KR20240110954A - 각막 내피 세포의 냉동보존 제제 및 상기 냉동보존 제제를 생산하기 위한 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결보존시키기 위한 방법, 및 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포에 대한 동결 제제를 제공한다. 본 개시내용은 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 보존하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 이러한 방법은 동결되지 않은 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결시키기 위한 동결시키는 단계로서, 이러한 동결시키는 단계는 온도를 비동결 온도로부터 동결 표적 온도로 변화시키는 경우 1℃/min 미만의 속도로 온도를 강하시키는 적어도 하나의 단계를 포함하는 동결시키는 단계 및, 필요한 경우, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지시키기 위한 단계를 포함한다.
Description
본 개시내용은 각막 내피 세포(corneal endothelial cell)의 냉동보존 제제를 위한 기술 및 이러한 제제를 생산하기 위한 방법 뿐만 아니라 이를 사용한 치료와 같은 적용 기술에 관한 것이다.
각막 내피 세포가 손상되면, 각막이 혼탁되어, 수포성 각막병증(bullous keratopathy)으로 인한 심각한 시력 손상이 야기된다. 수포성 각막병증에 대한 유일한 치료는 각막 이식이지만, 공여체 부족 및 거부반응과 같은 문제가 존재한다. 따라서, 신생 의약 치료의 개발이 요구되고 있다. 도시샤 대학(Doshisha University)은 공여체(donor)의 각막에서 분리한 각막 내피 세포를 Rho-관련 코일드-코일 형성 키나제(Rho-associated coiled-coil forming kinase; ROCK) 억제제 존재 하에 증식시켜 많은 환자 내로 세포를 주입함에 의한 각막 내피 세포 재생을 위한 치료법을 확립하였다. 그러나, 세포가 이의 품질을 유지하면서 보존될 수 있는 기간의 제한은 일본 전역 및 전 세계적으로 세포를 공급하는 데 주요한 문제를 야기하였다. 일반적으로, 세포는 10% 디메틸설폭시드(DMSO)를 함유한 보존 용액에 냉동 보관할 수 있으나, 재생 의료의 경우, DMSO의 독성 및 눈에 투여하는 경우 자극에 대한 우려로 인해 감소된 농도의 DMSO로 세포를 동결시키는 것이 바람직하다.
또한, 재생 의료에 사용될 동결된 세포 제제는 적어도 7% 이상의 DMSO를 함유하므로, 환자에게 투여되는 경우, 제제를 투여하기 직전에 식염수(saline)로 희석하거나 예를 들면, 환자에 대한 DMSO의 독성에 대한 우려로 인하여 정맥내 주입의 경우, 제제를 극도로 느린 속도로 투여함으로써 환자에게 고 농도의 DMSO가 투여되는 것을 피하였다.
각막 내피 세포 주입 치료요법(cell infusion therapy)은 고 농도를 지닌 세포 현탁액을, 400 μL 이하의 저 용량으로 환자의 안구의 전방(anterior chamber)에 투여하는 것이 요구되며, 현탁액은 투여 전에 희석할 수 없다. 따라서, DMSO 농도가 감소되거나 DMSO가 없는 세포 냉동보존 제제에 대한 필요성이 대두되고 있다.
본 발명의 발명자는 예를 들면, 냉동보존 시 온도 조건을 상세히 시험하였고 -1℃/분보다 느린 속도로의 온도 강하는 DMSO의 농도가 감소되거나(예컨대, 7% 미만) 또는 DMSO가 없는 냉동보존 용액에서 각막 내피 세포의 생존률(viability)이 높게 유지되도록 한다는 것을 발견하였다. 본 발명자는 또한 세포가 초기에 느린 속도로 온도를 강하시킨 다음 보다 빠른 냉각 속도로 동결시킬 때 세포 생존률이 증가한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 개시내용은 DMSO의 농도가 감소되거나 DMSO가 없는 냉동보존 용액에서 각막 내피 세포를 동결시키는 방법 및 환자에게 직접 투여할 수 있는 동결된 세포 제제를 생산하는 방법을 제공한다.
본 출원의 발명은 예를 들면, 다음 항목을 제공한다.
(항목 1)
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포(corneal endothelium-like cell)를 보존하기 위한 방법으로서, 이러한 방법이:
비-동결 상태의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결시키는 단계로서, 이러한 동결시키는 단계가 온도를 비-동결 온도로부터 동결 표적 온도(freezing target temperature)로 변화시키는 경우 분당(per minute) 1℃ 미만의 속도로 온도를 강하시키는 적어도 하나의 단계를 포함하는 단계; 및
임의로 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지시키는 단계를 포함하는 방법.
(항목 2)
상기 항목에 따른 방법으로서, 이러한 방법이 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지시키는 단계를 포함하는, 방법.
(항목 3)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 여기서 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지시키는 단계가 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결 유지 온도에서 유지시키는 단계를 포함하는, 방법.
(항목 4)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 동결 유지 온도가 약 -80℃ 내지 약 -10℃의 범위의 온도인, 방법.
(항목 5)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 동결 유지 온도가 약 -196℃ 내지 약 -10℃의 범위의 온도인 방법.
(항목 6)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 동결 유지 온도가 약 -30℃ 이하의 온도인 방법.
(항목 7)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 비-동결 온도로부터 분당 약 0.1℃ 내지 약 0.9℃의 속도로 온도가 강하되는, 방법.
(항목 8)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 비-동결 온도로부터 분당 약 0.2℃ 내지 약 0.8℃의 속도로 온도가 강하되는, 방법.
(항목 9)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 비-동결 온도로부터 분당 약 0.7℃의 속도로 온도가 강하되는, 방법.
(항목 10)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 비-동결 온도로부터 분당 약 0.2℃ 내지 약 0.7℃의 속도로 온도가 강하되는, 방법.
(항목 11)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 비-동결 온도가 약 0℃ 내지 약 42℃의 범위의 온도인, 방법.
(항목 12)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 비-동결 온도가 약 0℃ 내지 약 37℃의 범위의 온도인, 방법.
(항목 13)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 비-동결 온도가 약 4℃ 내지 약 23℃의 범위의 온도인, 방법.
(항목 14)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 동결시키는 단계가 약 -20℃ ± 10℃의 온도 범위 중 적어도 일부에서 분당 1℃ 미만의 속도로 온도를 강하시키는 적어도 하나의 단계를 포함하는, 방법.
(항목 15)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 동결시키는 단계가 온도를 약 -20℃ ± 10℃의 범위로 일정 시가 이상 동안 유지시키는 적어도 하나의 단계를 포함하는, 방법.
(항목 16)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 약 7% 미만의 DMSO를 함유하는 보존 용액 중에서 보존되는, 방법.
(항목 17)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 약 5% 이하의 DMSO를 함유하는 보존 용액 중에서 보존되는, 방법.
(항목 18)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 약 2% 이하의 DMSO를 함유하는 보존 용액 중에서 보존되는, 방법.
(항목 19)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 DMSO를 함유하지 않는 보존 용액 중에서 보존되는, 방법.
(항목 20)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 동결시키는 단계가 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 ROCK 억제제의 존재하에 동결시키는 단계를 포함하는, 방법.
(항목 21)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 동결시키는 단계가 온도를 제1 속도로 제1 표적 온도까지 강하시키는 단계 및 온도를 제2 속도로 제1 표적 온도로부터 제2 표적 온도까지 강하시키는 단계를 포함하고, 제1 속도는 분당 1℃ 미만이고 제2 속도보다 더 느린, 방법.
(항목 22)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 동결시키는 단계가 온도를 제1 표적 온도로 강하시키는 단계 및 이후에 온도를 제1 표적 온도에서 유지시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
(항목 23)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 제1 표적 온도가 약 -20℃ 내지 약 -5℃의 범위의 온도인, 방법.
(항목 24)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 제1 표적 온도가 약 -15℃ 내지 약 -10℃의 범위의 온도인, 방법.
(항목 25)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 제2 표적 온도가 약 -20℃ 이하의 온도인, 방법.
(항목 26)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 제2 표적 온도가 약 -196℃ 내지 약 -80℃의 범위의 온도인, 방법.
(항목 27)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 제1 속도가 분당 약 0.5℃ 내지 약 0.05℃의 속도인, 방법.
(항목 28)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 제1 속도가 분당 약 0.3℃ 내지 약 0.1℃의 속도인, 방법.
(항목 29)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 제2 속도가 분당 약 0.5 내지 약 5℃의 속도인, 방법.
(항목 30)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 제2 속도가 분당 약 1 내지 약 3℃의 속도인, 방법.
(항목 31)
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 동결된 제제를 생산하기 위한 방법으로서, 이러한 방법이:
약제학적으로 허용되는 구성성분(component)과 임의로 혼합된 비-동결 상태의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결시킴으로써 동결된 제제를 생산하기 위한 동결시키는 단계로서, 이러한 동결시키는 단계는 온도를 비-동결 온도로부터 동결 표적 온도로 변화시키는 경우 분당 1℃ 미만의 속도로 온도를 강하시키는 적어도 하나의 단계를 포함하는 단계; 및
임의로 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 동결된 제제를 동결된 상태로 유지시키는 단계를 포함하는, 방법.
(항목 32)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 항목 2 내지 30 중 어느 하나에 따른 방법에 기술된 하나 이상의 특징을 추가로 포함하는, 방법.
(항목 33)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 생산된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 동결된 제제(frozen formulation).
(항목 34)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 동결된 제제로서, 동결된 제제가 약 1 x 105 내지 약 3 x 106개의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는, 동결된 제제.
(항목 35)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 동결된 제제로서, 동결된 제제가 약 50 μL 내지 약 600 μL의 용적을 갖는, 동결된 제제.
(항목 36)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 동결된 제제로서, 동결된 제제가 용량(dose) 당 약 50 μL 내지 약 350 μL의 용적으로 투여되는, 동결된 제제.
(항목 37)
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 보존하기 위한 장치(device)로서, 이러한 장치가:
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 함유하기 위한 용기(container)를 함유하는 하우징(housing)/보존기(preserver);
하우징/보존기에 함유된 용기 내 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 온도를 제어하는 지시사항을 제공하는 온도 제어기(temperature controller); 및
온도 제어기로부터의 지시사항을 기반으로 하우징/보존기 내 온도를 조절할 수 있는 온도 조절기를 포함하고,
온도 조절기는 온도를 비-동결 온도로부터 동결된 표적 온도로 강하시키는 경우 분당 1℃ 미만의 속도로 온도를 변화시키는 적어도 하나의 단계를 포함하고 임의로 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지시키기 위해 온도를 제어하는 지시사항을 제공할 수 있는, 장치.
(항목 38)
컴퓨터가 장치 내에 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 보존하기 위한 방법을 실행하도록 하기 위한 프로그램으로서, 상기 장치는:
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 함유하기 위한 용기를 함유하는 하우징/보존기;
하우징/보존기에 함유된 용기 내 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 온도를 제어하는 지시사항을 제공하는 온도 제어기; 및
온도 제어기로부터의 지시사항을 기반으로 하우징/보존기 내 온도를 조절할 수 있는 온도 조절기를 포함하고,
프로그램은 온도 제어기가:
온도를 비-동결 온도로부터 동결 표적 온도로 강하시키는 경우 온도를 분당 1℃ 미만의 속도로 변화시키는 적어도 하나의 단계를 포함하도록 온도를 제어하는 단계; 및
임의로 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지하는 단계를 실행하도록 하는, 프로그램.
(항목 39)
컴퓨터가 장치 내에서 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 보존하기 위한 방법을 실행하도록 하기 위한 프로그램을 저장하는 기록 매체(recording medium)로서, 상기 장치는:
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 함유하기 위한 용기를 함유하는 하우징/보존기;
하우징/보존기에 함유된 용기 내 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 온도를 제어하는 지시사항을 제공하는 온도 제어기; 및
온도 제어기로부터의 지시사항을 기반으로 하우징/보존기 내 온도를 조절할 수 있는 온도 조절기를 포함하고,
프로그램은 온도 제어기가:
온도를 비-동결 온도로부터 동결 표적 온도로 강하시키는 경우 온도를 분당 1℃ 미만의 속도로 변화시키는 적어도 하나의 단계를 포함하도록 온도를 제어하는 단계; 및
임의로 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지하는 단계를 실행하도록 하는, 기록 매체.
(항목 40)
7% 미만의 DMSO; 및
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는 동결된 제제.
(항목 41)
7% 미만의 DMSO; 및
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는 동결된 제제로서,
동결된 제제는 해동 후 눈에 직접 투여될 수 있는, 동결된 제제.
(항목 42)
7% 미만의 DMSO; 및
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는 동결된 제제로서,
DMSO 및 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포는 느리게 동결된 상태로 존재하는, 동결된 제제.
(항목 43)
7% 미만의 DMSO;
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포; 및
식염수 구성성분을 포함하는 동결된 제제로서,
DMSO, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포, 및 식염수 구성성분은 동결된 상태로 존재하는, 동결된 제제.
(항목 44)
7% 미만의 DMSO;
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포; 및
배지(medium) 구성성분을 포함하는 동결된 제제로서,
DMSO, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포, 및 배지 구성성분은 동결된 상태로 존재하는, 동결된 제제.
(항목 45)
7% 미만의 DMSO; 및
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는, 해동 후 장기간 안정한 동결된 세포 제제.
(항목 46)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 동결된 제제로서, 동결된 제제가 약 5% 이하의 DMSO를 포함하는, 동결된 제제.
(항목 47)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 동결된 제제로서, 동결된 제제가 약 2% 이하의 DMSO를 포함하는, 동결된 제제.
(항목 48)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 동결된 제제로서, 동결된 제제가 DMSO를 포함하지 않는, 동결된 제제.
(항목 49)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 동결된 제제로서 ROCK 억제제를 추가로 포함하는, 동결된 제제.
(항목 50)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 동결된 제제로서, ROCK 억제제가 Y-27632인, 동결된 제제.
(항목 51)
ROCK 억제제; 및
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는 동결된 제제로서,
ROCK 억제제 및 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 동결된 상태로 존재하는, 동결된 제제.
(항목 52)
ROCK 억제제; 및
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포; 및
식염수 구성성분을 포함하는 동결된 제제로서,
ROCK 억제제, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포, 및 식염수 구성성분이 동결된 상태로 존재하는, 동결된 제제.
(항목 53)
ROCK 억제제;
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포; 및
배지 구성성분을 포함하는 동결된 제제로서,
ROCK 억제제, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포, 및 배지 구성성분이 동결된 상태로 존재하는, 동결된 제제.
(항목 54)
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포; 및
ROCK 억제제를 포함하는, 해동 후 장기 안정한 동결된 세포 제제.
(항목 55)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 제제로서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 해동 후 실온에서 적어도 6시간 동안 적어도 80%의 생존률을 갖는, 동결된 제제.
(항목 56)
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포; 및
ROCK 억제제를 포함하는 동결된 제제로서,
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포 및 ROCK 억제제가 느리게 동결된 상태로 존재하고,
제제가 해동 후 투여된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 생체 내 생착(engraftment) 및 생존을 억제하지 않는, 동결된 제제.
(항목 57)
7% 미만의 DMSO;
ROCK 억제제; 및
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는 동결된 제제로서,
DMSO, ROCK 억제제, 및 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 느리게 동결된 상태로 존재하는, 동결된 제제.
(항목 58)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 제제로서, ROCK 억제제가 Y-27632인, 동결된 제제.
(항목 59)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 제제로서, 제제가 약 7% 미만의 DMSO를 포함하는, 동결된 제제.
(항목 60)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 제제로서, 제제가 약 5% 이하의 DMSO를 포함하는, 동결된 제제.
(항목 61)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 제제로서, 제제가 약 2% 이하의 DMSO를 포함하는, 동결된 제제.
(항목 62)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 제제로서, 제제가 DMSO를 포함하지 않는, 동결된 제제.
(항목 63)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 제제로서, 제제가 느리게 동결된 상태의 세포를 포함하는, 동결된 제제.
(항목 64)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 제제로서, 제제가 비-동결 온도로부터 분 당 1℃ 미만의 속도로 온도를 강하시킴으로써 동결되는, 동결된 제제.
(항목 65)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 제제로서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 세포 주입 치료요법에 사용되는, 동결된 제제.
(항목 66)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 제제로서, 동결된 제제가 추가의 가공 또는 배양없이 해동 후 투여되는, 동결된 제제.
(항목 67)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 제제로서, 제제가 약 1 x 105 내지 약 3 x 106개의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는, 동결된 제제.
(항목 68)
항목 40 내지 67 중 어느 하나에 따른 제제로서, 동결된 제제가, 용적이 약 50 μL 내지 약 600 μL인, 동결된 제제.
(항목 69)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 제제로서, 제제가 용량 당 약 50 μL 내지 약 350 μL의 용적으로 투여되는, 동결된 제제.
