aleatório StarMut 25 μL Modelo de DNA do plasmídeo 1 μL Iniciador 1 1 μL Iniciador 2 1 μL Intensificador StarMut 0-20 μL Água (ddH2O) adicionado até 50 μL
[0119] O modelo de DNA do plasmídeo tendo uma concentração de 1-10 ng/μL, o iniciador 1 tendo uma concentração de 10 μM e o iniciador 2 tendo uma concentração de 10 μM foram armazenados a 4 °C em um tubo âmbar.
[0120] Condições de reação PCR propensa a erros: Etapa temperatura tempo 11 95 °C 2 min 12 94 °C 30 s 13 55 °C 1 min 14 72 °C 1,5 min 15 de volta à etapa 12, 30 ciclos 16 72 °C 10 min
[0121] O produto de PCR propensa a erros acima foi transformado em DH10B ilvG+ de Escherichia coli sensível a tribenuron-metil por choque térmico a 42 °C para construir uma biblioteca de mutantes aleatórios do gene ALT01.
3. Triagem de uma biblioteca de mutantes de gene ALT01
[0122] O produto transformado na biblioteca de mutantes acima foi inoculado sobre um meio de triagem (glicose 5 g/L, ampicilina 100 mg/L, valina 200 mg/L, leucina 200 mg/L, (NH4)2SO4 2 g/L, MgSO4·7H2O 200 mg/L, CaCl2·2H2O 10 mg/L, FeSO4·7H2O 1 mg/L, Na2HPO4·12H2O 1,5 g/L e KH2PO4 1,5 g/L) contendo tribenuron-metil em uma concentração de 200 mg/L e foi cultivado em uma temperatura de 37 °C por 24 horas.
[0123] Tendo em vista a capacidade de um gene de resistência de transformar tribenuron-metil em ácido benzenossulfônico que é não tóxico para bactérias, a biblioteca de mutantes acima foi submetida à triagem de alto rendimento usando o princípio e DH10B ilvG+ de Escherichia coli, que ainda é capaz de crescer no meio de triagem contendo tribenuron-metil em uma concentração de 200 mg/L, foi isolada para obter um gene de resistência.
4. Aquisição de genes de resistência a mutantes
[0124] Os resultados de sequenciamento mostraram aquisição de três genes de resistência a mutantes de ALT01, que foram nomeados genes ALT01M1, ALT01M2 e ALT01M3, respectivamente. A sequência de nucleotídeos de ALT01M1 foi mutada na posição 527 de G a C, resultando em mutação de glicina em alanina na posição 176 da sequência de aminoácidos de ALT01M1; a sequência de nucleotídeos de ALT01M2 foi mutada nas posições 532 e 533 de TC a GT, resultando em mutação de serina em valina na posição 178 da sequência de aminoácidos de ALT01M2; a sequência de nucleotídeos de ALT01M3 foi mutada nas posições 239 a 242 de CATA a GAGC, e nas posições 527 a 544 de GAAACTCCAGTAAAGAAG a CAAACGTCAGTAAAGAAA, resultando em mutação de prolina e tirosina em arginina e alanina nas posições 80 a 81 e mutação de glicina, serina e glicina em alanina, valina e arginina nas posições 176, 178 e 182 da sequência de aminoácidos de ALT01M3.
[0125] A sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT01M1 é mostrada na SEQ ID NO: 7 na listagem de sequências, e a sequência de nucleotídeos ALT01M1 que codifica a sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT01M1 é mostrada na SEQ ID NO: 8 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos ALT01M1-01 como mostrado na SEQ ID NO: 9 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT01M1 foi obtida com base no viés de uso do códon de soja; a sequência de nucleotídeos ALT01M1-02 como mostrado na SEQ ID NO: 10 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT01M1 foi obtida com base no viés de uso do códon de milho.
[0126] A sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT01M2 é mostrada na SEQ ID NO: 11 na listagem de sequências, e a sequência de nucleotídeos ALT01M2 que codifica a sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT01M2 é mostrada na SEQ ID NO: 12 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos ALT01M2-01 como mostrado na SEQ ID NO: 13 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT01M2 foi obtida com base no viés de uso do códon de soja; a sequência de nucleotídeos ALT01M2-02 como mostrado na SEQ ID NO: 14 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT01M2 foi obtida com base no viés de uso do códon de milho.
[0127] A sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT01M3 é mostrada na SEQ ID NO: 15 na listagem de sequências, e a sequência de nucleotídeos ALT01M3 que codifica a sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT01M3 é mostrada na SEQ ID NO: 16 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos ALT01M3-01 como mostrado na SEQ ID NO: 17 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT01M3 foi obtida com base no viés de uso do códon de soja; a sequência de nucleotídeos ALT01M3-02 como mostrado na SEQ ID NO: 18 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT01M3 foi obtida com base no viés de uso do códon de milho. Síntese das sequências de nucleotídeos a seguir:
[0128] A sequência de aminoácidos (369 aminoácidos) de ALT02 é mostrada na SEQ ID NO: 19 na listagem de sequências, e a sequência de nucleotídeos ALT02 (1110 nucleotídeos) que codifica a sequência de aminoácidos de ALT02 é mostrada na SEQ ID NO: 20 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos ALT02-01 como mostrado na SEQ ID NO: 21 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à ALT02 foi obtida com base no viés de uso do códon de soja; a sequência de nucleotídeos ALT02-02 como mostrado na SEQ ID NO: 22 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT02 foi obtida com base no viés de uso do códon de milho.
[0129] A proteína tolerante a herbicida ALT02M1 inclui uma mutação de glicina para alanina na posição 140 da sequência de aminoácidos da ALT02. A sequência de aminoácidos de ALT02M1 é mostrada na SEQ ID NO: 23 na listagem de sequências, e a sequência de nucleotídeos ALT02M1 que codifica a sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT02M1 é mostrada na SEQ ID NO: 24 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 como mostrado na SEQ ID NO: 25 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT02M1 foi obtida com base no viés de uso do códon de soja; a sequência de nucleotídeos ALT02M1-02 como mostrado na SEQ ID NO: 26 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT02M1 foi obtida com base no viés de uso do códon de milho.
[0130] A proteína tolerante a herbicida ALT02M2 inclui uma mutação de serina para valina na posição 142 da sequência de aminoácidos da ALT02. A sequência de aminoácidos da ALT02M2 é mostrada na SEQ ID NO: 27 na listagem de sequências, e a sequência de nucleotídeos ALT02M2 que codifica a sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT02M2 é mostrada na SEQ ID NO: 28; a sequência de nucleotídeos ALT02M2-01 como mostrado na SEQ ID NO: 29 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT02M2 foi obtida com base no viés de uso do códon de soja; a sequência de nucleotídeos ALT02M2-02 como mostrado na SEQ ID NO: 30 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT02M2 foi obtida com base no viés de uso do códon de milho.
[0131] A proteína tolerante a herbicida ALT02M3 inclui mutações de prolina e tirosina para arginina e alanina nas posições 44 a 45 e mutações de glicina, serina e glicina para alanina, valina e arginina nas posições 140, 142 e 146 da sequência de aminoácidos da ALT02. A sequência de aminoácidos da ALT02M3 é mostrada na SEQ ID NO: 31 na listagem de sequências, e a sequência de nucleotídeos ALT02M3 que codifica a sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT02M3 é mostrada na SEQ ID NO: 32 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos ALT02M3-01 como mostrado na SEQ ID NO: 33 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT02M3 foi obtida com base no viés de uso do códon de soja; a sequência de nucleotídeos ALT02M3-02 como mostrado na SEQ ID NO: 34 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT02M3 foi obtida com base no viés de uso do códon de milho.
[0132] A sequência de aminoácidos (362 aminoácidos) de ALT03 é mostrada na SEQ ID NO: 35 na listagem de sequências, e a sequência de nucleotídeos ALT03 (1089 nucleotídeos) que codifica a sequência de aminoácidos da ALT03 é mostrada na SEQ ID NO: 36 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos ALT03-01 como mostrado na SEQ ID NO: 37 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à ALT03 foi obtida com base no viés de uso do códon de soja; a sequência de nucleotídeos ALT03-02 como mostrado na SEQ ID NO: 38 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT03 foi obtida com base no viés de uso do códon de milho.
[0133] A proteína tolerante a herbicida ALT03M1 inclui uma mutação de glicina para alanina na posição 140 da sequência de aminoácidos da ALT03. A sequência de aminoácidos da ALT03M1 é mostrada na SEQ ID NO: 39 na listagem de sequências, e a sequência de nucleotídeos ALT03M1 que codifica a sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT03M1 é mostrada na SEQ ID NO: 40 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos ALT03M1-01 como mostrado na SEQ ID NO: 41 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT03M1 foi obtida com base no viés de uso do códon de soja; a sequência de nucleotídeos ALT03M1-02 como mostrado na SEQ ID NO: 42 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT03M1 foi obtida com base no viés de uso do códon de milho.
[0134] A proteína tolerante a herbicida ALT03M2 inclui uma mutação de serina para valina na posição 142 da sequência de aminoácidos da ALT03. A sequência de aminoácidos da ALT03M2 é mostrada na SEQ ID NO: 43 na listagem de sequências, e a sequência de nucleotídeos ALT03M2 que codifica a sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT03M2 é mostrada na SEQ ID NO: 44 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos ALT03M2-01 como mostrado na SEQ ID NO: 45 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT03M2 foi obtida com base no viés de uso do códon de soja; a sequência de nucleotídeos ALT03M2-02 como mostrado na SEQ ID NO: 46 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT03M2 foi obtida com base no viés de uso do códon de milho.
[0135] A proteína tolerante a herbicida ALT03M3 inclui mutações de prolina e tirosina para arginina e alanina nas posições 44 a 45 e mutações de glicina, serina e glicina para alanina, valina e arginina nas posições 140, 142 e 146 da sequência de aminoácidos da ALT03. A sequência de aminoácidos da ALT03M3 é mostrada na SEQ ID NO: 47 na listagem de sequências, e a sequência de nucleotídeos ALT03M3 que codifica a sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT03M3 é mostrada na SEQ ID NO: 48 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos ALT03M3-01 como mostrado na SEQ ID NO: 49 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT03M3 foi obtida com base no viés de uso do códon de soja; a sequência de nucleotídeos ALT03M3-02 como mostrado na SEQ ID NO: 50 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT03M3 foi obtida com base no viés de uso do códon de milho.
