KR101290062B1 - 말초 혈액으로부터 활성화 ｔ 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물, 이를 포함하는 배양 키트 및 이를 이용하여 말초 혈액으로부터 활성화 ｔ 임파구 세포를 유도하는 방법 - Google Patents
말초 혈액으로부터 활성화 ｔ 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물, 이를 포함하는 배양 키트 및 이를 이용하여 말초 혈액으로부터 활성화 ｔ 임파구 세포를 유도하는 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101290062B1 KR101290062B1 KR1020120073803A KR20120073803A KR101290062B1 KR 101290062 B1 KR101290062 B1 KR 101290062B1 KR 1020120073803 A KR1020120073803 A KR 1020120073803A KR 20120073803 A KR20120073803 A KR 20120073803A KR 101290062 B1 KR101290062 B1 KR 101290062B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- culture
- activated
- peripheral blood
- culture composition
- inducing
- Prior art date
Links
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 69
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 64
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 34
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 claims abstract description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 12
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 claims abstract description 12
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 claims abstract description 11
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 11
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 10
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 9
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims description 16
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 16
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 16
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical group O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 4
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 claims description 4
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 claims description 4
- CODNYICXDISAEA-UHFFFAOYSA-N bromine monochloride Chemical compound BrCl CODNYICXDISAEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 9
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 8
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 7
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 5
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 108010029961 Filgrastim Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 2
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 229960004177 filgrastim Drugs 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010031650 Thy-1 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000005245 sintering Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
- C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 말초 혈액으로부터 T 세포를 유도하기 위한 배양 조성물, 이를 포함하는 배양 키트 및 이를 이용하여 말초 혈액으로부터 T 세포를 유도하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아데노신 트리포스페이트(ATP), 2가 양이온, 염화물, 비타민 B6, 인슐린, G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factors), 에리스로포이에틴 및 용매를 포함하는, 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물, 이를 포함하는 배양 키트 및 이를 이용하여 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물, 이를 포함하는 배양 키트 및 이를 이용하여 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 말초 혈액으로부터 획득한 백혈구 세포를 유도분화시켜 CD3, CD25 양성 T 세포를 유도할 수 있도록 하는 배양 조성물, 이를 포함하는 배양 키트 및 이를 이용하여 CD3, CD25 양성 T 세포를 유도하는 방법에 관한 것이다.
T 세포란 T 임파구(T lymphocytes)로도 불리며 골수의 조혈줄기세포로부터 유래하고 가슴샘 내에서 분화하여 말초림프조직으로 이행하는 세포로서, 비장, 림프절의 가슴샘 전역에 분포한다.
이러한 T 세포는 조직 또는 혈액 내 림프구 중 60~70%를 차지하고 B세포보다 약간 많으며, 형태적으로 B세포와 구별할 수는 없지만 세포표면항원(CD4, CD8, CD3 또는 마우스에서는 Thy1 항원 등)의 차이에 의해 동정 분리할 수 있다.
T세포는 세포 표면에 발현하는 항원CD4 및 CD8 분자에 의해서 CD4+CD8- T세포와 CD4-CD8+ T세포로 크게 구분된다. 전자에 속하는 도움 T 세포, 지연형 과민 반응을 매개하는 세포, 후자에 속하는 살생 T 세포(killer T cell) 등 기능이 다른 몇 개의 아집단으로 나누어진다.
CD3는 모든 T 세포에 공통적으로 발현되는 세포표시인자이며, 세포가 T 세포임을 증명하는 세포표시인자이다. 이러한 T 세포 중에서 CD25를 발현하는 T 세포는 활성화 T 세포(activated T-lymphocyte)로 간주된다(T cell subsets A synopsis of the lecture by Dr. Steve Cobbold for the FHS Physiology Immunology Option 1/ Definitions and relationships of different T cell subsets http://users.path.ox.ac.uk/~scobbold/Teaching/TSUBSETS.pdf). 한편, CD25 양성인 세포는 활성화 T 세포(activated T-lymphocyte)로써 자가면역질환과 종양질환에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Romagnoli Paola, Tellier Julie, Van Meerwijik Joost Pm: Genetic control of thymic development of CD4+,CD25+FoxP3+ regulatory T lymphocytes, Eur J Immunol, 2005 Dec; 35(12):3525-32).
