RU2375448C2 - Способ выращивания плюрипотентных стволовых клеток - Google Patents

Abstract

Предложен способ выращивания плюрипотентных стволовых клеток с сохранением их недифференцированного состояния и плюрипотентности без использования клеток-фидеров. В способе применяется жидкая среда и культуральный сосуд, на поверхности которого иммобилизована молекула слитого белка, содержащего внеклеточный домен Е-кадгерина и Fc-район иммуноглобулина. Изобретение может быть использовано в регенеративной медицине. 8 з.п. ф-лы, 11 ил.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к способу выращивания и способу переноса генов для плюрипотентных стволовых клеток, таких как ES-клетки, и к плюрипотентным стволовым клеткам, полученным с использованием этих способов.

Уровень техники

Для продолжения жизни организмы обладают способностью быстро замещать и репарировать потерянные или поврежденные клетки и ткань, и эта способность известна как «регенерационная способность». Примеры «регенерационной способности» у высших животных включают общеизвестные феномены заживления ран кожи и кровеносных сосудов, но известно, что даже паренхимные органы, такие как печень и почки, подвергаются клеточному росту и реконструкции ткани для быстрого восстановления гомеостаза ткани в ответ на повреждение ткани. В недавние годы отмечались попытки использования этой природной «регенерационной способности» биологических организмов для достижения излечивания или ослабления различных заболеваний и ран, и подобные новые медицинские способы стали известны как «регенеративная медицина».

Стволовые клетки играют центральную роль в практике «регенеративной медицины». «Стволовые клетки» могут быть в общем случае определены как недифференцированные клетки, способные дифференцироваться в специализированные клетки или полифункциональные клетки, а также способные самовоспроизводиться, делая возможным генерирование клеток, идентичных самим себе. Уникальные стволовые клетки обнаружены в каждом типе ткани и клеток, и, например, клетки крови, такие как эритроциты, лимфоциты и мегакариоциты, продуцируются через клетки-предшественники, произведенные из стволовых клеток, известных как «гемопоэтические стволовые клетки», тогда как клетки скелетных мышц продуцируются из стволовых клеток/клеток-предшественников, известных как «сателлитные клетки» и «миобласты». Дополнительные типы, которые были идентифицированы до сих пор, включают невральные стволовые клетки, которые обнаружены в нервной ткани, такой как головной мозг и спинной мозг, и продуцируют нейроны и глиальные клетки, эпидермальные стволовые клетки, которые продуцируют эпидермальные клетки и клетки волосяных фолликулов, овальные клетки (печеночные стволовые клетки), которые продуцируют гепатоциты и клетки желчных протоков, и сердечные стволовые клетки, которые продуцируют кардиомиоциты.

Некоторые способы лечения регенеративной медицины с использованием стволовых клеток или клеток-предшественников, полученных из таких клеток, уже были представлены, и инфузионные трансплантационные способы с использованием гемопоэтических стволовых клеток или гемопоэтических клеток-предшественников хорошо известны в лечении состояний, вызываемых отсутствием или функциональной недостаточностью клеток крови, таких как лейкоз и пластическая анемия. Однако стволовые клетки, присутствующие в паренхимных органах, таких как головной мозг, сердце или печень, являются технически трудными для получения из живых тканей и/или для культивирования in vitro, и такие стволовые клетки также обычно имеют низкий потенциал пролиферации. Стволовые клетки могут быть также извлечены из тканей трупов, но медицинское использование полученных таким образом клеток связано с этическими проблемами. Таким образом, регенеративные способы лечения невропатии, кардиопатии и т.п. будет требовать развития способов для генерирования желаемых типов клеток с использованием клеток, других, чем стволовые клетки, присутствующие в таких тканях-мишенях.

Прежде всего, способы использования «плюрипотентных стволовых клеток» могут быть упомянуты в качестве стратегий, основанных на этом подходе. “Плюрипотентные стволовые клетки” определяются как клетки, способные к продолжительной или фактически неограниченной пролиферации in vitro при сохранении их недифференцированного состояния, проявления нормального кариотипа (хромосомы) и наличия способности дифференцироваться во все типы клеток трех зародышевых листков (эктодермы, мезодермы и эндодермы) при подходящих условиях. В настоящее время большинство известных плюрипотентных стволовых клеток являются эмбриональными стволовыми клетками (ES-клетками), выделенными из раннего эмбриона, и аналогичными эмбриональными половыми клетками (EG-клетками), выделенными из фетальных примордиальных эмбриональных клеток, где и те, и другие являются предметами данного изобретения.

ES-клетки могут быть выделены в виде популяции недифференцированных стволовых клеток перенесением внутренней клеточной массы эмбриона стадии бластоцисты в культуру in vitro и повторением процесса отделения и пассирования этой клеточной массы. Клетки имеют подходящую плотность клеток на клетках-фидерах, полученных из первичных культивируемых мышиных эмбриональных фибробластов (далее называемых MEF-клетками), полученных из мышиной фетальной ткани, или мышиных стромальных клеток, таких как клетки STO, и повторяемое пассирование с частой заменой культуральной среды может привести к установлению клеточной линии, сохраняющей свойство недифференцированных стволовых клеток. Другим признаком ES-клеток является присутствие фермента теломеразы, который проявляет активность поддержания длины хромосомной теломеры, и этот фермент придает ES-клеткам способность фактически неограниченного клеточного деления in vitro.

Линии ES-клеток, полученные таким образом, являются «плюрипотентными», так как они могут повторяемо выращиваться и пассироваться почти неограниченно при поддержании нормального кариотипа, и они способны дифференцироваться в многообразные различные типы клеток. Например, при трансплантации ES-клеток в тело животного подкожно, интраабдоминально или интратестикулярно они образуют опухоли, называемые «тератомами», но эти опухоли содержат смесь различных клеток и тканей, в том числе нейроны, остеоциты, хондроциты, кишечные клетки, мышечные клетки и т.п. В мышах, внутриматочная трансплантация в псевдобеременную мышь агрегатного эмбриона, генерированного инфузионным трансплантатом ES-клеток в эмбрион стадии бластоцисты или агрегацией (группированием) с эмбрионом стадии восьми клеток, приводит к генерированию «химерной мыши», которая является отпрыском, обладающим дифференцированными клетками, происходящими из этих ES-клеток, во всем теле или в частях его органов и тканей. Этот способ часто используют в качестве основного способа для генерирования “мышей с нокаутом”, в которых определенные гены являются искусственно разрушенными или модифицированными.

Хорошо известно также, что ES-клетки также индуцируются к дифференцировке в различные типы клеток культивированием in vitro. Хотя конкретный способ различается в зависимости от типа клетки, обычно используют способ индукции дифференцировки посредством образования “эмбриоидного тела” (далее называемого “EB”), которое является клеточной массой в эмбрион-подобном состоянии, образуемой агрегацией ES-клеток культивированием в суспензионной культуре. Такой способ может продуцировать клетки, имеющие характеристики эндодермы, эктодермы и мезодермы фетальной стадии, а также дифференцированные клетки, такие как клетки крови, сосудистые эндотелиальные клетки, хондроциты, клетки скелетных мышц, клетки гладких мышц, кардиомиоциты, глиальные клетки, нейроны, эпителиальные клетки, меланоциты, кератиноциты, адипоциты и т.п. Дифференцированные клетки, получаемые культивированием in vitro таким способом, имеют по существу такие же структурные и функциональные признаки, что и клетки, присутствующие в органах и тканях, и эксперименты с трансплантатами с использованием экспериментальных животных продемонстрировали, что происходящие из ES-клеток клетки прикрепляются к органам и тканям и нормально функционируют.

В отношении обзоров свойств ES-клеток и способов их культивирования и их способностей к дифференцировке in vivo и in vitro, авторы ссылаются на следующую литературу: Guide to Techniques in Mouse Development (Wasserman et al., Academic Press, 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro (M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225: 900, 1993); Manipulation the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994) (Непатентный документ 1); Embryonic Stem Cells (Turksen, ed., Humana Press, 2002) (Непатентный документ 2).

EG-клетки могут быть получены стимуляцией фетальных половых клеток, известных как примордиальные половые клетки, на клетках-фидерах, таких как клетки MEF или клетки STO, таким же образом, что и ES-клетки, с использованием фактора ингибирования лейкемии (далее называемого LIF) и основного фактора роста фибробластов (далее называемого bFGF/FGF-2), или химических агентов, таких как форсколин (Matsui et al., Cell 70:841, 1992; Koshimizu et al., Development 122: 1235, 1996). Было подтверждено, что EG-клетки имеют свойства, очень близкие к свойствам ES-клеток и обладают плюрипотентностью (Thomson & Odorico, Trends Biotechnol. 18:53, 2000). Таким образом, во всем этом описании термин «ES-клетки» может включать и «EG-клетки».

После того как Thomson et al. впервые установили ES-клетки из примата (макака резуса) в 1995 году, концепция регенеративной медицины с использованием плюрипотентных стволовых клеток начала приближаться к области реалий (Патент США № 5843780; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995). Позднее эти исследователи использовали сходные способы для успешного выделения и установления линий ES-клеток из ранних эмбрионов человека (Science 282: 114, 1998). Позднее исследовательские группы в Австралии и Сингапуре представили сходные сообщения (Reubinoff et al., Nat. Biotech. 18: 399, 2000; Международная публикация патента № WO00/27995), и в настоящее время были зарегистрированы 20 различных линий ES-клеток человека в Национальных институтах здравоохранения США (NIH) (http://stemcells.nih.gov/registry/index). Gearhart et al. также удалось создать линию EG-клеток человека из примордиальных половых клеток человека (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998; Патент США № 6090622).

При использовании этих плюрипотентных стволовых клеток для получения материалов для исследований или продуктов регенеративной медицины важно, чтобы используемые способы пассирования поддерживали недифференцированное состояние и высокую эффективность (потенциал) пролиферации этих клеток. Клетки MEF или подобные клетки (такие как клетки STO) используют обычно в качестве клеток-фидеров (питающих клеток) для ES/EG-клеток для поддержания недифференцированного состояния и высокой эффективности пролиферации этих клеток. Важным является также добавление фетальной телячьей сыворотки (далее называемой здесь FBS) к культуральной среде и решающим является выбор FBS-продукта, который пригоден для культивирования ES/EG-клеток, обычно с добавлением FBS в количестве приблизительно 10-20%. LIF был также идентифицирован как фактор, который поддерживает недифференцированное состояние ES/EG-клеток, полученных из мышиного эмбриона (Smith & Hooper, Dev. Biol. 121:1, 1987; Smith et al., Nature 336:688, 1988; Rathjen et al., Genes Dev. 4:2308, 1990), и добавление LIF к культуре может более эффективно поддерживать недифференцированное состояние (см. следующую литературу: Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994) (Непатентный документ 1) и Embryonic Stem Cells (Turksen, ed., Humana Press, 2002) (Непатентный документ 2)).

Однако способы культивирования, используемые для этих классических ES/EG-клеток, являются непригодными, когда ES- (или EG-) клетки используются для регенеративной медицины или для других практических целей. Одной из причин этого является то, что ES-клетки человека являются нечувствительными к LIF и отсутствие клеток-фидеров вызывает смерть этих клеток или потерю недифференцированного состояния и дифференциацию в различные типы клеток (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Использование клеток-фидеров само по себе является другой проблемой, так как они как системы сокультивирования увеличивают издержки производства и малопригодны для крупномасштабного культивирования, в то время как отделение и очистка ES-клеток от клеток-фидеров является необходимой, когда фактически должны использоваться эти ES-клетки. В будущем, при применении ES-клеток человека и других плюрипотентных стволовых клеток в качестве источников клеток для регенеративной медицины и, в частности, для клеточной трансплантационной терапии, применение продуктов клеток, полученных из животных (не человека), таких как клетки MEF, и FBS будут нежелательными вследствие рисков, включающих потенциальную инфекцию этих ES-клеток вирусами других животных и загрязнение антигенными молекулами, которые могут узнаваться в качестве гетероантигенов (Martin et al., Nature Med. 11:228, 2005).

Таким образом, для усовершенствования способов культивирования ES/EG-клеток и их модификации для того, чтобы они были пригодными для будущего применения, должны быть предприняты активные действия для развития заменителей FBS (Международная публикация патента № WO98/30679) и для использования в качестве клеток-фидеров клеток человека вместо клеток MEF (Richards et al., Nature Biotech. 20:933, 2002; Cheng et al., Stem Cells 21:131, 2003; Hovatta et al., Human Reprod. 18:1404, 2003; Amit et al., Biol. Reprod. 68:2150, 2003). Другой заманчивой перспективой является развитие способов культивирования без использования питающих клеток (фидеров). Carpenter et al. сообщили, что посев ES-клеток в покрытой Матригелем или Ламинином культуральной чашке и добавление кондиционированной клетками MEF среды к культуральной среде делают возможным пролонгированное культивирование ES-клеток человека, которые сохраняют их недифференцированное состояние и плюрипотентность (Xu et al., Nature Biotech. 19:971, 2001 (Непатентный документ 3); Международная публикация патента № WO01/51616 (Патентный документ 1)). Той же самой группе удалось также создать более эффективную систему культивирования ES-клеток разработкой бессывороточной среды, содержащей добавленный bFGF/FGF-2 или фактор стволовых клеток (далее называемый здесь SCF) (Международная публикация патента № WO03/020920 (Патентный документ 2)). Система культивирования ES-клеток с использованием той же самой бессывороточной среды, не требующая питающих клеток (фидеров), сообщалась также израильской исследовательской группой (Amit et al., Biol. Reprod. 70:837, 2004 (Непатентный документ 4)). Недавно также сообщалось о способе поддержания недифференцированного состояния ES-клеток человека добавлением bFGF/FGF-2 и антагониста костного морфогенетического белка Noggin (Xu et al., Nature Methods 2:185, 2005). Отдельно было показано, что простое добавление ингибитора гликогенсинтазы-киназы (GSK)-3 к культуральной среде может эффективно поддерживать недифференцированное состояние ES-клеток мыши и человека без добавления факторов роста или подобных им и без использования клеток-фидеров (Sato et al., Nature Med. 10:55, 2004 (Непатентый документ 5)).

Таким образом, хотя предлагаются новые способы для культивирования плюрипотентных стволовых клеток без применения клеток-фидеров, фактическое осуществление и промышленное применение таких клеток потребует еще большей эффективности выращивания и способов культивирования плюрипотентных стволовых клеток.

Одним хорошо известным фактором, который поддерживает недифференцированное состояние мышиных ES/EG-клеток и увеличивает их эффективность пролиферации, является вышеуказанный LIF, и, хотя LIF-родственное семейство IL-6 подпадает под эту категорию (Yoshida et al., Mech. Dev. 45:163, 1994; Koshimizu et al., Development 122:1235, 1996), очень мало других примеров сообщалось в литературе. Недавно, сообщалось о бессыворточной среде, содержащей добавленные bFGF/FGF-2 или SCF для значительного усиления эффективности пролиферации ES-клеток человека (Международная публикация патента № WO03/020920 (Патентный документ 2)).

Вследствие активной, т.е. пролиферирующей природы ES-клеток в сравнении с другими типами клеток, мало попыток предпринималось для действительного исследования их эффективности пролиферации; однако, нужды регенеративной медицины потребуют увеличенной пролиферации таких клеток.

