KR20070114378A - 말초혈액으로부터 유도된 쉽게 이용가능한 세포 물질을 제공하는 방법 및 그의 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 포유류 말초혈액 줄기세포의 TVEMF-확장을 나타낸 것이고, CD34+/Cd38-세포를 나타낸 것이고, 조직의 치유방법을 나타낸 것이다.
말초혈액 줄기세포
Description
본 발명은 TVEMF-바이오리액터(TVEMF-bioreactor)에서 작성(조제)되는 말초혈액으로부터의 성체줄기세포(adult stem cell)를 나타낸 것으로, 이러한 작성을 위한 과정, 그의 구성, 및 상기 세포 또는 구성으로 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다.
포유류, 특히 인간 조직(tissue)의 재생은 의료계 공동의 오랜동안의 염원이었다. 따라서, 인간 조직의 치유는 기증자로부터의 조직의 이식(술)에 의해 크게 달성되었다. 초기에 헤릭 쌍둥이 중 하나로부터 다른 쌍둥이로의 이식을 시작으로 해서, 이후에 남아프리카 공화국의 의사인 크리스티안 버나드에 의해 데니스 다발로부터 루이스 와스칸스키로로 심장의 이식술이 1967년 12월 3일에 이루어졌고, 조직 이식술은 말기환자의 생명을 연장하는 방법으로 널리 수용되었다.
인간 조직의 이식(술)은 초기의 이용에서 주요한 문제인 인체의 자연면역시 스템으로 인한 초기의 조직 거부반응의 문제에 직면하였다. 이는 제한된 수명을 연장하기 위한 조직 이식술의 이용에서 발생된다(와스칸스키는 과거의 수술로 18일동안만 생존함).
인체의 자연면역시스템으로 인한 문제를 극복하기 위해서, 다수의 거부반응에 대항할 수 있는 약(항거부반응약)(예를 들면, 이무란(Imuran), 사이클로스포린(Cyclosporine) 등)이 면역시스템을 억제하기 위하여 개발되었고, 이에 따라 거부반응에 앞서 조직의 이용이 연장되었다. 그러나, 이러한 거부반응 문제는 계속적으로 발생되었고, 조직 이식(술)에 대한 다른 대안이 필요하게 되었다.
골수이식이 또한 이용되어 오고 있으며, 백혈병 같은 질병의 치료나 골수와 같은 조직의 치유를 위한 과정이 진행되고 있으나, 골수이식도 문제점을 갖고 있다. 기증자로부터 조화될 필요가 있고(당시에 50% 미만으로 발견됨), 고통이 있고 비싸며 위험하다. 따라서, 골수이식에 대한 대안이 높게 요구된다. 미국특허 제6,129,911호에 기재된 간줄기세포의 이식과 같은 조직줄기세포의 이식은 광범위한 이용에서의 문제점이 나타난 유사한 한계를 갖고 있다.
최근들어, 연구자들은 조직이식의 대안으로 다능성 배아줄기세포의 이용을 실험적으로 행하였다. 배아줄기세포의 이용에 대한 이론은 인체에서 실질적으로 조직을 재생시키는데 이론적으로 이용될 수 있는 것이었다. 그러나, 조직 재생을 위한 배아줄기세포의 이용도 문제에 직면하였다. 이러한 문제들은 이식된 배아줄기세포가 제한된 제어성을 갖는다는 것이고, 종양이 자라게 된다는 것이며, 또한 인간의 배아줄기세포는 환자의 면역시스템에 의해 거부될 수 있는 문제점이 있다(2002 년 6월 21일자 news@nature.com에 온라인으로 피어슨에 의하여 발표된 "Stem Cell Hopes Double": 2002년 6월 17일 네이처). 또한, 배아줄기세포의 광범위한 이용은 윤리상, 도덕상, 정치적인 면에서 부담이 되고, 이러한 광범위한 이용은 여전히 문제점이 존재한다.
줄기세포의 다능성 본질(pluripotent nature)은 처음에 골수에서 발견된 성체줄기세포(adult stem cells)로부터 나타났다. Verfaille, C.M. 등에 의해 중간엽 줄기세포의 다능성은 성체골수로부터 유도되었다. 이는 다음의 네이처 417호에 기재되었다; 2002년 6월 20일 news@nature.com에 온라인으로 발표; Pearson,H에 의한 Stem cell hopes double에 doi:10.1038/nature00900,(2002), 2002년 6월 21일에 온라인으로 발표; doi:10.1038/news020617-11.
Boyse 등에 의해 미국특허 제6,569,427 B1호에 빈혈과 같은 다양한 질병과 가벼운 질환, 악성종양, 자가면역질환, 및 다양한 면역 기능장애와 결핍의 치료나 방지하는데 있어서 저온보존된 태아 또는 신생아의 혈액의 냉동보존 및 이용하는 것이 기재되어 있다. 또한, 보이스는 이종의 유전자 순서를 이용한 유전자의 치료에서 조혈의 재구성의 이용에 대해서도 개재하였다. 그러나, 보이스는 치료의 이용에서 세포의 확장을 단기간에 정지시키는 것을 나타내었다. 제대혈 은행인 코셀(CorCell)은 제대혈 줄기세포의 확장, 냉동보존, 및 이식의 통계를 제공한다. 이는 코셀의 제대혈 정보시트인 "Expansion of Umbilical Cord Blood Stem Cells"에 기재되어 있다. 하나의 확장과정은 중앙 콜라겐 베이스 매트릭스로 바이오리액터를 이용하는 것을 나타낸다. 연구센터인 Julich는 2001년 5월 17일자에 바이오리액 터(bioreactor)로부터의 혈액줄기세포를 발표하였다.
연구자들은 줄기세포의 확장과 관련된 분자메커니즘을 밝히기 위한 노력을 계속하였다. 예를 들어, 코셀 기사에 제대혈 줄기세포의 개발에서 델타1 보조(Delta-1 aids)로 명명된 단일분자가 개재되었다. Ohishi K 등에 의한 임상조사 110:1165-1174(2002)에 의하면, 델타1은 골수 및 제대혈 세포인 CD34+/CD38-의 인간의 가슴샘(thymus) 재증식 능력을 강화시킨다.
본 발명의 전체에 결쳐서 "말초혈액(peripheral blood)"이란 용어는 포유동물에서 규칙적으로 순환하는 또는 순환하고 있는 혈액을 의미한다. 또한, "말초혈액세포(peripheral blood cells)"이란 용어는 말초혈액에서 발견된 세포를 의미한다.
성체줄기세포는 다수의 성체조직에서 발견될 수 있지만, 성체줄기세포는 작은 양으로 발견되고 위치시키는데 어렵다. 또한, 조직에서 발견된 줄기세포는 조직에 제공될 수 있고, 진정한 다능성 세포로서 기능하는데 적절치 않을 수 있다. 그러나, 말초혈액세포는 조직에서의 줄기세포보다 손쉽게 이용가능할 수 있다.
그러므로, 인간의 기관이식, 골수이식, 또는 배아줄기세포에 기초하지 않은 인간 조직을 치유하는 과정 및 방법을 제공할 필요가 있고, 여전히 확장된 말초혈액줄기세포의 구성을 제공할 필요가 있다. 치료조건 및 투약에 있어서 시기보다는 시각적인 면에서 면역반응을 이끌어내지 않게 하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명은 부분적으로 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터의 말초혈액 줄기세포에 관한 것으로, 바람직하게 상기 줄기세포는 TVEMF-확장된(TVEMF-expanded) 줄기세포이다. 또한, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터의 말초혈액 줄기세포에 관한 것이다.
본 발명은 포유동물로부터의 말초혈액 줄기세포로서, 상기 말초혈액 줄기세포는 자연적으로 발생하는 말초혈액보다 적어도 7배 큰 체적당 수를 갖고; 상기 말초혈액 줄기세포는 자연적으로 발생하는 말초혈액의 줄기세포와 본질적으로 같은 3차원 구조, 세포-세포 지지체, 세포-세포 구조를 구비하는 말초혈액 줄기세포이다.
캐리어는 혈장, 혈액, 알부민, 세포배양 매개물, 버퍼, 및 냉동보존제로 이루어지는 그룹 중 적어도 어느 하나로 이루어지고; 성장팩터, 카퍼 킬레이트 시약, 및 호르몬 중 적어도 어느 하나를 더 포함한다.
상기 조성은 60%에서 80% 아미노 산-포도당 용액에 20%에서 40% 디메틸 설폭사이드 용액; 15%에서 25% 하이드록시 에틸 녹말 용액; 4%에서 6% 글리세롤, 3%에서 5% 포도당, 6%에서 10% 덱스트란 T10; 15%에서 25% 폴리에틸렌 글리콜; 및 75%에서 85% 아미노 산-포도당 용액으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 냉동보존제의 총 양을 포함한다.
도1은 바이오리액터의 배양캐리어 흐름 루프의 일실시예를 개략적으로 나타 낸 도면이다.
도2는 본 발명의 TVEMF-바이오리액터의 일실시예를 나타낸 측면도이다.
도3은 도2의 TVEMF-바이오리액터의 일실시예를 나타낸 측면사시도이다.
도4는 TVEMF-바이오리액터의 일실시예를 나타낸 수직단면도이다.
도5는 TVEMF-바이오리액터의 수직단면도이다.
도6은 바이오리액터를 수용할 수 있고 시간변화 전자력을 제공할 수 있는 시간변화 전자력장치를 나타낸 측면도이다.
도7은 도6에 나타낸 장치의 정면도이다.
도8은 도6의 장치에서 그 내부에 바이오리액터를 나타낸 정면도이다.
전술한 목적, 특징들 및 장점은 첨부된 도면과 관련한 다음의 실시예를 통하여 보다 분명해질 것이다. 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구체적인 실시예를 상세히 설명한다.
회전하는 TVEMF-바이오리액터(time varying electromagnetic force-bioreactor)는 세포배양 챔버 및 시간변화 전자력원(time varying electromagnetic force source)을 포함한다. 수술에 있어서, 말초혈액 혼합물은 세포배양 챔버에 위치된다. 상기 세포배양 챔버는 시간변화 전자력이 시간변화 전자력원에 의해 챔버에서 발생되는 동안의 시간에 걸쳐서 회전된다. 상기 시간이 완료됨에 따라, 상기 TVEMF-확장된 말초혈액 혼합물은 챔버로부터 제거된다. 보다 복잡한 TVEMF-바이오 리액터 시스템에서, 시간변화 전자력원은 도2 내지 도5에 나타낸 바와 같이, TVEMF-바이오리액터에 통합될 수 있으나, 도6 내지 도8에 나타낸 바와 같이 바이오리액터에 인접하게 될 수 있다. 또한, 세포에 자양물을 제공하는 세포배양 매개물이나 버퍼(바람직하게는 후술할 말초혈액 혼합물에 부가되는 매개물과 유사함)와 같은 유체 캐리어(carrier)는 주기적으로 재생(보충)되고 제거된다. 이하, 바람직한 TVEMF-바이오리액터를 설명한다.
도1은 포유류 세포를 성장시키기 위한 전체의 바이오리액터(생물반응장치) 배양시스템에서 배양캐리어 흐름 루프(culture carrier flow loop)(1)의 바람직한 실시예를 나타낸 것이다. 상기 바이오리액터 배양시스템은 세포배양 챔버(19), 바람직하게는 회전하는 세포배양 챔버, 산소공급기(oxygenator)(21), 배양캐리어의 흐름방향을 용이하게 하기 위한 장치인 메인펌프(15), 및 배양캐리어 필수요소를 선택적으로 입력하기 위한 공급매니폴드(17)를 포함한다. 여기에서, 상기 배양캐리어는 영양소(nutrients)(3), 버퍼(buffers)(5), 새로운 매개물(fresh medium)(7), 사이토카인(cytokines)(9), 성장팩터(growth factors)(11), 및 호르몬(13)과 같은 것 일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 실시예에서, 상기 메인펌프(15)는 산소공급기(21)에 새로운 유체 캐리어를 제공한다. 상기 유체 캐리어는 산소를 공급받고 세포배양 챔버(19)를 통과한다. 상기 세포배양 챔버(19)로부터 소비된 유체 캐리어의 폐기물은 제거되고 웨이스트(waste)(18)에 전달되며, 남은 세포배양 캐리어는 매니폴드(17)에 복귀된다. 그 결과로서, 상기 매니폴드(17)는 산소공급기(21)를 통해 세포배양 챔버(19)로 펌프(15)에 의해 재순환되기 전에 새로운 충전 을 수용한다.
상기 배양캐리어 흐름 후프(1)에서, 도1에 나타낸 바와 같이 상기 배양캐리어는 챔버(19)에서 살아있는 세포배양을 통해 순환되고 배양캐리어 흐름 루프(1)를 순환한다. 이러한 루프(1)에서, 조절은 세포배양 반응챔버(19) 내에서 일정한 조건을 유지하는 화학센서(미도시)에 따라 이루어진다. 이산화탄소로 압력을 제어하고, 산이나 염기의 도입으로 PH를 보정한다. 산소, 질소, 및 이산화탄소는 세포호흡을 유지시키기 위하여 가스교환시스템(미도시)에서 용해된다. 폐쇄루프(1)는 순환하는 가스 커패시턴스로부터 산소를 첨가하고 이산화탄소를 제거한다. 도1은 본 발명에서 이용될 수 있는 배양캐리어 흐름 루프의 바람직한 일실시예를 나타낸 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다. 바이오리액터로 영양소, 버퍼(완충제), 새로운 매개물, 사이토카인, 성장팩터, 및 호르몬과 같은 배양캐리어의 입력은 수동적, 자동적, 또는 다른 제어수단에 의해 수행될 수 있고, 폐기물 및 이산화탄소를 제어 및 제거할 수 있다.
도2 및 도3은 시간변화 전자력원과 통합된 TVEMF-바이오리액터(10)의 바람직한 실시예를 나타낸 것이다. 도4는 바람직한 형태로 본 발명에서 이용하기 위한 회전가능한 TVEMF-바이오리액터(10)의 단면을 나타낸 것이다. 도4의 TVEMF-바이오리액터(10)는 통합된 시간변화 전자력원을 나타낸 것이다. 도5는 시간변화 전자력원이 통합된 TVEMF-바이오리액터(10)의 바람직한 실시예를 나타낸 것이다. 도6 내지 도8은 인접한 시간변화 전자력원을 갖는 회전하는 바이오리액터를 나타낸 것이다.
도2는 본 발명에 따른 TVEMF-바이오리액터(10)의 바람직한 실시예를 나타낸 측면도이다. 도2는 베이스(112)에 의해 지지되는 모터 하우징(111)을 포함한다. 상기 모터 하우징(111) 내부에 모터(113)가 부착되고, 상기 모터(113)는 제1와이어(114) 및 제2와이어(115)에 의해 제어수단을 갖는 제어박스(116)에 연결된다. 이에 의하여, 상기 모터(113)의 속도는 제어노브(117)의 회전에 의하여 증가되게 제어될 수 있다. 모터 샤프트(18)가 하우징(111)을 통해 연장되게 설정되도록 상기 모터 하우징(111)은 내부에 모터(113)를 갖는다. 상기 모터 샤프트(118)는 길이방향으로 위치되고, 상기 샤프트(118)의 중심은 길이방향 챔버(119)의 위치에서 지구의 평면에 평행하다. 상기 챔버(119)는 플라스틱을 포함하는 투명한 재료로 이루어지는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 실시예에서, 상기 길이방향 챔버(119)는 샤프트(118)에 연결되고, 상기 챔버(119)는 지구의 평면에 평행한 길이방향 축과 함께 길이방향 축에 대하여 회전한다. 상기 챔버(119)는 와이어 코일(120)로 감겨진다. 상기 와이어 코일(120)의 크기 및 감겨진 횟수는 0.1mA에서 1000mA의 구형파 전류가 와이어 코일(120)에 공급되는 경우에 0.05가우스(gauss)에서 6가우스의 시간변화 전자력이 챔버(119) 내에서 발생되는 정도이다. 상기 와이어 코일(120)은 샤프트(118)의 단부에서 와이어(123, 124)에 의해 제1링(121) 및 제2링(122)에 연결된다. 전류가 일정하게 코일(120)에 공급되는 동안에 챔버(119)가 회전할 수 있는 방법으로 상기 링(121, 122)은 제1전자기 전달와이어(125)와 제2전자기 전달와이어(128)에 의해 접촉된다. 상기 와이어(125, 128)에 전자기 발생장치(126)가 연결된다. 상기 전자기 발생장치(126)는 전자기 발생장치 노브(127)의 회전으로 출력을 조정함으로써 와이 어(125, 128)와 코일(120)에 구형파를 공급한다.