[0136] A sequência de aminoácidos (350 aminoácidos) de ALT04 é mostrada na SEQ ID NO: 51 na listagem de sequências, e a sequência de nucleotídeos ALT04 (1053 nucleotídeos) que codifica a sequência de aminoácidos da ALT04 é mostrada na SEQ ID NO: 52 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos ALT04-01 como mostrado na SEQ ID NO: 53 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à ALT04 foi obtida com base no viés de uso do códon de soja; a sequência de nucleotídeos ALT04-02 como mostrado na SEQ ID NO: 54 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT04 foi obtida com base no viés de uso do códon de milho.
[0137] A proteína tolerante a herbicida ALT04M1 inclui uma mutação de glicina para alanina na posição 131 da sequência de aminoácidos da ALT04. A sequência de aminoácidos da ALT04M1 é mostrada na SEQ ID NO: 55 na listagem de sequências, e a sequência de nucleotídeos ALT04M1 que codifica a sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT04M1 é mostrada na SEQ ID NO: 56 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos ALT04M1-01 como mostrado na SEQ ID NO: 57 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT04M1 foi obtida com base no viés de uso do códon de soja; a sequência de nucleotídeos ALT04M1-02 como mostrado na SEQ ID NO: 58 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT04M1 foi obtida com base no viés de uso do códon de milho.
[0138] A proteína tolerante a herbicida ALT04M2 inclui uma mutação de serina para valina na posição 133 da sequência de aminoácidos da ALT04. A sequência de aminoácidos da ALT04M2 é mostrada na SEQ ID NO: 59 na listagem de sequências, e a sequência de nucleotídeos ALT04M2 que codifica a sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT04M2 é mostrada na SEQ ID NO: 60 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos ALT04M2-01 como mostrado na SEQ ID NO: 61 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT04M2 foi obtida com base no viés de uso do códon de soja; a sequência de nucleotídeos ALT04M2-02 como mostrado na SEQ ID NO: 62 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT04M2 foi obtida com base no viés de uso do códon de milho.
[0139] A proteína tolerante a herbicida ALT04M3 inclui mutações de prolina e tirosina para arginina e alanina nas posições 35 a 36 e mutações de glicina, serina e glicina para alanina, valina e arginina nas posições 131, 133 e 137 da sequência de aminoácidos da ALT04. A sequência de aminoácidos da ALT04M3 é mostrada na SEQ ID NO: 63 na listagem de sequências, e a sequência de nucleotídeos ALT04M3 que codifica a sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT04M3 é mostrada na SEQ ID NO: 64 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos ALT04M3-01 como mostrado na SEQ ID NO: 65 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT04M3 foi obtida com base no viés de uso do códon de soja; a sequência de nucleotídeos ALT04M3-02 como mostrado na SEQ ID NO: 66 na listagem de sequências que codifica a sequência de aminoácidos correspondente à proteína tolerante a herbicida ALT04M3 foi obtida com base no viés de uso do códon de milho.
Exemplo 2. Expressão e purificação de proteína
1. Amplificação PCR de genes
[0140] Um par de iniciadores foi projetado:
[0141] iniciador 3: TGCAGACATATGGAAACCGATAAAAAAAC (a porção sublinhada sendo local da enzima de restrição Nde I), como mostrado na SEQ ID NO: 67 na listagem de sequências;
[0142] iniciador 4: CCCAAGCTTCTAGCTTTCGTTCTGATCTAAGCCGTGC (a porção sublinhada sendo local da enzima de restrição Hind III), como mostrado na SEQ ID NO: 68 na listagem de sequência;
[0143] O gene ALT01M1 (terminal contendo locais da enzima de restrição Nde I e Hind III) foi amplificado usando o sistema de amplificação PCR a seguir: Taq DNA polimerase (5U/μL) 0,5 μL 5×PrimeSTARBuffer (Mg2+ Plus) 25 μL Mistura dNTP (cada 2,5 mM) 5 μL
DNA modelo (gene M1) 10 ng Iniciador 3 (25 μM) 1 μL Iniciador 4 (25 μM) 1 μL Água (ddH2O) adicionado até 50 μL
[0144] Condições de reação PCR: desnaturação a 98 °C por 1 min; então entrando no seguinte ciclo: desnaturação a 98 °C por 15 s, recozimento a 55 °C por 15 s, extensão a 72 °C por 1 min, incluindo totalmente 29 ciclos; extensão final a 72 °C por 10 min e resfriamento até a temperatura ambiente.
[0145] De acordo com o método de amplificação PCR acima, a sequência de nucleotídeos ALT01M2, a sequência de nucleotídeos ALT01M3, a sequência de nucleotídeos ALT01, a sequência de nucleotídeos ALT03M1, a sequência de nucleotídeos ALT03M2, a sequência de nucleotídeos ALT03M3, sequência de nucleotídeos ALT03, sequência de nucleotídeos ALT04M1, sequência de nucleotídeos ALT04M2, sequência de nucleotídeos ALT04M3 e sequência de nucleotídeos ALT04, que contêm os locais da enzima de restrição Nde I e Hind III em terminais, foram amplificadas. A sequência de nucleotídeos ALT02M1, sequência de nucleotídeos ALT02M2, sequência de nucleotídeos ALT02M3 e sequência de nucleotídeos ALT02 (terminais os quais contêm locais da enzima de restrição Nde I e Hind III, respectivamente) foram sintetizadas.
2. Construção de um vetor de expressão bacteriana e aquisição de micro-organismos recombinantes
[0146] O produto de amplificação PCR acima (a sequência de nucleotídeos ALT01M1, a sequência de nucleotídeos ALT01M2, a sequência de nucleotídeos ALT01M3, a sequência de nucleotídeos ALT01, a sequência de nucleotídeos ALT02M1, a sequência de nucleotídeos ALT02M2, a sequência de nucleotídeos ALT02M3, a sequência de nucleotídeos ALT02, a sequência de nucleotídeos ALT03M1, a sequência de nucleotídeos ALT03M2, a sequência de nucleotídeos ALT03M3, a sequência de nucleotídeos ALT03, a sequência de nucleotídeos ALT04M1, a sequência de nucleotídeos ALT04M2, a sequência de nucleotídeos ALT04M3 e a sequência de nucleotídeos ALT04, que contêm os locais da enzima de restrição Nde I e Hind III em terminais) e um vetor de expressão bacteriana pET-30a (+) foram digeridos, respectivamente, com enzimas de restrição Nde I e Hind III, os fragmentos de gene excisados mencionados acima foram ligados enzimaticamente, respectivamente, com o vetor de expressão bacteriana pET-30a (+) após a digestão da enzima, e os produtos ligados enzimaticamente foram transformados, respectivamente, na cepa hospedeira de expressão BL21 (DE3) para obter os micro-organismos recombinantes BL21 (ALT01M1), BL21 (ALT01M2), BL21 (ALT01M3), BL21 (ALT01), BL21 (ALT02M1), BL21 (ALT02M2), BL21 (ALT02M3), BL21 (ALT02), BL21 (ALT03M1), BL21 (ALT03M2), BL21 (ALT03M3), BL21 (ALT03), BL21 (ALT04M1), BL21 (ALT04M2), BL21 (ALT04M3), e BL21 (ALT04).
3. Expressão e purificação de proteína tolerante a herbicida em Escherichia coli
[0147] Os micro-organismos recombinantes BL21 (ALT01M1), BL21 (ALT01M2), BL21 (ALT01M3), BL21 (ALT01), BL21 (ALT02M1), BL21 (ALT02M2), BL21 (ALT02M3), BL21 (ALT02), BL21 (ALT03M1), BL21 (ALT03M2), BL21 (ALT03M3), BL21 (ALT03), BL21 (ALT04M1), BL21 (ALT04M2), BL21 (ALT04M3), e BL21 (ALT04) foram cultivados em 100 mL de meio LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCl e 100 mg/L de ampicilina, ajustados ao pH 7,5 com NaOH) até uma concentração de OD600nm = 0,6-0,8 e induzidos com isopropil tiogalactosídeo (IPTG) adicionado em uma concentração de 0,4 mM em uma temperatura de 16 °C por 20 horas. As células bacterianas foram coletadas por centrifugação e ressuspensas em 20 ml de tampão Tris-HCl (100 mM, pH 8,0), seguido pela realização de ultrassonicação (processador ultrassônico X0-900D, 30% de intensidade) por 10 min, então centrifugação, coleta do sobrenadante, purificação das proteínas tolerantes a herbicida adquiridas mencionadas acima com coluna de cromatografia de afinidade por íons de níquel e detecção do resultado da purificação usando eletroforese de proteínas SDS-PAGE com o tamanho de banda sendo consistente com o tamanho de banda previsto teoricamente.
Exemplo 3. Determinação de atividade enzimática de proteína tolerante a herbicida
[0148] O sistema de reação enzimática (1 mL) contém 0,2 μg de enzima reativa (as proteínas tolerantes a herbicida ALT01M1, ALT01M2, ALT01M3, ALT01, ALT02M1, ALT02M2, ALT02M3, ALT02, ALT03M1, ALT03M2, ALT03M3, ALT03, ALT04M1, ALT04M2, ALT04M3 e ALT04 obtidas a partir da purificação acima), 0,2 mM de tifensulfuron-metil (metsulfuron-metil, clorimuron-etil, bensulfuron-metil, sulfometuron-metil ou tribenuron-metil) e um sistema tampão de tampão fosfato em uma concentração de 50 mM (pH 7,0), que foram reagidos em um banho-maria em uma temperatura de 30 °C por 20 min. Cada reação foi cronometrada começando com a adição de enzima reativa e foi terminada com 1 mL de diclorometano. A fase orgânica após a delaminação foi desidratada com sulfato de sódio anidro.