Одной из проблем, встречающейся в настоящее время в культивировании плюрипотентных стволовых клеток, является то, что эти клетки обычно образуют тесные колонии, и, следовательно, с ними трудно манипулировать для пассирования и т.п. Недифференцированные ES/EG-клетки обычно обнаруживаются в состоянии, в котором эти клетки прочно скреплены друг с другом, образуя колонии, т.е. клеточные массы с неразличимыми границами между клетками. Для обеспечения ES/EG-клеток для пассирования или экспериментов по индуцированию дифференцировки необходимо, следовательно, диспергирование этих колоний в течение, по возможности, кратчайшего периода времени обработкой растворами протеазы, такой как трипсин или т.п. Однако после выполнения этого диспергирование колоний ES/EG-клеток на индивидуальные клетки требует обработки относительно высокой концентрацией протеаз и/или интенсивного механического перемешивания, и такие процедуры существенно уменьшают жизнеспособность и способность к адгезии этих ES/EG-клеток.

Кроме того, поскольку ES/EG-клетки подвергаются спонтанной дифференцировке во время непрерывного культивирования в кластерном состоянии, они должны быть диспергированы в отдельные клетки во время пассирования, и пассирование должно выполняться до того, как колонии вырастут до чрезмерного размера. Например, мышиные ES-клетки обычно требуют проведения каждого пассирования в течение 2-3 дней, и если пассирование не проводят подходящим способом, клетки, которые отклонились от их недифференцированного состояния, могут появляться в виде кластера, что делает эти клетки непригодными для использования. Это не может быть преодолено просто добавлением достаточного количества фактора, который поддерживает недифференцированное состояние ES/EG-клеток, такого как вышеупомянутый LIF или ингибиторы GSK-3, и индуцируется избыточный рост колоний и клеток с дифференцированным фенотипом. Таким образом, ожидается, что способ выращивания ES/EG-клеток без образования колоний, т.е. с индивидуальными диспергированными клетками, должен быть крайне полезным для обеспечения ES/EG-клеток для промышленного применения. Однако таких попыток или успехов до настоящего времени не было.

Авторы данного изобретения предварительно высевали клетки F9, линию клеток эмбриональной карциномы, которая, как известно, нормально пролиферирует посредством образования колоний, на культуральную чашку, покрытую Е-кадгерином (Nagaoka et al., Biotechnol. Lett. 24:1857, 2002 (Непатентный документ 6)), и обнаружили, что это предотвращает образование колоний клеток (International Symposium on Biomaterials and Drug Delivery Systems, 2002.04.14-16, Taipei, Taiwan; 1^st Meeting of the Japanese Society for Regenerative Medicine, 2002.4.18-19, Kyoto, Japan). Конкретно, клетки F9 проявляли морфологию диспергированных клеток на культуральной чашке, имеющей Е-кадгерин (эпителиальный кадгерин, интегральный мембранный белок), который является известной молекулой адгезии для клеток F9, иммобилизованный на необработанной полистироловой культуральной чашке (далее называемой здесь «Е-cad-чашкой».

Клетки F9 проявляют фенотип, несколько сходный с ES-клетками, экспрессируя щелочную фосфатазу (далее называемую здесь ALP) или SSEA-1 и Oct-3/4, которые известны в качестве специфических маркеров ES/EG-клеток (Lehtonen et al., Int. J. Dev. Biol. 33:105, 1989, Alonso et al., Int. J. Dev. Biol. 35:389, 1991). Однако клетки F9 не требуют клеток-фидеров или LIF для поддержания недифференцированного состояния этих клеток и, следовательно, являются отличающимися по механизму поддержания их недифференцированного состояния. Кроме того, в то время как ES-клетки имеют триплобластный (тройной) потенциал дифференцировки во все три зародышевых листка, дифференцировка клеток F9 ограничивается эндодермальными клетками, и они не способны образовывать химеры. Другими словами, хотя клетки F9 используют в качестве модельной системы ES/EG-клеток в некоторых экспериментах, они отличаются от ES/EG-клеток во многих аспектах, в том числе по способу культивирования и условиям культивирования.

Таким образом, невозможно предсказать, на основе научных данных, может ли вышеупомянутая Е-cad-чашка использоваться в способах культивирования ES-клеток, которые не требуют клеток-фидеров, могут ли ES-клетки, культивируемые такими способами, пассироваться при сохранении их недифференцированного состояния и плюрипотентности и может ли быть увеличена эффективность пролиферации этих ES-клеток. Действительно, эффективность пролиферации клеток F9, культивируемых на Е-cad-чашке, является приблизительно эквивалентной эффективности пролиферации клеток F9, культивируемых на чашке для культивирования обычных клеток, и не получены данные, которые предполагали бы, что посредством этого может быть увеличена эффективность пролиферации ES-клеток.

Известно, что Е-кадгерин экспрессируется недифференцированными мышиными ES-клетками, и также хорошо известно, что межклеточная адгезия заметно ингибируется ES-клетками, которые лишены экспрессии гена Е-кадгерина вследствие модификации гена (Larue et al., Development 122:3185, 1996). Однако еще не предпринимались попытки использования Е-кадгерина в качестве субстрата адгезии в способе культивирования ES/EG-клеток.

Кроме эффективных способов культивирования, описанных выше, при предполагаемом использовании плюрипотентных стволовых клеток, таких как ES-клетки, в качестве лабораторного материала или для производства продуктов регенеративной медицины, необходима также разработка способов эффективного введения выбранных экзогенных генов в эти клетки и их экспрессии. В частности, одной стратегией для применения ES-клеток в регенеративной медицине для лечения различных заболеваний является модификация свойств этих клеток, таких как эффективность пролиферации и дифференцировки или чувствительность к лекарственным средствам, и это может быть удовлетворительно реализовано введением и экспрессией подходящих экзогенных генов в этих клетках. Для мышиных ES-клеток общеизвестно, что гены могут быть искусственно модифицированы с получением трансгенных мышей или мышей с нокаутом, для чего особенно полезными являются эффективные способы переноса гена.

Обычный перенос экзогенных генов в клетки часто выполняют с использованием таких агентов, как фосфат кальция, DEAE-декстран и препараты катионных липидов. Однако известно, что приложение таких способов к ES-клеткам приводит к более низкой эффективности, чем эффективность в случае других типов клеток (Lakshmipathy et al., Stem Cells 22:531, 2004 (Непатентный документ 8)). Сообщалось также о способах с использованием различных вирусных векторов для переноса экзогенных генов. Например, общеизвестными являются ретровирусные векторы (Cherry et al., Mol. Cell Biol., 20:7419, 2000), аденовирусные векторы (Smith-Arica et al., Cloning Stem Cells 5:51, 2003), лентивирусные векторы (Amaguchi et al., J. Virol. 74:10778, 2000; Asano et al., Mol. Ther. 6:162, 2002; Международная публикация патента № WO02/101057) и векторы вируса Сендай (Sasaki et al., Gene Ther. 12:203, 2005; Japanese Unexamined Patent Publication No. 2004-344001). Тем не менее, конструирование и получение вирусных векторов являются относительно сложными и требуют затрат времени, в то время как биологическая безопасность также является проблемой, в зависимости от вируса, и, следовательно, такие способы не являются удобными или универсально применимыми.

Таким образом, перенос экзогенного гена в ES-клетки наиболее часто осуществляли способом, известным как электропорация. Этот способ включает применение электрического импульса к клеткам для временного открывания пор в клеточных мембранах для введения экзогенного гена в клетки, и этот способ является чрезвычайно гибким способом. Недавно был создан усовершенствованный способ, названный нуклеофекцией, посредством которого экзогенный ген переносят непосредственно в клеточное ядро для достижения значимо более высокой эффективности экспрессии (Lorenz et al., Biotech. Lett. 26:1589, 2004; Lakshmipathy et al., Stem Cells 22:531, 2004 (Непатентный документ 8)). Однако этот способ требует специального генерирующего импульсы устройства, и получение оптимальных условий не является легким. Кроме того, необходимо сначала обработать эти клетки протеазой, такой как трипсин, для диспергирования индивидуальных клеток, и, следовательно, токсичность клеток является относительно высокой.

Таким образом, наиболее применимыми способами переноса гена для плюрипотентных стволовых клеток, таких как ES-клетки, могли бы быть способы использования агентов переноса гена, которые являются недорогими и удобными для получения и могли бы сделать возможным эффективный перенос экзогенных генов в клетки, культивируемые в термостате.

Непатентный документ 1: Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994).

Непатентный документ 2: Embryonic Stem Cells (Turksen, ed., Humana Press, 2002).

Непатентный документ 3: Xu et al., Nature Biotech. 19:971, 2001.

Непатентный документ 4: Amit et al., Biol. Reprod. 70:837, 2004.

Непатентный документ 5: Sato et al., Nature Med. 10:55, 2004.

Непатентный документ 6: Nagaoka et al., Biotechnol. Lett. 24:1857, 2002.

Непатентный документ 7: Nagaoka et al., Protein Eng. 16:243, 2003.

Непатентный документ 8: Lakshmipathy et al., Stem Cells 22:531, 2004.

Патентный документ 1: Международная публикация патента № WO01/51616.

Патентный документ 2: Международная публикация патента № WO03/020920.

Описание изобретения

В свете этих обстоятельств, задачей данного изобретения является обеспечение способа культивирования плюрипотентных стволовых клеток, таких как ES-клетки, без применения клеток-фидеров, при котором увеличивается эффективность пролиферации и увеличивается эффективность переноса гена.

Для решения описанных выше проблем авторы данного изобретения исследовали возможности увеличения эффективности пролиферации и увеличения эффективности переноса гена для ES-клеток культивированием клеток в состоянии без образования колоний или, другими словами, в диспергированном состоянии.

Как упоминалось выше, авторам данного изобретения удалось культивировать клетки F9, линию клеток эмбриональной карциномы, без образования колоний, т.е. в диспергированном состоянии. При приготовлении чашки для культивирования клеток, которая имела Е-кадгерин, иммобилизованный или нанесенный в виде покрытия на твердофазной поверхности, (Е-cad-чашки), и посеве клеток F9 на этой Е-cad-чашке, клетки F9 проявляли морфологию диспергированных клеток без образования колоний. Эффективность пролиферации была по существу одинаковой для клеток F9, культивированных на Е-cad-чашке, и клеток F9, культивированных на обычной чашке.

При попытке посева ES-клеток на Е-cad-чашке фактически все клетки прикреплялись к этой чашке, и они проявляли морфологию диспергированных клеток без образования клеток, сходную с морфологией клеток F9. Наиболее примечательно, что эффективность пролиферации ES-клеток, посеянных на Е-cad-чашке, при этих условиях культивирования была значимо более высокой, чем эффективность пролиферации ES-клеток, культивируемых на обычной чашке. Эффективность переноса экзогенных генов и уровень экспрессии также были значимо более высокими.

Дополнительно было подтверждено, что ES-клетки, пассированные много раз на Е-cad-чашке, являются все еще недифференцированными и сохраняют их плюрипотентность при добавлении к этой жидкой среде фактора, который поддерживает недифференцированное состояние. Кроме того, было продемонстрировано, что ES-клетки, полученные с использованием вышеописанного способа, могут быть индуцированы к дифференцировке в функциональные дифференцированные клетки, такие как нейроны и кардиомиоциты, с использованием известных способов и что могут быть генерированы химерные мыши трансплантацией этих клеток в ранние мышиные эмбрионы, на чем данное изобретение было завершено.

Таким образом, в соответствии с первым вариантом осуществления данного изобретения обеспечен новый способ выращивания плюрипотентных стволовых клеток, таких как ES-клетки, который не требует клеток-фидеров. Способ согласно изобретению характеризуется тем, что используемый для культивирования сосуд имеет молекулу, прикрепляющую плюрипотентную стволовую клетку, иммобилизованную или нанесенную на субстратную твердофазную поверхность при заданной заранее плотности, посредством чего эти клетки могут культивироваться в диспергированном состоянии для увеличения способности пролиферации. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные таким образом, сохраняют недифференцированное состояние и плюрипотентность.

В соответствии со вторым вариантом осуществления способ согласно изобретению характеризуется тем, что используемый для культивирования сосуд имеет молекулу, прикрепляющую плюрипотентную стволовую клетку, иммобилизованную или нанесенную на субстратную твердофазную поверхность при заданной заранее плотности, посредством чего культивирование этих клеток в диспергированном состоянии может увеличивать эффективность переноса гена в эти клетки.

В качестве другого варианта осуществления данное изобретение обеспечивает плюрипотентные стволовые клетки, имеющие недифференцированное состояние и плюрипотентность, которые получены способом, описанным в данном изобретении. Для целей данного описания, “недифференцированное” состояние плюрипотентных стволовых клеток может быть подтверждено экспрессией по меньшей мере одного маркера отсутствия дифференцировки.

В соответствии с другим вариантом осуществления данное изобретение обеспечивает дифференцированные клетки, полученные посредством подходящей обработки, индуцирующей дифференцировку, из плюрипотентных стволовых клеток, полученных способом, описанным в данном изобретении. Дифференцированные клетки особо не ограничиваются, пока они являются типом клеток, дифференцировка которых может быть обычно индуцирована из плюрипотентных стволовых клеток. Конкретно, могут быть упомянуты эктодермальные клетки или произведенные из эктодермы клетки, мезодермальные клетки или произведенные из мезодермы клетки, эндодермальные клетки или произведенные из эндодермы клетки, и т.п.

Согласно другому варианту осуществления данное изобретение относится к способу генерирования химерного эмбриона или химерного животного с использованием плюрипотентных стволовых клеток, полученных способом, описанным в данном изобретении, и к генерированному химерному эмбриону или химерному животному.

Прежде всего данное изобретение относится к следующим аспектам.

(1) Способ выращивания плюрипотентных стволовых клеток, характеризующийся выращиванием плюрипотентных стволовых клеток в диспергированном состоянии при сохранении их недифференцированного состояния и плюрипотентности, с использованием жидкой среды и сосуда для культивирования, имеющего иммобилизованную или нанесенную на твердофазную поверхность субстрата молекулу, которая является адгезивной в отношении этих плюрипотентных стволовых клеток, без использования клеток-фидеров.

(2) Способ переноса гена для плюрипотентных стволовых клеток, характеризующийся эффективным переносом гена в плюрипотентные стволовые клетки и экспрессии его, с использованием жидкой среды и сосуда для культивирования, имеющего иммобилизованную или нанесенную на твердофазную поверхность субстрата молекулу, которая является адгезивной в отношении плюрипотентных стволовых клеток.

(3) Способ по (1) или (2) выше, где молекула, которая является адгезивной в отношении этих плюрипотентных стволовых клеток, является либо молекулой, которая экспрессируется этими плюрипотентными стволовыми клетками, либо молекулой, которая является структурно гомологичной с этой молекулой и имеет гомофильную связывающую способность с плюрипотентными стволовыми клетками.

(4) Способ по (3) выше, где молекула, которая является адгезивной в отношении этих плюрипотентных стволовых клеток, является молекулой, принадлежащей к семейству кадгеринов.

(5) Способ по (4) выше, где молекулой, принадлежащей к семейству кадгеринов, является Е-кадгерин или молекула, которая имеет структурную гомологию с этой молекулой, которая содержит домен ЕС1 и один или несколько доменов из домена ЕС2, домена ЕС3, домена ЕС4 и домена ЕС5 Е-кадгерина и которая имеет гомофильную связывающую способность с плюрипотентными стволовыми клетками.

(6) Способ по (5) выше, где Е-кадгерин получен из млекопитающего.

(7) Способ по (6) выше, где Е-кадгерин получен из человека или мыши.

