BR102013033373A2 - Proteína resistente a herbicida, gene resistente a herbicida, cassete de expressão, vetor recombinante, célula hospedeira transgênica, método para produzir uma proteína resistente a herbicida, método para ampliar a faixa-alvo de herbicidas, método para selecionar células vegetais transformadas, método para controlar plantas daninhas e método para proteger plantas do dano causado por herbicidas - Google Patents

Abstract

Proteína resistente a herbicida, gene resistente a herbicida, cassete de expressão, vetor recombinante, célula hospedeira transgênica, método para produzir uma proteína resistente a herbicida, método para ampliar a faixa-alvo de herbicidas, método para selecionar células vegetais transformadas, método para controlar plantas daninhas e método para proteger plantas do dano causado por herbicidas. A presente invenção refere-se a uma proteína resistente a herbicida, ao gene codificador e ao uso destes. A proteína resistente a herbicida compreende: (a) uma proteína consistindo em uma sequência de aminoácidos mostrada na seq id no: 2; ou (b) uma proteína consistindo em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% idênticos àquela apresentada na seq id no: 2. A proteína resistente a herbicida desta invenção é especialmente adequada para a expressão em plantas, com amplo espectro de resistência a herbicidas, especialmente a herbicidas de fenóxi auxina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNA RESISTENTE A HERBICIDA, GENE RESISTENTE A HERBICIDA, CASSETE DE EXPRESSÃO, VETOR RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSGÊNICA, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA RESISTENTE A HERBICIDA, MÉTODO PARA AMPLIAR A FAIXA-ALVO DE HERBICIDAS, MÉTODO PARA SELECIONAR CÉLULAS VEGETAIS TRANSFORMADAS, MÉTODO PARA CONTROLAR PLANTAS DANINHAS E MÉTODO PARA PROTEGER PLANTAS DO DANO CAUSADO POR HERBICIDAS".

Campo Técnico A presente invenção diz respeito a uma proteína resistente a herbicida, ao gene codificador e ao uso destes, especialmente uma proteína resistente ao 2,4-D, o gene codificador e o uso destes.

Antecedentes da invenção As plantas daninhas podem esgotar rapidamente os nutrientes valiosos para o solo necessários para o crescimento de culturas e de outras plantas planejadas. Existem muitos tipos de herbicidas atualmente para o controle de plantas daninhas e, entre estes, um herbicida especialmente popular é o glifosato. Culturas resistentes ao glifosato, tais como de milho, soja, algodão, beterraba, trigo e arroz, e as semelhantes foram desenvolvidas. Assim, é possível pulverizar glifosato nos campos plantados com culturas resistentes ao glifosato para controle de plantas daninhas sem provocar danos significativos à colheita. O glifosato vem sendo amplamente utilizado em todo mundo há mais de 20 anos, resultando na dependência excessiva à tecnologia do glifosato e em culturas tolerantes ao glifosato. Além disso, a alta pressão imposta provocou a seleção de plantas naturalmente mais tolerantes ao glifosato entre as espécies de ervas daninhas ou das plantas do tipo selvagem que desenvolveram resistência à atividade do glifosato. Há relatos de que algumas plantas daninhas desenvolveram resistência ao glifosato, inclusive plantas daninhas de folhas largas (latifoliadas) e plantas daninhas gramíneas como Swiss ryegrass, Lolium multiflorum, Eleusine indica, Ambrosia artemi- siifolia, Conyza canadensis, Conyza bonaríensis e Plantago lanceolata. Além disso, as plantas daninhas, que não constituem o problema agrícola antes do uso disseminado de culturas tolerantes ao glifosato, também gradualmente prevaleceram, e são difíceis de serem controladas com culturas tolerantes ao glifosato. Estas plantas daninhas existem principalmente junto com (mas não apenas com elas) plantas daninhas de folhas largas que são difíceis de serem controladas, como as plantas das espécies Amaranthus, Chenopodi-um, Taraxacum e Commelinaceae.

Na área de plantas daninhas resistentes ao glifosato ou das espécies de plantas daninhas cujo controle é difícil, os agricultores podem compensar a perda de eficácia do glifosato misturando-o no tanque ou utilizando também outro herbicida que seja capaz de controlar as plantas daninhas omitidas. Na maioria dos casos, um parceiro popular e eficaz da mistura no tanque, utilizado para controlar plantas daninhas de folhas largas, é o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Há mais de 65 anos, 2,4-D tem sido utilizado para controlar um amplo espectro de plantas daninhas de folhas largas na agricultura e em condições não ligadas a culturas, e é ainda um dos herbicidas mais amplamente usados no mundo. Uma limitação ao uso adicional de 2,4-D é sua seletividade muito baixa em plantas dicotiledôneas (como soja ou algodão). Portanto, em geral, 2,4-D não é usado em plantas dicotiledôneas que sejam sensíveis (e geralmente nem em suas proximidades). Adicionalmente, o uso de 2,4-D em culturas de gramíneas é limitado em certa medida por sua capacidade de provocar dano potencial à cultura. A combinação do 2,4-D com glifosato já foi utilizada para fortalecer o processo de esterilização antes do plantio direto de grãos de soja e de algodão. Contudo, em decorrência da sensibilidade destas espécies dicotiledôneas ao 2,4-D, estes processos de esterilização precisam ser realizados 14 a 30 dias antes do plantio.

Tal qual MCPA, ácido 2-metil-4-cloropropionico e ácido 2,4-D propiônico, 2,4-D é também um herbicida derivado de ácido fenóóxi alcanoi-co. O 2,4-D é usado para controlar seletivamente plantas daninhas de folhas largas em muitas culturas monocotiledôneas, como milho, trigo e arroz, sem dano sério às culturas desejadas. O 2,4-D é um derivado auxínico sintético, cuja função é desregular a homeostase normal entre a célula e os hormônios e impedir o crescimento equilibrado e controlado. O 2,4-D mostra diferentes níveis de seletividade em certas plantas (por exemplo, plantas dicotiledôneas são mais sensíveis do que plantas gramíneas). As diferenças no metabolismo do 2,4-D entre plantas distintas explicam em parte os níveis de seletividade. Em geral, as plantas o metabo-lizam lentamente. Assim, as diferenças na resposta ao 2,4-D provavelmente podem ser explicadas pela atividade diferente nos sítios-alvo. A metaboliza-ção de 2,4-D nas plantas ocorre usualmente em duas etapas, ou seja, a conjugação com aminoácido ou glicose seguida pela hidroxilação em geral.

Com o passar do tempo, as populações microbianas gradualmente desenvolveram vias alternativas eficazes para degradar esta substância estranha específica, que resultam na mineralização completa de 2,4-D. As aplicações contínuas de herbicidas em micróbios podem ser utilizadas para selecionar os microrganismos que são capazes de empregar herbicidas como fonte de carbono de modo a conferir-lhes uma vantagem competitiva no solo. Por esse motivo, o 2,4-D é atualmente formulado com período relativamente curto de meia-vida e sem efeito residual detectável nas culturas seguintes, o que promove sua aplicação como herbicida.

Ralstonia eutropha é um organismo cuja capacidade para degradar 2,4-D foi bastante estudada. O gene que codifica a enzima da primeira reação enzimática na via de mineralização é o tfdA. O tfdA catalisa a conversão de ácido 2,4-D em diclorofenol (DCP) por uma reação mediada por dioxigenase dependente de α-oxoglutarato. O DCP quase não tem atividade herbicida em comparação com o 2,4-D. O gene tfdA foi inserido em plantas dicotiledôneas que são sensíveis para introduzir a resistência ao 2,4-D (como algodão e tabaco) e criar plantas transgênicas.

Foi identificada uma série de genes do tipo tfdA que codificam proteínas capazes de degradar 2,4-D no meio ambiente. Muitos homólogos são similares ao tfdA (identidade de aminoácidos > 85%) e possuem atividade enzimática semelhante à exibida pelo tfdA. Contudo, um grande número de homólogos possui uma identidade significativamente menor (25-50%) com o tfdA embora contenham resíduos característicos associados com as Fe2+dioxigenases e as dioxigenases dependentes de α-oxoglutarato. Portanto, não são evidentes quais são as especificidades de substrato destas diferentes dioxigenases. Um único exemplo de baixa homologia com o tfdA (i-dentidade de aminoácidos de 28%) é o gene rdpA de Sphingobium herbici-dovorans. Foi demonstrado que esta enzima catalisa a primeira etapa na mineralização do ácido (R)-2,4-D propiônico (e outros ácidos (R)-fenóxi pro-piônicos) e do ácido 2,4-D fenoxiacético.

Com o surgimento de plantas daninhas resistentes ao glifosato e a aplicação ampliada do herbicida 2,4-D, é necessário introduzir a resistência ao 2,4-D nas plantas desejadas sensíveis a este herbicida. Até o momento, não foram encontrados relatos sobre os níveis de expressão da proteína 24DT07 resistente a herbicida em plantas e sobre a sua tolerância a herbicidas.

Sumário O objetivo da presente invenção é prover uma proteína resistente a herbicida, o gene codificador e o uso destes. A presente invenção tem como intenção prover um novo gene 24DT07 que tenha maior tolerância aos herbicidas em plantas.

Em um aspecto, a presente invenção provê uma proteína resistente a herbicida, que compreende: (a) uma proteína constituída por uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2; ou (b) uma proteína com a atividade de alcanoato arilóxi dioxigenase que é derivada a partir da sequência de aminoácidos em (a) substituindo e/ou excluindo e/ou adicionando um ou diversos aminoácidos na mesma; ou (c) uma proteína constituída por uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% idênticos à apresentada na SEQ ID NO: 2.

Em alguma concretização, a referida proteína resistente a herbicida é uma proteína constituída por uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% idênticos à apresentada na SEQ ID NO: 2.

Em alguma concretização, a referida proteína resistente a herbicida é uma proteína constituída por uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% idênticos à apresentada na SEQ ID NO: 2.

Em um aspecto, a presente invenção provê um gene resistente a herbicida, que compreende: (a) uma sequência de nucleotídeos que codifica a referida proteína resistente a herbicida; ou (b) uma sequência de nucleotídeos capaz de se hibridizar com a sequência de nucleotídeos conforme definida em (a) em condições rigorosas e que codifica uma proteína com a atividade de arilóxi alcanoato dioxigenase; ou (c) a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1.

As condições rigorosas poderíam ser as seguintes: hibridização em 6*SSC (citrato de sódio), solução de SDS 0,5% (sulfato de dodecil de sódio) a 65 °C e seguida por lavagem uma vez da membrana utilizando 2><SSC, SDS 0,1% e 1*SSC, SDS 0,1%, respectivamente.

Em outro aspecto, a presente invenção também provê um cassete de expressão que compreende o referido gene resistente a herbicida sob a regulação de uma sequência regulatória operacionalmente ligada.

Em um aspecto, a presente invenção provê ainda um vetor re-combinante, que compreende o referido gene resistente a herbicida ou o referido cassete de expressão.

Em outro aspecto, a presente invenção provê ainda uma célula hospedeira transgênica que compreende o referido gene resistente a herbicida ou o cassete de expressão, em que a referida célula hospedeira transgênica compreende células vegetais, células animais, bactérias, leveduras, baculovírus, nematódeos ou algas. Em algumas concretizações, o hospedeiro transgênico poderia ser selecionado a partir do grupo constituído por planta, animal, bactérias, leveduras, baculovírus, nematódeos ou algas.

Em alguma concretização, o referido hospedeiro transgênico é uma planta selecionada a partir do grupo constituído por soja, algodão, milho, arroz, trigo, beterraba e cana de açúcar.

Em um aspecto, a presente invenção provê ainda a método pa- ra produzir uma proteína resistente a herbicida, compreendendo as etapas de: obter as células hospedeiras transgênicas; cultivar as células hospedeiras transgênicas sob as condições que permitem a produção da proteína resistente a herbicida; e recuperar a proteína resistente a herbicida.

Em um aspecto, a presente invenção também provê um método para ampliar a faixa planejada de herbicidas, compreendendo uma etapa de coexpressar o nucleotídeo que codifica a referida proteína resistente a herbicida ou o cassete de expressão com pelo menos um segundo nucleotídeo que codifica uma proteína resistente a herbicida diferente da proteína resistente a herbicida conforme descrita acima ou da referida proteína resistente a herbicida codificada pelo cassete de expressão.

Em alguma concretização, o referido segundo nucleotídeo codifica proteína resistente ao glifosato, proteína resistente ao glufosinato de amônio, 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase, aceto-hidroxiácido sintase, proteína de citocromo ou protoporfirinogênio oxidase.

Alternativamente, o referido segundo nucleotídeo é um dsRNA que inibe genes importantes em inseto praga-alvo.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção provê uma célula hospedeira transgênica que coexpressa o nucleotídeo codificador da referida proteína resistente a herbicida ou o cassete de expressão com pelo menos um segundo nucleotídeo que codifica uma proteína resistente a herbicida diferente da proteína resistente a herbicida conforme descrita acima ou a referida proteína resistente a herbicida codificada pelo cassete de expressão.