도3은 본 발명에서 이용될 수 있는 도2에 나타낸 TVEMF-바이오리액터(10)의 측면사시도이다.
도4는 배양챔버(230)를 구비한 회전하는 TVEMF-바이오리액터(10)를 나타낸 것이다. 상기 배양챔버(230)는 그 내부에 말초혈액 혼합물을 포함하도록 적용되고 투명하다. 또한, 상기 배양챔버(230)는 외부 하우징(220)을 포함한다. 상기 외부 하우징(220)은 제1원통형상 가로단부 캡부재(290) 및 제2 원통형상 가로단부 캡부재(291)를 포함한다. 상기 제1원통형상 가로단부 캡부재(290) 및 제2 원통형상 가로단부 캡부재(291)는 내부 원통관형 유리부재(293) 및 외부 관형 유리부재(294)를 수용하도록 배치되며 서로 대향하는 제1단면(228)과 제2단면(229)을 갖는다. 적절한 압력밀봉이 제공된다. 상기 내부 관형부재(293)와 외부 관형부재(294) 사이에는 환형의 와이어 히터(296)가 있고, 상기 히터(296)는 세포 성장을 위해 적절한 배양온도를 얻는데 이용된다. 도5에 나타낸 바와 같이, 상기 와이어 히터(296)는 배양챔버(230)에 시간변화 전기장을 공급하기 위하여 시간변화 전자력장치로 이용될 수도 있다. 또한, 분리 와이어 코일(144)은 시간변화 전자력을 공급하는데 이용될 수 있다. 상기 제1단부 캡부재(290)와 제2단부 캡부재(291)는 챔버(230)에서 혼합물의 완만한 흐름을 촉진시키기 위하여 단면(228, 229)에 인접하는 내부 곡면을 갖는다. 상기 제1단부 캡부재(290)와 제2단부 캡부재(291)는 제1중앙유체 이송저널부재(292) 및 제2중앙유체 이송저널부재(295)를 각각 구비한다. 상기 제1중앙유체 이송저널부재(292) 및 제2중앙유체 이송저널부재(295)는 입력샤프트(223)와 출력샤프 트(225)에 각각 회전가능하게 수용된다. 각 이송저널부재(294, 295)는 단부캡부재(290, 291)에서 리세스된 카운터 보어(counter bore)에 설치하기 위한 플랜지를 구비하고, 샤프트(223, 225)에 대한 길이방향 이동에 대항하는 제1고정와셔와 링(297) 및 제2고정와셔와 링(298)에 의해 부착된다. 각 저널부재(294, 295)는 길이방향으로 연장되고 원주방향으로 배치되는 통로에 연결되는 중간체의 환형리세스를 갖는다. 상기 저널부재(292, 295)에서의 각 환형리세스는 단부캡부재(290, 291)에서 제1반경방향 배치통로(278)와 제2반경방향 배치통로(279)에 의해 제1입력 커플링(203) 및 제2입력 커플링(204)에 각각 연결된다. 반경방향 통로(278, 279)에서의 캐리어는 저널부재(294, 295)에서의 길이방향 통로와 제1환형 리세스를 통해 흐르고, 상기 캐리어가 저널부재(292, 295)를 통해 저널(292, 295)의 각 단부로 접근하게 한다. 상기 접근방향은 샤프트(223, 225) 주위의 원주방향이다.
제1관형 베어링 하우징(205) 및 제2관형 베어링 하우징(206)은 단부캡부재9290, 291)에 부착된다. 상기 제1관형 베어링 하우징(205) 및 제2관형 베어링 하우징(206)은 입력샤프트(223)와 출력샤프트(225)에서 외부 하우징(220)을 상대적으로 지지하는 볼베어링을 포함한다. 상기 제1베어링 하우징(205)은 외부 하우징(220)에 입출력 샤프트(223, 225)와 길이방향 축(221)에 대하여 회전방향으로 회전구동을 제공하기 위하여 부착된 제1스프라킷 기어(first sprocket gear)(210)를 구비한다. 상기 제1베어링 하우징(205)과 제2베어링 하우징(206)도 와이어 히터(296) 및 다른 센서로부터 전기를 받을 수 있는 설비를 갖는다.
내부 필터 조립체(235)는 내부 관형부재(215) 및 외부 관형부재(216)를 포함 한다. 상기 내부 관형부재(215) 및 외부 관형부재(216)는 길이방향을 따라 구멍을 가지며, 구멍을 갖는 제1내부필터 조립체 단부캡부재(217)와 제2내부필터 조립체 단부캡부재(218)를 구비한다. 상기 내부 관형부재(215)는 연동하는 중심에 위치되는 결합단면과 단부캡(217, 218)에 부착되는 각 부품을 갖는 두 부품으로 구성된다. 상기 외부 관형부재(216)는 제1내부필터 조립체 단부캡(217)과 제2내부필터 조립체 단부캡 사이에 장착된다.
상기 단부캡부재(217, 218)는 입력샤프트(223)와 출력샤프트(225)에서 각각 회전가능하게 지지된다. 상기 내부 부재(215)는 사이끼움홈(219)과 핀에 의해 출력샤프트(225)에 회전되게 부착된다. 10마이크론으로 짜여진 폴리에스테르 섬유(224)가 외부 부재(216)의 외면에 배치되고 각 단부에서 O링에 부착된다. 상기 내부 부재(215)는 결합핀에 의해 출력구동 샤프트(225)에서 슬롯에 부착되기 때문에, 상기 풀력구동 샤프트(225)는 내부 부재(215)를 회전시킬 수 있다. 상기 내부 부재(215)는 외부 부재(216)를 지지하는 제1 및 제2단부캡(217, 218)에 의해 결합된다. 상기 출력샤프트(225)는 제1고정 하우징(240)에서 베어링을 통해 연장되고 제1스프라킷 기어(241)에 결합된다. 도면에 나타낸 바와 같이, 상기 출력샤프트(225)는 관형의 보어(222)를 갖는다. 상기 보어(222)는 밀봉 사이에 위치되는 제1고정 하우징(240)에서 제1포트인 통로(289)로부터 내부 부재(215)로 연장된다. 이에 따라, 상기 유체 캐리어의 흐름은 고정 하우징(240)을 통해 내부 부재(215)로부터 흐를 수 있다.
상기 외부 하우징(220)에서 내부 부재(235)와 저널(292, 295)용의 제1 및 제2단부캡(217, 218) 사이에는 블레이드 부재(50a, 50b)용의 제1 및 제2허브(227, 226)가 배치된다. 상기 제2허브(226)가 입력샤프트(223)와 함께 회전하도록 상기 입력샤프트(223)에서 제2허브(226)는 핀(231)에 의해 입력샤프트(223)에 결합된다. 각 허브(227, 226)는 허브를 통해 캐리어를 이송하기 위하여 축방향으로 연장하는 통로를 갖는다.
상기 입력샤프트(223)를 회전가능하게 지지하기 위하여 상기 입력샤프트(223)는 제2고정 하우징(260)에서 베어링을 통해 연장된다. 제2길이방향 통로(267)는 입력샤프트(223)를 통해 면판(faceplate)과 하우징(260) 사이의 제2환형 리세스(23)에 배치되는 중간체의 보유와셔와 링 위치로 연장된다. 제2단부 캡부재(291)에서의 제3반경방향 통로(272)는 리세스에서의 유체 캐리어를 제2단부 캡부재(291)로부터 흐를 수 있게 한다. 도시하지는 않았지만, 제3통로(272)는 파이프와 Y조인트를 통해 각 통로(278, 279)에 연결된다.
도4에 샘플 포트가 도시되어 있다. 제1축을 따라 연장하는 제1보어(237)는 챔버(230)의 코너(233)를 가로지르고 제한된 개구부(234)를 형성한다. 상기 보어(237)는 원통의 밸브부재(236)를 수용하기 위하여 일단에 형성된 나사산 링과 카운터보어를 갖는다. 상기 밸브부재(236)는 개구부(234)와 결합하고 챔버(230)의 내부에서 약간 돌출되게 형성된 팁을 갖는다. 상기 밸브부재(236)에서의 O링(243)은 밀봉을 제공한다. 제2축을 따라 형성된 제2보어(244)는 O링(243)과 개구부(234) 사이의 위치에서 제1보어(237)를 가로지른다. 엘라스토머(elastomer) 또는 플라스틱 스토퍼(245)는 제2보어(244)를 폐쇄하고 샘플을 제거하기 위해 피하 주사기(hypodermic syringe)와 함께 진입될 수 있다. 샘플을 제거하기 위하여, 상기 밸 브부재(236)는 개구부(234)와 보어(244)의 접근을 후퇴시킨다. 주사기는 샘플을 추출하는데 이용될 수 있고, 상기 개구부(234)는 재폐쇄될 수 있다. 어떠한 외부의 오염도 TVEMF-바이오리액터(10)의 내부로 도달되지 않는다.
수술에 있어서, 캐리어는 제2포트인 통로(266)로부터 샤프트 통로에 입력되고, 이에 따라 제3반경방향 통로(272)를 통해 제1반경방향 배치통로(278)와 제2반경방향 배치통로(279)로 입력된다. 상기 캐리어가 저널(292, 294)에서 길이방향 통로를 통해 챔버(230)로 진입할 경우, 상기 캐리어는 허브(227, 226)의 단면(228, 229)에 영향을 미치며 허브(227, 226)에서의 통로를 통해 축방향뿐만 아니라 반경방향으로 소산된다(disperse). 상기 허브(227, 226)를 통과한 캐리어는 단부캡부재(217, 218)에 영향을 미치며 반경방향으로 소산된다. 이에 따라, 진입한 유체 캐리어의 흐름은 길이방향 축(221)으로부터 반경외측방향으로 멀어지고, 폴리에스테르 섬유(224)를 통해 배출되도록 각 단부 및 통로(266, 289)를 통해 배출되도록 필터 조립체(235)의 개구부로부터 환상의 방법으로 흐른다. 상기 외부 하우징(220)의 회전속도 및 회전방향의 제어에 의하여, 캐리어 작용이 바람직한 타입으로 되도록 상기 챔버(230)와 내부필터 조립체(235)가 달성될 수 있다. 그러나, 가장 중요한 것은 클리노스태트(clinostat) 작동이 새로운 유체 캐리어의 계속적인 공급과 함께 달성될 수 있는 것이다.
시간변화 전자력이 일체의 환형 와이어 히터(296)를 이용하는데에 적용되지 않는 경우, 상기 시간변화 전자력은 다른 바람직한 시간변화 전자력원에 의해 적용될 수 있다. 예를 들어, 도6 내지 도8은 시간변화 전자력 장치(140)를 나타낸 것이 고, 상기 시간변화 전자력 장치(140)는 일체의 시간변화 전자력을 갖는 것이 아니라 인접한 시간변화 전자력 장치를 갖는 바이오리액터에서의 세포배양에 전자력을 제공한다. 구체적으로, 도6은 시간변화 전자력 장치(140)의 바람직한 실시예를 나타낸다. 도6은 지지베이스(145), 상기 베이스(145)에서 지지되는 실린더 코일지지부(146), 및 상기 지지부(146)에 감겨진 와이어 코일(147)을 포함하는 장치(140)의 측면사시도이다. 도7은 도6에 나타낸 시간변화 전자력 장치(140)의 정면사시도이다. 도8은 시간변화 전자력 장치(140)의 정면사시도로서, 상기 장치(140)는 수술에 있어서, 전체의 바이오리액터(148)가 지지베이스(145)에 의해 지지되며 와이어 코일(147)에 의해 감겨진 실린더 코일 지지부(146)에 삽입된 것을 나타낸 것이다. 상기 시간변화 전자력 장치(140)가 바이오리액터(148)에 인접하기 때문에, 상기 시간변화 전자력 장치(140)는 재이용될 수 있다. 또한, 상기 시간변화 전자력 장치(140)가 바이오리액터(148)에 인접하기 때문에, 상기 장치(140)는 모든 타입의 바이오리액터, 바람직하게는 회전타입의 바이오리액터에서 전자력을 발생시키는데 이용될 수 있다.
수술에 있어서, TVEMF-확장 동안, 본 발명의 TVEMF-바이오리액터(10)는 세포배양 챔버에서 말초혈액 혼합물을 포함한다. TVEMF-확장 동안, 말초혈액 혼합물을 포함하는 챔버의 회전속도는 평가 및 조절될 수 있고, 이에 따라 말초혈액 혼합물은 길이방향 축 또는 그 주위에 대략 존재하게 된다. 회전속도의 증가는 벽 충격을 방지할 수 있다. 예를 들어, 회전의 증가는 상기 말초혈액 혼합물에서의 말초혈액 줄기세포가 회전사이클의 하방향측에서 과도하게 내측 및 하측으로 떨어지고 회전 사이클의 상방향측에서 과도하게 외측 및 불충분하게 상측으로 떨어지는 경우에 바람직하다. 최적으로는, 말초혈액 줄기세포를 3차원 구조, 세포-세포(cell-to-cell) 지지체, 세포-세포 구조로 유지하기 위하여 최소의 벽 충돌 주파수 및 세기를 촉진하는 회전율을 이용자가 바람직하게 선택하는 것이다. 본 발명의 바람직한 속도는 5RPM에서 120RPM이고, 보다 바람직하게는 10RPM에서 30RPM이다.
말초혈액 혼합물은 투명한 배양챔버를 통해 시각적으로 평가될 수 있고 수동으로 조정될 수 있다. 상기 말초혈액 혼합물의 평가 및 조정은 TVEMF-바이오리액터(10) 내에서 말초혈액 줄기세포의 위치를 모니터하는 센서(예를 들어, 레이저)에 의해 자동화될 수 있다. 큰 세포 이동을 읽고 나타내는 센서에 의해 메커니즘이 자동적으로 회전속도를 조정한다.
또한, 수술에 있어서, 본 발명은 전자력 발생장치가 작동되고 조정되는 것을 고려하고, 이에 따라 구형파 출력은 말초혈액 혼합물을 포함하는 챔버에서 요구되는 전자기장, 바람직하게는 0.05가우스에서 6가우스의 범위인 전자기장을 발생시킨다.
상기 구형파는 약 2cycle/second에서 25cycle/second의 주파수를 갖고, 바람직하게는 5cycle/second에서 20cycle/second이고, 예를 들면 약 10cycle/second이다. 컨덕터(conductor)는 약 1mA에서 1000mA의 RMS값을 갖고, 1mA에서 6mA가 바람직하다. 그러나, 이러한 파라미터가 본 발명의 TVEMF를 제한하는 것은 아니고, 본 발명의 다른 관점에 기초해서 변화될 수 있다. TVEMF는, 예를 들어 EN131 세포 센서 가우스 미터와 같은 표준 설비에 의해 측정될 수 있다.
다양한 변화는 본 발명을 벗어나지 않는 범위 내에서 시간변화 전자력에 영향받는 회전하는 바이오리액터에서 이루어질 수 있다.
