CN111500526B - 一种用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的组合物及其用途 - Google Patents

一种用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的组合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的组合物及其用途，利用Forskolin、SB431542、DAPT、IWP‑2、LDN‑193189这5种小分子化合物与传统培养原代小鼠角膜上皮细胞的ROCK抑制剂Y27632联合使用，可以有效地解决原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的贴壁性差和增殖差的问题，并且可以长期维持其形态和功能，这为大量制备功能成熟的小鼠角膜上皮细胞及其应用提供了可能。

Description

一种用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的组合物及其用途
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的组合物及其用途。
背景技术
长期以来，原代小鼠角膜上皮细胞体外培养存在较大的困难，原因在于：一、贴壁性差；二、增殖性差；三、由于原代小鼠角膜上皮细胞在体外培养时容易发生上皮-间充质细胞转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)等多种因素，使得其难以长期维持其形态和功能。目前，常用的用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的方法有：与小鼠成纤维细胞共培养；培养皿涂覆促吸附物质；加入单个促生长的小分子化合物等。但是，现有的方法只能部分地解决原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的困难。因此，有必要对原代小鼠角膜上皮细胞的培养进行进一步研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的组合物及其用途，利用Forskolin、SB431542、DAPT、IWP-2、LDN-193189这5种小分子化合物与传统培养原代小鼠角膜上皮细胞的Rho-associated kinase(ROCK)抑制剂Y27632联合使用，可以有效地解决原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的贴壁性差和增殖差的问题，并且可以长期维持其形态和功能，这为大量制备功能成熟的小鼠角膜上皮细胞及其应用提供了可能。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种组合物，包括Forskolin、SB431542、DAPT、IWP-2、LDN-193189和Y27632。
所述组合物用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
一种上述的组合物在制备原代小鼠角膜上皮细胞体外培养用添加剂中的用途。
所述用途中，所述组合物可以直接作为添加剂，添加至原代小鼠角膜上皮细胞的培养环境中使用。或者，该组合物也可与药学上可接受的辅料组合制备成添加剂，添加至原代小鼠角膜上皮细胞的培养环境中使用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案中，Forskolin、SB431542、DAPT、IWP-2、LDN-193189、Y27632的摩尔比优选为18～22:9～11:4～6:0.4～0.6:0.05～0.15:9～11。
优选地，所述Forskolin的浓度为18～22μmol/L。
优选地，所述SB431542的浓度为9～11μmol/L。
优选地，所述DAPT的浓度为4～6μmol/L。
优选地，所述IWP-2的浓度为0.4～0.6μmol/L。
优选地，所述LDN-193189的浓度为0.05～0.15μmol/L。
优选地，所述Y27632的浓度为9～11μmol/L。
优选地，所述组合物添加于培养基中，所述培养基为DermaLife Basal Medium。
本发明的组合物中，Forskolin为腺苷酸环化酶激活剂，可以下调EMT标记基因；SB431542可以抑制TGF-β信号通路；DAPT抑制Notch信号通路；IWP-2抑制Wnt信号通路；LDN-193189抑制BMP信号通路；Y27632抑制Rock信号通路。但相关的信号通路往往相互关联甚至相互抑制，因此本发明的组合物很可能并非通过单独的某个或某几个信号通路起效，初步推测本发明的组合物在小鼠角膜上皮细胞体外培养中可能的作用机制是通过综合调控多个信号通路进行，例如调控与EMT相关的多种信号通路等，调节与小鼠角膜上皮细胞相关的多种生长因子和转录调节因子等，促进细胞的增殖和功能的维持，且这种综合调控作用与本发明的组合物中各组分或其用量可能具有相关性。本发明的组合物中各组分发挥的作用是相辅相成的，单独的一种或几种效果不佳。
本发明的组合物具有特异性，对原代小鼠角膜上皮细胞体外培养具有促进作用，但对包括角膜基质细胞、角膜内皮细胞、视网膜色素细胞、虹膜色素细胞等在内的多种眼部细胞的培养没有促进作用。此外，本发明的组合物还具有种属特异性，其主要对小鼠角膜上皮细胞培养有效，对兔角膜上皮细胞等无显著效果。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