Em alguma concretização, o referido segundo nucleotídeo codifica proteína resistente a glifosato, proteína resistente a glufosinato de amônio, 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase, aceto-hidroxiácido sintase, proteína de citocromo ou protoporfirinogênio oxidase.

Alternativamente, o referido segundo nucleotídeo é um dsRNA que inibe genes importantes em inseto praga-alvo.

Na presente invenção, a proteína resistente a herbicida 24DT07 é expressa em uma planta transgênica acompanhada pelas expressões de uma ou mais proteínas resistentes ao glifosato e/ou proteínas resistentes ao glufosinato de amônio. Tal coexpressão de mais de um tipo de proteína resistente a herbicida em uma mesma planta transgênica pode ser conseguida pela transfecção e expressão dos genes de interesse em plantas por meio de engenharia genética. Além disso, a proteína resistente a herbicida 24DT07 pode ser expressa em uma planta (Progenitor 1) por meio de operações de engenharia genética, e a proteína resistente ao glifosato e/ou proteína resistente ao glufosinato de amônia pode ser expressa em uma segunda planta (Progenitor 2) por meio de operações de engenharia genética. Plantas da progênie que expressam todos os genes do Progenitor 1 e Progenitor 2 podem ser obtidas cruzando o Progenitor 1 e o Progenitor 2. RNA interferência (RNAi) refere-se a um fenômeno altamente conservado e eficaz de degradação de mRNA homólogos específicos, induzido pelo RNA de fita dupla (dsRNA) durante a evolução. Portanto, a tecnologia do RNAi poderia ser aplicada para desativar (knock out) ou bloquear a expressão de um gene específico.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção também provê um método para selecionar células vegetais transformadas, compreendendo as etapas de transformar múltiplas células vegetais com o gene resistente a herbicida ou o cassete de expressão e cultivar as referidas células a uma concentração de herbicida que permita o crescimento das células transformadas que expressam o gene resistente a herbicida ou do cassete de expressão enquanto elimina as células não transformadas ou inibe o crescimento das células não transformadas, em que o herbicida é um fenóxi auxi-na.

Em um aspecto, a presente invenção também provê um método para controlar plantas daninhas, compreendendo uma etapa de aplicar uma quantidade eficaz de herbicidas ao campo plantado com culturas contendo o referido gene resistente a herbicida, o referido cassete de expressão ou o referido vetor recombinante.

Em alguma concretização, o herbicida é um fenóxi auxina.

Em outro aspecto, a presente invenção também provê um método para proteger plantas do dano causado por herbicidas, compreendendo a etapa de introduzir o referido gene resistente a herbicida, o referido cassete de expressão ou o referido vetor recombinante em plantas de tal modo que as plantas obtidas produzem certa quantidade de proteína resistente a herbicida suficiente para protegê-las do dano causado por herbicidas.

Em alguma concretização, o referido é um fenóxi auxina ou ari-lóxi fenóxi proprionato e as referidas plantas são selecionadas a partir do grupo constituído por soja, algodão, milho, arroz, trigo, beterraba e cana de açúcar.

Em um aspecto, a presente invenção também provê um método para controlar plantas daninhas resistentes ao glifosato em um campo plantado com plantas tolerantes ao glifosato, compreendendo uma etapa de aplicar uma quantidade eficaz de herbicidas ao campo plantado com plantas tolerantes ao glifosato que contêm o referido gene resistente a herbicida, o referido cassete de expressão ou o referido vetor recombinante.

Em alguma concretização, o referido herbicida é um fenóxi auxina e a referida planta tolerante ao glifosato é monocotiledônea ou dicotiledô-nea.

Em outro aspecto, a presente invenção também provê um método para conferir a culturas resistência a herbicidas 2,4-D, compreendendo as etapas de introduzir o referido gene resistente a herbicida, o referido cassete de expressão ou o referido vetor recombinante nas plantas.

Em alguma concretização, as referidas plantas são selecionadas a partir do grupo constituído por soja, algodão, milho, arroz, trigo, beterraba e cana de açúcar.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção está relacionada com um método para controlar plantas daninhas, compreendendo uma etapa de aplicar uma quantidade eficaz de herbicidas ao campo plantado com culturas que contêm o gene resistente a herbicida da presente invenção.

Em algumas concretizações, o gene resistente a herbicida é produzido por uma célula hospedeira transgênica selecionada a partir do grupo constituído por células vegetais, células animais, bactérias, leveduras, baculovírus, nematódeos e algas.

Em algumas concretizações, a planta é selecionada a partir do grupo constituído por soja, algodão, milho, arroz, trigo, beterraba e cana de açúcar.

Em algumas concretizações, o nucleotídeo codificador da proteína resistente a herbicida ou o gene resistente a herbicida é coexpresso na planta com pelo menos um segundo nucleotídeo que codifica uma proteína resistente a herbicida diferente daquela da presente invenção.

Em algumas concretizações, o referido segundo nucleotídeo codifica proteína resistente ao glifosato, proteína resistente ao glufosinato de amônio, 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase, acetolactato sintase, proteína de citocromos ou protoporfirinogênio oxidase.

Em algumas concretizações, o herbicida é fenóxi auxina. O gene resistente a herbicida, o referido cassete de expressão ou o referido vetor recombinante é introduzido em plantas. Os métodos convencionais empregados na presente invenção para introduzir DNA exógeno em células vegetais incluem, entre outros, a transfecção mediada por Agro-bacterium, bombardeamento de partículas, captação direta de DNA e transformação de protoplastos, eletroporação ou introdução de DNA mediada por silício.

Os genes de resistência ao 2,4-D e as culturas subsequentes com resistência de acordo com a presente invenção proporcionam uma boa escolha para controlar espécies de plantas daninhas latifoliadas com resistência ao glifosato (ou alta tolerância ou sucessão) nas culturas. O 2,4-D é um herbicida de amplo espectro, relativamente barato e poderoso contra plantas daninhas de folhas largas. Se uma tolerância mais forte pudesse ser conferida a culturas dicotiledôneas e monocotiledôneas, os agricultores poderíam contar com boa eficácia. Dicotiledôneas transgênicas tolerantes ao 2,4-D são também mais flexíveis em termos de tempo de aplicação e quantidade administrada. Outro uso para tolerância ao herbicida 2,4-D é que este atributo poderia ser utilizado para prevenir danos a culturas sensíveis normais como deriva de 2,4-D, volatilização, transformação (ou outro fenômeno de movimento remoto), uso inadequado, destruição e os semelhantes. Várias misturas de diferentes fenóxi auxinas têm sido amplamente utilizadas para tratar condições que envolvem o espectro específico de plantas daninhas e ambientais em áreas distintas. Usar o gene 24DT07 em plantas pode conferir proteção contra um herbicida de fenóxi auxina de espectro mais amplo de modo a melhorar a flexibilidade e o alcance controlável de plantas daninhas, além conferir proteção para a faixa completa de danos de deriva causados por herbicidas de fenóxi auxina comercialmente disponíveis ou de longa distância provocados por herbicidas fenóxi.

Os herbicidas fenóxi auxina são em geral formulados na forma de ácidos ativos, mas, em alguns preparados comerciais, a formulação é em forma de um éster entre diversos preparados de ésteres correspondentes. Tendo em vista que as esterases vegetais nas plantas podem convertê-los em ácidos ativos, estes ésteres são também considerados os substratos da enzima 24DT07 em plantas. Do mesmo modo, podem também ser os sais orgânicos ou inorgânicos dos ácidos correspondentes. Quando expressam ácido propiônico quiral, sal de ácido propiônico ou éster propiônico, os herbicidas, mesmo se com diferentes números CAS, podem corresponder a um composto opticamente puro. Na denominação dos herbicidas, ainda se considera que a mistura racêmica (R, S) ou o enantiômero opticamente puro (R ou S) é o mesmo herbicida. As faixas possíveis de doses são aquelas para tratamento isolado ou combinado com outros herbicidas nas aplicações em culturas ou não ligadas a colheitas.

Foi identificado que o gene 24DT07 possui as características que permite a aplicação do herbicida de fenóxi auxina em plantas depois de expressarem o gene 24DT07 construído por engenharia genética, nas quais a tolerância inerente não existe ou não é suficiente para permitir a aplicação destes herbicidas. Além do mais, o gene 24DT07 pode conferir proteção em herbicidas fenóxi auxina quando a tolerância natural não é suficiente para permitir a seletividade em plantas. Um herbicida de fenóxi auxina, dois ou diversos podem ser continuamente, ou misturados no tanque, combinados para tratar plantas que compreendem apenas o gene 24DT07. A faixa de dose de cada herbicida de fenóxi auxina utilizado para controlar o amplo espectro de plantas daninhas dicotiledôneas varia de 25 a 4000 g ae/ha, mais geralmente de 100 a 2000 g ae/ha. A combinação destes herbicidas pertencentes a classes químicas diferentes e com modos de ação distintos em um mesmo campo (continuamente ou misturados no tanque) pode controlar a maioria das plantas daninhas potenciais, cujo controle se pretende com os herbicidas.

Glifosato é amplamente empregado porque controla um espectro muito amplo de espécies de plantas daninhas de folhas largas e gramíneas. Contudo, o uso repetido do glifosato aplicado a culturas tolerantes ao glifosato e em aplicações não ligadas a culturas resultou seletivamente (e continuará a resultar) na sucessão das plantas daninhas para espécies com mais tolerância natural ou biotipo resistente ao glifosato. A maioria das estratégias para manejo de resistência a herbicidas recomenda usar uma quantidade eficaz de herbicidas parceiros misturados no tanque como uma maneira para retardar o aparecimento de plantas daninhas resistentes. Os herbicidas parceiros proporcionam o controle de uma mesma espécie, mas com modos de ação diferentes. A sobreposição do gene 24DT07 e do atributo de tolerância ao glifosato (e/ou outros atributos de tolerância a herbicidas) pode proporcionar o controle de espécies de plantas daninhas resistentes ao glifosato (espécies de plantas daninhas de folhas largas controladas por uma ou mais fenóxi auxinas) em culturas tolerantes ao glifosato, aplicando-se seletivamente glifosato e fenóxi auxina (como 2,4-D) nas mesmas culturas. As aplicações destes herbicidas poderiam ser o uso individual de uma única composição de herbicida em uma mistura no tanque, contendo dois ou mais herbicidas com diferentes modelos de ação simultaneamente ou em sequência (por exemplo, antes do plantio, antes da emergência de plântulas ou depois da emergência de plântulas) (o tempo de intervalo variou de 2 horas a 3 meses). Alternativamente, composições de qualquer número de herbicidas, representando todas as classes de composto, poderiam ser utilizadas em qualquer momento (do período de 7 meses depois do plantio até o momento da colheita (ou, em relação a um único herbicida, refere-se ao intervalo anterior à colheita no qual o período mais curto é selecionado)), Flexibilidade é muito importante no controle de plantas daninhas de folhas largas, ou seja, tempo de aplicação, dose de um único herbicida e a capacidade para controlar plantas daninhas recalcitrantes ou resistentes. A dose de glifosato que se sobrepõe com o gene resistente ao glifosato / gene 24DT07 pode variar de 250 a 2500 g ae/ha; a dose de herbicidas de fenóxi auxina (um ou mais) pode variar de 25 a 4000 g ae/ha, A combinação ideal do tempo de aplicação depende das condições específicas, da espécie e do ambiente.

As formulações do herbicida (como fórmulas de ésteres, ácidos ou sais ou concentrações solúveis, concentrados emulsionados ou soluções solúveis) e aditivos de mistura no tanque (como adjuvante ou compatibilizan-te) podem afetar consideravelmente o controle de plantas daninhas de um determinado herbicida ou de uma combinação de um ou mais tipos de herbicidas. Quaisquer combinações químicas de qualquer um dos herbicidas a-cima estão compreendidas no âmbito da presente invenção.

Tal como conhecido pelo técnico no assunto, os benefícios da combinação de dois ou mais modos de ação para melhorar o espectro controlado de plantas daninhas e/ou de espécies naturais com mais tolerância ou espécies de plantas daninhas com resistência podem ser estendidos a substâncias químicas capazes de produzir tolerâncias a outros herbicidas além de tolerância ao glifosato em culturas através de meios artificiais (transgênicos ou não transgênicos). Na realidade, as características seguintes de resistência podem ser codificadas isoladamente ou multiplicadas por sobreposição de modo a proporcionar a capacidade para controlar efetivamente ou prevenir que plantas daninhas tenham sucessores com qualquer categoria das resistências a herbicidas citadas acima: resistência ao glifosato (como planta resistente ou bactéria, EPSPS, GOX, GAT), resistência ao glufosinato de amônio (como PAT, Bar), resistência ao herbicida inibidor da acetolactato sintase (ALS) (como genes de resistência às substâncias quí- micas imidazolidinona, sulfonilureia, triazol pirimidina, sulfonanilida, tioben-zoato de pirimidina e outros genes como AHAS, Csrl, SurA, etc.), resistência ao bromoxinil (como Bxn), resistência ao inibidor de HPPD (4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase), resistência ao inibidor de fitoeno desatura-se (PDS), resistência ao herbicida inibidor do fotossistema II (como psbA), resistência ao herbicida inibidor do fotossistema I, resistência ao herbicida inibidor de protoporfirinogênio oxidase IX (PPO) (como PPO-1), resistência ao herbicida fenilureia (como CYP76B1), enzima de degradação de dicam-ba, etc.