(8) Способ по любому из (1)-(7) выше, где молекула, которая является адгезивной в отношении плюрипотентных стволовых клеток, слита с Fc-районом иммуноглобулина и иммобилизована на твердофазной поверхности субстрата посредством этого Fc-района.

(9) Способ по любому из (1)-(8) выше, где эти плюрипотентные стволовые клетки являются эмбриональными стволовыми клетками (ES-клетками) или эмбриональными половыми клетками (EG-клетками) млекопитающего.

(10) Плюрипотентные стволовые клетки, полученные способом по любому из (1)-(9) выше.

Краткое описание графического материала

Фиг.1 является парой диаграмм, показывающих адгезию ES-клеток (линий клеток R1 и ЕВ3) c E-сad-Fc, нанесенным на полистироловую чашку. Степень адгезии представляет относительную величину, в которой за 100% принято количество ES-клеток, прилипших к чашке, покрытой желатином (0,1%). БСА: группа с ES-клетками, прилипшими к чашке, покрытой 0,1% бычьим сывороточным альбумином. *: относительно группы с желатином,

р<0,01.

Фиг.2 является рядом фотографий, показывающих морфологию ЕS-клеток, посеянных на E-cad-Fc-чашке. Эти изображения клеток получали спустя два дня после посева ES-клеток на чашку, покрытую желатином, коллагеном типа I, фибронектином или E-cad-Fc.

Фиг.3А является диаграммой, показывающей эффективность пролиферации ЕS-клеток, посеянных на E-cad-Fc-чашке. ES-клетки высевали на чашке с желатином (указанной как Контроль) или на чашке E-cad-Fc и количества клеток сравнивали на третий день. *: относительно группы Контроль, р<0,01.

Фиг.3В является диаграммой, показывающей поглощение BrdU ES-клетками, посеянными на E-cad-Fc-чашке. ES-клетки высевали на чашке с желатином (указанной как Контроль) или на чашке E-cad-Fc и метили BrdU. BrdU, проникший в эти клетки, детектировали спустя три дня окрашиванием при помощи антитела с использованием флуоресцентного красителя. *: относительно группы Контроль, р<0,01.

Фиг.4А является рядом фотографий, показывающих экспрессию маркера для недифференцированного состояния ЕS-клеток, посеянных на E-cad-Fc-чашке. ЕS-клетки (линию клеток ЕВ3) высевали на чашке с желатином (указанной как Контроль) или на чашке E-cad-Fc и активность ALP детектировали на 14-ый день культивирования. На этой фигуре, LIF(+) и (-), соответственно, указывают добавление/отсутствие добавления LIF к культуральной среде.

Фиг.4В является рядом фотографий, показывающих экспрессию маркеров для недифференцированных ES-клеток, посеянных на E-cad-Fc-чашке. ES-клетки (линию клеток ЕВ3) высевали на чашке с желатином (указанной как Контроль) или на чашке E-cad-Fc и белок Oct-3/4 детектировали на 14-ый день культивирования. DAPI: ядерное окрашивание с использованием DAPI. Наложенные: Наложение DAPI и красителя антитела Oct-3/4.

Фиг.5 является рядом фотографий, показывающих экспрессию маркеров для недифференцированных ЕS-клеток, посеянных на E-cad-Fc-чашке. ES-клетки (линию клеток ЕВ3) высевали на чашке с желатином (указанной как Контроль) или на чашке E-cad-Fc и экспрессии гена Oct-3/4 и гена Rex-1 исследовали при помощи ОТ-ПЦР на 14-ый день. Символы + и - на этой фигуре, соответственно, представляют добавление и отсутствие добавления LIF к культуральной среде.

Фиг.6 является диаграммой, показывающей LIF-реактивность ЕS-клеток, посеянных на E-cad-Fc-чашке. ЕS-клетки (линию R1) высевали на чашке с желатином (указанной как Контроль) или на чашке E-cad-Fc и культивировали при различных концентрациях LIF для образования колоний и активность ALP детектировали для измерения доли «недифференцированных» колоний. *: относительно Cont/LIF 1000 Е/мл, р<0,05.

Фиг.7 является рядом фотографий, показывающих плюрипотентность ЕS-клеток, пассированных на E-cad-Fc-чашке. ЕS-клетки (линию R1), посеянные и пассированные на чашке с желатином (указанной как Контроль) или на чашке E-cad-Fc, регенерировались и ЕВ образовывался в бессывороточной среде для индукции дифференцировки. Пробы, извлеченные в день 16 после образования ЕВ («ЕВ» на этой фигуре), использовали для исследования экспрессии генов различных маркеров дифференцировки при помощи ОТ-ПЦР. В качестве контрольных групп использовали ES-клетки перед вышеупомянутым пассированием и 16-дневные ЕВ, образованные с использованием этих клеток (1-ая и 2-ая слева на этой фигуре, соответственно). T/Bra: T/Brachyury, βH1: гемоглобин, AFP: α-фетопротеин, TTR: транстиретин, GDPDH: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа.

Фиг.8 является парой фотографий, показывающих плюрипотентность ES-клеток, пассированных на E-cad-Fc-чашке. ES-клетки (линию R1), посеянные на E-cad-Fc-чашке, индуцировали для дифференцировки в нейроны (верхняя фотография) и кардиомиоциты (нижняя фотография). Эти фото показывают изображения клеток, фиксированные на 12-ый день после индукции дифференцировки и окрашенные антителом против маркеров, специфических в отношении нейронов и кардиомиоцитов.

Фиг.9 является парой фотографий, показывающих передачу через зародышевую линию половых клеток ES-клеток, культивируемых на E-cad-Fc-чашке. Химерную мышь, генерированную из ES-клеток, культивированных на E-cad-Fc-чашке, скрещивали с мышью дикого типа C57BL/6 и мышей-потомков подвергали ПЦР-анализу с использованием двух различных микросателлитных маркеров. М: маркер размера ДНК, ES: ES-клетки (линия ЕВ3), В6: мышь C57BL/6, #1-#4: особи, которые, как считают на основе цвета шерсти, не содержат ES-клеток, #5-#8: особи, которые, как считают на основе цвета шерсти содержат ES-клетки. Цифры на вертикальной оси представляют размер ДНК (п.н.).

Фиг.10 является диаграммой, показывающей перенос гена/эффективность экспрессии для ЕS-клеток, посеянных на E-cad-Fc-чашке. Клетки (ЕВ3) высевали на чашку с желатином (указанную как Контроль) или на E-cad-Fc-чашку и их подвергали переносу гена с использованием экспрессирующего вектора GFP. GFP в этих клетках после одного дня детектировали антителом-красителем, использующим флуоресцентный краситель, и измеряли интенсивность флуоресценции. *: относительно группы Контроль, р<0,01.

Фиг.11 является рядом фотографий, показывающих морфологию ES-клеток, посеянных на E-cad-Fc-чашке. Эти изображения клеток получали спустя два дня после посева ES-клеток на чашках, покрытых желатином (Контроль) или E-cad-Fc.

Наилучший вариант осуществления изобретения

(Определения)

Термин «плюрипотентные стволовые клетки" во всем данном описании относится к клеткам, способным к пролонгированной и фактически неограниченной пролиферации in vitro при сохранении их недифференцированного состояния, проявляющим нормальный кариотип (хромосомы) и имеющим способность дифференцироваться во все три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и эндодерму) при подходящих условиях. Термин "плюрипотентные стволовые клетки" включает, но не ограничивается ими, ЕS-клетки, выделенные из раннего эмбриона, и их аналогичные EG-клетки, выделенные из примордиальных половых клеток фетальной стадии. Во всем данном описании термин "ES-клетки" будет использоваться, как включающий “EG-клетки”.

Термин “недифференцированное состояние” во всем данном описании обозначает природу плюрипотентных стволовых клеток, проявляющих состояние отсутствия дифференцировки, которое может быть подтверждено на основе одного или нескольких маркеров недифференцированных ES-клеток, таких как ALP-активность или экспрессия гена (продукта) Oct-3/4, или на основе экспрессии различных антигенных молекул. Состояние отсутствия дифференцировкки плюрипотентных стволовых клеток означает, что плюрипотентные стволовые клетки способны к пролонгированной или фактически неограниченной пролиферации и проявляют нормальный кариотип (хромосомы) при наличии способности дифференцироваться во все три зародышевых листка при подходящих условиях.

Термин “плюрипотентность” во всем этом описании относится к способности дифференцироваться в различные типы клеток. Дифференцированные клетки конкретно не ограничиваются, пока они являются типом клеток, в котором дифференцировка может быть обычно индуцирована из плюрипотентных стволовых клеток. Конкретно, могут быть упомянуты эктодермальные клетки или произведенные из эктодермы клетки, мезодермальные клетки или произведенные из мезодермы клетки, эндодермальные клетки или произведенные из эндодермы клетки, и т.п.

Термин “жидкая среда” в контексте всего описания включает любую жидкую среду, которая может быть использована для общепринятых способов пассирования плюрипотентных стволовых клеток.

Термин “молекула адгезии плюрипотентных стволовых клеток во всем этом описании может относиться к молекуле, которая связывается и слипается аффинно с плюрипотентными стволовыми клетками, и она может быть молекулой любого из различных типов соединений, таких как белок, пептид, сахаридная цепь, низкомолекулярное соединение (лекарственное средство) или т.п. В качестве молекул, слипающихся с плюрипотентными стволовыми клетками, предпочтительными являются молекулы, которые экспрессируются в этих клетках и имеют гомофильную связывающую способность, и в качестве примера может быть упомянуто семейство молекул кадгеринов. Известно, что Е-кадгерин экспрессируется недифференцированными ES-клетками и является, следовательно, предпочтительным для использования, но нет особого ограничения этим белком. Когда слипающаяся молекула (молекула адгезии) является молекулой белка или пептида, может использоваться пептидный фрагмент, пока он имеет такую же активность прилипания (адгезии), что и эта молекула белка или пептида.

Слипающаяся с плюрипотентной стволовой клеткой молекула (молекула адгезии плюрипотентных стволовых клеток) может быть использована для способа культивирования данного изобретения посредством иммобилизации или нанесения ее на твердофазную поверхность сосуда для культивирования или культурального субстрата (далее называемых вместе «культуральным субстратом»). В качестве культуральных субстратов для данного изобретения могут быть использованы любые субстраты, которые обычно используют для культивирования клеток, такие как чашка или колба. Эти культуральные субстраты могут быть приготовлены из неорганических материалов, таких как стекло, или из органических материалов, таких как полистирол или полипропилен, но они являются предпочтительно стерилизуемыми материалами с высокой термостойкостью и влагостойкостью.

Способом, применяемым для иммобилизации или нанесения молекулы адгезии плюрипотентной стволовой клетки на твердофазную поверхность культурального субстрата, может быть физический способ, такой как адсорбция, или химический способ, такой как образование ковалентной связи, но адсорбционный способ является предпочтительным вследствие легкости работы. Искусственная антигенная молекула может быть добавлена к адгезионной молекуле или слита с адгезионной молекулой заранее для использования связывания специфическими в отношении этой антигенной молекулы антителами. В этом случае, эти специфические антитела должны быть иммобилизованы на твердой фазе или нанесены на твердую фазу культурального субстрата заранее физическим способом, таким как адсорбция, или химическим способом, таким как образование ковалентной связи.

Культуральный субстрат (подложка), приготовленный таким образом, может быть использован непосредственно для обычного культивирования плюрипотентных стволовых клеток. То есть, подходящее количество плюрипотентных стволовых клеток может быть суспендировано в обычно используемой жидкой среде или среде для культуры клеток, и эту смесь наносят на этот культуральный субстрат. Последующие замена жидкой среды и пассирование могут также проводиться таким же образом, каким они проводятся в общепринятых способах.

Термин «гомофильное связывание» относится во всем этом описании к связыванию клетка-клетка или клетка-субстрат посредством молекул адгезии, которое включает связывание или ассоциацию между одним и тем же типом молекулы адгезии.

Термин «клетки-фидеры» во всем данном описании относится к отдельным клеткам, также известным как клетки-подложки, которые культивируются заранее и выполняют роль поставляющих питательные вещества и факторы роста клеток, которые могут отсутствовать в среде, используемой для культивирования клеток, которые были бы не способны выживать и расти сами по себе. «Клетки-фидеры» включают, но не ограничиваются ими, клетки MEF и стромальные клетки, такие как клетки STO.

Термин «диспергированное состояние» относится в данном контексте к состоянию растущих клеток, прикрепленных к поверхности культурального субстрата, где не образуются отдельные колонии и индивидуальные клетки либо не находятся в контакте с другими клетками, либо, если они находятся в частичном контакте, имеют очень малую площадь контакта.

Термин «ген» во всем данном описании обозначает генетический материал и относится к нуклеиновой кислоте, включающей единицы транскрипции. Геном может быть РНК или ДНК, и им может быть природно встречающаяся или искусственно сконструированная последовательность. Ген необязательно должен кодировать белок, и, например, он может кодировать функциональную РНК, такую как рибозим или siRNA (короткую/малую интерферирующую РНК).

Другие преимущества и признаки данного изобретения, кроме описанного выше эффекта, будут объясняться в подробном описании обеспеченных ниже предпочтительных вариантов осуществления.

Если нет других указаний, для проведения данного изобретения могут быть использованы способы генной инженерии, применяемые в молекулярной биологии и технологии рекомбинантных ДНК, а также обычные протоколы клеточной биологии и общепринятые способы, со ссылками на стандартную литературу в данной области. Они включают, например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd Edition (Sambrook & Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. ed., John Wiley & Sons, 1987); Methods in Enzymology Series (Academic Press); PCR Protocols: Methods in Molecular Biology (Bartlett & Striling, eds., Humana Press, 2003); Animal Cell Culture: A Practical Approach, 3^rd Edition (Masters ed., Oxford University Press, 2000); и Antibodies: A Laboratory Manual (Harlow et al. & Lane ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987). Реагенты и наборы, используемые для культивирования клеток и экспериментов по биологии клеток, цитируемые во всем данном описании, являются доступными из коммерческих источников, таких как Sigma, Aldrich, Invitrogen/GIBCO, Clontech and Stratagene.

Могут также проводиться обычные способы культивирования и эксперименты по развитию и биологии клеток с использованием плюрипотентных стволовых клеток со ссылкой на стандартную литературу в данной области. Эта литература включает Guide to Techniques in Mouse Development (Wasserman et al. ed., Academic Press, 1993); Embryonic Stem Cells, Differentiation in vitro (M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Hogan et al. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994; и Embryonic Stem Cells (Turksen ed., Humana Press, 2002). Реагенты и наборы, используемые для культивирования этих клеток и экспериментов по развитию и биологии клеток, цитируемые во всем данном описании, являются доступными из коммерческих источников, таких как Invitrogen/GIBCO и Sigma.

Стандартные протоколы уже были созданы для генерирования, пассирования и консервирования плюрипотентных стволовых клеток мыши и человека, и они могут проводиться с использованием плюрипотентных стволовых клеток со ссылкой на вышеупомянутую литературу, а также на большое изобилие другой литературы (Matsui et al., Cell 70:841, 1992; Thomson et al., U.S. Patent No. 5,843,780; Thomson et al., Science 282:114, 1998; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998; Shamblott et al., U.S. Patent No. 6,090, 622; Reubinoff et al., Nat. Biotech. 18:399, 2000; International Patent Publication No. WO00/27995). Хорошо известны также способы установления клеточных линий ES-клеток или ES-подобных клеток для других видов животных, таких как, например, обезьяны (Thomson et al., U.S. Patent No. 5,843,780; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7844, 1966), крыс (Iannaccone et al., Dev. Biol. 163:288, 1994; Loring et al., International Patent Publication No. WO99/27076), куры (Pain et al., Development 122:2339, 1996; U.S. Patent No. 5,340,740; U.S. Patent No. 5,656,479), свиньи (Wheeler et al., Reprod. Fertil. Dev. 6:563, 1994; Shim et al., Biol. Reprod. 57:1089, 1997) и т.п., и ES-клетки, используемые для данного изобретения, могут быть получены в соответствии со способами, описанными для каждого из этих видов.