(항목 70)
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 포함하는 동결된 제제를 함유하는 용기; 및
용기를 함유하면서 이를 동결된 상태로 유지하는 하우징을 포함하는, 동결된 제제 키트(kit).
(항목 71)
항목 70에 따른 동결된 제제 키트로서, 동결된 제제가 상기 항목 중 어느 하나에 따른 제제인, 동결된 제제.
(항목 72)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 제제;
제제를 함유하는 용기; 및
용기를 함유하면서 제제를 동결된 상태로 유지하는 하우징을 포함하는 동결된 제제 키트.
(항목 73)
용기; 및
용기를 함유하는 하우징을 포함하는 동결된 제제 키트로서,
용기는 상기 항목 중 어느 하나에 따른 제제를 함유하는 데 사용되고, 하우징은 제제를 동결된 상태로 유지하는 데 사용되는, 동결된 제제 키트.
(항목 74)
ROCK 억제제 및 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포 둘 다를 동결된 상태로 포함하는 동결된 제제를 함유하는 용기; 및
용기를 함유하면서 이를 동결된 상태로 유지하는 하우징을 포함하는 동결된 제제 키트.
(항목 75)
키트의 용도로서, 키트는
용기; 및
용기를 함유하는 하우징을 포함하고,
용기는 상기 항목 중 어느 하나에 따른 제제를 함유하는 데 사용되고, 하우징은 제제를 동결된 상태로 유지하는 데 사용되는, 키트의 용도.
(항목 76)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 제제를 수송(transporting)하고/하거나 보존하기 위한 방법으로서, 이러한 방법이:
제제를 용기 및 용기를 함유하는 하우징을 포함하는 키트의 용기 내에 위치시키는 단계; 및
키트 내 제제를 동결된 상태로 유지시키는 단계를 포함하는 방법.
(항목 77)
각막 내피 세포 주입 치료요법을 수행하기 위한 방법으로서, 이러한 방법이:
세포 주입 치료요법에 적합한 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 제공하는 단계;
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결시키는 단계로서, 동결시키는 단계가 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 온도를 비-동결 온도로부터 분당 1℃ 미만의 속도로 강하시키는 적어도 하나의 단계를 포함하는 단계;
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지하고 임의로 이를 주입 치료요법에 수송하는 단계;
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 해동하는 단계; 및
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
(항목 1A)
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 보존하기 위한 방법으로서, 이러한 방법이:
비-동결 상태의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결시키는 단계로서, 동결시키는 단계가 온도를 제1 표적 온도까지의 제1 속도로 강하시키고 온도를 제1 표적 온도로부터 제2 표적 온도까지 제2 속도로 강하시키는 단계를 포함하는 단계; 및
임의로 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지시키는 단계를 포함하고,
제1 속도는 분당 1℃ 미만이고 제2 속도보다 더 느린, 방법.
(항목 2A)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 동결시키는 단계가 온도를 제1 표적 온도까지 강하시킨 다음 이 온도를 제1 표적 온도에서 유지시키는, 방법.
(항목 3A)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 제1 표적 온도가 약 -20℃ 내지 약 -5℃의 범위의 온도인, 방법.
(항목 4A)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 제1 표적 온도가 약 -15℃ 내지 약 -10℃의 범위의 온도인, 방법.
(항목 5A)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 제2 표적 온도가 약 -20℃ 이하의 온도인, 방법.
(항목 6A)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 제2 표적 온도가 약 -196℃ 내지 약 -80℃의 범위의 온도인, 방법.
(항목 7A)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 제1 속도가 분당 약 0.5℃ 내지 약 0.05℃의 속도인, 방법.
(항목 8A)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 제1 속도가 분당 약 0.3℃ 내지 약 0.1℃의 속도인, 방법.
(항목 9A)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 제2 속도가 분당 약 0.5 내지 약 5℃의 속도인, 방법.
(항목 10A)
상기 항목 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 제2 속도가 분당 약 1 내지 약 3℃의 속도인, 방법.
본 개시내용에서, 상기 특징 중 하나 이상은 분명한 조합 외에 추가의 조합으로 제공될 수 있는 것으로 의도된다. 당업자는 다음의 상세한 설명을 읽고 이해할 때 본 개시내용의 추가 실시양태 및 이점을 인식할 것이다.
본 개시내용은 해동 후 눈에 직접 투여할 수 있는 각막 세포의 동결된 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 각막 내피 세포를 일본 및 헤외에 제공할 수 있다.
[도 1] 도 1은 실시예 1의 개요를 나타낸다;
[도 2] 도 2는 실시예 1에 사용된 배양된 세포의 형태의 사진을 나타낸다;
[도 3] 도 3은 기본 구성성분으로서 제공되는, 4% 인간 혈청 알부민 및 10% 글리세린과 상이한 농도의 DMSO가 들어있는 냉동보존 용액 중에 보존하고 해동한 후 세포 생존률을 비교하는 그래프를 나타낸다;
[도 4] 도 4는 기본 구성성분으로서 제공되는 4% 인간 혈청 알부민 및 10% 폴리에틸렌 글리콜과 상이한 농도의 DMSO가 들어있는 냉동보존 용액 중에 보존하고 해동한 후 세포 생존률을 비교하는 그래프를 나타낸다;
[도 5] 도 5는 23℃로부터 -1℃/min, -0.7℃/min, 또는 -0.5℃/min의 냉각 속도로 동결된 세포를 해동한 후 생존률을 비교하는 데이타를 나타낸다. 오차 바아(error bar)는 평균 ± SD를 나타낸다. 통계적 유의성은 던넷 t-시험(Dunnett's t-test)(비-동결에 대하여)(n = 3, **p < 0.05)을 기반으로 한다;
[도 6] 도 6은 세포를 4℃로부터 -1℃/min 또는 -0.5℃/min의 냉각 속도로 동결하고, 보존한 다음, 씨딩(seeding)한 후 7일차에 세포 밀도를 비교하는 데이타를 나타낸다;
[도 7] 도 7은 실시예 2의 개요를 나타낸다;
[도 8] 도 8은 10% 또는 5%의 DMSO가 보충된 배지에서 배양된 세포의 위상차 현미경사진(phase contrast micrograph)을 나타낸다;
[도 9] 도 9는 2%의 DMSO 또는 DMSO가 없는 배지에서 배양된 세포의 위상차 현미경사진을 나타낸다;
[도 10] 도 10은 재씨딩(reseeding)되고 수집된 후 세포의 생존률의 결과를 나타내는 그래프를 나타낸다. 각각의 그룹에 대해 좌측으로부터 우측으로, 10%, 5%, 2%, 및 0%의 DMSO가 나타나 있다;
[도 11] 도 11은 실시예 3의 개요를 나타낸다;
[도 12] 도 12는 10%의 DMSO를 함유하는 Cryostor CS10에서 동결시키고, 실온에서 0시간, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 또는 24시간 동안 방치한 다음, T25 배양 플라스크 내로 재씨딩하고, 24시간 후에 배양물에서 사진을 촬영한, 세포의 위상차 현미경 영상(image)을 나타낸다;
[도 13] 도 13은 5%의 DMSO를 함유하는 Cryostor CS5에서 동결시키고, 실온에서 0시간, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 또는 24시간 동안 방치한 다음, T25 배양 플라스크 내로 재씨딩하고, 24시간 후에 배양물에서 사진을 촬영한, 세포의 위상차 현미경 영상을 나타낸다;
[도 14] 도 14는 2%의 DMSO를 함유하는 Cryostor CS2에서 동결시키고, 실온에서 0시간, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 또는 24시간 동안 방치한 다음, T25 배양 플라스크 내로 재씨딩하고, 24시간 후에 배양물에서 사진을 촬영한, 세포의 위상차 현미경 영상을 나타낸다;
[도 15] 도 15는 재씨딩 및 수집 후 세포의 생존률의 결과를 나타내는 그래프를 나타낸다. 각각의 그룹에 대해 좌측으로부터 우측으로, CS10, CS5, 및 CS2가 나타나 있다;
[도 16] 도 16은 냉 박스(cold box) 속에 5일 동안 보존하고 해동한 후 세포의 생존률 및 세포 회수율을 나타낸다. 오차 바아는 평균 ± SD를 나타낸다. 통계적 유의성은 스튜던츠 t-시험(Student's t-test)(n = 3)을 기반으로 한다;
[도 17] 도 17은 냉 박스에 보존된 후 2일 동안 배양된 세포의 현미경사진을 나타낸다;
[도 18] 도 18은 냉 박스에 보존된 후 세포를 주입한 토끼 눈의 사진을 나타낸다;
[도 19] 도 19는 세포 주입 후 1일차에 각막 내피에서 CD166에 대한 면역조직화학적 염색의 사진을 나타낸다;
[도 20] 도 20은 세포 주입 후 1일차에 ZO-1 및 Na/K ATPase에 대한 면역조직화학 염색의 사진을 나타낸다;
[도 21] 도 21은 세포 주입 후 5일차에 각막 내피에서 CD166, ZO-1, 및 Na/K ATPase에 대한 면역조직화학 염색의 사진을 나타낸다;
[도 22] 도 22는 실시예 6의 공지된 구성성분을 함유하는 냉동보존 용액 내 냉동보존의 개요를 나타낸다;
[도 23] 도 23은 기본 구성성분으로서 제공되는 4% 인간 혈청 알부민 및 10% 글리세린과 상이한 농도의 DMSO가 들어있는 냉동보존 용액에서 -1℃/min, -0.7℃/min, -0.5℃/min, 또는 -0.2℃/min의 냉각 속도로 동결시키고 해동한 후 세포 생존률을 비교하는 그래프를 나타낸다;
[도 24] 도 24는 실시예 6의 상업적으로 이용가능한 냉동보존 용액에서 냉동보존의 개요를 나타낸다;
[도 25] 도 25는 상업적으로 이용가능한 냉동보존 용액에서 4℃로부터 -0.7℃/min의 냉각 속도로 동결하고 해동후 세포 생존률 및 회복율을 나타낸다;
[도 26] 도 26은 상업적으로 이용가능한 냉동보존 용액에서 4℃로부터 -1℃/min 또는 -0.7℃/min의 냉각 속도로 동결하고 해동후 세포 생존률을 비교하는 데이타를 나타낸다;
[도 27] 도 27은 상업적으로 이용가능한 냉동보존 용액에서 4℃로부터 -0.5℃/min 또는 -0.2℃/min의 냉각 속도로 동결하고 해동한 후 세포 생존률을 비교하는 데이타를 나타낸다;
[도 28] 도 28은 실시예 7에서 보존된 세포의 세포 생존률을 나타낸다;
[도 29] 도 29는 -0.5℃/min에서 -80℃까지 냉각된 경우의 온도 전이(temperature transition)를 나타낸다;
[도 30] 도 30은 -0.5℃/min에서 -10℃까지 냉각시키고, 온도를 -10℃에서 110분 동안 유지시킨 다음, -1.0℃/min에서 -80℃로 냉각시킨 경우의 온도 전이를 나타낸다; 및
[도 31] 도 31은 -0.1℃/min에서 -10℃로 및 이어서 -1.0℃/min에서 -80℃로 냉각시킨 경우의 온도 전이를 나타낸다.
[도 2] 도 2는 실시예 1에 사용된 배양된 세포의 형태의 사진을 나타낸다;
[도 3] 도 3은 기본 구성성분으로서 제공되는, 4% 인간 혈청 알부민 및 10% 글리세린과 상이한 농도의 DMSO가 들어있는 냉동보존 용액 중에 보존하고 해동한 후 세포 생존률을 비교하는 그래프를 나타낸다;
[도 4] 도 4는 기본 구성성분으로서 제공되는 4% 인간 혈청 알부민 및 10% 폴리에틸렌 글리콜과 상이한 농도의 DMSO가 들어있는 냉동보존 용액 중에 보존하고 해동한 후 세포 생존률을 비교하는 그래프를 나타낸다;
[도 5] 도 5는 23℃로부터 -1℃/min, -0.7℃/min, 또는 -0.5℃/min의 냉각 속도로 동결된 세포를 해동한 후 생존률을 비교하는 데이타를 나타낸다. 오차 바아(error bar)는 평균 ± SD를 나타낸다. 통계적 유의성은 던넷 t-시험(Dunnett's t-test)(비-동결에 대하여)(n = 3, **p < 0.05)을 기반으로 한다;
[도 6] 도 6은 세포를 4℃로부터 -1℃/min 또는 -0.5℃/min의 냉각 속도로 동결하고, 보존한 다음, 씨딩(seeding)한 후 7일차에 세포 밀도를 비교하는 데이타를 나타낸다;
[도 7] 도 7은 실시예 2의 개요를 나타낸다;
[도 8] 도 8은 10% 또는 5%의 DMSO가 보충된 배지에서 배양된 세포의 위상차 현미경사진(phase contrast micrograph)을 나타낸다;
[도 9] 도 9는 2%의 DMSO 또는 DMSO가 없는 배지에서 배양된 세포의 위상차 현미경사진을 나타낸다;
[도 10] 도 10은 재씨딩(reseeding)되고 수집된 후 세포의 생존률의 결과를 나타내는 그래프를 나타낸다. 각각의 그룹에 대해 좌측으로부터 우측으로, 10%, 5%, 2%, 및 0%의 DMSO가 나타나 있다;
[도 11] 도 11은 실시예 3의 개요를 나타낸다;
[도 12] 도 12는 10%의 DMSO를 함유하는 Cryostor CS10에서 동결시키고, 실온에서 0시간, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 또는 24시간 동안 방치한 다음, T25 배양 플라스크 내로 재씨딩하고, 24시간 후에 배양물에서 사진을 촬영한, 세포의 위상차 현미경 영상(image)을 나타낸다;
[도 13] 도 13은 5%의 DMSO를 함유하는 Cryostor CS5에서 동결시키고, 실온에서 0시간, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 또는 24시간 동안 방치한 다음, T25 배양 플라스크 내로 재씨딩하고, 24시간 후에 배양물에서 사진을 촬영한, 세포의 위상차 현미경 영상을 나타낸다;
[도 14] 도 14는 2%의 DMSO를 함유하는 Cryostor CS2에서 동결시키고, 실온에서 0시간, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 또는 24시간 동안 방치한 다음, T25 배양 플라스크 내로 재씨딩하고, 24시간 후에 배양물에서 사진을 촬영한, 세포의 위상차 현미경 영상을 나타낸다;
[도 15] 도 15는 재씨딩 및 수집 후 세포의 생존률의 결과를 나타내는 그래프를 나타낸다. 각각의 그룹에 대해 좌측으로부터 우측으로, CS10, CS5, 및 CS2가 나타나 있다;
[도 16] 도 16은 냉 박스(cold box) 속에 5일 동안 보존하고 해동한 후 세포의 생존률 및 세포 회수율을 나타낸다. 오차 바아는 평균 ± SD를 나타낸다. 통계적 유의성은 스튜던츠 t-시험(Student's t-test)(n = 3)을 기반으로 한다;
[도 17] 도 17은 냉 박스에 보존된 후 2일 동안 배양된 세포의 현미경사진을 나타낸다;
[도 18] 도 18은 냉 박스에 보존된 후 세포를 주입한 토끼 눈의 사진을 나타낸다;
[도 19] 도 19는 세포 주입 후 1일차에 각막 내피에서 CD166에 대한 면역조직화학적 염색의 사진을 나타낸다;
[도 20] 도 20은 세포 주입 후 1일차에 ZO-1 및 Na/K ATPase에 대한 면역조직화학 염색의 사진을 나타낸다;
[도 21] 도 21은 세포 주입 후 5일차에 각막 내피에서 CD166, ZO-1, 및 Na/K ATPase에 대한 면역조직화학 염색의 사진을 나타낸다;
[도 22] 도 22는 실시예 6의 공지된 구성성분을 함유하는 냉동보존 용액 내 냉동보존의 개요를 나타낸다;
[도 23] 도 23은 기본 구성성분으로서 제공되는 4% 인간 혈청 알부민 및 10% 글리세린과 상이한 농도의 DMSO가 들어있는 냉동보존 용액에서 -1℃/min, -0.7℃/min, -0.5℃/min, 또는 -0.2℃/min의 냉각 속도로 동결시키고 해동한 후 세포 생존률을 비교하는 그래프를 나타낸다;
[도 24] 도 24는 실시예 6의 상업적으로 이용가능한 냉동보존 용액에서 냉동보존의 개요를 나타낸다;
[도 25] 도 25는 상업적으로 이용가능한 냉동보존 용액에서 4℃로부터 -0.7℃/min의 냉각 속도로 동결하고 해동후 세포 생존률 및 회복율을 나타낸다;
[도 26] 도 26은 상업적으로 이용가능한 냉동보존 용액에서 4℃로부터 -1℃/min 또는 -0.7℃/min의 냉각 속도로 동결하고 해동후 세포 생존률을 비교하는 데이타를 나타낸다;
[도 27] 도 27은 상업적으로 이용가능한 냉동보존 용액에서 4℃로부터 -0.5℃/min 또는 -0.2℃/min의 냉각 속도로 동결하고 해동한 후 세포 생존률을 비교하는 데이타를 나타낸다;
[도 28] 도 28은 실시예 7에서 보존된 세포의 세포 생존률을 나타낸다;
[도 29] 도 29는 -0.5℃/min에서 -80℃까지 냉각된 경우의 온도 전이(temperature transition)를 나타낸다;
[도 30] 도 30은 -0.5℃/min에서 -10℃까지 냉각시키고, 온도를 -10℃에서 110분 동안 유지시킨 다음, -1.0℃/min에서 -80℃로 냉각시킨 경우의 온도 전이를 나타낸다; 및
[도 31] 도 31은 -0.1℃/min에서 -10℃로 및 이어서 -1.0℃/min에서 -80℃로 냉각시킨 경우의 온도 전이를 나타낸다.
