WO2023085369A1

WO2023085369A1 - 角膜内皮細胞の凍結保存製剤およびその製造法

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Publication number: WO2023085369A1
Application number: PCT/JP2022/041960
Authority: WO
Inventors: 範子小泉; 直毅奥村; 靖史松岡
Original assignee: 学校法人同志社; アクチュアライズ株式会社
Priority date: 2021-11-11
Filing date: 2022-11-10
Publication date: 2023-05-19
Also published as: AU2022385051A1; CA3238227A1; JPWO2023085369A1

Abstract

本開示は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結保存する方法および角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の凍結製剤を提供する。本開示は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する方法であって、非凍結状態の該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結する工程であって、非凍結温度から凍結目標温度に温度を変更する際に、１分あたり１℃未満の速度で温度を低下させる段階を少なくとも１つ含む、凍結工程、および必要に応じて、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持する工程を含む、方法を提供する。

Description

角膜内皮細胞の凍結保存製剤およびその製造法

　本開示は、角膜内皮細胞の凍結保存製剤およびその製造法の技術ならびにそれを用いた治療などの応用技術に関する。

　角膜内皮細胞が障害されると角膜が混濁し、水疱性角膜症による重症の視力障害をきたす。水疱性角膜症に対する唯一の治療法は角膜移植であるが、ドナー不足や拒絶反応などの問題があり、新しい再生医学的治療の開発が望まれている。同志社大学では、ドナー角膜より分雛した角膜内皮細胞をＲｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ：Ｒｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で増殖させ、多くの患者にその細胞を注入することで角膜内皮を再生する治療法を確立した。しかしながら、細胞の品質を保ったまま保存できる時間は限られていることから、日本全国や世界に細胞を供給する上で大きな問題があった。一般に細胞は１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む保存液で凍結保存しうるが、再生医療の場合にはＤＭＳＯの細胞に対する毒性や眼に投与した際の刺激性の懸念があったため、ＤＭＳＯの濃度を低減化して凍結することが望まれていた。

　また、再生医療に使用される細胞凍結製剤はＤＭＳＯを少なくとも７％以上含んでおり、患者に投与する際には患者へのＤＭＳＯの毒性を懸念して生理食塩液で投与直前に希釈したり、点滴静注などの投与の際の投与速度を極めて遅くすることで高濃度のＤＭＳＯが患者に投与されることを回避している。

　角膜内皮細胞注入療法では、患者の眼の前房部に４００μＬ以下の少ない用量で高濃度の細胞懸濁液を投与する必要があることから、投与前に希釈することができず、ＤＭＳＯの濃度を低減化した、あるいは含まない細胞凍結保存製剤が必要であった。

　本発明者らは、凍結保存時の温度条件などを詳細に検討し、－１℃／分よりも遅い低速での温度降下により、ＤＭＳＯ濃度を低減化した（例えば、７％未満）、あるいはＤＭＳＯを含まない凍結保存液で角膜内皮細胞の生存率が高く保たれることを見出した。本発明者らは、さらに、最初に緩慢な速度で温度を低下させた後に、冷却速度を速めて凍結させた場合、細胞生存率が上昇することを見出した。したがって、本開示は、ＤＭＳＯ濃度を低減化した、あるいはＤＭＳＯを含まない凍結保存液での角膜内皮細胞の凍結方法および患者にそのまま投与可能な細胞凍結製剤の製造方法を提供する。

　本願発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
　角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する方法であって、
　非凍結状態の該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結する工程であって、非凍結温度から凍結目標温度に温度を変更する際に、１分あたり１℃未満の速度で温度を低下させる段階を少なくとも１つ含む、凍結工程、および
　必要に応じて、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持する工程
を含む、方法。
（項目２）
　角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持する工程を含む、上記項目に記載の方法。
（項目３）
　前記凍結状態で維持する工程は、凍結維持温度で維持することを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
　前記凍結維持温度が、約－８０℃～約－１０℃の範囲内の温度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
　前記凍結維持温度が、約－１９６℃～約－１０℃の範囲内の温度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
　前記凍結維持温度が、約－３０℃以下の温度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、非凍結温度から１分あたり約０．１℃～約０．９℃の速度で温度を低下される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、非凍結温度から１分あたり約０．２℃～約０．８℃の速度で温度を低下される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、非凍結温度から１分あたり約０．７℃以下の速度で温度を低下される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、非凍結温度から１分あたり約０．２℃～約０．７℃の速度で温度を低下される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
　前記非凍結温度が、約０℃～約４２℃の範囲内の温度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
　前記非凍結温度が、約０℃～約３７℃の範囲内の温度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
　前記非凍結温度が、約４℃～約２３℃の範囲内の温度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
　前記凍結工程は、約－２０℃±１０℃の少なくとも一部の温度範囲において、１分あたり１℃未満の速度で温度を低下させる段階を少なくとも１つ含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
　前記凍結工程は、約－２０℃±１０℃の温度範囲に一定時間以上維持する段階を少なくとも１つ含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、約７％未満のＤＭＳＯを含む保存液中で保存される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、約５％以下のＤＭＳＯを含む保存液中で保存される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、約２％以下のＤＭＳＯを含む保存液中で保存される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、ＤＭＳＯを含まない保存液中で保存される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
　前記凍結工程は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞がＲＯＣＫ阻害剤の存在下で凍結されていることを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
　前記凍結工程が、第１の目標温度まで第１の速度で温度を低下させること、および第１の目標温度から第２の目標温度まで第２の速度で温度を低下させることを含み、該第１の速度が、１分あたり１℃未満の速度であり、該第２の速度よりも遅い、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
　前記凍結工程が、前記第１の目標温度まで温度を低下させた後、前記第１の目標温度で維持することをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
　前記第１の目標温度が、約－２０℃～約－５℃の範囲内の温度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
　前記第１の目標温度が、約－１５℃～約－１０℃の範囲内の温度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
　前記第２の目標温度が、約－２０℃以下の温度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
　前記第２の目標温度が、約－１９６℃～約－８０℃の範囲内の温度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
　前記第１の速度が、１分あたり約０．５℃～約０．０５℃の速度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
　前記第１の速度が、１分あたり約０．３℃～約０．１℃の速度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
　前記第２の速度が、１分あたり約０．５～約５℃の速度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
　前記第２の速度が、１分あたり約１～約３℃の速度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
　角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の凍結製剤を生産する方法であって、
　非凍結状態の該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を必要に応じて薬学的に受容可能な成分と混合し、凍結して凍結製剤を生産する工程であって、非凍結温度から凍結目標温度に温度を変更する際に、１分あたり１℃未満の速度で温度を低下させる段階を少なくとも１つ含む、凍結工程、および
　必要に応じて、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の該凍結製剤を凍結状態で維持する工程
を含む、方法。
（項目３２）
　項目２～３０のいずれかまたは複数の項に記載の方法に記載される１または複数の特徴をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
　上記項目のいずれか一項に記載の方法によって製造される角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の凍結製剤。
（項目３４）
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を約１×１０^５～約３×１０^６個を含む、上記項目のいずれか一項に記載の凍結製剤。
（項目３５）
　前記凍結製剤の体積は、約５０μＬ～約６００μＬである、上記項目のいずれか一項に記載の凍結製剤。
（項目３６）
　前記凍結製剤は、１回あたり約５０μＬ～約３５０μＬ投与されることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の凍結製剤。
（項目３７）
　角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する装置であって、該装置は
　該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を収容する容器を収容する収容・保存部と、
　収容・保存部において収容された容器内の角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の温度を制御するように指令する温度制御部と
　該収容・保存部における温度を、該温度制御部の指令に基づいて温度調節し得る、温度調節部と
を含み、
　該温度制御部は、非凍結温度から凍結目標温度に温度を低下させる際に、１分あたり１℃未満の速度で温度を変更する段階を少なくとも１つ含むように温度制御するよう指令することができ、必要に応じて、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持するように指令することができる、装置。
（項目３８）
　装置において角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存することができるようにコンピュータに実装させる方法をコードするプログラムであって、該装置は該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を収容する容器を収容する収容・保存部と、収容・保存部において収容された容器内の角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の温度を制御するように指令する温度制御部と、該収容・保存部における温度を、該温度制御部の指令に基づいて温度調節し得る、温度調節部とを含み、
　該プログラムは、該温度制御部に対して、非凍結温度から凍結目標温度に温度を低下させる際に、１分あたり１℃未満の速度で温度を変更する段階を少なくとも１つ含むように温度制御させ、必要に応じて、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持させる、プログラム。
（項目３９）
　装置において角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存することができるようにコンピュータに実装させる方法をコードするプログラムを格納した記録媒体であって、該装置は該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を収容する容器を収容する収容・保存部と、収容・保存部において収容された容器内の角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の温度を制御するように指令する温度制御部と、該収容・保存部における温度を、該温度制御部の指令に基づいて温度調節し得る、温度調節部とを含み、
　該プログラムは、該温度制御部に対して、非凍結温度から凍結目標温度に温度を低下させる際に、１分あたり１℃未満の速度で温度を変更する段階を少なくとも１つ含むように温度制御させ、必要に応じて、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持させる、記録媒体。
（項目４０）
　７％未満のＤＭＳＯと角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを含む、凍結製剤。
（項目４１）
　７％未満のＤＭＳＯと角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを含む、解凍後眼に直接投与可能な凍結製剤。
（項目４２）
　７％未満のＤＭＳＯと角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを緩慢凍結状態で凍結された状態で含む、凍結製剤。
（項目４３）
　７％未満のＤＭＳＯと角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞と生理食塩水の成分とを凍結状態で含む凍結製剤。
（項目４４）
　７％未満のＤＭＳＯと角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞と培地成分とを凍結状態で含む凍結製剤。
（項目４５）
　７％未満のＤＭＳＯと角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを含む解凍後長期安定性凍結細胞製剤。
（項目４６）
　約５％以下のＤＭＳＯを含む、上記項目のいずれか一項に記載の凍結製剤。
（項目４７）
　約２％以下のＤＭＳＯを含む、上記項目のいずれか一項に記載の凍結製剤。
（項目４８）
　ＤＭＳＯを含まない、上記項目のいずれか一項に記載の凍結製剤。
（項目４９）
　ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の凍結製剤。
（項目５０）
　前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、上記項目のいずれか一項に記載の凍結製剤。
（項目５１）
　ＲＯＣＫ阻害剤と角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを凍結状態で含む凍結製剤。
（項目５２）
　ＲＯＣＫ阻害剤と角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞と生理食塩水の成分とを凍結状態で含む凍結製剤。
（項目５３）
　ＲＯＣＫ阻害剤と角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞と培地成分とを凍結状態で含む凍結製剤。
（項目５４）
　解凍後長期安定性凍結細胞製剤であって、該製剤は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とＲＯＣＫ阻害剤とを含む、製剤。
（項目５５）
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の生存率が、解凍後、室温で少なくとも６時間少なくとも８０％の生存率である、上記項目のいずれか一項に記載の製剤。
（項目５６）
　解凍後投与された角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の生着および生体内における生存が阻害されない凍結製剤であって、該製剤は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とＲＯＣＫ阻害剤とを緩慢凍結状態で凍結された状態で含む、凍結製剤。
（項目５７）
　７％未満のＤＭＳＯとＲＯＣＫ阻害剤と角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを緩慢凍結状態で凍結された状態で含む、凍結製剤。
（項目５８）
　前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、上記項目のいずれか一項に記載の製剤。
（項目５９）
　約７％未満のＤＭＳＯを含む、上記項目のいずれか一項に記載の製剤。
（項目６０）
　約５％以下のＤＭＳＯを含む、上記項目のいずれか一項に記載の製剤。
（項目６１）
　約２％以下のＤＭＳＯを含む、上記項目のいずれか一項に記載の製剤。
（項目６２）
　ＤＭＳＯを含まない、上記項目のいずれか一項に記載の製剤。
（項目６３）
前記製剤は、緩慢凍結状態で凍結された状態で前記細胞を含む、上記項目のいずれか一項に記載の製剤。
（項目６４）
　前記製剤が、非凍結温度から１分あたり１℃未満の速度で温度を低下させて凍結されたものである、上記項目のいずれか一項に記載の製剤。
（項目６５）
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、細胞注入療法に使用されることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の製剤。
（項目６６）
　前記凍結製剤が、解凍後、さらなる加工も培養もすることなく投与されることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の製剤。
（項目６７）
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を約１×１０^５～約３×１０^６個を含む、上記項目のいずれか一項に記載の製剤。
（項目６８）
　前記凍結製剤の体積は、約５０μＬ～約６００μＬである、項目４０～６７のいずれか一項に記載の製剤。
（項目６９）
　前記製剤は、１回あたり約５０μＬ～約３５０μＬ投与されることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の製剤。
（項目７０）
　角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを凍結状態で含む凍結製剤を収容する容器と、該容器を凍結状態を維持しつつ収容する収容器とを含む、凍結製剤キット。
（項目７１）
　前記凍結製剤は、上記項目のいずれか一項に記載の製剤である、項目７０に記載の凍結製剤キット。
（項目７２）
　上記項目のいずれか一項に記載の製剤と、該製剤を収容する容器と、該製剤を凍結状態で維持しつつ該容器を収容する収容器とを含む、凍結製剤キット。
（項目７３）
　容器と、該容器を収容する収容器とを含む、凍結製剤キットであって、
　該容器は、上記項目のいずれか一項に記載の製剤を収容するように用いられ、該収容器は、該製剤を凍結状態で維持するように用いられる、キット。
（項目７４）
　ＲＯＣＫ阻害剤と角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを凍結状態で含む凍結製剤を収容する容器と、該容器を凍結状態を維持しつつ収容する収容器とを含む、凍結製剤キット。
（項目７５）
　容器と該容器を収容する収容器とを含むキットの使用であって、
　該容器は、上記項目のいずれか一項に記載の製剤を収容するように用いられ、該収容器は、該製剤を凍結状態で維持するように用いられる、使用。
（項目７６）
　上記項目のいずれか一項に記載の製剤の運搬および／または保存方法であって、
　該製剤を、容器と該容器を収容する収容器とを含むキットの容器中に配置する工程と、
　該キット中の製剤を凍結状態で維持する工程と、
を含む方法。
（項目７７）
　角膜内皮細胞注入療法を行う方法であって、
　該細胞注入療法に適切な角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を提供する工程、
　該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を、非凍結温度から１分あたり１℃未満の速度で温度を低下する段階を少なくとも一つ含む、凍結工程、
　該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持し、必要に応じて該注入療法へと運搬する工程、
　該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を解凍する工程、ならびに
　該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を被験体に投与する工程
を含む、方法。
（項目１Ａ）
　角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する方法であって、該方法が、
　非凍結状態の該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結する工程であって、第１の目標温度まで第１の速度で温度を低下させること、および第１の目標温度から第２の目標温度まで第２の速度で温度を低下させることを含む、凍結工程、および
　必要に応じて、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持する工程
を含み、該第１の速度が、１分あたり１℃未満の速度であり、該第２の速度よりも遅い、方法。
（項目２Ａ）
　前記凍結工程が、前記第１の目標温度まで温度を低下させた後、前記第１の目標温度で維持することをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３Ａ）
　前記第１の目標温度が、約－２０℃～約－５℃の範囲内の温度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４Ａ）
　前記第１の目標温度が、約－１５℃～約－１０℃の範囲内の温度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５Ａ）
　前記第２の目標温度が、約－２０℃以下の温度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６Ａ）
　前記第２の目標温度が、約－１９６℃～約－８０℃の範囲内の温度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７Ａ）
　前記第１の速度が、１分あたり約０．５℃～約０．０５℃の速度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８Ａ）
　前記第１の速度が、１分あたり約０．３℃～約０．１℃の速度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９Ａ）
　前記第２の速度が、１分あたり約０．５～約５℃の速度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０Ａ）
　前記第２の速度が、１分あたり約１～約３℃の速度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。