다음의 정의는 본 발명을 보다 명확하게 설명하기 위한 것이다. 이러한 정의는 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 또한, 몇몇의 정의는 TVEMF에 관련된 것을 포함하고, 이와 관련된 모든 정의는 서로 보완적이며 서로 대항되는 것이 아니다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "성체줄기세포(adult stem cell)"란 용어는 미분화세포 및 분화세포를 초래할 수 있는 다능성 세포를 나타낸다. 본 발명과 관련하여, 성체줄기세포는 CD34+/CD38-이다. 또한, 성체줄기세포는 체줄기세포로 알려져 있고, 배아로부터 직접 유도되는 배아줄기세포가 아니다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "말초혈액(peripheral blood)"이란 용어는 전신혈액(systemic blood), 즉 포유동물에서 전신을 순환하거나 또는 순환되는 혈액을 나타낸다. 이러한 포유동물은 태아가 아니다. 이러한 본 발명의 목적으로 인하여, 같은 순환상의 루프의 다른 부분에 위치되는 혈액 사이를 구별할 이유가 없다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "말초혈액세포(peripheral blood cell)"란 용어는 말초혈액으로부터의 세포를 나타낸다. 복제가 가능한 말초혈액세포는 TVEMF-바이오리액터에서 TVEMF-확장될 수 있고, 본 발명의 구성으로 나타날 수 있다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "말초혈액 줄기세포(peripheral blood stem cell)"란 용어는 말초혈액으로부터의 성체줄기세포를 나타낸다. 말초혈 액 줄기세포는 전술한 바와 같이 체줄기세포로 알려진 성체줄기세포이고, 배아로부터 직접 유도되는 배아줄기세포가 아니다. 바람직하게, 본 발명의 말초혈액 줄기세포는 CD34+/CD38-세포이다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "말초혈액 줄기세포 구성(peripheral blood stem cell composition)"이란 용어는 다음의 (1) 및/또는 (2) 각각의 본 발명의 말초혈액 줄기세포를 나타낸다. 상기 (1)은 자연적으로 발생하는 말초혈액원보다 적어도 7배 큰 체적당 수에서 동일하거나 매우 유사한 3차원 구조, 세포-세포 구조, 자연적으로 발생하는 말초혈액 줄기세포로서의 세포-세포 지지체를 갖고, 상기 (2)는 전술한 구조 및 지지체를 유지하는 TVEMF-확장을 갖는다. 상기 말초혈액 줄기세포는 제약적으로 수용가능한 캐리어, 혈장, 혈액, 알부민, 세포배양 매개물, 성장팩터, 카퍼 킬레이트 시약(copper chelating agent), 호르몬, 버퍼, 냉동보존(cryopreservative), 또는 다른 물질 중 어느 하나인 어떤 종류의 캐리어이다. 본 발명의 말초혈액 줄기세포와 원래의 말초혈액원과 비교하는 것은 자연적으로 발생하는 말초혈액을 참조하는데 바람직하다. 그러나, 이와 같은 비교가 이용될 수 없는 경우, 자연적으로 발생하는 말초혈액은 말초혈액의 평균이나 전형적인 특성, 바람직하게는 본 발명의 말초혈액 줄기세포원과 같은 포유류종으로 나타낼 수 있다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "말초혈액 혼합물(peripheral blood mixture)"이란 용어는 TVEMF-바이오리액터(예를 들어, 세포배양 챔버)에 위치될 수 있는 세포의 성장을 위한 매개물과 같이 세포가 확장되게 하는 물질을 갖 는 말초혈액 세포의 혼합물을 나타낸다. 상기 말초혈액세포는 세포배양 매개물과 같은 물질을 갖는 전체의 말초혈액을 간단히 혼합함으로써 말초혈액 혼합물에 존재될 수 있다. 또한, 상기 말초혈액 혼합물은 본 출원의 전체에 걸쳐서 설명될 바와 같이 말초혈액 줄기세포를 포함하는 "버피 코트(buffy coat)"와 같은 말초혈액으로부터의 세포 조제(작성)으로 이루어질 수 있다. 바람직하게, 상기 말초혈액 혼합물은 CD34+/CD38- 말초혈액 줄기세포와 Dulbecco의 매개물(DMEM)을 포함한다. 바람직하게, 상기 말초혈액 혼합물의 적어도 반은 DMEM 같은 세포배양 매개물이다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "TVEMF"란 용어는 "시간변화 전자력(Time Varying Electromagnetic Force)"을 나타낸다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 TVEMF는 (Fourier 곡선을 따르는)구형파이다. 바람직하게, 상기 구형파는 약 10cycles/second의 주파수를 갖고, 상기 컨덕터는 약 1mA에서 1000mA, 바람직하게는 약 1mA에서 6mA의 RMS값을 갖는다. 그러나, 이러한 파라미터가 본 발명의 TVEMF를 제한하는 것은 아니고, 본 발명의 다른 관점에 기초해서 변화될 수 있다. TVEMF는, 예를 들어 EN131 세포 센서 가우스 미터와 같은 표준 설비에 의해 측정될 수 있다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "TVEMF-바이오리액터(TVEMF-bioreactor)"란 용어는 전술한 바와 같이 TVEMF가 적용되는 회전하는 바이오리액터를 나타낸다. 바이오리액터에 적용되는 TVEMF는 0.05가우스(gauss)에서 6.0가우스의 범위에 있고, 바람직하게는 0.05가우스에서 0.5가우스이다. 본 실시예에서, 본 발명의 TVEMF-바이오리액터는 (TVEMF가 적용된)적절한 가우스 레벨에서 둘러싸인 말초혈액 혼합물의 회전을 제공하고, 상기 말초핼액세포(줄기세포를 포함)가 확장되게 한다. 바람직하게, 상기 TVEMF-바이오리액터는 성장 매개물(바람직하게는 첨가제)을 교환시키고, 말초혈액 혼합물에 산소공급을 한다. 상기 TVEMF-바이오리액터는 메커니즘에 수일 이상의 성장세포를 제공한다. 이론과 달리, 상기 TVEMF-바이오리액터는 TVEMF으로 바이오리액터에서의 세포에 영향을 주고, 이에 따라 TVEMF는 세포로 통과되거나 세포에 노출되어, 상기 세포는 TVEMF-확장을 받는다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "TVEMF-확장된 말초혈액세포(TVEMF-expanded peripheral blood cells)"란 용어는 TVEMF-바이오리액터에 위치된 후의 체적당 수가 증가되고 약 0.05가우스에서 6.0가우스의 TVEMF에 영향받는 말초혈액세포를 나타낸다. 체적당 세포 수의 증가는 TVEMF-바이오리액터에서의 세포 복제의 결과이고, 이에 따라 세포의 총수는 증가한다. 체적당 세포 수의 증가는 유체 체적의 단순한 감소로 인한 것이 확실히 아니다. 예를 들어, 70ml에서 10ml로 혈액의 체적 감소는 ml당 세포 수를 증가시킨다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포(TVEMF-expanded peripheral blood stem cells)"란 용어는 TVEMF-바이오리액터에 위치된 후의 체적당 수가 증가되고 약 0.05가우스에서 6.0가우스의 TVEMF에 영향받는 말초혈액 줄기세포를 나타낸다. 체적당 줄기세포 수의 증가는 TVEMF-바이오리액터에서의 세포 복제의 결과이고, 이에 따라 바이오리액터에서의 줄기세포의 총수는 증가한다. 체적당 줄기세포 수의 증가는 유체 체적의 단순한 감소로 인한 것이 확실히 아니다. 예를 들어, 70ml에서 10ml로 혈액의 체적 감소는 ml당 줄기세포 수를 증가시킨다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "TVEMF-확장하는(TVEMF-expanding)"이란 용어는 TVEMF-(회전하는)바이오리액터의 현재의 TVEMF에서 복제하는(분열 및 성장) TVEMF-바이오리액터에서의 세포의 단계를 나타낸다. 말초혈액 줄기세포(바람직하게는 CD34+/CD38- 줄기세포)는 더 분화하기 않고 복제한다. 이에 따라, 본 발명에 따라 확장된 모든 또는 대략적으로 모든 CD34+/CD38- 줄기세포는 복제하지만, 바이오리액터에서의 시간동안 분화하지는 않는다. 여기에서, "대략 모든(substantially all)"은 CD34+/CD38- 세포가 TVEMF-확장 동안에 더이상 CD34+/CD38-이 아닐정도로 CD34+/CD38- 세포의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 99%가 분화하지 않는 것을 의미한다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "TVEMF-확장(TVEMF-expansion)"이란 용어는 TVEMF-바이오리액터에서 말초혈액세포, 바람직하게는 말초혈액 줄기세포의 수를 약 0.05가우스에서 6.0가우스의 TVEMF로 세포에 영향을 주어서 증가시키는 과정을 나타낸다. 바람직하게, 말초혈액 줄기세포의 수의 증가는 원래의 말초혈액원의 체적당 수의 적어도 7배이다. 본 발명에 따른 TVEMF-바이오리액터에서의 말초혈액 줄기세포의 확장은 TVEMF-확장에 앞서 말초혈액 줄기세포로서 동일하거나 본질적으로 동일한 3차원 구조, 세포-세포 지지체, 세포-세포 구조를 갖거나 유지하는 말초혈액 줄기세포를 제공한다. TVEMF-확장의 다른 관점으로는 본 발명의 말초혈액 줄기세포의 예외적인 특성을 제공할 수 있다. 이론과 달리, TVEMF-확장은 3 차원 구조 및 세포-세포 지지체를 유지하는 말초혈액 줄기세포의 높은 농도를 제공하지만은 않는다. 이론과 달리, TVEMF는 TVEMF-확장 동안에 줄기세포의 성질, 예를 들어 유전자 촉진성장의 상향조절 또는 유전자 억제성장의 하향조절에 영향을 줄 수 있다. 전체적으로, TVEMF-확장은 말초혈액 줄기세포를 분화시키지 않고 촉진시킨다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "TVEMF-확장된 세포(TVEMF-expanded cell)"란 용어는 TVEMF-확장의 과정에 의해 영향을 받는 세포를 나타낸다.
본 출원의 전체에서, 조직의 치유, 질병이나 조건의 치료는 배타적인 것이 아니라 전체의 조직 치유에 관련된 것이다. 조직의 개선이나 향상은 후술할 바와 같이 줄기세포의 투여에 의해 발생된다. 본 발명은 수명에 영향을 주는 증상인 질병이나 조건의 치료에 대하여 부분적으로 나타냈지만, 본 발명은 작은 치유의 치료도 포함하고, 또한 포유동물(바람직하게는 인간)의 건강상의 증상이나 문제가 나타나기 전에 확장된 줄기세포를 초기에 도입함으로써 질병이나 조건의 억제/예방도 포함한다.
본 출원의 전체에서, "치유(repair)", "보충(물)(replenish)", 및 "재생(regenerathe)"이란 용어가 이용된다. 이러한 용어는 서로 배타적인 것이 아니라 전체의 조직 치유에 관련된 것이다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "유해물질(toxic substance)" 또는 이와 관련된 용어는 세포, 바람직하게는 말초혈액 줄기세포에 유해한 물질 또 는 환자에게 유해한 물질을 나타낼 수 있다. 특히, 유해물질이란 용어는 죽은 세포, 대식세포 또는 말초혈액이 특이하거나 이상한 물질(예를 들어, 낫세포(sickle cell), 다른 조직, 또는 폐기물)을 나타낸다. 다른 유해한 물질은 본 출원에서 논의된다. 혈액으로부터 유해한 물질의 제거는 종래에 잘 알려져 있고, 특히 환자에게 혈액제제를 도입하는 종래기술에서 알려져 있다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "골수의 성분채집(술)(apheresis of bone marrow)"이란 용어는 뼈에 니들의 삽입 및 골수의 추출을 나타낸다. 이러한 성분채집술은 종래기술에서 공지되어 있다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "자가(조직)(autologous)"란 용어는 기증자(확장에 앞서 말초혈액 줄기세포의 근원) 및 수령자가 같은 포유동물인 상황을 나타낸다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "동종이형(allogeneic)"이란 용어는 기증자(확장에 앞서 말초혈액 줄기세포의 근원) 및 수령자가 같은 포유동물인 상황을 나타낸다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "CD34+"란 용어는 혈액세포의 표면에 표면항원(CD34)의 존재를 나타낸다. CD34 단백질은 모든 발육상태에서 조혈줄기세포의 표면에 존재한다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "CD38-"란 용어는 혈액세포의 표면에 표면항원(CD38)의 결핍을 나타낸다. CD38은 본 발명의 줄기세포의 표면에 존재하지 않는다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "세포-세포 구조(cell-to-cell geometry)"란 용어는 다른 것에 대한 세포의 물리적 관계 사이에 간격, 거리를 포함하는 세포의 구조를 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 TVEMF-확장된 줄기세포는 인체에서와 같이 서로에 대하여 체류한다. 상기 확장된 세포는, 예를 들어 간격이 유지되지 않는 2차원의 확장 혈관에 비해 세포 사이의 자연적인 간격의 경계 내에 있다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "세포-세포 지지체(cell-to-cell support)"란 용어는 하나의 세포가 인접한 세포에 제공하는 지지체를 나타낸다. 예를 들어, 건강한 조직과 세포는 화학, 호르몬, 신경(적용될 수 있고 적절한)과 같이 인체에서의 다른 세포와 함께 상호작용을 유지한다. 본 발명에서, 이러한 상호작용은 정상적으로 기능하는 파라미터 내에서 유지되고, 이는 예를 들어, (자연의 혈액환경에서 이루어지지 않는 한)다른 세포에 유해 또는 손상신호를 보내지 않는 것을 의미한다.
본 출원의 전체에 걸쳐서 이용된 바와 같이, "3차원 구조(three-dimensional geometry)"란 용어는 배양접시에서 성장된 세포에서 발견되는 것과 같은 2차원 구조(여기에서, 상기 세포는 편평 및/또는 신장된다)와는 반대로 3차원 상태(자연의 상태와 같거나 매우 유사한 상태)에서의 세포의 구조를 나타낸다.
상기 3가지 정의의 각각은 본 발명의 줄기세포의 세포-세포 지지체, 구조, 및 3차원 구조에 관련된 것으로, "본질적으로 같은(essentially the same)"이란 용어는 정상적인 구조와 지지체가 본 발명의 TVEMF-확장된 세포에 제공되는 것을 의 미한다. 이에 따라, 상기 세포는 조직 치유에 이용할 수 없거나 비기능적이거나, 또는 다른 세포에 유해나 해를 가하는 것과 같은 방법으로 변화되지 않는다.
본 출원의 전체에서 이용되는 전술한 용어 또는 다른 용어를 나타내는 다른 설명은 전술한 정의에 의해 제한되지 않는다. 본 발명의 다양한 관점에 대한 정보는 본 출원의 전체에서 제공되고, 이는 제한되지 않는다.
본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간의 조직을 치유, 보충, 및 재생하기위하여 빠르게 이용할 수 있는 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포의 근원을 제공한다. 본 발명은 후술될 바와 같은 바람직한 실시예에 의해 완전히 이해될 수 있을 것이다.
[수술방법: TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포 구성의 작성 및 상기 구성의 이용]
본 발명의 바람직한 실시예에서, 조직을 치유, 대체, 및 재생에서 인체를 조력할 수 있거나 또는 질병의 치료나 연구에 유용한 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포의 작성(조제)을 위한 방법을 설명한다.
말초혈액은 포유동물, 바람직하게는 영장류, 보다 바람직하게는 인간으로부터 채혈되고, 이는 종래기술에 알려져 있으며 종래기술에서 잘 알려진 바와 같이 주사기를 통해 채혈된다. 말초혈액은 채혈될 수 있고, 즉시 확장될 수 있으며 냉동보존될 수 있다. 말초혈액은 영향받지 않을 정도로 인간으로부터 제거될 수 있다. 바람직한 말초혈액의 채혈양은 약 10ml에서 500ml이고, 100ml에서 300ml가 더 바람직하고, 보다 바람직하기는 150ml에서 200ml이다. 본 발명에 따른 말초혈액의 채혈 은 제한되는 것을 의미하는 것이 아니라, 포유류 말초혈액의 직접적인 채혈, 하나 이상의 근원으로부터 말초혈액의 고임, 상업적이나 다른 근원으로부터 혈액을 얻는 간접적 채혈, 혈액은행으로부터 냉동보존된 혈액을 포함하는 이러한 다른 의미를 포함할 수 있다.
일반적으로, 말초혈액이 포유동물로부터 직접적으로 채혈되는 경우, 이러한 말초혈액은 하나 이상의 주사기, 바람직하게는 항응고제를 포함하는 주사기로 주입된다. 혈액은 주사기에 저장될 수 있고 다른 용기로 이송될 수 있다. 말초혈액은 백혈구, 적혈구, 및 혈장으로 분리될 수 있다. 이는 원심기(혈액이 분리될 때까지 혈액의 용기를 회전시키는 장치)나 침전(혈액을 분리시키기 위하여 혈액의 용기로 침전물을 주입하는 과정)에 의해 수행된다. 말초혈액은 바닥에 적혈구(RBC)가 중간에 백혈구(WBC)가 상부에 혈장으로 분리된다. 상기 백혈구는 저장을 위해 제거된다. "버피 코트"라고 알려진 중간층은 중요한 말초혈액 줄기세포를 포함하고, 혈액의 다른 부분은 필요하지 않다. 어떤 혈액은행에서는 이러한 과정을 어느 정도 실행한다. 그러나, 다른 은행은 백혈구로부터 단핵세포(이 경우, 백혈구의 부분)를 제거함으로써 버피 코트 과정을 실행한다. 모든 사람이 이러한 방법에 동의하지는 않지만, 세포를 저장하는데 적은 냉동질소가 필요하고 저장되는 것이 적다.
말초혈액세포를 분리하는 다른 방법은 코브 스펙트라 세포 분리기와 같은 분리기에 하나 이상(바람직하게는 3)의 연속적인 흐름의 백혈구성분채집술의 라운드에 의해 채혈된 모든 말초혈액에 영향을 주는 것이다. 이와 같은 과정으로 하나의 핵을 갖는 말초혈액세포를 다른 말초혈액세포로부터 분리할 수 있다. 줄기세포는 하나의 핵을 갖는 그룹이다. 혈액세포의 분리를 위한 다른 방법은 종래기술에 잘 알려져 있다.