T 세포(T-Lymphocytes)는 암세포, 바이러스 또는 이식된 조직이나 세포에 대한 세포 면역을 중재하는 세포의 주요 유형이며, 표적을 공격하기 위해 T 세포는 휴지 상태, 및 비증식 상태에서 능동적이고, 증식이 가능한 상태로 활성화되어야 한다.
한편, 인체 내에서 이루어지는 조혈과정은 도 1에 도시된 바와 같이 다능성 조혈모세포에서 과립구, 단핵구, 림파구와 같은 기능성 성숙 분화세포로 분화되는 한 방향의 과정이다.
이와 같이 분화가 완료된 말초 혈액, 특히 그 중 성숙 백혈구로부터 활성화 T 임파구 세포로의 유도가 가능하다면 활성화 T 임파구 세포를 실험관 내에서(In vitro) 용이하게 유도배양 한 후 류마티스 관절염 이나 루프스와 같은 자가면역질환 치료 및 종양의 축소 및 사멸을 유도할 수 있는 세포 치료제 등과 관련한 다양한 분야에서의 연구 및 임상 적용이 가능할 것으로 기대된다.
이에 본 발명의 한 측면은 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 및 이러한 배양 조성물 및 배양 키트를 이용하여 활성화 T 임파구 세포를 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 아데노신 트리포스페이트(ATP), 2가 양이온, 염화물, 비타민 B, 인슐린, G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factors), 에리스로포이에틴 및 용매를 포함하는, 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물이 제공된다.
상기 유도된 T 세포는 CD3 및 CD25 세포표시인자가 양성인 것이다.
상기 2가 양이온은 Zn2 +, Cu2 +, Mg2 +, 및 Cr2 +로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다.
상기 염화물은 염화칼륨 및 염화 브롬(Bromine Chloride)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다.
상기 비타민 B는 비타민 B6인 것이 바람직하다.
상기 용매는 증류수인 것이 바람직하다.
상기 배양 조성물은 아데노신 트리포스페이트(ATP) 10-15mg, 2가 양이온 5-7mg, 염화물 80-100mg, 비타민 B 45-55mg, 인슐린 3-7 I.U, G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factors) 5-15 μg, 에리스로포이에틴 5 -15 I.U 및 잔부의 용매를 전체 조성물의 최종 부피가 8cc가 되도록 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기와 같은 배양 조성물을 함유하며, 내부 압력이 외부 압력과 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기를 포함하는, 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 혈액을 항응고제와 혼합한 후 원심분리하여 버피코트(Buffy coat) 및 혈장을 획득하는 단계; 상기와 같은 배양 조성물을 함유하며, 내부 압력이 외부 압력과 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기에, 상기에서 획득된 버피코트(Buffy coat) 및 혈장을 주입하는 단계; 및 상기 버피코트(Buffy coat) 및 혈장이 주입된 용기를 저온 배양기에 넣어서 배양하는 단계를 포함하는, 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하는 방법이 제공된다.
상기 배양은 70 시간 내지 120 시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.
상기 배양은 37 내지 39℃의 온도에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 유도된 T 세포는 CD3 및 CD25 세포표시인자가 양성인 것이 바람직하다.
말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하기 위한 본 발명의 배양 조성물, 배양 키트, 및 이를 이용한 활성화 T 임파구 세포의 유도 방법을 이용하는 경우, 성체로부터 획득한 말초 혈액으로부터 다량의 활성화 T 임파구 세포를 용이하게 획득할 수 있으며, 이에 따라 획득된 활성화 T 임파구 세포를 이용하여 류마티스 관절염 이나 루프스 등과 같은 자가면역질환의 치료 및 종양의 축소와 사멸을 유도할 수 있는 세포 치료제 등과 관련한 다양한 분야에서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 조혈모세포에서 성숙한 말초 혈구로 분화하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2(a)는 본 발명의 배양 조성물을 나타낸 것이고, 도 2(b)는 본 발명의 배양 조성물에 버피코트(Buffy coat) 및 혈장(Plasma)을 주입한 직후를 나타낸 것이며, 도2(c)는 본 발명의 배양 키트를 4주간 배양한 후의 결과를 나타낸 것이다.