[0149] A solução de reação desidratada acima foi seca por sopro com nitrogênio e filtrada pela adição de 1 mL de metanol e 20 μL do filtrado foram submetidos à espectrometria de massa por cromatografia líquida (LC-MS). As condições da cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) foram como a seguir: a fase móvel sendo metanol ﹕ água (80:20, V/V), coluna de cromatografia Zorbax XDB-C18 (3,5 μm, 2,1×50 mm, Agilent, USA), a temperatura da coluna sendo a temperatura ambiente, detector de UV, com um comprimento de onda de detecção de 255 nm, um volume de injeção da amostra de 20 μL e uma taxa de fluxo de 0,25 mL/min. As condições de espectrometria de massa de íons primários foram como a seguir: o modo de detecção de íons sendo detecção de íons multirreativa; a polaridade iônica sendo íons negativos; o modo de ionização sendo ionização por electrospray; uma tensão capilar de 4000 volts; uma temperatura do gás seco de 330 °C, uma taxa de fluxo de 10 L/min, uma pressão do gás atomizador de 35 psi, uma tensão de colisão de 135 volts; e uma faixa de varredura de massa de 300-500 m/z. As condições de espectrometria de massa de íons secundários foram como a seguir: uma tensão de colisão de 90 volts; uma faixa de varredura de massa de 30-400 m/z e outras condições sendo as mesmas que aquelas da espectrometria de massa de íons primários. Foi identificado por LC-MS que o metabolito de tifensulfuron-metil foi ácido tiofeno sulfônico e o metabolito de metsulfuron-metil, clorimuron-etil, bensulfuron-metil, sulfometuron-metil ou tribenuron-metil foi seu ácido sulfônico correspondente. A quantidade do ácido tiofeno sulfônico (metabolito) gerado foi detectada usando cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima exigida para catalisar a degradação de tifensulfuron-metil (metsulfuron-metil, clorimuron-etil, bensulfuron-metil, sulfometuron-metil ou tribenuron-metil) em pH 7,0, em uma temperatura de 30 °C dentro de 1 min para diminuir 1 μmol de tifensulfuron-metil (metsulfuron-metil, clorimuron-etil, bensulfuron-metil, sulfometuron-metil ou tribenuron-metil), que é expresso como U. Os resultados experimentais foram mostrados na Tabela 1.
Tabela 1. Resultados experimentais de degradação de herbicidas de sulfonilureia por proteínas tolerantes a herbicida atividade enzimática tribenuro bensulfur tifensulfur metsulfuro clorimuro sulfometur específica n-metil on-metil on-metil n-metil n-etil on-metil (μmol/min/mg) ALT01 1,8 1,7 27,4 2,0 2,7 1,9 ALT01M1 3,1 3,9 89,9 2,2 10,4 5,4 ALT01M2 10,8 2,4 106,0 1,2 9,0 3,5 ALT01M3 3,3 0,68 17,8 4,2 38,4 1,1 ALT02 1,9 1,8 28,8 2,1 2,8 2,0
ALT02M1 3,3 4,1 94,4 2,3 10,9 5,7 ALT02M2 11,3 2,5 111,3 1,3 9,5 3,7 ALT02M3 3,5 0,7 18,7 4,4 40,3 1,2 ALT03 1,7 1,6 26,0 1,9 2,6 1,8 ALT03M1 2,9 3,7 85,4 2,1 9,9 5,1 ALT03M2 10,3 2,3 100,7 1,1 8,6 3,3 ALT03M3 3,1 0,6 16,9 4,0 36,5 1,0 ALT04 1,6 1,5 24,7 1,8 2,4 1,7 ALT04M1 2,8 3,5 80,9 2,0 9,4 4,9 ALT04M2 9,7 2,2 95,4 1,1 8,1 3,2 ALT04M3 3,0 0,6 16,0 3,8 34,6 1,0
[0150] Os resultados experimentais acima indicam que, em comparação com a proteína tolerante a herbicida ALT01, a proteína purificada tolerante a herbicida ALT01M1 degrada tribenuron-metil, bensulfuron-metil e tifensulfuron-metil em eficiências que são 1,7, 2,3 e 3,3 vezes aquelas da ALT01, respectivamente; a proteína purificada tolerante a herbicida ALT01M2 degrada tribenuron-metil, bensulfuron-metil e tifensulfuron-metil em eficiências que são 6,0, 1,4 e 3,9 vezes aquelas da ALT01, respectivamente; a proteína purificada tolerante a herbicida ALT01M3 degrada tribenuron-metil, metsulfuron-metil e clorimuron-etil em eficiências que são 1,9, 2,1 e 14,2 vezes aquelas da ALT01, respectivamente.
[0151] Em comparação com a proteína tolerante a herbicida ALT02, a proteína purificada tolerante a herbicida ALT02M1 degrada tribenuron-metil,
bensulfuron-metil e tifensulfuron-metil em eficiências que são 1,7, 2,3 e 3,3 vezes aquelas da ALT02, respectivamente; a proteína purificada tolerante a herbicida ALT02M2 degrada tribenuron-metil, bensulfuron-metil e tifensulfuron-metil em eficiências que são 5,9, 1,4 e 3,9 vezes aquelas da ALT02, respectivamente; a proteína purificada tolerante a herbicida ALT02M3 degrada tribenuron-metil, metsulfuron-metil e clorimuron-etil em eficiências que são 1,8, 2,1 e 14,2 vezes aquelas da ALT02, respectivamente.
[0152] Em comparação com a proteína tolerante a herbicida ALT03, a proteína purificada tolerante a herbicida ALT03M1 degrada tribenuron-metil, bensulfuron-metil e tifensulfuron-metil em eficiências que são 1,5, 2,1 e 3,0 vezes aquelas da ALT03, respectivamente; a proteína purificada tolerante a herbicida ALT03M2 degrada tribenuron-metil, bensulfuron-metil e tifensulfuron-metil em eficiências que são 5,4, 1,3 e 3,5 vezes aquelas da ALT03, respectivamente; a proteína purificada tolerante a herbicida ALT03M3 degrada tribenuron-metil, metsulfuron-metil e clorimuron-etil em eficiências que são 1,6, 1,9 e 13,0 vezes aquelas da ALT03, respectivamente.
[0153] Em comparação com a proteína tolerante a herbicida ALT04, a proteína purificada tolerante a herbicida ALT04M1 degrada tribenuron-metil, bensulfuron-metil e tifensulfuron-metil em eficiências que são 1,5, 1,9 e 2,8 vezes aquelas da ALT04, respectivamente; a proteína purificada tolerante a herbicida ALT04M2 degrada tribenuron-metil, bensulfuron-metil e tifensulfuron-metil em eficiências que são 5,1, 1,2 e 3,3 vezes aquelas da ALT04, respectivamente; a proteína purificada tolerante a herbicida ALT03M3 degrada tribenuron-metil, metsulfuron-metil e clorimuron-etil em eficiências que são 1,6, 1,8 e 12,4 vezes aquelas da ALT04, respectivamente.
[0154] Assim, pode-se ver que, na sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT01, a mutação na posição 176 de glicina em alanina e/ou a mutação na posição 178 de serina em valina ambas podem intensificar a capacidade de genes mutantes (tais como o gene ALT01M1, ALT01M2 ou ALT01M3) degradarem herbicidas de sulfonilureia, especialmente tribenuron-metil. Na sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT02 (ou ALT03), a mutação na posição 140 de glicina em alanina e/ou a mutação na posição 142 de serina em valina ambas podem intensificar a capacidade de genes mutantes (tais como o gene ALT02M1, ALT02M2, ALT02M3, ALT03M1, ALT03M2 ou ALT03M3) degradarem herbicidas de sulfonilureia, especialmente tribenuron-metil. Na sequência de aminoácidos da proteína tolerante a herbicida ALT04, a mutação na posição 131 de glicina em alanina e/ou a mutação na posição 133 de serina em valina ambas podem intensificar a capacidade de genes mutantes (tais como o gene ALT04M1, ALT04M2 ou ALT04M3) degradarem herbicidas de sulfonilureia, especialmente tribenuron-metil.
Exemplo 4. Construção de vetores de expressão recombinante para soja
1. Construção de vetores de clonagem recombinantes contendo a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 para soja
[0155] A sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 foi ligada ao vetor de clonagem pGEM-T (Promega, Madison, EUA, CAT: A3600), de acordo com o procedimento operacional nas instruções do produto vetor pGEM-T de Promega Corporation, dessa forma, obtendo um vetor de clonagem recombinante DBN01-T, cujo processo de construção foi como mostrado na Figura 1 (em que, Amp representa o gene de resistência à ampicilina; fl representa a origem de replicação do fago fl; LacZ é códon de iniciação LacZ; SP6 é promotor de polimerase de RNA SP6; T7 é promotor de polimerase de RNA T7; ALT02M1-01 é a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 (SEQ ID NO: 25); e MCS é um sítio de clonagem múltipla).
[0156] Então, as células competentes T1 de Escherichia coli (Transgen, Beijing, China, CAT: CD501) foram transformadas como o vetor de clonagem recombinante DBN01-T usando o método de choque térmico sob as condições de choque térmico a seguir: mantendo 50 μL de células competentes T1 de Escherichia coli e 10 μL de DNA de plasmídeo (vetor de clonagem recombinante
DBN01-T) em banho-maria a 42 °C por 30 segundos; cultura em agitação a 37 °C por 1 hora (usando um agitador em uma velocidade de rotação de 100 rpm por agitação); e crescimento em uma placa LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCl e 15 g/L de ágar, com um pH ajustado para 7,5 com NaOH) de ampicilina (100 mg/L) tendo sua superfície revestida com IPTG (isopropiltio-β-D-galactosídeo) e X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactosídeo) durante a noite.
As colônias brancas foram coletadas e cultivadas em um meio de cultura líquido LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCl e 100 mg/L de ampicilina, com um pH ajustado para 7,5 com NaOH) em uma temperatura de 37 °C durante a noite.
Os plasmídeos nas células foram extraídos através de um método alcalino: centrifugação da solução de bactérias em uma velocidade de rotação de 12000 rpm por 1 min, remoção do sobrenadante, e suspensão da talos precipitados com 100 μL de solução pré-resfriada gelada I (25 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA (ácido etilenodiaminatetra-acético) e 50 mM glicose, com um pH de 8,0); adição de 200 μL de solução recém-formulada II (0,2M NaOH, 1% de SDS (dodecil sulfato de sódio)), inversão do tubo 4 vezes e mistura e colocação em gelo por 3-5 min; adição de 150 μL de solução gelada III (3 M acetato de potássio, 5 M ácido acético), mistura uniforme imediata e colocação em gelo por 5-10 min; centrifugação sob as condições de uma temperatura de 4 °C e uma velocidade de rotação de 12000 rpm por 5 min, adição 2 vezes de volumes de etanol anidro ao sobrenadante e colocação em temperatura ambiente por 5 min após misturar uniformemente; centrifugação sob as condições de uma temperatura de 4 °C e uma velocidade de rotação de 12000 rpm por 5 min, descarte do sobrenadante e secagem a ar do precipitado após lavagem com etanol em uma concentração de 70% (V/V); adição de 30 μL de TE (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA, com um pH de 8,0) contendo RNase (20 μg/mL) para dissolver o precipitado; banho-maria em uma temperatura de 37 °C por 30 min para digerir o RNA; e armazenamento em uma temperatura de -20 °C para o uso.