Quanto a outros herbicidas, alguns dos outros inibidores preferíveis de ALS incluem triazol-pirimidina benzenossulfonamida (cloransulam-metil, diclosulam, flumetsulam, metosulam e pirimidino triazol-sulfonamidas), tiobenzoato de pirimidina e flucarbazona. Alguns inibidores preferíveis de HPPD incluem mesotriona, isoxaflutol e sulcotriona. Alguns inibidores preferíveis de PPO incluem flumioxazina, butafenacil, carfentrazona, sulfentrazo-na e óxido de difenila (como acifluorfeno, fomesafeno, Lactofeno e oxifluor-feno).

Adicionalmente, os genes 24DT07 podem ser sobrepostos isoladamente ou com um ou mais outros atributos de entrada (como resistência a insetos, resistência a fungos ou tolerância a estresses) ou de saída (como rendimento aumentado, massa oleosa melhorada, qualidade de fibra melhorada), ou sobrepostos com um ou mais outros atributos de entrada (como resistência a insetos, resistência a fungos ou tolerância a estresses) ou de saída (como rendimento aumentado, massa oleosa melhorada, qualidade de fibra melhorada) depois da sobreposição com outras características de cultura resistente a herbicidas. Por conseguinte, a presente invenção pode oferecer a possibilidade de controlar com flexibilidade e economicamente qualquer número de pragas agronômicas e uma solução agronômica completa para melhorar a qualidade de culturas. O gene 24DT07 nesta invenção é capaz de degradar 2,4-D, o qual constitui a base de culturas importantes resistentes a herbicidas e da possibilidade de marcadores de seleção.

Quase todas as combinações de herbicidas para plantas daninhas de folhas largas poderíam ser controladas pela expressão transgênica do gene 24DT07. O gene 24DT07 é um excelente atributo de cultura tolerante a herbicida que pode ser sobreposto com, por exemplo, outras características de cultura tolerante a herbicida, como resistência ao glifosato, resistência ao glufosinato de amônio, resistência a inibidores de ALS (como imidazo-lidinona, sulfonilureia e triazol-pirimidina benzenossulfonamidas), resistência ao bromoxinil, resistência ao inibidor de HPPD, resistência ao inibidor de PPO e as semelhantes, e atributos de resistência a insetos (CrylAb, Cry1F, Vip3 , outra proteína de bacillus thuringiensis ou proteína resistente a insetos não derivada do bacilo). Além disso, o gene 24DT07 pode ser utilizado como marcador de seleção para auxiliar na seleção do transformante primário de plantas geneticamente modificadas com outro gene ou grupo de genes. O grupo fenóxi alcanoato pode ser utilizado para introduzir grupos funcionais ácidos estáveis nos herbicidas. Grupos ácidos podem contribuir para integrar a atividade de translocação no floema graças à “captação de ácidos” (a propriedade necessária para o efeito herbicida) nos novos herbicidas e melhorar sua mobilidade. Existem muitos herbicidas comercialmente disponíveis e experimentais que poderíam servir de substratos para 24DT07. Por conseguinte, é possível obter tolerância a outros herbicidas utilizando a presente invenção. O atributo de tolerância das culturas aos herbicidas desta invenção pode ser utilizado em uma combinação com outros atributos de tolerância das culturas aos herbicidas (inclusive, entre outros, tolerância ao glifosato). As combinações destes atributos produzem novos métodos para controlar espécies de plantas daninhas, graças à nova resistência adquirida ou à tolerância inerente aos herbicidas (como ao glifosato). Por conseguinte, além dos atributos de tolerância das culturas aos herbicidas, a presente invenção também inclui novos métodos para controlar plantas daninhas utilizando herbicidas, nos quais a referida tolerância ao herbicida é obtida através da enzima produzida pelas culturas transgênicas. A presente invenção pode ser aplicada a uma variedade de plantas, como Arabidopsis, tabaco, soja, algodão, arroz, milho e brássica. A presente invenção pode também ser aplicada a uma variedade de outras culturas monocotiledôneas (como pastagem de gramíneas ou relvado de grama) e dicotiledôneas (como alfalfa, cravo e espécies arbóreas, etc.). Do mesmo modo, o 2,4-D (ou outros substratos de 24DT07) podem ser aplicados mais ativamente a culturas gramíneas com tolerância moderada, e nas quais, a tolerância resultante proporcionará aos agricultores a possibilidade de usar estes herbicidas em doses mais eficazes e durante mais tempo sem o risco de causar danos às culturas.

Os genomas de plantas, os tecidos ou as células vegetais descritos neste pedido de patente referem-se a quaisquer materiais genéticos existentes nas plantas, nos tecidos ou nas células vegetais, e estes incluem o núcleo, plasmídeos e genomas mitocondrianos. A "resistência", neste relatório descritivo, pode ser herdada e permite que as plantas cresçam e se reproduzam no caso de tratamento eficaz ser aplicado às plantas específicas utilizando herbicida comum. Assim como reconhecido pelo técnico no assunto, mesmo se certo dano à planta causado por herbicidas for evidente, a planta ainda pode ser considerada "resistente". O termo "tolerância", neste relatório descritivo, é mais amplo do que o tempo "resistência" e inclui "resistência" e a capacidade melhorada de uma determinada planta resistir aos vários graus de danos induzidos pelos herbicidas que resultam em geral nos danos das plantas do tipo selvagem com os mesmos genótipos sob a mesma dose de herbicida.

Neste relatório descritivo, polinucleotídeos e/ou nucleotídeos formam um “gene” completo e codificam proteínas ou polipeptídeos nas células hospedeiras de interesse. Para um técnico no assunto, é fácil perceber que os polinucleotídeos e/ou nucleotídeos na presente invenção podem estar sob o controle das sequências reguladoras do hospedeiro planejado.

Como bem conhecido pelo técnico no assunto, o DNA existe tipicamente na forma de fitas duplas. Em tal arranjo, uma fita é complementar da outra, e vice-versa. Quando o DNA é replicado em plantas, outras fitas complementares do DNA são também geradas. Por conseguinte, os polinu-cleotídeos exemplificados na listagem de sequências e suas fitas complementares são abrangidos pela presente invenção. A “fita de codificação” geralmente utilizada na técnica refere-se a uma fita que se liga a uma fita em orientação inversa (antisense). Para expressar uma proteína in vivo, uma fita do DNA é tipicamente transcrita em uma fita complementar de um mRNA, que serve como o molde para expressão da proteína. Na realidade, um mRNA é transcrito a partir da fita “antisense” de DNA. A “fita sense” (orientação correta) ou “fita de codificação” contém uma série de códons (códon é um triplete de nucleotídeos que codifica um aminoácido específico), que poderia ser lida como quadros de leitura aberta (ORF) para gerar proteínas ou peptí-deos-alvo. O RNA e o PNA (ácido nucleico peptídico) que são funcionalmente equivalentes ao DNA exemplificado foram também contemplados no presente pedido de patente.

Uma molécula de ácido nucleico ou seus fragmentos foram hi-bridizados com o gene resistente a herbicida em condições de rigor neste pedido de patente. Quaisquer métodos regulares de hibridização ou amplificação de ácidos nucleicos podem ser empregados para identificar a existência do gene resistente a herbicida no presente pedido de patente. Moléculas de ácido nucleico ou seus fragmentos são capazes de se hibridizar especificamente com outras moléculas de ácidos nucleicos em certas condições. No presente pedido de patente, se duas moléculas de ácido nucleico puderem formar uma estrutura antiparalela de ácido nucleico com fitas duplas, pode ser determinado estas duas moléculas serão capazes de hibridizar especificamente uma com a outra. Se duas moléculas de ácido nucleico forem completamente complementares, uma das moléculas é denominada o “complemento” da outra. Neste pedido de patente, quando cada nucleotídeo de uma molécula de ácido nucleico for complementar ao nucleotídeo correspondente da outra molécula de ácido nucleico, é identificado que as duas moléculas são “completamente complementares”. Se duas moléculas de ácido nucleico puderem hibridizar uma com a outra de modo que possam anelar e se ligarem com estabilidade suficiente em condições normais de pelo menos “baixo rigor”, estes dois ácidos nucleicos são identificados como “complementares mínimos”. Do mesmo modo, se duas moléculas de ácido nucleico puderem hibridizar uma com a outra de modo que possam anelar e se ligarem com estabilidade suficiente em condições normais de “alto rigor”, é identificado que estes dois ácidos nucleicos são “complementares”. O desvio de “completamente complementar” pode ser permitido, desde que não impeça completamente que as duas moléculas formem uma estrutura de fita dupla. Para poder servir de iniciador ou de sonda, uma molécula de ácido nucleico precisa ter sequências suficientemente complementares para formar uma estrutura de fita dupla estável no solvente específico a uma concentração específica de sal.

Neste pedido de patente, sequência basicamente homóloga re-fere-se a uma molécula de ácido nucleico que pode hibridizar especificamente com a fita complementar de outra molécula de ácido nucleico à qual se combine sob a condição de “alto rigor”. As condições de rigor para hibridiza-ção de DNA são bem conhecidas pelo técnico no assunto, tais como tratamento com 6,0 x solução de cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a aproximadamente 45 °C e lavagem com 2,0 x SSC a 50 °C. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem é selecionada a partir de 2,0 χ SSC e 50 °C, para as condições de “baixo rigor”, e 0,2 x SSC e 50 °C para as condições de “alto rigor”. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem varia de 22 °C, para as condições de “baixo rigor”, a 65 °C para as condições de “alto rigor”. A temperatura e a concentração de sal podem variar junto ou apenas uma destas duas variáveis varia. De preferência, a condição de rigor utilizada neste pedido de patente poderia ser conforme abaixo. A SEQ ID NO:1 é especificamente hibridizada em 6,0 x solução de SSC e SDS 0,5% a 65 °C. Depois a membrana foi lavada uma vez em 2 x solução de SSC e SDS 0,1% e 1 x solução de SSC e SDS 0,1%, respectivamente.

Por conseguinte, neste pedido de patente, foram incluídas as sequências resistentes a herbicidas que podem hibridizar-se com a SEQ ID NO: 1 em condições de rigor. Estas sequências eram pelo menos aproximadamente 40%-50% homólogas ou aproximadamente 60%, 65% ou 70% ho- mólogas, até mesmo ao menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homólogas às sequências da presente invenção. A presente invenção provê proteínas funcionais. “Atividade funcional” (ou “atividade”), neste relatório descritivo, significa a atividade de pro-teínas/enzimas (isoladamente ou combinadas com outra proteína) neste pedido de patente para degradar herbicidas ou reduzir a atividade de herbicidas. As plantas que produzem as proteínas deste pedido de patente geram de preferência tal quantidade eficaz de proteínas que, quando as plantas são tratadas com herbicidas, o nível de expressão da proteína é suficiente para conferir às plantas resistência completa ou parcial a herbicidas (dose generalizada se não houver instruções específicas). Os herbicidas são habitualmente aplicados à dose que é capaz de eliminar as plantas desejadas, na dose e na concentração normais aplicadas no campo. De preferência, as células vegetais e as plantas deste pedido de patente estão protegidas da inibição do crescimento ou do dano causado pelo tratamento com herbicidas. As plantas e células vegetais transformadas da presente invenção preferivelmente possuem resistência ou tolerância a herbicidas 2,4-D, o que significa que as plantas e células vegetais transformadas podem sobreviver na condição com uma quantidade eficaz de herbicidas 2,4-D.

Genes e proteínas descritos no presente pedido de patente incluem não só as sequências especificamente exemplificadas, mas também partes e/ou fragmentos (inclusive deleção(ões) na proteína completa e/ou em sua extremidade), variantes, mutantes, substitutas (proteínas contendo aminoácido(s) substituído(s)), quimeras e proteínas de fusão retendo a atividade de resistência a herbicidas destas. As referidas “variantes” ou “variação” referem-se às sequências de nucleotídeos que codificam a mesma proteína ou que codificam uma proteína equivalente tendo atividade de resistência a herbicidas. A referida “proteína equivalente” refere-se às proteínas que possuem a mesma ou substancialmente a mesma bioatividade de resistência a herbicidas que aquela das proteínas reivindicadas. O “fragmento” ou “truncagem” do DNA ou de sequências de pro- teínas, conforme descritas neste pedido de patente, refere-se a uma parte ou uma forma artificialmente modificada destas (por exemplo, sequências adequadas para expressão em plantas) do DNA original ou de sequências de proteínas (nucleotídeos ou aminoácidos) envolvidas no presente pedido de patente. O comprimento da referida sequência é variável, mas é suficientemente longo para assegurar que a proteína (codificada) é uma proteína resistente a herbicidas. Em alguns casos (especialmente expressão em plantas), é vantajoso utilizar um gene truncado que codifica uma proteína truncada. O gene truncado preferível geralmente codifica 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% da proteína inteira.