ES-клетки являются плюрипотентными стволовыми клетками, выделенными в виде агрегата недифференцированных стволовых клеток экстракцией клеточной массы во внутреннем пространстве эмбриона стадии бластоцисты, известной в качестве массы внутренних клеток, и перенесением ее в культуру in vitro, с повторяемыми отделением и пассированием этой клеточной массы. В качестве мышиных ES-клеток, известны различные линии, в том числе Е14, D3, CCE, R1, J1, EB3 и т.п., некоторые из которых могут быть получены из Американской Коллекции Типовых Культур, Cell & Molecular Technologies или Thromb-X. В настоящее время 50 линий ES-клеток человека были установлены (заложены) по всему миру, и 20 различных линий зарегистрированы в Национальном институте здравоохранения США (NIH) (http://stemcells.nih.gov/registry/index.asp). Некоторые из них могут быть получены из ES Cell Internаtional или из Wisconsin Alumni Research Foundation.

Линии ES-клеток обычно закладывают культивированием ранних эмбрионов, но ES-клетки могут быть также получены из ранних эмбрионов, полученных ядерным переносом ядер соматических клеток (Munsie et al., Curr. Biol. 10:989, 2000; Wakayama et al., Science 292:740, 2001; Hwang et al., Science 303:1669, 2004). Были также предложены способы для генерирования ES-клеток из эмбрион-подобных структур стадии бластоцисты, полученных переносом ядер клеток желаемых животных в другие виды ооцитов или денуклеированные ооциты, разделенные на несколько частей (известные как цитопласты или оопластоиды) (Международные публикации патентов с номерами WO 99/45100; WO01/46401; WO01/96532; U.S. Pregrant Publication Nos. 02/90722; 02/194637). Сообщались также попытка получения ES-клеток из партеногенетического эмбриона, развившегося до той же самой стадии, что и стадия бластоцисты (U.S. Pregrant Publication No. 02/168763; Vrana K et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:11911-6) и способ слияния ES-клеток с соматическими клетками для получения ES-клеток, имеющих генетическую информацию ядра соматической клетки (Международная публикация патента № WO00/49137; Tada et al., Curr. Biol. 11:1553, 2001). ES-клетки, используемые для данного изобретения, включают ES-клетки, полученные такими способами, и ES-клетки, хромосомная ДНК которых была модифицирована способами генной инженерии.

EG-клетки, используемые для этого изобретения, получают стимуляцией фетальных половых клеток, известных как примордиальные половые клетки, на клетках-фидерах, таких как клетки MEF, клетки STO или клетки Sl/Sl⁴-m220 химическим агентом, таким как LIF, bFGF/FGF-2 или форсколин, таким же образом, как в случае ES-клеток (Matsui et al., Cell 70:841, 1992; Koshimizu et al., Development 122:1235, 1996), и их свойства являются очень сходными со свойствами ES-клеток (Thomson & Odorico, Trends Biotechnol. 18:53, 2000). Как и в случае ES-клеток, EG-клетки, полученные слиянием EG-клеток с соматическими клетками (Tada et al., EMBO J. 16:6510, 1997; Andrew et al.), и EG-клетки, хромосомная ДНК которых была модифицирована способами генной инженерии, могут быть также использованы для способа данного изобретения.

Кроме того, плюрипотентные стволовые клетки, подлежащие использованию для способа выращивания данного изобретения, не ограничиваются ES-клетками или EG-клетками, а включают все плюрипотентные стволовые клетки, полученные из эмбриона или плода млекопитающего, пупочного канатика или ткани или крови взрослой особи, например, органов или костного мозга взрослых особей, и имеющие ES/EG-клетка-подобные признаки. Например, ES-подобные клетки, полученные культивированием половых клеток при специальных условиях культивирования, проявляют признаки, сходные с признаками ES/EG-клеток (Kanatsu-Shinohara et al., Cell 119:1001, 2004), и могут быть использованы в качестве плюрипотентных стволовых клеток. В качестве другого примера, могут быть упомянуты мультипотентные взрослые (сохраняющиеся во взрослых особях) клетки-предшественники/стволовые клетки (MAPS), выделяемые из клеток костного мозга и имеющие потенциал для дифференцировки во все три зародышевых листка. Кроме того, плюрипотентные стволовые клетки, полученные культивированием клеток эпителиального влагалища корня волоса или кератиноцитов (Международная публикация патента № WO02/51980), кишечных эпителиальных клеток (Международная публикация патента № WO02/57430) или клеток внутреннего уха (Li et al., Nature Med. 9:1293, 2003) при специальных условиях культивирования, и плюрипотентные стволовые клетки, полученные обработкой мононуклеарных клеток крови (или стволовых клеток, содержащихся в их клеточной фракции) с использованием M-CSF (макрофагального колониестимулирующего фактора) + ФМА (форбол-12-миристат-13-ацетат) (Zhao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2426, 2003) или антитела CR3/43 (Abuljadayel, Curr. Med. Res. Opinion 19:355, 2003), все включены также, пока их признаки сходны с признаками ES/EG-клеток. В этом случае, признаки, сходные с признаками ES/EG-клеток, могут быть определены как свойства клеточной биологии, уникальные для ES/EG-клеток, такие как присутствие поверхностных (антигенных) маркеров, специфических в отношении этих клеток, и экспрессия генов, специфических для этих клеток, а также потенциал образования тератомы и потенциал образования химерной мыши.

Данное изобретение относится к способу культивирования плюрипотентных стволовых клеток, в том числе ES-клеток, и характеризуется использованием молекул, прилипающих к плюрипотентным стволовым клеткам (далее называемых здесь “прилипающими к плюрипотентным стволовым клеткам молекулами”). Прилипающие к плюрипотентным стволовым клеткам молекулы, используемые для проведения данного изобретения, используются для способа культивирования данного изобретения будучи иммобилизованными или нанесенными на твердофазной поверхности сосуда для культивирования или культурального субстрата (далее называемых вместе культуральным субстратом). Любой культуральный субстрат может быть использован в качестве культурального субстрата данного изобретения, пока он позволяет культивировать плюрипотентные стволовые клетки, но предпочтительно он является культуральным субстратом, используемым для культивирования клеток предыдущего уровня техники. В качестве примеров культуральных субстратов для культивирования клеток могут быть упомянуты чашка, планшет, колба, слайд с камерой, пробирка, клеточная фабрика, роллерный флакон, вращающаяся колба, полые волокна, микроносители, гранулы и т.п. Эти культуральные субстраты могут быть изготовлены из неорганических материалов, таких как стекло, или из органических материалов, таких как полистирол, но предпочтительно использовать такие материалы, как полистирол, которые имеют высокие адсорбционные свойства для белков и пептидов, или материалы, которые были обработаны, например, гидрофильной обработкой или гидрофобной обработкой, для увеличения адсорбционных свойств. Предпочтительными являются также стерилизуемые материалы с высокой термостойкостью и высокой влагостойкостью. В качестве примера такого предпочтительного субстрата могут быть упомянуты полистироловая чашка и/или планшет без специальной обработки для культивирования клеток (далее называемые здесь “необработанным полистироловым планшетом”), наиболее часто используемые для культивирования E. coli и т.п., и такие культуральные субстраты является коммерчески доступными.

Прилипающей к плюрипотентной стволовой клетки молекулой (т.е. молекулой адгезии плюрипотентных стволовых клеток) является молекула, которая связывается аффинно с плюрипотентными стволовыми клетками или прилипает аффинно к плюрипотентным стволовым клеткам, и она может быть любого типа, такой как белок, пептид, сахаридная цепь, низкомолекулярное соединение или молекула, составленная из двух или нескольких из этих компонентов. О немногих молекулах адгезии сообщалось для недифференцированных ES/EG-клеток, но известно, что эти клетки экспрессируют, например, ICAM-1, VCAM-1 и NCAM, принадлежащие к суперсемейству иммуноглобулинов (Tian et al., Biol. Reprod. 57:561, 1997). Молекула адгезии плюрипотентных стволовых клеток является предпочтительно молекулой, которая экспрессируется на поверхностях клеточных мембран используемых плюрипотентных стволовых клеток, и более предпочтительно она является молекулой с гомофильной связывающей способностью. Гомофильное связывание для адгезии клеток означает связывание клетка-клетка или клетка-субстрат через молекулу адгезии. Известные молекулы адгезии, имеющие такие свойства, включают NCAM, L1, плексин и кадгерин, среди которых члены кадгеринового семейства молекул являются предпочтительно используемыми с точки зрения прочности адгезии. Сообщалось также, что Е-кадгерин специфически экспрессируется недифференцированными ES-клетками (Larue et al., Development 122:3185, 1996), и, следовательно, эта молекула является предпочтительной для применения. Однако подлежащие использованию молекулы адгезии не ограничиваются Е-кадгерином, и могут быть использованы любая из молекул семейства кадгеринов или молекул адгезии гомофильного связывания, экспрессируемые плюрипотентными стволовыми клетками. Может также проводиться модификация генов ES-клеток способом генной инженерии, приводящая к экспрессии полноразмерного или частичного гена, кодирующего молекулу с гомофильной связывающей способностью, даже если она в норме не экспрессируется ES-клетками, для использования этой молекулы в способе данного изобретения.

Кадгерины являются молекулами адгезии, участвующими в Са²⁺-зависимой межклеточной адгезии и связывании, известном как адгезивное связывание или адгезионно-соединительное связывание, и хорошо известны три типа, Е-(эпителиальный)-кадгерин, N-(невральный)-кадгерин и Р-(плацентарный)-кадгерин. Эти молекулы кадгерина являются мембраносвязанными гликопротеинами, состоящими из 700-750 аминокислотных остатков, и внеклеточный район содержит пять повторяющихся структур, известных как внеклеточные кадгериновые (ЕС) домены, состоящие из приблизительно 110 аминокислотных остатков. Например, доменами Е-кадгерина человека (аминокислотная последовательность SEQ ID NO:1 в списке последовательностей) являются ЕС1, ЕС2, ЕС3, ЕС4 и ЕС5, соответствующие аминокислотным остаткам 157-262, 265-375, 378-486, 487-595 и 596-700, соответственно (где эти номера положений являются остатками аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1). Доменами мышиного Е-кадгерина (аминокислотная последовательность SEQ ID NO:2 в списке последовательностей) являются ЕС1, ЕС2, ЕС3, ЕС4 и ЕС5, соответствующие аминокислотным остаткам 159-264, 267-377, 380-488, 489-597 и 598-702, соответственно (где эти номера положений являются остатками аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2). Эти ЕС-домены являются гомологичными среди различных молекул кадгеринов, причем особенно высокая гомология имеется между доменами, расположенными вблизи N-конца (ЕС1, ЕС2). В настоящее время известно, что более 50 кадгериновых молекул проявляют такую сходную структуру, и они сгруппированы вместе в семейство кадгеринов. Обзоры по кадгеринам могут быть найдены в Takeichi, Curr. Opin. Cell Biol. 7:619, 1995; Marrs & Nelson, Int. Rev. Cytol. 165:159, 1996; Yap et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13:119, 1997; Yagi & Takeichi, Genes Dev. 14:1169, 2000; Gumbiner, J. Cell Biol. 148:399, 2000 и в другом месте.

Е-кадгерин (также называемый кадгерином-1) широко экспрессируется в эпителиальных клетках, таких как паренхимные клетки внутренних органов, таких как печень, почки и легкие, и в кератиноцитах, и известно, что он является важной молекулой адгезии для межклеточной адгезии (см. обзоры в Mareel et al., Int. J. Dev. Biol. 37:227, 1993; Mays et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 60:763, 1995; El-Bahrawy & Pignatelli, Microsc. Res. Tech. 43:224, 1998; Nollet et al., Mol. Cell. Biol. Res. Commun. 2:77, 1999). Е-кадгерин экспрессируется также в изобилии на недифференцированных мышиных ES-клетках, и известно, что ES-клетки, лишенные экспрессии Е-кадгерина вследствие применения генной инженерии, имеют заметно ингибированную межклеточную адгезию (Larue et al., Development 122:3185, 1996). Кроме того, может быть подтверждено, что гены Е-кадгерина экспрессируются также в линиях ES-клеток человека, на основании информации, хранимой в публичной базе данных экспрессии генов при U.S. National Center for Biotechnology Information (NCBI).

Способ получения кадгериновых молекул, таких как Е-кадгерин или другие молекулы адгезии, для проведения данного изобретения, если эта молекула является белком или пептидом, предпочтительно предусматривает получение, очистку и использование рекомбинантного белка при помощи молекулярно-биологических способов, хотя этим не ограничивается. Могут быть использованы другие способы со сравнимыми результатами, и, например, молекула адгезии плюрипотентных стволовых клеток может быть использована после экстракции и очистки из живых ткани или клеток, или пептид может быть химически синтезирован для использования.

Стандартные протоколы уже были установлены для способов получения рекомбинантных белков и получения генов, кодирующих такие белки, как молекулы адгезии плюрипотентных стволовых клеток, и можно сослаться на цитируемую выше литературу, хотя и нет ограничения этой литературой. Например, для Е-кадгерина, ген Е-кадгерина уже был выделен и идентифицирован для животных, в том числе человека (SEQ ID NO:1), мыши (SEQ ID NO:2) и крысы, и соответствующие нуклеотидные последовательности доступны из публичных баз ДНК, таких как NCBI (номера доступа: (человек) NM_004360; (мышь) NM_009864; (крыса) NM_031334). Таким образом, специалист в данной области может сконструировать праймер или зонд, специфический для представляющего интерес гена Е-кадгерина, и использовать его в обычных молекулярно-биологических способах для получения и применения кДНК для гена Е-кадгерина. Альтернативно, кДНК для гена Е-кадгерина может быть получена из RIKEN Gene Bank (Tsukuba, Japan) или Американской Коллекции Типовых культур (АТСС) или Invitrogen/ResGen. Ген, кодирующий используемую молекулу адгезии, предпочтительно получают из того же вида животного, из которого получают плюрипотентные стволовые клетки, и, например, при проведении данного изобретения с использованием мышиных ES-клеток предпочтительно использовать кДНК мышиного Е-кадгерина. Однако может быть использована кДНК Е-кадгерина из отличающегося вида, такого как человек, обезьяна, корова, лошадь, свинья, овца, птица (например, курица) или земноводное (например, Xenopus laevis).

Пример подходящего способа получения рекомбинантного белка молекулы адгезии для применения в проведении данного изобретения характеризуется перенесением гена, кодирующего эту молекулу, в клетки млекопитающего, такие как клетки COS, клетки 293 или клетки СНО, и его экспрессией. Предпочтительно, этот ген связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, делающей возможными транскрипцию и экспрессию этого гена в широком диапазоне клеток млекопитающих, т.е. последовательностью промотора, таким образом, что транскрипция и экспрессия находятся под контролем этого промотора. Транскрибируемый и экспрессируемый ген также предпочтительно связан с сигналом присоединения полиА. В качестве предпочтительных промоторов могут быть упомянуты промоторы из вирусов, таких как SV 40 (обезьяний вирус), цитомегаловирус (CMV) или вирус саркомы Рауса, или промотор β-актина, промотор EF 1α (фактора элонгации) или т.п.