도 3 내지 5는 동일한 조건에서 상이한 대상으로부터 유래된 3군의 말초 혈액 시료를 각각주입한 본 발명의 배양 키트를 이용하여 28일간 배양한 후 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색을 진행하여 현미경 하에서 관찰한 결과이다(X400). 상기 도3 내지 도5 각각에서 (a)는 CD 3의 면역조직화학 염색에 대한 결과를 나타낸 것이며, (b)는 CD25의 면역조직화학 염색에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 2(a)는 본 발명의 배양 조성물을 나타낸 것이고, 도 2(b)는 본 발명의 배양 조성물에 버피코트(Buffy coat) 및 혈장(Plasma)을 주입한 직후를 나타낸 것이며, 도2(c)는 본 발명의 배양 키트를 4주간 배양한 후의 결과를 나타낸 것이다.
도 3 내지 5는 동일한 조건에서 상이한 대상으로부터 유래된 3군의 말초 혈액 시료를 각각주입한 본 발명의 배양 키트를 이용하여 28일간 배양한 후 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색을 진행하여 현미경 하에서 관찰한 결과이다(X400). 상기 도3 내지 도5 각각에서 (a)는 CD 3의 면역조직화학 염색에 대한 결과를 나타낸 것이며, (b)는 CD25의 면역조직화학 염색에 대한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명에 의하면 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물이 제공된다. 본 발명의 배양 조성물에 의하면 유도에 의해 말초 혈액 내 분화가 완료된 혈구, 특히 백혈구(leukocytes)로부터 T 세포를 획득할 수 있다.
본 발명에 의하면 말초혈액으로부터 획득한 백혈구(leukocyte)로부터 CD3및 CD25가 양성인 활성화 T 임파구 세포를 획득할 수 있다. CD3는 모든 T 임파구 세포에 공통적으로 발현되는 세포표시인자로서 세포가 T 세포임을 증명하는 세포표시인자이며, 이러한 T 세포 중 CD25를 발현하는 T 세포는 활성화 T 임파구 세포(activated T-lymphocyte)로 간주된다.
보다 상세하게, 본 발명에 의하면 말초 혈액으로부터 분리한 버피 코트(Buffy coat)로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도할 수 있으며, 특히 상기 버피 코트에 포함된 백혈구로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도할 수 있는 것이다.
본 발명의 배양 조성물은 아데노신 트리포스페이트(ATP), 2가 양이온, 염화물, 비타민 B, 인슐린, G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factors), 에리스로포이에틴 및 용매를 포함한다.
본 발명에 있어서 사용될 수 있는 용매는 물이며, 바람직하게는 증류수이다.
상기 아데노신 트리포스페이트는 ATP라고도 불리며, 배양 조성물에 있어서 활성화 T 임파구로의 분화를 촉진하고 분화가 유지되도록 하는 에너지원 역할을 하는 것이다.
상기 ATP는 본 발명의 배양 조성물의 최종 부피 8cc를 기준으로 하여, 10-15mg의 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 11 내지 13 mg의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다. 상기 ATP가 10mg 미만의 양으로 포함되는 경우에는 활성화 T 임파구 세포로의 유도배양이 충분히 이루어지지 않는 문제가 있으며, 15mg 를 초과하여 포함되는 경우에는 활성화 T 임파구가 아닌 다른 세포로 분화할 가능성이 있는 문제가 있다.
상기 2가 양이온은 본 발명의 배양 조성물에 있어서 세포막을 안정시키고 전해질 균형을 맞추기 위해 고안된 성분으로서, Zn2 +, Cu2 +, Mg2 +, 및 Cr2+로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 Zn2 +인 것이다. 상기 2가 양이온은 황산구리, 황산마그네슘 황산아연 등과 같이 황산염, 구연산염 등 당해 기술 분야에 알려진 적절한 염의 형태로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, '1종 이상'이란 용어는 각 성분이 단독으로 사용되거나, 2종 이상의 성분이 조합으로 사용될 수 있음을 의미하는 것이다.
상기 2가 양이온은 본 발명의 배양 조성물의 최종 부피 8cc를 기준으로 하여, 본 발명의 배양 조성물에 5-7mg의 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 5.2 내지 6.6 mg의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다.
상기 2가 양이온이 5mg 미만의 양으로 포함되는 경우에는 활성화 T 임파구 세포로 유도분화가 불충분한 문제가 있으며, 7mg 를 초과하여 포함되는 경우에는 배양액의 높은 삼투압으로 인해 세포가 사멸할 수 있는 우려가 있다.
본 발명에 포함된 상기 염화물은, 배양 조성물에 있어서 양이온을 안정화시키고 배양액의 농도를 적절히 유지시키는 역할을 하는 것으로, 염화칼륨 및 염화 브롬(Bromine Chloride)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하며, 염화칼륨인 것이 보다 바람직하다.
