KR20150018653A - 무단백질·무지질 배지 순화 세포주, 이의 제조 방법 및 배지 - Google Patents
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Abstract
[과제]
안전성에 염려가 없는, 안정적인 유전자 재조합 단백질의 생산에 이용하는 것이 가능하며, 부유상태로 증식 가능하고, 저단가로 배양 가능한, 중국 햄스터 난소(CHO) 유래 세포주를 제공한다. 또한, 무단백질·무지질 배지를 사용하여 CHO 세포의 배지 순화법, 이를 사용하는 배지 등을 제공한다.
[해결수단]
외인성의 증식인자를 함유하지 않는 무단백질·무지질 배지에 있어서 부유상태로 증식 가능한 것을 특징으로 하고, CHO 세포 유래의 무단백질·무지질 배지 순화 세포의 세포.
안전성에 염려가 없는, 안정적인 유전자 재조합 단백질의 생산에 이용하는 것이 가능하며, 부유상태로 증식 가능하고, 저단가로 배양 가능한, 중국 햄스터 난소(CHO) 유래 세포주를 제공한다. 또한, 무단백질·무지질 배지를 사용하여 CHO 세포의 배지 순화법, 이를 사용하는 배지 등을 제공한다.
[해결수단]
외인성의 증식인자를 함유하지 않는 무단백질·무지질 배지에 있어서 부유상태로 증식 가능한 것을 특징으로 하고, CHO 세포 유래의 무단백질·무지질 배지 순화 세포의 세포.
Description
본 발명은, 실질적으로 단백질 및 지질을 포함하지 않는 배지에 적응한 신규 배양 세포주, 이의 제조 방법, 이의 배양주를 배양하기 위한 배지, 및 유전자 재조합 단백질 생산에 있어서 이의 이용에 관한다.
의약품의 시장에 있어서 바이오 의약품의 시장 점유율(market share)은 급격하게 확대되고 있다. 중에서도 효소, 호르몬, 항체, 성장인자, 혈액 응고 인자 등의 유전자 재조합 단백질 제제의 증대는 현저하며, 이들 의약품의 안정 제공을 위하여 안전하고 저렴한 가격으로 효율이 좋은 유전자 재조합 단백질 생산계(生産系)의 확립이 요구되고 있다.
종래에, 유전자 재조합 단백질은 생산성 및 효율 면에서 대장균 등으로 만들어지고 있다. 그러나, 대장균의 생산계에서는 단백질의 고차구조(高次構造)를 재현하기 어렵고, 당쇄 수식(糖鎖修飾) 등의 번역 후 수식이 가능하지 않다는 단점이 있다. 이를 위해, 활성에 고차구조나 번역 후 수식이 관여하는 사이토카인, 효소, 항체 의약 등을 포함하는 유전자 재조합 단백질 제제는 보통, 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary; CHO) 세포를 이용하여 생산되고 있다.
CHO 세포를 사용하는 생산계에 있어서는 문제점이 존재한다. 최근까지, CHO 세포의 배양에는 혈청이나 이종동물(異種動物) 유래의 생체물질이 사용되어왔다. 그러나, 혈청이나 이종동물 유래의 생체물질은, 동물 기원의 바이러스 등에 의한 감염 위험(risk)나 이종동물 항원에 의한 알레르기(allergy)등의 안전성에 관하여 문제를 초래한다. 또한, 로트(lot)간 차이 등, 생체 물질을 사용하는 것에는 안정성에 따르는 문제도 있다. 이에 따라, 혈청 등의 생체 물질을, 화학합성 또는 유전자 재조합 등으로 제조된 성분으로 옮겨놓은 완전 합성 배지도 개발되어있다(비특허문헌 1: Sumstrom 등, 2000). 그러나, 화학합성 또는 유전자 재조합에 따르는 성분, 구체적으로 증식 인자는 고가인 동시에 불안정하여, 산업적으로는 이들 물질 또는 증식 인자를 더하지 않고 배양할 수 있는 것이 요구된다.
CHO 세포의 배양에서 이러한 인자를 제거하는 방법으로서, 생체 유래 물질 또는 증식 인자를 전혀 포함하지 않는 환경에서, 시간을 들여서 세포를 순화시키는 배지 순화법(培地馴化法)이 있다. 세포는 환경에 적응하는 능력을 가지고 있어, 최저한의 필수 영양소뿐인 환경에서도, 시간을 들여서 적응시키는 것이 가능하다는 것은 예전부터 공지되어있다(비특허문헌 2: Kagawa 등, 1969, 비특허문헌 3: Kagawa 등, 1970). 단백질 발현계에서는 CHO 세포에 목적 단백질의 cDNA를 짜 넣은 벡터(vector)를 유전자 도입하여 발현시킬 때, 목적의 유전자가 편입된 세포를 선택하기 하기 위해서, 약제내성 유전자에 의한 형질전환이 수행된다. 목적 단백질의 유전자 도입 이외에 여분의 형질전환을 수행하면, 선별하는 방법이 한정되므로, 여분의 유전자 도입은 수행하지 않는 것이 바람직하다. 배지 순화법으로는, 세포 자신이 환경에 적응해가기 위하여, 유전자 도입 등의 여분의 유전자적인 개변(改?) 조작을 수행할 필요가 없다. 그 의미로는, 배지 순화법은 목적 유전자의 도입에 대하여 자유도가 높은 방법이다. 그러나, 배지 순화법은 시간과 노력이 드는데다 성공률도 낮아, 생산성이 높은 CHO 세포주 유래의 순화세포를 얻는 것은 시도되지 않았다.