[0157] Após a identificação do plasmídeo extraído por digestão SpeI e KasI, clones positivos foram verificados por sequenciação. Os resultados mostraram que a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 inserida no vetor de clonagem recombinante DBN01-T foi a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 25 na listagem de sequência, ou seja, a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 foi inserida corretamente.
2. Construção de vetores de expressão recombinante contendo a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 para soja
[0158] O vetor de clonagem recombinante DBN01-T e um vetor de expressão DBNBC-01 (estrutura principal do vetor: pCAMBIA2301 (que pode ser provido pela instituição CAMBIA)) foram ambos digeridos com enzimas de restrição SpeI e KasI respectivamente; o fragmento de sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 excisado foi inserido entre os locais SpeI e KasI no vetor de expressão DBNBC-01; e é bem-conhecido por um técnico no assunto construir um vetor usando métodos de digestão de enzimas convencionais, em que um vetor de expressão recombinante DBN100825 foi construído, cujo processo de construção foi como mostrado na Figura 2 (Espec: o gene de espectinomicina; RB: o limite direito; prAtUbi10: o promotor do gene de Arabidopsis thaliana Ubiquitin 10 (SEQ ID NO: 69); ALT02M1-01: a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 (SEQ ID NO: 25); tNos: o terminador de um gene de nopalina sintase (SEQ ID NO:70); prBrCBP: o promotor do gene do fator de alongamento eucariótico de colza 1α (Tsfl) (SEQ ID NO: 71); spAtCTP2: o peptídeo de trânsito de cloroplasto de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 72); EPSPS: o gene de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (SEQ ID NO: 73); tPsE9: o terminador de gene RbcS de ervilha (SEQ ID NO: 74); LB: o limite esquerdo).
[0159] As células competentes T1 de Escherichia coli foram transformadas com o vetor de expressão recombinante DBN100825 por um método de choque térmico sob as condições de choque térmico a seguir: manutenção de 50 μL de células competentes T1 de Escherichia coli e 10 μL de DNA de plasmídeo (vetor de expressão recombinante DBN100825) em banho-maria a 42 °C por 30 segundos; cultura em agitação a 37 °C por 1 hora (usando um agitador em uma velocidade de rotação de 100 rpm por agitação); então cultura sob a condição de uma temperatura de 37℃ em uma placa sólida LB contendo 50 mg/L de espectinomicina (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCl e 15 g/L de ágar, com um pH ajustado para 7,5 com NaOH) por 12 horas, coletando colônias brancas e cultura sob a condição de uma temperatura de 37 °C durante a noite em um meio de cultura líquido LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCl e 50 mg/L de espectinomicina, com um pH ajustado para 7,5 com NaOH). Os plasmídeos nas células foram extraídos através do método alcalino. O plasmídeo extraído foi identificado após a digestão com enzimas de restrição SpeI e KasI, e clones positivos foram identificados por sequenciamento. Os resultados demonstraram que a sequência de nucleotídeos entre os sítios SpeI e KasI no vetor de expressão recombinante DBN100825 foi a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 25 na listagem de sequências, ou seja, a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01.
[0160] O vetor de expressão recombinante DBN100826 contendo a sequência de nucleotídeos ALT02M2-01, o vetor de expressão recombinante DBN100827 contendo a sequência de nucleotídeos ALT02M3-01 e o vetor de expressão recombinante DBN100828 contendo a sequência de nucleotídeos ALT02-01 foram construídos de acordo com o método de construção do vetor de expressão recombinante DBN100825 contendo a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 conforme descrito acima. Os clones positivos foram verificados por sequenciamento com os resultados mostrando que a sequência de nucleotídeos ALT02M2-01, sequência de nucleotídeos ALT02M3-01 e sequência de nucleotídeos ALT02-01 inseridas nos vetores de expressão recombinante DBN100825, DBN100826, DBN100827 e DBN100828 foram as sequências de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 21 na listagem de sequências respectivamente, a saber, a sequência de nucleotídeos ALT02M2-01, a sequência de nucleotídeos
ALT02M3-01 e a sequência de nucleotídeos ALT02-01 foram inseridas corretamente.
[0161] De acordo com o método para a construção do vetor de expressão recombinante DBN100825 contendo a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 como descrito acima, um vetor de expressão recombinante de controle DBN100828N foi construído, cuja estrutura é como mostrado na Figura 3 (estrutura principal do vetor: pCAMBIA2301 (que pode ser provida pela instituição CAMBIA); Espec: o gene de espectinomicina; RB: o limite direito; prBrCBP: o promotor do gene do fator de alongamento eucariótico de colza 1α (Tsfl) (SEQ ID NO: 71); spAtCTP2: o peptídeo de trânsito de cloroplasto de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 72); EPSPS: o gene de 5-enolpiruvilshiquimato 3-fosfato sintase (SEQ ID NO: 73); tPsE9: o terminador de gene RbcS de ervilha (SEQ ID NO: 74); LB: o limite esquerdo). Clones positivos foram verificados por sequenciamento, sendo que os resultados demonstram que o vetor de expressão recombinante de controle DBN100828N foi corretamente construído.
3. Transformação de Agrobacterium com os vetores de expressão recombinante
[0162] Agrobacterium LBA4404 (Invitrogen, Chicago, EUA, CAT: 18313-015) foi transformado com os vetores de expressão recombinante DBN100825, DBN100826, DBN100827, DBN100828 e DBN100828N que foram construídos corretamente usando um método de nitrogênio líquido, sob as condições de transformação a seguir: colocação de 100 μL de Agrobacterium LBA4404 e 3 μL de DNA de plasmídeo (vetor de expressão recombinante) em nitrogênio líquido por 10 minutos e aquecimento em banho-maria a 37 °C por 10 minutos; inoculação do LBA4404 de Agrobacterium transformado em um tubo LB, cultura sob as condições de uma temperatura de 28 °C e uma velocidade de rotação de 200 rpm por 2 horas, espalhamento em uma placa LB contendo 50 mg/L de rifampicina e 50 mg/L de espectinomicina até que clones únicos positivos fossem desenvolvidos, seleção de clones únicos para a cultura e extração dos plasmídeos destes e realização da verificação da digestão de enzimas usando enzimas de restrição. Os resultados demonstraram que as estruturas dos vetores de expressão recombinantes DBN100825, DBN100826, DBN100827, DBN100828 e DBN100828N estavam completamente corretos.
Exemplo 5. Aquisição e verificação de plantas de soja transgênicas
1. Aquisição de plantas de soja transgênicas
[0163] De acordo com o método de infecção por Agrobacterium convencionalmente usado, o tecido do nó cotiledonar de variedade de soja cultivada de modo estéril Zhonghuang13 foi co-cultivado com o Agrobacterium na parte 3 do Exemplo 4, de modo a introduzir o T-DNA (incluindo a sequência do promotor do gene Ubiquitin10 de Arabidopsis thaliana, a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01, a sequência de nucleotídeos ALT02M2-01, a sequência de nucleotídeos ALT02M3-01, a sequência de nucleotídeos ALT02-01, o terminador tNos, o promotor do gene do fator de alongamento eucariótico de colza 1α, o peptídeo de trânsito de cloroplasto de Arabidopsis thaliana, um gene de 5-enolpiruvilshiquimato-3 fosfato sintase e o terminador de gene RbcS da ervilha) nos vetores de expressão recombinante DBN100825, DBN100826, DBN100827, DBN100828 e DBN100828N construídos na Parte 2 do Exemplo 4 dentro dos conjuntos de cromossoma de soja, dessa forma, obtendo plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 foi introduzida, plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M2-01 foi introduzida, plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M3-01 foi introduzida e plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02-01 foi introduzida; entretanto, plantas de soja de controle dentro das quais T-DNA em um vetor de expressão recombinante de controle DBN100828N foi introduzido e plantas de soja do tipo selvagem foram usadas como o controle.
[0164] No que se refere à transformação de soja mediada por Agrobacterium, em resumo, sementes de soja maduras foram germinadas em um meio de cultura de germinação de soja (3,1 g/L de sal B5, vitamina B5, 20 g/L de sacarose e 8 g/L de ágar, com um pH de 5,6) e as sementes foram inoculadas em um meio de cultura de germinação e cultivadas sob as condições de uma temperatura de 25±1 °C; e um fotoperíodo (claro/escuro) de 16 h/8 h.
Após 4-6 dias de germinação, mudas estéreis de soja inchadas em nós cotiledonares verde intensos foram coletadas, eixos hipocotiledonares foram cortados 3-4 mm abaixo dos nós cotiledonares, os cotilédones foram cortados longitudinalmente e brotos apicais, brotos laterais e brotos seminais foram removidos.
Uma ferida foi feita em um nó cotiledonar usando uma faca atrás de um bisturi e os tecidos do nó cotiledonar ferido foram contatados com um suspensão de Agrobacterium, em que o Agrobacterium pode transferir a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 (sequência de nucleotídeos ALT02M2-01, sequência de nucleotídeos ALT02M3-01 ou sequência de nucleotídeos ALT02-01) para os tecidos do nó cotiledonar ferido (etapa 1: a etapa de infecção). Nesta etapa, os tecidos do nó cotiledonar foram preferivelmente imersos na suspensão de Agrobacterium (OD660 = 0,5-0,8, um meio de cultura de infecção (2,15 g/L de sal MS, vitamina B5, 20 g/L de sacarose, 10 g/L de glicose, 40 mg/L de acetossiringona (AS), 4 g/L de ácido 2-morfolina etanossulfônico (MES) e 2 mg/L de zeatina (ZT), com um pH de 5,3)) para iniciar a inoculação.
Os tecidos do nó cotiledonar foram co-cultivados com Agrobacterium por um período de tempo (3 dias) (etapa 2: a etapa de co-cultura). Preferivelmente, os tecidos do nó cotiledonar foram cultivados em um meio de cultura sólido (4,3 g/L de sal MS, vitamina B5, 20 g/L de sacarose, 10 g/L de glicose, 4 g/L de MES, 2 mg/L de ZT e 8 g/L de ágar, com um pH de 5,6) após a etapa de infecção.
Após esse estágio de co-cultivo, pode haver uma etapa de “recuperação” opcional.