상기 염화물은 본 발명의 배양 조성물의 최종 부피 8cc를 기준으로 하여, 본 발명의 배양 조성물에 100-200mg의 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 130-170mg의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다.
상기 염화물이 100mg 미만의 양으로 포함되는 경우에는 삼투압이 과도하게 낮아지는 문제가 있으며, 200mg 를 초과하여 포함되는 경우에는 삼투압이 과도하게 높아지는 문제가 있다. 삼투압이 상기와 같이 과도하게 낮아지거나 높아지는 경우에는 세포의 배양에 있어서 부적정인 영향을 미치며, 활성화 T 임파구 세포의 유도가 원활하게 이루어지지 않을 수 있다.
상기 비타민 B는 특히 비타민 B6(피리독신)인 것이 바람직하며, 상기 비타민 B는 배양 조성물에 있어서 세포 분열의 촉매 역할을 하는 것이다.
상기 비타민 B는 본 발명의 배양 조성물의 최종 부피 8cc를 기준으로 하여, 본 발명의 배양 조성물에 45-55mg의 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 48-52mg의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다.
상기 비타민 B6가 45mg 미만의 양으로 포함되는 경우에는 세포 분열 및 분화의 효율에 문제가 있으며, 55mg를 초과하여 포함되는 경우에는 세포독성이 발생할 우려가 있다.
상기 인슐린은 배양 조성물에 있어서 세포 분화를 위한 신호전달물질의 역할을 하는 것으로, R(Regular) 인슐린을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 인슐린은 본 발명의 배양 조성물의 최종 부피 8cc를 기준으로 하여, 본 발명의 배양 조성물에 3-7 I.U의 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 4-6 I.U의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다.
상기 인슐린이 3 I.U 미만의 양으로 포함되는 경우에는 세포 분열 및 분화의 효율이 저하되는 문제가 있으며, 7 I.U 를 초과하여 포함되는 경우에는 과증식 및 세포사멸이 발생할 가능성이 있다.
상기 G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factors)는 필그라스팀(Filgrastim)이라고도 불리며, 세포 분화 과정에 있어서 분화를 유도하는 신호전달물질의 역할을 하는 것으로, 바람직하게는 유전자 재조합 G-CSF를 사용할 수 있다.
상기 G-CSF는 본 발명의 배양 조성물의 최종 부피 8cc를 기준으로 하여, 본 발명의 배양 조성물에 5-15 μg의 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 8-12μg의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다.
상기 G-CSF가 5μg 미만의 양으로 포함되는 경우에는 세포분열 및 분화의 효율이 저하되는 문제가 있으며, 15μg를 초과하여 포함되는 경우에는 과증식 및 세포사멸이 발생할 우려가 있다.
상기 에리스로포이에틴은 역시 세포 분화 과정에 있어서 분화를 유도하는 역할을 하는 것으로, 바람직하게는 유전자 재조합 에리스로포이에틴을 사용할 수 있다.
상기 에리스로포이에틴은 본 발명의 배양 조성물의 최종 부피 8cc를 기준으로 하여, 본 발명의 배양 조성물에 5 -15 I.U의 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 8 -12 I.U 의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다.
상기 에리스로포이에틴이 5I.U 미만의 양으로 포함되는 경우에는 세포분열 및 분화의 효율이 저하되는 문제가 있으며, 15I.U를 초과하여 포함되는 경우에는 과증식 및 세포사멸이 발생할 우려가 있다.
본 발명의 배양 조성물은 가장 바람직하게는, 아데노신 트리포스페이트(ATP) 10-15mg, 2가 양이온 5-7mg, 염화물 80-100mg, 비타민 B 45-55mg, 인슐린 3-7 I.U, G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factors) 5-15 μg, 에리스로포이에틴 5 -15 I.U 및 잔부의 용매를 전체 조성물의 최종 부피가 8cc가 되도록 포함한다.
한편, 본 발명에 의하면, 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 키트가 제공된다. 본 발명의 배양 키트는 상술한 본 발명의 배양 조성물이 함유된 밀폐 용기를 포함한다.
나아가, 상기 배양 키트는 내부 압력과 외부 압력이 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 키트에 이용될 수 있는 용기는 멸균 처리된 밀폐 용기인 것이 바람직하고, 상기 용기의 재질은 특히 제한되는 것은 아니며, 배양에 적절한 어떠한 용기도 사용할 수 있으나, 유리인 것이 바람직하다. 다만, 배양 조성물을 안전하게 함유하고, 세포를 배양할 수 있는 당업계에 알려진 적절한 어떠한 다른 용기도 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 바이알(vial)을 이용한다.