더욱이, CHO 세포에는 다른 문제가 있다. 본래, CHO 세포는 접착성의 세포로서, 산업용의 물질 대량 생산에 사용되고 있는 생물 반응기(bioreactor) 등의 용기(tank) 배양에 따른 생산에는 적합하기 않다. 접착성의 세포는 용기 벽(容器壁)에 접착해서 증식하기 때문에 넓은 세포 접착 면적이 필요로 된다. 이러한 접착 면적을 확보하기 위하여, 적층형(積層型) 내지는 공중섬유형(中空纖維型) 등의 고밀도 배양 장치나, 마이크로 운반체(micro carrier)와 같은 접착성 담체(carrier)를 사용하는 것으로써, 배양 장치의 복잡화나 생산 단가(cost)의 증대 등의 문제가 생긴다. 또한, 세포를 부유화(浮遊化) 시키기 위한 담체나 계면활성제 등의 부유제를 사용하는 것이 있다. 담체는 생산 단가를 밀어 올린다. 한편, 계면활성제는 세포 상해성(傷害性)이 있어, 세포에 대하여 독성을 나타내는 경우가 있기 때문에, 생산물의 정제 시, 불순물로서 제거할 필요가 있어, 정제에 장해가 되는 것이 있다. 따라서, 이러한 부유제를 사용하는 것 없이 CHO 세포를 부유시키는 것이 요구되고 있다.
Sunstrom NA, Gay RD, Wong DC, Kitchen NA, DeBoer L, Gray PP. Insulin-Like Growth Factor-I and Transferrin Mediate Growth and Survival of Chinese Hamster Ovary Cells. Biotechnol Prog., 2000; 16: 698-702.
Kagawa Y, Takaoka T, Katsuta H. Mitochondria of mouse fibroblasts, L-929, cultured in a lipid- and protein-free chemically defined medium. J Biochem., 1969; 65: 799-808.
Kagawa Y, Takaoka T, Katsuta H. Absence of essential fatty acids in mammalian cell strains cultured in lipid-and protein-free chemically defined synthetic media. J Biochem., 1970; 68: 133-6.
본 발명은, 상기 사정(事情)에 따라 이루어진 것으로, 안전성의 염려가 없고, 안정적인 유전자 재조합 단백질의 생산에 사용되는 것이 가능하며, 부유 형태로 증식 가능하여, 저 단가로 배양 가능한 CHO 유래 세포주, 또한 생체 유래 물질이나 고가로 불안정한 인자에 의존하지 않고 고 증식성의 무단백질·무지질 배지 순화 CHO 세포주를 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명은, 또한, 무단백질·무지질 배지를 사용한 CHO 세포의 배지 순화법, 이들에서 사용되는 배지 등을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자는, 배지 순화법을 사용한 단백질성 생체 물질이나 증식 인자, 지질류를 포함하지 않는 무단백질·무지질 배지에 순화한 CHO 세포주를 수립하는 것을 성공하였다. 따라서, 본 발명은 이하의 것을 제공한다.
(1) 외인성의 증식인자를 포함하지 않는 무단백질·무지질 배지에 있어서 부유상태로 증식 가능한 것을 특징으로 하는, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 유래의 무단백질·무지질 배지 순화 세포주의 세포;
(2) 세포주는 수탁번호 NITE P-01641인, 상기 (1) 기재의 세포;
(3) 주화된 CHO 세포 유래의 무단백질·무지질 배지 순화 세포를 배양하기 위한 무단백질·무지질 배지로서, 통상의 3 내지 5 배의 포도당을 함유하는 DMEM 배지에, 추가로 푸트레신(putrescine), 티민(thymine), 히포크산틴(hypoxanthine) 및 모노에탄올아민(monoethanolamine)을 포함하는, 외인성 증식 인자를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 배지;
(4) 2000 내지 5000 ㎎/ℓ의 포도당(glucose), 0.001 내지 2 ㎎/ℓ의 푸트레신, 0.01 내지 1 ㎎/ℓ의 티민, 0.1 내지 10 ㎎/ℓ의 히포크산틴 및 0.1 내지 5 ㎎/ℓ의 모노에탄올아민을 함유하는, 상기 (3) 기재의 무단백질·무지질 배지;
(5) 1 내지 20 ㎎/ℓ의 인슐린을 추가로 포함하는, 상기 (3) 또는 (4) 기재의 무단백질·무지질 배지;
(6) 상기 (3) 내지 (5)의 어느 하나 항 기재의 배지를 제조하기 위한 조성물로서, 배지로서 사용할 때의 각 성분의 최종농도가 DMEM 배지의 조성에, 2000 내지 5000 ㎎/ℓ의 포도당(glucose), 0.001 내지 2 ㎎/ℓ의 푸트레신, 0.01 내지 1 ㎎/ℓ의 티민, 0.1 내지 10 ㎎/ℓ의 히포크산틴 및 0.1 내지 5 ㎎/ℓ의 모노에탄올아민을 함유하는 것이 되도록 이들의 각 성분을 포함하는 조성물;
(7) CHO 세포를, 상기 (3) 내지 (5) 중 어느 하나 항 기재의 배지에 계대 배양 하는 공정을 포함하는, 상기 (1) 기대의 순화 세포주의 제작 방법;
(8) CHO 세포를, 단백질 및/또는 지질 또는 이들을 포함하는 첨가물을 함유하는 배지에 배양하는 공정 후, 상기 (3) 내지 (5) 중 어느 하나 항 기재의 배지에 계대 배양하는 공정을 포함하는, 상기 (7) 기재의 방법;
(9) 단백질 및/또는 지질 또는 이들을 포함하는 첨가물을 함유하는 배지에 배양하는 공정을, 단백질 및/또는 지질 또는 이들을 포함하는 첨가물의 함유량을 점차로 낮추면서 수행하는, 상기 (8) 기재의 방법;
(10) CHO 세포를, 상기 (3) 내지 (5) 중 어느 하나 항 기재의 배지에 배양하는 공정 후, 단백질 및/또는 지질 또는 이들을 포함하는 첨가물을 함유하는 배지에 배양하는 공정을 수행하여, 그 뒤 다시 상기 (3) 내지 (5) 중 어느 하나 항 기재의 배지에 배양하는 공정을 포함하는, 상기 (7) 내지 (9) 중 어느 하나 항 기재의 순화 세포주의 제작 방법.