　本開示において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。

　本開示により、融解後にそのまま眼に投与可能な角膜細胞凍結製剤を提供される。本発明により、角膜内皮細胞を日本全国および海外にも提供することができる。

図１は、実施例１の概要を示す。図２は、実施例１で使用する細胞の培養形態の写真を示す。図３は、４％ヒト血清アルブミンと１０％グリセリンをベース成分とした時のＤＭＳＯ濃度を変えた凍結保存液で保存し、融解後の細胞の生存率を比較したグラフを示す。図４は、４％ヒト血清アルブミンと１０％ポリエチレングリコールをベース成分とした時のＤＭＳＯ濃度を変えた凍結保存液で保存し、融解後の細胞の生存率を比較したグラフを示す。図５は、２３℃から－１℃／分、－０．７℃／分または－０．５℃／分の冷却速度で凍結した細胞の融解後の生存率を比較したデータを示す。エラーバーは平均±ＳＤを示す。統計学的有意差はＤｕｎｎｅｔｔ－ｔ検定（ｖｓ未凍結）に基づく（ｎ＝３，＊＊ｐ＜０．０５）。図６は、４℃から－１℃／分または－０．５℃／分の冷却速度で凍結して保存し、保存後播種７日目の細胞密度を比較したデータを示す。図７は、実施例２の概要を示す。図８は、ＤＭＳＯを１０％もしくは５％添加した培地で培養した細胞の位相差顕微鏡像を示す。図９は、ＤＭＳＯ　２％を含む、またはＤＭＳＯを含まない培地で培養した細胞の位相差顕微鏡像を示す。図１０は、再播種後の細胞を回収し、生存率を調べた結果を示すグラフである。各群の左から、ＤＭＳＯ１０％、５％、２％および０％を示す。図１１は、実施例３の概要を示す。図１２は、ＤＭＳＯを１０％含むＣｒｙｏｓｔｏｒ　ＣＳ１０中で凍結した細胞を０時間、３０分、１時間、３時間、６時間、または２４時間室温で放置した後、Ｔ２５培養フラスコに再播種し、２４時間後に細胞の培養状態を撮影した位相差顕微鏡像を示す。図１３は、ＤＭＳＯを５％含むＣｒｙｏｓｔｏｒ　ＣＳ５中で凍結した細胞を０時間、３０分、１時間、３時間、６時間、または２４時間室温で放置した後、Ｔ２５培養フラスコに再播種し、２４時間後に細胞の培養状態を撮影した位相差顕微鏡像を示す。図１４は、ＤＭＳＯを２％含むＣｒｙｏｓｔｏｒ　ＣＳ２中で凍結した細胞を０時間、３０分、１時間、３時間、６時間、または２４時間室温で放置した後、Ｔ２５培養フラスコに再播種し、２４時間後に細胞の培養状態を撮影した位相差顕微鏡像を示す。図１５は、再播種後の細胞を回収し、生存率を調べた結果を示すグラフを示す。各群の左から、ＣＳ１０、ＣＳ５、およびＣＳ２を示す。図１６は、保冷ボックスで５日間保存した細胞を融解した時の生存率と細胞回収率を示す。エラーバーは平均±ＳＤを示す。統計学的有意差はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　Ｔ検定に基づく（ｎ＝３）。図１７は、保冷ボックスで保存した後、２日間培養した細胞の顕微鏡写真を示す。図１８は、保冷ボックスでの保存後の細胞を注入したウサギの眼の写真を示す。図１９は、細胞注入後１日目の角膜内皮のＣＤ１６６の免疫組織染色の写真を示す。図２０は、細胞注入後１日目のＺＯ－１およびＮａ／Ｋ　ＡＴＰａｓｅの免疫組織染色の写真を示す。図２１は、細胞注入後５日目の角膜内皮のＣＤ１６６、ＺＯ－１およびＮａ／Ｋ　ＡＴＰａｓｅの免疫組織染色の写真を示す。図２２は、実施例６の既知成分の凍結保存液における凍結保存の概要を示す。図２３は、４％ヒト血清アルブミンと１０％グリセリンをベース成分とした時のＤＭＳＯ濃度を変えた凍結保存液で－１℃／分、－０．７℃／分、－０．５℃／分、または－０．２℃の冷却速度で凍結し、融解後の細胞の生存率を比較したグラフを示す。図２４は、実施例６の市販の凍結保存液における凍結保存の概要を示す。図２５は、市販の凍結保存液において、４℃から－０．７℃／分の冷却速度で凍結した細胞の融解後の生存率および回収率を示す。図２６は、市販の凍結保存液において、４℃から－１℃／分または－０．７℃／分の冷却速度で凍結した細胞の融解後の生存率を比較したデータを示す。図２７は、市販の凍結保存液において、４℃から－０．５℃／分または－０．２℃／分の冷却速度で凍結した細胞の融解後の生存率を比較したデータを示す。図２８は、実施例７において保存した細胞の細胞生存率を示す。図２９は、－０．５℃／ｍｉｎで－８０℃まで冷却した場合の温度の推移を示す。図３０は、－０．５℃／ｍｉｎで－１０℃まで冷却し、１１０分－１０℃で維持し、その後－１．０℃／ｍｉｎで－８０℃まで冷却した場合の温度の推移を示す。図３１は、－０．１℃／ｍｉｎで－１０℃まで冷却し、その後－１．０℃／ｍｉｎで－８０℃まで冷却した場合の温度の推移を示す。

　以下、本開示を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。本明細書において、「約」とは、後に続く値の±１０％を意味する。組成を表す「％」は、特に指示しない限り、ＤＭＳＯおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を指す場合はｗ／ｗ％、グリセリンおよびポリエチレングリコールを指す場合はｖ／ｖ％を意味する。

　（定義）
　本明細書において、「角膜内皮細胞」とは当該分野で用いられる通常の意味で用いられる。角膜とは、眼を構成する層状の組織の一つであり透明であり、最も外界に近い部分に位置する。角膜は、ヒトでは外側（体表面）から順に５層でできているとされ、外側から角膜上皮、ボーマン膜、固有層、デスメ膜（角膜内皮基底膜）、および角膜内皮で構成される。特に、特定しない限り、上皮および内皮以外の部分は「角膜実質」とまとめて称することがあり、本明細書でもそのように称する。本明細書において「ＨＣＥＣ」（ｈｕｍａｎ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ）とは、ヒト角膜内皮細胞の略称である。

　本明細書において、「角膜内皮様細胞」とは、幹細胞から分化した細胞、例えばｉＰＳ細胞等から分化した細胞であって、角膜内皮細胞と実質的な同一の機能を有する細胞を指す。幹細胞、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等から角膜内皮様細胞へと分化させる方法は、当該分野で周知である（ＭｃＣａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．　２０１５　Ｄｅｃ　２１；１０（１２）：ｅ０１４５２６６；　Ａｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ．　２０１８　Ｍａｙ　１；５９（６）：２４３７－２４４４）。典型的な例において、簡潔には、細胞解離バッファー（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、０日目に１：１２希釈でｉＰＳ細胞を３５ｍｍマトリゲルコーティングプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種する（８０％コンフルエントプレートを１２個のプレートに分ける）。ｉＰＳ細胞を４日間培地（ｍＴｅＳＲ１；ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）中で増殖させる。４日目に、ｍＴｅＳＲ１培地を、８０％ＤＭＥＭ－Ｆ１２（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０％ＫＳＲ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｍＭ　Ｌ－グルタミン（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｉｎｃ．）、０．１ｍＭ　β－メルカプトエタノール（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）、および８ｎｇ／ｍＬ　βＦＧＦ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）の基本培地中に、５００ｎｇ／ｍＬヒト組換えＮｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）および１０μＭのＳＢ４３１５４２（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を含むＳｍａｄ阻害剤培地で置換する。６日目に、Ｓｍａｄ阻害剤培地を、８０％ＤＭＥＭ－Ｆ１２（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０％ＫＳＲ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｍＭ　Ｌ－グルタミン（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｉｎｃ．）、０．１ｍＭ　β－メルカプトエタノール（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）、および８ｎｇ／ｍＬ　βＦＧＦ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）の基本培地中に、０．１×　Ｂ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｎｇ／ｍＬ組換えヒト血小板由来増殖因子－ＢＢ（ＰＤＧＦ－ＢＢ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ　Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）および１０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＤｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質－２（ＤＫＫ－２；Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む角膜培地で置換する。７日目に、分化中のＣＥＣを、新しいマトリゲールコーティングプレート（３５ｍｍ）に移し、さらに１３日間角膜培地中で増殖させる。分化したＣＥＣを２０日目に回収する。上記例は典型的な例であって、当業者は、当該分野で周知の他の方法（Ｆｕｋｕｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．　２０１４　Ｄｅｃ　２；９（１２）：ｅ１１２２９１；　Ｈａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ．　２０１６　Ｍａｒ　１７；５３１（７５９４）：３７６－８０）も使用し得る。また、当業者であれば、当該分野で周知の方法の条件を適宜調節して、角膜内皮様細胞を作製することができる。

　「角膜内皮細胞」および「角膜内皮様細胞」は、磁性体（例えば、鉄）を含んでいてもよい。例えば、磁性物質を含む角膜内皮細胞を前房内に注入した場合、磁力により角膜の内側（例えば、デスメ膜）に引き付け接着を促すことが可能である（Ｐａｔｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ．　２００９　Ｍａｙ；５０（５）：２１２３－３１；Ｍｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ．　２００３　Ｊｕｎ；７６（６）：７４５－５１；およびＭｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ．　２００５　Ｆｅｂ；８０（２）：１４９－５７）。「磁性体」とは、磁場により磁化される物質を指し、例えば、鉄、コバルト、ニッケル、フェライトなどが挙げられる。

　本明細書において、細胞の「保存」とは、任意の目的（例えば、細胞注入療法、またはそのための輸送）のために容器中に一定期間保管することを意味し、細胞を増殖させることなく、細胞の機能を維持しつつ容器中に維持することを指す。保存は、細胞を増殖させることを目的とする「培養」とは異なる。また、保存は、投与直前に細胞をシリンジ等の容器に移し入れることも、投与前に用時調製するために容器内に一時的に保持することも意味しない。「凍結保存」は、凍結状態で保存することを意味する。