Ген, используемый для получения рекомбинантного белка, не должен обязательно содержать полноразмерную область гена, кодирующую эту молекулу, так как он может быть частичной последовательностью гена, пока молекула белка или пептида, кодируемая этой частичной последовательностью, имеет активность адгезии, эквивалентную активности или превышающую активность исходной молекулы. Например, Е-кадгерин, подходящий для применения в соответствии с данным изобретением, может быть рекомбинантным белком, сконструированным из частичных последовательностей, включающих аминокислотные остатки 690-710 из N-конца, кодирующие внеклеточный район, т.е. белок, содержащий ЕС1-ЕС5-домены. Поскольку домен, ближайший к N-концу, (ЕС1) молекулы кадгерина обычно определяет специфичность связывания или свойство гомофильного связывания этой молекулы (Nose et al., Cell 61:147, 1990), может быть сконструирована и использована молекула белка, содержащая по меньшей мере ЕС1 и лишенная одного или нескольких других доменов. Может быть также использован белок, имеющий по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% гомологию на уровне аминокислот с вышеупомянутой молекулой белка и проявляющий адгезионную активность.

Вышеупомянутый рекомбинантный белок может быть также получен в виде белка, слитого с другим белком или пептидом. Например, он может быть получен в виде белка, слитого с Fc-районом иммуноглобулина или с белком GST (глутатион-S-трансферазой), белком МВР (маннозусвязывающим белком), белком авидином, His-меткой (олигогистидином), НА (ГемАгглютинином), Mec-меткой, меткой VSV-G (гликопротеином вируса везикулярного стоматита) или т.п., и Белок А/G-колонка или колонка со специфическим антителом может быть использована для удобной и эффективной очистки этого рекомбинантного белка. Fc-слитый белок является особенно предпочтительным для проведения данного изобретения, так как он имеет более высокую способность адсорбироваться на культуральных субстратах, изготовленных из такого материала, как полистирол.

Многочисленные гены, кодирующие Fc-районы иммуноглобулина, уже были выделены и идентифицированы в млекопитающих, включая человека. О многих из их нуклеотидных последовательностей сообщалось, и, например, информация о нуклеотидных последовательностях, содержащих Fc-районы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, является доступной из публичных баз данных ДНК, таких как NCBI, причем эти последовательности зарегистрированы, соответственно, как номера доступа: AJ294730, AJ294731, AJ294732 и AJ294733. Таким образом, специалист в данной области может сконструировать праймер или зонд, специфический для Fc-района, и использовать его в обычных молекулярно-биологических способах для получения и применения кДНК, кодирующей этот Fc-район IgG1 или IgG2 человека или IgG2а или IgG2b мыши, которые имеют сильную связывающую аффинность в отношении Белка А/G. Известны способы усиления связывающей аффинности в отношении Белка А введением мутаций в Fc-районы (Nagaoka et al., Protein Eng. 16:243, 2003 (Непатентный документ 7)), и могут быть также использованы Fc-белки с генетическими модификациями в таких способах.

Примеры способов получения рекомбинантных белков для Е-кадгерина, которые являются предпочтительными для проведения данного изобретения, были опубликованы в литературе авторами данного изобретения (Nagaoka et al., Biotechnol. Lett. 24:1857, 2002 (Непатентный документ 6); Protein Eng. 16:243, 2003 (Непатентный документ 7)).

Коммерчески доступным является также очищенный рекомбинантный белок, полученный введением в мышиные клетки слитого гена, полученного связыванием кДНК, имеющей последовательность, кодирующую Fc-район IgG человека и последовательность His-метки, с кДНК, кодирующей внеклеточный район Е-кадгерина мыши или человека, и экспрессией этого рекомбинантного белка (Recombinant Human/Mouse E-cadherin-Fc Chimera; R&D Systems, Genzyme Techne), который может быть использован в качестве белка Е-кадгерина мыши и человека.

Способом для иммобилизации или нанесения молекулы адгезии плюрипотентных стволовых клеток на твердофазную поверхность культурального субстрата для проведения способа, описанного данным изобретением, может быть физический способ, такой как адсорбция, или химический способ, такой как образование ковалентной связи, но адсорбционный способ является предпочтительным вследствие легкости работы. Когда молекулой адгезии является молекула белка или пептида или когда она является высокомолекулярным соединением, содержащим сахаридные цепи, эта молекула может быть легко адсорбирована контактированием раствора этой молекулы с твердофазной поверхностью культурального субстрата, такого как чашка, и удалением растворителя после предписанного периода времени. Более конкретно, раствор молекулы адгезии, приготовленный с использованием растворителя, такого как дистиллированная вода или PBS, может быть отфильтрован и стерилизован и затем контактирован с культуральным субстратом, таким как чашка, и ему дают стоять в течение периода нескольких часов - полного дня/ночи для получения культурального субстрата для клеток с иммобилизованной или нанесенной на нем молекулой адгезии. Его предпочтительно используют после промывания несколько раз дистиллированной водой или PBS и замены сбалансированным солевым раствором, таким как PBS.

Искусственную антигенную молекулу предпочтительно соединяют или сливают с этой молекулой адгезии заранее, так как это позволит использовать связывание с антителами, специфическими для этой антигенной молекулы, и эффективно прикрепить эти молекулы адгезии на поверхности субстрата. В этом случае, эти специфические антитела должны быть иммобилизованы или нанесены на поверхности культурального субстрата заранее физическим способом, таким как абсорбция или химическим способом, таким как образование ковалентной связи. Например, для рекомбинантного белка, полученного слиянием Fc-района IgG с молекулой адгезии, антителом, присоединяемым заранее к культуральному субстрату, может быть антитело, которое специфически узнает этот Fc-район IgG. Для рекомбинантного белка, полученного слиянием белка- или пептида-метки с молекулой адгезии, антитело, специфическое для этой слитой молекулы, может быть присоединено заранее к культуральному субстрату для использования.

Молекула адгезии, иммобилизованная или нанесенная на твердофазной поверхности субстрата для культуры клеток, для проведения данного изобретения, может быть молекулой одного типа, или могут быть использованы в комбинации две или более различных молекул адгезии. В таких случаях, растворы каждой из молекул адгезии могут быть смешаны, и этот смешанный раствор может быть нанесен описанным выше способом.

Концентрация раствора молекулы адгезии должна соответствующим образом учитываться на основании адсорбции и/или аффинности этой молекулы и физических свойств этой молекулы, но для рекомбинантного белка, полученного слиянием Fc-района с внеклеточным районом Е-кадгерина, эта концентрация равна приблизительно 0,01-1000 мкг/мл, предпочтительно приблизительно 0,1-200 мкг/мл, даже более предпочтительно 1-50 мкг/мл и наиболее предпочтительно 5-10 мкг/мл.

Плюрипотентные стволовые клетки, используемые для проведения данного изобретения, высевают на культуральный субстрат, приготовленный описанным выше способом. Способ культивирования и условия культивирования для плюрипотентных стволовых клеток могут быть обычным способом культивирования и обычными условиями культивирования для плюрипотентных стволовых клеток, за исключением использования описанного выше культурального субстрата. Обычные способы культивирования и условия культивирования для плюрипотентных стволовых клеток описаны в вышеупомянутой литературе и, конкретно, в Guide to Techniques in Mouse Development (Wasserman et al., Academic Press, 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro (M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225: 900, 1993); Manipulation the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994); Embryonic Stem Cells (Turksen, ed., Humana Press, 2002); а также в других источниках (Matsui et al., Cell 70:841, 1992; Thomson et al., U.S. Patent No. 5,843,780; Thomson et al., Science 282:114, 1998; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998; Shamblott et al., U.S. Patent No. 6,090, 622; Reubinoff et al., Nat. Biotech. 18:399, 2000 и International Patent Publication No. WO00/27995), хотя и нет конкретного ограничения этими ссылками.

Жидкой средой, используемой для культивирования AscI, может быть любая среда, которая может быть использована в традиционных способах пассирования плюрипотентных стволовых клеток. В качестве конкретных примеров могут быть упомянуты модифицированная Иглом среда Дульбекко (DMEM), минимальная эссенциальная среда Глазгов (GMEM), среда RPMI 1640 и т.п., обычно с добавлением приблизительно 2 мМ глутамина и/или приблизительно 100 мкМ 2-меркаптоэтанола. Может быть также использована среда KnockOut DMEM (Invitrogen), определенная для ES-клеток DMEM (Cell & Molecular Technology) и TX-WES (Thrpomb-X), которые являются коммерчески доступными в качестве сред для культивирования ES-клеток. Такие среды предпочтительно содержат FBS, добавляемую до приблизительно 5-25%, но они могут также быть бессывороточными средами, замененными, например, 15-20% KnockOut Serum Replacement (Invitrogen). Могут быть также использованы культуральный супернатант клеток МEF или среда, содержащая добавленные bFGF/FGF-2, SCF или т.п., и подробные процедуры для этого являются общеизвестными (Xu et al., Nature Biotech. 19:971, 2001; Международная публикация патента WO01/51616; Международная публикация патента WO03/020920; Amit et al., Biol. Reprod. 70:837, 2004).

Жидкая среда для культивирования плюрипотентных стволовых клеток имеет также предпочтительно вещества и факторы, добавленные к ней, которые способствуют поддержанию недифференцированного состояния плюрипотентных стволовых клеток. Конкретные вещества и факторы не являются особо ограниченными, но LIF является предпочтительным для мышиных ES/EG-клеток. LIF является белковым фактором, который является общеизвестным из опубликованной литературы (Smith & Hooper, Dev. Biol. 121:1, 1987; Smith et al., Nature 336:688, 1988; Rathjen et al., Genes Dev. 4:2308, 1990), а также в виде номеров доступа X13967 (LIF человека), Х06381 (мышиный LIF) и NM_022196 (крысиный LIF), и его рекомбинантные белки могут быть получены, например, под товарным названием ESGRO (Chemicon). Добавление ингибитора GSK-3 к культуральной среде может эффективно поддерживать недифференцированное состояние ES-клеток мыши и человека без добавления других факторов роста или биологически активных факторов (Sato et al., Nature Med. 10:55, 2004). В этом случае, любое вещество, имеющее активность ингибирования активности GSK-3, может быть использовано, и может быть упомянуто, например, Wnt-семейство молекул (Manoukian & Woodgett, Adv. Cancer Res. 84:203, 2002; Doble & Woodgett, J. Cell Sci. 116:1175, 2003).

Посредством посева плюрипотентных стволовых клеток, которые поддерживались пассированием общепринятыми способами на культуральном субстрате, приготовленном по описанному выше способу, и культивированием с вышеуказанными условиями культивирования, и способом для проведения данного изобретения можно выполнять пассирование этих клеток в диспергированном состоянии при поддержании исходного недифференцированного состояния этих клеток. Поскольку плюрипотентные стволовые клетки, культивируемые в этом состоянии, физически не ингибируются во время деления клеток и/или механизмы ингибирования роста клеток, опосредованные межклеточным контактом не функционируют, и/или выживание клеток увеличивается и количество мертвых клеток уменьшается, наблюдается существенная пролиферация и рост клеток. В случае культивирования мышиных ES-клеток по способу данного изобретения, в качестве одного примера, можно достичь увеличения степени пролиферации по меньшей мере в 1,25 раза, предпочтительно в по меньшей мере 1,5 раза и более предпочтительно в по меньшей мере 2 раза в сравнении с культивированием общепринятым способом. Пассирование до приблизительно 4 генераций при этих условиях делает возможным получение по меньшей мере в 3 раза и предпочтительно по меньшей мере в 10 раз большего количества клеток, чем количество клеток, получаемых традиционными способами. Степень пролиферации может быть выражена такими показателями, как степень увеличения количества клеток или скорость удвоения на единицу времени, и используемыми способами измерения и расчета могут быть любые общеизвестные способы, используемые для обычных экспериментов с клетками.

Как объяснялось выше, состояние отсутствия дифферецировки плюрипотентных стволовых клеток означает, что плюрипотентные стволовые клетки способны к пролонгированной или фактически неограниченной пролиферации и проявляют нормальный кариотип (хромосомы) при наличии способности к дифференцировке во все три зародышевых листка при подходящих условиях. Предпочтительно они имеют также одно из других свойств плюрипотентных стволовых клеток, таких как сохранение активности теломеразы, образование тератомы или способность образования химер. Способы исследования природы и свойств клеток могут быть легко проведены с использованием установленных стандартных протоколов со ссылкой на цитированную выше литературу, например, Guide to Techniques in Mouse Development (Wasserman et al., Academic Press, 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro (M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225: 900, 1993); Manipulation the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994); или Embryonic Stem Cells (Turksen, ed., Humana Press, 2002), но нет конкретного ограничения только этими способами.

Плюрипотентные стволовые клетки в недифференцированном состоянии могут быть определены как клетки, для которых по меньшей мере один и предпочтительно более маркерных молекул могут быть подтверждены с использованием по меньшей мере одного и предпочтительно более чем одного способов, описанных ниже. Экспрессию различных маркеров, специфических в отношении недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток, детектируют общепринятыми биохимическими или иммунохимическими способами. Хотя нет конкретных ограничений в отношении используемого способа, предпочтительными являются иммунохимические способы, такие как иммуногистологическое окрашивание или иммуноблот-анализ. В таких способах могут быть использованы маркер-специфические поликлональные антитела или моноклональные антитела, которые связываются с недифференцированными плюрипотентными стволовыми клетками. Антитела, которые нацелены на индивидуальные специфические маркеры, являются коммерчески доступными и могут быть подходящим образом использованы. Специфические маркеры для недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток включают активность ALP и продукт экспрессии гена Oct-3/4 или гена Rex-1/Zfp42. Могут быть также использованы различные антигенные молекулы, которые включают маркеры отсутствия дифференцировки SSEA-1 для мышиных ES-клеток, SSEA-3 для ES-клеток человека, или SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, gCTM-2 и т.п. Их экспрессия уменьшается или элиминируется после дифференцировки ES-клеток.

Альтернативно, экспрессия маркеров недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток может быть подтверждена молекулярно-биологическими способами, часто используемыми в предыдущем уровне техники для желаемых маркерных белков, такими как использующая обратную транскриптазу полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) или гибридизационный анализ, независимо от конкретного способа. Известны последовательности нуклеиновых кислот для генов, кодирующих маркерные белки, специфические для недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток (например, Oct-3/4, Rex-1/Zfp42 или Nanog), и маркер-специфические последовательности, необходимые в качестве праймеров или зондов, могут быть легко определены из публичных баз данных, таких как NCBI.

Применение способа переноса генов в плюрипотентные стволовые клетки

Согласно другому варианту осуществления данного изобретения способ, описанный данным изобретением, может быть использован в качестве способа для эффективного переноса желаемого экзогенного гена в плюрипотентные стволовые клетки. Нет конкретных ограничений для переносимых экзогенных генов, и, например, речь может идти о природном белке, таком как фактор роста или рецептор, фермент, фактор транскрипции или т.п., или об искусственном белке, генерированном модификацией с использованием способа генной инженерии. Переносимый ген может быть также геном функциональной РНК, такой как рибозим или siRNA. Экзогенный ген может быть даже геном маркера для оценки эффективности переноса генов или стабильности экспрессии, такой как ген, кодирующий GFP (зеленый флуоресцентный белок) или β-галактозидазу, люциферазу или т.п.