본 발명은, 생체 유래 물질이나 고가로 불안정한 인자의 첨가에 의존하지 않고 부유 증식이 가능한 무단백질·무지질 배지 순화 CHO 세포주를 제공한다. 본 발명의 무단백질·무지질 배지에 의한 순화 세포주는, 계면활성제 등의 부유제를 사용하지 않고 부유세포용의 일반적인 스핀(spin) 배양이나 생물반응기(bioreactor)형 고밀도 배양 장치를 사용해서 부유 배양이 가능하다. 또한, 세포의 부유형태는 세포 외 기질(Extracellular Matrix; ECM)의 결핍이 원인이 되는 것이 아닌, 및 유전자 변이를 동반하지 않는 안정한 주(株)로서, 바이오(bio) 의약물의 생산계에 요구되는, 안전하고 안정적인 세포주이다.
본 발명의 순화 세포주는, 세포 스스로가 생산하고 있는(즉 자가 생산(auto crine)적인 작용에 의한다) 상피 성장 인자(Epidermal Growth Factor; EGF)에 의존하는 증식성을 나타내며, 외래의 증식 인자의 첨가에 의존하지 않고 증식이 가능하다. 인슐린 및/또는 GM3 갱글리오시드(ganglioside)를 배지에 제공하는 것으로 세포막의 지질뗏목(Lipid raft)의 형성을 유도하는 것으로서, 본 발명의 순화 세포주는 원주 CHO 세포와 같은 정도 이상의 증식성을 나타낸다.
또한, 본 발명의 순화 세포주는, 원주 CHO 세포보다 우수한 재조합 단백질의 생산효율을 가진다. 따라서, 본 발명의 순화 세포주를 사용하는 것으로서, 원하는 유전자 재조합 단백질을 효율 좋게 생산하는 것이 가능하며, 바이오 의약품의 생산성을 향상시키는 것이 가능하다. 본 발명의 순화 세포주를 사용하는 것으로서, 바이오 의약품을 더욱 안전, 저렴, 안정적으로 생산할 수 있다.
본 발명의 순화 세포의 제조법은, 특별한 장치를 필요로 하지 않고, 재현성 좋은 부유 배양이 가능한 순화 세포를 제작하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 배지는, 실질적으로 무단백질·무지질로서, 저렴한 가격에서 안정적으로 이용할 수 있으며, 유전자 재조합 단백질을 정제할 때에 장해가 되는 여분의 물질을 포함하지 않으므로 유익하다.
도 1은, 본 발명의 순화 세포주의 제조 방법의 수순을 나타내는 도이다. 패널(panel) A는, DMEM 배지 순화 세포주이며, 패널 B는, NPL 배지 순화 세포주의 제조 방법을 각각 나타낸다.
도 2는, 본 발명의 무단백질·무지질 배지 순화 세포의 세포 형태를 나타내는 도립위상차현미경(inverted phase-contrast microscope, 倒立位相差顯微鏡) 사진이다(배율 100 배). 패널 A: NPLAd CHO 세포, 패널 B: DMAd CHO 세포, 패널 C: 원주 CHO-K1 세포주.
도 3은, 본 발명의 무단백질·무지질 배지 순화 세포(NPLAd CHO 세포)의 형태에 대하여 ECM의 영향을 나타내는 도립위상차현미경 사진이다(배율 40 배). 패널 A: 무처리 플레이트(plate), 패널 B: 피브로넥틴(fibronectin) 코팅(coat)된 플레이트, 패널 C: 1형 콜라겐(collagen) 코팅된 플레이트, 패널 D: 알부민(albumin) 코팅된 플레이트.
도 4는, 본 발명의 무단백질·무지질 배지 순화 세포의 형태에 대하여 혈청 첨가의 영향을 나타내는 도립위상차현미경 사진이다(배율 40 배). 패널A：DMAd CHO 세포, 패널 B: 역순화 DMAd CHO 세포(3번째 계대 배양), 패널 C: 역순화 DMAd CHO 세포(20번째 계대 배양), 패널 D: NPLAd CHO 세포, 패널 E: 역순화 NPLAd CHO 세포(2번째 계대 배양), 패널 F: 역순화 NPLAd CHO 세포(9번째 계대 배양), 패널 G: 원주 CHO 세포.
도 5는, 역순화 배양법에 의한 세포 증식률의 복귀를 표하는 도이다. －○－：원주 CHO 세포, －×－：DMAd CHO 세포, －●－：역순화 DMAd CHO 세포(25 번째 계대 배양).
수식은 각군 3 웰(well)의 평균±표준 편차(standard deviation, SD)로 나타내고 있다.
도 6은, NPLAd CHO 세포의 증식에 대하여 항-EGF 중화항체에 의한 영향 및 인슐린에 의한 세포증식 유도를 표하는 도이다. －●－: 인슐린 첨가, －○－: 인슐린 첨가 + 항 EGF 중화항체 (5 ㎎/㎖) 첨가.
수식은 각군 3 웰의 평균±표준편차를 나타내고 있다.
도 7은, 인슐린 첨가 NPLAd CHO 세포와 원주 CHO 세포의 증식 비교를 표하는 도이다. □：원주 CHO 세포, ■： 인슐린 첨가(10 ㎎/㎖) NPLAd CHO 세포.
수식은 각 군 3 웰의 평균±표준 편차로 나타내고 있다.
도 8은, EGF/EGFR의 자가분비 루프(autocrine loop)와 항 EGF 항체에 의한 증식 저해를 모식적으로 나타내는 도이다.
도 9는, 세포막 및 지질 뗏목(lipid raft)의 구조를 모식적으로 표하는 도이다.
도 10은, 갱글리오시드 GM3의 첨가에 의한 세포 형태로의 영향을 나타내는 도립위상차현미경 사진이다(배율 40 배). 패널 A: GM3 0 ng/㎖, 패널 B: GM3 250 ng/㎖, 패널 C: GM3 1,250 ng/㎖, 패널 D: GM3 2,500 ng/㎖.
도 11은, 갱글리오시드 GM3의 첨가량에 의한 세포증식에 대한 영향을 표하는 도이다.
수식은 각 군 3 웰의 평균±표준 편차로 나타내고 있다.