Devido à redundância dos códons genéticos, uma variedade de diferentes sequências de DNA pode codificar uma mesma sequência de a-minoácidos. Está ao alcance do técnico no assunto conseguir sequências substitutas de DNA que codifiquem uma mesma ou substancialmente a mesma proteína. Estas diferentes sequências de DNA estão incluídas neste pedido de patente. A referida “substancialmente a mesma” sequência refere-se a uma sequência na qual certos aminoácidos são substituídos, excluídos, adicionados ou inseridos, mas cuja atividade de resistência a herbicidas não é substancialmente afetada, e também inclui os fragmentos que permanecem com a atividade de resistência a herbicidas.

Substituição, deleção ou adição de alguns aminoácidos em sequências de aminoácidos, neste pedido de patente, é a técnica convencional empregada na área. De preferência, tal alteração em aminoácido inclui: alteração com características mínimas, ou seja, substituição de aminoácidos reservados que não influenciam significativamente o dobramento e/ou a atividade da proteína; deleção curta, geralmente uma deleção de aproximadamente 1-30 aminoácidos; alongamento curto de terminação amino ou carbo-xila, tal como alongamento com resíduo de metionina na terminação amino; peptídeo curto de conexão, como, por exemplo, com aproximadamente 20- 25 resíduos de extensão.

Os exemplos de substituição conservadora são as substituições que acontecem nos seguintes grupos de aminoácidos: aminoácidos básicos (como arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (como ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (por exemplo, glutamina e asparagi-na), aminoácidos hidrofóbicos (como leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (por exemplo, fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidos de pequena molécula (como glicina, alanina, serina e treonina e metio-nina). As substituições de aminoácidos que geralmente não alteram a atividade específica são bem conhecidas na técnica e já foram descritas em, por exemplo, Protein, editado por N. Neurath e R. L. Hill, publicado pela Acade-mic Press, Nova York em 1979. As substituições mais comuns são Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, A-la/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly, e suas substituições invertidas.

Evidentemente, para o técnico no assunto, tal substituição pode ocorrer fora das regiões que são importantes para a função molecular e que ainda causa a produção de polipeptídeos ativos. Para o polipeptídeo da presente invenção, os resíduos de aminoácido, que são necessários para sua atividade e escolhidos como os resíduos não substituídos, podem ser identificados de acordo com os métodos conhecidos da técnica como, por exemplo, mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese pela técnica de varredura com substituições de aminoácidos por alanina (alanine scanning) (ver, por exemplo, Cunningham e Wells, 1989, Science 244:1081-1085). A última técnica é realizada pela introdução de mutações em cada resíduo com carga positiva na molécula e detecção da atividade de resistência a herbicida das moléculas obtidas por mutação, visando identificar os resíduos de aminoácidos que são importantes para a atividade das moléculas. Sítios de interação enzima-substratos também podem ser determinados pela análise de sua estrutura tridimensional, a qual pode ser determinada através de algumas técnicas como análise por ressonância magnética nuclear (NMR), cristalografia ou marcação por fotoafinidade (ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255:306-312 ; Smith, et al., 1992, J. Mol. Biol 224:899-904; Wlodaver, et al., 1992, FEBS Letters 309:59-64).

Por conseguinte, sequências de aminoácidos que possuem certa homologia com as sequências de aminoácidos apresentada na SEQ ID No. 2 estão também compreendidas nesta invenção. A similaridade/homologia de sequência entre estas sequências e as sequências descritas na presente invenção é tipicamente superior a 60%, de preferência superior a 75%, mais preferivelmente superior a 80%, ainda mais preferivelmente superior a 90% e mais preferivelmente superior a 95%. As proteínas e os polinucleotídeos preferidos na presente invenção podem também ser definidos de acordo com faixas mais específicas da homologia e/ou similaridade. Por exemplo, podem ter homologia e/ou similaridade de 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com as sequências descritas neste pe- dido de patente.

As sequências reguladoras descritas neste pedido de patente incluem, entre outras, promotor, peptídeo de trânsito, terminador, reforçador, sequência inicial, introns e outras sequências reguladoras que podem ser operacionalmente ligada ao referido gene 24DT07. O referido promotor é um promotor que pode ser expresso em plantas, em que o referido “promotor que pode ser expresso em plantas” re-fere-se a um promotor que assegure que as sequências de codificação ligadas com o promotor podem ser expressas em células vegetais. O promotor que pode ser expresso em plantas pode ser um promotor constitutivo. Os exemplos de promotores capazes de direcionar a expressão constitutiva em plantas incluem, entre outros, o promotor 35S derivado do vírus do mosaico da couve-flor, o promotor ubi, o promotor do gene GOS2 derivado do arroz e os semelhantes. Alternativamente, o promotor que pode ser expresso em plantas pode ser um promotor específico de tecidos, o que significa que o nível de expressão dirigida por este promotor em alguns tecidos vegetais como, por exemplo, no clorênquima, é mais alto do que em outros tecidos da planta (pode ser medido através do teste convencional de RNA), como o promotor da PEP carboxilase. Alternativamente, o promotor que pode ser expresso em plantas pode ser também promotores induzíveis por feridas. Promotores induzíveis por ferida ou promotores que direcionam maneiras de expressão induzíveis por feridas referem-se aos promotores pelos quais o nível de expressão das sequências codificadoras pode ser acentuadamente aumentado quando comparados com aqueles nas condições normais de crescimento, quando as plantas são submetidas a feridas mecânicas ou ferida causada pela mordida de insetos. Os exemplos de promotores induzíveis por feridas incluem, entre outros, os promotores de genes de inibidores da protease de batatas e tomates (pin I e pin II) e os promotores do gene do inibidor de protease do milho (MPI). O referido peptídeo de trânsito (também denominado sequência de sinalização parácrina ou sequência líder) direciona os produtos da trans-gênese para organelas ou compartimentos celulares específicos. Para a proteína receptora, o referido peptídeo de trânsito pode ser heterogêneo. Por exemplo, sequências que codificam o peptídeo de trânsito para cloropolastos são utilizadas para levar para guiar para o cloroplasto; ou a sequência reservada “KDEL” é utilizada para guiar para o retículo endoplasmático ou a sequência CTPP do gene de lectina da cevada é utilizada para guiar para o vacúolo.

As referidas sequências líderes incluem, entre outras, sequências líderes de vírus com RNA pequeno como, por exemplo, a sequência líder do EMCV (região 5’ não codificadora do vírus da encefalomiocardite); sequências líderes do vírus Y da batata, como a sequência líder do MDMV (Vírus do mosaico anão do milho); proteína de ligação da cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP); sequência líder não traduzida o mRNA da proteína de revestimento do vírus do mosaico da alfafa (RNA4 do AMV); sequência líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV). O referido reforçador inclui, entre outros, o reforçador do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), o reforçador do vírus do mosaico da escrofu- lária (FMV), o reforçador do vírus da marca em anel do cravo (CERV), o re-forçador do vírus do mosaico das nervuras da mandioca (CsVMV), o reforçador da vírus do mosaico da Mirabilis (MMV), o reforçador do vírus das folhas amarelas onduladas do Cestrum (CmYLCV), reforçador do vírus das folhas onduladas do algodoeiro de Multan (CLCuMV), vírus do mosqueado amarelo da Commelina (CoYMV) e o reforçador do vírus do mosaico das esfrias cloróticas do amendoim (PCLSV).

Para a aplicação em monocotiledôneas, os referidos introns incluem, entre outros, introns hsp70 do milho, introns de ubiquitina do milho, intron 1 Adh, introns de sacarose sintase ou introns Act do arroz. Para a a-plicação em plantas dicotiledôneas, referidos introns incluem, entre outros, introns CAT-1, introns pKANNIBAL, introns PIV2 e introns de “super ubiquitina”.

Os referidos terminadores podem ser as sequências de sinalização apropriadas de poliadenilação que desempenham uma função em plantas. Estas incluem, entre outras, a sequência de sinalização de poliadenilação derivada do gene de nopalina sintetase (NOS) de Agrobacterium tume-faciens, a sequência de sinalização de poliadenilação derivada do gene do inibidor II de protease (pin II), a sequência de sinalização de poliadenilação derivada do gene ssRUBISCO E9 de ervilhas e a sequência de sinalização de poliadenilação derivada do gene de a-tubulina. O termo “operacionalmente ligado”, neste relatório descritivo, re-fere-se à ligação de sequências de ácido nucleico que propicia às sequências a função necessária das sequências ligadas. O termo “operacionalmente ligado”, neste relatório descritivo pode representar a ligação do promotor com as sequências de interesse, a qual faz com que a transcrição destas sequências ocorra sob o controle e a regulação do promotor. Quando a sequência de interesse codifica uma proteína e a expressão desta proteína é necessária, o termo “operacionalmente ligado” indica que a ligação do promotor e da referida sequência faz com que o transcrito obtido seja efetivamente traduzido. Se a ligação do promotor e da sequência codificadora resulta em transcrição com fusão e a expressão da proteína codificada for ne- cessária, tal ligação é gerada para assegurar que o primeiro códon de início da tradução do transcrito obtido é o códon de início da sequência de codificação. Alternativamente, se a ligação do promotor e da sequência de codificação resulta em tradução com fusão e a expressão da proteína codificada for necessária, tal ligação é gerada para assegurar que o primeiro códon de início da tradução da sequência 5’ não traduzida é ligado com o promotor, e tal maneira de ligação faz com que a relação entre os produtos obtidos da tradução e o quadro de leitura aberta “open reading frame” que codifica a proteína de interesse encontre-se com o quadro de leitura. Sequências de ácido nucleico que podem ser “operacionalmente ligadas” incluem, entre outras, sequências que propiciem a função de expressão gênica (ou seja, elementos para expressão do gene, como promotor, região 5’ não traduzida, introns, região codificadora de proteína, região 3’ não traduzida, sítios de poliadenilação e/ou terminadores da transcrição); sequências que propiciem a função de transferência e/ou integração do DNA (ou seja, sequências T que limitam o DNA, sítios de reconhecimento de enzima recombinante específica do sítio, sítios de reconhecimento da integrase); sequências que propiciam a função selecionável (ou seja, marcadores de resistência a antibióticos, genes biossintéticos); sequências que propiciam a função de marcadores de pontuação; sequências que auxiliam a operação de sequências in vitro ou in vivo (sequências de poliligantes, sequências recombinantes de sítios específicos) e sequências que propiciam a função de replicação (ou seja, origens de replicação de bactérias, sequências para replicação autônoma, sequências centroméricas). A presente invenção pode conferir novo(s) atributo(s) de resistência a herbicida às plantas ao mesmo tempo em que efeitos adversos, inclusive sobre a produtividade, não são observados. As plantas da presente invenção podem tolerar 2 χ, 3 χ, 4 χ ou 5 χ o nível de aplicação geral de ao menos um herbicida em questão. A melhora destes níveis de resistência está incluída no âmbito da presente invenção. Por exemplo, é possível aperfeiçoar com previsibilidade e depois desenvolver muitos tipos de tecnologias conhecidas na técnica de modo a aumentar a expressão de um determinado gene.

Na presente invenção, a referida proteína resistente a herbicida é a sequência de aminoácidos 24DT07 como mostrada na SEQ ID NO: 2 da listagem de sequências. O referido gene de resistência a herbicida é a sequência de nucleotídeos 24DT07 como mostrada na SEQ ID NO: 1 da listagem de sequências. Para ser aplicado a plantas, o gene resistente a herbicida também contém, além da região de codificação da proteína codificada pela sequência de nucleotídeos 24DT07, outros elementos como, por exemplo, regiões de codificação que codificam peptídeos de trânsito, as regiões de codificações que codificam proteínas marcadoras seletivas ou as proteínas que conferem resistência a insetos. A proteína resistente a herbicida 24DT07, conforme aqui descrita, é tolerante à maioria dos herbicidas de fenóxi auxina. Os genomas das plantas na presente invenção contêm DNAs exógenos que incluem a sequência de nucleotídeos 24DT07. As plantas são protegidas da ameaça de herbicidas por expressarem uma quantidade eficaz desta proteína. “Quantidade eficaz” refere-se à quantidade que não causa danos ou causa danos ligeiros. Ao mesmo tempo, as plantas devem ser morfologicamente normais, e poderiam ser cultivadas sob os meios comuns para o consumo e/ou a geração de produtos. O nível de expressão de proteínas do cristal (ICP) de resistência a herbicida nos materiais da planta pode ser determinado empregando vários métodos descritos nesse campo, como o método de quantificar o mRNA que codifica a proteína resistente a herbicida no tecido utilizando os iniciado-res específicos, ou o método de quantificar a proteína resistente a herbicida direta e especificamente. A presente invenção prove uma proteína resistente a herbicida, o gene codificador e o uso destes com as seguintes vantagens: 1. Forte atividade de resistência a herbicidas. A proteína resistente a herbicida 24DT07 da presente invenção é fortemente resistente a herbicidas, especialmente aos herbicidas de fenóxi auxina, em particular ao 2,4-D. 2. Amplo espectro de resistência a herbicidas, A proteína resistente a herbicida 24DT07 da presente invenção mostra alta resistência a uma variedade de herbicidas fenóxi auxina, por conseguinte, seu prospecto de aplicação sobre as plantas é amplo.