상기 용기는 상기 본 발명의 배양 조성물을 전체 부피의 약 7/50 내지 9/50의 양으로 함유하는 것이 바람직하다.
나아가, 본 발명에 의하면 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하는 방법이 제공된다
본 발명의 방법은 상기 본 발명의 배양 조성물 및 배양 키트를 이용하며, 보다 상세하게 말초혈액을 항응고제와 혼합한 후 원심분리하여 버피코트(Buffy coat) 및 혈장을 획득하는 단계; 상기 본 발명의 배양 조성물을 함유하며 내부 압력과 외부압력이 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기에, 상기에서 획득된 버피코트(Buffy coat) 및 혈장을 주입하는 단계; 및 상기 버피코트(Buffy coat) 및 혈장이 주입된 용기를 저온 배양기에 넣어서 배양하는 단계를 포함한다.
말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하는 본 발명의 방법에 사용되는 배양 조성물 및 이를 포함하는 키트는 상술한 바와 같다.
본 발명의 활성화 T 임파구 세포 유도 방법은 보다 상세하게는, 먼저 인체로부터 획득한 혈액의 응고를 방지하기 위해 항응고제와 혼합한 후, 이를 원심분리하여 버피코트(Buffy coat) 및 혈장을 획득한다.
이 때 상기 혈액은 바람직하게는 인체의 말단으로부터 획득되는 말초 혈액인 것이 바람직하다. 상기 말초 혈액은 정맥으로부터 획득하는 것이 보다 바람직하며, 예를 들어 팔, 다리 등의 정맥으로부터 획득할 수 있다.
이 때 사용될 수 있는 항응고제는 소듐 시트레이트 및 헤파린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
항응고제는 말초 혈액 100 중량부 당 6 내지 7 중량부의 비율로 혼합하고, 바람직하게는 약 6.6 중량부의 비율로 혼합하며, 말초 혈액 100 중량부 당 6 미만의 항응고제가 혼합되는 경우 항응고 효과가 충분하지 않을 수 있으며, 7 중량부를 초과하는 양의 항응고제가 혼합되는 경우 시트레이드 독성이 발생할 수 있는 문제가 있다.
혈액의 분리를 위한 상기 원심분리는 1500 내지 1700 rpm의 범위에서 20 내지 25 분 동안 수행되며, 1600 내지 1700 rpm의 범위에서 22 내지 24 분 동안 수행되는 것이 보다 바람직하다.
원심분리가 1500 rpm 미만에서 수행되거나 20 분 미만으로 수행되는 경우 원심분리가 불충분하게 수행되는 문제가 있으며, 1700 rpm을 초과하여 수행되거나 25 분을 초과하여 수행되는 경우에는 세포가 손상될 우려가 있다.
원심분리가 완료되면 혈액은 세 층으로 분리가 된다. 가장 아래층은 약 45%를 차지하며, 적혈구(Red blood cells)로 이루어진 층이며, 중간층은 약 1%를 차지하며, 백혈구(White blood cells) 및 혈소판 (platelets) 으로 이루어진 층으로서 '버피 코트(Buffy coat)'라고 불리는 층이고, 가장 윗층은 약 54%를 차지하며 혈장(Plasma)으로 이루어진 층이다.
상술한 본 발명의 배양 조성물을 함유하고 내부 압력이 외부압력과 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기에, 상기에서 분리된 버피코트층 및 혈장층을 주입한다. 상기 외부 압력은 상압을 의미하며, 압력의 조절 방법은 예를 들어 주사기 바늘을 패킹된 고무 마개에 투과시킨 후 압력이 평형을 이루면 주사바늘을 제거하는 방식으로 이루어질 수 있으나 이러한 방법에 특히 제한되는 것은 아니다.
후속적으로 버피코트층 및 혈장층을 주입한 상기 용기를 저온 배양기에서 배양한다. 이 때, 상기 저온 배양은 50 시간 내지 200 시간 동안 수행되고, 바람직하게는 70 시간 내지 160 시간 동안 수행되며, 50 시간 미만으로 배양하는 경우 배양이 충분하지 않은 문제가 있으며, 200 시간을 초과하여 배양하는 경우 배양 조성물 내의 세포 농도가 과도하게 증가하여 세포사멸 혹은 세포자살이 발생하는 문제가 있다.