　本明細書において、「非凍結温度」とは、その温度で維持しても凍結が生じない温度を指し、「凍結目標温度」とは、本開示の方法の凍結工程における角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結させる際の目標となる温度を指す。「凍結維持温度」とは、凍結した角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を一定期間凍結状態で維持するための温度を指す。凍結維持温度は、目的となる細胞等の対象が凍結状態を維持することができれば、変動しても良い。

　本明細書において、「緩慢凍結状態」とは、１分あたり１℃未満の速度で温度を低下させる段階を少なくとも１つ含む凍結工程により凍結された状態を指す。

　本明細書において、「解凍後長期安定性」とは、凍結された細胞を解凍後室温で維持した場合、少なくとも６時間細胞少なくとも８０％の生存率を維持することを指す。

　本明細書において、「凍結製剤」とは、凍結状態で保存される製剤であって、解凍後、使用に適した形態、または用時調製の形態の製剤を指す。「用時調製」とは、投与する直前に、薬剤を追加することにより、または溶媒で希釈することによって使用に適した製剤を調製することをいう。

　本明細書において、「加工」とは、細胞または細胞集団についていうとき、その特定の操作によって、その細胞または細胞集団の何らかの状態または性質が変化することをいい、好ましくは細胞集団の性質を変化させる、薬剤追加、薬剤処理、または特定細胞の単離などの操作、あるいは細胞密度を変更する、溶媒による希釈または濃縮などの操作を意味する。

　本明細書において、「一定温度」とは、設定温度の±１℃の範囲にあることを指す。

　本明細書において、「角膜内皮の症状、障害または疾患」とは、角膜内皮において生じる任意の症状、障害または疾患をいう。例えば、角膜内皮の症状、障害または疾患としては、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術後の障害、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ（ＰＰＤ：ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｕｓ　ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ（ＣＨＥＤ：ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、および特発性角膜内皮障害等が挙げられるがそれらに限定されない。

　本明細書において「被験体」とは、本開示の製剤の投与対象を指し、被験体としては、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等)があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。

　本明細書において、「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、抗体、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。あるいは、溶液状態では不安定な化合物を提供する際、使用直前に凍結乾燥した粉末を適切な溶媒で溶解して用時調製する必要がある場合に、キットの形態が好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬）をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。

　本明細書において「プログラム」は、当該分野で使用される通常の意味で用いられ、コンピュータが行うべき処理を順序立てて記述したものであり、日本国では特許法上「物」として扱われるものである。すべてのコンピュータはプログラムに従って動作している。現代のコンピュータではプログラムは広義のデータとして表現され、記録媒体または記憶装置に格納される。

　本明細書において「記録媒体」は、本開示の方法を実行させるプログラムを格納した記録媒体であり、記録媒体は、プログラムを記録できる限り、どのようなものであってもよい。例えば、内部に格納され得るＲＯＭやＨＤＤ、磁気ディスク、ＵＳＢメモリ等のフラッシュメモリなどの外部記憶装置でありうるがこれらに限定されない。

　本明細書において「システム」とは、本開示の方法またはプログラムを実行する構成をいい、本来的には、目的を遂行するための体系や組織を意味し、複数の要素が体系的に構成され、相互に影響するものであり、コンピュータの分野では、ハードウェア、ソフトウェア、ＯＳ、ネットワークなどの、全体の構成をいう。

　本明細書において「機械学習」とは、明示的にプログラミングすることなく、コンピュータに学ぶ能力を与える技術をいう。機能単位が新しい知識・技能を獲得すること、又は既存の知識・技能を再構成することによって、自身の性能を向上させる過程である。経験から学ぶように計算機をプログラミングすることで、細部をプログラミングするのに必要になる手間の多くは減らせ、機械学習分野では、経験から自動的に改善を図れるようなコンピュータプログラムを構築する方法について議論している。データ分析・機械学習の役割としては、アルゴリズム分野と並んで知的処理の基盤になる要素技術であり、通常他の技術と連携して利用され、連携する分野の知識（ドメインスペシフィック（領域特有）知識；例えば、医学分野）が必要である。その応用範囲としては、予測（データを集め、これから起こることを予測する）、探索（集めたデータの中から、何か目立つ特徴を見つける）、検定・記述（データの中のいろいろな要素の関係を調べる）などの役割がある。機械学習は、実世界の目標の達成度を示す指標に基づくものであり、機械学習の利用者が、実世界での目標を把握していなければならない。そして、目的が達成されたときに、良くなるような指標を定式化する必要がある。機械学習は逆問題で、解が解けたかどうかが不明確な不良設定問題である。学習したルールの挙動は確定的ではなく確率（蓋然）的である。何らかの制御できない部分が残ることを前提とした運用上の工夫が必要であり、本発明のテイラーメイド法はこの解決手段ともいいうるものである。訓練時と運用時の性能指標をみながら、機械学習の利用者が、データや情報を実世界の目標に合わせて逐次的に取捨選択することも有用である。

　機械学習としては、線形回帰、ロジスティック回帰、サポートベクターマシンなどが用いられ得、および交差検証（交差検定、交差確認ともいう。Ｃｒｏｓｓ　Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ；ＣＶ）を行うことで、各モデルの判別精度を算出することができる。ランキングした後、１つずつ特徴量を増やして機械学習（線形回帰、ロジスティック回帰、サポートベクターマシンなど）と交差検証を行い、各モデルの判別精度を算出することができる。それにより、最も高い精度のモデルを選択することができる。本発明において、機械学習は、任意のものを使用することができ、教師付き機械学習として、線形、ロジスティック、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）などを利用することができる。

　（好ましい実施形態）
　以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本開示の例示であり、本開示の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本開示の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。

　（保存方法）
　角膜内皮細胞に凍結保存において、凍結時の損傷を抑えるＤＭＳＯを１０％含む保存液で凍結することにより、角膜内皮細胞を高い生存率を維持しながら保存し得る。しかしながら、ＤＭＳＯの細胞に対する毒性や眼に投与した際の刺激性の懸念があったため、本発明者らは、ＤＭＳＯを低減した保存液で、高い生存率を維持できる保存条件を検討したところ、－１℃／分よりも遅い低速での温度降下により、ＤＭＳＯ濃度を低減化した（例えば、７％未満）、あるいはＤＭＳＯを含まない凍結保存液で角膜内皮細胞の生存率が高く保たれることを見出した。

　冷却速度が遅すぎる場合には、細胞外の水分が先に凍結することで、細胞外の水分が除去され、細胞内から水分が流出する。細胞内の溶質濃度の上昇により細胞の生存に有害な影響を与える。冷却速度が速すぎる場合は、細胞内からの水分の流出は抑えられるが、細胞内に表結晶による損傷が生じ、生存に有害な影響を与える。細胞の凍結保存における冷却速度は、細胞損傷に大きな影響を与える。最適な冷却速度によりその影響を最小限に抑えることが可能であり、－１℃／分の冷却速度が推奨されている。角膜内皮細胞において、－１℃／分よりも遅い低速での温度降下により、ＤＭＳＯ濃度を低減化した（例えば、７％未満）、あるいはＤＭＳＯを含まない凍結保存液で角膜内皮細胞の生存率が高く保たれたことは予想外であった。

　一態様において、本開示は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する方法であって、非凍結状態の該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結する工程であって、非凍結温度から凍結目標温度に温度を変更する際に、１分あたり１℃未満の速度で（－１℃／分よりも遅い冷却速度で）温度を低下させる段階を少なくとも１つ含む、凍結工程を含む方法を提供し得る。

　一態様において、本開示は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の凍結製剤を生産する方法であって、非凍結状態の該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を必要に応じて薬学的に受容可能な成分と混合し、凍結して凍結製剤を生産する工程であって、非凍結温度から凍結目標温度に温度を変更する際に、１分あたり１℃未満の速度で温度を低下させる段階を少なくとも１つ含む、凍結工程を含む方法を提供し得る。

　一部の実施形態において、－１℃／分よりも遅い冷却速度は、１分あたり約０．１℃～約０．９℃、好ましくは１分あたり約０．２℃～約０．８℃、より好ましくは１分あたり約０．２℃～約０．７℃の範囲内の温度であり得る。特定の実施形態において、－１℃／分よりも遅い冷却速度は、－０．９℃／分、－０．８℃／分、－０．７℃／分、－０．６℃／分、－０．５℃／分、－０．４℃／分、－０．３℃／分、－０．２℃／分、または－０．１℃／分であり得る。

　一実施形態において、凍結目標温度（例えば、－８０℃）までの冷却速度は一定であってもよく、一定でなくてもよい。一部の実施形態において、本開示の方法は、特定の温度域で、－１℃／分よりも遅い冷却速度で温度を低下させる段階を少なくとも含み、凍結目標温度までに温度を低下させる過程において、温度を上昇する段階を含んでもよく、－１℃／分よりも速い冷却速度で温度を低下させる段階を含んでもよく、一定温度で維持する段階を含んでもよい。

　凍結目標温度は、適宜設定され、例えば、約－２０℃～－１９６℃の範囲内の温度であり得、例えば、約－２０℃、約－３０℃、約－４０℃、約－５０℃、約－６０℃、約－７０℃、約－８０℃、約－９０℃、約－１００℃、約－１５０℃、約－１９０℃、または約－１９６℃であり得る。

　一実施形態において、本開示の方法は、特定の温度域において、－１℃／分よりも遅い平均冷却速度で温度が低下していれば、温度を上昇する段階を含んでもよく、－１℃／分よりも速い冷却速度で温度を低下させる段階を含んでもよく、一定温度で維持する段階を含んでもよい。

　一実施形態において、本開示の方法は、特定の温度域において、－１℃／分より早い速度で温度を低下させた後、一定温度で維持して、再び、－１℃／分より早い速度で温度を低下させることで（これを繰り返してもよい）、－１℃／分よりも遅い平均冷却速度を達成してもよい。

　一実施形態において、本開示の方法は、特定の温度域において、－１℃／分より早い速度で温度を低下させた後、温度を上昇させ、次いで一定温度で維持して、再び、－１℃／分より早い速度で温度を低下させることで（これを繰り返してもよい）、－１℃／分よりも遅い平均冷却速度を達成してもよい。

　一実施形態において、本開示の方法は、特定の温度域において、－１℃／分より早い速度で温度を低下させた後、温度を上昇させ、再び、－１℃／分より早い速度で温度を低下させることで（これを繰り返してもよい）、－１℃／分よりも遅い平均冷却速度を達成してもよい。

　一実施形態において、－１℃／分よりも遅い冷却速度で温度を低下させる特定の温度域は、少なくとも非凍結状態から凍結状態へと移行する温度を少なくとも含む温度範囲であり得る。特定の実施形態において、上記温度域は、約－８０℃～約０℃、約－７０℃～約０℃、約－６０℃～約０℃、約－５０℃～約０℃、約－４０℃～約０℃、約－３０℃～約０℃、約－２０℃～約０℃、約－１０℃～約０℃、約－８０℃～約－１０℃、約－７０℃～約－１０℃、約－６０℃～約－１０℃、約－５０℃～約－１０℃、約－４０℃～約－１０℃、約－３０℃～約－１０℃、または約－２０℃～約－１０℃であり得る。

　一実施形態において、本開示の方法は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持する工程をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、凍結維持温度は、約－１９６℃～約－４℃、約－１９６℃～約－１０℃、約－１９６℃～約－２０℃、約－１９６℃～約－３０℃、約－１９６℃～約－４０℃、約－１９６℃～約－５０℃、約－１９６℃～約－６０℃、約－１９６℃～約－７０℃、約－１９６℃～約－８０℃、約－８０℃～約－４℃、約－８０℃～約－１０℃、約－８０℃～約－２０℃、約－８０℃～約－３０℃、約－８０℃～約－４０℃、約－８０℃～約－５０℃、約－８０℃～約－６０℃、または約－８０℃～約－７０℃の範囲内の温度であり得る。好ましい実施形態において、凍結維持温度は、約－８０℃で維持することを含み得る。

　いくつかの実施形態において、本開示の方法の凍結工程は、約０℃～約４２℃、約０℃～約３７℃、約４℃～約２３℃、約４℃～約１０℃の範囲内の非凍結温度から開始し得る。好ましい実施形態において、特にＤＭＳＯの存在下で凍結する場合は、凍結する工程は、４℃の非凍結温度から開始し得る。特定の実施形態において、本開示の方法は、凍結工程の前に、上記非凍結温度で角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞をインキュベートする工程をさらに含んでもよい。

　一実施形態において、本開示の方法の凍結工程は、約－２０℃±１０℃の少なくとも一部の温度範囲または全範囲において、１分あたり１℃未満の速度で温度を低下させる、または一定温度で一定時間維持する段階を少なくとも１つ含み得る。一実施形態において、本開示の方法の凍結工程は、約－２０℃±１０℃の温度範囲に一定時間以上、例えば、２０分以上、３０分以上、４０分以上、５０分以上、１時間以上、１時間３０分以上、または２時間以上連続して維持する段階を少なくとも１つ含み得る。上記温度範囲は、－２０℃±５℃であってもよい。凍結工程において、不均一で整列されていない状態で氷結晶が形成されると細胞へのダメージが大きくなり、生存率が低下し得る。理論に束縛されることを望まないが、凍結工程において、氷結晶と保存液中の溶質（例えば、ＮａＣｌ）の共晶点付近（例えば、－２０℃±１０℃）で緩慢に温度を低下させる、または共晶点付近で一定時間温度を維持することで、結晶が均一に整列し、細胞へのダメージが軽減され得る。