As soluções técnicas desta invenção serão descritas mais detalhadamente por meio das figuras anexadas e dos exemplos a seguir.

Breve Descrição dos desenhos A Figura 1 mostra o esquema para construir o vetor de clonagem recombinante DBN01-T, contendo a sequência de nucleotídeos 24DT07 u-sada na proteína resistente a herbicida, gene codificador e usos destes na presente invenção; A Figura 2 mostra o esquema para construir o vetor de expressão recombinante DBN100228, contendo a sequência de nucleotídeos 24DT07 usada na proteína resistente a herbicida, gene codificador e usos destes na presente invenção; A Figura 3 mostra o esquema para construir o vetor de expressão recombinante DBN100228N, contendo a sequência de controle usada na proteína resistente a herbicida, gene codificador e usos destes na presente invenção; A Figura 4 mostra o efeito de resistência a herbicida da planta transgênica Ti de Arabidopsis da proteína resistente a herbicida, gene codificador e uso destes na presente invenção; A Figura 5 mostra o esquema para construir o vetor de expressão recombinante DBN100217, contendo a sequência de nucleotídeos 24DT07 usada na proteína resistente a herbicida, gene codificador e uso desses na presente invenção; A Figura 6 mostra o esquema para construir o vetor de expressão recombinante DBN100217N, contendo a sequência de controle usada na proteína resistente a herbicida, o gene codificador e uso destes na presente invenção.

Descrição Detalhada da Invenção As soluções técnicas da proteína resistente a herbicida, do gene codificador e do uso destes na presente invenção serão ilustradas mais detalhadamente através dos exemplos a seguir.

Exemplo 1: A obtenção e síntese da sequência do gene 24DT07 1. Obtenção da sequência do gene 24DT07 A sequência de aminoácidos da proteína resistente a herbicida 24DT07 (293 aminoácidos) foi mostrada como a SEQ ID NO: 2 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos (882 nucleotídeos) que codifica a sequência de aminoácidos correspondente da proteína resistente a herbicida 24DT07 (293 aminoácidos) foi mostrada como SEQ ID NO: 1 na listagem de sequências. 2. Síntese da sequência de nucleotídeos descrita acima A sequência de nucleotídeos 24DT07 (mostrada como SEQ ID NO: 1 na listagem de sequências) foi sintetizada pela GenScript CO., LTD, Nanjing, P.R. China. A sequência de nucleotídeos 24DT07 sintetizada (SEQ ID NO: 1) foi ligada com um sítio de restrição para Spel na extremidade 5’ e um sítio de restrição para Kasl na extremidade 3’.

Ao mesmo tempo, a sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída (mostrada como SEQ ID NO: 3 na listagem de sequências) foi também sintetizada, na qual a Arg240 foi substituída por Gin. A sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída sintetizada (SEQ ID NO: 3) foi ligada com um sítio de restrição para Spel na extremidade 5’ e um sítio de restrição para Kasl na extremidade 3’.

Ao mesmo tempo, a sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada (mostrada como SEQ ID NO: 4 na listagem de sequências) foi também sintetizada, a qual é composta pelos aminoácidos de 1 a 290 da sequência de aminoácidos 24DT07. A sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada sintetizada (SEQ ID NO: 4) foi ligada com um sítio de restrição para Spel na extremidade 5’ e um sítio de restrição para Kasl na extremidade 3’.

Ao mesmo tempo, a sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada (mostrada como SEQ ID NO: 5 na listagem de sequências) foi também sintetizada, na qual três aminoácidos Ala, Leu e Vai foram adicionados depois do 293e aminoácido da sequência de aminoácidos 24DT07. A sequên- cia de nucleotídeos 24DT07 adicionada sintetizada (SEQ ID NO: 5) foi ligada com um sítio de restrição para Spel na extremidade 5’ e um sítio de restrição para Kasl na extremidade 3’.

Exemplo 2: Construção de vetores de expressão recombinante Arabidopsis e a transfecção de Agrobacterium com os vetores de expressão recombinante 1. Construção do vetor de clonagem recombinante de Arabidopsis, DBN01-T, contendo a sequência de nucleotídeos 24DT07 A sequência de nucleotídeos 24DT07 sintetizada foi clonada no vetor de clonagem pGEM-T (Promega, Madison, EUA, CAT: A3600), para obter o vetor de clonagem recombinante DBN01-T, seguindo as instruções para o vetor p-GEM-T da Promega, e o processo de construção é mostrado na Figura 1 (em que o Amp é um gene de resistência à ampicilina; f1 é a origem de replicação do fago f1; LacZ é o códon de início de LacZ; SP6 é o promotor de SP6 RNA polimerase; T7 é o promotor de T7 RNA polimerase; 24DT07 é a sequência de nucleotídeos 24DT07 (SEQ ID NO: 1); MCS é sítios de clonagem múltipla). O vetor de clonagem recombinante DBN01-T foi depois transformado para células T1 competentes de E. coli (Transgen, Beijing, China, CAT: CD501) através do método de choque térmico. As condições do choque térmico foram como segue: 50 pl_ de células T1 competentes de E. coli e 10 pL de DNA plasmidial (vetor de clonagem recombinante, DBN01-T) foram incubados em banho-maria a 42 °C durante 30 segundos. Depois, as células de E. coli foram incubadas em banho-maria a 37 °C por 1 h (100 rpm em incubadora com agitação) e em seguida cultivadas em uma placa LB (Triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCI 10 g/L, Ágar 15 g/L, e o pH foi ajustado para 7,5 com NaOH), cuja superfície estava recoberta com IPTG (Isopropil tio-beta-D-galactose glicosídeo), X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indol-beta-D-galactose glicosídeo) e ampicilina (100 mg/L), durante a noite. As colônias brancas foram escolhidas e cultivadas em caldo LB (Triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCI 10 g/L, ampicilina 100 mg/L e o pH foi ajustado para 7,5 com NaOH) a 37 °C durante a noite. Plasmídeos destas foram extraídos usando o método de lise alcalina como segue: o líquido bac-teriano foi centrifugado por 1 minuto a 12000 rpm, o sobrenadante foi descartado e o pélete foi novamente suspenso em 100 pL de solução I gelada (Tris-HCI 25 M, EDTA 10 mM (ácido etilenodiaminotetracético) e glicose 50 mM, pH = 8,0); depois, 150 pl_ de solução II recentemente preparada (NaOH 0,2 M, SDS 1% (sulfato de dodecil de sódio)) foram adicionados e o tubo foi invertido 4 vezes, misturado e colocado em gelo por 3-5 minutos; 150 pL de solução III fria (acetato de potássio 4 M e ácido acético 2 M) foram adicionados, imediatamente misturados completamente e incubados em gelo por 5-10 minutos; a mistura foi centrifugada a 12000 rpm e a 4 °C por 5 minutos, dois volumes de etanol anidro foram adicionados ao sobrenadante, misturados e depois colocados à temperatura ambiente por 5 minutos; a mistura foi centrifugada a 12000 rpm e a 4 °C por 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pélete foi seco depois de lavado com etanol 70% (V/V); 30 pL de TE (Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM, pH = 8,0) contendo RNase (20 pg /ml_) foram adicionados para dissolver o pélete; a mistura foi incubada a 37 °C em banho-maria por 30 minutos para digestão do RNA e armazenada a - 20 °C para o uso futuro.

Depois que os plasmídeos extraídos foram confirmados com as enzimas de restrição Spel e Kasl, os clones positivos foram verificados por meio do sequenciamento. Os resultados mostraram que a referida sequência de nucleotídeos 24DT07 inserida no vetor de clonagem recombinante DBN01-T era a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1 na listagem de sequências, indicando que a sequência de nucleotídeos 24DT07 foi corretamente inserida. A sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída sintetizada de nucleotídeos foi inserida no vetor de clonagem pGEM-T para obter o vetor de clonagem recombinante DBN02-T após o processo para construir o vetor de clonagem recombinante DBN01-T como descrito acima, em que mi24DT07 era a sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída (SEQ ID NO: 3). A sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída no vetor de clonagem recombinante DBN02-T foi verificada para ser corretamente inserida com a digestão pelas enzimas de restrição e sequenciamento, A sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada sintetizada de nucleotídeos foi inserida no vetor de clonagem pGEM-T para obter o vetor de clonagem recombinante DBN03-T após o processo para construir o vetor de clonagem DBN01-T como descrito acima, em que mt24DT07 era a sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada (SEQ ID NO: 4). A sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada no vetor de clonagem recombinante DBN03-T foi verificada para ser corretamente inserida com a digestão pelas enzimas de restrição e sequenciamento. A sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada sintetizada foi inserida no vetor de clonagem pGEM-T para obter o vetor de clonagem recombinante DBN04-T após o processo para construir o vetor de clonagem DBN01-T como descrito acima, em que ma24DT07 a sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada (SEQ ID NO: 5). A sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada no vetor de clonagem recombinante DBN04-T foi verificada para ser corretamente inserida com a digestão pelas enzimas de restrição e sequenciamento. 2. Construção do vetor de expressão recombinante em Arabidopsis, DBN100228, contendo a sequência de nucleotídeos 24DT07 O vetor de clonagem recombinante DBN01-T e o vetor de expressão DBNBC-01 (Espinha dorsal (backbone) do vetor: pCAMBIA2301, disponibilizado pela CAMBIA Institution) foram digeridos com as enzimas de restrição Spel e Kasl. O fragmento clivado da sequência de nucleotídeos 24DT07 foi ligado entre os sítios de restrição para Spel e para Kasl do vetor de expressão DBNBC-01 para construir o vetor de expressão recombinante DBN100228. Este é um método convencional bem conhecido pelo técnico no assunto para construir um vetor de expressão através da digestão por enzimas de restrição. O esquema de construção é mostrado na Figura 2 -Spec: gene de espectinomicina; RB: borda direita; AtUbilO: Promotor 10 do gene da ubiquitina da Arabidopsis (Ubiquitina) (SEQ ID NO: 6); 24DT07: sequência de nucleotídeos 24DT07 (SEQ ID NO: 1); Nos: terminador do gene de nopalina sintetase (SEQ ID NO: 7); prCaMV35S: promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (SEQ ID NO:8); PAT: gene da glufosinato acetil transferase (SEQ ID NO:9); tCaMV35S: terminador 35S do vírus do mosaico da couve-flor (SEQ ID NO: 10); LB: borda esquerda. O vetor de expressão recombinante DBN100228 foi transformado em células T1 competentes de E. coli pelo método do choque térmico como segue: 50 pL de células T competentes de E. coli e 10 pL de DNA plasmidial (vetor de expressão recombinante DBN100228) foram inoculados em banho-maria a 42 °Cpor 30 segundos. Depois, as células de E. coli foram incubadas em banho-maria a 37 °Cpor 1 hora (100 rpm em incubadora com agitação) e em seguida cultivadas em uma placa de LB sólido (Triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCI 10 g/L, Ágar 15 g/L e o pH foi ajustado para 7,5 com NaOH) contendo espectinomicina 50 mg/L a 37°C por 12 horas. As colônias brancas foram escolhidas e cultivadas em caldo LB (Triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCI 10 g/L, espectinomicina 50 mg/L e o pH foi ajustado para 7,5 com NaOH) a 37 °C durante a noite. Plasmídeos destas foram extraídos empregando o método de lise alcalina. Depois que os plasmídeos extraídos foram confirmados com as enzimas de restrição Spel e Kasl, os clones positivos foram verificados através do sequenciamento. Os resultados mostraram que a sequência de nucleotídeos entre os sítios de restrição Spel e Kasl no vetor de expressão recombinante DBN100228 era a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 1 na listagem de sequências, ou seja, a sequência de nucleotídeos 24DT07.

Após o processo para construir o vetor de expressão recombinante DBN100228 como descrito acima, o vetor de clonagem recombinante DBN02-T foi digerido com as enzimas de restrição Spel e Kasl para clivar a sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída que foi então inserida no vetor de expressão DBNBC-01 para obter o vetor de expressão recombinante DBN100228-L A digestão pelas enzimas de restrição e o sequenciamento verificaram que a sequência de nucleotídeos entre os sítios de restrição Spel e Kasl no vetor de expressão recombinante DBN100228-Í era a sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída.

Após o processo para construir o vetor de expressão recombi- nante DBN100228 como descrito acima, o vetor de clonagem recombinante DBN03-T foi digerido com as enzimas de restrição Spel e Kasl para clivar a sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada que foi então inserida no vetor de expressão DBNBC-01 para obter o vetor de expressão recombinante DBN100228-t. A digestão pelas enzimas de restrição e o sequenciamento verificaram que a sequência de nucleotídeos entre os sítios de restrição Spel e Kasl no vetor de expressão recombinante DBN100228-t era a sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada.