도 12는 인슐린 및 GM3 첨가 NPL 배지에 배양한 NPLAd CHO 세포 및 혈청첨가 배지에 배양한 원주 CHO 세포의 증식성 비교를 표하는 도이다. －○－: 인슐린 + GM3 첨가 NPL 배지에 배양한 NPLAd CHO 세포, －●－: 혈청 첨가 배지에 배양한 원주 CHO 세포.
수식은 각 군 3 웰의 평균±표준 편차로 나타내고 있다.
도 13은, GM 3 첨가에 의한 지질 뗏목 형성의 유도 개념을 모식적으로 표하는 도이다.
도 14는, 과도상태(transient)법에 의한 원주 CHO 세포 및 순화 세포주의 재조합 단백질 생산성 비교 실험의 흐름(flow)를 나타내는 모식도이다.
도 15는 나노 류 리포터 벡터(NanoLuc reporter vector) pNL1.3.CMV의 벡터 지도(vector map)이다.
도 16은, 원주 CHO 세포에 대하여, DMAd CHO 세포, GM3 첨가 NPLAd CHO 세포 및 GM3 비 첨가 NPLAd CHO 세포의 루시퍼라제(luciferase) 상대활성(比活性, specific activity)의 비교를 나타내는 도이다. －▲－: DMAd CHO 세포, －○－: GM3 비 첨가 NPLAd CHO 세포, －●－: GM3 첨가 NPLAd CHO 세포.
수식은 각 군 3 웰의 평균±표준 편차로 나타내고 있다.
도 17은, GM3 첨가 NPLAd CHO 세포, GM3 비 첨가 NPLAd CHO 세포, DMAd CHO 세포 및 원주 CHO 세포에 있어서, 세포 당 루시퍼라제 활성의 추정치의 비교를 나타내는 도이다. 。－●－：GM3 첨가 NPLAd CHO 세포, －○－：GM3 비 첨가 NPLAd CHO 세포, －△－：DMAd CHO 세포, 및 －×－：원주 CHO 세포.
수식은 도 16에서 측정한 각 세포의 발광량을, 동일 배지, 배양 조건에서 배양한 경우의 동 세포의 시간 경과적(經時的)인 세포 수에 나눈 값으로, 평균±표준편차로 나타내고 있다.
도 2는, 본 발명의 무단백질·무지질 배지 순화 세포의 세포 형태를 나타내는 도립위상차현미경(inverted phase-contrast microscope, 倒立位相差顯微鏡) 사진이다(배율 100 배). 패널 A: NPLAd CHO 세포, 패널 B: DMAd CHO 세포, 패널 C: 원주 CHO-K1 세포주.
도 3은, 본 발명의 무단백질·무지질 배지 순화 세포(NPLAd CHO 세포)의 형태에 대하여 ECM의 영향을 나타내는 도립위상차현미경 사진이다(배율 40 배). 패널 A: 무처리 플레이트(plate), 패널 B: 피브로넥틴(fibronectin) 코팅(coat)된 플레이트, 패널 C: 1형 콜라겐(collagen) 코팅된 플레이트, 패널 D: 알부민(albumin) 코팅된 플레이트.
도 4는, 본 발명의 무단백질·무지질 배지 순화 세포의 형태에 대하여 혈청 첨가의 영향을 나타내는 도립위상차현미경 사진이다(배율 40 배). 패널A：DMAd CHO 세포, 패널 B: 역순화 DMAd CHO 세포(3번째 계대 배양), 패널 C: 역순화 DMAd CHO 세포(20번째 계대 배양), 패널 D: NPLAd CHO 세포, 패널 E: 역순화 NPLAd CHO 세포(2번째 계대 배양), 패널 F: 역순화 NPLAd CHO 세포(9번째 계대 배양), 패널 G: 원주 CHO 세포.
도 5는, 역순화 배양법에 의한 세포 증식률의 복귀를 표하는 도이다. －○－：원주 CHO 세포, －×－：DMAd CHO 세포, －●－：역순화 DMAd CHO 세포(25 번째 계대 배양).
수식은 각군 3 웰(well)의 평균±표준 편차(standard deviation, SD)로 나타내고 있다.
도 6은, NPLAd CHO 세포의 증식에 대하여 항-EGF 중화항체에 의한 영향 및 인슐린에 의한 세포증식 유도를 표하는 도이다. －●－: 인슐린 첨가, －○－: 인슐린 첨가 + 항 EGF 중화항체 (5 ㎎/㎖) 첨가.
수식은 각군 3 웰의 평균±표준편차를 나타내고 있다.
도 7은, 인슐린 첨가 NPLAd CHO 세포와 원주 CHO 세포의 증식 비교를 표하는 도이다. □：원주 CHO 세포, ■： 인슐린 첨가(10 ㎎/㎖) NPLAd CHO 세포.
수식은 각 군 3 웰의 평균±표준 편차로 나타내고 있다.
도 8은, EGF/EGFR의 자가분비 루프(autocrine loop)와 항 EGF 항체에 의한 증식 저해를 모식적으로 나타내는 도이다.
도 9는, 세포막 및 지질 뗏목(lipid raft)의 구조를 모식적으로 표하는 도이다.
도 10은, 갱글리오시드 GM3의 첨가에 의한 세포 형태로의 영향을 나타내는 도립위상차현미경 사진이다(배율 40 배). 패널 A: GM3 0 ng/㎖, 패널 B: GM3 250 ng/㎖, 패널 C: GM3 1,250 ng/㎖, 패널 D: GM3 2,500 ng/㎖.
도 11은, 갱글리오시드 GM3의 첨가량에 의한 세포증식에 대한 영향을 표하는 도이다.
수식은 각 군 3 웰의 평균±표준 편차로 나타내고 있다.
도 12는 인슐린 및 GM3 첨가 NPL 배지에 배양한 NPLAd CHO 세포 및 혈청첨가 배지에 배양한 원주 CHO 세포의 증식성 비교를 표하는 도이다. －○－: 인슐린 + GM3 첨가 NPL 배지에 배양한 NPLAd CHO 세포, －●－: 혈청 첨가 배지에 배양한 원주 CHO 세포.