В одном предпочтительном варианте осуществления подлежащий переносу экзогенный ген связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая делает возможной транскрипцию и экспрессию этого гена, т.е. последовательностью промотора, под контролем этого промотора, в форме, делающей возможными его транскрипцию и экспрессию. В таких случаях, этот ген предпочтительно связан с сигнальной последовательностью полиА. В качестве промоторов, которые делают возможными транскрипцию и экспрессию экзогенных генов в плюрипотентных стволовых клеток, могут быть упомянуты промоторы из вирусов, таких как вирус SV40, СMV или вирус саркомы Рауса, или промотор β-актина, промотор EF1α или т.п. В зависимости от цели, может быть также использована последовательность нуклеиновой кислоты, делающая возможными транскрипцию или экспрессию конкретного гена в определенных типах клетки/ткани или в клетках с конкретной стадией дифференцировки, т.е. последовательность клетка/ткань-специфического промотора или специфического в отношении стадии дифференцировки промотора или промотора Pol. III для экспрессии РНК. Эти последовательности промоторов могут быть использованы из публичных баз данных ДНК, таких как NCBI, и могут быть использованы обычные молекулярно-биологические способы для конструирования векторов генов, содержащих желаемые последовательности генов. Векторы для этих промоторов могут быть получены из Invitrogen, Promega, Ambion и других источников.

Способ введения гена (вектора) конкретно не ограничивается и могут быть упомянуты, например, способы трансфекции с использованием фосфата кальция или DEAE-декстрана. Способы трансфекции для клеток-мишеней переноса генов могут также использоваться с использованием липидных препаратов, которые могут быть поглощены этими клетками и имеют низкую цитотоксичность, такие как LipofectAMIN (Invitrogen), Superfect (Qiagen) или DOTMA (Roche), с образованием комплексов липосома-нуклеиновая кислота, содержащих ген-мишень. Альтернативно, представляющий интерес ген может быть включен в вирусный вектор, такой как ретровирус или аденовирус, и этот рекомбинантный вирус может быть использован для инфицирования клеток. В этом случае, этот вирусный вектор является реконструкцией последовательности нуклеиновой кислоты полноразмерной или частично недостаточной или мутированной вирусной ДНК или РНК представляющим интерес геном, включенным таким образом, что он может экспрессироваться.

Применение плюрипотентных стволовых клеток, выращенных по способу данного изобретения

Плюрипотентные стволовые клетки, которые были выращены согласно способу выращивания по данному изобретению, могут быть затем получены эффективно и в больших количествах в виде плюрипотентных стволовых клеток, поддерживающих их недифференцированное состояние, с использованием общеизвестных способов получения клеток. Способ переноса гена данного изобретения делает возможным эффективное и высокопроизводительное получение плюрипотентных стволовых клеток, имеющих желаемый ген, перенесенный и экспрессируемый в них. Полученные таким образом плюрипотентные стволовые клетки будут далее называться “плюрипотентными стволовыми клеткми, полученными согласно данному изобретению”.

В качестве способов извлечения плюрипотентных стволовых клеток могут быть упомянуты способы, использующие общеизвестную ферментативную обработку, которую используют обычным образом для пассирования плюрипотентных стволовых клеток. В качестве конкретного примера может быть упомянут способ, в котором среду удаляют из культурального сосуда, в котором культивировали плюрипотентные стволовые клетки, используют PBS для промывания несколько раз, предпочтительно 2-3 раза, добавляют раствор, содержащий подходящую протеазу (например, раствор, содержащий такую протеазу, как трипсин или диспаза), проводят культивирование при 37°С в течение подходящего периода времени, предпочтительно приблизительно 1-20 минут и более предпочтительно 3-10 минут, и затем эту смесь суспендируют в подходящем растворе, таком как вышеуказанная среда для культивирования ES-клеток, с получением отдельных клеток. Могут быть также использованы неферментативные способы, и, например, может быть упомянут способ, в котором среду удаляют из культурального сосуда, в котором культивировали плюрипотентные стволовые клетки, PBS используют для промывания несколько раз, предпочтительно 2-3 раза, добавляют раствор этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) до конечной концентрации 0,01-100 мМ, предпочтительно 0,1-50 мМ и более предпочтительно 1-10 мМ, для обработки при 37°С в течение подходящего времени, предпочтительно приблизительно 1-60 минут и более предпочтительно 10-30 минут, для отделения этих клеток и затем эту смесь суспендируют в подходящем растворе, таком как вышеуказанная среда для культивирования ES-клеток, для получения индивидуальных клеток. Тот же самый способ может проводиться с использованием этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)тетраацетата (ЭГТА) вместо ЭДТА.

Данное изобретение обеспечивает также дифференцированные клетки, полученные подходящей индуцирующей дифференцировку обработкой из плюрипотентных стволовых клеток, полученных согласно данному изобретению. Эти дифференцированные клетки конкретно не ограничиваются, пока они являются типом клеток, дифференцировка которых может быть обычно индуцирована из плюрипотентных стволовых клеток. Конкретно, могут быть упомянуты эктодермальные клетки или произведенные из экстодермы клетки, мезодермальные клетки или произведенные из мезодермы клетки, эндодермальные клетки или произведенные из эктодермы клетки, и т.п.

Произведенными из эктодермы клетками являются клетки, составляющие такие ткани и органы, как нервная ткань, шишковидное тело, мозговое вещество надпочечников, пластиды и эпидермальная ткань, но они не ограничиваются этими тканями и органами. Произведенными из мезодермы клетками являются клетки, составляющие такие ткани и органы, как мышечная ткань, соединительная ткань, костная ткань, хрящевая ткань, сердечная ткань, сосудистая ткань, кроветворная ткань, дермальная ткань, органы мочевой и репродуктивной системы, но они не ограничиваются этими тканями и органами. Произведенными из эндодермы клетками являются клетки, составляющие такие ткани и органы, как ткань пищеварительного тракта, респираторные органы или вилочковую железу, тиреоид, паратиреоид, мочевой пузырь, среднее ухо, ткань печени и поджелудочной железы, но они не ограничиваются этими тканями и органами.

Плюрипотентные стволовые клетки, полученные в соответствии с данным изобретением, и/или дифференцированные клетки, полученные из таких клеток, применимы для фармакологической оценки или оценки активности различных физиологически активных веществ (таких как лекарственные средства) или новых генных продуктов неизвестной функции. Например, они могут быть использованы для скрининга веществ и лекарственных средств, участвующих в функциональной регуляции плюрипотентных стволовых клеток или различных дифференцированных клеток, и/или веществ или лекарственных средств с токсичностью или ингибирующим действием в отношении плюрипотентных стволовых клеток или различных дифференцированных клеток. В настоящее время, очень мало способов скрининга было установлено с использованием клеток человека, и дифференцированные клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, полученных согласно данному изобретению, являются полезными источниками клеток для проведения таких способов скрининга.

Данное изобретение относится также к способу генерирования химерных эмбрионов или химерных животных с использованием плюрипотентных стволовых клеток, полученных согласно способу, описанному данным изобретением, и к генерированным химерным эмбрионам и химерным животным. Стандартные протоколы уже были установлены для генерирования химерных эмбрионов и химерных животьных, и они могут быть легко получены со ссылкой, например, на Manipulation the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Hogan et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994), хотя нет конкретного ограничения этой ссылкой.

Примеры

Данное изобретение будет теперь объясняться более подробно посредством следующих примеров, с пониманием того, что они являются только примерами этого изобретения и не предназначены для ограничения каким-либо образом объема изобретения.

Пример 1: Получение рекомбинантного белка Е-кадгерина

Способы конструирования вектора для экспрессии слитого белка, содержащего внеклеточный район мышиного Е-кадгерина и Fc-район IgG (IgG/Fc) (см. SEQ ID NO:25), (далее называемого «E-cad-Fc»), и для получения и очистки этого белка основаны на способах, сообщенных авторами данного изобретения (Nagaoka et al., Biotechnol. Lett. 24:1857, 2002 (Непатентный документ 6); Protein Eng. 16:243, 2003 (Непатентный документ 7)). Сначала ДНК-фрагмент, кодирующий внеклеточный домен (E-cad-ECD), (соответствующий аминокислотным остаткам 1-699), из кДНК Е-кадгерина, амплифицировали с использованием кДНК-матрицы, содержащей полноразмерную последовательность для мышиного Е-кадгерина (предоставляемой RIKEN; RDB No. 1184), в качестве матрицы. ДНК-фрагмент, кодирующий комплекс мышиный IgG/Fc, выделяли из кДНК, полученной выделением мРНК из экспрессирующей мышиный IgG1 гибридомы и выполнением обратной транскрипции с использованием обратной транскриптазы. После подтверждения нуклеотидных последовательностей обоих ДНК-фрагментов их встраивали в экспрессирующий вектор pRC-CMV (Invitrogen) для конструирования экспрессирующего вектора pRC-E-cad-Fc, содержащего последовательности E-cad-ECD и IgG/Fc.

Для получения белка E-cad-Fc использовали клетки СНО-К1 (полученные из RIKEN, Tsukuba). Линеаризованную плазмиду pRC-E-cad-Fc (1,0 мкг) смешивали с 5,0 мкл реагента Липофектамина™ (Invitrogen) и использовали для переноса гена в клетки СНО-К1 в соответствии с протоколом, рекомендуемым в инструкции к продукту. Затем для получения клона клеток, продуцирующих конститутивно и в больших количествах белок E-cad-Fc, эти клетки извлекали после второго дня от переноса гена и высевали при 0,2 клеток на лунку в 96-луночном планшете (IWAKI). После культивирования в течение 7 дней в среде RPMI 1640, содержащей 400 мкг/мл G418 (Invitrogen), культуральные супернатанты собирали из лунок с выжившими клетками и измеряли содержания белка E-cad-Fc в этих культуральных супернатантах. Клоны с наивысшим продуцированием белка E-cad-Fc (линии 4G7) выделяли и использовали для следующего эксперимента. Эти клетки кондиционировали в бессывороточной среде (СНО-S-SFM II; Invitrogen) и затем культивировали в виде массовой культуры с использованием вращаемой колбы и собирали культуральный супернатант.

Этот культуральный супернатант фильтровали с использованием мембранного фильтра 0,45 мкм и затем концентрировали с использованием ультрафильтрационной мембраны с размерами пор 100 кДа (YM100; Amicon) и перемешиваемой ячейки (Amicon 8200; Amicon). Концентрированный раствор диализовали с использованием 20 мМ фосфатного буфера (рН 7,2) и затем очищали обычным способом с использованием Белка А-колонки (Amersham Biosciences) и использовали в следующем эксперименте.

Пример 2: Адгезия ES-клеток с E-cad-Fc-чашкой

Исследовали адгезию ES-клеток с чашкой для культивирования клеток, покрытой белком E-cad-Fc (ниже называемой здесь «E-cad-Fc-чашкой»). PBS-разбавленный раствор белка E-cad-Fc выливали в необработанные полистироловые чашки для культивирования разных размеров и обрабатывали для нанесения покрытия при 37°С. После промывания и перед посевом этих клеток выполняли обработку блокирования в течение 1-2 часов 0,1% раствором BSA для предотвращения неспецифической адгезии этих клеток. В качестве контроля использовали чашки, покрытые BSA (0,1%), желатином (0,1%), коллагеном типа I (0,01%; KOKEN) или фибронектином (5,0 мкг/мл; KOKEN).

Используемыми линиями ES-клеток были клетки ЕВ3 (предоставленные профессором Хитоши Нива из RIKEN), клетки R1 (Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8424, 1993) и клетки 129SV (полученные из Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd.), и эти экспериментальные результаты не обнаруживали различий между различными линиями ES-клеток. Эти ES-клетки пассировали в соответствии со способами, описанными в Manipulation the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Hogan et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994) и в Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols (Turksen, ed., Humana Press, 2002), с использованием среды KnockOut-DMEM (Invitrogen), содержащей 10% FBS, 0,1 мМ раствор несущественных аминокислот МЕМ, 2 мМ L-глутамина и 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола (далее называемой здесь ESM), с добавлением 1000 Е/мл LIF (ESGRO; Chemicon), при поддержании их недифференцированного состояния, и их подавали для экспериментирования. ES-клетки, пассированные при этих условиях, будут называться далее «ES-клетками, пассированными при обычных условиях».

ES-клетки, пассированные при обычных условиях, промывали дважды бессывороточной средой и обрабатывали 0,25% раствором трипсина, содержащим 1 мМ ЭДТА, с получением отдельных клеток, которые суспендировали в ESM. Если нет других указаний, те же самые условия использовали после этого для отделения этих ES-клеток от чашки, пассирования и других экспериментов. Очищенный белок E-cad-Fc наносили на необработанный 96-луночный планшет (IWAKI) описанным выше способом и суспензию клеток, приготовленную при 3,0×10⁵ клеток/мл, высевали в нем при 100 мкл и культивировали в течение 4 часов. После промывания бессывороточной средой эту среду заменяли средой, содержащей 10% красителя Alamar Blue (Biosource International), в течение 4 часов реакции, после чего измеряли оптическую плотность в качестве показателя количества жизнеспособных клеток.

Эти результаты показаны на фиг.1. ES-клетки обычно имеют низкую способность к адгезии в сравнении с фибробластами и эпителиальными клетками, и они по существу не способны прилипать на полистироловом планшете, который является либо необработанным, либо обработан ВSА, и они образуют агрегированную клеточную массу в среде; однако, после предобработки планшета для культивирования желатином, коллагеном или фибронектином они способны прикрепляться таким же образом, как при посеве на обычную чашку для культивирования клеток. При испытании адгезионной способности ES-клеток с использованием планшета, покрытого различными концентрациями E-cad-Fc, как линия клеток R1, так и линия клеток ЕВ3 обнаруживала удовлетворительную адгезию при концентрациях 5,0 мкг/мл и выше. Между прочим, ES-клетки способны также прилипать к E-cad-Fc-чашке при бессывороточных условиях, и адгезия с этой чашкой явно является независимой от молекул адгезии в сыворотке, таких как фибронектин.

Известно, что связывание через Е-кадгерин является Са²⁺-зависимым (Mareel et al., Int. J. Dev. Biol. 37:227, 1993; Takeichi, Curr. Opin. Cell Biol. 7:619, 1995; Marrs & Nelson, Int. Rev. Cytol. 165:159, 1996). Для испытания действия добавления хелатообразующего агента на адгезию ES-клеток с E-cad-Fc-чашкой, ES-клетки, культивированные в течение 4 часов на E-cad-Fc-чашке, обрабатывали таким же образом в течение 30 минут этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) или этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)тетраацетатом (ЭГТА) при 5 мМ конечной концентрации и после промывания этих клеток PBS количества клеток измеряли с использованием красителя Alamar Blue, как описано выше. При обработке с использованием ЭДТА, который имеет низкую селективность в отношении ионов металлов, адгезия ES-клеток как с E-cad-Fc, так и с фибронектином нарушалась, но при обработке с использованием ЭГТА, который имеет высокую Са²⁺-селективность, связывание с фибронектином не ингибировалось и только связывание с Е-кадгерином нарушалось. Этот эффект не предотвращался даже добавлением 5 мМ Mg²⁺ для обработки ЭГТА. Эти результаты предполагают, что адгезия ES-клеток с E-cad-Fc-чашкой включает в себя взаимодействие между молекулами Е-кадгерина, присутствующими на поверхностях ES-клеток, и молекулами Е-кадгерина, иммобилизованными на твердофазной поверхности E-cad-Fc-чашки.