　－２０℃±１０℃の温度範囲において、１分あたり１℃未満の速度で温度を低下させる、または一定温度で一定時間維持する段階を少なくとも含んでいれば、－２０℃±１０℃の温度の温度範囲外は、どのような速度で温度を変化させてもよい。

　さらなる態様において、本開示は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する方法であって、非凍結状態の該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結する工程であって、約－２０℃±１０℃の温度範囲に一定時間以上維持する段階を少なくとも１つ含む、凍結工程、および要に応じて、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持する工程を含む、方法を提供する。－２０℃±１０℃の温度の温度範囲外は、どのような速度で温度を変化させてもよい。

　一部の実施形態においては、－３０℃より温度を下げてから、温度を上昇させて、共晶点付近（－２０℃±１０℃）の温度範囲で、緩慢に温度を低下させる、または一定時間温度を維持してもよい。当業者は、本明細書の開示に鑑み、本開示の効果を奏する限り、－３０℃より低い温度で維持する時間について適宜調整することができるが、例えば、２時間以下、１時間以下、３０分以下、または２０分以下であり得る。

　一実施形態において、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、約７％未満、約５％以下、または約２％以下のＤＭＳＯを含む保存液中で保存され得る。保存液中に含まれるＤＭＳＯは、細胞に悪影響を与え得るため、約５％以下であることが好ましく、より好ましくは、約２％以下であり、最も好ましくは保存液中にＤＭＳＯは含まれない。特定の実施形態において、保存液中に含まれるＤＭＳＯは約５％であり得る。特定の実施形態において、保存液中に含まれるＤＭＳＯは約２％であり得る。

　一実施形態において、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞は、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で凍結され得る。

　ＲＯＣＫ阻害剤としては、下記文献：米国特許４６７８７８３号、特許第３４２１２１７号、国際公開第９５／２８３８７、国際公開９９／２０６２０、国際公開９９／６１４０３、国際公開０２／０７６９７６、国際公開０２／０７６９７７、国際公開第２００２／０８３１７５、国際公開０２／１００８３３、国際公開０３／０５９９１３、国際公開０３／０６２２２７、国際公開２００４／００９５５５、国際公開２００４／０２２５４１、国際公開２００４／１０８７２４、国際公開２００５／００３１０１、国際公開２００５／０３９５６４、国際公開２００５／０３４８６６、国際公開２００５／０３７１９７、国際公開２００５／０３７１９８、国際公開２００５／０３５５０１、国際公開２００５／０３５５０３、国際公開２００５／０３５５０６、国際公開２００５／０８０３９４、国際公開２００５／１０３０５０、国際公開２００６／０５７２７０、国際公開２００７／０２６６６４、国際公開２０１４／１１３６２０、国際公開２０１９／０８９８６８、国際公開２０１４／０５５９９６、国際公開２０１９／０１４３００、国際公開２０１９／０１４３０４、国際公開２０１８／１３８２９３、国際公開２０１８／１１５３８３、国際公開２０１８／１１８１０９、国際公開２０１８／１０２３２５、国際公開２０１８／００９６２２、国際公開２０１８／００９６２５、国際公開２０１８／００９６２７、国際公開２０１７／２０５７０９、国際公開２０１７／１２３８６０、国際公開２０１６／１１２２３６、国際公開２０１６／０２８９７１、国際公開２０１５／１６５３４１、国際公開２０１５／０５４３１７、国際公開２０１５／００２９２６、国際公開２０１５／００２９１５、国際公開２０１４／０６８０３５、国際公開２０１４／０５５９９６、国際公開２０１３／０３０３６６、国際公開２０１２／１４６７２４、国際公開２０１１／１０７６０８、国際公開２０１０／１０４８５１、国際公開２００８／０７７５５０、国際公開２００８／０３６５４０、国際公開２００５／０９７７９０などに開示された化合物があげられる。かかる化合物は、それぞれ開示された文献に記載の方法により製造することができる。具体例として、１－（５－イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンまたはその塩（たとえば、ファスジル（１－（５－イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン））、（＋）－トランス－４－（１－アミノエチル）－１－（４－ピリジルカルバモイル）シクロヘキサン（（Ｒ）－（＋）－トランス－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド）またはその塩（たとえば、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－トランス－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）など）などがあげられ、これらの化合物は、市販品（富士フイルム和光純薬株式会社、旭化成ファーマ等）を好適に用いることもできる。

　いくつかの実施形態において、使用され得るＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ－２７６３２（（＋）－トランス－４－（１－アミノエチル）－１－（４－ピリジルカルバモイル）シクロヘキサン）、リパスジル（４－フルオロ－５－｛［（２Ｓ）－２－メチル－１，４－ジアゼパン－１－イル］スルホニル｝イソキノリン）、ファスジル（１－（５－イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン）、ベロスジル（Ｎ－（１，２－ジヒドロ－１－オキソ－６－イソキノリニル）－α－（ジメチルアミノ）－３－チオフェンアセトアミド）、ベルモスジル（２－［３－［４－［（１Ｈ－インダゾール－５－イル）アミノ］キナゾリン－２－イル］フェノキシ］－Ｎ－イソプロピルアセタミド）およびその薬学的に許容される塩が挙げられる。ベルモスジルの構造は、以下のとおりである。

　いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤は、リパスジル、Ｙ－２７６３２、ファスジル、ネタルスジル、ベロスジル、ベルモスジルまたはその薬学的に許容される塩であり、より好ましくは、リパスジル、Ｙ－２７６３２またはその薬学的に許容される塩であり得る。

　（製剤）
　別の態様において、本開示は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する上記方法、または角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の凍結製剤を生産する上記方法によって製造される角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の凍結製剤を提供し得る。

　一態様において、本開示は、７％未満のＤＭＳＯと角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを含む、凍結製剤を提供し得る。

　一態様において、本開示は、７％未満のＤＭＳＯと角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを緩慢凍結状態で凍結された状態で含む、凍結製剤を提供し得る。

　一態様において、本開示は、７％未満のＤＭＳＯと角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞と生理食塩水の成分とを凍結状態で含む凍結製剤を提供し得る。

　一態様において、本開示は、７％未満のＤＭＳＯと角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞と培地成分とを凍結状態で含む凍結製剤を提供し得る。

　再生医療に使用される細胞凍結製剤はＤＭＳＯを少なくとも７％以上含んでおり、患者に投与する際には患者へのＤＭＳＯの毒性を懸念して生理食塩液で投与直前に希釈したり、点滴静注などの投与の際の投与速度を極めて遅くすることで高濃度のＤＭＳＯが患者に投与されることを回避する必要があった。本開示の方法により、７％未満の低減化されたＤＭＳＯ濃度の保存液において保存しても高い生存率が維持された。本開示は、７％未満というこれまで実現できなかった低濃度のＤＭＳＯを含む凍結製剤を達成した。

　一態様において、本開示は、解凍後長期安定性凍結細胞製剤であって、該製剤は、７％未満のＤＭＳＯと角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを含む、製剤し得る。

　一態様において、本開示は、ＲＯＣＫ阻害剤と角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを凍結状態で含む凍結製剤を提供し得る。

　一態様において、本開示は、ＲＯＣＫ阻害剤と角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞と生理食塩水の成分（例えば、ＮａＣｌ）とを凍結状態で含む凍結製剤を提供し得る。

　一態様において、本開示は、ＲＯＣＫ阻害剤と角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞と培地成分とを凍結状態で含む凍結製剤を提供し得る。当業者であれば、培地成分は、適宜選択することができる。培地成分としては、例えば、グルコース等の炭素源、アミノ酸、ビタミン、電解質、リン酸塩、緩衝剤、成長因子、血清、血清アルブミンなどが挙げられるが、これらに限定されない。基礎培地成分に含まれるアミノ酸としては、特に限定されず、例えば、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリンなどが挙げられる。基礎培地成分に含まれるビタミン類としては、特に限定されず、例えば、Ｄ－パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｉ－イノシトール、ナイアシンアミド、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、ビオチン、リポ酸、ビタミンＢ₁₂、アデニン、チミジンなどが挙げられる。培地成分に含まれる電解質としては、特に限定されず、例えば、ＣａＣｌ_２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ_４、ＮａＣｌ、ＮａＨ_２ＰＯ_４、ＮａＨＣＯ_３、Ｆｅ（ＮＯ_３）_３、ＦｅＳＯ_４、ＣｕＳＯ_４、ＭｎＳＯ_４、Ｎａ_２ＳｉＯ_３、（ＮＨ_４）６Ｍｏ_７Ｏ_２４、ＮａＶＯ_３、ＮｉＣｌ_２、ＺｎＳＯ_４などが挙げられる。細胞注入療法に使用される場合においては、培地は、異種血清成分を実質的に含まないことが好ましい。ここで「異種血清成分」は、レシピエントとは異なる種の生物に由来する血清成分を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ウシやウマに由来する血清、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＦＣＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウマ血清（ＨＳ）などが異種血清成分に該当する。

　一態様において、本開示は、解凍後長期安定性凍結細胞製剤であって、該製剤は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とＲＯＣＫ阻害剤とを緩慢凍結状態で凍結された状態で含む、製剤を提供し得る。

　一態様において、本開示は、解凍後投与された角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の生着および生体内における生存が阻害されない凍結製剤であって、該製剤は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とＲＯＣＫ阻害剤とを緩慢凍結状態で凍結された状態で含む、凍結製剤を提供し得る。

　本開示の製剤は、解凍後眼に直接投与可能であり得る。

　一実施形態において、製剤に含まれる角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の細胞数は、約１×１０^５～約３×１０^６細胞であり得、好ましくは、約５×１０^５～約１×１０^６細胞であり得る。特定の実施形態において、製剤に含まれる角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の細胞数は、例えば、約１×１０^５細胞、約２×１０^５細胞、約３×１０^５細胞、約４×１０^５細胞、約５×１０^５細胞、約６×１０^５細胞、約７×１０^５細胞、約８×１０^５細胞、約９×１０^５細胞、約１×１０^６細胞、約２×１０^６細胞、約３×１０^６細胞、約４×１０^６細胞、または約５×１０^６細胞であり得る。

　一実施形態では、製剤の液量は、約５０μｌ～約２０００μｌ、約５０μｌ～約１０００μｌ、約５０μｌ～約８００μｌ、約５０μｌ～約６００μｌ、約５０μｌ～約３００μｌ、約１００μｌ～約２０００μｌ、好ましくは約１００μｌ～約１０００μｌ、より好ましくは約２００μｌ～約８００μｌ、最も好ましくは約３００μｌ～約６００μｌであり得るが、目的に応じて適宜変更可能である。製品規格としては、例えば、基準量（例えば、３００μｌ）の±約５％、±約１０％、±約１５％、±約２０％、±約２５％、±約５０％などであり得る。例えば、製剤の液量は、少なくとも約５０μｌ、例えば、約１００μｌ、約２００μｌ、約３００μｌ、約４００μｌ、約５００μｌ、約６００μｌ、約７００μｌ、約８００μｌ、約９００μｌ、約１ｍｌ、約２ｍｌ、約３ｍｌ、約４ｍｌ、約５ｍｌ、約６ｍｌ、約７ｍｌ、約８ｍｌ、約９ｍｌ、または約１０ｍｌであり得る。いくつかの実施形態において、細胞注入療法において、両眼への注入を企図する場合は、製品規格として投与量の２倍量、３倍量、または４倍量であってもよい。両眼への注入を企図しない場合であっても、投与に失敗したときに備えて、製品規格として投与量の２倍量、３倍量、または４倍量であってもよい。液量の範囲は、上記数値を適宜組み合わせることができる。

　一実施形態において、本開示の製剤は、１回当たり約５０μＬ～約３５０μＬ、約２５０μＬ～約３５０μＬ、約３００μＬ～約３５０μＬ、または約３００μＬ投与され得る。本開示の製剤は、前房内に投与され得る。

　本開示の製剤の細胞密度は、約２×１０^４個／ｍｌ以上であることが通常である。理論に束縛されるのは望まないが、細胞注入用として用いられる場合、細胞密度が少なすぎると治療効果が期待できず、細胞密度が高すぎると細胞の重なりが増えることによって、保存中の細胞死が促進される可能性がある。したがって、典型的には細胞密度は、約２×１０^４個／ｍｌ～約８×１０^７個／ｍｌの範囲内で適宜決定することができ、好ましくは約２×１０^４個／ｍｌ～約８×１０^７個／ｍｌ、より好ましくは約２×１０^５個／ｍｌ～約８×１０^６個／ｍｌ、さらに好ましくは約１×１０^６個／ｍｌ～約８×１０^６個／ｍｌ、最も好ましくは約２×１０^６個／ｍｌ～約４×１０^６個／ｍｌで得あり得る。当業者であれば、適切な細胞密度を用途に応じて適宜決定することが可能である。例えば、保存された角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、細胞注入療法に使用される場合、保存する懸濁液の体積、至適投与量、任意で追加されるＲＯＣＫ阻害剤、および投与される懸濁液の体積等を考慮して、保存後に密度を調節する操作を軽減されるように、保存される細胞密度が決定されてもよい。典型的には、至適投与量は約１×１０^５～約３×１０^６細胞であり得、好ましくは、約５×１０^５～約１×１０^６細胞であり得る。当業者であれば、至適投与量を達成するように、製剤に含まれる細胞数、液量、および細胞密度を適宜決定することができる。