수식은 각 군 3 웰의 평균±표준 편차로 나타내고 있다.
도 13은, GM 3 첨가에 의한 지질 뗏목 형성의 유도 개념을 모식적으로 표하는 도이다.
도 14는, 과도상태(transient)법에 의한 원주 CHO 세포 및 순화 세포주의 재조합 단백질 생산성 비교 실험의 흐름(flow)를 나타내는 모식도이다.
도 15는 나노 류 리포터 벡터(NanoLuc reporter vector) pNL1.3.CMV의 벡터 지도(vector map)이다.
도 16은, 원주 CHO 세포에 대하여, DMAd CHO 세포, GM3 첨가 NPLAd CHO 세포 및 GM3 비 첨가 NPLAd CHO 세포의 루시퍼라제(luciferase) 상대활성(比活性, specific activity)의 비교를 나타내는 도이다. －▲－: DMAd CHO 세포, －○－: GM3 비 첨가 NPLAd CHO 세포, －●－: GM3 첨가 NPLAd CHO 세포.
수식은 각 군 3 웰의 평균±표준 편차로 나타내고 있다.
도 17은, GM3 첨가 NPLAd CHO 세포, GM3 비 첨가 NPLAd CHO 세포, DMAd CHO 세포 및 원주 CHO 세포에 있어서, 세포 당 루시퍼라제 활성의 추정치의 비교를 나타내는 도이다. 。－●－：GM3 첨가 NPLAd CHO 세포, －○－：GM3 비 첨가 NPLAd CHO 세포, －△－：DMAd CHO 세포, 및 －×－：원주 CHO 세포.
수식은 도 16에서 측정한 각 세포의 발광량을, 동일 배지, 배양 조건에서 배양한 경우의 동 세포의 시간 경과적(經時的)인 세포 수에 나눈 값으로, 평균±표준편차로 나타내고 있다.
본 명세서 및 특허청구의 범위에 있어서, 이하의 용어는, 각각 이하로 정의된 의의를 가지는 것으로 한다. 수립(樹立) 세포주로는, 동일의 세포 접종 밀도에서 계대 배양한 경우, 3 계대 이상으로 건넌 증식 속도, 세포 형태에 변화가 없는 것을 확인된 세포주로 정의한다. 무단백질·무지질 배지로는, 그 조성에서 단백질 및 지질의 한쪽 또는 둘 다, 또는 단백질 및 지질의 한쪽 또는 둘 다를 포함하는 첨가물(예를 들면, 혈청, 조직 추출액 등)을 포함하는 배지를 의미하며, 첨가 성분의 불순물 또는 혼입 물로서 존재하는 미량의 단백질 또는 지질의 존재가 허용된다. 증식인자로는, 특정의 세포에 대하여 증식을 촉진하는 분자량 8 kD를 넘는 사이토카인(cytokine)을 의미하며, 상피성장인자(Epidermal growth factor: EGF), 인슐린-유사 성장인자(Insulin-like growth factor: IGF), 변형 성장인자(Transforming growth factor: TGF), 신경 성장인자(Nerve growth factor：NGF), 뇌-유래 신경 영양인자(Brain-derived neurotrophic factor: BDNF), 혈관 내피세포 증식인자(Vesicular endothelial growth factor: VEGF), 과립구 콜로니 자극인자(Granulocyte-colony stimulating factor: G-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극인자(Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor： GM-CSF), 혈소판 유래 성장인자(Platelet-derived growth factor: PDGF), 에리트로포이에틴(Erythropoietin: EPO), 트롬보포이에틴(thrombopoietin: TPO), 염기성 섬유모세포 증식인자(鹽基性 線維芽細胞 增殖因子, basic fibroblast growth factor: bFGF 또는 FGF2), 간세포 증식인자(Hepatocyte growth factor: HGH)를 포함한다.
DMEM 배지(둘베코 개변(改變))(또는 변법(變法))) 이글 배지(Dulbecco′s modified Eagle′s medium))로는, 이글 최소 필요 배지(Eagle, Science 1959 Aug 21;130(3373):432-7)를 둘베코가 개변한 조성(Dulbecco, Virology 1959 July; 8(3):396-7)을 가지는, 포유동물세포 용의 합성 배지로서, 이러한 둘베코의 조성을 기본으로 하는 것인 한에 있어서, HEPES, 페놀레드(phenolred), 피루브산(pyruvic acid) 등의 성분 함유의 유무 또는 함량의 다른 것도 포함한다. 단, 단백질 또는 지질을 첨가하게 되는 것은 포함하지 않는다.
1.
무단백질
·무지질 배지
본 발명의 무단백질·무지질 배지는, DMEM 배지를 개변한 것이다. DMEM 매지는, 원주 CHO 세포가 혈청 첨가 DMEM 배지에서 장기간 계대 배양 되기 위하여, 원주 CHO 세포는 DMEM 배지의 조성에 적응하여, 용이하게 순화될 수 있는 가능성이 높다고 생각되므로, 이들을 기본의 배지로 하여 사용한다.