본 개시내용이 이제 설명될 것이다. 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서 전반에 걸쳐 단수의 표현은 또한 이의 복수의 개념을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 단수 관사(예컨대, 영어에서 "a", "an", "the" 등)는 또한 달리 나타내지 않는 한, 이의 복수형의 개념을 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 달리 나타내지 않는 한, 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 충돌이 발생할 경우, 본 명세서(정의 포함)가 우선한다. 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "약"은 다음에 나오는 값의 ±10%를 의미한다. 조성을 나타내는 "%" 기호는 달리 나타내지 않는 한, DMSO 및 인간 혈청 알부민(HSA)을 지칭하는 경우 w/w%를 의미하고, 글리세린 및 폴리에틸렌 글리콜을 지칭하는 경우 v/v%를 의미한다.
(정의)
본원에 사용된 바와 같은, 어구 “각막 내피 세포”는 현장에서 사용되는 일반적인 의미로 사용된다. 각막은 눈을 구성하는 층판 조직(lamellar tissue) 중 하나로, 투명하며 외부 세계와 가장 가까운 곳에 위치한다. 인간에서, 각막은 각막 상피, 보우만 막(Bowman's membrane), 고유판(lamina propria), 데스메 막(Descemet's membrane)(각막 내피의 기저막), 외부(체 표면)으로부터의 각막 내피의 5개 층으로 구성된다. 달리 명시하지 않는 한, 상피와 내피 이외의 각막의 부위는 때때로 총괄적으로 "각막 간질"로서 지칭되며, 본원에서도 그렇게 지칭된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "HCEC"는 인간 각막 내피 세포의 약어이다.
본원에 사용된 바와 같은, 어구 각막 내피-유사 세포'는 실질적으로 각막 내피 세포와 동일한 기능을 갖는, iPS 세포와 같은, 줄기 세포에서 분화된 세포를 지칭한다. 배아 줄기 세포(embryonic stem cell; ES cell), 유도된 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell; iPS cell)와 같은, 줄기 세포를 각막 내피-유사 세포로 분화시키는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다(McCabe et al., PLoS One. 2015 Dec 21; 10(12): e0145266; Ali et al., Invest Ophalmol Vis Sci. 2018 59(6): 2437-2444). 대표적인 예로서, 요약하면, iPS 세포를 0일차에 35 mm 마트리겔-코팅된 플레이트(Matrigel-coated plate)(Corning)에 1:12 희석에서 세포 해리 완충제(Life Technologies)(80% 합치(confluent)된 플레이트를 12개의 플레이트로 나눈다)를 사용하여 씨딩한다. iPS 세포를 배지(mTeSR1; STEMCELL Technologies Inc.)에서 4일 동안 성장시킨다. 4일차에, mTeSR1 배지를 80% DMEM-F12(Life Technologies), 20% KSR(Life Technologies), 1% 비-필수 아미노산(Life Technologies), 1 mM L-글루타민(STEMCELL Technologies, Inc.), 0.1 mM β-머캅토에탄올(MilliporeSigma), 및 8 ng/mL βFGF(MilliporeSigma)로 구성된 기저 배지 속에 500 ng/mL 인간 재조합 노긴(human recombinant Noggin)(R&D Systems, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재) 및 10 μM SB431542(MilliporeSigma)를 함유하는 Smad 억제제 배지로 대체하였다. 6일차에, Smad 억제제 배지를 80% DMEM-F12(Life Technologies), 20% KSR(Life Technologies), 1% 비-필수 아미노산(Life Technologies), 1 mM L-글루타민(STEMCELL Technologies, Inc.), 0.1 mM β-머캅토에탄올(MilliporeSigma), 및 8 ng/mL βFGF(MilliporeSigma)로 구성된 기저 배지 속에 0.1 x B27 보충물(Life Technologies), 10 ng/mL 재조합 인간 혈소판-기원한 성장 인자-BB(PDGF-BB; PeproTech, 미국 뉴저지주 록키 힐 소재) 및 10 ng/mL 재조합 인간 익코프-관련 단백질(Dickkopf-related protein)-2(DKK-2; R&D Systems)를 함유하는 각막 배지로 대체하였다. 7일차에, 분화하는 CEC를 새로운 마트리겔-코팅된 플레이트(Matrigel-coated plate)(35 mm)로 이동시키고 각막 배지 속에서 추가로 13일 동안 성장시켰다. 분화된 CEC를 20일차에 수집하였다. 상술한 실시예는 대표적인 예이고, 당해 분야의 숙련가는 당해 분야에 잘 공지된 다른 방법을 사용할 수 있다(Fukuta et al., PLoS One. 2014 Dec 2; 9 (12): e112291; Hayashi et al., Nature. 2016 Mar 17; 531 (7594): 376-80). 또한, 당해 분야의 숙련가는 당해 분야에서 적절한 것으로 잘 공지된 방법의 조건을 조정함으로써 각막 내피-유사 세포를 생산할 수 있다.
어구 "각막 내피 세포" 및 "각막 내피-유사 세포"는 자기 물질(magnetic substance)(예컨대, 철)을 함유할 수 있다. 예를 들면, 자기 물질을 함유하는 각막 내피 세포를 전방 내로 주입하는 경우, 자기력은 세포가 내부 각막(예컨대, 데스메 막(Descemet's membrane)에 유인되어 부착하도록 할 수 있다(Patel et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009 May; 50(5): 2123-31; Mimura et al., Exp Eye Res. 2003 Jun; 76(6): 745-51; and Mimura et al., Exp Eye Res. 2005 Feb; 80(2): 149-57). 어구 "자기 물질"은 철, 코발트, 니켈, 및 페라이트(ferrite)와 같은 자기장에 의해 자기화된 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 세포의 "보존"은 세포를 증식시키지 않지만, 용기 내에서 이의 기능을 유지하면서 임의의 목적(예: 세포 주입 치료요법 또는 이를 위한 수송)을 위해 일정 시간 동안 용기에 세포를 저장하는 것을 의미한다. 보존은 세포를 증식시키기 위해 의도되는 "배양"과는 상이하다. 더욱이, 보존은 투여 직전에 세포를 주사기 등으로 이동시키거나, 투여 전 사전 준비를 위해 세포를 용기에 일시적으로 유지시키는 것을 의미하지 않는다. 용어 "냉동보존"은 동결된 상태로의 보존을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 어구 "비-동결 온도"는 이러한 온도를 유지한 경우 동결이 발생하지 않는 온도를 지칭하고, 어구 "동결 표적 온도"는 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 본 개시내용의 방법에서의 동결시키는 공정에서 동결시키기 위한 표적 온도를 지칭한다. 어구 "동결 유지 온도"는 동결된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 일정 시간 동안 동결된 상태로 유지되는 온도를 지칭한다. 동결 유지 온도는 대상물이 동결되어 있는 한, 예를 들면, 목적한 세포가 동결되어 유지될 수 있는 한 다양할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 어구 "느리게-동결된 상태"는 분당 1℃ 미만의 속도로 온도를 강하시키는 적어도 하나의 단계를 포함하는 동결시키는 공정에 의해 동결된 상태를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 어구 "해동 후 장기간 안정성"은 동결된 세포가 해동된 다음 실온에 유지되는 경우 적어도 6시간 동안 적어도 80%의 세포 생존률을 유지하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 어구 "동결된 제제"은 동결된 상태로 보존되고, 해동 후, 사용하기에 적합한 형태 또는 사전 제조에 적합한 형태인 제제를 지칭한다. 어구 "사전 제제"는 제제를 이에 가하거나 또는 이를 투여 직전에 용매로 희석시킴에 의한 사용하기에 적합한 제제의 제조를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "가공"은 세포 또는 세포 집단을 지칭하는 경우, 세포 또는 세포 집단의 임의의 상태 또는 특성을 변화시키는 특정 공정, 바람직하게는 제제의 첨가, 제제를 사용한 처리, 또는 특정 세포의 단리와 같이 세포 집단의 특성을 변화시키는 작업, 또는 세포 밀도의 변화, 용매를 사용한 희석, 또는 농축과 같은 작업을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 어구 "일정 온도"는 설정된 온도의 ± 1℃ 이내를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 어구 "각막 내피의 증상, 장애, 또는 질환"은 각막 내피에서 발생하는 임의의 증상, 장애, 또는 질환을 지칭한다. 각막 내피의 증상, 장애, 또는 질환의 예는 푹스 내피 이영양증(Fuchs' endothelial dystrophy), 이식 후 각막 장애(post-transplant corneal disorder), 각막 내피염(coreal endotheliitis), 외상(trauma), 안과 수술 후 장애(post-ophthalmic surgery disorder), 안과 레이저 수술 후 장애(post-ophthalmic laser surgery disorder), 노화(aging), 후부 다형성 이영양증(posterior polymorphous dystrophy; PPD), 선천성 유전성 내피 이영양증(congenital hereditary endothelial dystrophy; CHED), 특발성 각막 내피 장애(idiopathic coreal endothelial disorder)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체(subject)"는 본 개시내용의 제제의 투여될 대상을 지칭하고, 대상체는 포유동물(예컨대, 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 소, 말, 양, 원숭이 등)일 수 있고, 영장류, 특히 인간이 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "키트"는 제공될 부품(예컨대, 시험 제제(test agent), 진단제, 치료제, 항체, 표지, 설명서 등)이 일반적으로 2개 이상의 구획으로 제공되는 단위를 지칭한다. 이러한 키트는 안정성 등을 위해 혼합물로 제공되어서는 안 되는 조성물을 제공하는 목적을 위해 바람직하며, 사용 직전에 혼합하는 것이 바람직하다. 또한, 용액에서 불안정하여 동결건조된 분말을 사용 직전에 적절한 용매에 용해시켜 사전 제조를 적용시켜야 할 필요가 있는 화합물을 제공하는 경우에 키트가 바람직하다. 이러한 키트는 제공될 부품(예: 시험 제제, 진단제, 치료제)을 사용하는 방법 또는 시약을 가공해야 하는 방법을 설명하는 지침 또는 설명서를 갖는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "프로그램"은 당해 분야에서 사용되는 통상적인 의미로 사용되며 컴퓨터에 의해 실행되는 처리에 대한 순서화된 설명이며, 일본 특허법에 따라 "생산물"로 취급된다. 모든 컴퓨터는 프로그램에 따라 작동한다. 현대의 컴퓨터에서, 프로그램은 넓은 의미로 데이터로 표현되며, 기록매체나 저장장치에 저장된다.
본원에 사용된 바와 같은, 어구 "기록 매체"는 본 개시내용의 방법을 실행하기 위한 프로그램을 저장하는 기록 매체이며, 기록 매체는 이것이 프로그램을 기록할 수 있는 한 어떠한 매체도 가능하다. 예를 들어, 기록매체는 내부에 밀봉될 수 있는 ROM, HDD, 자기 디스크, 또는 외부 저장 장치, 예를 들면, 플래시 메모리, 예를 들면, USB 메모리 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "시스템"은 본 개시내용의 방법이나 프로그램을 실행하는 구성을 지칭하며, 필수적으로 목적을 수행하기 위한 체계나 조직을 의미하며, 체계적으로 구성되어 서로 상호작용하는 여러 요소들로 구성된다. 시스템은 컴퓨터 분야에서 하드웨어, 소프트웨어, 운영체제, 네트워크 등의 전반적인 구성을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 어구 "머신 러닝(machine learning)"은 명확한 프로그래밍 없이도 컴퓨터에 학습할 수 있는 능력을 부여하는 기술, 즉, 기능 단위가 새로운 지식과 기술을 습득하거나 기존 지식과 기술을 재구성함으로써 자체 성능을 개선시키는 공정을 말한다. 경험으로부터 학습하도록 컴퓨터를 프로그래밍하면 세부 사항을 프로그래밍하는 데 필요한 노력이 많이 줄어들고, 경험으로부터 자동적으로 개선될 수 있는 컴퓨터 프로그램을 구축하는 방법이 기계 학습 분야에서 논의되고 있다. 알고리즘 분야와 함께, 데이터 분석, 머신 러닝은 지능형 처리의 기반이 되는 구성 기술이며, 주로 다른 기술과 결합하여 사용되므로 협력 분야의 지식(도메인-특이적인 지식; 예를 들면, 의학 분야에서)을 필요로 한다. 이의 애플리케이션 범위는 예측(데이터 수집 및 일어날 일 예측), 탐색(수집된 데이터에서 눈에 띄는 특징 찾기), 및 시험과 설명(데이터에서 다양한 요소 간의 관계 시험)과 같은 역할을 포함한다. 머신 러닝은 실제 목표의 달성 수준의 지표를 기반으로 하며, 머신 러닝의 사용자는 실제 목표를 알아야만 한다. 이후에, 목표가 달성되면 더 좋아질 지표를 공식화하는 것이 필요하다. 머신 러닝은 해결 방법이 해결되었는지의 여부가 불분명한 경우 역 문제(inverse problem) 및 잘못-부여된 문제(ill-posed problem)이다. 학습된 규칙의 거동은 확실하지 않고 확률적(개연성)이다. 일부 제어할 수 없는 부분이 남을 것이라는 전제하에 작동을 고안하는 것이 필요하며, 본 발명의 맞춤형 방법은 이러한 문제에 대한 해결책이라 할 수 있다. 또한 머신 러닝 사용자가 학습 및 작동 동안에 성능 지표를 점검하면서 실제 목표에 맞는 데이터 또는 정보를 연속적으로 선택하는 것이 또한 유용하다.
예를 들면, 선형 회귀, 로지스틱 회귀 또는 서포트 벡터 머신(support vector machine)을 머신 러닝에 사용할 수 있으며, 교차-검증(cross-validation; CV, 교차-입증(cross-verification) 또는 교차-점검(cross-checking)으로서 지칭됨)을 사용하여 각 모델의 판별 정확도를 계산할 수 있다. 순위를 매긴 후, 특징의 수를 하나씩 늘리고 머신 러닝(선형 회귀, 로지스틱 회귀, 서포트 벡터 머신 등) 및 교차-검증을 수행하여 각 모델의 판별 정확도를 계산할 수 있다. 이는 정확도가 가장 높은 모델을 선택하도록 한다. 본 발명에서는, 어떠한 머신 러닝도 사용될 수 있고, 선형, 로지스틱, 서포트 벡터 머신(SVM) 등이 지도 머신 러닝(supervised machine learning)으로서 사용될 수 있다.
(바람직한 실시양태)
바람직한 실시양태가 하기에 설명될 것이지만, 이러한 실시양태는 본 개시내용을 예시하는 것이며, 본 발명의 범위가 이러한 바람직한 실시양태에 제한되는 않는 다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 당해 분야의 숙련가는 다음의 바람직한 실시예를 참고로 본 개시내용의 범위 내에서 변형, 변화 등을 용이하게 할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 당해 분야의 숙련가는 이러한 실시양태 중 어느 것도 적절하게 조합할 수 있다.
(보존 방법)
각막 내피 세포의 냉동보존을 위해, 각막 내피 세포를 동결 동안 손상을 줄이는 10%의 DMSO를 함유하는 보존 용액에서 동결함으로써 높은 생존률으로 보존할 수 있다. 그러나, 세포에 대한 DMSO의 독성 및 눈에 투여한 경우 자극에 대한 우려가 있었다. 따라서, 본 발명자들은 감소된 농도의 DMSO를 지닌 보존 용액에서 높은 생존성을 유지할 수 있는 보존 조건을 시험하였고, -1℃/min보다 느린 속도로의 온도 강하가 DMSO 농도가 감소되었거나(예컨대, 7% 미만) 또는 DMSO가 없는 냉동보존 용액 중에서 각막 내피 세포의 높은 생존률의 유지가 가능함을 발견하였다.