상기 배양은 37 내지 39℃의 온도에서 수행되며, 보다 바람직하게는 약 38℃의 온도에서 수행된다. 37℃ 미만에서 수행되는 경우에는 다른 계열의 세포로 분화할 수 있는 문제가 있고, 39℃를 초과하여 수행되는 경우에는 세포 열손상이 발생할 우려가 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
<
실시예
>
1. 배양액을 포함하는 배양
키트의
제조
정맥으로부터 추출한 혈액 30cc를 응고 방지를 위해 2cc의 시트레이트 완충제(100cc 시트레이트 완충제 내에는 2.45g 덱스트로즈, 2.2g 소듐 시트레이트, 730mg 시트르산을 포함)(Fenwal)와 혼합하여 혼합액을 제조하였다.
상기 혼합액을 1670 rpm에서 24분 동안 원심분리하여 분리된 혈액으로부터 버피코트(Buffy coat) 및 혈장(Plasma)을 피펫으로 채취하여 50cc 용량의 밀폐 유리병인 배양 키트에 주입하였다.
혈액 30cc를 원심분리하여 얻은 버피코트(Buffy coat) 및 혈장(Plasma)에 대하여 상기 배양 키트에는 하기 표 1과 같은 성분을 포함하는 배양 조성물이 함유되어 있고, 여기에 용매로서 증류수(Distiled water)를 전체 조성물의 최종 부피가 8cc가 되도록 추가하였다.
| 실시예 1 | |
| ATP(Adenosin tri-phosphate) | 15mg |
| 염화칼륨 | 150mg |
| 피리독신 | 50mg |
| 아연 | 5mg |
| 구리 | 0.6 mg |
| 마그네슘 | 0.3 mg |
| 크롬 | 0.004 mg |
| h-에리스로포이에틴 | 10 I.U |
| hG-CSF(Filgrastim) | 10μg |
| R(Regular) 인슐린 | 5 I.U |
상기 밀폐 유리병으로부터 27 게이지 주사기를 이용하여 패킹된 고무마개에 투과시킨 후 압력이 평형을 이루면 주사기를 제거하여 유리병 내외의 압력이 동일하도록 하였다.
도 2(a)는 본 발명의 배양 조성물을 나타낸 것이고, 도 2(b)는 본 발명의 배양 조성물에 버피코트(Buffy coat) 및 혈장(Plasma)을 주입한 직후를 나타낸 것이며, 도2(c)는 본 발명의 배양 키트를 4주간 배양한 후의 결과를 나타낸 것이다.
2. 말초 혈액으로부터 활성화 T
임파구
세포의 유도 과정
3명의 지원자로부터 혈액을 채취하여 1.에서 제조된 바와 같은 배양키트 3군을 구성하여 28일 동안 같은 조건에서 각각 배양하였으며, 배양 온도는 섭씨 38℃로 하였다.
3. T 세포의 유도 결과 확인
(1) 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색
배양이 끝난 후 각각의 배양키트 내에 포함된 각 시료를 시린지에 의해 흡입하여 10mL의 시험 튜브에 배치하고, 그 후 각각의 튜브를 3000rpm으로 10분간 실온에서 원심분리한 후 밑에 가라앉아 분리된 세포 성분(pellet)을 채취하여 파라핀에 넣어 10% 포르말린 용액에서 고정시켰다. 파라핀-포매 세포 블록을 형성한 후, 헤마톡실린-에오진 염색의 수행을 위해 각 시료의 박편을 만들고 면역조직화학 염색처리를 하였다. 면역조직화학 염색을 위해 Bond-MAX (Leica) 장치를 사용하였다.
상기와 같이 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색을 진행한 후 현미경 하에서 관찰하였고(X400), 이에 따른 제1군의 결과를 도 3에 나타내었고, 제2군의 결과를 도 4에 나타내었으며, 제3군의 결과를 도5에 각각 나타내었다.
활성화 림파구로써의 세포 분화를 확인하기 위한 면역형광검사의 항체목록은 CD3 및 CD25이며, 본 실험에 사용된 면역조직화학 염색의 마커는 하기 표 2와 같다.
| 항체 | 제조사 | 희석 비율 | 전처리 |
| CD3 | DAKO | 1:500 | ER2(EDTA, pH8/9) |
| CD25 | Leica | 1:200 | ER1 |
한편, 본 실험에서 사용된 면역조직화학 염색 시약의 정보는 하기와 같다:
Leica Microsystems
Bond TM Polymer Refine Detetion
Catalog No: DS9800
상기 도3 내지 도5에서 (a)는 CD 3에 대한 면역조직화학 염색 결과를 나타낸 것이며, (b)는 CD25에 대한 면역조직화학 염색 결과를 나타낸 것이다.