말초혈액 샘플로부터 적혈구를 제거하는 것이 바람직하다. 일반적으로 사람들은 동일한 (줄기세포의 이식을 위해 필요한)HLA타입을 가질 수 있지만, 동일한 혈액 타입을 갖는 것은 아니다. 적혈구를 제거함으로써, 줄기세포 이식에 대한 부작용은 최소화될 수 있다. 적혈구를 제거함으로써, 상기 줄기세포 샘플은 보다 많은 사람들에게 양립될 수 있는 기회를 갖는다. 적혈구가 해동되는 경우에 적혈구도 파열될 수 있어서, 헤모글로빈을 유리(해제)시킨다. 이러한 타입의 헤모글로빈은 이식을 받는 사람들에게 심각한 영향을 줄 수 있다. 또한, 적혈구가 파열되는 경우에 줄기세포의 생육성(viability)은 감소된다.
또한, 말초혈액을 냉동시켜서 저장하거나 다른 포유동물에게 혈액을 수혈하는 경우, 혈액은 HIV/AIDS, 간염, 백혈병이나 변역장애와 같은 감염인 유전적 질병이 존재하지 않도록 하기 위하여 검사될 수 있다. 이러한 질병이 존재하는 경우, 상기 혈액은 내버려 질 수 있고, 이용자에게 위험을 감수시키고 이용될 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 혈액세포는 기증자로부터 얻을 수 있다. 채혈에 앞서 기증자는 G-CSF(0.3ng에서 5ug의 양, 바람직하게는 1ng/kg에서 100ng/kg, 더 바람직하게는 5ng/kg에서 20ng/kg, 보다 더 바람직하게는 6ng/kg)로 3일에 걸쳐 매 12시간마다 그리고나서 4일에 한번 처리되는 것이 바람직하다. 바람직한 방법으로는, 유사한 양의 GM-CSF도 투여된다. 다른 대안으로는 GM-CSF만이 이용될 수 있거나 또는 다른 성장팩터 분자인 인터루킨(interleukins)이 이용될 수 있다. 혈액은 기증 자로부터 채혈되고, 말초혈액 혼합물의 전체가 이용되거나 또는 분리된 제1세포부분이 이용될 수 있다. 상기 줄기세포(CD34+/CD38-)를 포함하는 세포부분은 확장되도록 말초혈액 혼합물을 작성하는데 이용된다. 세포는 코브 스펙트라 tpv분리기와 같은 분리기를 통해 연속적 흐름의 백혈구성분채집술(leukapheresis)의 3라운드에 의해 기증자의 총 혈액 체적에 영향을 줌으로써 분리될 수 있다. 바람직하게, 확장된 줄기세포는 같은 기증자에게 재도입되고, 상기 기증자는 후술될 바와 같이 조직을 치유하는데 필요하다. 다른 기채혈(pre-collection) 투여도 본 기술의 당업자에 의해 명백히 알 수 있다.
바람직하게, 적혈구는 말초혈액으로부터 제거되고, 말초혈액 줄기세포를 포함하는 남은 세포는 TVEMF-바이오리액터에서의 적절한 매개물("말초혈액 혼합물" 참조)에 위치된다. 본 발명의 실시예에서, 전술한 "버피 코트"(본 출원의 전체에서 설명된 바와 같이, 말초혈액 줄기세포를 포함)만이 TVEMF-바이오리액터에 위치되는 세포 재료이다. 다른 말초혈액세포 작성을 준비하기 위하여 다른 실시예는 다른 비줄기세포의 제거와 말초혈액의 구성요소를 포함한다. 단지 남은 말초혈액 구성과 같이, 이러한 말초혈액세포 작성도 CD34+/CD38- 말초혈액 줄기세포를 가질 수 있다. 말초혈액세포의 비줄기세포 타입의 제거는 침전 및 원심기에 한정되지 않고 소극적인 분리기술을 통해 달성될 수 있다. 여러 소극적인 분리기술도 잘 알려져 있다. 그러나, 적극적인 분리기술이 이용될 수 있고, 본 발명에서는 이러한 기술이 바람직하다. 혈액에서 다양한 구성요소를 제거하고 CD34+/CD38-을 위해 적극적으로 선택하는 방법이 알려져 있고, 이러한 방법은 요구되는 말초혈액 줄기세포를 용해 시키지 않고 손상시키지 않는 한 이용될 수 있다. 예를 들어, CD34+/CD38-을 위해 선택적으로 유연한 방법이 이용될 수 있다. 바람직하게, 전술한 바와 같은 "버피 코트"는 말초혈액으로부터 작성되고, CD34+/CD38-세포가 TVEMF-확장을 위해 버피 코트로부터 분리된다.
채혈된 말초혈액 또는 전술한 바와 같이 요구되는 세포부분은 TVEMF-확장이 발생되도록 TVEMF-바이오리액터에 위치되어야 한다. 전술한 바와 같이, "말초혈액 혼합물은 세포의 성장을 위한 매개물과 같이 세포가 확장되게 하며 TVEMF-바이오리액터에 위치될 수 있는 물질과 함께 말초혈액(또는 요구되는 세포부분, 예를 들어 적혈구없는 말초혈액, 또는 "버피 코트" 세포, 또는 말초혈액으로부터 분리된 CD34+/CD38- 말초혈액 줄기세포)의 혼합물을 포함한다. 세포를 성장 및 확장하게 하는 매개물인 세포배양 매개물은 잘 알려져 있다. 바람직하게, 세포를 확장하게 하는 물질은 세포배양 매개물이고, 더 바람직하기는 Dulbecco의 매개물이다. 상기 세포 매개물의 구성요소는 줄기세포를 손상 및 사멸시켜서는 안된다. 다른 구성요소도 TVEMF-확장 동안 또는 이에 앞서 말초혈액 혼합물에 부가될 수 있다. 예를 들어, 상기 말초혈액은 Dulbecco의 매개물과 함께 바이오리액터에 위치될 수 있고, 인간 혈청 알부민의 5%(또는 다른 요구량, 예를 들어 약 1%에서 10%의 범위)로 보충될 수 있다. 상기 말초혈액 혼합물의 다른 첨가제는 성장팩터, 카퍼 킬레이트 시약, 사이토카인, 호르몬, 및 TVEMF-확장을 강화할 수 있는 다른 물질에 한정되지 않고, 바이오리액터에 위치되기 전에 바이오리액터의 말초혈액 외부 또는 내부에 첨가될 수 있다. 바람직하게, 개개인으로부터 채혈한 말초혈액(바람직하게는 약 10ml에서 500ml의 인간말초혈액, 더 바람직하기는 약 100ml에서 300ml, 더 바람직하기는 150ml에서 200ml의 인간말초혈액)의 전체 체적은 Dulbecco의 매개물(DMEM) 같은 세포배양 매개물로 혼합되고, TVMEF-확장을 위해 말초혈액 혼합물을 작성하는 인간 혈청 알부민의 5%로 보충된다. 예를 들어, 50ml에서 100ml이 말초혈액 샘플을 위해, 약 25ml에서 100ml의 DMEM/5%의 인간 혈청 알부민이 이용된다. 이에 따라, 바이오리액터에 위치될때 말초혈액 혼합물의 총체적은 약 75ml에서 200ml가 된다. 보다 많은 말초혈액이 채혈될 수 있고, 예를 들어 개개인으로부터의 채혈이 200ml이상인 경우에 모든 줄기세포를 이용하는 것이 말초혈액의 채혈에 바람직하다. (같거나 다른 근원으로부터) 일회분 이상의 말초혈액을 고이게 함으로써 큰 체적이 이용될 수 있게 하는 것이 바람직하다. 말초혈액이 채혈되고 고이며 함께 TVEMF-확장되는 경우에 TVEMF-바이오리액터 관류의 이용은 특히 유용하다.
본 발명의 카퍼 킬레이트 시약은 비유해 카퍼 킬레이트 시약일 수 있고, 바람직하게는 페니실라민(penicillamine) 또는 트리엔틴 하이드로클로라이드(trientine hydrochloride)일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 페니실라민은 DMSO에 용해되며 약 10ppm의 양으로 말초혈액 혼합물에 첨가되는 D(-)-2-아미노-3-메르캅터-3-메칠부타닉 산(D(-)-2-Amino-3-Mercaptor-3-Methylbutanic Acid)(시그마-알드릭; Sigma-Aldrich)이다. 카퍼 킬레이트 시약은 포유동물에 투여될 수 있고, 이때 말초혈액은 포유동물로부터 직접 채혈될 것이다. 이와 같은 투여는 포유동물로부터 말초혈액을 채혈하기 전에 하루 이상이 바람직하고, 2일 이상이 더 바람직하다. 카퍼 킬레이트 시약의 목적은 말초혈액 혼합물 자체에 첨가할지, 혈액 기증자 포유동물에 투여할지, 또는 둘다 인지를 결정하여 TVEMF-확장에 앞서 말초혈액에서 카퍼의 양을 감소시키는 것이다. 이론과 달리, 이용가능한 카퍼의 양의 감소는 TVEMF-확장을 강화시킨다.
"TVEMF-바이오리액터에 위치되는"이란 용어는 한정되는 것을 의미하지 않고-말초혈액 혼합물은 바이오리액터의 전체 외부에서 이루어질 수 있으며 그리고 나서 상기 혼합물이 바이오리액터의 내부에 위치된다. 또한, 상기 말초혈액 혼합물은 바이오리액터의 내부에서 전체적으로 혼합될 수 있다. 예를 들어, 상기 말초혈액(또는 세포 부분)은 바이오리액터에 위치될 수 있고, Dulbecco의 매개물과 5%의 인간 혈청 알부민으로 보충되며, 여기에서 상기 Dulbecco 매개물과 5%의 인간 혈청 알부민은 바이오리액터에 미리 첨가하거나 동시에 첨가하거나, 또는 바이오리액터에 말초혈액을 첨가한 후에 첨가할지를 결정한다.
TVEMF-바이오리액터에 위치되는 본 발명의 바람직한 말초혈액 혼합물은 다음을 포함한다: 말초혈액 샘플의 버피 코트로부터 분리되는 CD34+/CD38- 줄기세포 및 CD34+/CD38-을 가지며 약 150ml에서 250ml이고, 바람직하기는 약 200ml의 총체적을 갖는 Dulbecco 매개물을 포함한다. 더 바람직하게는 상기 말초혈액 혼합물에 G-CSF(granulocyte-Colony Stmulating Factor)가 포함된다. 상기 G-CSF는 말초혈액 줄기세포의 TVEMF-확장을 강화시키는데 충분한 양으로 존재한다. 보다 바람직하게, TVEMF-확장에 앞서 말초혈액 혼합물에 존재하는 G-CSF의 양은 약 25ng/ml에서 200ng/ml 말초혈액 혼합물이고, 더 바람직하기는 약 50ng/ml에서 150ng/ml이고, 보다 바람직하기는 약 100ng/ml이다.
상기 TVEMF-바이오리액터 용기(말초혈액 줄기세포를 포함하는 말초혈액 혼합물을 포함)는 3차원 구조, 세포-세포 지지체, 및 세포-세포 구조를 유지하기 위하여 말초혈액 줄기세포의 부유를 제공하는 속도에서 회전된다. 바람직하게, 상기 회전속도는 5rpm에서 120rpm이고, 더 바람직하기는 10rpm에서 30rpm이다. 이러한 회전속도는 한정되는 것이 아니며, 회전속도는 세포배양 챔버와 그 내부에 위치되는 샘플의 크기 및 적어도 일부분의 바이오리액터의 타입에 의존한다. 세포가 TVEMF-바이오리액터에 있는 동안, 상기 세포는 영양소와 새로운 매개물(예를 들어, DMEM 및 5%의 인간 혈청 알부민)로 이송되고, 호르몬, 사이토카인, 및/또는 성장팩터(바람직하기는 G-CSF)에 노출되고, 유해물질이 제거된다. 상기 TVEMF-바이오리액터에서의 말초혈액세포로부터 제거되는 유해물질은 죽은 세포의 유해과립재료 및 과립구와 대식세포의 유해재료를 포함한다. 상기 세포의 TVEMF-확장은 제어되고, 이에 따라 상기 세포는 적어도 여러번 확장(체적당 수의 증가)한다. 말초혈액 줄기세포(존재한다면 다른 세포를 포함)는 적어도 4일 동안 TVEMF-확장을 하고, 바람직하기는 4일에서 약 14일 동안, 보다 바람직하기는 7일에서 10일 동안, 가장 바람직하기는 약 7일 동안이다. TVEMF-확장은 TVEMF-바이오리액터에서 16일 이상 동안 계속될 수 있다. TVEMF-확장이 160일 이상 발생하더라도, 이와 같은 길이 확장은 본 발명에서 바람직한 것은 아니다.
TVEMF-확장은 약 26℃에서 41℃의 온도로, 바람직하기는 37℃의 온도로 TVEMF-바이오리액터에서 수행된다.
TVEMF-확장을 하는 세포의 전체 확장을 모니터링하는 한 방법은 시각검사에 의해 이루어진다. 말초혈액 줄기세포는 전형적으로 어두운 적색이다. 말초혈액 혼합물을 형성하는데 이용되는 매개물은 밝고 맑은 색이다. 상기 바이오리액터가 외전을 시작하고 TVEMF가 적용됨에 따라, 상기 세포는 채색된 세포의 클러스터(cluster)를 감싸는 매개물과 함께 바이오리액터 용기의 중앙으로 밀집한다. 산소와 다른 영양소 첨가물은 바이오리액터의 윈도우(전형적으로 청명한 플라스틱)를 통해 세포 클러스터를 볼 수 있도록 하기 위하여 흐려지지 않는다. 클러스터의 형성은 줄기세포를 3차원 구조, 세포-세포 지지체, 및 세포-세포 구조로 유지하는데 중요하다. 상기 클러스터가 흩어져서 나타나며 세포가 바이오리액터 용기의 벽과 접촉을 시작하는 경우, 회전속도는 (수동 또는 자동적으로)증가되어 세포의 집중화된 클러스터는 다시 형성될 수 있다. 형성후의 세포 클러스터의 시각적인 직경과 이후의 클러스터 직경을 측정하여 비교하면, TVEMF-바이오리액터의 세포의 수가 대략 증가한 것으로 나타난다. TVEMF-확장 동안에 세포의 수의 증가의 측정은 종래의 바이오리액터에서 공지된 여러 방법으로 실행될 수 있다. 클러스터 크기의 증가를 측정 및 모니터링하기 위하여 TVEMF-바이오리액터에 자동센서가 포함될 수 있다.
TVEMF-확장 과정은,예를 들어 바이오리액터 내부에 밀집된 남은 세포를 확보하기 위하여 세포 클러스터 형성을 체크할 수 있는 실험실 전문가에 의해 모니터링될 수 있고, 상기 세포 클러스터가 흩어지기 시작하는 경우에 바이오리액터의 회전을 증가시킬 것이다. 세포 클러스터와 바이오리액터의 내부에서 말초혈액 혼합물의점도를 모니터링하기 위한 자동 시스템은 세포 클러스터를 모니터링할 수 있다. 세포 클러스터의 점도의 변화는 TVEMF-확장 과정이 시작된 후의 2일 정도면 명백하게 이루어지고, TVEMF-바이오리액터의 회전속도는 시간에 대하여 증가될 수 있다. TVEMF-바이오리액터 속도는 전체의 TVEMF-확장을 통해서 변화할 수 있다. TVEMF-확장을 하는 세포가 TVEMF-바이오리액터 용기의 측에 접촉하지 않도록 상기 회전속도는 적시에 조정된다.
또한, 실험실 전문가는 TVEMF-확장 동안에 하루 동안 또는 이틀마다 새로운 매개물을 수동(예를 들어, 주사기)으로 삽입할 수 있고, 바람직하기는 영양소 및 성장팩터와 같은 다른 요구되는 첨가제를 바이오리액터에 삽입할 수 있으며, 폐기물 및 유해물을 세포를 포함하는 매개물에서 제거할 수 있다. 새로운 매개물 및 다른 첨가제는 TVEMF-확장 동안에 자동으로 TVEMF-바이오리액터에 공급될 수 있고, 폐기물은 자동으로 제거된다.
말초혈액 줄기세포는 TVEMF-바이오리액터에 위치되고 TVEMF-확장이 이루어진 후에 약 7일에서 14일 동안 원래의 수의 적어도 7배로 증가될 수 있다. 바람직하게, 상기 TVEMF-확장은 약 7일에서 10일 동안 발생하고, 보다 바람직하기는 약 7일이다. TVEMF-확장 동안에 줄기세포 수의 측정은 필요하지 않다. 본 출원의 전체에 걸쳐서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포는 자연적으로 발생하는 비확장된 말초혈액 줄기세포와 같거나 본질적으로 같은 3차원 구조, 세포-세포 지지체, 세포-세포 구조를 갖는다.