Na etapa de “recuperação”, pode haver pelo menos um antibiótico (cefalosporina) conhecido por inibir o crescimento de Agrobacterium em um meio de cultura de recuperação (3,1 g/L de sal B5, vitamina B5, 1 g/L de MES, 30 g/L de sacarose, 2 mg/L de ZT, 8 g/L de ágar, 150 mg/L de cefalosporina, 100 mg/L de ácido glutâmico e 100 mg/L de ácido aspártico, com um pH de 5,6), sem a adição de um agente seletivo para um transformante de planta (etapa 3: a etapa de recuperação). Preferivelmente, os blocos de tecido regenerados dos nós cotiledonares foram cultivados em um meio de cultura sólido com um antibiótico, mas sem um agente seletivo, para eliminar Agrobacterium e prover um estágio de recuperação para as células infectadas. Subsequentemente, os blocos de tecido regenerados dos nós cotiledonares foram cultivados em um meio de cultura contendo um agente seletivo (glifosato) e calos transformados crescentes foram selecionados (etapa 4: a etapa de seleção). Preferivelmente, os blocos de tecido regenerados dos nós cotiledonares foram cultivados em um meio de cultura sólido de triagem (3,1 g/L de sal B5, vitamina B5, 1 g/L de MES, 30 g/L de sacarose, 1 mg/L de 6-benziladenina (6-BAP), 8 g/L de ágar, 150 mg/L de cefalosporina, 100 mg/L de ácido glutâmico, 100 mg/L de ácido aspártico e 0,25 mol/L de N-(fosfonometil)glicina, com um pH de 5,6) contendo um agente seletivo, assim, resultando em crescimento seletivo das células transformadas. Então, as plantas foram regeneradas das células transformadas (etapa 5: a etapa de regeneração). Preferivelmente, os blocos de tecido regenerados dos nós cotiledonares desenvolvidos em um meio de cultura contendo um agente seletivo foram cultivados em meios de cultura sólidos (um meio de cultura de diferenciação B5 e meio de cultura de enraizamento) para regenerar plantas.
[0165] Os blocos de tecido resistentes obtidos a partir da triagem foram transformados no meio de cultura de diferenciação B5 (3,1 g/L de sal B5, vitamina B5, 1 g/L de MES, 30 g/L de sacarose, 1 mg/L de ZT, 8 g/L de ágar, 150 mg/L de cefalosporina, 50 mg/L de ácido glutâmico, 50 mg/L de ácido aspártico, 1 mg/L de giberelina, 1 mg/L de auxina e 0,25 mol/L de N-(fosfonometil)glicina, com um pH de 5,6) e cultivados a 25 °C para diferenciação. As mudas diferenciadas foram transferidas para o meio de cultura de enraizamento B5 (3,1 g/L de sal B5, vitamina B5, 1 g/L de MES, 30 g/L de sacarose, 8 g/L de ágar, 150 mg/L de cefalosporina e 1 mg/L de ácido indol-3-butírico (IBA)), cultivadas no meio de cultura de enraizamento até alcançar uma altura de cerca de 10 cm a 25 °C e transferidas para uma estufa para a cultura até a frutificação. Na estufa, as plantas foram cultivadas a 26 ºC por 16 horas e, então, cultivadas a
20 ºC por 8 horas todos os dias.
2. Verificação das plantas de soja transgênicas usando TaqMan
[0166] Cerca de 100 mg de folhas das plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 foi introduzida, as plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M2-01 foi introduzida, as plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M3-01 foi introduzida, as plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02-01 foi introduzida e plantas de soja de controle, respectivamente, foram tomadas como amostras e o DNA genômico destes foi extraído com um DNeasy Plant Maxi Kit de Qiagen e números de cópias de um gene EPSPS foram detectados pelo método de PCR quantitativa por fluorescência de sonda Taqman de modo a determinar os números de cópias dos genes de interesse. Ao mesmo tempo, plantas de soja do tipo selvagem foram usadas como controles e detectadas e analisadas de acordo com o método mencionado acima. Repetições triplas foram definidas para os experimentos e suas médias determinadas.
[0167] O método específico para a detecção do número de cópias do gene EPSPS foi como a seguir:
[0168] Etapa 21. 100 mg de folhas das plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 foi introduzida, plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M2-01 foi introduzida, plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M3-01 foi introduzida e plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02-01 foi introduzida, plantas de soja de controle e plantas de soja do tipo selvagem, respectivamente, foram tomadas e moídas em um homogenato usando nitrogênio líquido em um almofariz, respectivamente, e triplas repetições foram tomadas para cada amostra;
[0169] Etapa 22. O DNA genômico das amostras mencionadas acima foi extraído usando um DNeasy Plant Mini Kit de Qiagen (para o método particular, consulte as instruções de produto deste);
[0170] Etapa 23. As concentrações do DNA genômico das amostras mencionadas acima foram detectadas usando NanoDrop 2000 (Thermo Scientific);
[0171] Etapa 24. As concentrações do DNA genômico das amostras mencionadas acima foram ajustadas para um valor de concentração consistente que varia de 80 a 100 ng/μL;
[0172] Etapa 25. Os números de cópias das amostras foram identificados usando o método de PCR quantitativa por fluorescência de sonda Taqman, em que amostras para as quais os números de cópias tinham sido identificados e conhecidos foram tomadas como padrões, as amostras das plantas de soja do tipo selvagem foram tomadas como o controle e triplas repetições foram tomadas para cada amostra e foram medidas; as sequências de iniciadores de PCR quantitativa por fluorescência e uma sonda foram como a seguir:
[0173] Os seguintes iniciadores e sonda foram usados para detectar a sequência de gene EPSPS:
[0174] iniciador 5: CTGGAAGGCGAGGACGTCATCAATA como mostrado na SEQ ID NO: 75 na listagem de sequências;
[0175] iniciador 6: TGGCGGCATTGCCGAAATCGAG como mostrado na SEQ ID NO: 76 na listagem de sequências;
[0176] sonda 1: ATGCAGGCGATGGGCGCCCGCATCCGTA como mostrado na SEQ ID NO: 77 na listagem de sequência;
[0177] Sistema de reação PCR: JumpStartTM Taq ReadyMixTM (Sigma) 10 μL mistura de iniciador/sonda 50× 1 μL DNA genômico 3 μL água (ddH2O) 6 μL
[0178] A mistura de iniciador/sonda 50 × compreende 45 μL de cada iniciador em uma concentração de 1 mM, 50 μL da sonda em uma concentração de 100 μM e 860 μL de tampão 1×TE e foi armazenada a 4 °C em um tubo âmbar.
[0179] Condições de reação PCR:
Etapa temperatura tempo 31 95 °C 5 min 32 95 °C 30 s 33 60 °C 1 min 34 de volta à etapa 32, repetida 40 vezes
[0180] Os dados foram analisados usando software SDS2.3 (Applied Biosystems).
[0181] Foi ainda demonstrado, pela análise dos resultados experimentais do número de cópias do gene EPSPS, que a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01, a sequência de nucleotídeos ALT02M2-01, a sequência de nucleotídeos ALT02M3-01 e a sequência de nucleotídeos ALT02-01 tinham sido todas integradas no conjunto de cromossoma das plantas de soja detectadas e todas as plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 foi introduzida, plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M2-01 foi introduzida, plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M3-01 foi introduzida e plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02-01 foi introduzida e plantas de soja de controle resultaram em plantas de soja transgênicas de cópia única.
Exemplo 6. Detecção de efeitos da tolerância a herbicida das plantas de soja transgênicas
[0182] O efeito da tolerância a herbicida tribenuron-metil foi detectado nas plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 foi introduzida, as plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M2-01 foi introduzida, as plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M3-01 foi introduzida, as plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02-01 foi introduzida, plantas de soja de controle e plantas de soja do tipo selvagem (no estágio das mudas V3-V4), respectivamente.
[0183] As plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos
ALT02M1-01 foi introduzida, as plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M2-01 foi introduzida, as plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M3-01 foi introduzida, as plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02-01 foi introduzida, plantas de soja de controle e plantas de soja do tipo selvagem foram tomadas e pulverizadas com tribenuron-metil (144 g de ai/ha, concentração de campo oito vezes maior) ou um solvente em branco (água), respectivamente. O grau de dano causado pelo herbicida foi medido para cada planta de acordo com o grau de enrolamento da folha e o grau de dano no ponto de crescimento 3 dias após a pulverização (3 DAT), 7 dias após a pulverização (7 DAT), 14 dias após a pulverização (14 DAT) e 21 dias após a pulverização (21 DAT): o caso onde as folhas são planas como plantas não tratadas e os pontos de crescimento são intactos é definido como tendo um grau de dano de 0%; o caso onde as veias são localmente amarronzadas, novas folhas são malformadas e o crescimento da planta é lento é definido como tendo um grau de dano de 50%; e o caso onde as veias são roxas, até que a planta inteira esteja morta e os pontos de crescimento estejam amarronzados e seco é definido como tendo um grau de dano de 100%. As plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 foi introduzida foram de três cepas no total (S1, S2 e S3), as plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M2-01 foi introduzida foram de três cepas no total (S4, S5 e S6), as plantas de soja dentro no total (S7, S8 e S9), as plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02-01 foi introduzida foram de três cepas no total (S10, S11 e S12), as plantas de soja de controle foram de duas cepas no total (S13 e S14) e as plantas de soja do tipo selvagem foram de uma cepa no total (CK1); e 10-15 plantas foram selecionadas de cada cepa e testadas. Os resultados foram conforme mostrados na Tabela 2 e na Figura 4.
Tabela 2. Resultados experimentais da tolerância a herbicida de plantas T1 de soja transgênicas
Tratamento Genótipos Dano Dano Dano Dano de soja médio % médio % médio % médio % 3DAT 7DAT 14DAT 21DAT S1 0 0 0 0 S2 0 0 0 0 S3 0 0 0 0 S4 0 0 0 0 S5 0 0 0 0 S6 0 0 0 0
Solvente em S7 0 0 0 0 branco S8 0 0 0 0 (água) S9 0 0 0 0 S10 0 0 0 0 S11 0 0 0 0 S12 0 0 0 0 S13 0 0 0 0 S14 0 0 0 0 CK1 0 0 0 0 S1 15 8 0 0 S2 16 9 0 0 S3 10 3 0 0 S4 0 0 0 0 S5 0 0 0 0
144 g ai/ha S6 0 0 0 0 tribenuron- S7 12 3 0 0 metil S8 11 2 0 0 (8x Tri.) S9 10 1 0 0 S10 25 15 5 0 S11 24 14 3 0 S12 30 17 4 0 S13 63 91 100 100 S14 58 95 100 100
CK1 76 87 100 100
[0184] Para sojas, concentração de campo oito vezes maior de tribenuron-metil é uma dose eficaz para tratamento de alta pressão. Os resultados na Tabela 2 e Figura 4 mostraram que as proteínas tolerantes a herbicida ALT02M1-01, ALT02M2-01, ALT02M3-01 e ALT02-01 todas podem conferir plantas de soja transgênicas com a tolerância a ácido benzenossulfônico; comparado com as plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02-01 foi introduzida, todas as plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M1-01 foi introduzida, as plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M2-01 foi introduzida e as plantas de soja dentro das quais a sequência de nucleotídeos ALT02M3-01 foi introduzida tinham uma tolerância a ácido benzenossulfônico significativamente aumentada; enquanto as plantas de soja de controle e as plantas de soja do tipo selvagem não tinham qualquer tolerância a ácido benzenossulfônico.