Após o processo para construir o vetor de expressão recombinante DBN 100228 como descrito acima, o vetor de clonagem recombinante DBN04-T foi digerido com as enzimas de restrição Spel e Kasl para clivar a sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada que foi então inserida no vetor de expressão DBNBC-01 para obter o vetor de expressão recombinante DBN100228-a, A digestão pelas enzimas de restrição e o sequenciamento verificaram que a sequência de nucleotídeos entre os sítios de restrição Spel e Kasl no vetor de expressão recombinante DBN100228-a era a sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada. 3. Construção do vetor de expressão recombinante em Arabidopsis DBN100228N contendo a sequência de controle Após o processo para construir o vetor de clonagem recombinante DBN01-T compreendendo a sequência de nucleotídeos 24DT07 conforme descrita na parte 1 do Exemplo 2, o vetor de clonagem recombinante DBN01R-T contendo a sequência de controle foi construído utilizando a sequência de controle (SEQ ID NO: 11). Os clones positivos foram verificados através do sequenciamento. Os resultados mostraram que a sequência natural de nucleotídeos inserida no vetor de clonagem recombinante DBN01R-T era a sequência apresentada na SEQ ID NO: 11 na listagem de sequências, indicando que a sequência de nucleotídeos de controle foi corretamente inserida.

Após o processo para construir o vetor de expressão recombinante DBN100228 contendo a sequência de nucleotídeos 24DT07 conforme descrito na parte 2 do Exemplo 2, o vetor de expressão recombinante DBN100228N contendo a sequência natural foi construído, utilizando a sequência natural e o processo de construção mostrado na Figura 3 - (Espinha dorsal do vetor: pCAMBIA2301, disponibilizado pela CAMBIA Institution; Spec: gene de espectinomicina; RB: borda direita; AtUbilO: promotor 10 do gene da ubiquitina de Arabidopsis (Ubiquitina) (SEQ ID NO: 6); mN: sequência de controle (SEQ ID NO: 11); Nos: terminador do gene de nopalina sinte-tase (SEQ ID NO: 7); prCaMV35S: promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (SEQ ID NO:8); PAT: gene da glufosinato acetil transferase (SEQ ID NO:9); tCaMV35S: terminador 35S do vírus do mosaico da couve-flor (SEQ ID NO: 10); LB: borda esquerda. Os clones positivos foram verificados através do sequenciamento. Os resultados mostraram que a sequência de controle inserida no vetor de expressão recombinante DBN100228N era a sequência apresentada na SEQ ID NO: 11 na listagem de sequências, indicando que a sequência de controle foi corretamente inserida. 4. Transfecção de Agrobacterium tumefaciens com os vetores de expressão recombinante de Arabidopsis Os vetores de expressão recombinante, corretamente construídos, DBN100228, DBN100228-Í, DBN100228-t, DBN100228-a e DBN100228N (sequência de controle) foram transfectados em Agrobacterium GV3101 após o método de congelamento rápido com nitrogênio líquido como segue: 100 pL de Agrobacterium GV3101 e 3 μΐ_ de DNA plasmidial (vetor de expressão recombinante) foram colocados em nitrogênio líquido por 10 minutos e depois incubados em banho-maria a 37 °C durante 10 minutos. Em seguida, as células transfectadas de Agrobacterium GV3101 foram inoculadas em caldo LB e cultivadas a 28 °C, 200 rpm por 2 horas e espalhadas sobre uma placa de LB contendo rifampicina 50 mg/L (Rifampicina) e espectinomicina 100 mg/L até que surgissem monocolônias positivas. As colônias monopositivas foram escolhidas e cultivas, e plasmídeos destas foram extraídos. Os vetores de expressão recombinante DBN100228, DBN100228-Í, DBN100228-t e DBN100228-a e DBN100228N (sequência de controle) foram verificados com as enzimas de restrição Styl e Bglll e o vetor de expressão recombinante DBN100228N (sequência de controle) foi verifi- cado com as enzimas de restrição Styl e Bgll. Os resultados mostraram que a estrutura dos vetores de expressão recombinante DBN100228, DBN100228-Í, DBN100228-t, DBN100228-a e DBN100228N (sequência natural) estava correta, respectivamente.

Exemplo 3: Obtenção da planta Arabidopsis com a sequência de nucleotí-deos 24DT07 inserida As sementes de Arabidopsis do tipo selvagem foram suspensas em solução de agarose 0,1% e mantidas a 4 °C durante dois dias para satisfazer a necessidade de dormência e assegurar a germinação sincronizada das sementes. Vermiculita e esterco de cavalo foram misturados junto e irrigados até ficarem úmidos com água subterrânea. A mistura do solo foi desidratada durante 24 horas. As sementes previamente tratadas foram cultivadas na mistura do solo e cobertas com uma máscara umectante por 7 dias. As sementes foram germinadas e as plantas cultivadas em uma estufa a uma temperatura constante de 22 °C com umidade constante de 40-50% e uma condição de dia longo com a intensidade de luz de 120-150 μ-mol/m2s(16 horas de luz / 8 horas de escuridão). As plantas foram inicialmente irrigadas com solução nutriente de Hoagland e depois com água dei-onizada para manter o solo úmido, mas não encharcado. O método Floral dip foi empregado para transformar Arabidopsis. Um ou mais meios YEP, contendo espectinomicina 100 mg/L e rifampicina 10 mg/L, de 15-30 mL foram inoculados com as colônias selecionadas de Agrobacterium como pré-cultura. A pré-cultura foi incubada a 28 °C e 220 rpm durante a noite. Cada pré-cultura foi utilizada para inocular duas culturas de 500 mL de meio YEP contendo espectinomicina (100 mg/L) e rifampicina (10 mg/L) e as culturas foram incubadas a 28 °C em uma incubadora com agitação durante a noite. As culturas foram centrifugadas a uma velocidade de 8700 x g por 10 minutos à temperatura ambiente para precipitar as células e o sobrenadante obtido foi descartado. As pelotas celulares foram gentilmente ressuspensas em 500 mL de meio permeável que contém 1/2 χ sais de MS/vitamina B5, sacarose 10% (p/v), benzilaminopurina 0,044 μΜ (10 \jLIL (solução estoque a 1 mg/mL em DMSO)) e Silvet L-77 300 qL/L. Plan- tas de aproximadamente 1 mês de vida foram embebidas no meio por 15 segundos, e assegurado que as inflorescências mais recentes estavam submersas. Em seguida, as plantas foram pousadas pelo lado e cobertas (transparente ou não transparente) durante 24 horas, depois lavadas com água e colocadas verticalmente. As plantas foram cultivadas a 22 °C em um ciclo de luz de 16 horas de luz / 8 horas de escuridão. As sementes foram colhidas depois de embebidas por 4 semanas.

As sementes Ti recentemente colhidas (semente de nucleotí-deos 24DT07, sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída, sequências de nucleotídeos 24DT07 truncadas, sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada e sequência natural) foram secadas à temperatura ambiente durante 7 dias. As sementes foram cultivadas em placas de germinação (26,5 x 51 cm), 200 mg de sementes Ti (cerca de 10000 sementes)/placa. As sementes já haviam sido suspensas em 40 mL de solução de agarose 0,1% e armazenadas a 4 °C por 2 dias para satisfazer a necessidade de dormência e assegurar a germinação sincronizada das sementes.

Vermiculita e esterco de cavalo foram misturados junto e irrigados até que estivessem úmidos com água subterrânea e drenados por meio da gravidade. As sementes previamente tratadas (40 mL cada uma) foram uniformemente plantadas na mistura de solo, utilizando pipeta, e cobertas com máscara umectante por 4 a 5 dias. A mascara foi retirada 1 dias antes da seleção inicial de transformantes, pulverizando-se glufosinato de amônio (seleção do gene PAT cotransformado) depois da germinação.

Em 7 dias após o plantio (DAP) e 11 DAP respectivamente, as plantas T1 (estágio de cotiledôneo e estágio de 2-4 folhas, respectivamente) foram pulverizadas com solução herbicida Liberty a 0,2% (glufosinato de amônio 200g ai/L) utilizando um bocal DeVilbiss de ar comprimido a um volume de pulverização de 10 mL/disco (703 L/ha) de modo a fornecer uma quantidade eficaz de glufosinato de amônio (280 g ai/ha) para cada aplicação. As plantas sobreviventes (plantas em crescimento ativo) foram verificadas 4 a 7 dias depois da última pulverização e transferida para o vaso quadrado (7 cmx7 cm) feito de vermiculita e esterco de cavalo (3-5 plantas por vaso). As plantas transplantadas foram cobertas com máscara umectante por 3-4 dias e colocadas na sala de cultura a 22 °C ou diretamente para a estufa conforme descrito acima. Depois, a máscara foi retirada e as plantas foram plantadas na estufa (22 ± 5 °C, 50 ± 30% RH, 14 horas de iluminação: 10 horas de escuridão, luz natural no mínimo de 500 pE/m2s1 + luz de complemento) pelo menos um dia antes de ser testada a capacidade de 24DT07 para conferir a resistência ao herbicida de fenóxi auxina.

Exemplo 4: Teste do efeito de resistência a herbicida da Arabidopsis trans-gênica O gene 24DT07 foi utilizado para transformar Arabidopsis pela primeira vez. Inicialmente, transformantes Ti foram selecionados a partir do conjunto básico de sementes não transformadas, utilizando o esquema de seleção com glufosinato de amônio. Aproximadamente 40000 sementes Ti são rastreadas entre as quais 195 linhagens da geração de transformantes T1 positivos (gene PAT) foram identificadas, ou seja, a eficiência da transformação foi de aproximadamente 0,5%. Os testes do efeito de resistência a herbicida para sal de dimetil amônio de 2,4-D e Agroxone de plantas T-\ de Arabidopsis transformadas com a sequência de nucleotídeos 24DT07, a sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída, a sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada, a sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada e a sequência de nucleotídeos de controle, respectivamente, e plantas Arabidopsis do tipo selvagem foram realizados depois de 18 dias do plantio.

As plantas Ti de Arabidopsis Ti transformadas com a sequência de nucleotídeos 24DT07, a sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída, a sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada, a sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada e a sequência de nucleotídeos de controle, respectivamente, e plantas Arabidopsis do tipo selvagem foram pulverizadas com sal de dimetil amônio de 2,4-D (560 g ae/ha, 1 vez a concentração em campo), Agroxone (560 g ae/ha, 1 vez a concentração em campo) e solvente branco (água). As condições de resistência das plantas foram contadas 7 dias e 14 dias após a pulverização. Plantas com condições de crescimento compatíveis com o solvente branco (água) 7 dias depois da esterilização foram cias- sificadas como plantas altamente resistentes; Plantas com folhas onduladas em roseta 7 dias depois da esterilização foram classificadas como plantas moderadamente resistentes; Plantas incapazes de pendoamento 14 dias depois da esterilização foram classificadas como plantas de baixas resistência e as plantas mortas depois de 14 dias da esterilização foram classificadas como plantas não resistentes. Como cada planta Ti de Arabidopsis representa um evento independente de transformação, diferenças significativas de respostas individuais de Ti podem ser esperadas sob uma determinada dose. Os resultados são mostrados na Tabela 1 e Figura 4.

Tabela 1. Resultados de resistência a herbicida de plantas transgênicas Ti de Arabidopsis Para Arabidopsis, 50 g ae/ha de 2,4-D e Agroxone representam a dose eficaz para distinguir as plantas sensíveis de plantas com resistência média. Os resultados mostrados na Tabela 1 e na Figura 4 indicaram que o gene 24DT07 confere resistência a herbicida a plantas individuais de Arabidopsis (somente partes das plantas possuem a resistência porque os sítios de inserção de plantas da geração T1 são aleatórios. Por conseguinte, os níveis de expressão do gene de resistência são diferentes, resultando nos níveis diferentes de resistência), especialmente aos herbicidas de fenóxi au-xina. As plantas Arabidopsis do tipo selvagem e as plantas Arabidopsis transformadas com a sequência de controle não apresentaram resistência ao herbicida de fenóxi auxina. Além disso, os níveis de resistência ao sal de dimetil amônio de 2,4-D e ao Agroxone de plantas Ti de Arabidopsis transformadas com a sequência de nucleotídeos 24DT07, a sequência de nucleo-tídeos 24DT07 substituída, a sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada e a sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada não mostraram diferenças significativas.