냉각 속도가 너무 느린 경우, 세포 외부의 물이 먼저 동결되고, 이는 세포 외부의 물이 제거되어 물이 세포 밖으로 유출되도록 한다. 세포 생존은 세포 내 용질의 농도 증가로 인해 부정적인 영향을 받는다. 냉각 속도가 너무 빠르면, 세포로부터의 수분 손실이 감소하지만, 얼음 결정에 의해 세포가 손상되어 생존이 부정적으로 영향을 받는다. 세포의 냉동보존 시 냉각 속도는 세포 손상에 상당한 영향을 미친다. 최적의 냉각속도는 충격을 최소화할 수 있으며, -1℃/min의 냉각 속도가 추천된다. 각막 내피 세포의 경우 -1℃/min보다 더 느린 속도로의 온도 강하는 DMSO 농도가 감소되어 있거나(예컨대, 7% 미만) 또는 DMSO가 없는 냉동보존 용액에서 각막 내피 세포의 높은 생존률의 유지를 가능하게 한다는 것은 예상하지 못한 것이었다.
하나의 측면에서, 본 개시내용은 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 보존하기 위한 방법을 제공할 수 있으며, 이러한 방법은 비-동결 상태의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결시키는 단계를 포함하고, 이러한 동결시키는 단계는 온도를 비-동결 온도로부터 동결 표적 온도로 변화시키는 경우 분당 1℃ 미만의 속도(-1℃/min 보다 낮은 냉각 속도)로 온도를 강하시키는 적어도 하나의 단계를 포함한다.
하나의 측면에서, 본 개시내용은 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 동결된 제제를 생산하기 위한 방법을 제공할 수 있고, 이러한 방법은 약제학적으로 허용되는 구성성분과 임의로 혼합된 비-동결 상태의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결시키는 단계를 포함하고, 이러한 동결시키는 단계는 온도를 비-동결 온도로부터 동결 표적 온도까지 변화시키는 경우 분당 1℃ 미만의 속도로 강하시키는 적어도 하나의 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, -1℃/min 보다 느린 냉각 속도는 분당 약 0.1℃ 내지 약 0.9℃, 바람직하게는 분당 약 0.2℃ 내지 약 0.8℃, 및 보다 바람직하게는 분당 약 0.2℃ 내지 약 0.7℃의 범위의 온도일 수 있다. 특정의 실시양태에서, -1℃/min 보다 느린 냉각 속도는 -0.9℃/min, -0.8℃/min, -0.7℃/min, -0.6℃/min, -0.5℃/min, -0.4℃/min, -0.3℃/min, -0.2℃/min, 또는 -0.1℃/min일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 동결 표적 온도(예컨대, -80℃)까지의 냉각 속도는 일정할 수 있거나 일정하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 특정 온도 범위에서의 온도를 -1℃/min보다 더 느린 냉각 속도로 적어도 강하시키는 단계를 포함하고, 온도를 상승시키는 단계, 온도를 -1℃/min보다 더 빠른 냉각 속도로 강하시키는 단계, 또는 온도를 동결 표적 온도로 강하시키는 도중에 온도를 일정한 온도에서 유지시키는 단계를 포함할 수 있다.
표적 동결 온도는 적절하게 설정되며, 예를 들면, 약 -20℃ 내지 -196℃, 예를 들면, 약 -20℃, 약 -30℃, 약 -40℃, 약 -50℃, 약 -60℃, 약 -70℃, 약 -80℃, 약 -90℃, 약 -100℃, 약 -150℃, 약 -190℃, 또는 약 -196℃의 범위의 온도일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 온도를 증가시키는 단계, 온도를 -1℃/min 보다 빠른 냉각 속도로 강하시키는 단계, 또는 온도가 특정 온도 범위에서 -1℃/min 보다 더 느린 평균 냉각 속도로 강하하는 한 온도를 일정한 온도에서 유지시키는 단계를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 특정 온도 범위에서 -1℃/min 보다 빠른 속도로 온도를 강하시키는 단계, 온도를 일정한 온도에서 유지시키는 단계, 및 이후에 온도를 다시 -1℃/min 보다 느린 속도로 강하시키는 단계에 의해 -1℃/min보다 느린 평균 냉각 속도를 달성할 수 있다(이러한 과정은 반복될 수 있다).
하나의 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 온도를 특정 온도 범위에서 -1℃/min 보다 빠른 속도로 강하시키는 단계, 온도를 상승시키는 단계, 온도를 일정한 온도에서 유지하는 단계, 및 이후에 온도를 다시 -1℃/min보다 빠른 속도로 강하시키는 단계에 의해 -1℃/min 보다 느린 평균 냉각 속도를 달성할 수 있다(이러한 과정은 반복될 수 있다).
하나의 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 온도를 특정 온도 범위에서 -1℃/min 보다 빠른 속도로 강하시키는 단계, 온도를 상승시키는 단계, 및 이후에 온도를 다시 -1℃/min보다 빠른 속도로 강하시키는 단계에 의해 -1℃/min 보다 느린 평균 냉각 속도를 달성할 수 있다(이러한 과정은 반복될 수 있다).
하나의 실시양태에서, 온도가 -1℃/min 보다 느린 냉각 속도로 강하되는 특정 온도 범위는 적어도 비-동결 상태로부터 동결된 상태로 이동하는 최소한의 온도를 포함하는 온도 범위일 수 있다. 특정의 실시양태에서, 상술한 온도 범위는 약 -80℃ 내지 약 0℃, 약 -70℃ 내지 약 0℃, 약 -60℃ 내지 약 0℃, 약 -50℃ 내지 약 0℃, 약 -40℃ 내지 약 0℃, 약 -30℃ 내지 약 0℃, 약 -20℃ 내지 약 0℃, 약 -10℃ 내지 약 0℃, 약 -80℃ 내지 약 -10℃, 약 -70℃ 내지 약 -10℃, 약 -60℃ 내지 약 -10℃, 약 -50℃ 내지 약 -10℃, 약 -40℃ 내지 약 -10℃, 약 -30℃ 내지 약 -10℃, 또는 약 -20℃ 내지 약 -10℃일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 동결 유지 온도는 약 -196℃ 내지 약 -4℃, 약 -196℃ 내지 약 -10℃, 약 -196℃ 내지 약 -20 C, 약 -196℃ 내지 약 -30℃, 약 -196℃ 내지 약 -40℃, 약 -196℃ 내지 약 -50℃, 약 -196℃ 내지 약 -60℃, 약 -196℃ 내지 약 -70℃, 약 -196℃ 내지 약 -80℃, 약 -80℃ 내지 약 -4℃, 약 -80℃ 내지 약 -10℃, 약 -80℃ 내지 약 -20℃, 약 -80℃ 내지 약 -30℃, 약 -80℃ 내지 약 -40℃, 약 -80℃ 내지 약 -50℃, 약 -80℃ 내지 약 -60℃, 또는 약 -80℃ 내지 약 -70℃일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 동결 유지 온도는 약 -80℃에서 유지하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에서 동결시키는 단계는 약 0℃ 내지 약 42℃, 약 0℃ 내지 약 37℃, 약 4℃ 내지 약 23℃, 약 4℃ 내지 약 10℃의 범위의 비-동결 온도에서 시작할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 특히 DMSO의 존재하에서 동결시키는 경우에, 동결시키는 단계는 4℃의 비-동결 온도에서 시작할 수 있다. 특정의 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결 전에 상술한 비-동결 온도에서 항온처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에서 동결시키는 단계는 분당 1℃ 미만의 속도로 온도를 강하시키거나 또는 온도를 약 -20℃ ± 10℃의 온도 범위 중 적어도 일부 또는 전체에서 일정 시간 동안 일정 온도에서 유지시키는 적어도 하나의 단계를 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 약 -20℃ ± 10℃의 온도 범위를 일정 기간 이상 동안, 예를 들면, 20분 이상, 30분 이상, 40분 이상, 50분 이상, 1시간 이상, 1시간 30분 이상, 또는 2시간 이상 동안 연속적으로 유지하는 적어도 하나의 단계를 포함할 수 있다. 상술한 온도 범위는 -20℃±5℃일 수 있다. 동결 동안, 균일하지 않고 정렬되지 않은 상태의 얼음 결정의 형성은 세포에 대한 손상을 증가시키고 생존률을 감소시킬 수 있다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 동결 동안, 온도를 보존 용액 중의 얼음 결정 및 용질(예컨대, NaCl)의 공융점(eutectic point)(예컨대, -20℃ ± 10℃) 근처로 일정 시간 동안 느리게 강하시키는 단계는 결정이 균일하게 정렬되어 세포에 대한 손상을 감소시키도록 한다.
온도는 적어도 분당 1℃ 미만의 속도로 온도를 강하시키거나 온도를 -20℃ ± 10℃의 온도 범위에서 일정 시간 동안 일정한 온도에서 유지시키는 적어도 하나의 단계가 포함되는 한, -20℃ ± 10℃의 온도 범위를 벗어나는 어떠한 속도에서도 변할 수 있다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 보존하는 방법을 제공할 수 있고, 이러한 방법은 비-동결 상태의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결시키는 단계를 포함하고, 이러한 동결시키는 단계는 온도를 -20℃ ± 10℃의 온도 범위에서 일정 시간 이상 동안 유지시키고; 임의로 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지시키는 적어도 하나의 단계를 포함한다. 온도는 -20℃ ± 10℃의 온도 범위 밖에서 어떠한 속도로도 변할 수 있다.
일부 실시양태에서, 온도를 -30℃ 미만까지 강하시키고, 증가시킨 다음, 공융점(-20℃ ± 10℃) 근처의 온도 범위에서 일정 시간 동안 유지시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 본 개시내용의 효과가 달성되는 한 본원의 개시내용의 측면에서 적절한 것으로서 온도가 -30 미만으로 유지되는 기간을 조절할 수 있지만, 이러한 기간은 예를 들면, 2시간 이하, 1시간 이하, 또는 30분 이하, 또는 20분 이하일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포는 약 7%, 약 5% 이하, 또는 약 2% 이하의 DMSO를 함유하는 보존 용액 중에서 보존할 수 있다. 보존 용액은 바람직하게는 세포에서 DMSO의 잠재적인 부작용으로 인하여 약 5% 이하, 보다 바람직하게는 약 2% 이하의 DMSO를 함유하고, 가장 바람직하게는 DMSO를 함유하지 않는다. 특정의 실시양태에서, 보존 용액은 약 5%의 DMSO를 함유할 수 있다. 특정의 실시양태에서, 보존 용액은 약 2%의 DMSO를 함유할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포는 ROCK 억제제의 존재하에 동결될 수 있다.
ROCK 억제제는 예를 들면, 다음의 공보에 개시된 화합물일 수 있다: 미국 특허 번호 4678783, 일본 특허 번호 3421217, WO95/28387, WO99/20620, WO99/61403, WO02/076976, WO02/076977, WO2002/083175, WO02/100833, WO03/059913, WO03/062227, WO2004/009555, WO2004/022541, WO2004/108724, WO2005/003101, WO2005/039564, WO2005/034866, WO2005/037197, WO2005/037198, WO2005/035501, WO2005/035503, WO2005/035506, WO2005/080394, WO2005/103050, WO2006/057270, WO2007/026664, WO2014/113620, WO2019/089868, WO2014/055996, WO2019/014300, WO2019/014304, WO2018/138293, WO2018/1115383, WO2018/118109, WO2018/102325, WO2018/009622, WO2018/009625, WO2018/009627, WO2017/205709, WO2017/123860, WO2016/112236, WO2016/028971, WO2015/165341, WO2015/054317, WO2015/002926, WO2015/002915, WO2014/068035, WO2014/055996, WO2013/030366, WO2012/146724, WO2011/107608, WO2010/104851, WO2008/077550, WO2008/036540, WO2005/097790, 등. 이러한 화합물은 상기 개시된 공보에 기술된 방법에 따라 생산할 수 있다. 이의 구체적인 예는 1-(5-이소퀴놀린설포닐)호모피페라진 또는 이의 염(예컨대, 파수딜(Fasudil)(1-(5-이소퀴놀린설포닐)호모피페라진), (+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-1-(4-피리딜카바모일)사이클로헥산 ((R)-(+)-트랜스-(4-피리딜)-4-(1-아미노에틸)-사이클로헥산카복스아미드) 또는 이의 염 (예컨대, Y-27632 ((R)-(+)-트랜스-(4-피리딜)-4-(1-아미노에틸)-사이클로헥산카복스아미드 디하이드로클로라이드 일수화물) 등을 포함한다. 이러한 화합물의 상업적으로 이용가능한 생성물(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, ASAHI KASEI PHARMA CORPORATION 등으로부터)이 또한 적합하게 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 사용될 수 있는 ROCK 억제제의 예는 Y-27632((+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-1-(4-피리딜카바모일)사이클로헥산, 리파수딜(4-플루오로-5-{[(2S)-2-메틸-1,4-디아제판-1-일]설포닐}이소퀴놀린), 파수딜(1-(5-이소퀴놀린설포닐)호모피페라진), 베로수딜(N-(1,2-디하이드로-1-옥소-6-이소퀴놀리닐)-α-(디메틸아미노)-3-트리펜아세트아미드), 벨루모수딜(Belumosudil)(2-[3-[4-[(1H-인다졸-5-일)아미노]퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-이소프로필아세트아미드), 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 벨루모수딜은 다음 구조를 갖는다:
[화학식 1]
.
일부 실시양태에서, ROCK 억제제는 리파수딜, Y-27632, 파수딜, 네타르수딜, 베로수딜, 벨루모수딜, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 보다 바람직하게는 리파수딜, Y-27632, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다.
(제제)
다른 측면에서, 본 개시내용은 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 보존하기 위한 상술한 방법 및/또는 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 동결된 제제를 생산하기 위한 상술한 방법에 의해 생산된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 동결된 제제를 제공할 수 있다.
하나의 측면에서, 본 개시내용은 7% 미만의 DMSO 및 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는 동결된 제제를 제공할 수 있다.
하나의 측면에서, 본 개시내용은 7% 미만의 DMSO 및 느리게 동결된 상태의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는 동결된 제제를 제공할 수 있다.
하나의 측면에서, 본 개시내용은 7% 미만의 DMSO 및 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포, 및 동결된 상태의 식염수 구성성분을 포함하는 동결된 제제를 제공할 수 있다.
하나의 측면에서, 본 개시내용은 7% 미만의 DMSO 및 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포, 및 동결된 상태의 배지 구성성분을 포함하는 동결된 제제를 제공할 수 있다.
재생 의약에 사용될 동결된 세포 제제는 적어도 7% 이상의 DMSO를 포함하므로, 환자에게 투여되는 경우, 환자에 대한 DMSO의 독성에 대한 우려로 인하여 투여 직전에 제제를 식염수로 희석하거나, 또는 예를 들면, 정맥내 주입의 경우에, 제제를 극도로 느린 속도로 투여함으로써 환자에게 고 농도 DMSO를 투여하는 것을 피하는 것이 필수적이었다. 본 개시내용의 방법은 심지어 DMSO 농도가 7% 미만으로 감소된 보존 용액 중에서 보존하는 경우에도 높은 생존률을 유지하였다. 본 개시내용은 7% 미만의 DMSO를 함유하는 동결된 제제를 달성하였고, 이는 이전에 달성불가능한 낮은 농도이었다.
하나의 측면에서, 7% 미만의 DMSO 및 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 함유하는 해동 후 장기간 안정한 동결된 세포 제제가 본 개시내용에 의해 제제화될 수 있다.
하나의 측면에서, 본 개시내용은 ROCK 억제제 및 동결된 상태의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는 동결된 제제를 제공할 수 있다.
하나의 측면에서, 본 개시내용은 ROCK 억제제, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포, 및 동결된 상태의 식염수 구성성분(예컨대, NaCl)을 포함하는 동결된 제제를 제공할 수 있다.
하나의 측면에서, 본 개시내용은 ROCK 억제제, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포, 및 동결된 상태의 배지 구성성분을 포함하는 동결된 제제를 제공할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 적절한 배지 구성성분을 선택할 수 있다. 배지 구성성분의 예는 탄소원, 예를 들면, 글루코스, 아미노산, 비타민, 전해질, 포스페이트, 완충제, 성장 인자, 혈청, 및 혈청 알부민을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 기본 배지의 구성성분에 포함된 아미노산은 특히 제한되지 않으며, 이의 예는 L-아르기닌, L-시스테인, L-글루타민, 글리신, L-히스티딘, L-이소루이신, L-루이신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-타이로신, 및 L-발린을 포함한다. 기본 배지의 구성성분에 포함된 비타민은 특별히 제한되지 않으며, 이의 예는 칼슘 D-판토테네이트, 콜린 클로라이드, 엽산, i-이노시톨, 니아신아미드, 리보플라빈, 티아민, 피리독신, 바이오틴, 리포산, 비타민 B12, 아데닌, 및 티미딘을 포함한다. 배지 구성성분에 포함된 전해질은 특별히 제한되지 않으며, 이의 예는 CaCl2, KCl, MgSO4, NaCl, NaH2PO4, NaHCO3, Fe(NO3)3, FeSO4, CuSO4, MnSO4, Na2SiO3, (NH4)6Mo7O24, NaVO3, NiCl2, 및 ZnSO4를 포함한다. 세포 주입 치료요법에 사용되는 경우, 배지에는 바람직하게는 이종 혈청 구성성분이 없다. 본원에 사용된 바와 같은, 어구 "이종 혈청 구성성분"은 수령체와는 상이한 종의 유기체로부터 유래된 혈청 구성성분을 의미한다. 예를 들면, 수령체가 인간인 경우, 소 또는 말로부터 유래된 혈청, 예를 들면, 소 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 송아지 태아 혈청(fetal calf serum; FCS), 송아지 혈청(calf serum; CS), 또는 말 혈청(horse serum; HS)이 이종 혈청 구성성분에 해당된다.