本发明的组合物用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养，能够很好地促进小鼠角膜上皮细胞贴壁、增殖，以及维持其原有的功能和形态，这为大量制备功能成熟的小鼠角膜上皮细胞及其应用提供了可能，是一种良好的用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的添加剂。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为实施例1中原代小鼠角膜上皮细胞形态与结晶紫染色结果，其中A为显微镜下观察到的细胞形态，B为结晶紫染色结果，C为结晶紫染色结果的统计图，***表示P<0.01。
图2为实施例2中对原代小鼠角膜上皮细胞进行Ki67免疫荧光染色结果，其中A为免疫荧光照片，B为A中免疫荧光染色结果的统计图，**表示P<0.05，***表示P<0.01。
图3为实施例3中qRT-PCR检测原代小鼠角膜上皮细胞功能与分化相关基因表达结果，其中，A表示干细胞标志物p63、k14和分化标志物k12的表达结果，B表示上皮-间充质细胞转化标志物zeb1、zeb2、a-sma、b-catenin的表达结果，*表示P<0.05(与Ctrl组相比)，**表示P<0.05(与Ctrl组相比)，***表示P<0.05(与Ctrl组相比)。
图4为实施例4中原代小鼠角膜上皮细胞长期培养形态变化图。
图5为实施例5中原代兔角膜上皮细胞培养形态示意图。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
实施例1～5参照以下方法进行组合物的制备、细胞培养及分组：
一、本发明的组合物及其配制：
1、组合物中各组分(除有特别说明外，均购自Apexbio)的溶解：
Forskolin：25mg，溶解于1.520mL DMSO中，浓度为40mmol/L。
SB431542：10mg，溶解于1.300mL DMSO中，浓度为20mol/L。
DAPT(即DAPT(GSI-IX))：10mg，溶解于1.156mL DMSO中，浓度为20mol/L。
IWP-2：10mg，溶解于2.140mL DMSO中，浓度为10mol/L。
LDN-193189：5mg，溶解于12.300mL DMSO中，浓度为1mol/L。
Y27632：10mg，溶解于3.122mL DMSO中，浓度10mol/L。
配制时，如有不溶解，置于37℃水浴加热10分钟或者置于超声波浴中震荡一段时间。分装，储存于-20℃。用时取出加入培养基中稀释至所需浓度。
2、组合物的配制
本实施例所用的培养基为DermaLife Basal Medium，本发明的组合物在培养基中的终浓度为：
Forskolin：20μmol/L
SB431542：10μmol/L
DAPT：5μmol/L
IWP-2：0.5μmol/L
LDN-193189：0.1μmol/L
Y27632：10μmol/L
现配现用。
二、细胞培养及实验分组
实验对象：SPF级6～8周龄C57BL/6小鼠(实施例1～4)，雌雄不限；新西兰大白兔(实施例5)。
实验试剂：结晶紫染色液、Anti-Ki67抗体、SYBR Premix Ex Taq试剂盒等。
实验仪器：手术显微镜、TE-2000U荧光倒置相差显微镜、OLYMPUS CKX53倒置显微镜等。
细胞培养及分组：
1.分离眼球：颈椎脱臼法处死小鼠(空气栓塞法处死兔)，用镊子摘除眼球，装进含有2％PS(链霉素&青霉素)的1XPBS中。在原代细胞间内显微镜下修剪眼球表面的结膜，用1XPBS(含有2％PS)清洗三次，每次5分钟。
2.消化过夜：取适量DermaLife Basal Medium，添加DiapaseⅡ(终浓度为10mg/mL)。将眼球放入培养基中，置于4℃过夜。
3.分离角膜上皮：在原代细胞间内显微镜下用虹膜恢复器轻轻刮除角膜上皮，将角膜上皮用1XPBS(含有2％PS)清洗三次，每次5分钟。
4.消化并计数：将角膜上皮放入胰酶中，37℃消化15分钟。离心，弃上清，用少量DermaLife Basal Medium重悬，计数。
5.设置分组：
A.Ctrl：对照组，只含培养基
B.Vehicle：溶剂组，培养基+DMSO
C.Y27632：实验组，培养基+Y27632
D.5C：实验组，培养基+5C(即20μmol/L Forskolin、10μmol/L SB431542、5μmol/LDAPT(GSI-IX)、0.5μmol/L IWP-2和0.1μmol/L LDN-193189五种组分，简称5C)
E.6C：实验组，培养基+6C(即20μmol/L Forskolin、10μmol/L SB431542、5μmol/LDAPT(GSI-IX)、0.5μmol/L IWP-2、0.1μmol/L LDN-193189和10μmol/L Y27632六种组分，简称6C)
共设置五组，按2500个/cm2细胞密度接种细胞，按以上分组方式进行培养。
实施例1：原代小鼠角膜上皮细胞的贴壁性
按上述方法进行原代小鼠角膜上皮细胞培养一周：①在镜下观察其贴壁情况，并拍照。②结晶紫染色观察细胞密度：去除培养基，用1XPBS漂洗细胞三次；加入4％多聚甲醛于室温固定15分钟；1XPBS漂洗细胞三次；加入0.05％结晶紫染液，室温染色30分钟；1XPB漂洗细胞三次，将培养皿晾干，拍照。
结果如图1A，在显微镜下可观察到，细胞培养一周，Ctrl组与Vehicle组贴壁细胞少，Y27632组(即图中Y组，下同)与5C组细胞贴壁性较好，6C组细胞贴壁性最好，而且用6C处理的细胞其形态结构更加规则，细胞间连接更加紧密。图1B结晶紫染色结果也显示，6C组细胞数量最多。图1C为结晶紫染色结果的统计图，可以看出，6C组相对5C组和Y27632组，在促进细胞贴壁作用上具有显著性差异。
实施例2：原代小鼠角膜上皮细胞的增殖性