Exemplo 7. Construção de vetores de expressão recombinante para milho
1. Construção de vetores de clonagem recombinantes contendo sequência de nucleotídeos ALT02M1-02 para milho
[0185] A sequência de nucleotídeos ALT02M1-02 foi ligada ao vetor de clonagem pGEM-T (Promega, Madison, EUA, CAT: A3600), de acordo com o procedimento operacional nas instruções do vetor de produto pGEM-T de Promega Corporation, dessa forma, obtendo um vetor de clonagem recombinante DBN02-T, cujo processo de construção é como mostrado na Figura 5 (em que, Amp representa o gene de resistência a ampicilina; f1 representa a origem de replicação do fago f1; LacZ é códon de iniciação LacZ; SP6 é promotor de polimerase de RNA SP6; T7 é promotor de polimerase de RNA T7; ALT02M1-02 é a sequência de nucleotídeos ALT02M1-02 (SEQ ID NO: 26); e MCS é um sítio de clonagem múltipla).
[0186] De acordo com o método na Parte 1 do Exemplo 4, células competentes
T1 de Escherichia coli foram transformadas com o vetor de clonagem recombinante DBN01-T usando o método de choque térmico e os plasmídeos nas células foram extraídos através do método alcalino. O plasmídeo extraído foi identificado após a digestão com enzimas de restrição SpeI e KasI, e clones positivos foram identificados por sequenciamento. Os resultados demonstraram que a sequência de nucleotídeos entre os sítios SpeI e KasI no vetor de clonagem recombinante DBN02-T foi a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 26 na listagem de sequências, ou seja, a sequência de nucleotídeos ALT02M1-02.
2. Construção de vetores de expressão recombinante contendo sequência de nucleotídeos ALT02M1-02 para milho
[0187] O vetor de clonagem recombinante DBN02-T e um vetor de expressão DBNBC-02 (estrutura principal do vetor: pCAMBIA2301 (que pode ser provido pela instituição CAMBIA)) foram ambos digeridos com enzimas de restrição SpeI e KasI; o fragmento da sequência de nucleotídeos ALT02M1-02 excisada foi inserido entre os locais Spel e KasI no vetor de expressão DBNBC-02; e é bem-conhecido por um técnico no assunto por construir um vetor usando métodos de digestão de enzimas convencionais, em que um vetor de expressão recombinante DBN100833 foi construído, cujo processo de construção foi como mostrado na Figura 6 (Espec: o gene de espectinomicina; RB: o limite direito; prUbi: o promotor do gene Ubiquitina 1 do milho (SEQ ID NO: 78); ALT02M1-02: a sequência de nucleotídeos ALT02M1-02 (SEQ ID NO:26); tNos: o terminador de um gene de nopalina sintase (SEQ ID NO:70); PMI: o gene de fosfomanose isomerase (SEQ ID NO: 79); LB: o limite esquerdo).
[0188] De acordo com o método na Parte 2 do Exemplo 4, células competentes T1 de Escherichia coli foram transformadas com o vetor de expressão recombinante DBN100833 usando o método de choque térmico e os plasmídeos nas células foram extraídos através do método alcalino. O plasmídeo extraído foi identificado após a digestão com enzimas de restrição SpeI e KasI, e clones positivos foram identificados por sequenciamento. Os resultados demonstraram que a sequência de nucleotídeos entre os sítios SpeI e KasI no vetor de expressão recombinante DBN100833 foi a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 26 na listagem de sequências, ou seja, a sequência de nucleotídeos ALT02M1-02.
[0189] O vetor de expressão recombinante DBN100832 contendo a sequência de nucleotídeos ALT02M2-02, o vetor de expressão recombinante DBN100831 contendo a sequência de nucleotídeos ALT02M3-02 e o vetor de expressão recombinante DBN100830 contendo a sequência de nucleotídeos ALT02-02 foram construídos de acordo com o método de construção do vetor de expressão recombinante DBN100833 contendo a sequência de nucleotídeos ALT02M1-02 conforme descrito acima. Os clones positivos foram verificados por sequenciamento, com os resultados mostrando que a sequência de nucleotídeos ALT02M2-02, sequência de nucleotídeos ALT02M3-02 e sequência de nucleotídeos ALT02-02 inseridas nas DBN100832, DBN100831 e DBN100830 foram as sequências de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 22 na listagem de sequências respectivamente, a saber, a sequência de nucleotídeos ALT02M2-02, a sequência de nucleotídeos ALT02M3-02 e a sequência de nucleotídeos ALT02-02 foram inseridas corretamente.
[0190] De acordo com o método para a construção do vetor de expressão recombinante DBN100833 contendo a sequência de nucleotídeo ALT02M1-02 como descrito acima, um vetor de expressão recombinante de controle DBN100830N foi construído, cuja estrutura é como mostrado na Figura 7 (estrutura principal do vetor: pCAMBIA2301 (que pode ser provido pela instituição CAMBIA); Espec: o gene de espectinomicina; RB: o limite direito; prUbi: o promotor do gene Ubiquitina 1 do milho (SEQ ID NO: 78); PMI: o gene de fosfomanose isomerase (SEQ ID NO: 79); tNos: o terminador de um gene de nopalina sintase (SEQ ID NO:70); LB: o limite esquerdo). Clones positivos foram verificados por sequenciamento, sendo que os resultados demonstram que o vetor de expressão recombinante de controle DBN100830N foi corretamente construído.
3. Transformação de Agrobacterium com os vetores de expressão recombinante para milho
[0191] Agrobacterium LBA4404 (Invitrogen, Chicago, EUA, CAT: 18313-015) foi transformado com os vetores de expressão recombinante DBN100833, DBN100832, DBN100831, DBN100830 e DBN100830N que foram construídos corretamente usando um método de nitrogênio líquido, sob as condições de transformação a seguir: colocação de 100 μL de Agrobacterium LBA4404 e 3 μL de DNA de plasmídeo (vetor de expressão recombinante) em nitrogênio líquido por 10 minutos e aquecimento em banho-maria a 37 °C por 10 minutos; inoculação do LBA4404 de Agrobacterium transformado em um tubo LB, cultura sob as condições de uma temperatura de 28 °C e uma velocidade de rotação de 200 rpm por 2 horas, espalhamento em uma placa LB contendo 50 mg/L de rifampicina e 50 mg/L de espectinomicina até que clones únicos positivos fossem desenvolvidos, seleção de clones únicos para a cultura e extração dos plasmídeos destes e realização da verificação da digestão de enzimas usando enzimas de restrição. Os resultados demonstraram que as estruturas dos vetores de expressão recombinantes DBN100833, DBN100832, DBN100831, DBN100830 e DBN100830N estavam completamente corretos.
Exemplo 8. Aquisição e verificação de plantas de milho transgênicas
1. Aquisição de plantas de milho transgênicas
[0192] De acordo com o método de infecção por Agrobacterium convencionalmente usado, embriões jovens de variedade de milho cultivada de modo estéril Zong31 (Z31) foram co-cultivados com o Agrobacterium na Parte 3 do Exemplo 7, de modo a introduzir T-DNA (incluindo a sequência do promotor do gene Ubiquitina 1 do milho, sequência de nucleotídeo ALT02M1-02, sequência de nucleotídeo ALT02M2-02, sequência de nucleotídeo ALT02M3-02 e sequência de nucleotídeo ALT02-02, o gene PMI e a sequência terminadora tNos) nos vetores de expressão recombinante DBN100833, DBN100832,
DBN100831, DBN100830 e DBN100830N construídos na Parte 2 do Exemplo 7 no conjunto de cromossoma do milho, dessa forma, obtendo plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M1-02 foi introduzida, plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M2-02 foi introduzida, plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M3-02 foi introduzida e plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02-02 foi introduzida; enquanto isso, as plantas de milho de controle dentro das quais T-DNA no vetor de expressão recombinante de controle DBN100830N foi introduzido e plantas de milho do tipo selvagem foram usadas como o controle.
[0193] No que se refere à transformação do milho mediada por Agrobacterium, em resumo, embriões jovens imaturos foram separados do milho e contatados com uma suspensão de Agrobacterium, em que o Agrobacterium pode transferir a sequência de nucleotídeo ALT02M1-02 (sequência de nucleotídeo ALT02M2-02, sequência de nucleotídeo ALT02M3-02 ou sequência de nucleotídeo ALT02-02) para pelo menos uma célula de um dos embriões jovens (etapa 1: a etapa de infecção). Nesta etapa, os embriões jovens foram preferivelmente imersos em uma suspensão de Agrobacterium (OD660 = 0,4-0,6, um meio de cultura de infecção (4,3 g/L de sal MS, vitamina MS, 300 mg/L de caseína, 68,5 g/L de sacarose, 36 g/L de glicose, 40 mg/L de acetossiringona (AS) e 1 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), com um pH de 5,3)) para iniciar a inoculação. Os embriões jovens foram co-cultivados com Agrobacterium por um período de tempo (3 dias) (etapa 2: a etapa de co-cultura). Preferivelmente, os embriões jovens foram cultivados em um meio de cultura sólido (4,3 g/L de sal MS, vitamina MS, 300 mg/L de caseína, 20 g/L de sacarose, 10 g/L de glicose, 100 mg/L de acetossiringona (AS), 1 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e 8 g/L de ágar, com um pH de 5,8) após a etapa de infecção. Após esse estágio de co-cultivo, pode haver uma etapa de “recuperação” opcional. Na etapa de “recuperação”, pode haver pelo menos um antibiótico (cefalosporina) conhecido por inibir o crescimento de Agrobacterium em um meio de cultura de recuperação (4,3 g/L de sal MS, vitamina MS, 300 mg/L de caseína, 30 g/L de sacarose, 1 mg/L de 2,4-D e 3 g/L de fitagel, com um pH de 5,8), sem a adição de um agente seletivo para uma transformante de planta (etapa 3: a etapa de recuperação). Preferivelmente, os embriões jovens foram cultivados em um meio de cultura sólido com um antibiótico, mas sem um agente seletivo a fim de eliminar Agrobacterium e prover um estágio de recuperação para as células infectadas. Subsequentemente, os embriões jovens inoculados foram cultivados em um meio de cultura contendo um agente seletivo (manose) e calos transformados crescentes foram selecionados (etapa 4: a etapa de seleção). Preferivelmente, os embriões jovens foram cultivados em um meio de cultura sólido de triagem (4,3 g/L de sal MS, vitamina MS, 300 mg/L de caseína, 30 g/L de sacarose, 12,5 g/L de manose, 1 mg/L de 2,4-D e 3 g/L de fitagel, com um pH de 5,8) com um agente seletivo, resultando no crescimento seletivo de células transformadas. Então, as plantas foram regeneradas a partir dos calos (etapa 5: a etapa de regeneração). Preferivelmente, os calos desenvolvidos em um meio de cultura contendo um agente seletivo foram cultivados em meios de cultura sólidos (um meio de cultura de diferenciação MS e meio de cultura de enraizamento MS) para regenerar as plantas.