하나의 측면에서, 본 개시내용은 느리게 동결된 상태의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포 및 ROCK 억제제를 포함하는 해동 후 장기간 안정한 동결된 세포 제제를 제공할 수 있다.
하나의 측면에서, 본 개시내용은 느리게 동결된 상태의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포 및 ROCK 억제제 둘 다를 포함하는 동결된 제제를 제공할 수 있고, 이러한 제제는 해동 후 투여된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 생체 내 생착 및 생존을 억제하지 않는다.
본 개시내용의 제제는 해동된 후 눈에 직접 투여될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 제제에 포함된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 수는 약 1 x 105 내지 약 3 x 106개의 세포, 바람직하게는 약 5 x 105 내지 약 1 x 106개의 세포일 수 있다. 특정의 실시양태에서, 제제에 포함된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 수는 예를 들면, 약 1 x 105개의 세포, 약 2 x 105개의 세포, 약 3 x 105개의 세포, 약 4 x 105개의 세포, 약 5 x 105개의 세포, 약 6 x 105개의 세포, 약 7 x 105개의 세포, 약 8 x 105개의 세포, 약 9 x 105개의 세포, 약 1 x 106개의 세포, 약 2 x 106개의 세포, 약 3 x 106개의 세포, 약 4 x 106개의 세포, 또는 약 5 x 106개의 세포일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 제제의 액체 용적은 약 50 μL 내지 약 2000 μL, 약 50 μL 내지 약 1000 μL, 약 50 μL 내지 약 800 μL, 약 50 μL 내지 약 600 μL, 약 50 μL 내지 약 300 μL, 약 100 μL 내지 약 2000 μL, 바람직하게는 약 100 μL 내지 약 1000 μL, 보다 바람직하게는 약 200 μL 내지 약 800 μL, 및 가장 바람직하게는 약 300 μL 내지 약 600 μL일 수 있지만, 목적에 따라 적절하게 변할 수 있다. 제품 명세는 예를 들면, 참고 양(예컨대, 300 μL)의 ± 약 5%, ± 약 10%, ± 약 15%, ± 약 20%, ± 약 25%, ± 약 50% 등일 수 있다. 예를 들면, 제제의 액체 용적은 적어도 약 50 μL, 예컨대, 약 100 μL, 약 200 μL, 약 300 μL, 약 400 μL, 약 500 μL, 약 600 μL, 약 700 μL, 약 800 μL, 약 900 μL, 약 1 mL, 약 2 mL, 약 3 mL, 약 4 mL, 약 5 mL, 약 6 mL, 약 7 mL, 약 8 mL, 약 9 mL, 또는 약 10 mL일 수 있다. 일부 실시양태에서, 양 눈으로의 주입이 세포 주입 치료요법에서 고려되는 경우, 제품 명세는 투여량의 2배, 3배, 또는 4배일 수 있다. 양 눈으로의 주입이 고려되지 않는 경우에도, 제품 명세는 투여가 실패하는 경우에 투여량의 2배, 3배, 또는 4배일 수 있다. 상술한 값은 적절하게는 액체 용적 범위로 합해질 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용의 제제는 용량 당 약 50 μL 내지 약 350 μL, 약 250 μL 내지 약 350 μL, 약 300 μL 내지 약 350 μL, 또는 약 300 μL의 용적으로 투여될 수 있다. 본 개시내용의 제제는 전방으로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 제제의 세포 밀도는 일반적으로 약 2 x 104개의 세포/mL 이상이다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 세포 주입용으로 사용된 경우, 과도하게 낮은 세포 밀도는 치료학적 효과를 가질 수 없지만, 과도하게 높은 세포 밀도는 세포의 증가된 중첩으로 인하여 보존 동안 세포 사멸을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 세포 밀도는 전형적으로 약 2 x 104개의 세포/mL 내지 약 8 x 107개의 세포/mL, 바람직하게는 약 2 x 104개의 세포/mL 내지 약 8 x 107개의 세포/mL, 보다 바람직하게는 약 2 x 105개의 세포/mL 내지 약 8 x 106개의 세포/mL, 추가로 바람직하게는 약 1 x 106개의 세포/mL 내지 약 8 x 106개의 세포/mL, 및 가장 바람직하게는 약 2 x 106개의 세포/mL 내지 약 4 x 106개의 세포/mL의 범위 내에서 적절한 것으로 결정될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 적절한 응용에 따라 적절한 세포 밀도를 결정할 수 있다. 예를 들면, 보존된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 세포 주입 치료요법에 사용되는 경우, 세포 밀도는 보존 후 밀도를 조정하는 작업이 보존될 현탁액의 용적, 최정 투여량, 임의로 가해질 ROCK 억제제, 및 투여될 현탁액의 용적 등을 고려하여 감소되도록 결정할 수 있다. 전형적으로, 최적 투여량은 약 1 x 105 내지 약 3 x 106개의 세포 및 바람직하게는 약 5 x 105 내지 약 1 x 106개의 세포일 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 최적의 투여량을 달성하기 위하여, 적절한 것으로서 제제 속에 함유된 세포의 수, 액체 용적, 및 세포 밀도를 결정할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포는 용기 내에 함유될 수 있다. 일부 실시양태에서, 플레이트(12, 24, 48, 또는 96-웰 플레이트), 튜브, 바이알(유리 바이알), 주사기, 및 디쉬(dish)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 어떠한 용기로 사용될 수 있다. 본 개시내용의 방법은 용기의 유형에 상관없이 높은 세포 생존률 비율로 세포를 보존할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 제제는 약 7% 미만, 약 5% 이하, 또는 약 2% 이하의 DMSO를 포함할 수 있다. 제제는 바람직하게는 약 5% 이하의 DMSO, 보다 바람직하게는 약 2% 이하의 DMSO를 포함하고, 가장 바람직하게는 DMSO를 포함하지 않는다. 특정의 실시양태에서, 제제에 포함된 DMSO는 약 5%일 수 있다. 특정의 실시양태에서, 제제에 포함된 DMSO는 약 2%일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 제제는 ROCK 억제제를 포함할 수 있다. ROCK 억제제는 상술한 바와 같다. ROCK 억제제는 세포 부착을 촉진하므로, ROCK 억제제가 보존 동안 제제에 포함되는 경우, 부착을 촉진하여 보존에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 따라서, ROCK 억제제는 전형적으로 투여 직전에 제제에 가해진다. 그러나, 예상치목하게도, ROCK 억제제가 보존 동안 제제에 이미 포함되었던 경우, 보존 후 높은 세포 생존률이 달성되었고, 전방에 주입된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포는 각막 내피 내에서 생착되어 정상적으로 기능하였다(실시예 5).
일부 실시양태에서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포는 해동 후 실온에서 적어도 6시간 동안 적어도 80% 또는 적어도 90%의 생존률을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포는 해동 후 실온에서 적어도 3시간 동안 적어도 90% 생존률의 생존률을 가질 수 있다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 보존하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 비-동결 상태의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결시키는 단계를 포함하고, 이러한 동결시키는 단계는 온도를 제1 속도로 제1 표적 온도까지 강하시키는 단계 및 제2 속도로 제1 표적 온도로부터 제2 표적 온도까지 강하시키는 단계; 및 임의로 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지시키는 단계를 포함하고, 제1 속도는 분당 1℃ 미만의 속도이고 제2 속도보다 더 느리다. 어구 "제1 표적 온도"는 초냉각된 상태(supercooled state)가 유지되는 온도를 지칭한다. 제1 표적 온도는 바람직하게는 제1 표적 온도에 대한 냉각 속도보다 더 빠른 속도로 냉각된 경우 냉각이 시닥되는 온도이다. 제2 표적 온도는 온도를 제1 표적 온도로부터 추가로 강하시킴에 의해 달성된 최종 표적 온도를 지칭한다. 본 발명자는 세포 생존률이 온도를 제1 속도로 초냉각된 상태로 제1 표적 온도까지 서서히 강하시키고, 제1 속도를 제2 속도로 변화시켜 동결을 개시한 다음, 온도를 제2 표적 온도로 강하시킴에 의해 추가로 개선됨을 발견하였다. 이러한 방법은 본 개시내용에 기술된 하나 이상의 실시양태를 가질 수 있다.
다른 측면에서, 동결시키는 단계는 온도를 제1 속도로 제1 표적 온도로 강하시키는 단계 및 온도를 제2 속도로 제1 표적 온도로부터 제2 표적 온도까지 강하시키는 단계를 포함할 수 있다. 제1 속도는 분당 1℃ 미만이고 제2 속도보다 더 느릴 수 있다. 이러한 방법은 본 개시내용에 기술된 하나 이상의 실시양태를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 동결시키는 공정은 온도를 제1 표적 온도까지 강하시키는 단계 및 이후에 온도를 제1 표적 온도에서 유지시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 제1 표적 온도가 유지되는 동안의 기간은 초냉각된 상태가 유지되는 한 적절하게 설정될 수 있고 예를 들면, 약 5분 또는 그 이상, 약 10분 또는 그 이상, 약 20분 또는 그 이상, 약 30분 또는 그 이상, 약 40분 또는 그 이상, 약 50분 또는 그 이상, 약 60분 또는 그 이상, 약 70분 또는 그 이상, 약 80분 또는 그 이상, 약 90분 또는 그 이상, 약 100분 또는 그 이상, 약 110분 또는 그 이상, 약 120분 이상, 약 150분 이상, 약 180분 이상, 및 약 240분 이하일 수 있다.
제1 표적 온도는 초냉각된 온도가 유지되는 어떠한 온도, 예를 들면, 약 -20℃ 내지 약 -5℃, 바람직하게는 약 -15℃ 내지 약 -10℃, 및 보다 바람직하게는 -13℃ 내지 -10℃의 온도일 수 있다.
제2 표적 온도는 제1 표적 온도보다 더 낮고 적절하게 설정될 수 있다. 예를 들면, 약 -20℃ 이하, 바람직하게는 약 -196℃ 내지 약 -80℃, 및 보다 바람직하게는 약 -196℃ 또는 약 -80℃의 온도일 수 있다.
제1 속도는 이것이 느린 속도인 한 적절하게 설정될 수 있다. 예를 들면, 분당 약 0.9℃ 이하, 바람직하게는 분당 약 0.5℃ 내지 약 0.05℃, 및 보다 바람직하게는 분당 약 0.3℃ 내지 약 0.1℃의 속도일 수 있다.
제2 속도는 이것이 제1 속도보다 빠른 한 적절하게 설정될 수 있고 속도가 제1 속도로부터 제2 속도로 변화하는 경우 동결이 시작되도록 하는 온도이다. 예를 들면, 분당 약 0.5 내지 약 5℃, 바람직하게는 분당 약 1 내지 약 3℃의 속도일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포는 세포 주입 치료요법에 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 제제는 추가의 가공 또는 배양없이 해동 후 투여될 수 있다.
(보존 장치)
추가의 측면에서, 본 개시내용은 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 보존하기 위한 장치를 제공할 수 있고, 이러한 방법은 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 함유하기 위한 용기; 하우징/보존기 내에 함유된 용기에서 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 온도를 제어하는 지시사항을 제공하는 온도 제어기; 및 온도 제어기로부터의 지시사항을 기반으로 하우징/보존기 내 온도를 조절할 수 있는 온도 조절기를 함유하는 하우징/보존기를 포함하고; 온도 제어기는 온도를 비-동결 온도로부터 동결 표적 온도로 강하시키는 경우 분당 1℃ 미만의 속도로 온도를 변화시키는 적어도 하나의 단계를 포함하고 임의로 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지하도록 온도를 제어하는 지시사항을 제공할 수 있다.
다른 측면에서, 본 개시내용의 장치 내 온도 제어기는 온도를 제1 속도로 제1 표적 온도로 강하시킨 다음 온도가 비-동결 온도로부터 동결 표적 온도로 강하되는 경우 온도를 제2 속도로 제1 표적 온도로부터 제2 표적 온도로 강하시키는 지시사항을 제공할 수 있다. 장치는 본 개시내용에 기술된 하나 이상의 실시양태를 가질 수 있다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 컴퓨터가 장치 내에서 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 보존하는 방법을 실행하도록 하기 위한 프로그램을 제공할 수 있고, 이러한 장치는 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 함유하기 위한 용기를 함유하는 하우징/보존기; 하우징/보존기 내에 함유된 용기에서 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 온도를 제어하는 지시사항을 제공하는 온도 제어기; 및 온도 제어기로부터의 지시사항을 기반으로 하우징/보존기 내 온도를 조절할 수 있는 온도 조절기를 포함하고, 프로그램은 온도를 비-동결 온도로부터 동결 표적 온도로 강하시키는 경우, 분당 1℃ 미만의 속도로 온도를 변화시키는 적어도 하나의 단계를 포함하도록 하기 위해 온도 제어기가 온도 제어를 실행하도록 하고; 임의로 동결된 상태의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 유지한다.
다른 측면에서, 본 개시내용의 프로그램은 온도를 제1 속도로 제1 표적 온도로 강하시킨 다음 온도가 비-동결 온도로부터 동결 표적 온도로 강하되는 경우 온도를 제2 속도로 제1 표적 온도로부터 제2 표적 온도로 강하시키는 지시사항을 제공할 수 있다. 프로그램은 본 개시내용에 기술된 하나 이상의 실시양태를 가질 수 있다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 컴퓨터가 장치 내에서 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 보존하는 방법을 실행하도록 하는 프로그램을 저장하는 기록 매체를 제공할 수 있고, 이러한 장치는 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 함유하기 위한 용기를 함유하는 하우징/보존기; 하우징/보존기에 함유된 용기 내 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 온도를 제어하는 지시사항을 제공하는 온도 제어기; 및 온도 제어기로부터의 지시사항을 기반으로 하우징/보존기 내 온도를 조절할 수 있는 온도 조절기를 포함하고, 프로그램은 온도를 비-동결 온도로부터 동결 표적 온도로 강하시키는 경우 분당 1℃ 미만의 속도로 온도를 변화시키는 적어도 하나의 단계를 포함하도록 온도 제어기가 온도 제어를 실행하도록 하고; 임의로 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지시킨다.
다른 측면에서, 본 개시내용의 기록 매체에 저장된 프로그램은 온도를 제1 속도로 제1 표적 온도로 강하시키고 이후에 온도가 비-동결 온도로부터 동결 표적 온도로 강하되는 경우 온도를 제2 속도로 제1 표적 온도로부터 제2 표적 온도로 강하시키는 지시사항을 제공할 수 있다. 프로그램은 본 개시내용에 기술된 하나 이상의 실시양태를 가질 수 있다.
본 개시내용의 장치 또는 프로그램에 의해 실현된 다양한 기능은 부분적으로 또는 전체적으로 수동으로 구현될 수 있다.
본 개시내용의 장치 또는 프로그램에 의해 실현된 다양한 기능은 인공 지능(AI) 또는 머신 러닝에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 구현될 수 있다.
본 개시내용의 프로그램은 컴퓨터-판독가능한 기록 매체에 저장될 수 있거나 또는 프로그램 제품으로서 구성될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 어구 "기록 매체"는 임의의 "휴대용 물리적 매체", 예를 들면, 메모리 카드, USB 메모리, SD 카드, 플렉시블 디스크(flexible disk), 광자기 디스크(magneto-optical disk), ROM, EPROM, EEPROM, CD-ROM, MO, DVD 및 블루-레이(Blue-ray)(등록 상표) 디스크를 포함한다.
용어 "프로그램"은 임의의 언어 또는 설명 방식으로 작성된 데이터 처리 방식이며, 소스 코드(source code) 또는 바이너리 코드(binary code)와 같은 임의의 형식일 수 있다. 참고로, "프로그램"은 필수적으로 단독으로 구성된 것에 제한되지 않고, 다중 모듈 또는 라이브러리로 배포되는 것과 운영 체제(operating system; OS)로 제시되는 별도의 프로그램과 협력하여 해당 기능을 달성하는 것을 포함한다. 잘-공지된 구성 및 절차가 실시양태에 기술된 각각의 장치에서 기록 매체를 판독하기 위한 구체적인 구성, 판독 절차, 또는 판독 후 설치 절차에 대해 사용될 수 있다.