TVEMF-확장의 완료에 따라, 본 발명이 구성에 있어서, 상기 TVEMF-바이오리액터에서 세포 재료는 본 발명의 줄기세포를 포함한다. 다양한 물질이 구성으로부터 제거 또는 첨가될 수 있게 되어 더 나은 이용을 할 수 있다. 본 발명의 다른 실 시예는 생체밖의 포유류 말초혈액 줄기세포 구성에 관한 것으로, 상기 생체밖의 포유류 말초혈액 줄기세포 구성은 인체 시스템 또는 조직을 조력하는 기능을 하고, 조직을 치유, 보충, 및 재생을 한다. 상기 구성은 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포를 포함하고, 원래의 말초혈액에 비해 체적당 말초혈액 줄기세포의 체적당 수가 적어도 7배의 양으로 된다. 예를 들어, 상기 말초혈액 줄기세포의 수(X)가 TVEMF-바이오리액터에 소정의 체적으로 위치되는 경우, TVEMF-확장 이후에 TVEMF-바이오리액터에서의 말초혈액 줄기세포의 수는 적어도 7X로 될 것이다(확장 과정 동안에 세포의 제거가 없는 경우). 이러한 적어도 7배의 확장은 본 발명에서 필수적인 것은 아니지만, 이러한 확장은 치료과정에서 바람직하다. 예를 들어, TVEMF-확장된 세포는 자연적으로 발생하는 말초혈액에 비해 말초혈액 줄기세포의 수가 2배의 양으로 될 수 있다. 바람직하기는 TVEMF-확장된 세포는 자연적으로 발생하는 말초혈액에 비해 말초혈액 줄기세포의 체적당 수가 약 4배에서 25배의 범위에 있다. 본 발명은 포유동물로부터 말초혈액 줄기세포를 포함하는 구성을 나타낸다. 상기 말초혈액 줄기세포는 포유동물로부터 자연적으로 발생하는 말초혈액보다 적어도 7배 큰 체적당 수가 존재한다. 상기 말초혈액 줄기세포는 자연적으로 발생하는 말초혈액과 같거나 본질적으로 같은 3차원 구조, 세포-세포 지지체, 세포-세포 구조를 갖는다. 본 발명의 구성은 혈장, 혈액, 알부민, 세포배양 매개물, 성장팩터, 카퍼 킬레이트 시약, 호르몬, 버퍼, 냉동보존에 제한되지 않고 제약적으로 수용가능한 캐리어를 포함할 수 있다. "제약적으로 수용가능한 캐리어(Pharmaceutically acceptable carrier)"는 줄기세포를 포유동물, 바람직하게는 인간으로 도입하게 하는 시약을 의미한다. 이러한 캐리어는 전술한 물질을 포함할 수 있고, 특히 구성이 도입된 포유동물로부터 혈액 수혈에 이용될 수 있는 물질, 예를 들어 혈액 혈장, 알부민; 염류나 버퍼(바람직하게는 알부민으로 보충된 버퍼)을 포함할 수 있다. 포유동물로 구성의 "도입(introduction)" 동물로 구성의 "투여(administration)"를 의미한다. 포유동물로 본 발명의 줄기세포의 투여는 정맥 주입에 의해 수행된다. 그러나, 다른 투여 방법, 예를 들어 기관이나 치료을 필요로 하는 근처 부위에 직접 주입하는 방법, 약물 투여(특히, 대장 장애를 위해)의 방법, 및 잘 알려진 다른 방법이 이용될 수 있고, 치유를 필요로 하는 직접적인 부위에 줄기세포를 도입하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 주입은 수용가능한 G-CSF의 양, 예를 들어 0.3ng에서 5ug의 양, 더 바람직하기는 1ng/kg에서 100ng/kg, 보다 바람직하기는 5ng/kg에서 20ng/kg, 가장 바람직한 6ng/kg의 양을 주입한다. 본 발명의 구성에서 줄기세포의 투여는 전술한 바와 같은 제약적 캐리어로 발생시킬 수 있다. 구성에서 투여되도록 하는 본 발명에 따른 확장된 줄기세포의 양은 적어도 1000 줄기세포의 양, 바람직하기는 적어도 104 줄기세포, 더 바람직하기는 적어도 105 줄기세포, 보다 바람직하기는 107에서 109 줄기세포, 가장 바람직한 것은 1012 줄기세포의 양이 치료에 효과적이다. 이와 같은 확장된 줄기세포 수의 투여는 일회분 이상이 될 수 있다. 본 출원의 전체에 걸쳐서 나타낸 바와 같이, 환자에게 투여된 줄기세포의 수는 본 발명에 따른 확장에 의해 증가된 바와 같이 본래의 혈액에서 원래 이용가능한 줄기세포의 수에 제한될 수 있다. 이론과 달리, 줄기세포는 자연의 인체 시스템에 의해 투 여가 간단히 제거된 후에 인체에 의해 이용되지 않는다. "수용가능한 캐리어(Acceptable carrier)"는 세포에 유해하지 않은 본 발명의 말초혈액 줄기세포를 나타내고, TVEMF-확장 후, 냉동보존의 후 또는 이에 앞서, 포유동물의 도입(투여)에 앞서 살아남을 수 있다. 이러한 캐리어는 잘 알려져 있고, 본 출원의 전체에서 설명한 바와 같은 물질을 포함하는 다양한 물질을 포함한다. 예를 들어, 혈장, 혈액, 알부민, 세포배양 매개물, 버퍼, 및 냉동보존은 본 발명에서 모두 수용가능한 캐리어이다. 요구되는 캐리어는 요구되는 이용에 의존된다.
종래(TVEMF의 이용이 없음)에 잘 알려진 다른 확장방법은 말초혈액 줄기세포가 3차원 구조 및 세포-세포 지지체를 유지하는 동안에 자연적으로 발생하는 말초혈액보다 적어도 7배의 양으로 말초혈액 줄기세포의 확장을 제공하지 않는다. TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포는 원래의 말초혈액과 같거나 본질적으로 같은 3차원 구조, 세포-세포 지지체, 세포-세포 구조를 갖는다. 상기 구성은 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포를 포함할 수 있고, Dulbecco 매개물 또는 냉동보존을 위한 용해에서 부유된다. 상기 구성은 유해한 과립 재료, 예를 들어 죽은 세포 및 유해재료 또는 과립구와 대식세포에서 해제된다. 상기 구성은 구성의 온도를 -120℃에서 -196℃로 감소시키고 치료나 다른 이용을 위해 필요로 할때까지의 온도 범위에서 냉동보존된 구성을 유지시킴으로써 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포를 포함하는 냉동보존된 구성일 수 있다. 후술할 바와 같이, 가능한 많은 유해 재료가 냉동보존에 앞서 구성으로부터 제거된다.
본 발명의 다른 실시예는 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포의 구성을 갖는 조 직을 재생 및/또는 (전술한 바와 같은)자가면역 질병과 같은 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포는 TVEMF-확장이 완료된 후에 냉동보존을 행한다. 상기 세포는 포유류 신체, 바람직하게는 인간으로 도입, 예를 들어 치유를 위해 조직에 직접 또는 정맥에 주입될 수 있고, 인체의 자연 시스템은 조직을 치유 및 제생한다. 바람직하게, 포유류 신체로 도입되는 구성은 투여된 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포에서 역반응을 일으키는 유해 재료 및 다른 재료로부터 해제된다(자유롭다). 상기 방법(및 구성)은 포유류, 바람직하게는 인간, 생명유지 기관 및 다른 조직을 치유하는데 잠재적으로 이용될 수 있고, 이와 같은 잠재적인 이용은 간 조직, 심장 조직, 조혈 조직, 혈관, 피부 조직, 근육 조직, 창자 조직, 이자 조직, 중앙 신경 시스템 세포, 뼈, 연골 조직, 연결 조직, 폐 조직, 지라 조직, 뇌 조직, 및 다른 인체 조직을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 세포는 치료나 연구를 위해 손쉽게 이용될 수 있고, 이러한 치료나 연구는 개개의 혈액 세포를 필요로 하고, 특히 질병이 발생되는 경우에 질병을 해제하기 위한 세포가 필요하다.
[예 I: TVEMF 바이오리액터에서 실제적인 세포의 TVEMF-확장]
말초혈액이 채혈되고, 말초혈액세포는 아래의 표1에 나타낸 바와 같이 확장된다.
A) 세포의 채집 및 유지
인간 말초혈액(75ml; 약 0.75 × 106 cells/ml)은 인간 기증자로부터 전술한 바와 같은 주사기에 의해 얻게되고, 약 75ml의 Iscove의 변형된 Dulbecco 매개물(IMDM)(GIBCO, Grand Island, NY)에서 부유된다. 상기 Dulbecco 매개물(IMDM)은 20%에서 5%의 인간 알부민(HA), 100ng/ml 재조합형 인간 G-CSF(Amgen Inc., Thousand Oaks, CA), 및 100ng/ml 재조합형 인간 줄기세포 팩터(SCF)(Amgen)으로 보충된다. 상기 말초혈액 혼합물은 도2 및 도3에 나타낸 바와 같은 TVEMF-바이오리액터에 위치된다. TVEMF-확장은 정상의 공기 O2/N비를 갖는 37℃, 6% CO2에서 발생된다. 상기 TVEMF-바이오리액터는 초기에 분당 10회전의 속도(10rpm)에서 회전되고, 본 출원의 전체에서 나타낸 바와 같이, 바이오리액터에서 부유된 말초혈액세포를 유지하기 위하여 필요에 따라 조정된다. 6mA의 시간변화 전류는 바이오리액터에 적용된다. 상기 말초혈액 혼합물에 적용되는 구형파(TVEMF)는 약 0.5가우스이다(주파수: 약 10cycle/sec).
TVEMF-바이오리액터의 말초혈액 혼합물에서의 배양 매개물은 2일마다 한번씩 변화되고/새롭게 된다. 10일에, 상기 세포는 TVEMF-바이오리액터로부터 제거되고 PBS와 함께 세척되고 분석된다. 그 결과를 표1에 나타내었다. 제어 데이타는 확장된 인간 말초혈액의 샘플을 나타내고; 확장된 샘플은 TVEMF-확장 후의 각각의 제어 샘플을 나타낸다.
| 제어 1 | 세포카운트 310,000 | 생육성(Viability) 99% |
| 제어 2 | 세포카운트 305,000 | 생육성 98% |
| 제어 3 | 세포카운트 325,000 | 생육성 100% |
| 제어 4 | 세포카운트 340,000 | 생육성 98% |
| 제어 5 | 세포카운트 325,000 | 생육성 98% |
| 제어 6 | 세포카운트 330,000 | 생육성 98% |
| 제어 7 | 세포카운트 315,000 | 생육성 99% |
| 제어 8 | 세포카운트 350,000 | 생육성 98% |
| 제어 9 | 세포카운트 320,000 | 생육성 98% |
| 제어 10 | 세포카운트 300,000 | 생육성 98% |
| 확장된 샘플 1 | 세포카운트 3,200,000 대응하는 CD34+ 증가:yes | 생육성 98% |
| 확장된 샘플 2 | 세포카운트 3,400,000 대응하는 CD34+ 증가:yes | 생육성 100% |
| 확장된 샘플 3 | 세포카운트 3,550,000 대응하는 CD34+ 증가:yes | 생육성 100% |
| 확장된 샘플 4 | 세포카운트 3,500,000 대응하는 CD34+ 증가:yes | 생육성 98% |
| 확장된 샘플 5 | 세포카운트 3,450,000 대응하는 CD34+ 증가:yes | 생육성 99% |
| 확장된 샘플 6 | 세포카운트 3,400,000 대응하는 CD34+ 증가:yes | 생육성 98% |
| 확장된 샘플 7 | 세포카운트 3,200,000 대응하는 CD34+ 증가:yes | 생육성 98% |
| 확장된 샘플 8 | 세포카운트 3,550,000 대응하는 CD34+ 증가:yes | 생육성 99% |
| 확장된 샘플 9 | 세포카운트 3,400,000 대응하는 CD34+ 증가:yes | 생육성 99% |
| 확장된 샘플 10 | 세포카운트 3,500,000 대응하는 CD34+ 증가:yes | 생육성 98% |
표1로부터 알 수 있는 바와 같이, 비확장된 제어와 비교하면, 말초혈액세포의 TVEMF-확장은 10일에 걸친 세포의 수에 있어서 대략 10-fold의 증가를 나타낸다. 상기 세포가 성장하는 배양 매개물은 1-2일마다 변화되고/새롭게 된다(공급된다).
B) TVEMF-확장된 세포의 분석
제어 및 확장된 샘플의 총 세포 카운트(cell count)는 챔버(마이크로그리드(microgrid)를 갖는 슬라이드 현미경에서 확장된 샘플 또는 제어 세포 부유의 체적을 위치시키고 샘플에서 세포의 수를 카운팅함으로써 이용되는 혈구계 같은 장치)를 카운팅하여 얻게된다. TVEMF-확장의 10일 후의 제어 및 확장된 샘플의 총 세포 카운트의 결과를 표1에 나타내었다.
표1에서 대응하는 CD34+ 증가의 표시는 다음과 같이 결정되었다: 확장된 샘플의 CD34+ 세포는 그 내부에 인간 CD34 선택 키트(EasySep positive selection, StemCell Technologies)를 갖는 다른 세포로부터 분리되고, 상기와 같이 챔버를 카운팅하여 카운트되며, FACScan 흐름 세포계산(기)(Becton-Dickinson)으로 확정된다. CFU-GEMM 및 CFU-GM은 클론원성분석에 의해 카운트된다. 세포 생육성(생육 세포는 살아있고, 비생육 세포는 죽음)은 트리판 블루 배타 테스트(trypan blue exclusive test)에 의해 결정된다. 확장된 샘플에서의 "yes"의 답은 총 세포 카운트에 대응하는 양에서 CD34+ 세포가 증가하는 것을 나타낸다.
C) 조혈 콜로니 형성 세포 양의 증가
이러한 TVEMF-확장 조직 배양 시스템에서 기증자의 말초혈액세포의 배양은 조혈 콜로니 형성 세포(colony-forming cell)의 수를 현저하게 증가시킨다. 전술한 분리 측정에서 결정된 바와 같이, CFU-GM(7-fold 이상) 및 CFU-GEMM(9-fold 이상) 콜로니 형성 세포 수의 일정한 증가는 고원이 없이 7일 이상 관찰되었다.
D) CD34+ 세포의 증가
이러한 TVEMF-확장 조직 배양 시스템에서 정상적인 기증자로부터의 MNCs의 배양은 CD34+ 세포의 수를 현저하게 증가시킨다. 전술한 분리 측정에서 결정된 바와 같이, CD34+ 세포의 평균개수는 6일의 배양으로 10-fold 증가되었고 같은 날에 고원이 있었다.
[수술방법-냉동보존]
전술한 바와 같이, 말초혈액은 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터 채혈된다. 적어도 적혈구는 말초혈액으로부터 제거된다. 상기 말초혈액 줄기세포(요구되는 다른 세포 및 매개물을 갖음)는 TVEMF-바이오리액터에 위치되고, 시간변화 전자력 및 확장에 의해 영향을 받는다. 상기 적혈구가 TVEMF-확장에 앞서 제거되지 않는 경우, TVEMF-확장 후에 제거되는 것이 바람직하다. 상기 TVEMF-확장된 세포는 냉동보존될 수 있다. 이하, TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포의 냉동보존을 위해 방법에 관해 상세히 설명하고, 이러한 세포를 포함하는 구성이 제공된다.
TVEMF-확장 후, TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포를 포함하는 TVEMF-확장된 세포는 적어도 하나의 동결방지제를 포함하는 적어도 하나의 냉동보존 용기에 이송될 수 있다. TVEMF-확장 동안에 존재하는 매개물 및 다른 구성요소를 제거하기 위하여 TVEMF--확장된 말초혈액 줄기세포는 용액(예를 들어, 버퍼 용액 또는 요구되는 냉동보존 용액)으로 먼저 세척되고, 세포의 냉동보존을 위해 용액에서 혼합된다. 이러한 용액은 냉동보존, 냉동보존 용액 또는 동결방지를 나타낸다. 상기 세포는 적절한 냉동 용기에 이송되고, 상기 용기의 온도를 -120℃에서 -196℃, 바람직하게는 -130℃에서 -150℃로 감소시키고, 그 온도에서 유지시킨다. 이러한 온도의 감소는 냉동 과정 동안에 줄기세포의 손상이 가해지지 않도록 또는 최소한의 손상만을 입도록 느리게 진행된다. 필요한 경우, 상기 세포의 온도(약 냉동 용기의 온도)는 인체로 세포를 도입할 수 있는 온도(룸의 온도로부터 인체의 온도)로 상승되고, TVEMF-확장된 세포는 포유류 신체, 바람직하게는 인간에 도입될 수 있다.