[0194] Os calos resistentes obtidos de triagem foram transferidos para o meio de cultura de diferenciação MS (4,3 g/L de sal MS, vitamina MS, 300 mg/L de caseína, 30 g/L de sacarose, 2 mg/L de 6-benziladenina, 5 g/L de manose e 3 g/L de fitagel, com um pH de 5,8) e cultivados a 25 °C para diferenciação. As mudas diferenciadas foram transferidas para o meio de cultura de enraizamento MS (2,15 g/L de sal MS, vitamina MS, 300 mg/L de caseína, 30 g/L de sacarose, 1 mg/L de ácido indol-3-acético e 3 g/L de fitagel, com um pH de 5,8), cultivadas a 25 °C até uma altura de cerca de 10 cm e transferidas para uma estufa para a cultura até a frutificação. Na estufa, as plantas foram cultivadas a 28 º por 16 horas e, então, cultivadas a 20 º por 8 horas todos os dias.
2. Verificação das plantas de milho transgênicas usando TaqMan
[0195] A planta de milho dentro da qual a sequência de nucleotídeo ALT02M1-02 foi introduzida, a planta de milho dentro da qual a ALT02M2-02 foi introduzida, a planta de milho dentro da qual a ALT02M3-02 foi introduzida, a planta de milho dentro da qual a ALT02-02 foi introduzida e a planta de milho de controle foram detectadas e analisadas de acordo com o método para verificação de plantas de soja transgênicas com TaqMan como descrito na parte 2 do Exemplo 5. O número de cópias do gene PMI foi detectado pelo método de PCR quantitativa por fluorescência de sonda Taqman de modo a determinar o número de cópias do gene alvo. Enquanto isso, plantas de milho do tipo selvagem foram usadas como o controle e detectadas e analisadas de acordo com o método mencionado acima. Repetições triplas foram definidas para os experimentos e suas médias determinadas.
[0196] Os seguintes iniciadores e sonda foram usados para detectar a sequência de gene PMI:
[0197] iniciador 7: GCTGTAAGAGCTTACTGAAAAAATTAACA como mostrado na SEQ ID NO: 80 na listagem de sequências;
[0198] iniciador 8: CGATCTGCAGGTCGACGG como mostrado na SEQ ID NO: 81 na listagem de sequências;
[0199] sonda 2: TCTCTTGCTAAGCTGGGAGCTCGATCC como mostrado na SEQ ID NO: 82 na listagem de sequências.
[0200] Foi ainda demonstrado, pela análise dos resultados experimentais do número de cópias de gene PMI, que a sequência de nucleotídeo ALT02M1-02, a sequência de nucleotídeo ALT02M2-02, a sequência de nucleotídeo ALT02M3-02 e a sequência de nucleotídeo ALT02-02 tinham todos sido integrados no conjunto do cromossoma das plantas de milho detectadas e todas as plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M1-02 foi introduzida, as plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M2-02 foi introduzida, as plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M3-02 foi introduzida, as plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02-02 foi introduzida e plantas de milho de controle resultaram em plantas de milho transgênicas de cópia única.
Exemplo 9. Detecção dos efeitos de tolerância a herbicida das plantas de milho transgênicas
[0201] O efeito da tolerância a herbicida tribenuron-metil foi detectado nas plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M1-02 foi introduzida, plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M2-02 foi introduzida, plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M3-02 foi introduzida, plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02-02 foi introduzida, plantas de milho de controle e plantas de milho do tipo selvagem (em estágios V3-V4), respectivamente.
[0202] As plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M1-02 foi introduzida, as plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M2-02 foi introduzida, as plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M3-02 foi introduzida, as plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02-02 foi introduzida, plantas de milho de controle e plantas de milho do tipo selvagem foram tomadas e pulverizadas com tribenuron-metil (144 g de ai/ha, concentração de campo oito vezes maior) ou um solvente em branco (água), respectivamente. O grau de dano causado pelo herbicida foi medido para cada planta de acordo com o status de crescimento da planta 3 dias após a pulverização (3 DAT), 7 dias após a pulverização (7 DAT), 14 dias após a pulverização (14 DAT) e 21 dias após a pulverização (21 DAT): um status de crescimento equivalente àquele das plantas não tratadas é definido como tendo um grau de dano de 0%; o caso onde folhas são localmente cloróticas e amarelas, mas o crescimento normal da planta é substancialmente não afetado, é definido como tendo um grau de dano de 50%; e o caso onde a planta inteira é roxa e a secagem é definida como tendo um grau de dano de 100%. As plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M1-02 foi introduzida foram de três cepas no total (S15, S16 e S17), as plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M2-02 foi introduzida foram de três cepas no total (S18, S19 e S20), as plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M3-02 foi introduzida foram de três cepas no total (S21, S22 e S23), as plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02-02 foi introduzida foram de três cepas no total (S24, S25 e S26), as plantas de milho de controle foram de duas cepas no total (S27 e S28) e as plantas de milho do tipo selvagem foram de uma cepa no total (CK2); e 10-15 plantas foram selecionadas de cada cepa e testadas. Os resultados foram conforme mostrados na Tabela 3 e na Figura 8.
Tabela 3. Resultados experimentais da tolerância a herbicida de plantas T1 de milho transgênicas Tratamento Genótipos Dano Dano Dano Dano de soja médio % médio % médio % médio % 3DAT 7DAT 14DAT 21DAT S15 0 0 0 0 S16 0 0 0 0 S17 0 0 0 0 S18 0 0 0 0 S19 0 0 0 0 S20 0 0 0 0 Solvente em S21 0 0 0 0 branco S22 0 0 0 0 (água) S23 0 0 0 0 S24 0 0 0 0 S25 0 0 0 0 S26 0 0 0 0 S27 0 0 0 0 S28 0 0 0 0 CK2 0 0 0 0 144 g ai/ha S15 5 0 0 0 tribenuron- S16 6 0 0 0 metil S17 3 0 0 0
(8x Tri.) S18 0 0 0 0 S19 0 0 0 0 S20 0 0 0 0 S21 3 0 0 0 S22 2 0 0 0 S23 0 0 0 0 S24 14 5 0 0 S25 15 4 0 0 S26 20 7 0 0 S27 61 82 100 100 S28 53 78 100 100 CK2 46 86 100 100
[0203] Para o milho, a concentração de campo oito vezes maior de tribenuron-metil é uma dose eficaz para o tratamento de alta pressão. Os resultados na Tabela 3 e Figura 8 mostraram que as proteínas tolerantes a herbicida ALT02M1-02, ALT02M2-02, ALT02M3-02 e ALT02-02 todas podem conferir plantas de milho transgênicas com a tolerância a ácido benzenossulfônico; comparado com as plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02-02 foi introduzida, todas as plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M1-02 foi introduzida, as plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M2-02 foi introduzida e as plantas de milho dentro das quais a sequência de nucleotídeo ALT02M3-02 foi introduzida tinham uma tolerância a ácido benzenossulfônico significativamente aumentada; enquanto as plantas de milho de controle e as plantas de milho do tipo selvagem não tinham qualquer tolerância a ácido benzenossulfônico.
[0204] Em conclusão, a proteína tolerante a herbicida ALT01 da presente invenção pode exibir uma maior tolerância a herbicidas de sulfonilureia, particularmente tribenuron-metil quando sua sequência de aminoácido é mutada na posição 176 de glicina a alanina e/ou na posição 178 de serina a valina (tal como as proteínas tolerantes a herbicida ALT01M1, ALT01M2 ou
ALT01M3); a proteína tolerante a herbicida ALT02 (ou ALT03) pode exibir uma maior tolerância a herbicidas de sulfonilureia, particularmente tribenuron-metil quando sua sequência de aminoácido é mutada na posição 140 de glicina a alanina e/ou na posição 142 de serina a valina (tal como as proteínas tolerantes a herbicida ALT02M1, ALT02M2, ALT02M3, ALT03M1, ALT03M2 ou ALT03M3); a proteína tolerante a herbicida ALT04 pode exibir uma maior tolerância a herbicidas de sulfonilureia, particularmente tribenuron-metil quando sua sequência de aminoácido é mutada na posição 131 de glicina a alanina e/ou na posição 133 de serina a valina (tal como as proteínas tolerantes a herbicida ALT04M1, ALT04M2 ou ALT04M3). Além disso, os genes de codificação das proteínas tolerantes a herbicida, mencionadas acima, são particularmente adequados para a expressão em plantas devido ao uso dos códons de plantas preferidos. As plantas de soja e milho dentro das quais as proteínas tolerantes a herbicida mencionadas acima são introduzidas têm uma forte tolerância a herbicidas de sulfonilureia e podem tolerar tribenuron-metil de uma concentração de campo oito vezes maior, particularmente. Portanto, as proteínas tolerantes a herbicida mencionadas acima têm uma perspectiva de aplicação ampla em plantas.
[0205] Finalmente, deve ser determinado que os exemplos acima são usados meramente para a ilustração, em vez de limitação, a solução técnica da presente invenção; e embora a presente invenção foi descrita em detalhes com referência aos exemplos preferidos, um técnico no assunto deve entender que modificações ou substituições equivalentes podem ser feitas na solução técnica da presente invenção sem se afastar do espírito e escopo da solução técnica da presente invenção.