본 발명의 무단백질·무지질 배지(Non-Protein, Non-Lipid Medium; NPL 배지)는, DMEM 배지를 기본(base)으로, 세포의 증식성 등을 개선하기 위해서 설계하였다. DMEM 배지에 혈청을 첨가하지 않는 것으로서 일어나는 영양성분의 저하, 구체적으로 비 필수성분이 대사에 대하여 합성에 보충되는 것의, 합성까지의 시간차(time lag) 등에 따르는 세포 증식의 저하를 일으킬 가능성이 있다. 때문에, NPL 배지의 조성으로는, DMEM에는 포함되지 않는 비필수 아미노산 류(1 내지 100 ㎎/ℓ의 범위의 알라닌(alamin)(바람직하게는 1 내지 50 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 10 ㎎/ℓ), 5 내지 100 ㎎/ℓ의 범위의 아스파라긴(asparagine)(바람직하게는 20 내지 80 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 50 ㎎/ℓ), 5 내지 100 ㎎/ℓ의 범위의 아스파르트산(aspartic acid)(바람직하게는 5 내지 50 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 25 ㎎/ℓ), 5 내지 100 ㎎/ℓ의 범위의 시스테인(Cystein)(바람직하게는 5 내지 50 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 20 ㎎/ℓ), 1 내지 250 ㎎/ℓ의 범위의 글루타민산(glutamic acid)(바람직하게는 100 내지 250 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 200 ㎎/ℓ), 1 내지 100 ㎎/ℓ의 범위의 페닐알라닌(phenyl alamine)(바람직하게는 40 내지 100 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 70 ㎎/ℓ), 10 내지 100 ㎎/ℓ의 범위의 프롤린(proline)(바람직하게는 50 내지 100 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 100 ㎎/ℓ), 무기질 류(0.1 내지 10 ㎎/ℓ의 범위의 황산아연(zinc sulfate)(7 수화물)(바람직하게는 0.5 내지 5 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 2㎎/ℓ), 0.001 내지 0.01 ㎎/ℓ의 아셀렌산 나트륨(sodium selenite)(바람직하게는 0.001 내지 0.008 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 0.004 ㎎/ℓ), 0.0001 내지 0.005 ㎎/ℓ의 범위의 황산동(II)(copper sulfate (II)) 5 수화물(바람직하게는 0.0001 내지 0.003 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 0.002 ㎎/ℓ), 비타민(vitamin)으로서 0.001 내지 1 ㎎/ℓ의 범위의 비오틴(biotin)(바람직하게는 0.005 내지 0.5 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 0.01 ㎎/ℓ) 및 0.01 내지 2 ㎎/ℓ의 비타민 B12(바람직하게는 0.01 내지 1 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 0.1 ㎎/ℓ), 핵산 전구체로서 0.01 내지 1 ㎎/ℓ의 범위의 티민(thymine)(바람직하게는 0.05 내지 0.8 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 0.7 ㎎/ℓ), 0.1 내지 10 ㎎/ℓ의 히포크산틴(hypoxanthine)(바람직하게는 0.001 내지 1 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 0.2 ㎎/ℓ), 0.1 내지 5 ㎎/ℓ의 범위의 모노 에탄올아민(mono ethanol amine)(바람직하게는 0.5 내지 3 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 1.5 ㎎/ℓ)을 DMEM의 조성에 가해, 포도당(glucose)을 DMEM의 2 내지 5 배 량(2000 내지 5000 ㎎/ℓ)으로 하였다.
또한, 단백질 또는 지질 이외라고 하면, 그 외의 저 분자 화합물을 첨가하는 것도 바람직하다. 배지는, 최종적으로 사용시의 삼투압이 200 내지 400 mOs㎖/㎏의 범위(바람직하게는 250 내지 350 mOs㎖/㎏의 범위)가 되도록 조정한다.
본 발명의 NPL 배지에는, 추가로, 1 내지 20 ㎎/ℓ의 인슐린(바람직하게는 1 내지 15 ㎎/ℓ), 및/또는 0.1 내지 10 ㎎/ℓ(바람직하게는 1 내지 5 ㎎/ℓ)의 갱글리오시드 GM3(1-O-[4-O-(3-O-a-뉴라미노실-b-D-갈락토피라노실)-b-D-글루코피라노실]세라미드; 1-O-[4-O-(3-O-a-neuraminosyl-b-D-galactopyranosyl)-b-D-glucopyranosyl]cerimide):
을 첨가하는 것도 바람직하다. 이들 중 하나 또는 둘 다를 첨가하는 것으로써, 세포의 증식 속도를 촉진하거나, 또는 순화 기간을 단축하는 것이 가능하다.
본 발명의 NPL 배지는, 사용시에 용해 또는 희석한 것에 의해 상기의 조성을 가지는 수용액이 되도록, 사전에 상기 함유 성분의 일부 또는 전부를 배양한 건조 조성물 또는 농축액을 제조하여 두는 것이 가능하다. 이러한 조성물을 사용하는 것으로써, 사용시에 간편하게 본 발명의 NPL 배지를 제조하는 것이 가능하다.
2.
CHO
순화 세포주의 수립 방법
원주 CHO 세포는, 시판의 것을 입수해서 사용하는 것이 가능하다. 통상, 혈청을 첨가하는 배지에 유지 배양되고 있는 CHO 세포를, 다음으로 혈청 첨가물을 저하 시키면서 계대 배양을 하여, 최종적으로는 혈청 및 증식인자를 포함하지 않는 배지에 안정적으로 증식하도록 될 때까지 순화시킨다. 이러한 순화의 과정에 있어서 사용하는 배지로서는, DMEM 배지 등의 표준적인 배지를 사용하는 것이 가능하나, 무 혈청상태로의 안정적인 증식성을 얻기 위하여, 본 발명의 NPL 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 인슐린 및/또는 GM3를 첨가한 NPL 배지는, 더욱 단기간으로 순화시키는 것이 가능하므로, 바람직하다.
수립시킨 순화 세포주를 정치 배양에 있어서 부유상태에서 안정 증식하는 형태를 획득하고 있다. 이로써, 본 발명의 순화 세포주는, 담체(carrier) 또는 부유시키기 위한 약제 등을 사용하지 않고, 스피너(spinner)나 용기(tank)에서 용이함과 동시에 대량으로 부유 배양하는 것이 가능하다.
이렇게 해서 NPL 배지를 사용하여 수립된 CHO 순화 세포주는, “NPLAdoo1“으로서 2013년 6월 28일에, 일본국 치바현 키사라즈시 카즈사 카마타리 2-5-8, 독립행정법인 제품평가기술 기반기구 특허 미생물 기탁센터(NPMD)에 수탁되어, 수탁번호 NITE P-01641이 부여되었다.