다양한 데이터베이스는 저장 수단, 예를 들면, 메모리 장치, 예를 들면, RAM, ROM; 고정 디스크 장치, 예를 들면, 하드 디스크; 플렉시블 디스크, 또는 광 디스크, 또는 다양한 처리 및 웹사이트 제공에 사용되는 다양한 프로그램, 표, 데이터베이스, 웹 페이지 파일 등이다.
더욱이, 장치의 분산 및 통합의 구체적인 형태는 도면에 나타낸 것에 제한되지 않지만, 다양한 추가에 따라 또는 기능 부담에 따라 이를 임의의 단위로 기능적으로 또는 물리적으로 배포 및 통합함으로써 전체적으로 또는 부분적으로 구성시킬 수 있다. 다시 말해서, 전술한 실시양태의 어떠한 조합도 구현될 수 있거나, 또는 실시양태가 선택적으로 구현될 수 있다.
(키트)
추가의 측면에서, 본 개시내용은 ROCK 억제제 및 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 둘 다 동결된 상태로 포함하는 동결된 제제를 함유하는 용기; 및 용기를 동결된 상태로 유지하면서 함유하는 하우징을 포함하는 동결된 제제 키트를 제공할 수 있다.
하나의 측면에서, 본 개시내용은 동결된 상태의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는 동결된 제제를 함유하는 용기; 및 용기를 동결된 상태로 유지하면서 함유하는 하우징을 포함하는 동결된 제제 키트를 제공할 수 있다.
하나의 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 따른 제제; 제제를 함유하는 용기; 및 제제를 동결된 상태로 유지하면서 용기를 함유하는 하우징을 포함하는 동결된 제제 키트를 제공할 수 있다.
하나의 측면에서, 본 개시내용은 용기; 및 용기를 함유하는 하우징을 포함하는 동결된 제제 키트를 제공할 수 있고, 용기는 본 개시내용에 따른 제제를 함유하는 데 사용되고, 하우징은 제제를 동결된 상태로 유지하는 데 사용된다.
하나의 측면에서, 본 개시내용은 키트의 용도를 제공할 수 있고, 키트는 용기; 및 용기를 함유하는 하우징을 포함하고, 용기는 본 개시내용에 따른 제제를 함유하는 데 사용되고, 하우징은 제제를 동결된 상태로 유지하는 데 사용된다.
하나의 실시양태에서, 하우징은 함유할 용기를 약 -80℃ 내지 약 -20℃ 범위의 온도에서 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하우징은 함유할 용기를 약 -80℃에서 유지할 수 있다.
(보존, 수송, 및 치료)
추가의 측면에서, 본 개시내용 제제를 용기 및 용기를 함유하는 하우징을 포함하는 키트의 용기 내에 위치시키는 단계, 및 키트 내 제제를 동결된 상태로 유지하는 단계를 포함하여, 본 개시내용에 따른 제제를 수송하고/하거나 보존하는 방법을 제공할 수 있다.
추가의 측면에서, 각막 내피 세포 주입 치료요법을 수행하기 위한 방법이 제공될 수 있고, 이러한 방법은 세포 주입 치료요법에 적합한 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 제공하는 단계; 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결시키는 단계로서, 이러한 동결시키는 단계가 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 온도를 비-동결 온도로부터 분당 1℃ 미만의 속도로 강하시키는 적어도 하나의 단계를 포함하는 단계; 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지시키고 임의로 이를 주입 치료요법으로 수송하는 단계; 및 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 해동시키는 단계; 및 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 개시내용의 방법은 온도가 비-동결 온도로부터 동결 표적 온도로 강하되는 경우, 온도를 제1 속도로 제1 표적 온도로 강하시키는 단계 및 온도를 제2 속도로 제1 표적 온도로부터 제2 표적 온도로 강하시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 본 개시내용에 기술된 하나 이상의 실시양태를 가질 수 있다.
하나의 실시양태에서, 수송은 온도를 약 -80℃ 내지 약 -20℃의 범위, 바람직하게는 -80℃에서 유지시키면서 수행할 수 있다.
대상체에 대한 투여는 바람직하게는 해동한지 6시간 이내에 수행되며, 예를 들면, 투여는 6시간 이내, 5시간 이내, 4시간 이내, 3시간 이내, 2시간 이내, 1시간 이내, 30분 이내, 20분 이내, 또는 10분 이내에 수행될 수 있다. 대상체에 대한 투여는 눈의 전 안방 내에서 수행될 수 있다.
본 개시내용은 이해의 용이성을 위해 바람직한 실시양태와 함께 상기에 설명되었다. 이후에, 본 개시내용은 실시예를 참고로 설명될 것이나, 상기 설명 및 다음의 실시예는 단지 예시 목적을 위해 제공되며 본 개시내용을 제한하려는 것이 아니다. 따라서, 본 개시내용의 내용은 본원에 구체적으로 기술된 실시양태 또는 실시예에 제한되지 않지으나, 청구범위에 의해서만 제한된다.
[실시예]
본 개시내용은 실시예를 참고로 구체적으로 설명될 것이다. 실시예에 사용된 다양한 시약은 구체적으로 나타낸 것 외에, Sigma-Aldrich, BASF Japan K.K. 등으로부터 구입할 수 있는 것으로 이해된다.
(실시예 1: 공지된 구성성분을 함유하는 냉동보존 용액에서의 동결)
글리세린 및 폴리에틸렌 글리콜은 세포 냉동보존제로서 잘-공지된 구성성분이지만, 이러한 성분은 세포를 보존하는 데 효과적이지 않다. 따라서, 알부민 또는 10% DMSO와 같은 단백질 구성성분을 일반적으로 첨가해 왔다. 본 실시예의 목적은 HCEC가 이러한 일반적인 조건 하에서 보존될 수 있는지의 여부 및 냉각 속도가 일반적으로 공지된 속도인, -1℃/min보다 느린 경우 낮은 농도의 DMSO를 사용하여도 HCEC가 냉동보존될 수 있는지의 여부를 입증하기 위한 것이다.
(물질)
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4회 계대배양(passage) 후의 인간 각막 내피 세포
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OptiMEMTM-I(Invitrogen 21585-070)
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TrypleTM 선택 효소(10x)(Thermo Fisher Scientific A12177-01)
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Sekijuji 알부민 25% 정맥내 12.5 g/50 mL(Japan Blood Products Organization)
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2.0 mL의 극저온성 바이알(Cryogenic Vial)(Corning 430488)
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프로그램가능한 냉동고(Programmable freezer)(NEPAGENE PF-NP-200)
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Bicell(Nihon Freezer Co., Ltd.)
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iMatrix-511(nippi 892012)
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Bambanker hRM(NIPPON Genetics CS-11-001)
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10% DMSO와 함께 예비제제화된 Cryostor CS10(Hemacare 210102)
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5% DMSO와 함께 예비제제화된 Cryostor CS5(Hemacare 205102)
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2% DMSO와 함께 예비제제화된 Cryostor CS2(Hemacare 202102)
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고 등급 CP-1(Kyokuto Pharmaceutical 27207)
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DMSO가 없는 Bambanker(NIPPON Genetics CS-09-001)
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CryoScarless DMSO Free(BioVerde CPL-A1)
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12-웰 플레이트(costar 3513)
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PROTEOSAVE SS 50 mL 원심분리 튜브(Sumitomo Bakelite MS-52550)
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STEMFULL 15 mL 원심분리 튜브(Sumitomo Bakelite MS-90150)
4% HSA, 10% 글리세린 또는 10% 폴리에틸렌 글리콜, 및 10%, 5%, 2%, 또는 0% DMSO를 함유하는 OptiMEM를 보존 용액으로서 사용하였다.
(방법)
1. 4회 계대배양 후의 인간 각막 내피 세포를 사용한다. 배지를 배양 디쉬로부터 배양물 속에서 제거하고, OptiMEM을 가하고, 세척한다. 이러한 과정을 2회 반복한다.
2. OptiMEM의 제거 후, TrypleTM 선택 효소(10x)를 가하고 37℃(5% CO2)에서 20분 동안 배양한다.
3. 20분 후, 배지를 현탁시키고, 50 mL의 STEMFULL 속에 수집한다.
4. 300G에서 5분 동안 원심분리한다.
5. 상층액을 제거하고 OptiMEM(2% HSA) 속에 현탁시킨다.
6. 300G에서 5분 동안 원심분리한다.
7. 단계 5 및 6을 다시 반복한다.
8. 상층액을 제거하고 OptiMEM(2% HSA) 속에 현탁시키고, 트립신 블루 염색에 의해 세포의 수를 계수한다.
9. 세포를 시험할 냉동보존 시약의 수에 상응하는 수의 15 mL의 STEMFULL 내로 분배함으로써 각각 1.2 x 106개의 세포를 함유하도록 한다. 비동결 그룹(대조군) 및 배양물로서 1000개의 세포/mm2의 세포 밀도에서 12-웰 플레이트에 세포를 씨딩하고 배지를 2일마다 교환하면서 2주 동안 배양한다.
10. 15 mL의 STEMFULL를 300 G에서 5분 동안 원심분리한다.
11. 세포를 각각 냉동보존 용액을 함유하는 동결 튜브 속에 수집하여 보존한다.
12. 프로그램가능한 냉동고 속에 4℃로부터 -80℃ 까지 -0.5℃/min에서 동결시킨다.
13. 온도가 -80℃로 강하된 경우 -80℃에서 미리 냉각시킨 Bicell 공정 하우징에 이동시키고 Bicell을 냉동고 속에서 -80℃로 3일 동안 냉동보존한다.
14. 냉동보존한지 3일 후, 동결 튜브를 해동시키며 여기서 세포는 수 욕(water bath) 속에서 37℃로 1 내지 2분 동안 보존하였다.
15. 세포를 먼저 37℃로 가온시킨 배지 속에 수집하고, 수집된 세포의 수 및 세포 생존률을 트립판 블루 염색으로 측정한다.
실시예 1의 개요는 도 1에 나타낸다.
(결과)
도 2는 본 실시예에 사용된 배양된 세포의 형태의 사진을 나타낸다. 당해 로트(lot)에서 세포는 형태학적 이상이 없는 것으로 밝혀졌다.
도 3은 기본 구성성분으로서 제공되는 4% 인간 혈청 알부민 및 10% 글리세린 및 상이한 농도의 DMSO가 들어있는 냉동보존 용액 중에서 보존하고 해동시킨 후의 세포 생존률을 비교하는 그래프를 나타낸다. 5% 이상의 DMSO가 함유되면, 냉각 속도에 상관없이 높은 생존률이 유지되었다. 그러나 2% 또는 0% DMSO에서, 냉각 속도는 세포 생존률에 유의적인 영향을 미쳤고 -0.5℃/min의 경우 90% 이상의 생존률이 유지되었다. Bicell은 동결시킬 세포용 튜브를 함유하는 하우징이며 이의 내부 온도는 -80℃의 초저온 냉동고에 넣는 경우 대략 -1℃/min의 속도로 강하된다. 세포 생존률은 -1℃/min로 프로그래밍가능한 냉동고에 보관한 경우에 비해 Bicell에 보관한 경우 더 낮았다.
도 4는 기본 구성성분으로서 4% 인간 혈청 알부민 및 10% 폴리에틸렌 글리콜 및 상이한 농도의 DMSO가 들어있는 냉동보존 용액 중에서 보존하고 해동한 후의 세포 생존률을 비교하는 그래프이다. 글리세린을 함유한 냉동보존 용액의 결과와 달리, 5% DMSO를 함유한 냉동보존 용액 중의 세포생존률 또한 냉각 속도에 영향을 받았다. 2% 이하의 DMSO를 함유하는 조성물의 경우 -0.5℃/min의 냉각 속도로 동결했을 때, 생존률은 약 80%이었고 이는 -1℃/min의 냉각 속도로 동결했을 때보다 훨씬 더 높았다. 이러한 결과는 보다 느린 냉각 속도가 생존률을 개선시킴을 나타낸다.
(실시예 2: 냉동보존 및 동결 속도의 시험)
(물질)
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4회 계대배양 후의 인간 각막 내피 세포
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OptiMEMTM-I(Invitrogen 21585-070)
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TrypleTM 선택 효소(10x)(Thermo Fisher Scientific A12177-01)
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Sekijuji 알부민 25% 정맥내 12.5 g/50 mL(Japan Blood Products Organization)
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2.0 mL 극저온성 바이알(Corning 430488)
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프로그램가능한 냉동고(NEPAGENE PF-NP-200)
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Bicell(Nihon Freezer Co., Ltd.)
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iMatrix-511(nippi 892012)
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Bambanker hRM(NIPPON Genetics CS-11-001)
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10% DMSO와 함께 예비제제화된 Cryostor CS10(Hemacare 210102)
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5% DMSO와 함께 예비제제화된 Cryostor CS5(Hemacare 205102)
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2% DMSO와 함께 예비제제화된 Cryostor CS2(Hemacare 202102)
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고 등급 CP-1(Kyokuto Pharmaceutical 27207)(10% DMSO 함유)
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DMSO가 없는 Bambanker(NIPPON Genetics CS-09-001)
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CryoScarless DMSO Free(BioVerde CPL-A1)
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12-웰 플레이트(costar 3513)
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PROTEOSAVE SS 50 mL 원심분리 튜브(Sumitomo Bakelite MS-52550)
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STEMFULL 15 mL 원심분리 튜브(Sumitomo Bakelite MS-90150)
(방법)
1. 4회 계대배양 후의 인간 각막 내피 세포를 사용한다. 배지를 배양 디쉬로부터 배양물 속에서 제거하고, OptiMEM을 가하고, 세척한다. 이러한 과정을 2회 반복한다.
2. OptiMEM의 제거 후, TrypleTM 선택 효소(10x)를 가하고 37℃(5% CO2)에서 20분 동안 배양한다.
3. 20분 후, 배지를 현탁시키고, 50 mL의 STEMFULL 속에 수집한다.
4. 300G에서 5분 동안 원심분리한다.
5. 상층액을 제거하고 OptiMEM(2% HSA) 속에 현탁시킨다.
6. 300G에서 5분 동안 원심분리한다.
7. 단계 5 및 6을 다시 반복한다.
8. 상층액을 제거하고 OptiMEM(2% HSA) 속에 현탁시키고, 트립신 블루 염색에 의해 세포의 수를 계수한다.
9. 세포를 시험할 냉동보존 시약의 수에 상응하는 수의 15 mL의 STEMFULL 내로 분배함으로써 각각 1.2 x 106개의 세포를 함유하도록 한다. 비동결 그룹(대조군) 및 배양물로서 1000개의 세포/mm2의 세포 밀도에서 12-웰 플레이트에 세포를 씨딩하고 배지를 2일마다 교환하면서 2주 동안 배양한다.
10. 15 mL의 STEMFULL를 300 G에서 5분 동안 원심분리한다.
11. 350 μL의 다양한 냉동보존 시약 속에 현탁한다.
12. 다양한 냉동보존 시약을 함유하는 17개의 15 mL의 STEMFULL에 100 μM의 최종 농도로 조정된 Y-27632(100 μL)을 가하여 450 μL의 총 용적을 만든다.
13. 450 μL의 세포를 각각의 동결 튜브(1.2 x 106개의 세포/450μL) 내로 분배한다.
14. 프로그램가능한 냉동고 속에 4℃로부터 -80℃ 까지 1℃/min 또는 -0.5℃/min으로, 또는 -0.2℃/min으로 동결시킨다.
15. 온도가 -80℃로 강하된 경우 -80℃에서 미리 냉각시킨 Bicell 공정 하우징에 이동시키고 Bicell을 냉동고 속에서 -80℃로 3일 동안 냉동보존한다.
16. 냉동보존한지 3일 후, 동결 튜브를 해동시키며, 여기서 세포는 수 욕 속에서 37℃로 1 내지 2분 동안 보존하였다.
17. 세포를 먼저 37℃로 가온시킨 배지 속에 수집하고, 수집된 세포의 수 및 세포 생존률을 트립판 블루 염색으로 측정한다.
18. 세포를 12-웰 플레이트에 수집하고 1000개의 세포/mm2의 세포 밀도에서 재씨딩한다.
19. 배지를 2일마다 교환하면서 2주 동안 배양한다.
20. 배양 7일차에, 위상차 현미경(x200) 하에 5개 시야에서 세포를 사진 촬영하고, 세포 밀도를 계산한다.
(결과)
도 5는 4℃로부터 -1℃/min, -0.5℃/min, 또는 -0.2℃/min의 냉각 속도로 동결된 세포를 해동한 후 생존률을 비교한 데이터를 나타낸다. DMSO를 함유한 동결보존제로 -1℃/min, -0.5℃/min, -0.2℃/min에서 높은 생존률을 달성하였다. DMSO가 없는 냉동보존제의 경우 세포 생존률은 냉각 속도에 반비례하여 증가하였고, 이는 보다 느린 냉각 속도가 세포 생존률을 증가시키는 데 효과적임을 시사한다. -1℃/min의 냉각 속도로 동결된 세포를 해동하여 항온처리기에 씨딩하였을 때, 바닥면에 부착되지 않은 많은 세포가 다수 관찰되었고, 이는 각막 내피 세포의 감소된 기능을 나타낸다. 이러한 발견은 각막 내피 세포의 생존률을 개선시키고 이의 기능을 유지하기 위해서 -1℃/min보다 느린 냉각 속도로의 동결이 중요함을 시사한다.