(2) 소결
도 3 내지 5를 참고하면, 상기 실험에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 배양 조성물 및 방법을 이용하여 4주간 배양한 결과, 림프 계통의 세포 표시 인자인 CD3가 발현되었고, 이와 함께 CD 25가 발현되어 본 발명에 의해서 활성화 T 임파구 세포가 획득되는 것을 확인할 수 있으며, 나아가 3군의 실험이 모두 동일한 결과를 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
도 3 내지 5를 참고하면, 실험 결과 다량의 혈소판과 약간의 세포질을 갖는 작은 임파구 유사 핵, 그리고 다량의 세포질을 갖는 작은 임파구 또는 단핵구 유사 핵을 포함하는 두 그룹의 핵을 갖는 세포 성분이 확인되었다. 상기 두 그룹의 세포는 모두 CD3 및 CD25에 대해 모두 강한 면역 반응성을 나타내었다.
이러한 결과는 발명의 배양 조성물, 키트 및 방법을 이용하는 경우 성숙된 말초백혈구로부터 활성화 T 세포가 유도된 것을 입증하는 것이다.
Claims (12)
- 아데노신 트리포스페이트(ATP), 2가 양이온, 염화물, 비타민 B, 인슐린, G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factors), 에리스로포이에틴 및 용매를 포함하는, 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 유도된 T 세포는 CD3 및 CD25 세포표시인자가 양성인, 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 2가 양이온은 Zn2 +, Cu2 +, Mg2 +, 및 Cr2 +로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인, 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 염화물은 염화칼륨 및 염화 브롬(Bromine Chloride)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인, 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 비타민 B는 비타민 B6(피리독신)인, 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 용매는 증류수인, 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 배양 조성물은 아데노신 트리포스페이트(ATP) 10-15mg, 2가 양이온 5-7mg, 염화물 80-100mg, 비타민 B 45-55mg, 인슐린 3-7 I.U, G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factors) 5-15 μg, 에리스로포이에틴 5 -15 I.U 및 잔부의 용매를 전체 조성물의 최종 부피가 8cc가 되도록 포함하는, 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 배양 조성물을 함유하며, 내부 압력이 외부 압력과 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기를 포함하는, 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 키트.
- 혈액을 항응고제와 혼합한 후 원심분리하여 버피코트(Buffy coat) 및 혈장을 획득하는 단계;
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 배양 조성물을 함유하며, 내부 압력이 외부 압력과 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기에, 상기에서 획득된 버피코트(Buffy coat) 및 혈장을 주입하는 단계; 및
상기 버피코트(Buffy coat) 및 혈장이 주입된 용기를 저온 배양기에 넣어서 배양하는 단계
를 포함하는, 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 배양은 70 시간 내지 120 시간 동안 수행되는, 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 배양은 37 내지 39℃의 온도에서 수행되는, 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 유도된 T 세포는 CD3 및 CD25 세포표시인자가 양성인, 말초 혈액으로부터 활성화 T 임파구 세포를 유도하는 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120073803A KR101290062B1 (ko) | 2012-07-06 | 2012-07-06 | 말초 혈액으로부터 활성화 ｔ 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물, 이를 포함하는 배양 키트 및 이를 이용하여 말초 혈액으로부터 활성화 ｔ 임파구 세포를 유도하는 방법 |
| PCT/KR2012/006318 WO2014007421A1 (en) | 2012-07-06 | 2012-08-08 | Culture composition for inducing activated t lymphocytes from peripheral blood, culture kit comprising the same, and method for inducing activated t lymphocytes from peripheral blood using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120073803A KR101290062B1 (ko) | 2012-07-06 | 2012-07-06 | 말초 혈액으로부터 활성화 ｔ 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물, 이를 포함하는 배양 키트 및 이를 이용하여 말초 혈액으로부터 활성화 ｔ 임파구 세포를 유도하는 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101290062B1 true KR101290062B1 (ko) | 2013-07-26 |
Family
ID=48998104
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020120073803A KR101290062B1 (ko) | 2012-07-06 | 2012-07-06 | 말초 혈액으로부터 활성화 ｔ 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물, 이를 포함하는 배양 키트 및 이를 이용하여 말초 혈액으로부터 활성화 ｔ 임파구 세포를 유도하는 방법 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101290062B1 (ko) |
| WO (1) | WO2014007421A1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114149978B (zh) * | 2022-02-09 | 2022-04-26 | 深圳博雅感知药业有限公司 | 制备car-t细胞的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20070114378A (ko) * | 2005-02-28 | 2007-12-03 | 리제네텍 인코포레이티드 | 말초혈액으로부터 유도된 쉽게 이용가능한 세포 물질을 제공하는 방법 및 그의 조성물 |