이론과 달리, 세포를 냉동시키면 통상적으로 파괴되고, 세포 내의 물도 냉각으로 인하여 얼게된다. 세포 맴브레인, 세포 탈수, 용질 농도, 및 얼음 결정 형성에 삼투압 효과에 의해 손상이 발생될 수 있다. 얼음은 세포 외부에 형성되는 것과 같이, 이용가능한 물이 용액으로부터 제거되며 세포로부터 빠져나가고, 삼투압 탈수가 발생되어 세포를 파괴하는 용질 농도가 상승된다(For a discussion, see Mazur, P., 1977, Cryobiology 14:251-272).
다른 재료는 어는점이 다르다. 어는 과정 및 결정으로부터 세포벽의 손상을 최소화하기 위하여 냉동을 위해 말초혈액 줄기세포 구성은 가능한 적은 오염물질을 포함한다.
이러한 손상은 동결방지제의 이용(a), 냉동율의 제어(b), 및 악화반응을 최소화기 위해 충분히 낮은 온도에서의 저장(c)에 의해 감소될 수 있다.
본 발명에서 냉동보존제를 포함하는 것은 바람직하다. 냉동보존제는 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide (DMSO)) (Lovelock, J. E. and Bishop, M. W. H., 1959, Nature 183:1394-1395; Ashwood-Smith, M. J., 1961, Nature 190:1204-1205), 글리세롤, 폴리비닐피롤리딘(polyvinylpyrrolidine) (Rinfret, A. P., 1960, Ann. N.Y. Acad. Sci. 85:576), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) (Sloviter, H . A. and Ravdin, R. G., 1962, Nature 196:548), 알부민, 덱스트란(dextran), 설탕, 에틸렌글리콜(ethylene glycol), 아이-에리스리톨(i-erythritol), 디-리비톨(D-ribitol), 디-만니톨(D-mannitol) (Rowe, A. W., et al., 1962, Fed. Proc. 21:157), 디-소르비톨(D-sorbitol), 아이-이노시톨(i-inositol), 디-젖당(D-lactose), 콜린 클로라이드(choline chloride) (Bender, M. A., et al., 1960, J. Appl. Physiol. 15:520), 아미노 산-포도당 액(amino acid-glucose solutions)나 아미노 산(Phan The Tran and Bender, M. A., 1960, Exp. Cell Res, 20:651), 메탄올, 아세트아미드(acetamide), 글리세롤 모노아세테이트(glycerol monoacetate) (Lovelock, J. E., 1954, Biochem. J. 56:265), 및 무기성 소금(Phan The Tran and Bender, M. A., 1960, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 104:388; Phan The Tran and Bender, M. A., 1961, in Radiobiology, Proceedings of the Third Australian Conference on Radiobiology, Ilbery, P. L. T., ed., Butterworth, London, p. 59)을 포함하여 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 실시예에서, DMSO가 이용된다. DMSO, 액체는 낮은 농도로 세포에 뮤해하다. 작은 분자인 DMSO는 세포에 침투되고 어는점을 변형하여 물을 결합시켜서 세포간의 세포기관을 보호하고, 얼음 형성으로 인한 손상을 방지한다. 첨가 혈장(예를 들어, 20%에서 25%의 농도)DMSO를 보호할 수 있다. DMSO의 첨가후, 약 1%의 DMSO 농도가 4℃ 이상의 온도에서 유해할 수 있기 때문에, 세포는 0℃ 이하로 유지되어야 한다. 바람직한 동결방지제는 총 구성을 위해 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포를 결합한 것이다: 60%에서 80% 아미노 산-포도당 용액(amino acid-glucose solution)에 20%에서 40% 디메틸 설폭사이드 용액(dimethyl sulfoxide solution), 15%에서 25% 하이드록시 에틸 녹말 용액(hydroxyethyl starch solution), 4%에서 6% 글리세롤, 3%에서 5% 포도당, 6%에서 10% 덱스트란(dextran) T10, 또는 15%에서 25% 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)이나 75%에서 85% 아미노 산-포도당 용액(amino acid-glucose solution). 상기와 같이 나타낸 냉동보존의 양은 전체 구성에서의 냉동보존의 총 양인 것이 바람직하다(구성에 첨가되는 물질의 양은 아님).
말초혈액세포 및 냉동보존제 이외의 다른 물질이 냉동되도록 본 발명의 구성에 존재할 수 있지만, 본 발명의 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포 구성의 냉동보존은 냉동 메커니즘을 고려할 때 가능한 다른 물질을 적게 포함시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포의 구성은 약 -120℃에서 -196℃, 바람직하게는 -130℃에서 -196℃, 더 바람직하게는 -130℃에서 -150℃의 범위의 온도에서 냉각된다.
제어되는 낮은 냉각율은 중요하다. 다른 동결방지제(Rapatz, G., et al., 1968, Cryobiology 5(1):18-25) 및 다른 세포타입은 다른 최적의 냉각율을 갖는다(see e.g. Rowe, A. W. and Rinfret, A. P., 1962, Blood 20:636; Rowe, A. W., 1966, Cryobiology 3(1):12-18; Lewis, J. P., et al., 1967, Transfusion 7(1):17-32; and Mazur, P., 1970, Science 168:939-949 for effects of cooling velocity on survival of peripheral cells (and on their transplantation potential)). 물이 얼음으로 변하는 용해상의 열은 최소화되어야 한다. 냉동 과정은, 예를 들어 프로그램가능한 냉동장치나 메탄올 배치 과정의 이용에 의하여 수행될 수 있다.
프로그램가능한 냉동장치는 최적의 냉각율을 결정하고, 냉각을 용이하게 한다. 크료메드(cryomed)나 플래나 같은 프로그램가능한 제어율 냉각기는 요구되는 냉각율 곡선에 어는 레지멘을 변화시킨다. 다른 수용가능한 냉각기는, 예를 들어 산요 모델 MDF-1155ATN-152C와 모델 MDF-2136ATN-135C, Prienceton CryoTech TEC2000일 수 있다. 예를 들면, 10% DMSO 및 20% 혈장에서의 말초혈액세포 또는 CD34+/CD38-세포를 위해, 최적율은 0℃에서 -200℃로부터 1℃/분에서 3℃/분이다.
본 실시예에서, 냉각율은 본 발명의 세포에 이용될 수 있다. 세포를 유지하는 냉동용기는 냉동 온도에서 안정되어야 하고, 어는점과 녹는점에 있어서 급속한 열이송과 제어효과가 있어야 한다. 냉각 동안에 열을 효율적으로 이송하기 위하여 큰 체적(100ml-200ml)이 금속 플레이트 사이에서 유지되는 폴로레핀 백(예를 들면, Delmed)에서 냉동시키는데 이용될 수 있지만(골수세포의 백은 약 3℃/분의 냉동율로 -80℃의 냉동기에 위치시킴으로써 냉동된다.), 밀봉된 플라스틱 병(예를 들면, Nunc, Wheaton cryules) 또는 유리앰플은 작은 양(1ml-2ml)을 증가시키는데 이용될 수 있다.
다른 실시예에서, 냉각의 메탄올 배치 방법이 이용될 수 있다. 상기 메탄올 배치 방법은 큰 크기에서 작은 아이템을 증가하기 위한 냉동보존의 처리에 적절하다. 상기 방법은 냉동율의 수동제어뿐만 아니라 냉동율을 모니터링하는 리코더가 필요하지 않다. 바람직한 관점에서, DMSO-cfl 세포는 얼음으로 미리 냉각되고 -130℃에서 기계적 냉동기(예를 들면, Harris 또는 Revco)에서 교대로 위치되는 칠드 메탄올을 포함하는 트레이로 이송된다. 메탄올 배치의 서모커플 측정 및 샘플은 1℃/분에서 3℃/분의 요구되는 냉동율을 나타낸다. 적어도 2시간 후, 견본은 -80℃의 온도에 도달될 것이고, 영구저장을 위한 액체 질소(-196℃)에 직접 위치될 수 있다.
냉동 이후, TVEMF-확장된 줄기세포는 (냉동기 같은)냉동 저장용기로 빠르게 이송될 수 있다. 본 실시예에서, 상기 세포는 액체 질소(-196℃)나 그 증기(-165℃)냉동저장될 수 있다. 상기 저장온도는 -120℃ 이하로 되어야 하고, 바람직하게는 -130℃ 이하가 되어야 한다. 이러한 저장은 고효율 액체 질소 냉동기의 이용에 의해 용이하게 된다. 상기 액체 질소 냉동기는 극히 낮은 진공과 내부의 초잔열을 갖는 큰 Thermos 용기와 유사하다. 이에 따라, 열의 누설 및 질소의 손실이 완전히 최소화로 유지된다.
상기 세포의 냉동 보존을 위한 바람직한 장치 및 절차는 미국 캘리포니아 란초 코도보 서모제너시스 코퍼레이션(Thermogenesis Corp., Rancho Cordovo, CA)에서 제조된 것으로, 세포 온도를 -130℃ 이하로 낮추기 위한 절차를 이용한다. 상기 세포는 냉동 및 보존 동안 열발생 플라즈마 백(thermogenesis plasma bag)에 수용된다.
다른 냉동기들도 상업적으로 이용가능하다. 예를 들면, "바이오아케이브(BioArchive) 냉동기는 본 발명의 혈액이나 세포와 같은 극저온 샘플을 냉동시킬 수 있을 뿐만 아니라 재고하며, 예를 들면 한 번에 3,626 백의 냉동 혈액을 관리할 수 있다. 이러한 냉동기는 지시가 입력되면 특정 샘플을 회수할 수 있는 로봇 암을 구비하며, 다른 샘플들과 혼란되게 하거나 다른 샘플들이 온열 환경으로 노출되지 않는 것을 확실하게 한다. 또한 샨호 모델 MDF-1555 A-152와 모델 MDF-2136 ATN-135C 및 프린스턴 CryoTech TEC 2000과 같은 다른 냉동기들도 상업적으로 이용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
TVEMF-확장된 주변 혈액 줄기세포 조성의 온도가 -120℃ 이하, 바람직하게는 -130℃ 이하로 감소한 후, 열발생 냉동기와 같은 장치에 수용될 수 있다. 이들의 온도는 약 -120℃ 내지 -196℃, 바람직하게는 -130℃ 내지 -150℃의 온도로 유지된다. 본 발명에 따라 저온 보존되는 TVEMF-확장된 주변 혈액 줄기세포 조성의 온도는 장기간 동안 -120℃를 상회해서는 안된다.
본 발명에 따라 저온 보존되는 TVEMF-확장된 주변 혈액 줄기세포 또는 조성은 필요시 해동될 수 있도록 불특정 기간 동안 냉동될 수 있다. 예를 들면, 조성은 18년 이상 냉동될 수 있다. 혈액 기증자의 수명이 길면 길수록 보다 장기간으로 냉동될 수 있다.
필요시. 내부에 셀을 갖는 백은 열발생 플라즈마 해동기 또는 서모라인 해동기 시리즈(Thermoline Thawer series)와 같은 다른 해동 장치 등의 해동 시스템에 놓아둘 수 있다. 냉동 보존되는 조성의 온도는 상온까지 상승한다. 냉동 보존제와 혼합된 세포를 해동하는 다른 바람직한 방법에 있어서, 본 발명에 따라 저온 보존되는 TVEMF-확장된 주변 혈액 줄기세포 조성을 가지며, 액체 질소에 저장되는 백은 15분 동안 액체 질소의 기체 상태에 놓아두고, 5분 동안 대기 상온에 노출시키며, 가능한 한 신속하게 37℃의 수조에서 최종적으로 해동시킬 수 있다. 상기 해동된 백의 내용물은 등장 염(isotonic salt) 용액에 2.5%(중량/체적)의 사람 혈청 알부민 및 5%(중량/체적)의 덱스트란(dextran) 40(Solplex 40: Sifra, Verona, Italy)을 포함하는 용액으로 바로 희석되고, 이후 10분 동안 400g으로 원심 분리된다. 상기 상청액(supernatant)은 제거되고, 상기 침전된 세포는 새로운 알루민/덱스트란 용액에서 재현탁된다. 루비스텐(Rubinstein) 등의 비혈연 골수 이식을 위한 태반/탯줄 혈액의 절차 및 냉동 보존(Proc. Natl. Acad. Sci. 92:10119-1012(1995) for Removal of Hypertonic Cryoprotectant)을 참조해 보면, 세포 해동의 여러 바람직한 방법을 라자리. 엘(Lazzari, L) 등(Evaluation of the effect of cryopreservation on ex vivo expansion of hematopoietic progenitors from cord blood. Bone Marrow Trans. 28:693-698(2001))에서 알 수 있다.
상기 세포의 온도가 상온으로 상승한 후, 이들은 재조사 또는 재생 치료에 이용될 수 있다. 상기 해동된 TVEMF-확장된 주변 혈액 줄기세포 조성은 포유 동물, 바람직하게는 인간에 직접적으로 투입될 수 있고, 그 해동된 형태로 예를 들면 요구되는 재조사용으로 이용될 수 있다. 상기 해동된 세포가 존재하는 용액은 완벽하게 씻겨나갈 수 있고, 다른 것과 교환 또는 부가되거나 필요시 달리 조작될 수 있다. 여러 첨가물이 상기 해동된 조성(또는 냉동 저장되지 않는 TVEMF-확장된 주변 혈액 줄기세포 조성)에 포유 동물의 신체로 투입되기 전, 바람직하게는 투입 바로 직전에 부가될 수 있다. 이러한 첨가물은 성장인자, 구리 킬레이트제(copper chelating agent), 사이토카인(cytokine), 호르몬, 적절한 완충물 또는 희석물을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. G-GSF가 첨가되는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 인간에 대하여, G-CSF가 약 20 내지 40 마이크로그램/kg 신체 중량, 보다 바람직하게는 30 마이크로그램/kg 신체 중량의 양으로 첨가된다. 또한, 투입 전, 상기 TVEMF-확장된 주변 혈액 줄기세포 조성은 포유 동물 자신, 또는 적절한 기증자, 플라즈마, 혈액 또는 알부민, 또는 예를 들면 수혈과 동반될 수 있는 다른 물질과 혼합될 수 있다. 상기 해동된 주변 혈액 줄기 세포는 예를 들면 치료에 사용되도록 필요로 되는 조제약 또는 치료에 사용될 수 있는 조제약에 대한 역반응이 있을 경우 이를 관찰하기 위한 테스트에 이용될 수 있다.
FDA는 조직의 재생을 위하여 확장된 주변 혈액 줄기 세포의 이용은 미국에서는 승인하고 있지 않지만, 이러한 승인은 절박하게 나타나고 있다. 확장된 주변 혈액 줄기 세포의 충분한 양의 직접 주입은 심장, 간, 췌장, 피부, 근육, 장, 비장, 뇌, 그리고 본 발명에 걸쳐 언급된 다른 조직과 같은 생명 조직을 재생하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 TVEMF-확장형 말초혈액 즐기세포 조성은 조직을 치료 또는 재생할 수 있도록 하든가 소정의 질병 또는 상태를 치료 하기에 충분한 양을 포유류,바람직하게는 인간에게 투여되어야 한다. 어떤 치료 절차에 특히 외상성 손상이 발생하여 즉각적인 조직치료가 필요한 경우에 ml당 107 ~109즐기세포를 보유한 TVEMF-확장형 말초혈액 즐기세포 조성중 적어도 20ml가 바람직하게는 한꺼번에 이용되는 것이 바람직하다. 이같은 양은 특히 75kg~80kg의 체중을 가진 사람에게 바람직하다. 포유류에 투입될 TVEMF-확장형 말초혈액 즐기세포 조성량은 부분적으로는 소스말초혈액물질(특히 꽤 제한된 양만이 이용될수 있는경우)에 있는 세포수에 따르게 된다. 환자에 투여되는 TVEMF-확장형 말초혈액 즐기세포의 바람직한 범위는 예를들면 ml당 107 ~109즐기세포를 보유한 10ml~50ml의 TVEMF-확장형 말초혈액 즐기세포 조성이며, 잠재적으로는 그 이상 일수도 있다.고농도의 어떤 물질이 포유류에 투여되면 독성이 있거나 심지어는 치명적이라고 이해되고 있지만 모든 TVEMF-확장형 말초혈액 즐기세포를 예를 들면 TVEMF가 확장한 후 적어도 7번 투여하면 TVEMF-확장형 말초혈액 즐기세포에 과다투여한 것으로는 보이지 않는다.여러 도너 또는 다중집합체 로부터 말초혈액 이 사용되는경우 포유류에 투여되는 말초혈액줄기세포의 수가 높아질수 있다. 또한 환자에 투여될수 있는 TVEMF세포의 투여량은 집합체 또는 한 개인 으로 부터 제공되는 말초혈액의 양에 의해 제한되지 않으며, 다중 투여 예를들면 하루에 한번, 하루에 두번 또는 일주일에 한번 또는 다른 투약 시계(time frame)도 더 쉽게 이용될수 있다. 또한 조직이 처리되면 조직의 형태는 TVEMF-확장형 말초혈액 즐기세포가 이용할 수 있을 만큼 많이 또는 더 적은 투여량이 이용되도록 한다.예컨데 간은 가장 쉽게 처리될 수 있으며 다른 어떤 조직 보다 더적은 즐기 세포를 필요로 한다.