　一実施形態において、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞は、容器に収容され得る。いくつかの実施形態において、容器としては、任意のものを使用してよく、例えば、プレート（１２、２４、４８または９６ウェルプレート）、チューブ、バイアル瓶（ガラスバイアル）、シリンジ、およびディッシュが挙げられるがこれらに限定されない。本開示の方法は、容器の種類にかかわらず、高い細胞生存率で細胞を保存することができる。

　一実施形態において、製剤は、約７％未満、約５％以下、または約２％以下のＤＭＳＯを含み得る。製剤は、約５％以下のＤＭＳＯを含むことが好ましく、より好ましくは、約２％以下を含み、最も好ましくはＤＭＳＯを含まない。特定の実施形態において、製剤中に含まれるＤＭＳＯは約５％であり得る。特定の実施形態において、製剤中に含まれるＤＭＳＯは約２％であり得る。

　一実施形態において、製剤はＲＯＣＫ阻害剤を含み得る。ＲＯＣＫ阻害剤については、上記のとおりである。ＲＯＣＫ阻害剤は細胞接着を促進するため、保存時から製剤中に予めＲＯＣＫ阻害剤を含めてしまうと、接着が促進されてしまい、保存に悪影響が出ると思われるため、典型的にはＲＯＣＫ阻害剤は、投与の直前に製剤に添加される。しかしながら、予想外にも、ＲＯＣＫ阻害剤を保存の際から予め製剤中に含めた場合、保存後の細胞の生存率は高く、前房内に注入された角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞は、角膜内皮に生着し、正常に機能していた（実施例５）。

　いくつかの実施形態において、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の生存率は、解凍後、室温で少なくとも６時間少なくとも８０％、または少なくとも９０％の生存率であり得る。いくつかの実施形態において、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の生存率は、解凍後、室温で少なくとも３時間少なくとも９０％の生存率であり得る。

　別の態様において、本開示は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する方法であって、該方法が、非凍結状態の該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結する工程であって、第１の目標温度まで第１の速度で温度を低下させること、および第１の目標温度から第２の目標温度まで第２の速度で温度を低下させることを含む、凍結工程、および必要に応じて、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持する工程を含み、第１の速度が、１分あたり１℃未満の速度であり、第２の速度よりも遅い、方法を提供する。「第１の目標温度」とは、過冷却状態が維持される温度を指す。第１の目標温度は、好ましくは、第１の目標温度までの冷却速度よりも速い速度で冷却した場合に、凍結が開始する際の温度であり得る。第２の目標温度は、第１の目標温度からさらに温度を低下させて、最終的に目標とする温度を指す。本発明者らは、第１の目標温度まで過冷却状態で第１の速度で緩慢に温度を低下させ、第２の速度に変化させて凍結を開始させ、第２の目標温度まで温度を低下させることにより、細胞生存率がさらに改善されることを見出した。前記方法は、本開示に記載の１つまたは複数の実施形態を有してもよい。

　別の態様において、凍結工程は、第１の目標温度まで第１の速度で温度を低下させること、および第１の目標温度から第２の目標温度まで第２の速度で温度を低下させることを含み得る。第１の速度は、１分あたり１℃未満の速度であり、第２の速度よりも遅い速度であり得る。前記方法は、本開示に記載の１つまたは複数の実施形態を有してもよい。

　いくつかの実施形態において、凍結工程は、第１の目標温度まで温度を低下させた後、第１の目標温度で維持することをさらに含んでもよい。第１の目標温度で維持する時間は、過冷却状態が維持されていれば適宜設定してもよく、例えば、約５分以上、約１０分以上、約２０分以上、約３０分以上、約４０分以上、約５０分以上、約６０分以上、約７０分以上、約８０分以上、約９０分以上、約１００分以上、約１１０分以上、約１２０分以上、約１５０分以上、約１８０分以上であり得、最大で約２４０分であり得る。

　第１の目標温度は、過冷却状態が維持される温度であればよく、例えば、約－２０℃～約－５℃の温度、好ましくは、約－１５℃～約－１０℃の温度、より好ましくは、－１３℃～－１０℃の温度であり得る。

　第２の目標温度は、第１の目標温度よりも低い温度であり、適宜設定でき、例えば、約－２０℃以下の温度、好ましくは、約－１９６℃～約－８０℃の温度、より好ましくは、約－１９６℃または約－８０℃であり得る。

　第１の速度は、緩慢な速度であれば適宜設定してもよく、例えば、１分当たり約０．９℃以下の速度、好ましくは、１分あたり約０．５℃～約０．０５℃、より好ましくは、１分あたり約０．３℃～約０．１℃の速度であり得る。
　第２の速度は、第１の速度より速く、第１の速度から第２の速度に変化させた際に凍結が開始するような温度であれば適宜設定してよく、例えば、１分あたり約０．５～約５℃の速度、好ましくは、１分あたり約１～約３℃の速度であり得る。

　一実施形態において、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞は、細胞注入療法に使用され得る。一実施形態において、製剤が、解凍後、さらなる加工も培養もすることなく投与され得る。

　（保存装置）
　さらなる態様において、本開示は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する装置であって、該装置は該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を収容する容器を収容する収容・保存部と、収容・保存部において収容された容器内の角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の温度を制御するように指令する温度制御部と、該収容・保存部における温度を、該温度制御部の指令に基づいて温度調節し得る、温度調節部とを含み、該温度制御部は、非凍結温度から凍結目標温度に温度を低下させる際に、１分あたり１℃未満の速度で温度を変更する段階を少なくとも１つ含むように温度制御するよう指令することができ、必要に応じて、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持するように指令することができる、装置を提供し得る。

　別の態様において、本開示の装置の温度制御部は、非凍結温度から凍結目標温度に温度を低下させる際、第１の目標温度まで第１の速度で温度を低下させ、その後第１の目標温度から第２の目標温度まで第２の速度で温度を低下させるよう指令してもよい。前記装置は、本開示に記載の１つまたは複数の実施形態を有してもよい。

　さらなる態様において、本開示は、装置において角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存することができるようにコンピュータに実装させる方法をコードするプログラムであって、該装置は該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を収容する容器を収容する収容・保存部と、収容・保存部において収容された容器内の角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の温度を制御するように指令する温度制御部と、該収容・保存部における温度を、該温度制御部の指令に基づいて温度調節し得る、温度調節部とを含み、該プログラムは、該温度制御部に対して、非凍結温度から凍結目標温度に温度を低下させる際に、１分あたり１℃未満の速度で温度を変更する段階を少なくとも１つ含むように温度制御させ、必要に応じて、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持させる、プログラムを提供し得る。

　別の態様において、本開示のプログラムは、非凍結温度から凍結目標温度に温度を低下させる際、第１の目標温度まで第１の速度で温度を低下させ、その後第１の目標温度から第２の目標温度まで第２の速度で温度を低下させるよう指令してもよい。前記プログラムは、本開示に記載の１つまたは複数の実施形態を有してもよい。

　さらなる態様において、本開示は、装置において角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存することができるようにコンピュータに実装させる方法をコードするプログラムを格納した記録媒体であって、該装置は該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を収容する容器を収容する収容・保存部と、収容・保存部において収容された容器内の角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の温度を制御するように指令する温度制御部と、該収容・保存部における温度を、該温度制御部の指令に基づいて温度調節し得る、温度調節部とを含み、該プログラムは、該温度制御部に対して、非凍結温度から凍結目標温度に温度を低下させる際に、１分あたり１℃未満の速度で温度を変更する段階を少なくとも１つ含むように温度制御させ、必要に応じて、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持させる、記録媒体を提供し得る。

　別の態様において、本開示の記録媒体に格納されたプログラムは、非凍結温度から凍結目標温度に温度を低下させる際、第１の目標温度まで第１の速度で温度を低下させ、その後第１の目標温度から第２の目標温度まで第２の速度で温度を低下させるよう指令してもよい。前記プログラムは、本開示に記載の１つまたは複数の実施形態を有してもよい。

　本開示の装置またはプログラムで実現される各種機能は、その一部または全部が手動で実現されてもよい。

　本開示の装置またはプログラムで実現される各種機能は、その一部または全部が人工知能（ＡＩ）または機械学習によって実現または最適化されてもよい。

　本開示に係るプログラムを、コンピュータにて読み取り可能な記録媒体に格納してもよく、また、プログラム製品として構成することもできる。ここで、この「記録媒体」とは、メモリーカード、ＵＳＢメモリ、ＳＤカード、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ－ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤ、および、Ｂｌｕ－ｒａｙ（登録商標）　Ｄｉｓｃ等の任意の「可搬用の物理媒体」を含むものとする。

　また、「プログラム」とは、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものも含む。なお、実施の形態に示した各装置において記録媒体を読み取るための具体的な構成、読み取り手順、あるいは、読み取り後のインストール手順等については、周知の構成や手順を用いることができる。

　各種のデータベース等は、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスク等の固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等のストレージ手段であり、各種処理やウェブサイト提供に用いる各種のプログラムやテーブルやデータベースやウェブページ用ファイル等を格納する。

　更に、装置の分散・統合の具体的形態は図示するものに限られず、その全部または一部を、各種の付加等に応じて、または、機能負荷に応じて、任意の単位で機能的または物理的に分散・統合して構成することができる。すなわち、上述した実施形態を任意に組み合わせて実施してもよく、実施形態を選択的に実施してもよい。

　（キット）
　さらなる態様において、本開示は、ＲＯＣＫ阻害剤と角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを凍結状態で含む凍結製剤を収容する容器と、該容器を凍結状態を維持しつつ収容する収容器とを含む、凍結製剤キットを提供し得る。

　一態様において、本開示は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを凍結状態で含む凍結製剤を収容する容器と、該容器を凍結状態を維持しつつ収容する収容器とを含む、凍結製剤キットを提供し得る。

　一態様において、本開示は、本開示の製剤と、該製剤を収容する容器と、該製剤を凍結状態で維持しつつ該容器を収容する収容器とを含む、凍結製剤キットを提供し得る。

　一態様において、本開示は、容器と、該容器を収容する収容器とを含む、凍結製剤キットであって、該容器は、本開示の製剤を収容するように用いられ、該収容器は、該製剤を凍結状態で維持するように用いられる、キットを提供し得る。

　一態様において、本開示は、容器と該容器を収容する収容器とを含むキットの使用であって、該容器は、本開示の製剤を収容するように用いられ、該収容器は、該製剤を凍結状態で維持するように用いられる、使用を提供し得る。

　一実施形態において、収容器は、収容する容器を約－８０℃～約－２０℃の範囲内の温度で維持し得る。一部の実施形態において、収容器は、収容する容器を約－８０℃で維持し得る。

　（保存、運搬および治療）
　さらなる態様において、本開示は、本開示の製剤の運搬および／または保存方法であって、該製剤を、容器と該容器を収容する収容器とを含むキットの容器中に配置する工程と、該キット中の製剤を凍結状態で維持する工程と、を含む方法を提供し得る。

　さらなる態様において、角膜内皮細胞注入療法を行う方法であって、該細胞注入療法に適切な角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を提供する工程、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を、非凍結温度から１分あたり１℃未満の速度で温度を低下する段階を少なくとも一つ含む、凍結工程、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持し、必要に応じて該注入療法へと運搬する工程、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を解凍する工程、ならびに該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を被験体に投与する工程を含む、方法を提供し得る。
　別の態様において、本開示の方法は、非凍結温度から凍結目標温度に温度を低下させる際、第１の目標温度まで第１の速度で温度を低下させること、および第１の目標温度から第２の目標温度まで第２の速度で温度を低下させることを含み得る。前記方法は、本開示に記載の１つまたは複数の実施形態を有してもよい。

　一実施形態において、運搬は、約－８０℃～約－２０℃の範囲内の温度、好ましくは－８０℃で維持しながら行われ得る。

　被験体への投与は、解凍後６時間以内に行われることが好ましく、例えば、６時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、１時間以内、３０分以内、２０分以内、または１０分以内に行われ得る。被験体への投与は、眼の前房内に行われ得る。

　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

　以下、実施例に基づいて本開示をより具体的に説明する。本実施例において用いられる各種試薬は、具体的に示したもののほか、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＢＡＳＦジャパン株式会社などから入手されるものも用いることができることが理解される。

　（実施例１：既知成分の凍結保存液における凍結）
　グリセリンおよびポリエチレングリコールは細胞凍結保存剤としてよく知られている成分であるが、これらの成分だけでは保存効果が低いことからアルブミンなどのタンパク質成分の添加や、１０％ＤＭＳＯの添加が一般に行われる。本実施例は、このような一般的条件でＨＣＥＣが保存されるかどうかを確認し、さらに冷却速度を一般的に知られている－１℃／分より遅くした時に、ＤＭＳＯの濃度が低い場合でも凍結保存できるのかどうかを確認することを目的とする。