3. 재조합 단백질의 생산방법
본 발명의 무단백질·무지질 배지 순화 세포주는, 원하는 단백질을 암호화(code)하는 유전자를 도입하는 것으로부터, 재조합 단백질의 생산에 사용하는 것이 가능하다. 도입 유전자를 담당하여 가지는(斷指) 벡터(vector)의 제조법 및 유전자 도입법은, CHO 세포에 적용 가능한 방법이라면 구체적으로 제한하지 않으며, 당해 기술분야에서 사용되는 방법을 사용하는 것이 가능하다. 본 발명의 무단백질·무지질 배지 순화 세포주는, 대용량의 부유계에 배양하는 것이 가능하며, CHO 세포와 비교하여 수배의 단백질 생산성을 가지므로, 과도상태법(transient method)으로도 충분히 생산성을 확보할 수 있다. 재조합 단백질을 생산하는 경우, 배지로서는, DMEM, NPL 등의 임의의 무단백질·무지질 배지를 사용하는 것이 가능하나, 형질감염(transfection) 전의 배양에 있어서, GM3 및/또는 인슐린을 첨가하여 배양하며, GM3 및/또는 인슐린을 첨가해서 배양해, 형질도입을 수행할 때에는 GM3을 포함하지 않는 배지 중에서 수행하는 것으로서, 효율적으로 재조합 단백질 생산을 수행할 수 있다.
생산된 재조합 단백질은, 단백질의 특징에 응하는 해당 기술 분야에서 사용되고 있는 임의의 방법을 사용하는 것으로부터, 본 발명의 세포 또는 배지로부터 회수하여, 정제할 수 있다.
[실시예]
1. 배지 순화법에 따른 무단백질·무지질 배지 순화 CHO 세포주의 수립
이하와 같이 하여, 배지 순화법을 사용해, 2 종류의 CHO 세포주를 수립하였다.
(1) 세포
배지 순화법을 위하여 사용된 CHO-K1 세포는, 유럽 세포 배양 은행(European Collection of Cell Cultures; ECACC)로부터 구입하였다. 이 세포는, 10% 소 배아 혈청(Fetal bovine serum; FBS)를 첨가하여 둘베코 개변 이글(Dulbecco’s Modified Eagle’s MEM; DMEM) 배지에서 유지 배양을 수행하였다.
(2) 배지
CHO 세포에 배지 순화법을 시도하는 것에 따라, 배지로서는, [표 1]에 나타난 DMEM 배지 및 NPL 배지를 사용하였다.
각 배지는, 각각의 소정의 최종농도가 되도록 하는 소정의 성분을 증류수에 용해하여, 여과멸균 하는 것으로서 제조되었다.
* 단위: ㎎/ℓ
(3) 배지 순화법
(3-1) DMEM 배지에 의한 순화
DMEM 배지에 의한 순화는 다음의 순서에 따랐다(도 1, 패널 A). 먼저, 원주세포의 유지 배지인 10% FBS 첨가 DMEM 배지에서, 혈청농도가 3%가 될 때까지, 순차적으로, 혈청 농도를 낮추어 약 1 주간 배양을 수행하였다. 추가로 1 개월 간, 1% FBS 혈청 DMEM 배지에 배양을 계속하였다. 세포 증식성이 안정될 때까지 1% FBS 첨가 DMEM 배지에 배양을 수행하여, 안정한 단계에서 혈청의 첨가를 멈추어 배양하였다.
무 혈청의 DMEM 배지에 의해 배양에서 세포의 증식이 두드러지게 악화되는 경우에는, 재차 1%의 혈청을 첨가하여, 상태가 회복될 때까지 배양을 수행하여, 안정한 단계에서 다시, 무 혈청화를 확인하였다. 최종적으로 무 혈청 상태에 안정적인 배양이 가능할 때까지 이러한 조작을 반복하였다. 이러한 기간의 배양은 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 수행하였다.
DMEM 배지에 의해 순화된 세포주를 “DMAd CHO 세포”로 명명하였다. DMAd CHO 세포는, 순화 후 30 계대 이상 경과한 것을 이하의 실험에 있어서 사용하였다.
또한, 순화에 의한 주 세포의 정의로서는, 증식 속도가 안정한 단계에서, 생존률 90% 이상의 세포를 10 만개/㎖의 세포밀도에서 25 cm2의 배양 플라스크(culture flask)에 접종하여, 3 계대 이상, 증식 속도와 세포 형태가 변화하지 않는 것을 갖고 순화주로 하였다.
(3-2) NPL 배지에 의한 순화
NPL 배지에 의한 순화는 다음의 순서에 따랐다(도 1, 패널 B). 먼저, 원주세포의 유지 배지인 10% FBS 첨가 DMEM 배지에서, 혈청농도가 3%가 될 때까지, 순차적으로, 혈청 농도를 낮추어 DMEM 배지에서 약 1주간 배양을 수행하였다. 추가로 2 주간 동안, 1% FBS 첨가 NPL 배지에 옮겨 교환하여 배양을 계속하였다. 세포 증식성이 안정될 때까지 1% FBS 첨가 DMEM 배지에 배양을 수행하여, 안정한 단계에서 혈청의 첨가를 멈추어 배양하였다.
무 혈청의 NPL 배지에 의해 배양에서 세포의 증식이 두드러지게 악화되는 경우에는, 재차 1%의 혈청을 첨가하여, 상태가 회복될 때까지 배양을 수행하여, 안정한 단계에서 다시, 무 혈청화를 확인하였다. 최종적으로 무 혈청 상태에 안정적인 배양이 가능할 때까지 이러한 조작을 반복하였다. 이러한 기간의 배양은 전부 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 수행하였다. NPL 배지에 의해 순화된 세포주를 “NPLAd CHO 세포”로 명명하였다. NPLAd CHO 세포는 순화 후 200 계대 이상 경과한 것을 이하의 실험에 있어서 사용하였다.