전술한 실시예는 일반적으로 TVEMF-확장형 말초혈액 즐기세포를 저온보존하는데 관한 것이지만 이미 저온보존되고 확장되지 않고 비TVEMF-확장형의 말초혈액 즐기세포를 해동한후에도 TVEMF-확장이 발생 할 수 있다. 또한 저온보존이 요망되는 경우 세포를 냉동하기 전후에 TVEMF-확장이 발생 할 수도 있다.혈액은행은 예를들면 어떤 시점에 필요하다면 저온저장소에 말초혈액줄기세포를 포함하는 조성물을 저온보존하고 있다. 이같은 조성물은 졸래의 방법에 따라 해동될 수 있으며 기술된 바와 같이 TVEMF-확장은 TVEMF 프로세스에서 변화를 가질수 있다. 이후 이 TVEMF-확장형 말초혈액 즐기세포는 상기한 바와 같이 본발명의 조성물로 간주되다. 외상적 손상이 발생하여 환자의 말초혈액줄기세포가 이미 확장되어 있고 준비할 귀중한 여분의 시간을 필요로 하지않는 경우에는 저온보존 하기전의 TVEMF-확장이 바람직하다.
또한 바람직하지는 않지만 TVEMF-확장형 말초혈액 즐기세포는 저온보존된후 해동되며 이후 사용되지 않으면 다시 저온보존 될수도 있다. 즐기세포가 냉동되기전에 TVEMF-확장되는 것(즉 수는 증가하지만 크기는 증가하지않음)이 바람직하다.줄기세포는 또한 냉동후에 확장될수 있으며 이후 냉동전에 이미 확장되었다 해도 해동된다.
주변 혈액 줄기 세포의 확장은 여러 날 소요될 수 있다. 삶과 죽음의 상황, 또는 외상의 경우와 같이 주변 혈액 줄기 세포의 즉각적인 제공을 갖는데 중요한 상황에서, 특히 재조사가 세포의 재투입 전에 이루어질 필요가 있는 경우, 주변 혈액 줄기 세포의 확장을 기다리는데 여러 날은 소용없게 된다. 따라서, 치료 지연의 매 분은 삶과 죽임을 가르는 비상 상황을 예측하여 이용될 수 있는 이러한 확장된 주변 혈액 줄기 세포를 갖도록 하는 것이 특히 바람직하다.
또한, 본 발명의 TVEMF-확장형 주변 혈액 줄기 세포는, TVEMF 확장 이후, 냉동 보존으로 또는 냉동 보존 없이, 포유 동물, 바람직하게는 근원 포유 동물(주변 혈액의 근원인 포유동물)로 투입될 수 있다. 그러나, 이러한 투입은 근원 포유동물(자가 조직)에만 한정될 필요는 없고, TVEMF 확장형 세포는 다른 포유 동물(동종 이계 포유 동물)로 이전될 수 있는 것임을 알 수 있다.
또한, 주변 혈액은 본 발명에 대하여 성체 줄기 세포의 바람직한 근원이지만, 골수로부터의 성체 줄기 세포는 본 발명에서의 주변 혈액 줄기 세포와 유사한 방식으로 TVEMF-확장되고 이용될 수 있는 것임을 알 수 있다.
골수는 줄기세포의 근원으로 손쉽게 이용할 수 없지만, 성분채집술이나 다른 방법을 통해 체집되어야 한다.
본 발명은 TVEMF-확장된 줄기세포를 질병 상태를 테스트하기 위한 시스템으로의 도입을 포함하는 질병 상태의 연구방법도 포함한다. 상기 시스템은 질병을 갖는 포유동물, 질병을 연구하기 위한 적절한 동물 모델, 또는 질병을 연구하기 위한 생체 테스트 시스템을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포는 다음의 질병을 치료하는 연구에 이용될 수 있다:
I. 정상적인 혈액세포생성 및 성숙의 기능장애(질환) 또는 결핍으로 야기되는 질병, 초과증식 줄기세포 질환(hyperproliferative stem cell disorders), 재생불량 빈혈(aplastic anemia), 범혈구감소증(pancytopenia), 저혈소판증(thrombocytopenia), 적혈구 무형성(red cell aplasia), 약, 방사선, 또는 감염으로 인한 블랙판-다이아몬드 증후군(Blackfan-Diamond syndrome), 특발(idiopathic);
II. 조혈 성질환(Hematopoietic malignancies), 급성 림프종(림프성) 백혈병(acute lymphoblastic (lymphocytic) leukemia), 만성 림프종 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수 백혈병(acute myelogenous leukemia), 만성 세균발생 백혈병(chronic myclogenous leukemia), 급성 악성 세균경화(acute malignant myclosclerosis), 다발 세균종(multiple mycloma), 진성 적혈구증가증(polycythemia vera), 원인불명 골수화생(agnogenic myelometaplasia), 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 호지킨림프종(Hodgkin's lymphoma), 비호지킨림프종(non-Hodgkins's lymphoma);
III. 악성(malignant)으로 인한 환자의 면역억제(Immunosuppression), 고형 종양(solid tumors), 악성 흑색종(malignant melanoma), 위암종(carcinoma of the stomach), 난소 암종(ovarian carcinoma), 유방 암종(breast carcinoma), 소 세포 폐(small cell lung), 암종(carcinoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 고환 암(testicular carcinoma), 아교모세포종(glioblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 유윙 육종(Ewing's sarcoma), 림프종(lymphoma);
IV. 자가면역질환(Autoimmune diseases), 류마티스관절염(rheumatoid arthritis), 당뇨병 타입 I(diabetes type I), 만성 감염(chronic hepatitis), 다발경화증(multiple sclerosis), 및 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus);
V. 유전성 (선천성) 질환(Genetic (congenital) disorders), 빈혈(anemias), 가족성 무형성증(familial aplastic), 판코니 증후군(Fanconi's syndrome), 블루움 증후군(Bloom's syndrome), 적혈구계 무형성증(pure red cell aplasia (PRCA)), 선천성각화부전증(dyskeratosis congenital), 블랙판-다이아몬드 증후군(Blackfan-Diamond-syndrome), 선천 이적혈구생성 증후군 I-IV(congenital dyserythropoietic syndromes I-IV), 슈와크만-다이아몬드 증후군(Chwachmann-Diamond syndrome), 이수소폴산 리덕테이스 결핍증(dihydrofolate reductase deficiencies), 포름아미노 전이효소 결핍(formamino transferase deficiency), 레쉬-니한 증후군(Lesch-Nylan syndrome), 선천성 구형적혈구증(congenital spherocytosis), 선천성 타원적혈구증(congenital elliptocytosis), 선천성 입모양적혈구증가증(congenital stomatocytosis), 선천성 무알에이취 질환(congenital Rh null disease), 발작야간혈색뇨증(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria), 글루코스-6-인산디하이 드로저네이스 결핍증(G6PD(glucose-6-phosphate dehydrogenase)), 변이 1,2,3 피루브산염 키닌 결핍증(variants 1,2,3, pyruvate kiniase deficiency), 선천성 에리트로포에틴 민감증(congenital erythropoietin sensitivity), 결핍증(deficiency), 낫 적혈구 병(sickle cell disease)와 소질(trait), 지중해빈혈 (thalassemia), 알파, 베타, 감마 메트-혈색소혈증(alpha, beta, gamma met-hemoglobinemia), 선천성 면역 장애(congenital disorders of immunity), 중증 복합 면역결핍 병(severe combined immunodeficiency disease, (SCID)), 무표지 림프구 증후군(bare lymphocyte syndrome), 이온운반체-반응성 복합ophore-responsive combined), 결핍증(immunodeficiency), 캐핑 비정상 복합 결핍증(mbined immunodeficiency with a capping abnormality), 뉴클레오시드 인산화효소 결핍증(nucleoside phosphorylase deficiency), 과립구 액틴 결핍증(anulocyte actin deficiency), 영아 무과립구증(infantile agranulocytosis), 고쉐 병(Gaucher's disease), 아데노신 데아미나제 결핍증(adenosine deaminase deficiency), 코스트만 증후군(Kostman's syndrome), 세망 이생성(reticular dysgenesis), 선천성 백혈구 기능장애 증후군(congenital leukocyte dysfunction syndromes); 및
VI. 골화석증(osteopetrosis)을 포함하는 다른 질병, 세균경화증(mycloselerosis), 후천성 요혈빈혈(acquired hemolytic anemias), 후선성 면역결핍증(acquired immunodeficiencies), 1차 또는 2차 면역 결핍에 의한 감염성 장애(infectious disorders causing primary or secondary immunodeficiencies), 기타 세균성감염(bacterial infections)(예를 들면, 브루셀라병(Brucellosis), 리스테리아증(Listerosis), 결핵(tuberculosis), 나병(leprosy)), 기생충감염(parasitic infections) (예를 들면, 말라리아(malaria), 리슈만편모충증(Leishmaniasis)), 곰팡이 감염(fungal infections), 노화 포식세포 장애(aging phagocyte disorders)로 인한 림프세포계(lymphoid cell sets)과 면역부전기능(impaired immune functions), 코스트만 무과립구증(Kostmann's agranulocytosis), 만성 육아종 병(chronic granulomatous disease), 세디아크-히가시 증후군(Chediak-Higachi syndrome), 중성구 액틴 결핍증(neutrophil actin deficiency), 중성구 막 GP-180 결핍증(neutrophil membrane GP-180 deficiency),대사 축적병(metabolic storage diseases), 뮤코다당질축적증(mucopolysaccharidoses), 뮤코리피도시스(mucolipidoses), 달리 분류되지 않는 면역 메카니즘(miscellaneous disorders involving immune mechanisms), 비스코트-올드리치 증후군(Wiskott-Alrich Syndrome), 알파 1- 항트립신 결핍증(alpha 1-antitrypsin deficiency).
확장, 보존, 및 해동의 전체 과정 동안, 본 발명의 말초혈액 줄기세포는 3차원 구조, 세포-세포 지지체, 세포-세포 구조를 유지한다.
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
Claims (55)
- 포유동물로부터의 말초혈액 줄기세포로서,상기 말초혈액 줄기세포는 자연적으로 발생하는 말초혈액보다 적어도 7배 큰 체적당 수를 갖고;상기 말초혈액 줄기세포는 자연적으로 발생하는 말초혈액의 줄기세포와 본질적으로 같은 3차원 구조, 세포-세포 지지체, 세포-세포 구조를 구비하는말초혈액 줄기세포.
- 제1항에 따른 말초혈액 줄기세포 및 수용가능한 캐리어를 포함하는 조성.
- 제2항에 있어서,상기 수용가능한 캐리어는 혈장, 혈액, 알부민, 세포배양 매개물, 버퍼, 및 냉동보존제로 이루어지는 그룹 중 적어도 어느 하나로 이루어지고;성장팩터, 카퍼 킬레이트 시약, 및 호르몬 중 적어도 어느 하나를 더 포함하는조성.
- 제3항에 있어서,상기 성장팩터가 존재하는 경우에 상기 성장팩터는 G-CSF이고,상기 카퍼 킬레이트 시약이 존재하는 경우에 상기 카퍼 킬레이트 시약은 D-페니실라민인조성.
- 제2항에 있어서,상기 구성은 말초혈액 줄기세포를 냉동 보존하기 위해 충분한 온도에서 이루어지는구성.
- 제2항에 있어서,상기 냉동보존제는 세포의 냉동보존을 위해 충분한 양으로 존재하고,상기 조성은 약 -120℃에서 -196℃의 온도에서 이루어지는조성.
- 제6항에 있어서,상기 온도는 -130℃에서 -150℃인조성.
- 제2항에 있어서,제약적으로 수용가능한 캐리어를 더 포함하는 조성.
- 제3항에 있어서,상기 조성은 60%에서 80% 아미노 산-포도당 용액에 20%에서 40% 디메틸 설폭사이드 용액; 15%에서 25% 하이드록시 에틸 녹말 용액; 4%에서 6% 글리세롤, 3%에서 5% 포도당, 6%에서 10% 덱스트란 T10; 15%에서 25% 폴리에틸렌 글리콜; 및 75%에서 85% 아미노 산-포도당 용액으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 냉동보존제의 총 양을 포함하는조성.
- 제2항에 있어서,상기 조성은 유해 물질로부터 해제되는조성.
- 포유동물로부터의 말초혈액 줄기세포로서,상기 말초혈액 줄기세포는 TVEMF-확장된 것인말초혈액 줄기세포.
- 제11항에 있어서,체적당 확장된 말초혈액 줄기세포의 수는 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포가 유도되는 말초혈액의 체적당 줄기세포의 수보다 적어도 2배 큰TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포.
- 제12항에 있어서,체적당 확장된 말초혈액 줄기세포의 수는 적어도 7배 큰TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포.
- 제13항에 따른 말초혈액 줄기세포 및 수용가능한 캐리어를 포함하는 조성.
- 제13항에 따른 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포를 포함하는 조성으로서,상기 수용가능한 캐리어는 혈장, 혈액, 알부민, 세포배양 매개물, 버퍼, 및 냉동보존제로 이루어지는 그룹 중 적어도 어느 하나로 이루어지고;성장팩터, 카퍼 킬레이트 시약, 및 호르몬 중 적어도 어느 하나를 더 포함하는조성.
- 제15항에 있어서,상기 성장팩터가 존재하는 경우에 상기 성장팩터는 G-CSF이고,상기 카퍼 킬레이트 시약이 존재하는 경우에 상기 카퍼 킬레이트 시약은 D-페니실라민인조성.
- 제14항에 있어서,상기 조성은 60%에서 80% 아미노 산-포도당 용액에 20%에서 40% 디메틸 설폭사이드 용액; 15%에서 25% 하이드록시 에틸 녹말 용액; 4%에서 6% 글리세롤, 3%에서 5% 포도당, 6%에서 10% 덱스트란 T10; 15%에서 25% 폴리에틸렌 글리콜; 및 75%에서 85% 아미노 산-포도당 용액으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 냉동보존제의 총 양을 포함하는조성.
- 제14항에 있어서,상기 조성은 말초혈액 줄기세포를 냉동 보존하기 위해 충분한 온도에서 이루어지는조성.
- 제14항에 있어서,상기 냉동보존제는 세포의 냉동보존을 위해 충분한 양으로 존재하고,상기 조성은 약 -120℃에서 -196℃의 온도에서 이루어지는조성.
- 제14항에 있어서,상기 온도는 -130℃에서 -150℃인조성.
- 제14항에 있어서,상기 조성은 유해 물질로부터 해제되는조성.