　（材料）
・４代継代後のヒト角膜内皮細胞
・ＯｐｔｉＭＥＭ^ＴＭ－Ｉ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　２１５８５－０７０）
・Ｔｒｙｐｌｅ^ＴＭＳｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ　（１０×）　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａ１２１７７－０１）
・赤十字アルブミン２５％静注１２．５ｇ／５０ｍＬ　（日本血液製剤機構）
・２．０ｍｌ　Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ　Ｖｉａｌｓ　（Ｃｏｒｎｉｎｇ　４３０４８８）
・プログラムフリーザー　（ＮＥＰＡＧＥＮＥ　ＰＦ－ＮＰ－２００）
・バイセル　（日本フリーザー株式会社）
・ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　（ｎｉｐｐｉ　８９２０１２）
・Ｂａｍｂａｎｋｅｒ　ｈＲＭ　（日本ジェネティクス　ＣＳ－１１－００１）
・Ｃｒｙｏｓｔｏｒ　ＣＳ１０　ｐｒｅｆｏｍｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　１０％　ＤＭＳＯ　（Ｈｅｍａｃａｒｅ　２１０１０２）
・Ｃｒｙｏｓｔｏｒ　ＣＳ５　ｐｒｅｆｏｍｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　５％　ＤＭＳＯ　（Ｈｅｍａｃａｒｅ　２０５１０２）
・Ｃｒｙｏｓｔｏｒ　ＣＳ２　ｐｒｅｆｏｍｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　２％　ＤＭＳＯ　（Ｈｅｍａｃａｒｅ　２０２１０２）
・ＣＰ－１　ｈｉｇｈ　ｇｒａｄｅ　（極東製薬　２７２０７）
・Ｂａｍｂａｎｋｅｒ　ＤＭＳＯ　Ｆｒｅｅ　（日本ジェネティクス　ＣＳ－０９－００１）
・クライオスカーレス　ＤＭＳＯ　Ｆｒｅｅ　（バイオベルデ　ＣＰＬ－Ａ１）
・１２ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ　（ｃｏｓｔａｒ　３５１３）　
・プロテオセーブＳＳ　遠沈管５０ｍＬ　（住友ベークライト　ＭＳ－５２５５０）
・ステムフル　遠沈管１５ｍＬ　（住友ベークライト　ＭＳ－９０１５０）
　４％ＨＳＡと、１０％グリセリンまたは１０％ポリエチレングリコールと、１０％、５％、２％または０％ＤＭＳＯとを含有するＯｐｔｉＭＥＭを保存液として使用した。

　（方法）
１．４代継代後のヒト角膜内皮細胞を使用した。培養中の培養皿から培地を除去し、ＯｐｔｉＭＥＭを添加し、洗浄した。この作業を２回繰り返した。
２．ＯｐｔｉＭＥＭ除去後、Ｔｒｙｐｌｅ^ＴＭＳｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ（１０×）を添加し、３７℃（５％ＣＯ_２）で２０ｍｉｎインキュベートした。
３．２０分後培地で懸濁し、５０ｍｌステムフルに回収した。
４．３００Ｇ×５ｍｉｎ遠心した。
５．上清を除去し、ＯｐｔｉＭＥＭ（２％ＨＳＡ）で懸濁した。
６．３００Ｇ×５ｍｉｎ遠心した。
７．５－６を再び繰り返した。
８．上清を除去し、ＯｐｔｉＭＥＭ（２％ＨＳＡ）で懸濁し、細胞数をトリパンブルー染色によりカウントした。
９．検討する凍結保存試薬の分だけ、１．２×１０^６個ずつ１５ｍｌステムフルに分注した。また、未凍結群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として１２ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１０００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ^２の細胞密度で播種し、２日おきに培地交換しながら２週間培養した。
１０．１５ｍｌステムフルを３００Ｇ×５ｍｉｎ遠心した。
１１．回収した細胞を、凍結保存液を用いてクライオチューブに保存した。
１２．プログラムフリーザーで４℃から－８０℃まで、－０．５℃／ｍｉｎで凍結した。１３．－８０℃まで下がったら事前に－８０℃で冷やしておいたバイセル処理容器に移動し、－８０℃のフリーザー内で３日間凍結保存した。
１４．３日間凍結保存後、細胞を保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１－２分間溶かした。
１５．事前に３７℃に温めておいた培地で細胞を回収し、トリパンブルー染色により回収細胞数と細胞生存率を計測した。

　実施例１の概要を図１に示す。

　（結果）
　図２は、本実施例で使用する細胞の培養形態の写真を示す。形態的な異常が無いロットであることが確認された。

　図３は、４％ヒト血清アルブミンと１０％グリセリンをベース成分とした時のＤＭＳＯ濃度を変えた凍結保存液で保存し、融解後の細胞の生存率を比較したグラフを示す。ＤＭＳＯが５％以上含まれているときには冷却速度に関わりなく高い生存率が維持されているが、２％あるいは０％では冷却速度が細胞の生存率に大きな影響を及ぼし、－０．５℃／分で９０％以上の生存率が維持された。ＢｉＣｅｌｌは、凍結される細胞のチューブを格納する容器であり、－８０℃のディープフリーザーに入れた場合には内部の温度が－１℃／分前後の速度で低下するようになっている容器である。ＢｉＣｅｌｌで保存した場合では、プログラムフリーザーで－１℃／分で保存した場合より生存率が低かった。

　図４は、４％ヒト血清アルブミンと１０％ポリエチレングリコールをベース成分とした時のＤＭＳＯ濃度を変えた凍結保存液で保存し、融解後の細胞の生存率を比較したグラフを示す。グリセリンを含む凍結保存液における結果と異なり、５％ＤＭＳＯを含む凍結保存液においても冷却速度の影響が細胞生存率に表れた。２％ＤＭＳＯ以下の組成では、－０．５℃／分の冷却速度で凍結した場合に約８０％の生存率を示し、－１℃／分の冷却速度で凍結した場合よりもはるかに高かった。これらの結果は、冷却速度を遅くすることで生存率を改善することを示している。

　（実施例２：凍結保存剤と凍結速度の検討）
　（材料）
・４代継代後のヒト角膜内皮細胞
・ＯｐｔｉＭＥＭ^ＴＭ－Ｉ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　２１５８５－０７０）
・Ｔｒｙｐｌｅ^ＴＭＳｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ　（１０×）　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａ１２１７７－０１）
・赤十字アルブミン２５％静注１２．５ｇ／５０ｍＬ　（日本血液製剤機構）
・２．０ｍｌ　Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ　Ｖｉａｌｓ　（Ｃｏｒｎｉｎｇ　４３０４８８）
・プログラムフリーザー　（ＮＥＰＡＧＥＮＥ　ＰＦ－ＮＰ－２００）
・バイセル　（日本フリーザー株式会社）
・ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　（ｎｉｐｐｉ　８９２０１２）
・Ｂａｍｂａｎｋｅｒ　ｈＲＭ　（日本ジェネティクス　ＣＳ－１１－００１）
・Ｃｒｙｏｓｔｏｒ　ＣＳ１０　ｐｒｅｆｏｍｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　１０％　ＤＭＳＯ　（Ｈｅｍａｃａｒｅ　２１０１０２）
・Ｃｒｙｏｓｔｏｒ　ＣＳ５　ｐｒｅｆｏｍｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　５％　ＤＭＳＯ　（Ｈｅｍａｃａｒｅ　２０５１０２）
・Ｃｒｙｏｓｔｏｒ　ＣＳ２　ｐｒｅｆｏｍｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　２％　ＤＭＳＯ　（Ｈｅｍａｃａｒｅ　２０２１０２）
・ＣＰ－１　ｈｉｇｈ　ｇｒａｄｅ　（極東製薬　２７２０７）（１０％ＤＭＳＯ含有）・Ｂａｍｂａｎｋｅｒ　ＤＭＳＯ　Ｆｒｅｅ　（日本ジェネティクス　ＣＳ－０９－００１）
・クライオスカーレス　ＤＭＳＯ　Ｆｒｅｅ　（バイオベルデ　ＣＰＬ－Ａ１）
・１２ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ　（ｃｏｓｔａｒ　３５１３）　
・プロテオセーブＳＳ　遠沈管５０ｍＬ　（住友ベークライト　ＭＳ－５２５５０）
・ステムフル　遠沈管１５ｍＬ　（住友ベークライト　ＭＳ－９０１５０）
　（方法）
１．４代継代後のヒト角膜内皮細胞を使用した。培養中の培養皿から培地を除去し、ＯｐｔｉＭＥＭを添加し、洗浄した。この作業を２回繰り返した。
２．ＯｐｔｉＭＥＭ除去後、Ｔｒｙｐｌｅ^ＴＭＳｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ（１０×）を添加し、３７℃（５％ＣＯ_２）で２０ｍｉｎインキュベートした。
３．２０分後培地で懸濁し、５０ｍｌステムフルに回収した。
４．３００Ｇ×５ｍｉｎ遠心した。
５．上清を除去し、ＯｐｔｉＭＥＭ（２％ＨＳＡ）で懸濁した。
６．３００Ｇ×５ｍｉｎ遠心した。
７．５－６を再び繰り返した。
８．上清を除去し、ＯｐｔｉＭＥＭ（２％ＨＳＡ）で懸濁し、細胞数をトリパンブルー染色によりカウントした。
９．検討する凍結保存試薬の分だけ、１．２×１０^６個ずつ１５ｍｌステムフルに分注した。また、未凍結群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として１２ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１０００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ^２の細胞密度で播種し、２日おきに培地交換しながら２週間培養した。
１０．１５ｍｌステムフルを３００Ｇ×５ｍｉｎ遠心した。
１１．各種の凍結保存試薬３５０μｌで懸濁した。
１２．各種の凍結保存試薬に終濃度１００μＭになるように調整したＹ－２７６３２（１００μｌ）を、１１の１５ｍｌステムフルに添加して、全量４５０μｌにした。
１３．クライオチューブに４５０μｌずつ分注した（１．２×１０^６個／４５０μｌ）。１４．プログラムフリーザーで、４℃から－８０℃まで、－１℃／ｍｉｎもしくは－０．５℃／ｍｉｎもしくは－０．２℃／ｍｉｎで凍結させた。
１５．－８０℃まで下がったら事前に－８０℃で冷やしておいたバイセル処理容器に移動し、－８０℃フリーザー内で３日間凍結保存した。
１６．３日間凍結保存後、細胞を保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１～２分間溶した。
１７．事前に３７℃に温めておいた培地で細胞を回収し、トリパンブルー染色により回収細胞数と細胞生存率を計測した。
１８．回収した細胞は１２ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１０００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ^２の細胞密度で再播種した。
１９．２日おきに培地交換をしながら、２週間培養した。
２０．培養７日目に位相差顕微鏡（２００倍）で５視野、細胞写真を撮影し、細胞密度を算出した。

　（結果）
　図５は、４℃から－１℃／分、－０．５℃／分または－０．２℃／分の冷却速度で凍結した細胞の融解後の生存率を比較したデータを示す。ＤＭＳＯを含む凍結保存剤では－１℃／分、－０．５℃／分および－０．２℃／分のいずれの条件においても高い生存率が達成された。ＤＭＳＯを含まない凍結保存剤では冷却速度と反比例する形で細胞生存率が向上していることから、冷却速度を遅くすることは細胞の生存率を上げる効果があることが示された。また、－１℃／分の冷却速度で凍結した細胞を融解して、培養器に播種すると底面に接着しない細胞が多く認められ、角膜内皮細胞の機能が低下していることが示唆される。これらのことから、－１℃／分よりも遅い冷却速度で凍結することが、角膜内皮細胞の生存率の改善および機能の維持する上で重要であることが示唆された。

　図６は、４℃から－１℃／分または－０．５℃／分の冷却速度で凍結して保存し、保存後播種７日目の細胞密度を比較したデータを示す。２％ＤＭＳＯを含むＣＳ２、ＤＭＳＯを含まないＢａｍｂａｎｋｅｒ　ＤＭＳＯ　Ｆｒｅｅ、クライオスカーレス　ＤＭＳＯ　Ｆｒｅｅにおいて－１℃／分で凍結した場合は、細胞密度が低かったが、－０．５℃／分の冷却速度で凍結した場合は、高い細胞密度を示した。このことから、冷却速度は、保存後の培養における細胞密度にも影響を与えることが示された。

　（実施例３：ＤＭＳＯ添加培養検討）
　（方法）
１．実施例２（１－１０）と同様の方法で細胞を回収し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ　ＣＳ２を用いて細胞をクライオチューブに保存する。
２．プログラムフリーザーで４℃から－８０℃まで、－０．５℃／ｍｉｎで凍結させる。３．－８０℃まで下がったら事前に－８０℃で冷やしておいたバイセル処理容器に移動し、－８０℃フリーザー内で３日間凍結保存する。
４．３日間凍結保存後、細胞を保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１－２分間溶かす。
５．事前に３７℃に温めておいた培地で細胞を回収し、トリパンブルー染色により回収細胞数と細胞生存率を計測する。
６．回収した細胞を、１５ｍｌステムフル４本に分注し、３００Ｇ×５ｍｉｎ遠心する。７．遠心後、上清を除去し、ＤＭＳＯ１０％，５％，２％，０％含んだ培地を用いて１０００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ^２の細胞密度に調整し、１２ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに再播種する。８．播種後１ｈ，３ｈ，６ｈ，２４ｈに位相差顕微鏡により細胞の写真を撮影する。
９．各時間において細胞写真を撮影後、浮いている細胞も含めて容器中の全ての細胞を回収し、トリパンブルー染色により細胞生存率を測定する。