Затем ES-клетки, пассированные при обычных условиях культивирования, высевали в E-cad-Fc-чашке или 24-луночном планшете (IWAKI), покрытых другим субстратом, и проводили культивирование. Известно, что ES-клетки обычно образуют плотно прилегающие одна к другой, округлые колонии на клетках-фидерах или на обычной чашке для культивирования клеток. В этом случае, ES-клетки образовывали отдельные плотно прилегающие колонии того же типа даже в случае необработанной полистироловой чашки для культивирования, покрытой желатином, коллагеном типа I или фибронектином (см. фиг.2). Однако следует отметить, что ES-клетки, посеянные на E-cad-Fc-чашке, независимо от того, являются ли они клетками ЕВ3 или клетками R1, по существу не смогли образовать отдельные колонии даже после 2 или 3 дней после посева, и они обнаруживали вместо этого увеличение количества индивидуально диспергированных клеток.

Пример 3: Культивирование ES-клеток с использованием E-cad-Fc-чашки

Для исследования эффективности пролиферации ES-клеток на E-cad-Fc-чашке ES-клетки, пассированные при обычных условиях, извлекали и 500 из этих ES-клеток высевали на E-cad-Fc-чашке или на планшете, покрытом желатином (96-луночном планшете), и культивировали в течение 3-4 дней. После промывания этих клеток бессывороточной средой количества клеток измеряли с использованием красителя Alamar Blue, как описано выше. В результате, количество ES-клеток, культивируемых на E-cad-Fc-чашке, относительно количества ES-клеток, культивируемых на желатиновом планшете, после 3 дней культивирования было значимо более высоким как для линии клеток ЕВ3, так и для линии клеток R1 (см. фиг.3А). Количества клеток групп с E-cad-Fc-чашками с обеими линиями ES-клеток также были приблизительно в 2 раза более высокими в день 4 культивирования. При извлечении ES-клеток после четырех одинаковых пассажей и регистрации количеств клеток, количества культивируемых на E-cad-Fc-чашке ES-клеток были в 3-5 раз более высокими, чем в случае клеток, культивируемых на обычной желатиновой чашке. Не было различия между этими чашками в отношении степени адгезии непосредственно после посева этих ES-клеток, что предполагает, что ES-клетки, культивируемые на E-cad-Fc-чашке, имеют более высокую эффективность пролиферации и способность к выживанию. При проведении того же самого эксперимента с клетками F9 не обнаруживали различия в эффективностях пролиферации клеток культивируемой на E-cad-Fc-чашках группы и культивируемой на обычных чашках группы.

Затем исследовали синтез ДНК этих ES-клеток с использованием поглощения 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) в качестве показателя. ES-клетки, культивируемые в течение 3 дней в описанных выше условиях, извлекали в виде отдельных клеток после мечения BrdU (10 мкМ) в течение 30 минут и пересевали в 96-луночный планшет. Спустя 4 часа, прикрепившиеся ES-клетки фиксировали раствором FixDenat (Roche Applied Science) и промывали PBS, после чего давали им реагировать с анти-BrdU-антителом (BMG 6H8; Roche Applied Science) (100-кратное разведение) и окрашивали, используя цианоген 3(Cy3)-меченое антитело (Jackson Immunoresearch Laboratory) (разведение 1:1000). Ядра клеток окрашивали раствором 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (0,1 мкг/мл). Изображения антител и окрашивания красителем наблюдали с использованием системы ArrayScan™ (Cellomics). В результате, культивируемая на E-cad-Fc-чашке группа проявляла значимо более высокое поглощение BrdU в сравнении с культивируемой на обычных чашках группой (см. фиг.3В).

Известно, что ES-клетки обычно подвергаются спонтанной дифференцировке после образования больших, близко прилегающих колоний. Таким образом, при культивировании трех разных линий мышиных ES-клеток, используемых в этом эксперименте, на обычной чашке, эти колонии растут до чрезмерно больших размеров и продуцируют дифференцированные клетки различной морфологии, если их не пассируют каждые 2 или 3 дня. Однако при культивировании на E-cad-Fc-чашке достаточно пассировать только один раз каждые 5-7 дней, если уменьшить начальное высеваемое количество, и в этих условиях культивирования не наблюдали чрезмерного образования колоний или дифференцированных клеток. Таким образом, для проверки, сохраняли ли ES-клетки, культивируемые на E-cad-Fc-чашке, их недифференцированное состояние или сохранялось ли это диспергированное состояние и недифференцированное состояние этих ES-клеток даже после множественного пассирования, их пассировали несколько раз на этой чашке и исследовали свойства полученных ES-клеток.

Сначала исследовали активность ALP и экспрессии белка Oct-3/4 в качестве показателей недифференцированных ES-клеток для подтверждения дифференцированного состояния ES-клеток. Активность ALP детектировали с использованием набора Sigma Diagnostics Alkaline Phosphatase (Sigma). После промывания культивируемых ES-клеток (линий клеток ЕВ3 и R1) PBS их фиксировали раствором цитрата, содержащим 66% ацетон/3% формалин, и промывали PBS, после чего их обрабатывали в течение 15 минут щелочным окрашивающим раствором в нафтоле AS-BI-фосфата, включенным в этот набор для цветной реакции (см. фиг.4А).

Экспрессию белка Oct-3/4 исследовали при помощи иммуноокрашивания. Конкретно, культивируемые ES-клетки фиксировали 8% формальдегидом (Waco Pure Chemical Industries, Co., Ltd.) и промывали PBS и затем давали им реагировать с анти-Oct-3/4-антителом (продуктом Santa Cruz) (разведение 1:200) и окрашивали Alexa Fluor-меченым антителом (Alexa-488; Molecular Probes) (разведение 1:1000). Ядра клеток окрашивали раствором DAPI (0,1 мкг/мл). Изображения антител и окрашивания красителем наблюдали с использованием флуоресцентного микроскопа (см. фиг.4В).

В результате, высокая активность ALP (фиг.4А) и экспрессия белка Oct-3/4 (фиг.4В) были подтверждены с ES-клетками, культивируемыми в течение 14 дней на E-cad-Fc-чашке, сходным образом с ES-клетками, культивируемыми на чашке, покрытой желатином, используемой в качестве контрольной группы (далее называемой «желатиновой чашкой»).

Затем исследовали экспрессию генов Oct-3/4 и Rex-1/Zfp42 в качестве маркеров недифференцированных ES-клеток. ES-клетки, культивируемые на E-cad-Fc-чашке и желатиновой чашке в течение 14 дней, извлекали и тотальную РНК получали с использованием 1 мл TRIZOL (Invitrogen). Затем кДНК синтезировали обычным способом с использованием обратной транскриптазы M-MLV (Invitrogen) и ее использовали в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием следующих праймеров для амплификации каждого генного фрагмента.

Oct-3/4 [размер амплификации: 528 п.н.]

5'-праймер: 5'-GAAGTTGGAGAAGGTGGAACC-3' (SEQ ID NO:3)

3'-праймер: 5'-GCCTCATACTCTTCTCGTTGG-3' (SEQ ID NO:4)

Rex-1 [размер амплификации: 930 п.н.]

5'-праймер: 5'-AAAGTGAGATTAGCCCCGAG-3' (SEQ ID NO:5)

3'-праймер: 5'-TCCCATCCCCTTCAATAGCA-3' (SEQ ID NO:6)

Nanog [размер амплификации: 710 п.н.]

5'-праймер: 5'-GAGGAAGCATCGAATTCTGG-3' (SEQ ID NO:7)

3'-праймер: 5'-AAGTTATGGAGCGGAGCAGC-3' (SEQ ID NO:8)

GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) [размер амплификации: 858 п.н.]

5'-праймер: 5'-GGAAGCTTGTCATCAACGG-3' (SEQ ID NO:9)

3'-праймер: 5'-CTCTTGCTCAGTGTCCTTGC-3' (SEQ ID NO:10)

ПЦР проводили с использованием термоциклера TaKaRa PCR Thermal Cycler MP (TaKaRa) с использованием ДНК-полимеразы Taq TaKaRa (TAKARA) в качестве термостабильной ДНК-полимеразы. Сначала кДНК-содержащий раствор для ПЦР-реакции нагревали при 94°С и затем цикл нагревания 94°С:30 секунд → 59°С:30 секунд → 72°С:60 секунд повторяли 22 раза с последующим конечным нагреванием при 72°С в течение 5 минут и затем охлаждением до 4°С. Продукт ПЦР подвергали электрофорезу на 1,5% агарозном геле, окрашивали SYBR Green I (TAKARA) и детектировали с использованием Typhoon 8600 (Amersham Biosciences).

Эти результаты показаны на фиг.5. ES-клетки, культивированные на обычной желатиновой чашке, обнаруживали высокую экспрессию Oct-3/4, Rex-1 и Nanog в присутствии LIF со значимым уменьшением экспрессии в отсутствие LIF. Сходные результаты были обнаружены с ES-клетками, культивируемыми на E-cad-Fc-чашке, причем высокая экспрессия Oct-3/4, Rex-1 и Nanog обнаруживалась в присутствии LIF. Те же самые пробы использовали для испытания экспрессии генов маркеров дифференцировки для нейронов, мезодермальных клеток и эндодермальных клеток, таких как NeuroD3 или Sox-1, T-Brachyury, Flk-1, гемоглобин, α-фетопротеин и транстиретин, но экспрессия генов маркеров дифференцировки была обнаружена в присутствии LIF для ES-клеток, культивируемых либо на желатиновой чашке, либо на E-cad-Fc-чашке. Как видно из результатов на фиг.4А, 4В и 5, было подтверждено, что культивируемые на E-cad-Fc-чашке ES-клетки пролиферировали без образования колоний и обнаруживали иную морфологию, чем при обычном культивировании, при сохранении их недифференцированного состояния.

Затем исследовали, изменялась ли реактивность культивируемых на E-cad-Fc-чашке ES-клеток в отношении LIF. ES-клетки, пассированные на обычной желатиновой чашке и на E-cad-Fc-чашке, культивировали в течение 5 дней с концентрацией LIF 0-1000 Е/мл без пассирования и затем обе группы клеток пересевали на желатиновую чашку и культивировали еще в течение 3 дней (с постоянной концентрацией LIF во время периода культивирования). Активность ALP образованных на этих чашках колоний ES-клеток детектировали по способу, описанному выше, и измеряли долю колоний, сохраняющих недифференцированное состояние. Колонии с активностью ALP, обнаруживаемой в по меньшей мере 80% клеток, оценивали как «недифференцированные».

ES-клетки, культивируемые на желатиновой чашке, образовывали чрезмерно большие колонии в конце первых 5 дней культивирования, но не наблюдали клеток, которые могли бы быть явно оценены как являющиеся дифференцированными клетками. ES-клетки, культивируемые на E-cad-Fc-чашке, пролиферировали без образования колоний и сохраняли их диспергированное состояние, как и в предыдущем эксперименте. После пересева ES-клетки, культивируемые на обычной чашке с концентрацией LIF 1000 Е/мл, сохраняли активность ALP практически во всех из этих колоний, но доля недифференцированных колоний уменьшалась с понижением концентрации LIF (см. фиг.6). ES-клетки, культивируемые перед этим на E-cad-Fc-чашке, были способны сохранять свойства отсутствия дифференцировки фактически во всех из этих колоний, даже при концентрации LIF 100 Е/мл. Не обнаруживали ингибирования эффективности пролиферации при низкой концентрации LIF. Это предполагает, что культивирование с использованием E-cad-Fc-чашки позволяет уменьшать количество дополнительных факторов, необходимых для роста ES-клеток, таких как LIF, в сравнении со способами предыдущего уровня техники.

Затем исследовали, может ли E-cad-Fc-чашка использоваться для фидер-независимого кондиционирования ES-клеток. ES/EG-клетки обычным образом пассировали и поддерживали сокультивированием с клетками-фидерами, но их фидер-зависимое сотсояние культивирования может быть кондиционировано в фидер-независимое состояние. Однако это требует высокой плотности ES-клеток и повторяемого пассирования в среде, содержащей высокую концентрацию LIF (обычно 5-кратную или 10-кратную). Например, для того, чтобы ES-клетки (линии R1), выращиваемые в фидер-зависимом состоянии, были кондиционированы в фидер-независимое состояние, необходимо посеять эти клетки при плотности клеток приблизительно 5,0×10⁴ клеток/см² и добавить LIF в концентрации 1×10⁴ Е/мл. Однако можно кондиционировать ES-клетки в фидер-независимое состояние, как в предыдущем уровне техники, посевом ES-клеток на E-cad-Fc-чашку при плотности 500 клеток/см² и пассированием с ESM, содержащей 1×10³ Е/мл LIF. Было также подтверждено, что ES-клетки, полученные таким образом, в достаточной степени поддерживают их недифференцированное состояние и плюрипотентность.

Пример 4: Изучение способности к дифференцировке ES-клеток, культивируемых на E-cad-Fc-чашке

Было подтверждено, что ES-клетки, пассированные множественное число раз на E-cad-Fc-чашке, все еще имеют плюрипотентность. Сначала эти ES-клетки культивировали в суспензии в отсутствие LIF для образования эмбриоидных тел (ЕВ), и прогрессирование спонтанной дифференцировки исследовали на основе экспрессии нескольких генов маркеров дифференцировки. Конкретно, для образования ЕВ из ES-клеток, ES-клетки, пассированные по меньшей мере 3 раза на E-cad-Fc-чашке, извлекали в форме отдельных клеток и затем готовили капельку, содержащую 500 клеток, в 15 мкл не содержащей LIF ESM, для культуры в висячей капле. ЕВ, образованные в этой культуре висячей капли, периодически собирали и получение РНК и синтез кДНК выполняли описанными выше способами. ОТ-ПЦР-реакцию проводили с этой ДНК в качестве матрицы с использованием следующих праймеров для амплификации каждого фрагмента гена маркера.

NeuroD3 [размер амплификации: 405 п.н.]

5'-праймер: 5'-CATCTCTGATCTCGACTGC-3' (SEQ ID NO:11)

3'-праймер: 5'-CCAGATGTAGTTGTAGGCG-3' (SEQ ID NO:12)

Sox-1 [размер амплификации: 407 п.н.]

5'-праймер: 5'-GCACACAGCGTTTTCTCGG-3' (SEQ ID NO:13)

3'-праймер: 5'-ACATCCGACTCCTCTTCCC-3' (SEQ ID NO:14)

T/Brachyury-1 [размер амплификации: 528 п.н.]

5'-праймер: 5'-TCCAGGTGCTATATATTGCC-3' (SEQ ID NO:15)

3'-праймер: 5'-TGCTGCCTGTGAGTCACAAC-3' (SEQ ID NO:16)

Flk-1 [размер амплификации: 398 п.н.]

5'-праймер: 5'-TAGGTGCCTCCCCATACCCTGG-3' (SEQ ID NO:17)

3'-праймер: 5'-TGGCCGGCTCTTTCGCTTACTG-3' (SEQ ID NO:18)

гемоглобин [размер амплификации: 415 п.н.]

5'-праймер: 5'-AACCCTCAATGGCCTGTGG-3' (SEQ ID NO:19)

3'-праймер: 5'-TCAGTGGTACTTGTGGGACAGC-3' (SEQ ID NO:20)

α-фетопротеин [размер амплификации: 997 п.н.]