Exemplo 5: Construção do vetor de expressão recombinante em milho e transfecção de Agrobacterium com vetor de expressão recombinante 1. Construção do vetor de expressão recombinante em milho DBN100217 contendo a sequência de nucleotídeos 24DT07 O vetor de clonagem recombinante DBN01-T e o vetor de expressão DBNBC-02 (Espinha dorsal do vetor: pCAMBIA2301, disponibilizado pela CAMBIA Institution) foram digeridos com as enzimas de restrição Spel e Kasl. O fragmento clivado da sequência de nucleotídeos 24DT07 foi ligado entre os sítios de restrição Spel e Kasl do vetor de expressão DBNBC-01 para construir o vetor de expressão recombinante DBN100217. Este é um método convencional bem conhecido para construir vetor de expressão por meio de digestão por enzimas de restrição. Os sítios de restrição Spel e Kasl no vetor de expressão DBNBC-01 foram também introduzidos empregando o método convencional de digestão por enzimas. O esquema de construção é mostrado na Figura 5 (Spec: gene de espectinomicina; RB: borda direita; Ubi: promotor 1 do gene de ubiquitina do milho (Ubiquitina) (SEQ ID NO: 12); 24DT07: sequência de nucleotídeos 24DT07 (SEQ ID NO: 1); Nos: termina-dor do gene de nopalina sintetase (SEQ ID NO: 7); PMI: gene de fosfomano-se isomerase (SEQ ID NO: 13); LB: borda esquerda). O vetor de expressão recombinante DBN100217 foi transformado em células T1 competentes de E. coli com o método de choque térmico como segue: 50 μΙ_ de células T1 competentes de E. coli e 10 pL de DNA plasmidial (vetor de expressão recombinante DBN100217) foram incubados em banho-maria a 42 °C por 30 segundos. Em seguida, as células de E. coli foram incubadas em banho-maria a 37 °C por 1 hora (100 rpm em incubadora com agitação) e depois foram cultivadas em uma placa de meio LB sólido (Triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCI 10 g/L, Ágar 15 g/L e o pH foi ajustado para 7,5 com NaOH) contendo espectinomicina 50 mg/L (Espec-tinomicina) a 37 °C por 12 horas. As colônias brancas foram escolhidas e cultivadas em caldo LB (Triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCI 10 g/L, espectinomicina 50 mg/L e o pH foi ajustado para 7,5 com NaOH) a 37 °C durante a noite. Os plasmídeos destas foram extraídos empregando o método de lise alcalina. Depois que os plasmídeos extraídos foram confirmados com as enzimas de restrição Spel e Kasl, os clones positivos foram verificados através do sequenciamento. Os resultados mostraram que a sequência de nucleotídeos entre os sítios de restrição Spel e Kasl no vetor de expressão recombinante DBN100217 era a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 1 na listagem de sequências, ou seja, a sequência de nucleotídeos 24DT07.

Após o processo para construir o vetor de expressão recombinante DBN100217 conforme descrito acima, o vetor de clonagem recombinante DBN02-T foi digerido com as enzimas de restrição Spel e Kasl para clivar a sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída que foi então inserida no vetor de expressão DBNBC-01 para obter o vetor de expressão recombinante DBN100217-L A digestão pelas enzimas de restrição e o sequenciamento verificaram que a sequência de nucleotídeos entre os sítios de restrição Spel e Kasl no vetor de expressão recombinante DBN100217-Í era a sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída.

Após o processo para construir o vetor de expressão recombinante DBN100217 conforme descrito acima, o vetor de clonagem recombinante DBN03-T foi digerido com as enzimas de restrição Spel e Kasl para clivar a sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada que foi então inserida no vetor de expressão DBNBC-01 para obter o vetor de expressão recombi- nante DBN100217-t. A digestão pelas enzimas de restrição e o sequencia-mento verificaram que a sequência de nucleotídeos entre os sítios de restrição Spel e Kasl no vetor de expressão recombinante DBN100217-t era a sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada.

Após o processo para construir o vetor de expressão recombinante DBN100217 conforme descrito acima, o vetor de clonagem recombinante DBN04-T foi digerido com as enzimas de restrição Spel e Kasl para clivar a sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada que foi então inserida no vetor de expressão DBNBC-01 para obter o vetor de expressão recombinante DBN100217-a. A digestão pelas enzimas de restrição e o sequencia-mento verificaram que a sequência de nucleotídeos entre os sítios de restrição Spel e Kasl no vetor de expressão recombinante DBN100217-a era a sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada. 2. Construção do vetor de expressão recombinante em milho DBN100217N contendo a sequência de nucleotídeos de controle Após o processo para construir o vetor de clonagem recombinante DBN01-T contendo as sequências de nucleotídeos 24DT07 descritas na parte 1 do Exemplo 2, o vetor de clonagem recombinante DBN01R-T contendo a sequência de controle foi construído utilizando a sequência de controle (SEQ ID NO: 11). Os clones positivos foram verificados através do se-quenciamento. Os resultados mostraram que a sequência natural de nucleotídeos inserida no vetor de clonagem recombinante DBN01R-T era a sequência apresentada na SEQ ID NO: 11 na listagem de sequências, indicando que a sequência de nucleotídeos de controle foi corretamente inserida.

Após o processo para construir o vetor de expressão recombinante DBN100217 contendo as sequências de nucleotídeos 24DT07 descritas na parte 1 do Exemplo 5, o vetor de expressão recombinante DBN100217N contendo a sequência natural foi construído utilizando a sequência natural e o processo de construção mostrado na Figura 6 - Espinha dorsal do vetor: pCAMBIA2301, disponibilizado pela CAMBIA Institution; Spec: gene de espectinomicina; RB: borda direita; ZmUbil: promotor 1 do gene de ubiquitina (ubiquitina) do milho (SEQ ID NO: 12); mN: sequência de controle (SEQ ID NO: 11); Nos: terminador do gene de nopalina sintetase (SEQ ID NO: 7); PMI: gene de fosfomanose isomerase (SEQ ID NO: 13); LB: borda esquerda, Os clones positivos foram verificados através do sequenci-amento. Os resultados mostraram que a sequência de controle inserida no vetor de expressão recombinante DBN100228N era a sequência apresentada na SEQ ID NO: 11 na listagem de sequências, indicando que a sequência de nucleotídeos de controle foi corretamente inserida. 3. Transfecção de Agrobacterium tumefaciens com vetores de expressão recombinante em milho Os vetores de expressão recombinante, corretamente construídos, DBN100217, DBN100217-Í, DBN100217-t, DBN100217-a e DBN100217N (sequência de controle) foram transfectados em Agrobacterium LBA4404 (Invitrgen, Chicago, EUA, Cat. n°: 18313-015) seguindo o método de congelamento rápido com nitrogênio líquido como segue: 100 μΐ_ de Agrobacterium LBA4404 e 3 pL de DNA plasmidial (vetor de expressão recombinante) foram colocados em nitrogênio líquido e mantidos por 10 minutos e depois incubados em banho-maria a 37 °C durante 10 minutos. Em seguida, as células transfectadas de Agrobacterium LBA4404 foram inocula-dos em um tubo LB e cultivadas a 28 °C, 200 rpm por 2 horas e espalhadas sobre uma placa LB contendo rifampicina 50 mg/L (Rifampicina) e especti-nomicina 100 mg/L até que surgissem monocolônias positivas. As monoco-lônias positivas foram escolhidas e cultivas, e plasmídeos destas foram extraídos. Os vetores de expressão recombinante DBN100217, DBN100217-Í, DBN100217-t e DBN100217-a foram verificados com as enzimas de restrição EcoRI e BgiW e DBN100217N (sequência de controle) foi verificado com as enzimas de restrição Sty\ e Bgl\. Os resultados mostraram que as estruturas dos vetores de expressão recombinante DBN100217, DBN100217-Í, DBN100217-t, DBN100217-a e DBN100217N (sequência natural) eram corretas, respectivamente.

Exemplo 6: Obtenção e verificação das plantas transgênicas de milho com a sequência de nucleotídeos 24DT07 inserida De acordo com o método convencional de transfecção em Agro- bacterium, o cultivar Zong 31 (Z31) de milho foi cultivado em condições esterilizadas, e o embrião jovem foi cocultivado com as cepas de Agrobacterium construídas na parte 3 do Exemplo 5 de modo a introduzir T-DNAs nos vetores de expressão recombinante DBN100217, DBN100217-Í, DBN100217-t, DBN100217-a e DBN100217N (sequência natural) construídos na parte 1 e 2 do Exemplo 5 (incluindo a sequência do promotor 1 do gene de ubiquitina do milho, a sequência de nucleotídeos 24DT07, a sequência de nucleotí-deos, 24DT07 substituída, a sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada, a sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada, a sequência de nucleotídeos de controle, o gene PMI e a sequência do terminador Nos) no genoma do milho. As plantas de milho contendo a sequência de nucleotídeos 24DT07, a sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída, a sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada, a sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada e a sequência de nucleotídeos de controle, respectivamente, foram obtidas e, ao mesmo tempo, uma planta de milho do tipo selvagem foi considerada como controle.

Em relação à transfecção de milho mediada por Agrobacterium, resumidamente, um embrião jovem imaturo de milho foi isolado de milhos e colocado em contato com uma suspensão de Agrobacterium, em que o A-grobacterium consegue liberar a sequência de nucleotídeos 24DT07 para pelo menos uma célula de um embrião jovem (Etapa 1: etapa de infecção). Nesta etapa, de preferência, o embrião jovem foi imerso na suspensão de Agrobacterium (OD66o = 0,4-0,6, meio de infecção (sal MS 4,3 g/L, vitaminas MS, caseína 300 mg/L, sacarose 68,5 g/L, glicose 36 g/L, Acetosiringona 40 mg/L (AS), ácido 2,4-diclorofenoxiacético 1 mg/L (2,4-D), pH = 5,3)) para iniciar a inoculação. O embrião jovem e Agrobacterium foram cocultivados por um período (3 dias) (Etapa 2: etapa de cocultivo). De preferência, o embrião jovem foi cultivado em meio sólido (sal MS 4,3 g/L, vitaminas MS, caseína 300 mg/L, sacarose 20 g/L, glicose 10 g/L, acetosiringona 100 mg/L (AS), ácido 2,4-diclorofenoxiacético 1 mg/L (2,4-D) e Ágar 8 g/L, pH = 5,8) depois da etapa de infecção. Após esta etapa de cocultivo, uma etapa de “recuperação” seletiva pode ser precedida. Na etapa de “recuperação”, o meio de recuperação (sal MS 4,3 g/L, vitaminas MS, caseína 300 mg/L, sa-carose 30 g/L, ácido 2,4-diclorofenoxiacético 1 mg/L (2,4-D) e Ágar 8 g/L, pH = 5,8) contém ao menos um tipo de antibiótico inibidor de Agrobacterium (cefalosporina) sem o agente seletivo para transfectantes vegetais (Etapa 3: etapa de recuperação). De preferência, o embrião jovem foi cultivado em uma cultura com meio sólido contendo antibióticos, mas sem agente seletivo de modo a eliminar Agrobacterium e proporcionar um período de recuperação para as células infectadas. Em seguida, o embrião jovem inoculado foi cultivado em um meio contendo agente seletivo (manose) e o calo transfec-tado em crescimento foi selecionado (Etapa 4: etapa de seleção). De preferência, o embrião jovem foi cultivado em um meio sólido seletivo contendo agente seletivo (sal MS 4,3 g/L, vitaminas MS, caseína 300 mg/L, sacarose 5 g/L, manose 12,5 g/L, ácido 2,4-diclorofenoxiacético 1 mg/L (2,4-D) e Ágar 8 g/L, pH = 5,8), resultando no crescimento seletivo das células transfectadas. Em seguida, o calo regenerou em plantas (Etapa 5: etapa de regeneração). De preferência, o calo foi cultivado em um meio sólido contendo agente seletivo (Meio de diferenciação MS e meio de enraizamento MS) para regenerar em plantas. O calo resistente obtido foi transferido para o referido meio de diferenciação MS (sal MS 4,3 g/L, vitaminas MS, caseína 300 mg/L, sacarose 30 g/L, 6-benziladenina 2 mg/L, manose 5 g/L e Ágar 8 g/L, pH = 5,8) e cultivado e diferenciado a 25 °C. As plântulas diferenciadas foram transferidas para o referido meio de enraizamento MS (sal MS 2,15 g/L, vitaminas MS, caseína 300 mg/L, sacarose 30 g/L, ácido indol-3-acético 1 mg/L e ágar 8 g/L, pH = 5,8) e cultivadas até aproximadamente 10 cm de altura a 25 °C. Em seguida, as plântulas foram transferidas e cultivadas na estufa até a frutificação. Na estufa, as plantas de milho foram cultivadas a 28 °C por 16 horas e a 20 °C por 8 horas todos os dias. 2. Verificação de plantas transgênicas de milho com o gene 24DT07 inserido pela técnica de TaqMan 100 mg de folhas de cada planta transfectada de milho (planta de milho transfectada com a sequência de nucleotídeos 24DT07, a sequên- cia de nucleotídeos 24DT07 substituída, a sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada, a sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada ou a sequência de nucleotídeos de controle, respectivamente) foram coletadas como amostra, respectivamente. O DNA genômico das plantas foi extraído utilizando o kit DNeasy Plant Maxi (Qiagen) e o número de cópias do gene 24DT07 foi quantificado utilizando o ensaio de PCR quantitativa por fluorescência com base em sonda Taqman. Planta de milho do tipo selvagem foi coletada como controle e analisada de acordo com os processos descritos acima. Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados foram os valores médios. O método específico para detector o número de cópias do gene 24DT07 foi descrito como segue: Etapa 11: 100 mg de folhas de cada planta transfectada de milho (planta de milho transfectada com a sequência de nucleotídeos 24DT07, a sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída, a sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada, a sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada ou a sequência de nucleotídeos de controle, respectivamente) e de planta de milho do tipo selvagem foram coletados e triturados para homogenato em um almofariz em nitrogênio líquido, respectivamente. O procedimento foi realizado em triplicata para cada amostra.