　実施例３の概要を図７に示す。

　（結果）
　図８は、ＤＭＳＯを１０％もしくは５％添加した培地で培養した細胞の位相差顕微鏡像を示す。ＤＭＳＯを１０％もしくは５％添加した培地で培養した細胞は、ＤＭＳＯを添加しない培地で培養した細胞に比較して顕著に細胞数が低下しており、培養器の底（ラミニンコート済み）に非接着の細胞が多いことが示された。ＤＭＳＯを含まない培地で培養した細胞は、接種後１時間でも大部分の細胞が接着し、３時間ではすべての細胞が接着しているのに対し、ＤＭＳＯ　１０％では２４時間まで全く細胞の接着は認められなかった。ＤＭＳＯ　５％でも１時間後はほとんど接着細胞が認められず、３時間後、６時間後では半数以下の細胞の接着は認められるものの、２４時間後では逆に接着細胞がほとんどなくなった。図８の顕微鏡像において、白く見える細胞は非接着細胞を示し、黒く見えて非円形の細胞が接着細胞を示す。

　図９は、ＤＭＳＯ　２％を含む、またはＤＭＳＯを含まない培地で培養した細胞の位相差顕微鏡像を示す。ＤＭＳＯ　２％を含む培地で培養した細胞の接着率は、ＤＭＳＯを含まない培地で培養した細胞の接着率と変わらなかった。

　眼の前房内の環境においては、前房液は徐々には置き換わるものの、ＤＭＳＯを含む組成で細胞を注入した場合には相当時間高濃度のＤＭＳＯにさらされると考えられることから、１０％などの高濃度のＤＭＳＯを含む凍結保存剤のままで細胞を前房内に注入すると角膜内皮細胞の生存率や接着に大きな障害を与えることが予想される。

　図１０は、再播種後の細胞を回収し、生存率を調べた結果を示すグラフである。顕微鏡写真（図８）ではほとんど接着していなかったＤＭＳＯ　１０％を含む培地で培養した細胞も生存率は１時間の時点では低下していなかった。しかし、その後に生存率が低下することから、ＤＭＳＯを１０％含む培地で培養した細胞は１時間の時点では生存率の低下は認められないものの、重大なダメージをすでに受けており、そのために接着できなかったことが推定される。

　これらの結果を踏まえれば、前房内に注入される細胞製剤に含まれるＤＭＳＯは５％以下が好ましく、２％以下または含まないことが最も好ましい。

　（実施例４：凍結融解後の安定性の検討）
　（方法）
１．実施例２（１－１０）と同様の方法で細胞を回収し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ　ＣＳ１０，ＣＳ５，ＣＳ２を用いてクライオチューブに各保存液あたり６本ずつ保存する。
２．プログラムフリーザーで４℃から－８０℃まで、－０．５℃／ｍｉｎで凍結させる。３．－８０℃まで下がったら事前に－８０℃で冷やしておいたバイセル処理容器に移動し、－８０℃フリーザー内で３日間凍結保存する。
４．３日間凍結保存後、細胞を保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１～２分間溶かす。
５．各保存液あたり１本ずつはすぐに事前に３７℃に温めておいた培地で細胞を回収し、トリパンブルー染色により細胞生存率を測定する　（０ｈ）。残りの５本ずつは、室温で３０ｍｉｎ，１ｈ，３ｈ，６ｈ，２４ｈ放置させた後に同様の方法で細胞を回収し、トリパンブルー染色により細胞生存率を測定する。
６．それぞれの時間で回収した細胞は、１２ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１０００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ^２の細胞密度で再播種する。
７．それぞれ再播種した時間から２４ｈ培養後、位相差顕微鏡により細胞写真を撮影する。

　実施例４の概要を図１１に示す。

　（結果）
　図１２は、ＤＭＳＯを１０％含むＣｒｙｏｓｔｏｒ　ＣＳ１０中で凍結した細胞を０時間、３０分、１時間、３時間、６時間、または２４時間室温で放置した後、Ｔ２５培養フラスコに再播種し、２４時間後に細胞の培養状態を撮影した位相差顕微鏡像を示す。室温で６時間以上放置した場合、細胞増殖や接着能の低下が認められた。

　図１３は、ＤＭＳＯを５％含むＣｒｙｏｓｔｏｒ　ＣＳ５中で凍結した細胞を０時間、３０分、１時間、３時間、６時間、または２４時間室温で放置した後、Ｔ２５培養フラスコに再播種し、２４時間後に細胞の培養状態を撮影した位相差顕微鏡像を示す。室温で６時間置いた細胞で若干の細胞増殖および接着能の低下が認められるものの、ＣＳ５と比較してその程度は低かった。

　図１４は、ＤＭＳＯを２％含むＣｒｙｏｓｔｏｒ　ＣＳ２中で凍結した細胞を０時間、３０分、１時間、３時間、６時間、または２４時間室温で放置した後、Ｔ２５培養フラスコに再播種し、２４時間後に細胞の培養状態を撮影した位相差顕微鏡像を示す。室温で６時間置いた細胞でも変化は認められない。

　図１５は、再播種後の細胞を回収し、生存率を調べた結果を示すグラフである。これらの結果から、ＤＭＳＯを５％以下、好ましくは２％以下で含む凍結保存剤で凍結した細胞製剤は融解後も安定な製剤であり、臨床使用上の利便性が大きいと考えられた。

　（実施例５：ＶＩＸＥＬＬ^ＴＭにおける凍結保存および保存後の角膜内皮細胞の注入）
　ＶＩＸＥＬＬ^ＴＭは、ドライアイスを充填することで－７５℃±１５℃を１８日間維持できる。本実施例では、ＶＩＸＥＬＬ^ＴＭを用いて角膜内皮細胞を保存・運搬を行い、その後角膜内皮細胞の注入を行う。

　（方法）
　（凍結保存）
１．培養した角膜内皮細胞を回収し、１００μＭのＹ２７６３２を添加したＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）　ＣＳ２で１．２×１０^６細胞／４５０μｌの細胞密度で懸濁した。
２．プログラムフリーザーを使用して、バイアルを４℃から－０．５℃／分の速度で－８０℃まで温度を低下させて凍結した。
３．保存したバイアルをＢＩＣＥＬＬ^ＴＭに入れ、－８０℃でディープフリーザーに一旦保存した。
４．保存されたバイアルを取り出し、ドライアイスを含むＶＩＸＥＬＬ^ＴＭに収めて５日間保存された。

　（細胞注入）
　直径８ｍｍの角膜内皮細胞を剥離したモデルに対してＣｒｙｏｓｔｏｒ　ＣＳ２で凍結保存した培養ヒト角膜内皮細胞を医療品輸送向け保冷ボックス（ＶＩＸＥＬＬ^ＴＭ）で５日間保存後、前房水を灌流することなく注入することにより生体内での角膜内皮再生の動態を観察した。

　３時間の俯き姿勢終了後、１、２、３、５日経過時に細隙灯顕微鏡による前眼部観察を行い、炎症や感染の有無を確認した。手術の前日、当日、術後２、４日にプログラフ注射液５ｍｇ／ｍＬを生理食塩水１００ｍＬを加え希釈し、全量６ｍｌを後耳介静脈に注射した。術後１，５日に安楽死を行い、免疫染色を行った。

　（結果）
　図１６は、保冷ボックスで５日間保存した細胞を融解した時の生存率と細胞回収率を示す。生存率は５日時点の生細胞数／総細胞数で算出した。細胞回収率は、理論上の細胞数（充填した細胞数）を１００％とした時の回収率とした。

　保冷ボックスで保存された細胞が正常な形質を保っているかどうかを確認するため、融解後の細胞を遠心分離で凍結保存剤を除去し、通常の８％ＦＢＳを含むＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地（Ｙ２７６３２も含む）に再懸濁した上でＴ２５培養フラスコに播種して２日間培養した。図１７は、保冷ボックスで保存した後、２日間培養した細胞の顕微鏡写真を示す。非凍結細胞と同じ形状で培養器の底面に接着していることから、正常な形質が保たれていることが確認された。

　図１８は、保冷ボックスでの保存後の細胞を注入したウサギの眼の写真を示す。角膜内皮細胞が生着したことにより角膜の透明性が維持された。

　図１９は、細胞注入後１日目の角膜内皮のＣＤ１６６の免疫組織染色の写真を示す。角膜内皮の組織を固定し、角膜内皮細胞の発現マーカーの一つであるＣＤ１６６に対する抗体を１次抗体として結合させた後に蛍光標識した２次抗体を結合させて免疫組織染色した。注入した細胞がきれいにモノレイヤーに生着しており、ＣＤ１６６が強く発現していることが確認された。上段は角膜中央部、下段は周辺部を示す。ヒトのＣＤ１６６のみに結合する抗体で染色しているため、ウサギの角膜内皮は染色されず、明確な境界が確認された。

　図２０は、細胞注入後１日目のＺＯ－１およびＮａ／Ｋ　ＡＴＰａｓｅの免疫組織染色の写真を示す。ＺＯ－１およびＮａ／Ｋ　ＡＴＰａｓｅは、角膜内皮細胞の機能分子として発現している。図２１は、細胞注入後５日目の角膜内皮のＣＤ１６６、ＺＯ－１およびＮａ／Ｋ　ＡＴＰａｓｅの免疫組織染色の写真を示す。

　これらの結果は、注入された角膜内皮細胞が、角膜内皮に生着し、正常に機能していることを示している。

　（実施例６：－０．７℃／分の冷却速度での凍結）
　本実施例は、実施例１と同様の既知成分の凍結保存液および実施例２と同様の市販の保存液において、４℃から－０．７℃／分の冷却速度で凍結した場合の角膜内皮細胞の生存率を確認することを目的とする。

　図２２および図２４に、本実施例の概要を示す。

　（結果）
　図２３は、４％ヒト血清アルブミンと１０％グリセリンをベース成分とした時のＤＭＳＯ濃度を変えた凍結保存液で－１℃／分、－０．７℃／分、－０．５℃／分、または－０．２℃の冷却速度で凍結し、融解後の細胞の生存率を比較したグラフを示す。１０％のＤＭＳＯを含む凍結保存液では、－０．５℃／分および－０．２℃の冷却速度で凍結した場合に生存率の改善傾向が認められた。また、５％のＤＭＳＯを含む凍結保存液では、－０．７℃／分、－０．５℃／分、および－０．２℃の冷却速度で凍結した場合に生存率の改善傾向が認められた。２％のＤＭＳＯを含む凍結保存液およびＤＭＳＯを含まない凍結保存液では、－０．７℃／分、－０．５℃／分、および－０．２℃の冷却速度で凍結した場合に顕著な生存率の改善が認められた。

　図２５は、市販の凍結保存液において、４℃から－０．７℃／分の冷却速度で凍結した細胞の融解後の生存率および回収率を示す。生存率は生細胞数／総細胞数で算出した。細胞回収率は、理論上の細胞数（充填した細胞数）を１００％とした時の回収率とした。図２６は、市販の凍結保存液において、４℃から－１℃／分または－０．７℃／分の冷却速度で凍結した細胞の融解後の生存率を比較したデータを示す。図２７は、市販の凍結保存液において、４℃から－０．５℃／分または－０．２℃／分の冷却速度で凍結した細胞の融解後の生存率を比較したデータを示す。ＤＭＳＯを含まない凍結保存液では、－０．７℃／分、－０．５℃／分および－０．２℃／分の冷却速度で凍結した場合に－１℃／分の冷却速度で凍結した場合と比べて生存率の顕著な改善が認められた。

　実施例１および２の結果と本実施例の結果を踏まえれば、細胞生存率は、－０．７℃／分およびこれより遅い冷却速度で凍結して保存することで改善される。特に、２％と低いＤＭＳＯを含む凍結保存液およびＤＭＳＯを含まない凍結保存液において、顕著な生存率の改善が認められたため、本開示の方法により、凍結保存時のＤＭＳＯを低減化することが可能になる。

　（実施例７：ガラスバイアル製剤での凍結保存）
　本実施例では、ガラスバイアルでの凍結保存を行った。以下に示すように、容器に関係なく、緩慢な冷却速度で凍結することにより高い生存率で保存することができる。