-
2012
- 2012-07-06 KR KR1020120073803A patent/KR101290062B1/ko active IP Right Grant
- 2012-08-08 WO PCT/KR2012/006318 patent/WO2014007421A1/en active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20070114378A (ko) * | 2005-02-28 | 2007-12-03 | 리제네텍 인코포레이티드 | 말초혈액으로부터 유도된 쉽게 이용가능한 세포 물질을 제공하는 방법 및 그의 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2014007421A1 (en) | 2014-01-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | A toxicity study of multiple-administration human umbilical cord mesenchymal stem cells in cynomolgus monkeys | |
| Sutherland et al. | The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry | |
| Sut et al. | Duration of red blood cell storage and inflammatory marker generation | |
| Torelli et al. | A good manufacturing practice method to ex vivo expand natural killer cells for clinical use | |
| EP2235162B1 (en) | Method of producing a population of cells | |
| Steininger et al. | Leukapheresis in non–cytokine‐stimulated donors with a new apheresis system: first‐time collection results and evaluation of subsequent cryopreservation | |
| Zhang et al. | Stem cell collection in unmanipulated HLA‐haploidentical/mismatched related transplantation with combined granulocyte‐colony stimulating factor‐mobilised blood and bone marrow for patients with haematologic malignancies: the impact of donor characteristics and procedural settings | |
| CN104039333B (zh) | 移植物抗宿主疾病的治疗或预防方法 | |
| Bucar et al. | Influence of the mesenchymal stromal cell source on the hematopoietic supportive capacity of umbilical cord blood-derived CD34+-enriched cells | |
| CN115039763A (zh) | 一种免疫细胞冻存液 | |
| Spoerl et al. | Patients' outcome after rescue plerixafor administration for autologous stem cell mobilization: a single‐center retrospective analysis | |
| WO2017156235A1 (en) | Methods of preserving mesenchymal stem cells | |
| KR101290062B1 (ko) | 말초 혈액으로부터 활성화 ｔ 임파구 세포를 유도하기 위한 배양 조성물, 이를 포함하는 배양 키트 및 이를 이용하여 말초 혈액으로부터 활성화 ｔ 임파구 세포를 유도하는 방법 | |
| CN109628396B (zh) | 记忆性淋巴细胞群在肝癌治疗中的应用 | |
| Yang et al. | Human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation restores hematopoiesis in acute radiation disease | |
| KR101290061B1 (ko) | 말초 혈액으로부터 수지상 세포를 유도하기 위한 배양 조성물, 이를 포함하는 배양 키트 및 이를 이용하여 말초 혈액으로부터 수지상 세포를 유도하는 방법 | |
| CN111849897B (zh) | 一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法 | |
| Tran et al. | Optimized processing of growth factor mobilized peripheral blood CD34+ products by counterflow centrifugal elutriation | |
| Wu et al. | Terumo spectra optia leukapheresis of cynomolgus macaques for hematopoietic stem cell and T cell collection | |
| Hodgkinson et al. | Intersecting worlds of transfusion and transplantation medicine: an international symposium organized by the Canadian blood services centre for innovation | |
| Wu et al. | Bioactivity of CD34+ cells in patients with acute-on-chronic liver failure | |
| Pereira et al. | A novel approach for the enumeration of Peripheral Blood Stem Cells suitable for Transplantation | |
| Yang et al. | Fully Automated Continuous Centrifugal Microfluidics Isolates Natural Killer Cells with High Performance and Minimal Stress | |
| Wright-Kanuth et al. | Hematopoietic stem cell transplantation | |
| Papert | New approaches to improve extracorporeal photopheresis for the treatment of graft-versus-host disease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| A302 | Request for accelerated examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160722 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170725 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180724 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190723 Year of fee payment: 7 |