Etapa 12: os DNAs genômicos das amostras acima foram extraídos utilizando o kit DNeasy Plant Mini (Qiagen) seguindo as instruções para o produto.

Etapa 13: As concentrações de DNA no genoma das amostras acima foram determinadas utilizando NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).

Etapa 14: As concentrações de DNA no genoma foram ajustadas para a mesma faixa de 80-100 ng/pL.

Etapa 15: os números de cópias das amostras foram quantificados por meio do ensaio de PCR quantitativa por fluorescência com base em sonda Taqman, a amostra quantificada com número conhecido de cópias foi considerada uma amostra padrão e a planta de milho do tipo selvagem foi considerada como controle. O procedimento foi realizado em triplicata para cada amostra e os resultados foram os valores médios. Os iniciadores e as sondas utilizados na PCR quantitativa por fluorescência eram conforme mostrados abaixo.

Os iniciadores e a sonda seguintes foram utilizados para detectar a sequência de nucleotídeos 24DT07, a sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída, a sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada e a sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada: Iniciador 1: CGCTATGAACAGATACGCAGTGC (conforme mostrado na SEQ ID NO:14 na listagem de sequências) ;

Iniciador 2: AAGCCTTGGCGAAGTCGATC (conforme mostrado na SEQ ID NO:15 na listagem de sequências) ;

Sonda 1: TGCTGTCCTGTAAGTGGCTGTCCCCTC (conforme mostrada na SEQ ID NO:16 na listagem de sequências) ;

Os iniciadores e a sonda seguintes foram utilizados para detectar a sequência de controle: Iniciador 3 : TGCGTATTCAATTCAACGACATG (conforme mostrado na SEQ ID NO:17 na listagem de sequências) ;

Iniciador 4 : CTTGGTAGTTCTGGACTGCGAAC (conforme mostrado na SEQ ID NO:18 na listagem de sequências) ;

Sonda 2 : CAGCGCCTTGACCACAGCTATCCC (conforme mostrada na SEQ ID NO:19 na listagem de sequências) ; O sistema da reação PCR era como segue: JumpStart™ Taq ReadyMix™ ( Sigma ) 10 pL

Mistura 50* iniciadorIsonda 1 pL

DNAgenômico 3 pL Água (ddH20) 6 μΙ_ A referida mistura 50 x iniciador!sonda continha 45 μί_ de cada iniciador (1 mM), 50 μΙ_ de sonda (100 μΜ) e 860 μΐ_ de 1 x tampão TE e foi armazenada em tubo de âmbar a 4 °C.

As condições da reação PCR foram como segue: Etapa Temperatura Tempo 21 95 °C 5 minutos 22 95 °C 30 segundos 23 60 °C 1 minuto 24 de volta à etapa 22 e repetido 40 vezes Os dados foram analisados com o software SDS 2.3 (Applied Bi- osystems).

Os resultados experimentais mostraram que todas as sequências de nucleotídeos, sequência de nucleotídeo 24DT07, sequência de nu-cleotídeos 24DT07 substituída, sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada, sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada, e a sequência natural de haviam sido integradas nos genomas das plantas detectadas de milho, respectivamente. Além do mais, todas as plantas de milho transfectadas com sequência de nucleotídeos 24DT07, sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída, sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada, sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada e a sequência de nucleotídeos de controle, respectivamente, continham uma única cópia do gene 24DT07.

Exemplo 7: Testes do efeito de resistência a herbicida das plantas transgê-nicas de milho Os testes dos efeitos de resistência a herbicida para sal de di-metil amônio de 2,4-D e Agroxone de plantas de milho contendo a sequência de nucleotídeos 24DT07, a sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída, a sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada, a sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada, a sequência de nucleotídeos de controle, respectivamente, e as plantas de milho do tipo selvagem (estágios V3 - V4) foram realizados respectivamente.

Plantas de milho contendo a sequência de nucleotídeos 24DT07, a sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída, a sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada, a sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada, a sequência de nucleotídeos de controle, respectivamente, e plantas de milho do tipo selvagem foram coletadas e esterilizadas com sal de dimetil amônio de 2,4-D (8960 g ae/ha, 16 vezes a concentração em campo), Agroxone (8960 g ae/ha, 16 vezes a concentração em campo) e solvente branco (á-gua) respectivamente. O desenvolvimento de raiz escora foi contado 21 dias após a esterilização. Três linhagens (S1, S2, e S3) de plantas de milho transfectadas com a sequência de nucleotídeos 24DT07, duas linhagens (S4 e S5) de plantas de milho transfectadas com a sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída, duas linhagens (S6 e S7) de plantas de milho transfectadas com a sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada, duas linhagens (S8 e S9) de plantas de milho transfectadas com a sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada, duas linhagens (S10 e S11) de plantas de milho transfectadas com a sequência de nucleotídeos de controle e 1 linhagem de milho do tipo selvagem (CK) foram selecionadas, e 10-15 plantas de cada linhagem foram testadas. Os resultados foram mostrados na Tabela 2. Tabela 2. Resultados de testes do efeito de resistência a herbicida das plantas transoênicas Ti de milho Os resultados na Tabela 2 indicaram que o gene 24DT07 conferiu alta resistência contra herbicidas às plantas transgênicas de milho, especialmente contra os herbicidas de fenóxi auxina (como as plantas monocoti-ledôneas possuem inerentemente certa resistência aos herbicidas de fenóxi auxina, surgiram altos níveis de resistência); enquanto nenhuma das plantas de milho do tipo selvagem e das plantas de milho transfectadas com sequências de controle mostrou altos níveis de resistência contra herbicidas. Além disso, os níveis de resistência contra sal de dimetil amônio de 2, 4-D e Agroxone de plantas de milho transformadas com sequência de nucleotídeos 24DT07, sequência de nucleotídeos 24DT07 substituída, sequência de nucleotídeos 24DT07 truncada e sequência de nucleotídeos 24DT07 adicionada não mostraram diferenças significativas.

Acima de tudo, as plantas de milho e de Arabidopsis thaliana transfectadas com a sequência de nucleotídeos 24DT07 apresentavam alta capacidade de resistência a herbicida. Códons preferidos de planta foram empregados no gene resistente a herbicida 24DT07 na presente invenção, resultando em que o gene resistente a herbicida da presente invenção é a-dequado para expressão em plantas. A proteína resistente a herbicida 24DT07 da presente invenção possui um amplo espectro de resistência a herbicida, especialmente aos herbicidas de fenóxi auxina.

Finalmente, o que deve ser explicado é que todos os exemplos acima se destinam simplesmente a ilustrar as soluções técnicas da presente invenção, mais do que a restringir. Embora a descrição detalhada desta invenção tenha sido fornecida com referência aos exemplos preferíveis, o versado na técnica deve entender que as soluções técnicas da invenção podem ser modificadas ou equivalentemente substituídas, sem que deixem de ser abrangidas pelo espírito e pelo âmbito da presente invenção.

Claims (23)

1. Proteína resistente a herbicida, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma proteína consistindo em uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2; ou (b) uma proteína constituída pela sequência de aminoácidos com pelo menos 90% idênticos àquela apresentada na SEQ ID NO: 2.

2. Proteína resistente a herbicida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida proteína resistente a herbicida é uma proteína consistindo em uma sequência de aminoácidos com pelos menos 95% idênticos àquela apresentada na SEQ ID NO: 2.

3. Proteína resistente a herbicida de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida proteína resistente a herbicida é uma proteína consistindo em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% idênticos à apresentada na SEQ ID NO: 2.

4. Gene resistente a herbicida, caracterizado por compreender: (a) uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína resistente a herbicida como definida em qualquer uma das reivindicações 1a 3; ou (b) uma sequência de nucleotídeos capaz de se hibridizar com a sequência de nucleotídeos conforme definida em (a) em condições rigorosas e que codifica uma proteína com a atividade de alcanoato arilóxi dioxigenase; ou (c) a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 1.

5. Cassete de expressão, caracterizado por compreender o referido gene resistente a herbicida como definido na reivindicação 4, sob a regulação de uma sequência reguladora operacionalmente ligada,

6. Vetor recombinante, caracterizado por compreender o referido gene resistente a herbicida como definido na reivindicação 4 ou o referido cassete de expressão como definido na reivindicação 5.

7. Célula hospedeira transgênica, caracterizada por compreender o referido gene resistente a herbicida como definido na reivindicação 4 ou o referido cassete de expressão como definido na reivindicação 5, em que a referida célula hospedeira transgênica compreende células vegetais, células animais, bactérias, leveduras, baculovírus, nematódeos ou algas.

8. Célula hospedeira transgênica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o referido hospedeiro transgênico é uma planta selecionada a partir do grupo consistindo em soja, algodão, milho, arroz, trigo, beterraba e cana de açúcar.

9. Método para produzir uma proteína resistente a herbicida, caracterizado por compreender as etapas de: obter as células hospedeiras transgênicas como defindas na reivindicação 7 ou 8; cultivar as células hospedeiras transgênicas nas condições que permitam a produção da proteína resistente a herbicida; e recuperar a referida proteína resistente a herbicida.

10. Método para ampliar a faixa-alvo de herbicidas, caracterizado por compreender uma etapa de coexpressar o nucleotídeo que codifica a proteína resistente a herbicida como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou o cassete de expressão como definido na reivindicação 5, com pelo menos um segundo nucleotídeo que codifica uma proteína resistente a herbicida diferente daquela como definida na reivindicação 1 a 3 ou aquela codificada pelo cassete de expressão como definido na reivindicação 5.

11. Método para ampliar a faixa-alvo de herbicidas de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido segundo nucleotídeo codifica proteína resistente ao glifosato, proteína resistente ao glufosinato de amônio, 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase, acetolactato sinta-se, proteína de citocromos ou protoporfirinogênio oxidase.

12. Método para ampliar a faixa-alvo de herbicidas de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido segundo nucleotídeo é um dsRNA que inibe genes importantes no inseto-praga alvo.

13. Método para selecionar células vegetais transformadas, caracterizado por compreender as etapas de transformar múltiplas células vegetais com o gene resistente a herbicida como definido na reivindicação 4 ou o cassete de expressão como definido na reivindicação 5, e cultivar as refe- ridas células a uma concentração de herbicida que permita o crescimento das células transformadas que expressam o gene resistente a herbicida ou o cassete de expressão enquanto elimina as células não transformadas ou inibe o crescimento das células não transformadas, em que o herbicida é uma fenóxi auxina.

14. Método para controlar plantas daninhas, caracterizado por compreender uma etapa de aplicar uma quantidade eficaz de herbicidas ao campo plantado com culturas contendo o gene resistente a herbicida como definido na reivindicação 4, o cassete de expressão como definido na reivindicação 5 ou o vetor recombinante como definido na reivindicação 6.

15. Método para controlar plantas daninhas de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o herbicida é uma fenóxi auxina.

16. Método para proteger plantas do dano causado por herbicidas, caracterizado por compreender uma etapa de introduzir o gene resistente a herbicida como definido na reivindicação 4, o cassete de expressão como definido na reivindicação 5 ou o vetor recombinante como definido na reivindicação 6, em plantas de tal modo que as plantas obtidas produzam certa quantidade de proteína resistente a herbicida suficiente para protegê-las do dano causado por herbicidas.

17. Método para proteger plantas do dano causado por herbicidas de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o herbicida é uma fenóxi auxina.

18. Método para proteger plantas do dano causado por herbicidas de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que as referidas plantas são selecionadas a partir do grupo consistindo em soja, algodão, milho, arroz, trigo, beterraba e cana de açúcar.

19. Método para controlar plantas daninhas resistentes ao glifo-sato em um campo plantado com plantas tolerantes ao glifosato, caracterizado por compreender uma etapa de aplicar uma quantidade eficaz de herbicidas ao campo plantado com plantas tolerantes ao glifosato, as quais contêm o gene resistente a herbicida como definido na reivindicação 4, o casse- te de expressão como definido na reivindicação 5 ou o vetor recombinante como definido na reivindicação 6.

20. Método para controlar plantas daninhas resistentes ao glifo-sato em um campo plantado com plantas tolerantes ao glifosato de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o referido herbicida é uma fenóxi auxina.

21. Método para controlar plantas daninhas resistentes ao glifosato em um campo plantado com plantas tolerantes ao glifosato de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que as referidas plantas tolerantes ao glifosato são monocotiledôneas ou dicotiledôneas.

22. Método para conferir a culturas resistência contra herbicidas de 2,4-D, caracterizado por compreender uma etapa de introduzir o gene resistente a herbicida como definido na reivindicação 4, o cassete de expressão como definido na reivindicação 5 ou o vetor recombinante como definido na reivindicação 6, em plantas.

23. Método para conferir a culturas resistência contra herbicidas de 2,4-D de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que as referidas plantas são selecionadas a partir do grupo consistindo em soja, algodão, milho, arroz, trigo, beterraba e cana de açúcar.