　（材料および方法）
　実施例２（１－１０）と同様の方法で細胞を回収し、以下の保存溶液および冷却速度で細胞をガラスバイアルに保存した。
・コントロール群：保存溶液：ＣＳ２＋Ｙ－２７６３２（１００μＭ）、凍結速度：－０．５℃／ｍｉｎ（～－８０℃）
・ＨＳＡ添加群：保存溶液：ＣＳ２＋Ｙ－２７６３２（１００μＭ）＋４％ＨＳＡ、凍結速度：－０．５℃／ｍｉｎ（～－８０℃）
・速度（１）群：保存溶液：ＣＳ２＋Ｙ－２７６３２（１００μＭ）、凍結速度：－０．５℃／ｍｉｎ（～－１０℃），１１０ｍｉｎ　ｈｏｌｄ（－１０℃），－１．０℃／ｍｉｎ（～－８０℃）
・速度（２）群：保存溶液：ＣＳ２＋Ｙ－２７６３２（１００μＭ）、凍結速度：－０．１℃／ｍｉｎ（～－１０℃），－１．０℃／ｍｉｎ（～－８０℃）

　（結果）
　図２９～３１は、温度の推移を示す。サンプルの急激な温度上昇は、冷却時に見られる潜熱によるものである。－０．５℃／ｍｉｎで－８０℃まで冷却して凍結した場合、８５％を超える高い生存率で保存されることを示した。また、ＨＳＡを添加して、同じ冷却条件で保存した場合、さらに生存率が上昇し、９０％を超える生存率を示した。また、緩慢な速度で－１０℃まで冷却し（その後－１０℃で一定時間維持してもよい）、その後－１．０℃／ｍｉｎの速度で冷却して保存した場合も同様に、コントロール群と比較して生存率が上昇し、９０％を超える生存率を示した（図２８）。すべての保存群において、細胞の形状に異常は認められなかった。

　このように、容器にかかわらず、緩慢な冷却速度で凍結して保存することによって高い生存率で細胞を保存することができることを示した。また、緩慢な速度で特定の温度まで冷却し（その後一定時間温度を維持してもよい）、その後速度を速めて冷却して保存することにより、さらに細胞生存率を改善することを示した。

　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、２０２１年１１月１１日に出願された日本国特許出願第２０２１－１８４２４６号の優先権の利益を請求し、その内容は参照によって本明細書に組み込まれる。

　ＤＭＳＯ濃度を低減化した、あるいはＤＭＳＯを含まない凍結保存液での角膜内皮細胞の凍結方法および患者にそのまま投与可能な細胞凍結製剤の製造方法が提供される。このように製剤は細胞移植等に用いられ得るため、製薬等の分野において利用可能である。

Claims

　角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する方法であって、
　非凍結状態の該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結する工程であって、非凍結温度から凍結目標温度に温度を変更する際に、１分あたり１℃未満の速度で温度を低下させる段階を少なくとも１つ含む、凍結工程、および
　必要に応じて、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持する工程
を含む、方法。
　角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持する工程を含む、請求項１に記載の方法。
　前記凍結状態で維持する工程は、凍結維持温度で維持することを含む、請求項１または２に記載の方法。
　前記凍結維持温度が、約－８０℃～約－１０℃の範囲内の温度である、請求項３に記載の方法。
　前記凍結維持温度が、約－１９６℃～約－１０℃の範囲内の温度である、請求項３に記載の方法。
　前記凍結維持温度が、約－３０℃以下の温度である、請求項３に記載の方法。
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、非凍結温度から１分あたり約０．１℃～約０．９℃の速度で温度を低下される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、非凍結温度から１分あたり約０．２℃～約０．８℃の速度で温度を低下される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、非凍結温度から１分あたり約０．７℃以下の速度で温度を低下される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、非凍結温度から１分あたり約０．２℃～約０．７℃の速度で温度を低下される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
　前記非凍結温度が、約０℃～約４２℃の範囲内の温度である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
　前記非凍結温度が、約０℃～約３７℃の範囲内の温度である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
　前記非凍結温度が、約４℃～約２３℃の範囲内の温度である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
　前記凍結工程は、約－２０℃±１０℃の少なくとも一部の温度範囲において、１分あたり１℃未満の速度で温度を低下させる段階を少なくとも１つ含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
　前記凍結工程は、約－２０℃±１０℃の温度範囲に一定時間以上維持する段階を少なくとも１つ含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、約７％未満のＤＭＳＯを含む保存液中で保存される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、約５％以下のＤＭＳＯを含む保存液中で保存される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、約２％以下のＤＭＳＯを含む保存液中で保存される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、ＤＭＳＯを含まない保存液中で保存される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
　前記凍結工程は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞がＲＯＣＫ阻害剤の存在下で凍結されていることを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
　前記凍結工程が、第１の目標温度まで第１の速度で温度を低下させること、および第１の目標温度から第２の目標温度まで第２の速度で温度を低下させることを含み、該第１の速度が、１分あたり１℃未満の速度であり、該第２の速度よりも遅い、請求項１に記載の方法。
　前記凍結工程が、前記第１の目標温度まで温度を低下させた後、前記第１の目標温度で維持することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
　前記第１の目標温度が、約－２０℃～約－５℃の範囲内の温度である、請求項２１または２２に記載の方法。
　前記第１の目標温度が、約－１５℃～約－１０℃の範囲内の温度である、請求項２１または２２に記載の方法。
　前記第２の目標温度が、約－２０℃以下の温度である、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。
　前記第２の目標温度が、約－１９６℃～約－８０℃の範囲内の温度である、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。
　前記第１の速度が、１分あたり約０．５℃～約０．０５℃の速度である、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。
　前記第１の速度が、１分あたり約０．３℃～約０．１℃の速度である、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。
　前記第２の速度が、１分あたり約０．５～約５℃の速度である、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の方法。
　前記第２の速度が、１分あたり約１～約３℃の速度である、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の方法。
　角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の凍結製剤を生産する方法であって、
　非凍結状態の該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を必要に応じて薬学的に受容可能な成分と混合し、凍結して凍結製剤を生産する工程であって、非凍結温度から凍結目標温度に温度を変更する際に、１分あたり１℃未満の速度で温度を低下させる段階を少なくとも１つ含む、凍結工程、および
　必要に応じて、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の該凍結製剤を凍結状態で維持する工程
を含む、方法。
　請求項２～３０のいずれかまたは複数の項に記載の方法に記載される１または複数の特徴をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
　請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法によって製造される角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の凍結製剤。
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を約１×１０^５～約３×１０^６個を含む、請求項３３に記載の凍結製剤。
　前記凍結製剤の体積は、約５０μＬ～約６００μＬである、請求項３３または３４に記載の凍結製剤。
　前記凍結製剤は、１回あたり約５０μＬ～約３５０μＬ投与されることを特徴とする、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の凍結製剤。
　角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する装置であって、該装置は
　該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を収容する容器を収容する収容・保存部と、
　収容・保存部において収容された容器内の角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の温度を制御するように指令する温度制御部と
　該収容・保存部における温度を、該温度制御部の指令に基づいて温度調節し得る、温度調節部と
を含み、
　該温度制御部は、非凍結温度から凍結目標温度に温度を低下させる際に、１分あたり１℃未満の速度で温度を変更する段階を少なくとも１つ含むように温度制御するよう指令することができ、必要に応じて、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持するように指令することができる、装置。
　装置において角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存することができるようにコンピュータに実装させる方法をコードするプログラムであって、該装置は該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を収容する容器を収容する収容・保存部と、収容・保存部において収容された容器内の角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の温度を制御するように指令する温度制御部と、該収容・保存部における温度を、該温度制御部の指令に基づいて温度調節し得る、温度調節部とを含み、
　該プログラムは、該温度制御部に対して、非凍結温度から凍結目標温度に温度を低下させる際に、１分あたり１℃未満の速度で温度を変更する段階を少なくとも１つ含むように温度制御させ、必要に応じて、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持させる、プログラム。
　装置において角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存することができるようにコンピュータに実装させる方法をコードするプログラムを格納した記録媒体であって、該装置は該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を収容する容器を収容する収容・保存部と、収容・保存部において収容された容器内の角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の温度を制御するように指令する温度制御部と、該収容・保存部における温度を、該温度制御部の指令に基づいて温度調節し得る、温度調節部とを含み、
　該プログラムは、該温度制御部に対して、非凍結温度から凍結目標温度に温度を低下させる際に、１分あたり１℃未満の速度で温度を変更する段階を少なくとも１つ含むように温度制御させ、必要に応じて、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持させる、記録媒体。
　７％未満のＤＭＳＯと角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを含む、凍結製剤。
　７％未満のＤＭＳＯと角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを含む、解凍後眼に直接投与可能な凍結製剤。
　７％未満のＤＭＳＯと角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを緩慢凍結状態で凍結された状態で含む、凍結製剤。
　７％未満のＤＭＳＯと角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞と生理食塩水の成分とを凍結状態で含む凍結製剤。
　７％未満のＤＭＳＯと角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞と培地成分とを凍結状態で含む凍結製剤。
　７％未満のＤＭＳＯと角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを含む解凍後長期安定性凍結細胞製剤。
　約５％以下のＤＭＳＯを含む、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の凍結製剤。
　約２％以下のＤＭＳＯを含む、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の凍結製剤。
　ＤＭＳＯを含まない、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の凍結製剤。
　ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む、請求項４０～４８のいずれか一項に記載の凍結製剤。
　前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、請求項４９に記載の凍結製剤。
　ＲＯＣＫ阻害剤と角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを凍結状態で含む凍結製剤。
　ＲＯＣＫ阻害剤と角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞と生理食塩水の成分とを凍結状態で含む凍結製剤。
　ＲＯＣＫ阻害剤と角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞と培地成分とを凍結状態で含む凍結製剤。
　解凍後長期安定性凍結細胞製剤であって、該製剤は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とＲＯＣＫ阻害剤とを含む、製剤。
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の生存率が、解凍後、室温で少なくとも６時間少なくとも８０％の生存率である、請求項５４に記載の製剤。
　解凍後投与された角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞の生着および生体内における生存が阻害されない凍結製剤であって、該製剤は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とＲＯＣＫ阻害剤とを緩慢凍結状態で凍結された状態で含む、凍結製剤。
　７％未満のＤＭＳＯとＲＯＣＫ阻害剤と角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを緩慢凍結状態で凍結された状態で含む、凍結製剤。
　前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、請求項５０～５７のいずれか一項に記載の製剤。
　約７％未満のＤＭＳＯを含む、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の製剤。
　約５％以下のＤＭＳＯを含む、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の製剤。
　約２％以下のＤＭＳＯを含む、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の製剤。
　ＤＭＳＯを含まない、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の製剤。
前記製剤は、緩慢凍結状態で凍結された状態で前記細胞を含む、請求項３０～５２のいずれか一項に記載の製剤。
　前記製剤が、非凍結温度から１分あたり１℃未満の速度で温度を低下させて凍結されたものである、請求項３０～５３のいずれか一項に記載の製剤。
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、細胞注入療法に使用されることを特徴とする、請求項４０～６４のいずれか一項に記載の製剤。
　前記凍結製剤が、解凍後、さらなる加工も培養もすることなく投与されることを特徴とする、請求項４０～６５のいずれか一項に記載の製剤。
　前記角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を約１×１０^５～約３×１０^６個を含む、請求項４０～６６のいずれか一項に記載の製剤。
　前記凍結製剤の体積は、約５０μＬ～約６００μＬである、請求項４０～６７のいずれか一項に記載の製剤。
　前記製剤は、１回あたり約５０μＬ～約３５０μＬ投与されることを特徴とする、請求項４０～６８のいずれか一項に記載の製剤。
　角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを凍結状態で含む凍結製剤を収容する容器と、該容器を凍結状態を維持しつつ収容する収容器とを含む、凍結製剤キット。
　前記凍結製剤は、請求項３０～５９のいずれか一項に記載の製剤である、請求項７０に記載の凍結製剤キット。
　請求項４０～６９のいずれか一項に記載の製剤と、該製剤を収容する容器と、該製剤を凍結状態で維持しつつ該容器を収容する収容器とを含む、凍結製剤キット。
　容器と、該容器を収容する収容器とを含む、凍結製剤キットであって、
　該容器は、請求項４０～６９のいずれか一項に記載の製剤を収容するように用いられ、該収容器は、該製剤を凍結状態で維持するように用いられる、キット。
　ＲＯＣＫ阻害剤と角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞とを凍結状態で含む凍結製剤を収容する容器と、該容器を凍結状態を維持しつつ収容する収容器とを含む、凍結製剤キット。
　容器と該容器を収容する収容器とを含むキットの使用であって、
　該容器は、請求項４０～６９のいずれか一項に記載の製剤を収容するように用いられ、該収容器は、該製剤を凍結状態で維持するように用いられる、使用。
　請求項４０～６９のいずれか一項に記載の製剤の運搬および／または保存方法であって、
　該製剤を、容器と該容器を収容する収容器とを含むキットの容器中に配置する工程と、
　該キット中の製剤を凍結状態で維持する工程と、
を含む方法。
　角膜内皮細胞注入療法を行う方法であって、
　該細胞注入療法に適切な角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を提供する工程、
　該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を、非凍結温度から１分あたり１℃未満の速度で温度を低下する段階を少なくとも一つ含む、凍結工程、
　該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を凍結状態で維持し、必要に応じて該注入療法へと運搬する工程、
　該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を解凍する工程、ならびに
　該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を被験体に投与する工程
を含む、方法。