5'-праймер: 5'-TGCTCAGTACGACAAGGTCG-3' (SEQ ID NO:21)

3'-праймер: 5'-ACTGGTGATGCATAGCCTCC-3' (SEQ ID NO:22)

транстиретин [размер амплификации: 440 п.н.]

5'-праймер: 5'-AGTCCTGGATGCTGTCCGAG-3' (SEQ ID NO:23)

3'-праймер: 5'-TCAGAGGTCGGGCAGCCCAGC-3' (SEQ ID NO:24)

Эти результаты показаны на фиг.7. При удалении LIF из среды для индукции спонтанной дифференцировки ЕВ из ES-клеток, культивируемых на обычной желатиновой чашке, наблюдали экспрессию специфических генов маркеров трех зародышевых листков, включающих в себя эктодерму (NeuroD3, Sox-1), мезодерму (T-Brachyury, Flk-1, гемоглобин) и эндодерму (α-фетопротеин, транстиретин). Даже с использованием ES-клеток, культивируемых на E-cad-Fc-чашке, экспрессия маркерных генов всех трех зародышевых листков была подтверждена на приблизительно таком же уровне, что и в случае группы желатиновой чашки.

Затем исследовали способность ES-клеток к дифференцировке в нейроны и кардиомиоциты. Сообщалось, что сокультивирование ES-клеток с клетками-фидерами, которые являются стромальными клетками, посеянными заранее на чашку для культивирования, могло индуцировать дифференцировку ES-клеток в нейроны и/или кардиомиоциты (Yamane et al., Methods Mol. Biol. 184:261, 2002; Schroeder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:4018, 2003). Таким образом, способность ES-клеток дифференцироваться в нейроны испытывали в системе дифференциации с использованием клеток РА6, а способность дифференцироваться в кардиомиоциты испытывали в системе с использованием клеток ST2. Клетки РА6 или клетки ST2 (и те, и другие, полученные из RIKEN Cell Bank) высевали на 6-луночную чашку для культивирования клеток (CORNING) и культивировали до конфлюэнтности с использованием среды ДМЕМ (Invitrogen), содержащей 10% FBS, для использования в качестве клеток-фидеров. Затем готовили культуральную среду ES-клеток в виде отдельных клеток и клетки-фидеры промывали дважды PBS и засеивали при 2000 клеток на лунку. На следующий день эту культуральную среду заменяли средой ESM, содержащей 20% KnockOut Serum Replacement (Invitrogen), для системы дифференцировки в нейроны (РА6-фидер) и ESM, содержащей 10% FBS, для системы дифференцировки в кардиомиоциты (ST2-фидер). Эти клетки в день 12 культивирования фиксировали 70% раствором этанола и давали им взаимодействовать с антителом против ассоциированного с микротрубочками белка-2 (МАР-2) (АВ5622; Chemicon) или с антителом против миозина саркомера (MF20; Американская Коллекция Типовых Культур) в качестве первичного антитела и затем с меченым пероксидазой хрена вторичным антителом (Histofine Simple Stain PO (R) или PO (M); Nichirei Biosciences) и, наконец, проводили цветную реакцию с использованием раствора субстрата АСЕ (3-амино-9-этилкарбазола) (Nichirei Biosciences), после чего выполняли наблюдение с использованием оптического микроскопа. Результаты показаны на фиг.8.

Когда ES-клетки, культивированные на обычной желатиновой чашке, высевали на клетки РА6 при этих условиях культивирования, образовывались колонии до размера, наблюдаемого невооруженным глазом в пределах нескольких дней культивирования, и при приблизительно дне 7 культивирования наблюдали морфологическое изменение в дифференцированные клетки, обнаруживающие структуру неврита (аксона нервной клетки). Эти клетки были в сильной степени положительными в отношении маркера нейронов МАР-2, что свидетельствует о том, что эти ES-клетки дифференцировались в нейроны. ES-клети, посеянные на клетки ST2, образовывали колонии, проявляющие автономную пульсацию с дня 12 культивирования, и эти колонии клеток были в сильной степени положительными в отношении маркера кардиомиоцитов миозина саркомера, ясно показывая, что эти ES-клетки дифференцировались в кардиомиоциты. Дифференцировку в нейроны и кардиомиоциты подтверждали также с использованием ES-клеток, культивируемых на E-cad-Fc-чашке, сходным с контрольной группой образом. Эти экспериментальные результаты демонстрируют, что ES-клетки, культивируемые на E-cad-Fc-чашке, сохраняют их плюрипотентность in vitro.

Затем испытывали способность образования тератомы этих ES-клеток. Тератома представляет собой опухоль, содержащую фетальную ткань и развитую ткань из трех зародышевых листков эндодермы, мезодермы и эктодермы, которая образуется при трансплантации ES-клеток в животное, такое как мышь, и способность образования тератомы используют в качестве индикатора плюрипотентности ES-клеток.

ES-клетки (линию ЕВ3) высевали на желатиновую чашку и на E-cad-Fc-чашку и пассировали 5 раз каждые три дня. Эти ES-клетки инъецировали в яичники голой мыши Balb/c (приблизительно 200 клеток в каждый) с использованием обычных способов, и в день 60 образование тератомы было обнаружено во всех трансплантированных ES-клетками яичниках без заметного различия в размере опухоли между культивируемой на желатиновой чашке группой и культивируемой на E-cad-Fc-чашке группой. Кроме того, после приготовления срезов тканей обычным способом и наблюдения гистологии тератомы каждой из групп имели образование эктодермальных тканей/клеток, в том числе эпидерма-подобных тканей/клеток и нейронов, которые были положительными в отношении различных маркеров нейронов (βIII-тубулина, GFAР, нейрофиламента М, GAP-43), мезодермальных тканей/клеток, в том числе ткани, подобной костной ткани, хрящевой ткани и ткани скелетных мышц, и эндодермальных тканей/клеток, в том числе ткани, подобной кишечной ткани и бронхоэпителиальной ткани, и, следовательно, было подтверждено, что ES-клетки, культивируемые на E-cad-Fc-чашке, сохраняли способность образования тератомы.

Пример 5: Исследование способности образования химер ES-клеток, культивируемых на E-cad-Fc-чашке

Определяли, сохраняют ли ES-клетки, пассированные много раз на E-cad-Fc-чашке, способность образования химер. ES-клетки (линии клеток ЕВ3), взятые из одной и той же партии клеток замороженного исходного запаса, для которого было подтверждено, что он имеет способность образования химер, высевали на желатиновую чашку и E-cad-Fc-чашку и пассировали 5 раз каждые три дня. Эти ES-клетки инъецировали в бластоцисты мыши С57BL/6 (приблизительно 100 клеток в каждую) с использованием обычного способа и их трансплантировали в матки ложнобеременных мышей ICR (в возрасте 8-10 недель) и доводили до родов. Мыши С57BL/6 имеют обычно черную шерсть, но некоторые новорожденные особи имели приобретенные вследствие трансплантации ES-клеток шерсть цвета агути (с наличием светлого колечка на темном волосе на части тела (5-80%); в целом четыре такие химерные мыши были получены из ES-клеток, культивированных на желатиновой чашке, и в целом семь были получены из ES-клеток, культивированных на E-cad-Fc-чашке.

Затем этих химерных мышей скрещивали с нормальными мышами ICR с получением потомства, для подтверждения, что приобретенная из ES-клеток окраска шерсти была передана следующей генерации. Из двух химерных самцов мышей, полученных трансплантацией ES-клеток, культивированных на E-cad-Fc-чашке, были получены 14 и 17 детенышей, соответственно, из которых 5 и 6, соответственно, проявляли происходящий из ES-клеток цвет шерсти среди особей, обнаруживающих цвет шерсти мышей С57BL/6, бластоцисты которых использовали в качестве хозяев. Анализ микросателлитных маркеров, специфических для мышиного штамма, подтвердил, что эти особи имели генотип, происходящий из этих ES-клеток (фиг.9). Конкретно, получали геномную ДНК из каждой молодой особи общепринятым способом и четыре микросателлитных маркера D4Mit72, D4Mit116, D7Mit276 и D10Mit186, детектировали для детектирования генетического различия между мышами 129SV, происходящими из ES-клеток, и мышами C57BL/6, используемыми для генерирования химерных мышей и скрещивания. В результате, в особях, которые, как считали, не имеют генетического вклада ES-клеток, на основе цвета шерсти (№1-№4 на фотографии), было обнаружено то же самое распределение для всех микросателлитных маркеров, что и в случае мышей С57BL/6. С другой стороны, в особях, которые, как считали, имеют генетический вклад ES-клеток, на основе цвета шерсти (№5-№8 на фотографии), обнаружили как распределение мыши С57BL/6, так и распределение, специфическое для ES-клеток, что подтвердило, что гены ES-клеток были перенесены в эти особи.

Пример 6: Исследование степени переноса генов в ES-клетках, культивируемых на E-cad-Fc-чашке

Общепринятый способ с Липофектамином 2000 (Invitrogen) использовали для переноса экспрессирующего GFP вектора pEGFP-N2 (Clontech) в ES-клетки, которые культивировали в течение 3 дней на желатиновой чашке и на E-cad-Fc-чашке. Отдельные клетки извлекали после одного дня и пересевали их в 96-луночном планшете. Спустя 4 часа, прикрепившиеся Е3-клетки фиксировали в течение 10 минут 8% раствором формалина и затем их обрабатывали 0,2% раствором Тритон X-100/PBS и усилителем сигнала FX Image-iT (Invitrogen). После промывания PBS и реакции с моноклональным анти-СГР-антителом (Nacalai Tesque) выполняли окрашивание с использованием Alexa Fluor 546-меченого антитела против крысиного IgG. Ядра клеток окрашивали раствором DAPI (0,1 мкг/мл). Изображения антитела и красителя наблюдали с использованием системы ArrayScan™ (Cellomics). В результате, значимо более высокая экспрессия GFP была обнаружена в культивируемой на E-cad-Fc-чашке группе, чем на культивируемой на обычной чашке группе, что свидетельствует о том, что культивируемые на E-cad-Fc-чашке ES-клетки имели более высокую эффективность переноса генов, чем обычным образом культивируемые ES-клетки (см. фиг.10).

Пример 7: Получение белка E-cad-Fc человека и изучение применимости

Для конструирования вектора, экспрессирующего слитый белок внеклеточного района Е-кадгерина человека и IgG/Fc (см. SEQ ID NO:26), (далее называемый здесь hE-cad-Fc), кДНК из линии А431 плоскоклеточного рака человека использовали в качестве матрицы для амплификации ДНК-фрагмента (соответствующего аминокислотным остаткам 1-697), кодирующего внеклеточный домен Е-кадгерина человека (hE-cad-ECD). После подтверждения нуклеотидной последовательности он был встроен в экспрессирующий вектор, содержащий последовательность IgG/Fc, упомянутый в Примере 1, для конструирования pRC-hE-cad-Fc. Конструирование и очистку вектора hE-cad-Fc выполняли в соответствии со способом, описанным в Примере 1.

Исследовали адгезию и пролиферацию мышиных ES-клеток на чашках для культивирования клеток, покрытых белком hE-cad-Fc (далее называемых «hE-cad-Fc-чашками»). Способ приготовления hE-cad-Fc-чашек был таким же, что и способ, описанный в Примере 2 выше. Конкретно, PBS-разбавленный раствор белка hE-cad-Fc выливали в необработанные полистироловые чашки для культивирования и обрабатывали для покрытия на протяжении ночи при 37°С, для применения в качестве hE-cad-Fc-чашек. При посеве ES-клеток (линий ЕВ3 и R1) в эти чашки обнаруживали такую же сильную адгезию, какую обнаруживали при использовании чашек, покрытых мышиным белком E-cad-Fc. ES-клетки, посеянные в hE-cad-Fc-чашки, также не могли образовывать отдельные колонии даже спустя 2 или 3 дня после посева, и наблюдали отдельные клетки, которые были в диспергированном состоянии и активно пролиферирующем состоянии (фиг.11). Недифференцированное состояние и плюрипотентность этих ES-клеток также сохранялись, как и при культивировании с использованием E-cad-Fc-чашек.

Промышленная применимость

С использованием способа выращивания данного изобретения можно получать плюрипотентные стволовые клетки, такие как ES-клетки, эффективно и в крупном масштабе без применения клеток-фидеров. Кроме того, поскольку эти плюрипотентные стволовые клетки могут культивироваться в диспергированном состоянии, в значительной степени облегчаются пассирование и извлечение клеток. Может быть также уменьшено количество факторов, таких как LIF, которые добавляют к жидкой среде для культивирования. Кроме того, способ данного изобретения делает возможным эффективный перенос желаемых генов в плюрипотентные стволовые клетки, такие как ES-клетки, и позволяет получать высокие уровни их экспрессии. Полученные таким образом плюрипотентные стволовые клетки могут быть использованы для получения различных типов функционально дифференцированных клеток с использованием подходящих известных индуцирующих дифференцировку систем и являются полезными для фармакологической оценки или оценки активности различных физиологически активных веществ или новых генных продуктов с неизвестной функцией.

Claims (9)

1. Способ выращивания плюрипотентных стволовых клеток, характеризующийся выращиванием указанных плюрипотентных стволовых клеток в диспергированном состоянии с сохранением их недифференцированного состояния и плюрипотентности, с применением жидкой среды и культурального сосуда, имеющего иммобилизованную или нанесенную на твердофазную поверхность субстрата молекулу, которая является адгезивной в отношении указанных плюрипотентных стволовых клеток, без применения клеток-фидеров, где указанная молекула представляет собой слитый белок, содержащий внеклеточный домен Е-кадгерина и Fc-район иммуноглобулина.

2. Способ выращивания плюрипотентных стволовых клеток по п.1, в котором за указанной стадией выращивания следует перенос гена в указанные плюрипотентные стволовые клетки.

3. Способ по п.1 или 2, где молекулой, которая является адгезивной в отношении указанных плюрипотентных стволовых клеток, является либо молекула, которая экспрессируется указанными плюрипотентными стволовыми клетками, либо молекула, которая является структурно гомологичной указанной молекуле и обладает способностью гомофильного связывания с указанными плюрипотентными стволовыми клетками.

4. Способ по п.3, где молекулой, которая является адгезивной в отношении указанных плюрипотентных стволовых клеток, является молекула, принадлежащая к семейству кадгеринов.

5. Способ по п.4, где указанной молекулой, принадлежащей к семейству кадгеринов, является Е-кадгерин или молекула, которая имеет структурную гомологию с указанной молекулой, которая содержит домен ЕС1 и один или несколько доменов из домена ЕС2, домена ЕСЗ, домена ЕС4 и домена ЕС5 Е-кадгерина и которая обладает способностью гомофильного связывания с указанными плюрипотентными стволовыми клетками.

6. Способ по п.5, где указанный Е-кадгерин получен из млекопитающего.

7. Способ по п.6, где указанный Е-кадгерин получен из человека или мыши.

8. Способ по п.1 или 2, где молекула, которая является адгезивной в отношении указанных плюрипотентных стволовых клеток, слита с Fc-районом иммуноглобулина и иммобилизована на твердофазной поверхности указанного субстрата посредством указанного Fc-района,

9. Способ по п.1 или 2, где указанные плюрипотентные стволовые клетки являются эмбриональными стволовыми клетками (ES-клетками) млекопитающего или эмбриональными половыми клетками (EG-клетками) млекопитающего.

Images