Claims (15)

Reivindicações
1. Proteína tolerante a herbicida, caracterizada pela proteína tolerante a herbicida compreender: (a) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 1, e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 176 e/ou uma substituição de valina na posição 178 da SEQ ID NO: 1; ou (b) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 19, e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 140 e/ou uma substituição de valina na posição 142 da SEQ ID NO: 19; ou (c) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 35, e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 140 e/ou uma substituição de valina na posição 142 da SEQ ID NO: 35; ou (d) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 51, e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 131 e/ou uma substituição de valina na posição 133 da SEQ ID NO: 51; ou (e) uma proteína que é derivada de (a) até (d) pela substituição e/ou deleção e/ou adição de um ou mais aminoácidos nas sequências de aminoácidos de (a) até (d), e possui atividade de tifensulfuron hidrolase; preferivelmente, a proteína tolerante a herbicida compreende: (f) uma sequência de aminoácidos de (a), em que a sequência de aminoácidos de (a) tem uma substituição de arginina na posição 80 e/ou uma substituição de alanina na posição 81 e/ou uma substituição de arginina na posição 182 da SEQ ID NO: 1; ou (g) uma sequência de aminoácidos de (b), em que a sequência de aminoácidos de (b) tem uma substituição de arginina na posição 44 e/ou uma substituição de alanina na posição 45 e/ou uma substituição de arginina na posição 146 da SEQ ID NO: 19; ou (h) uma sequência de aminoácidos de (c), em que a sequência de aminoácidos de (c) tem uma substituição de arginina na posição 44 e/ou uma substituição de alanina na posição 45 e/ou uma substituição de arginina na posição 146 da SEQ ID NO: 35; ou (i) uma sequência de aminoácidos de (d), em que a sequência de aminoácidos de (d) tem uma substituição de arginina na posição 35 e/ou uma substituição de alanina na posição 36 e/ou uma substituição de valina na posição 137 da SEQ ID NO: 51; ou (j) uma proteína que é derivada de (a) até (d) pela substituição e/ou deleção e/ou adição de um ou mais aminoácidos nas sequências de aminoácidos de (f) até (i), e possui atividade de tifensulfuron hidrolase; preferivelmente, a proteína tolerante a herbicida compreende: (k) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 15; ou (l) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 31; ou (m) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 47; ou (n) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59 ou SEQ ID NO: 63.
2. Gene tolerante a herbicida, caracterizado pelo gene tolerante a herbicida compreender: (o) uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína tolerante a herbicida conforme definida na reivindicação 1; ou (p) uma sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17 ou 18; ou (q) uma sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 33 ou 34; ou
(r) uma sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 40, 41, 42, 44, 45, 46, 48, 49 ou 50.
3. Cassete de expressão, em que o cassete de expressão é caracterizado por compreender o gene tolerante a herbicida, conforme definido na reivindicação 2, sob a regulação de uma sequência regulatória eficazmente ligada.
4. Vetor recombinante, caracterizado por compreender o gene tolerante a herbicida, conforme definido na reivindicação 2, ou o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 3.
5. Método para produzir uma proteína tolerante a herbicida, caracterizado por compreender: - obtenção de uma célula de um organismo hospedeiro transgênico contendo o gene tolerante a herbicida, conforme definido na reivindicação 2, ou o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 3; - cultivo da célula do organismo hospedeiro transgênico sob condições que permitem a produção de uma proteína tolerante a herbicida; e - recuperação da proteína tolerante a herbicida; preferivelmente, o organismo hospedeiro transgênico compreende plantas, animais, bactérias, leveduras, baculovírus, nematódeos ou algas.
6. Método para aumentar as faixas de tolerância a herbicida, caracterizado por compreender: co-expressão da proteína tolerante a herbicida, conforme definida na reivindicação 1, ou da proteína tolerante a herbicida codificada pelo cassete de expressão conforme definido na reivindicação 3, em uma planta com pelo menos uma segunda proteína que é diferente da proteína tolerante a herbicida, conforme definida na reivindicação 1, ou da proteína tolerante a herbicida codificada pelo cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 3; preferivelmente, a segunda proteína é 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase, glifosato oxidorredutase, glifosato-N-acetiltransferase, glifosato descarboxilase, glufosinato acetiltransferase, dioxigenase dependente de α-cetoglutarato, dicamba monooxigenase, 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase, acetolactate sintase, proteínas do tipo citocromo e/ou protoporfirinogênio oxidase.
7. Método para selecionar células de planta transformadas, caracterizado por compreender: transformação de uma pluralidade de células de planta com o gene tolerante a herbicida, conforme definido na reivindicação 2, ou com o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 3, e cultivo das células sob uma concentração de herbicida que permite o crescimento das células transformadas que expressam o gene tolerante a herbicida ou o cassete de expressão, enquanto elimina-se as células não transformadas ou inibe-se o crescimento das células não transformadas, em que o herbicida é um herbicida de sulfonilureia.
8. Método para controle de ervas daninhas, caracterizado por compreender: aplicação de uma dose eficaz de um herbicida de sulfonilureia a um campo para o plantio de uma planta-alvo, em que a planta contém o gene tolerante a herbicida, conforme definido na reivindicação 2, ou o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 3; preferivelmente, o método para controle de ervas daninhas compreende a aplicação de uma dose eficaz de um herbicida de sulfonilureia a um campo para o plantio de uma planta tolerante ao glifosato, em que a planta tolerante ao glifosato contém o gene tolerante a herbicida, conforme definido na reivindicação 2, ou o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 3, em que a erva daninha é uma erva daninha resistente ao glifosato.
9. Método para proteger uma planta contra danos causados por herbicidas de sulfonilureia ou para conferir tolerância a um herbicida de sulfonilureia a uma planta ou para produzir uma planta tolerante a herbicida de sulfonilureia, caracterizado por compreender a introdução do gene tolerante a herbicida, conforme definido na reivindicação 2, do cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 3 ou do vetor recombinante, conforme definido na reivindicação 4, em uma planta para fazer com que a planta resultante produza uma quantidade suficiente de proteínas tolerantes a herbicida para proteger a planta contra danos causados por herbicidas de sulfonilureia.
10. Método para cultivar uma planta tolerante a herbicida de sulfonilureia, caracterizado por compreender: - plantio de pelo menos um propágulo de planta, cujo genoma contém o gene tolerante a herbicida, conforme definido na reivindicação 2, ou o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 3; - permitir que o propágulo de planta cresça em uma planta; e - aplicação de uma dose eficaz de um herbicida de sulfonilureia ao ambiente de crescimento de uma planta compreendendo pelo menos a planta, e colheita da planta que apresenta danos reduzidos e/ou um maior rendimento de planta em comparação com outras plantas que não contêm o gene tolerante a herbicida, conforme definido na reivindicação 2, ou o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 3.
11. Sistema de plantio para controlar o crescimento de ervas daninhas, em que o sistema de plantio é caracterizado por compreender um herbicida de sulfonilureia e um ambiente de crescimento de planta no qual existe pelo menos uma planta-alvo, em que a planta contém o gene tolerante a herbicida, conforme definido na reivindicação 2, ou o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 3; preferivelmente, o sistema de plantio para controlar o crescimento de ervas daninhas compreende um herbicida de sulfonilureia, um herbicida de glifosato e um campo para o plantio de pelo menos uma planta tolerante ao glifosato, em que a planta tolerante ao glifosato contém o gene tolerante a herbicida, conforme definido na reivindicação 2, ou o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 3, em que a erva daninha é uma erva daninha resistente ao glifosato.
12. Método ou sistema de plantio, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pela planta ser milho, soja, Arabidopsis thaliana, algodão, colza, arroz, sorgo, trigo, cevada, milhete, cana-de-açúcar ou aveias.
13. Método ou sistema de plantio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizado pelo herbicida de sulfonilureia ser tribenuron-metil, sulfometuron-metil, halosulfuron-metil, pirazosulfuron-etil, tifensulfuron-metil, bensulfuron-metil, metsulfuron-metil, etametsulfuron-metil ou clorimuron-etil.
14. Uso de uma proteína tolerante a herbicida para degradar herbicidas de sulfonilureia, em que a proteína tolerante a herbicida é caracterizada por compreender: (1) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 1, e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 176 e/ou uma substituição de valina na posição 178 da SEQ ID NO: 1; ou (2) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 19, e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 140 e/ou uma substituição de valina na posição 142 da SEQ ID NO: 19; ou (3) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 35, e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 140 e/ou uma substituição de valina na posição 142 da SEQ ID NO: 35; ou (4) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 51, e pelo menos tendo uma substituição de alanina na posição 131 e/ou uma substituição de valina na posição 133 da SEQ ID NO: 51; ou (5) uma proteína que é derivada de (1) até (4) pela substituição e/ou deleção e/ou adição de um ou mais aminoácidos nas sequências de aminoácidos de (1) até (4), e possui atividade de tifensulfuron hidrolase; preferivelmente, a proteína tolerante a herbicida compreende: (6) uma sequência de aminoácidos de (1), em que a sequência de aminoácidos de (1) tem uma substituição de arginina na posição 80 e/ou uma substituição de alanina na posição 81 e/ou uma substituição de arginina na posição 182 da SEQ ID NO: 1; ou (7) uma sequência de aminoácidos de (2), em que a sequência de aminoácidos de (2) tem uma substituição de arginina na posição 44 e/ou uma substituição de alanina na posição 45 e/ou uma substituição de arginina na posição 146 da SEQ ID NO: 19; ou (8) uma sequência de aminoácidos de (3), em que a sequência de aminoácidos de (3) tem uma substituição de arginina na posição 44 e/ou uma substituição de alanina na posição 45 e/ou uma substituição de arginina na posição 146 da SEQ ID NO: 35; ou (9) uma sequência de aminoácidos de (4), em que a sequência de aminoácidos de (4) tem uma substituição de arginina na posição 35 e/ou uma substituição de alanina na posição 36 e/ou uma substituição de arginina na posição 137 da SEQ ID NO: 51; ou (10) uma proteína que é derivada de (6) até (9) pela substituição e/ou deleção e/ou adição de um ou mais aminoácidos nas sequências de aminoácidos de (6) até (9), e possui atividade de tifensulfuron hidrolase; preferivelmente, a proteína tolerante a herbicida compreende: (11) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 15; ou (12) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 31; ou (13) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 47; ou (14) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59 ou SEQ ID NO: 63.
15. Uso de uma proteína tolerante a herbicida para degradar herbicidas de sulfonilureia, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelos herbicidas de sulfonilureia serem tribenuron-metil, sulfometuron-metil, halosulfuron-metil,
pirazosulfuron-etil, tifensulfuron-metil, bensulfuron-metil, metsulfuron-metil, etametsulfuron-metil ou clorimuron-etil.
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