도 6은 세포를 4℃로부터 -1℃/min 또는 -0.5℃/min의 냉각 속도로 동결한 다음, 씨딩한 후 7일차에 세포 밀도를 비교한 데이터를 나타낸다. 2% DMSO가 들어있는 CS2 뿐만 아니라, 둘 다 DMSO가 없는 Bambanker DMSO Free 및 CryoScarless DMSO Free 내에서 분당 -1℃로 동결시켰을 때, 세포 밀도는 낮았다. 그러나, 분당 -0.5℃의 냉각 속도로 동결시키면, 높은 세포 밀도가 관찰되었다. 이는 냉각 속도가 또한 보존 후 배양액 속의 세포 밀도에도 영향을 미침을 나타낸다.
(실시예 3: DMSO가 첨가된 배양물의 시험)
(방법)
1. 세포를 실시예 2(단계 1 내지 10)에서와 동일한 방식으로 수집하고 세포를 Cryostor CS2를 사용하여 동결 튜브 속에 보존한다.
2. 프로그램가능한 냉동고 내에 -0.5℃/분으로 4℃로부터 -80℃까지 동결시킨다.
3. 온도가 -80℃로 강하된 경우 -80℃에서 미리 냉각시킨 Bicell 처리 하우징으로 이동시키고 Bicell을 냉동고 속에서 -80℃에서 3일 동안 냉동보존한다.
4. 냉동보존한지 3일 후, 동결 튜브를 해동시키며 여기서 세포는 수 욕 속에 37℃에서 1 내지 2분 동안 보존하였다.
5. 세포를 먼저 37℃로 가온시킨 배지 속에 수집하고, 수집된 세포의 수 및 세포 생존률을 트립판 블루 염색으로 측정한다.
6. 수집된 세포를 4개의 15 mL의 STEMFULL 내로 분배하고 300 G에서 5분 동안 원심분리한다.
7. 원심분리 후, 상층액을 제거하고, 세포 밀도를 10%, 5%, 2%, 및 0%의 DMSO를 함유하는 배지를 사용하여 1000개의 세포/mm2로 조정하고, 12-웰 플레이트 내에 재씨딩한다.
8. 세포를 씨딩 후 1 h, 3 h, 6 h, 및 24 h 차에 위상차 현미경 하에 사진을 촬영한다.
9. 세포의 사진을 각각의 시점에 취한 후, 부유하는 세포를 포함하는 모든 세포를 용기 속에 수집하고, 세포 생존률을 트립판 블루 염색으로 결정한다.
실시예 3의 개요는 도 7에 나타낸다.
(결과)
도 8은 10% 또는 5%의 DMSO가 보충된 배지에서 배양된 세포의 위상차 현미경 사진을 나타낸다. 10% 또는 5%의 DMSO를 첨가한 배지에서 배양한 세포의 수는 DMSO가 없는 배지에서 배양된 세포의 수에 비해 유의적으로 적었는데, 이는 항온처리기 (라미닌 코팅됨) 바닥에 비-부착성 세포가 많이 존재함을 나타낸다. DMSO가 없는 배지에서 배양한 세포의 대부분은 접종 후 1시간째에서도 부착성이었고, 3시간째에는 모든 세포가 부착성이었지만, 10% DMSO에서는 24시간까지 세포가 부착성이지 않았다. 5% DMSO의 경우, 1시간 후에는 거의 부착성이 없는 세포가 관찰되었고, 세포의 1/2은 3시간 및 6시간 후 부착성이었지만, 역으로, 24시간 후에는 거의 부착성이 없는 세포가 존재하였다. 도 8의 현미경 사진에서, 흰색으로 나타나는 세포는 비-부착성 세포를 나타내고, 검은색으로 나타나는 비환형 세포는 부착성 세포를 나타낸다.
도 9는 2% DMSO가 들어있거나 DMSO가 없는 배지에서 배양된 세포의 위상차 현미경 사진을 나타낸다. 2% DMSO를 함유한 배지에서 배양된 세포의 부착률은 DMSO가 없는 배지에서 배양한 세포의 부착률과 다르지 않았다.
DMSO를 함유한 조성물과 함께 세포를 눈의 전안방 내 환경에 주입하는 경우, 전 안방 액은 점차적으로 교체될 것이지만, 전 안방 액은 상당한 기간 동안 고 농도의 DMSO에 노출되는 것으로 여겨지며, 따라서, 10%와 같은 고 농도의 DMSO를 지닌 냉동보존제에 담긴 세포를 전방에 주입할 경우, 각막 내피 세포의 생존률과 부착은 심각하게 손상될 것으로 예상된다.
도 10은 재씨딩 및 수집 후 세포의 생존률의 결과를 나타낸 그래프를 나타낸다. 현미경 사진에서 거의 부착성이지 않았던(도 8), 10%의 DMSO를 함유한 배지에서 배양된 세포는 1시간째 생존률에서의 감소는 나타내지 않았다. 그러나, 생존률에서 후속적인 감소는 10%의 DMSO를 함유한 배지에서 배양된 세포가 생존률에서의 감소가 관찰되지 않았지만 이미 1시간째에 유의적인 손상됨으로써 부착할 수 없음을 시사한다.
이러한 결과를 기반으로, 전방에 주입될 세포 제제는 바람직하게는 5% 이하의 DMSO를 포함하고, 대부분 바람직하게는 2% 이하의 DMSO를 포함하거나 DMSO를 포함하지 않는다.
(실시예 4: 동결 및 해동 후 안정성의 시험)
(방법)
1. 세포를 실시예 2(단계 1 내지 10)와 동일한 방식으로 수집하고 세포를 Cryostor CS10, CS5, CS2를 사용하여 각각의 보존 액에 대해 6개의 동결 튜브에 세포를 보존한다.
2. 프로그래밍가능한 냉동고에서 4℃로부터 -80℃까지 -0.5℃/분으로 동결시킨다.
3. 온도가 -80℃로 강하된 경우 -80℃로 이미 냉각시킨 Bicell 처리 하이징에 이동시키고 Bicell을 냉동고에 -80℃에서 3일 동안 냉동보존한다.
4. 냉동보존한지 3일 후, 동결 튜브를 해동시키며 여기서 세포는 수 욕에서 37℃로 1 내지 2분 동안 보존시켰다.
5. 각 보존 용액당 1개에 대해, 미리 37℃로 가온시킨 배지에 세포를 즉시 수집하고, 트리판 블루 염색으로 세포 생존률에 대해 측정한다(0h). 각 보존 용액에 해 나머지 5개의 경우, 세포를 실온에서 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 24시간 동안 둔 다음, 동일한 방식으로 수집하여 세포 생존률을 트립판 블루 염색으로 측정한다.
6. 각 시점에서 수집한 세포를 12-웰 플레이트에 1000개의세포/mm2의 세포 밀도에서 재씨딩한다.
7. 세포를 재씨딩으로부터 24시간 배양 후 위상차 현미경 하에 사진을 찍는다.
실시예 4의 개요는 도 11에 나타낸다.
(결과)
도 12는 10% DMSO를 함유한 Cryostor CS10에서 동결시키고, 실온에서 0시간, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 또는 24시간 동안 방치한 후 T25 배양 플라스크에 재 씨딩시킨 세포의 위상차 현미경 연상을 나타낸다. 실온에서 6시간 이상 동안 둔 경우, 세포 증식 및 접착능에서의 감소가 관찰되었습니다.
도 13은 5% DMSO를 함유하는 Cryostor CS5에 동결시키고, 실온에서 0시간, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 또는 24시간 동안 둔 다음, T25 배양 플라스크에 재씨딩하고, 24시간 후에 배양물에서 사진찍은 세포의 위상차 현미경 영상을 나타낸다. 실온에서 6시간 동안 방치한 세포에서 세포 증식 및 부착능에서 약간의 감소가 관찰되었지만, 감소 정도는 CS5에 비해 더 낮았다.
도 14는 2% DMSO를 함유하는 Cryostor CS2에서 동결시키고, 실온에서 0시간, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 또는 24시간 동안 둔 다음, T25 배양 플라스크에 재씨딩하고, 24시간 후에 배양물에서 사진찍은 세포의 위상차 현미경 영상을 나타낸다. 실온에서 6시간 방치한 세포에서조차 변화는 관찰되지 않는다.
도 15는 재씨딩 및 수집 후 세포의 생존률의 결과를 나타내는 그래프이다. 이러한 결과는 5% 이하, 바람직하게는 2% 이하의 DMSO를 함유하는 냉동보존제 속에서 동결시킨 세포 제제가 해동 후에도 안정하고 임상 사용에 매우 편리하다는 것을 시사한다.
(실시예 5: VIXELLTM 속에서 냉동보존 및 보존 후 각막 내피 세포의 주입)
드라이 아이스를 충전시킴으로써 VIXELLTM를 -75℃ ± 15℃를 18일 동안 유지할 수 있다. 본 실시예에서는, VIXELL™을 사용하여 각막 내피 세포를 보존 및 수송한 후, 각막 내피 세포를 주입한다.
(방법)
(냉동보존)
1. 배양된 각막 내피 세포를 수집하고 세포를 1.2 x 106개의 세포/450 μL의 세포 밀도에서 100 μM의 Y27632가 보충된 CryoStor(등록 상표) CS2에 세포를 현탁시킨다.
2. 바이알을 프로그램가능한 냉동고를 사용하여 온도를 4℃로부터 -80℃까지 -0.5℃/min의 속도로 강하시킴으로써 동결시킨다.
3. 보존된 바이알을 BicellTM에 두고 초저온 냉동고에 -80℃에서 1회 보존한다.
4. 보존된 바이알을 제거하고 이를 드라이 아이스를 함유하는 VIXELLTM 속에 5일 동안 보존한다.
(세포 주입)
각막 내피 세포가 직경이 8 mm인 영역에서 탈착된 동물 모델에 Cryostor CS2에 냉동보존하고 의약품 수송용 냉 박스(VIXELLTM)에 5일 동안 보존한 배양된 인간 각막 내피 세포를, 전방 유액의 주입없이, 주입함으로써 생체 내에서 각막 내피 재생의 역학을 관찰하였다.
[표 1]
3시간의 복와위 자세를 완료한 후, 1, 2, 3, 5일차에 세극-등 현미경(slit-lamp microscopy)으로 전안(anterior eye)을 관찰하여 염증 및 감염에 대해 점검하였다. 수술 전날, 수술 당일, 및 수술 후 2, 4일차에, 5 mg/mL의 프로그라프 주입액(Prograf injection solution)을 100 mL의 식염수로 희석하고, 총 6 ml의 용적을 후이개 정맥(posterior auricular vein)에 주입하였다. 안락사 및 면역염색을 수술 후 1일 및 5일차에 수행하였다.
(결과)
도 16은 냉각 냉 박스에 5일간 보관하고 해동한 후 세포의 생존률 및 세포 회수율을 나타낸다. 생존률은 5일차의 생존 세포의 수/전체 세포의 수로서 계산하였다. 세포 회복율은 이론적인 세포 수(채워진 세포의 수)를 100%로 한 회복율로서 정의하였다.
냉 박스에 보존된 세포가 정상적인 형태를 유지하는지를 확인하기 위해, 세포를 해동하고 원심분리에 의해 동결보존제로부터 제거하고, 평소와 같이 8% FBS를 함유하는 OPTI-MEM 배지(Y27632를 또한 함유함)에 재현탁하고, T25 배양 플라스크에 씨딩하고, 2일 동안 배양하였다. 도 17은 냉 박스에 보존한 후 2일 동안 배양한 세포의 현미경 사진을 나타낸다. 세포는 항온처리기 바닥에 냉동되지 않은 세포와 동일한 형태로 부착되었고, 정상적인 형태가 유지되었음이 확인되었다.
도 18은 냉 박스에 보존 한 후의 세포를 주입한 토끼 눈의 사진을 나타낸다. 각막 내피 세포의 생착으로 인해 각막의 투명성이 유지되었다.
도 19는 세포 주입 후 1일차에 각막 내피 세포에서 CD166에 대한 면역조직화학적 염색의 사진을 나타낸다. 각막 내피 세포 조직을 고정하고 1차 항체로서, 각막 내피 세포의 발현 마커 중 하나인, CD166에 대한 항체에 1차 항체에 결합시킨 후 형광 표지된 2차 항체에 결합시킴으로써 면역조직화학적으로 염색하였다. 주입된 세포는 단층으로 깔끔하게 이식되었고, CD166의 강력한 발현을 입증하였다. 상부 열은 각막의 중앙 부분을 나타내고 하부 열은 주변 부분을 나타낸다. 인간 CD166에만 결합하는 항체로 염색을 수행하였기 때문에, 토끼 각막 내피 세포는 염색되지 않고 명확한 경계가 확인되었다.
도 20은 세포 주입 후 1일째에 ZO-1 및 Na/K ATPase에 대한 면역조직화학적 염색의 사진을 나타낸다. ZO-1 및 Na/K ATPase는 각막 내피 세포에서 기능성 분자로서 발현된다. 도 21은 세포 주입 후 5일차에 각막 내피 세포에서 CD166, ZO-1, 및 Na/K ATPase에 대한 면역조직화학적 염색의 사진을 나타낸다.
이러한 결과는 나타낸 각막 내피 세포가 이식되어 각막 내피에서 정상적으로 기능함을 나타낸다.
(실시예 6: -0.7℃/min의 냉각 속도로 동결)
본 실시예의 목적은 실시예 1과 같이 공지된 성분을 함유하는 냉동보존 용액 및 실시예 2에서와 같이 상업적으로 이용가능한 보존 용액에서 4℃에서 -0.7℃/min의 냉각 속도로 동결시킨 경우 각막 내피 세포의 생존률을 입증하기 위한 것이다.
도 22 및 24는 본 실시예의 개요를 나타낸다.
(결과)
도 23은 기본 구성성분으로서 제공되는 4% 인간 혈청 알부민 및 10% 글리세린 및 상이한 농도의 DMSO가 들어있는 냉동보존 용액 중에서 -1℃/min, -0.7℃/min, -0.5℃/min, 또는 -0.2℃/min의 냉각 속도로 동결시킨 후 세포 생존률을 비교하는 그래프를 나타낸다. 10%의 DMSO를 함유한 냉동보존 용액의 경우, -0.5℃/min 및 -0.2℃의 냉각 속도로 동결시켰을 때 생존률이 개선되는 경향이 관찰되었다. 5%의 DMSO를 함유하는 냉동보존 용액의 경우, -0.7℃/min, -0.5℃/min, 및 -0.2℃의 냉각속도로 동결시켰을 때 생존률이 개선되는 경향이 관찰되었다. 2% DMSO를 포함하고 DMSO를 포함하지 않는 냉동보존 용액은 -0.7℃/min, -0.5℃/min 및 -0.2°C의 냉각 속도로 냉동시켰을 때 생존률에서 유의적인 개선을 나타내었다.
도 25는 상업적으로 이용가능한 냉동보존 용액 중에서 4℃로부터 -0.7℃/min의 냉각 속도로 동결시키고 해동한 후 세포 생존률 및 회복률을 나타낸다. 생존률은 생존 세포 수/전체 세포 수로 계산되었습니다. 세포 회수율은 이론적인 세포 수(충전된 세포 수)를 100%로 한 회복율로 정의하였다. 도 26은 상업적으로 이용가능한 냉동보존 용액 중에서 4℃로부터 -1℃/min 또는 -0.7℃/min의 냉각 속도로 냉동하고 해동시킨 후 세포 생존률을 비교하는 데이터를 나타낸다. 도 27은 상업적으로 이용가능한 냉동보존 용액 중에서 4℃로부터 -0.5℃/min 또는 -0.2℃/min의 냉각 속도로 냉동하고 해동한 후 세포 생존률을 비교하는 데이터를 나타낸다. DMSO가 들어있지 않은 냉동보존 용액의 경우, -1℃ 냉각속도로 동결했을 때와 비교하여 -0.7℃/min, -0.5℃/min, 및 -0.2℃/min의 냉각속도로 동결했을 때 생존률의 유의적인 개선이 관찰되었다.
실시예 1 및 2와 본 실시예의 결과를 기반으로, 세포 생존률은 -0.7℃/분 또는 더 느린 냉각 속도로 동결하고 보존함으로써 개선된다. 특히, 2%로 낮은 DMSO를 함유하는 냉동보존 용액 및 DMSO가 들어있지 않은 냉동보존 용액 중에서 생존률에서의 유의적인 개선이 관찰되었다. 따라서, 본 개시내용의 방법은 냉동보존시 DMSO를 감소시킬 수 있다.