Ki67免疫荧光染色法检测原代小鼠角膜上皮细胞增殖性：细胞按上述方法培养一周后，去除培养基，1XPBS漂洗细胞三次；加入4％多聚甲醛于室温固定15分钟；1XPBS漂洗三次，每次5分钟；0.2％的Triton×-100透膜，室温孵育20分钟；1×PBS漂洗三次，每次5分钟；加入2％牛血清白蛋白(BSA)封闭液，室温孵育1小时；用含有1％BSA的抗体稀释液稀释Ki67抗体，吸去封闭液，立即加入稀释好的一抗，4℃过夜；1×PBS漂洗三次，每次10分钟；加入二抗，室温，避光孵育2小时；1×PBS漂洗三次，每次10分钟；用DAPI封片。用荧光显微镜拍照。
结果如图2A，被Ki67染色的细胞核呈绿色，表明细胞具有增殖性，可以看出，用6C处理的细胞，其增殖性很强。图2B为Ki67免疫荧光染色结果的统计图，可以看出，6C组相对5C组和Y27632组，在促进细胞增殖作用上具有显著性差异。
实施例3：原代小鼠角膜上皮细胞的细胞功能与分化情况
原代小鼠角膜上皮细胞按上述方法培养一周后，按照TRIZOL法提取细胞RNA；逆转录；使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行qRT-PCR检测，检测与小鼠角膜上皮细胞功能相关的基因以及与上皮-间充质细胞转化相关的基因表达情况。
原代小鼠角膜上皮细胞在体外培养时，由于上皮-间充质细胞转化等多种因素，细胞难以长期维持原有的形态和功能。而正常体内细胞不会发生此种改变。结果如图3A，qRT-PCR结果显示，无任何添加剂的Ctrl组及单纯溶剂的vehicle组，体外培养效果很差，其干细胞标志物表达较低，分化标注物、上皮-间充质细胞转化标志物表达较高，提示Ctrl组及vehicle组的细胞已失去正常细胞的形态和功能。用6C处理的细胞其干细胞标志物P63，K14表达更多，分化标志物K12表达较少，而且6C组几乎不表达上皮-间充质细胞转化标志物ZEB1，ZEB2，α-SMA，β-CATENIN(图3B)，6C组的P63、K14、K12、ZEB1、ZEB2、α-SMA的表达与Ctrl组均有显著性差异，说明6C组的细胞干性更强，具有更强的增殖性和分化潜能，且6C能够很好地抑制原代小鼠角膜上皮细胞在体外培养时发生的转化，使其更接近体内正常角膜上皮细胞的功能。
此外，Y27632组与5C组虽然也有一定的改善效果，但6C组的K14、K12、ZEB1、ZEB2、α-SMA、β-CATENIN的表达与Y27632组、5C组也具有显著性差异，提示6C组的细胞培养效果最佳，优于Y27632组与5C组。
结合上述分析可知，加6C培养的原代小鼠角膜上皮细胞其功能更接近小鼠体内角膜上皮细胞，且6C的效果优于Y27632组与5C组。
实施例4：原代小鼠角膜上皮细胞长期培养时的形态变化
按以上分组方式长期培养原代小鼠角膜上皮细胞，每隔两天换一次液，换液时，用1XPBS漂洗一次。在不同时间点用显微镜观察并拍照。
结果如图4，Ctrl组与Vehicle组在一开始贴壁性较差，增殖性弱，随着培养时间的延长，细胞逐渐死亡，脱落；Y27632组在前10天增殖性较弱，随后增殖性增强，但到了第60天时，增殖性减弱，而且细胞状态较差；5C组增殖速率较快，仅次于6C组，但是6C组细胞培养到第60天时，其细胞状态最好，优于5C组的细胞，细胞间连接紧密有规则，细胞体积无异常增大。
实施例5：本发明组合物的种属特异性
结果如图5，在显微镜下可观察到，兔角膜上皮细胞培养一周后，5个组细胞贴壁情况、生长速率与形态几乎没有区别，这表明6C对角膜上皮细胞的促进作用有种属特异性，其主要对小鼠角膜上皮细胞有效，对兔角膜上皮细胞无显著效果。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (9)

1.一种用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的组合物，其特征在于：包括Forskolin、SB431542、DAPT、IWP-2、LDN-193189和Y27632；所述Forskolin、SB431542、DAPT、IWP-2、LDN-193189、Y27632的摩尔比为18～22:9～11:4～6:0.4～0.6:0.05～0.15:9～11。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述Forskolin的浓度为18～22 μmol/L。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述SB431542的浓度为9～11 μmol/L。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述DAPT的浓度为4～6 μmol/L。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述IWP-2的浓度为0.4～0.6 μmol/L。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述LDN-193189的浓度为0.05～0.15 μmol/L。
7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述Y27632的浓度为9～11 μmol/L。
8.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物添加于培养基中，所述培养基为DermaLife Basal Medium。
9.一种权利要求1至8中任一项所述的组合物在制备原代小鼠角膜上皮细胞体外培养用添加剂中的用途。
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