- TVEMF-바이오리액터의 배양챔버에 말초혈액 혼합물을 위치시키고;말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위하여 TVEMF-바이오리액터에서 TVEMF 및 TVEMF-확장하는 말초혈액 줄기세포에 의해 상기 말초혈액 혼합물에 영향을 주는말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제22항에 있어서,상기 TVEMF는 약 0.05가우스에서 6.0 가우스인말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제22항에 있어서,상기 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포의 체적당 수가 TVEMF-바이오리액터에 위치되는 말초혈액 줄기세포의 체적당 수의 7배 이상으로 될때까지 계속해서 TVEMF-확장하는말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제22항에 있어서,상기 TVEMF-바이오리액터에 말초혈액 혼합물을 위치시키기에 앞서 말초혈액을 채혈하는 것을더 포함하는 말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제25항에 있어서,상기 말초혈액은 인간 말초혈액인말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제22항에 있어서,상기 말초혈액 혼합물에 말초혈액을 첨가하기에 앞서 말초혈액 저장설비로부터 냉동보존된 말초혈액을 해동하여 채혈하는 것을더 포함하는 말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제22항에 있어서,TVEMF-확장에 앞서 말초혈액 혼합물로부터 유해 물질을 제거하는 것을더 포함하는 말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제22항에 있어서,상기 TVEMF-바이오리액터는 통합된 TVEMF 근원인말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제22항에 있어서,상기 TVEMF-바이오리액터는 인접한 TVEMF 근원인말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제22항에 있어서,상기 말초혈액 혼합물은 다른 말초혈액 조성요소로부터 분리되는 CD34+/CD38-말초혈액 줄기세포를 포함하는말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제22항에 있어서,상기 말초혈액 혼합물은 다른 말초혈액 조성요소로부터 분리되는 버피 코트를 포함하는말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제22항에 있어서,상기 말초혈액 혼합물은 적혈구에서 해제되는 말초혈액을 포함하는말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제22항에 있어서,말초혈액 줄기세포 조성의 TVEMF-확장된 세포를 -120℃에서 -196℃의 제어율 의 온도로 냉동용기의 온도를 낮춘 온도를 갖는 냉동용기로 이송하는 것을더 포함하는 말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제34항에 있어서,-120℃에서 -196℃의 제어율의 온도로 냉동용기의 온도를 낮추기에 앞서 말초혈액 줄기세포 조성으로부터 유해 물질을 제거하는 것을더 포함하는 말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제34항에 있어서,온도를 낮춘 이후에 냉동용기의 온도를 소정시간 동안 -120℃에서 -196℃로 유지하는 것을더 포함하는 말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제36항에 있어서,상기 소정시간 동안은 적어도 1년인말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제36항에 있어서,온도를 낮추고 유지한 후에, 말초혈액 줄기세포 조성을 포유동물에 적정한 온도로 도입하기 위하여 제어율로 냉동용기의 온도를 증가시키는 것을더 포함하는 말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제38항에 있어서,상기 유해물질은 증가된 온도의 말초혈액 줄기세포 조성으로부터 제거되는말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제34항에 있어서,온도를 낮추기 전에 말초혈액 줄기세포 조성의 TVEMF-확장된 세포에 냉동보존제를 첨가하는 것을더 포함하는 말초혈액 줄기세포 조성을 작성하기 위한 방법.
- 제22항에 따른 방법에 의해 작성되는 수용가능한 캐리어 및 말초혈액 줄기세포를 포함하는 조성.
- 효과적으로 치료하기 위하여 제1항에 따른 말초혈액 줄기세포를 포함하는 조성의 양 및 제약적으로 수용가능한 캐리어를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는포유동물의 조직을 치유하는 방법.
- 효과적으로 치료하기 위하여 제11항에 따른 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포를 포함하는 조성의 양 및 제약적으로 수용가능한 캐리어를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는포유동물의 조직을 치유하는 방법.
- 제43항에 있어서, 치유되는 상기 조직은 인간 조직인포유동물의 조직을 치유하는 방법.
- 제44항에 있어서,상기 포유동물은 TVEMF-확장에 앞서 말초혈액 줄기세포의 근원인포유동물의 조직을 치유하는 방법.
- 제44항에 있어서,치유되는 상기 조직은 간 조직, 심장 조직, 조혈 조직, 혈관, 피부 조직, 근육 조직, 창자 조직, 이자 조직, 중앙 신경 시스템 세포, 뼈, 연골 조직, 연결 조직, 폐 조직, 지라 조직, 및 뇌 조직으로 이루어지는 그룹으로부터 적어도 어느 하나가 선택되는포유동물의 조직을 치유하는 방법.
- 제43항에 있어서,포유동물에 투여되는 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포의 양은 107에서 109 stem cell/ml를 갖는 조성 중 적어도 20ml인포유동물의 조직을 치유하는 방법.
- 효과적으로 치료하기 위하여 제1항에 따른 말초혈액 줄기세포를 포함하는 조성의 양 및 제약적으로 수용가능한 캐리어를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는포유동물의 질병을 치료하는 방법.
- 효과적으로 치료하기 위하여 제11항에 따른 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포를 포함하는 조성의 양 및 제약적으로 수용가능한 캐리어를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는포유동물의 질병을 치료하는 방법.
- 제49항에 있어서,상기 포유동물은 인간이고, 상기 포유동물은 TVEMF_확장에 앞서 말초혈액 줄기세포의 근원인포유동물의 질병을 치료하는 방법.
- 제50항에 있어서,포유동물에 투여되는 TVEMF-확장된 말초혈액 줄기세포의 양은 107에서 109 stem cell/ml를 갖는 조성 중 적어도 20ml인포유동물의 질병을 치료하는 방법.
- 제50항에 있어서,상기 질병은 정상적인 혈액세포생성 및 성숙의 기능장애(질환) 또는 결핍으로 야기되는 초과증식 줄기세포 질환(hyperproliferative stem cell disorders), 재생불량 빈혈(aplastic anemia), 범혈구감소증(pancytopenia), 저혈소판증(thrombocytopenia), 적혈구 무형성(red cell aplasia), 약, 방사선, 또는 감염으로 인한 블랙판-다이아몬드 증후군(Blackfan-Diamond syndrome), 특발(idiopathic);조혈 성질환(Hematopoietic malignancies), 급성 림프종(림프성) 백혈병(acute lymphoblastic (lymphocytic) leukemia), 만성 림프종 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수 백혈병(acute myelogenous leukemia), 만성 세균발생 백혈병(chronic myclogenous leukemia), 급성 악성 세균경화(acute malignant myclosclerosis), 다발 세균종(multiple mycloma), 진성 적혈구증가증(polycythemia vera), 원인불명 골수화생(agnogenic myelometaplasia), 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 호지킨림프종(Hodgkin's lymphoma), 비호지킨림프종(non-Hodgkins's lymphoma);악성(malignant)으로 인한 환자의 면역억제(Immunosuppression), 고형 종양(solid tumors), 악성 흑색종(malignant melanoma), 위암종(carcinoma of the stomach), 난소 암종(ovarian carcinoma), 유방 암종(breast carcinoma), 소 세포 폐(small cell lung), 암종(carcinoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 고환 암(testicular carcinoma), 아교모세포종(glioblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 유윙 육종(Ewing's sarcoma), 림프종(lymphoma);자가면역질환(Autoimmune diseases), 류마티스관절염(rheumatoid arthritis), 당뇨병 타입 I(diabetes type I), 만성 감염(chronic hepatitis), 다발경화증(multiple sclerosis), 및 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus);유전성 (선천성) 질환(Genetic (congenital) disorders), 빈혈(anemias), 가족성 무형성증(familial aplastic), 판코니 증후군(Fanconi's syndrome), 블루움 증후군(Bloom's syndrome), 적혈구계 무형성증(pure red cell aplasia (PRCA)), 선천성각화부전증(dyskeratosis congenital), 블랙판-다이아몬드 증후군(Blackfan-Diamond-syndrome), 선천 이적혈구생성 증후군 I-IV(congenital dyserythropoietic syndromes I-IV), 슈와크만-다이아몬드 증후군(Chwachmann-Diamond syndrome), 이수소폴산 리덕테이스 결핍증(dihydrofolate reductase deficiencies), 포름아미노 전이효소 결핍(formamino transferase deficiency), 레쉬-니한 증후군(Lesch-Nylan syndrome), 선천성 구형적혈구증(congenital spherocytosis), 선천성 타원적혈구증(congenital elliptocytosis), 선천성 입모양적혈구증가증(congenital stomatocytosis), 선천성 무알에이취 질환(congenital Rh null disease), 발작야간혈색뇨증(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria), 글루코스-6-인산디하이 드로저네이스 결핍증(G6PD(glucose-6-phosphate dehydrogenase)), 변이 1,2,3 피루브산염 키닌 결핍증(variants 1,2,3, pyruvate kiniase deficiency), 선천성 에리트로포에틴 민감증(congenital erythropoietin sensitivity), 결핍증(deficiency), 낫 적혈구 병(sickle cell disease)와 소질(trait), 지중해빈혈 (thalassemia), 알파, 베타, 감마 메트-혈색소혈증(alpha, beta, gamma met-hemoglobinemia), 선천성 면역 장애(congenital disorders of immunity), 중증 복합 면역결핍 병(severe combined immunodeficiency disease, (SCID)), 무표지 림프구 증후군(bare lymphocyte syndrome), 이온운반체-반응성 복합ophore-responsive combined), 결핍증(immunodeficiency), 캐핑 비정상 복합 결핍증(mbined immunodeficiency with a capping abnormality), 뉴클레오시드 인산화효소 결핍증(nucleoside phosphorylase deficiency), 과립구 액틴 결핍증(anulocyte actin deficiency), 영아 무과립구증(infantile agranulocytosis), 고쉐 병(Gaucher's disease), 아데노신 데아미나제 결핍증(adenosine deaminase deficiency), 코스트만 증후군(Kostman's syndrome), 세망 이생성(reticular dysgenesis), 선천성 백혈구 기능장애 증후군(congenital leukocyte dysfunction syndromes); 및골화석증(osteopetrosis)을 포함하는 다른 질병, 세균경화증(mycloselerosis), 후천성 요혈빈혈(acquired hemolytic anemias), 후선성 면역결핍증(acquired immunodeficiencies), 1차 또는 2차 면역 결핍에 의한 감염성 장애(infectious disorders causing primary or secondary immunodeficiencies), 기타 세균성감염(bacterial infections)(예를 들면, 브루셀라병(Brucellosis), 리스테리아증(Listerosis), 결핵(tuberculosis), 나병(leprosy)), 기생충감 염(parasitic infections) (예를 들면, 말라리아(malaria), 리슈만편모충증(Leishmaniasis)), 곰팡이 감염(fungal infections), 노화 포식세포 장애(aging phagocyte disorders)로 인한 림프세포계(lymphoid cell sets)과 면역부전기능(impaired immune functions), 코스트만 무과립구증(Kostmann's agranulocytosis), 만성 육아종 병(chronic granulomatous disease), 세디아크-히가시 증후군(Chediak-Higachi syndrome), 중성구 액틴 결핍증(neutrophil actin deficiency), 중성구 막 GP-180 결핍증(neutrophil membrane GP-180 deficiency),대사 축적병(metabolic storage diseases), 뮤코다당질축적증(mucopolysaccharidoses), 뮤코리피도시스(mucolipidoses), 달리 분류되지 않는 면역 메카니즘(miscellaneous disorders involving immune mechanisms), 비스코트-올드리치 증후군(Wiskott-Alrich Syndrome), 알파 1- 항트립신 결핍증(alpha 1-antitrypsin deficiency)으로 이루어지는 그룹으로부터 적어도 어느 하나가 선택되는포유동물의 질병을 치료하는 방법.
- TNEMF-확장된 줄기세포를 질병상태를 위한 테스트 시스템에 도입하는 것을 포함하는질병 상태를 연구하기 위한 방법.
- 제53항에 있어서,상기 질병은 정상적인 혈액세포생성 및 성숙의 기능장애(질환) 또는 결핍으로 야기되는 초과증식 줄기세포 질환(hyperproliferative stem cell disorders), 재생불량 빈혈(aplastic anemia), 범혈구감소증(pancytopenia), 저혈소판증(thrombocytopenia), 적혈구 무형성(red cell aplasia), 약, 방사선, 또는 감염으로 인한 블랙판-다이아몬드 증후군(Blackfan-Diamond syndrome), 특발(idiopathic);조혈 성질환(Hematopoietic malignancies), 급성 림프종(림프성) 백혈병(acute lymphoblastic (lymphocytic) leukemia), 만성 림프종 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수 백혈병(acute myelogenous leukemia), 만성 세균발생 백혈병(chronic myclogenous leukemia), 급성 악성 세균경화(acute malignant myclosclerosis), 다발 세균종(multiple mycloma), 진성 적혈구증가증(polycythemia vera), 원인불명 골수화생(agnogenic myelometaplasia), 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 호지킨림프종(Hodgkin's lymphoma), 비호지킨림프종(non-Hodgkins's lymphoma);악성(malignant)으로 인한 환자의 면역억제(Immunosuppression), 고형 종양(solid tumors), 악성 흑색종(malignant melanoma), 위암종(carcinoma of the stomach), 난소 암종(ovarian carcinoma), 유방 암종(breast carcinoma), 소 세포 폐(small cell lung), 암종(carcinoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 고환 암(testicular carcinoma), 아교모세포종(glioblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 유윙 육종(Ewing's sarcoma), 림프종(lymphoma);자가면역질환(Autoimmune diseases), 류마티스관절염(rheumatoid arthritis), 당뇨병 타입 I(diabetes type I), 만성 감염(chronic hepatitis), 다발경화증(multiple sclerosis), 및 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus);유전성 (선천성) 질환(Genetic (congenital) disorders), 빈혈(anemias), 가족성 무형성증(familial aplastic), 판코니 증후군(Fanconi's syndrome), 블루움 증후군(Bloom's syndrome), 적혈구계 무형성증(pure red cell aplasia (PRCA)), 선천성각화부전증(dyskeratosis congenital), 블랙판-다이아몬드 증후군(Blackfan-Diamond-syndrome), 선천 이적혈구생성 증후군 I-IV(congenital dyserythropoietic syndromes I-IV), 슈와크만-다이아몬드 증후군(Chwachmann-Diamond syndrome), 이수소폴산 리덕테이스 결핍증(dihydrofolate reductase deficiencies), 포름아미노 전이효소 결핍(formamino transferase deficiency), 레쉬-니한 증후군(Lesch-Nylan syndrome), 선천성 구형적혈구증(congenital spherocytosis), 선천성 타원적혈구증(congenital elliptocytosis), 선천성 입모양적혈구증가증(congenital stomatocytosis), 선천성 무알에이취 질환(congenital Rh null disease), 발작야간혈색뇨증(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria), 글루코스-6-인산디하이 드로저네이스 결핍증(G6PD(glucose-6-phosphate dehydrogenase)), 변이 1,2,3 피루브산염 키닌 결핍증(variants 1,2,3, pyruvate kiniase deficiency), 선천성 에리트로포에틴 민감증(congenital erythropoietin sensitivity), 결핍증(deficiency), 낫 적혈구 병(sickle cell disease)와 소질(trait), 지중해빈혈 (thalassemia), 알파, 베타, 감마 메트-혈색소혈증(alpha, beta, gamma met-hemoglobinemia), 선천성 면역 장애(congenital disorders of immunity), 중증 복합 면역결핍 병(severe combined immunodeficiency disease, (SCID)), 무표지 림프구 증후군(bare lymphocyte syndrome), 이온운반체-반응성 복합ophore-responsive combined), 결핍증(immunodeficiency), 캐핑 비정상 복합 결핍증(mbined immunodeficiency with a capping abnormality), 뉴클레오시드 인산화효소 결핍증(nucleoside phosphorylase deficiency), 과립구 액틴 결핍증(anulocyte actin deficiency), 영아 무과립구증(infantile agranulocytosis), 고쉐 병(Gaucher's disease), 아데노신 데아미나제 결핍증(adenosine deaminase deficiency), 코스트만 증후군(Kostman's syndrome), 세망 이생성(reticular dysgenesis), 선천성 백혈구 기능장애 증후군(congenital leukocyte dysfunction syndromes); 및골화석증(osteopetrosis)을 포함하는 다른 질병, 세균경화증(mycloselerosis), 후천성 요혈빈혈(acquired hemolytic anemias), 후선성 면역결핍증(acquired immunodeficiencies), 1차 또는 2차 면역 결핍에 의한 감염성 장애(infectious disorders causing primary or secondary immunodeficiencies), 기타 세균성감염(bacterial infections)(예를 들면, 브루셀라병(Brucellosis), 리스테리아증(Listerosis), 결핵(tuberculosis), 나병(leprosy)), 기생충감 염(parasitic infections) (예를 들면, 말라리아(malaria), 리슈만편모충증(Leishmaniasis)), 곰팡이 감염(fungal infections), 노화 포식세포 장애(aging phagocyte disorders)로 인한 림프세포계(lymphoid cell sets)과 면역부전기능(impaired immune functions), 코스트만 무과립구증(Kostmann's agranulocytosis), 만성 육아종 병(chronic granulomatous disease), 세디아크-히가시 증후군(Chediak-Higachi syndrome), 중성구 액틴 결핍증(neutrophil actin deficiency), 중성구 막 GP-180 결핍증(neutrophil membrane GP-180 deficiency),대사 축적병(metabolic storage diseases), 뮤코다당질축적증(mucopolysaccharidoses), 뮤코리피도시스(mucolipidoses), 달리 분류되지 않는 면역 메카니즘(miscellaneous disorders involving immune mechanisms), 비스코트-올드리치 증후군(Wiskott-Alrich Syndrome), 알파 1- 항트립신 결핍증(alpha 1-antitrypsin deficiency)으로 이루어지는 그룹으로부터 적어도 어느 하나가 선택되는질병 상태를 연구하기 위한 방법.
- 포유동물로부터의 골수줄기세포로서,상기 골수줄기세포는 TVEMF-확장된 것인골수줄기세포.
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