(실시예 7: 유리 바이알 제제에서 냉동보존)
본 실시예에서는, 냉동보존을 유리 바이알에서 수행하였다. 하기 나타낸 바와 같이, 느린 냉각 속도로의 동결은 용기와 상관없이 높은 생존률으로의 보존을 허용한다.
(물질 및 방법)
세포를 실시예 2(단계 1 내지 10)에서와 동일한 방식으로 수집하고, 세포를 다음의 보존 용액 및 냉각 속도로 유리 바이알에 보존하였다.
·
대조군 그룹: 보존 용액: CS2 + Y-27632(100 μM), 동결 속도: -0.5℃/min(-80℃까지)
HSA 첨가 그룹: 보존 용액: CS2 + Y-27632 (100 μM) + 4% HSA, 냉각속도: -0.5℃/min(-80℃까지)
· 속도 (1) 그룹: 보존 용액: CS2 + Y-27632(100 μM), 동결 속도: -0.5℃/min(-10℃까지), 110분 동안(-10℃), -1.0℃/min(-80℃까지)으로 유지
·
속도 (2) 그룹: 보존 용액: CS2 + Y-27632(100 μM), 동결 속도: -0.1℃/min(-10℃까지), -1.0℃/min(-80℃까지)
(결과)
도 29 내지 31은 온도 전이를 나타낸다. 샘플 온도에서의 급격한 상승은 냉각 동안 방출되는 잠열로 인해 발생한다. -0.5℃/min에서 -80℃까지 샘플을 동결시켰을 때 샘플은 85% 이상의 높은 생존률으로 보존되었음이 밝혀졌다. 샘플을 HSA와 함께 가하고 동일한 냉각 조건하에 보존한 경우, 생존률이 더욱 증가하여 90%를 초과하였다. 유사하게, 샘플을 느린 속도로 -10℃까지 냉각시키고(및 이후에 일정 시간 동안 -10℃를 유지할 수 있음), -1.0℃/분의 속도로 냉각시킨 다음, 보존하는 경우, 생존률은 90%를 초과하였고 이는 대조군의 것보다 더 높았다(도 28). 모든 보존 그룹에서 세포 형태의 이상은 관찰되지 않았다.
따라서, 세포를 느린 냉각 속도로 동결시키고, 이를 용기에 관계없이 보존함으로써 세포를 높은 생존률으로 보존할 수 있음이 밝혀졌다. 또한 세포 생존률은 세포를 느린 속도로 특정 온도까지 냉각한 다음(이후 온도를 일정 시간 동안 유지시킬 수 있음) 세포를 더 빠른 속도로 냉각하고 이를 보존함에 의해 추가로 개선되었음이 밝혀졌다.
본 개시내용이 본 개시내용의 바람직한 실시양태와 함께 상기에 예시되었지만, 본 개시내용이 청구범위에 의해서만 해석되어야 한다는 것이 이해되어야 한다. 본원에 인용된 특허, 특허원, 및 참고문헌은 본원에 구체적으로 제시된 바와 같이 이의 전문이 참고로 본원에 포함될 수 있음이 이해되어야 한다. 본 출원은 2021년 11월 11일자로 출원된, 일본 특허 출원 제2021-184246호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
[산업적 이용가능성]
감소된 농도의 DMSO 또는 DMSO가 들어있지 않은 냉동보존 용액에서 각막 내피 세포를 동결시키는 방법 및 환자에게 직접 투여할 수 있는 동결된 세포 제제를 생산하는 방법이 제공된다. 따라서, 상기 제제는 세포이식 등에 사용될 수 있으며, 약제학적 분야에서도 이용 가능하다.
Claims (77)
- 각막 내피 세포(corneal endothelial cell) 및/또는 각막 내피-유사 세포(corneal endothelium-like cell)를 보존하기 위한 방법으로서, 이러한 방법이:
비-동결 상태(non-frozen state)의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결시키는 단계로서, 이러한 동결시키는 단계가 온도를 비-동결 온도로부터 동결 표적 온도(freezing target temperature)로 변화시키는 경우 분당 1℃ 미만의 속도로 온도를 강하시키는 적어도 하나의 단계를 포함하는 단계; 및
임의로 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지시키는 단계를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지시키는 단계가 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결 유지 온도에서 유지시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제3항에 있어서, 동결 유지 온도가 약 -80℃ 내지 약 -10℃의 범위의 온도인, 방법.
- 제3항에 있어서, 동결 유지 온도가 약 -196℃ 내지 약 -10℃의 범위의 온도인, 방법.
- 제3항에 있어서, 동결 유지 온도가 약 -30℃ 이하의 온도인, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 비-동결 온도로부터 분당(per minute) 약 0.1℃ 내지 약 0.9℃의 속도로 온도가 강하되는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 비-동결 온도로부터 분당 약 0.2℃ 내지 약 0.8℃의 속도로 온도가 강하되는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 비-동결 온도로부터 분당 약 0.7℃의 속도로 온도가 강하되는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 비-동결 온도로부터 분당 약 0.2℃ 내지 약 0.7℃의 속도로 온도가 강하되는, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 비-동결 온도가 약 0℃ 내지 약 42℃의 범위의 온도인, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 비-동결 온도가 약 0℃ 내지 약 37℃의 범위의 온도인, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 비-동결 온도가 약 4℃ 내지 약 23℃의 범위의 온도인, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 동결시키는 단계가 약 -20℃ ± 10℃의 온도 범위 중 적어도 일부에서 분당 1℃ 미만의 속도로 온도를 강하시키는 적어도 하나의 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 동결시키는 단계가 온도를 약 -20℃ ± 10℃의 범위로 일정 시간 이상 동안 유지시키는 적어도 하나의 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 약 7% 미만의 DMSO를 함유하는 보존 용액 중에서 보존되는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 약 5% 이하의 DMSO를 함유하는 보존 용액 중에서 보존되는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 약 2% 이하의 DMSO를 함유하는 보존 용액 중에서 보존되는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 DMSO를 함유하지 않는 보존 용액 중에서 보존되는, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 동결시키는 단계가 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 ROCK 억제제의 존재하에 동결시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 동결시키는 단계가 온도를 제1 속도로 제1 표적 온도까지 강하시키는 단계 및 온도를 제2 속도로 제1 표적 온도로부터 제2 표적 온도까지 강하시키는 단계를 포함하고, 제1 속도는 분당 1℃ 미만이고 제2 속도보다 더 느린, 방법.
- 제21항에 있어서, 동결시키는 단계가 온도를 제1 표적 온도로 강하시키는 단계 및 이후에 온도를 제1 표적 온도에서 유지시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 제1 표적 온도가 약 -20℃ 내지 약 -5℃의 범위의 온도인, 방법.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 제1 표적 온도가 약 -15℃ 내지 약 -10℃의 범위의 온도인, 방법.
- 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 표적 온도가 약 -20℃ 이하의 온도인, 방법.
- 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 표적 온도가 약 -196℃ 내지 약 -80℃의 범위의 온도인, 방법.
- 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 속도가 분당 약 0.5℃ 내지 약 0.05℃의 속도인, 방법.
- 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 속도가 분당 약 0.3℃ 내지 약 0.1℃의 속도인, 방법.
- 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 속도가 분당 약 0.5 내지 약 5℃의 속도인, 방법.
- 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 속도가 분당 약 1 내지 약 3℃의 속도인, 방법.
- 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 동결된 제제를 생산하기 위한 방법으로서, 이러한 방법이:
약제학적으로 허용되는 구성성분(component)과 임의로 혼합된 비-동결 상태의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결시킴으로써 동결된 제제를 생산하는 동결시키는 단계로서, 이러한 동결시키는 단계는 온도를 비-동결 온도로부터 동결 표적 온도로 변화시키는 경우 분당 1℃ 미만의 속도로 온도를 강하시키는 적어도 하나의 단계를 포함하는 단계; 및
임의로 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 동결된 제제를 동결된 상태로 유지시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제31항에 있어서, 제2항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 방법에 기술된 하나 이상의 특징을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 동결된 제제(frozen formulation).
- 제33항에 있어서, 동결된 제제가 약 1 x 105 내지 약 3 x 106개의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는, 동결된 제제.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, 동결된 제제가 약 50 μL 내지 약 600 μL의 용적을 갖는, 동결된 제제.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 동결된 제제가 용량(dose) 당 약 50 μL 내지 약 350 μL의 용적으로 투여되는, 동결된 제제.
- 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 보존하기 위한 장치(device)로서, 이러한 장치가:
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 함유하기 위한 용기(container)를 함유하는 하우징(housing)/보존기(preserver);
하우징/보존기에 함유된 용기 내 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 온도를 제어하는 지시사항을 제공하는 온도 제어기(temperature controller); 및
온도 제어기로부터의 지시사항을 기반으로 하우징/보존기 내 온도를 조절할 수 있는 온도 조절기를 포함하고,
온도 조절기는 온도를 비-동결 온도로부터 동결된 표적 온도로 강하시키는 경우 분당 1℃ 미만의 속도로 온도를 변화시키는 적어도 하나의 단계를 포함하고 임의로 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지시키기 위해 온도를 제어하는 지시사항을 제공할 수 있는, 장치. - 컴퓨터가 장치 내에 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 보존하기 위한 방법을 실행하도록 하기 위한 프로그램으로서, 상기 장치는:
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 함유하기 위한 용기를 함유하는 하우징/보존기;
하우징/보존기에 함유된 용기 내 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 온도를 제어하는 지시사항을 제공하는 온도 제어기; 및
온도 제어기로부터의 지시사항을 기반으로 하우징/보존기 내 온도를 조절할 수 있는 온도 조절기를 포함하고,
프로그램은 온도 제어기가:
온도를 비-동결 온도로부터 동결 표적 온도로 강하시키는 경우 온도를 분당 1℃ 미만의 속도로 변화시키는 적어도 하나의 단계를 포함하도록 온도를 제어하는 단계; 및
임의로 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지하는 단계를 실행하도록 하는, 프로그램. - 컴퓨터가 장치 내에서 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 보존하기 위한 방법을 실행하도록 하기 위한 프로그램을 저장하는 기록 매체(recording medium)로서, 상기 장치는:
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 함유하기 위한 용기를 함유하는 하우징/보존기;
하우징/보존기에 함유된 용기 내 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 온도를 제어하는 지시사항을 제공하는 온도 제어기; 및
온도 제어기로부터의 지시사항을 기반으로 하우징/보존기 내 온도를 조절할 수 있는 온도 조절기를 포함하고,
프로그램은 온도 제어기가:
온도를 비-동결 온도로부터 동결 표적 온도로 강하시키는 경우 온도를 분당 1℃ 미만의 속도로 변화시키는 적어도 하나의 단계를 포함하도록 온도를 제어하는 단계; 및
임의로 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지하는 단계를 실행하도록 하는, 기록 매체. - 7% 미만의 DMSO; 및
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는 동결된 제제. - 7% 미만의 DMSO; 및
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는 동결된 제제로서,
동결된 제제는 해동 후 눈에 직접 투여될 수 있는, 동결된 제제. - 7% 미만의 DMSO; 및
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는 동결된 제제로서,
DMSO 및 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포는 느리게 동결된 상태로 존재하는, 동결된 제제. - 7% 미만의 DMSO;
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포; 및
식염수(saline) 구성성분을 포함하는 동결된 제제로서,
DMSO, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포, 및 식염수 구성성분은 동결된 상태로 존재하는, 동결된 제제. - 7% 미만의 DMSO;
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포; 및
배지(medium) 구성성분을 포함하는 동결된 제제로서,
DMSO, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포, 및 배지 구성성분은 동결된 상태로 존재하는, 동결된 제제. - 7% 미만의 DMSO; 및
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는, 해동 후 장기간 안정한 동결된 세포 제제. - 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 동결된 제제가 약 5% 이하의 DMSO를 포함하는, 동결된 제제.
- 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 동결된 제제가 약 2% 이하의 DMSO를 포함하는, 동결된 제제.
- 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 동결된 제제가 DMSO를 포함하지 않는, 동결된 제제.
- 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, ROCK 억제제를 추가로 포함하는, 동결된 제제.
- 제49항에 있어서, ROCK 억제제가 Y-27632인, 동결된 제제.
- ROCK 억제제; 및
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는 동결된 제제로서,
ROCK 억제제 및 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 동결된 상태로 존재하는, 동결된 제제. - ROCK 억제제; 및
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포; 및
식염수 구성성분을 포함하는 동결된 제제로서,
ROCK 억제제, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포, 및 식염수 구성성분이 동결된 상태로 존재하는, 동결된 제제. - ROCK 억제제;
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포; 및
배지 구성성분을 포함하는 동결된 제제로서,
ROCK 억제제, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포, 및 배지 구성성분이 동결된 상태로 존재하는, 동결된 제제. - 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포; 및
ROCK 억제제를 포함하는, 해동 후 장기간 안정한 동결된 세포 제제. - 제54항에 있어서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 해동 후 실온에서 적어도 6시간 동안 적어도 80%의 생존률(viability)을 갖는, 동결된 제제.
- 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포; 및
ROCK 억제제를 포함하는 동결된 제제로서,
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포 및 ROCK 억제제가 느리게 동결된 상태로 존재하고,
제제가 해동 후 투여된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 생체 내(in vivo) 생착(engraftment) 및 생존을 억제하지 않는, 동결된 제제. - 7% 미만의 DMSO;
ROCK 억제제; 및
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는 동결된 제제로서,
DMSO, ROCK 억제제, 및 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 느리게 동결된 상태로 존재하는, 동결된 제제. - 제50항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, ROCK 억제제가 Y-27632인, 동결된 제제.
- 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 약 7% 미만의 DMSO를 포함하는, 동결된 제제.
- 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 약 5% 이하의 DMSO를 포함하는, 동결된 제제.
- 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 약 2% 이하의 DMSO를 포함하는, 동결된 제제.
- 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 DMSO를 포함하지 않는, 동결된 제제.
- 제30항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 느리게 동결된 상태의 세포를 포함하는, 동결된 제제.
- 제30항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 비-동결 온도로부터 분 당 1℃ 미만의 속도로 온도를 강하시킴으로써 동결되는, 동결된 제제.
- 제40항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포가 세포 주입 치료요법(cell infusion therapy)에 사용되는, 동결된 제제.
- 제40항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 동결된 제제가 추가의 가공 또는 배양없이 해동 후 투여되는, 동결된 제제.
- 제40항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 약 1 x 105 내지 약 3 x 106개의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 포함하는, 동결된 제제.
- 제40항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가, 용적이 약 50 μL 내지 약 600 μL인, 동결된 제제.
- 제40항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 용량 당 약 50 μL 내지 약 350 μL의 용적으로 투여되는, 동결된 제제.
- 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 포함하는 동결된 제제를 함유하는 용기; 및
용기를 함유하면서 이를 동결된 상태로 유지하는 하우징을 포함하는, 동결된 제제 키트(kit). - 제70항에 있어서,
동결된 제제가 제30항 내지 제59항 중 어느 하나에 따른 제제인, 동결된 제제. - 제40항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 제제;
제제를 함유하는 용기; 및
용기를 함유하면서 제제를 동결된 상태로 유지하는 하우징을 포함하는 동결된 제제 키트. - 용기; 및
용기를 함유하는 하우징을 포함하는 동결된 제제 키트로서,
용기는 제40항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 제제를 함유하는 데 사용되고, 하우징은 제제를 동결된 상태로 유지하는 데 사용되는, 동결된 제제 키트. - ROCK 억제제 및 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포 둘 다를 동결된 상태로 포함하는 동결된 제제를 함유하는 용기; 및
용기를 함유하면서 이를 동결된 상태로 유지하는 하우징을 포함하는 동결된 제제 키트. - 키트의 용도로서, 키트가
용기; 및
용기를 함유하는 하우징을 포함하고,
용기는 제40항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 제제를 함유하는 데 사용되고, 하우징은 제제를 동결된 상태로 유지하는 데 사용되는, 키트의 용도. - 제40항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 제제를 수송(transporting)하고/하거나 보존하기 위한 방법으로서, 이러한 방법이:
제제를 용기 및 용기를 함유하는 하우징을 포함하는 키트의 용기 내에 위치시키는 단계; 및
키트 내 제제를 동결된 상태로 유지시키는 단계를 포함하는 방법. - 각막 내피 세포 주입 치료요법을 수행하기 위한 방법으로서, 이러한 방법이:
세포 주입 치료요법에 적합한 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 제공하는 단계;
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결시키는 단계로서, 동결시키는 단계가 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포의 온도를 비-동결 온도로부터 분당 1℃ 미만의 속도로 강하시키는 적어도 하나의 단계를 포함하는 단계;
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 동결된 상태로 유지하고 임의로 이를 주입 치료요법에 수송하는 단계;
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 해동하는 단계; 및
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피-유사 세포를 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
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