(4) 결과
DMEM 배지 및 NPL 배지 중 어느 것을 사용한 경우에도, 순화 세포주를 수립하는 것이 가능하였다. 수립한 순화주의 세포는 원주의 세포와 원주의 세포의 형태를 도 2에 나타낸다. 계대 배양 중의 NPLAd CHO 세포(패널 A) 및 DMAd CHO 세포(패널 B), 및 원주 CHO-K1 세포주(패널 C)를, 도립위상차현미경(inverted phase-contrast microscope, 倒立位相差顯微鏡)으로 관찰하였다(배율 100 배). 원주 CHO 세포는 포석(敷石) 형태에 증식하는 것에 대하여(패널 C), 무단백질·무지질 배지에 순화한 DMAd CHO 세포(패널 B) 및 NPLAd CHO 세포(패널 A)는, 단일로서 또는 집괴(集塊, clump)형태로 부유하고 있다. 통상, CHO 세포의 부유화에는 진탕이나, 계면활성제 등의 부유제의 첨가가 필요하나, 순화주의 세포는 이러한 조작을 더하지 않더라도 집괴 형태로 부유 배양할 수 있다.
CHO 세포는 혈청보다 제공되는 지질 종류, 증식인자가 증식에 필요로 된다고 하나, 순화 세포는, 순화의 과정에 있어서 이러한 물질을 자기생산 할 수 있도록 된 것으로 판단된다. 추가로 2 주의 순화 세포주는 함께 원주 CHO 세포와 다르며, 어떠한 부유 상태로 하는 처리를 더하지 않는 것에도 불구하고, 집괴 형태의 부유 상태로의 형질이 변화되어, 부유제 등이 없이 부유 상태로 증식 가능하게 되었다.
본 발명의 순화 세포주의 증식 속도는, 상기와 같이 플라스크(flask) 중에 정치 배양하는 경우, 원주 CHO 세포보다 어느 정도 뒤쳐져 있다. DMAd CHO 세포는 1 주간 내지 10 일에 융합성(confluent)이 되는 것에 비하여, NPLAd CHO 세포는 5 일에 융합성이 되어 계대가 필요하게 되었다. 그러므로, NPLAd CHO 세포의 증식 속도는 DMAd CHO 세포와 비교하면 빠르다. 원주의 CHO 세포의 계대 간격은 3 내지 4 일 간이므로, NPLAd CHO 세포, DMAd CHO 세포 중 어느 것도 원주와 비교하면 증식 속도는 점차 느려지게 되었다.
이는, 무단백질·무지질 배지 순화주는 세포의 증식에 자기 증식인자 만에 의존하고 있으므로, 자기 증식인자 이외의 인자가 부족할 가능성이나, 장기간의 단백질 및/또는 지질의 결손 상태에 따른 세포 기능의 저하 등, 몇 가지의 원인이 고려될 수 있다. 그러나, 회전(spin) 배양법이나 생물 반응기(bio reactor) 형태의 배양 장치는 효율적으로 영양성분의 교환이나 영양 공급 등이 가능하므로, 정치 배양과 비교하여 증식 속도가 빠르게 되고 있으며, 또한, 정치 배양과 비교하여 고 세포밀도로 배양하는 것이 가능하다. 그러나, 이러한 정도의 세포 증식속도의 차이는 배양법의 선택이나 개량을 충분히 보충하는 것이 가능할 것으로 고려될 수 있다.
상기에서 수립된 NPLAd CHO 세포는, NPLAd001로서, 2013년 6월 28일에, 일본국 치바현 키사라즈시 카즈사 카마타리 2-5-8, 독립행정법인 제품평가기술 기반기구 특허 미생물 기탁센터(NPMD)에 수탁되어, 수탁번호 NITE P-01641이 부여되었다.
2.
무단백질
·무지질 배지 순화
CHO
세포의 증식성에 관한 검사
일반적으로 혈청을 사용해서 배양되고 있는 접착 계 세포에서는, 스스로가 내고 있는 인테그린(integrin) 등의 세포 접착인자로서 피브로넥틴(fibronectin) 등의 혈청 중의 ECM을 통해서 결합하는 것으로 배양 용기에 접착한다. 순화 세포의 배양 형태가 접착성에서 부유 형태에 이르는 원인은, 무단백질·무지질 배지에서 ECM이 공급되지 않는 것이라는 가능성이 있다. 여기서, 피브로넥틴, 1 형 콜라겐(collagen) 등의 ECM 및 알부민(albumin)으로 코팅(coat)된 플레이트에 NPLAd CHO 세포를 접종, 배양하는 것으로서, NPLAd CHO 세포가 접착형태로 돌아가는가를 관찰하였다.
(1) 배양 기질
이하의 배양기질을 사용하였다: (1) 피브로넥틴 코팅된(fibronectin-coat) 24 웰 플레이트(24 well plate)(일본 벡톤·디킨슨 사 제(製), “피브로넥틴 코트 24 웰 플레이트”, (2)I 형 콜라겐 코팅된(collagen-coat) 24 웰 플레이트(일본 벡톤·디킨슨 사 제, “I 형 콜라겐 코트 24 웰 플레이트”), (3) 알부민 코팅된(albumin-coat) 24 웰 플레이트(일본 벡톤·디킨슨 사 제의 24 웰 플레이트에, 1 mg/㎖의 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin; BSA)/인산염 완충 생리식염수(Phosphate Buffered Saline; PBS) 1 mL를 주입하여 37 도에서 2 시간 동안 배양한(incubate) 후, 2 회 PBS로 세척(rinse)하여 여분의 BSA를 씻어 없애고, 클린벤치(clean bench)내에서 무균 건조한 것), 및 (4) 무처리 플레이트(일본 벡톤·디킨슨 사 제의 24 웰 플레이트).
(2) 실험 방법
세포는 NPLAd CHO 세포를 사용하고, 배지는 NPL 배지를 사용하였다. NPL 배지에서 유지하고 있는 NPLAd CHO 세포를, NPL 배지에서 ２ 회 세척하였다. 세척 후, NPL 배지에 현탁(suspension, 현탁)하여 세포 집괴(集塊, clump)를 풀어낸 다음에, 개량 뉴바우어 혈구계산반(血球計算盤) (neubauer hemocytometer) 및 트리판블루(trypan blue)를 사용하여 색소 배제법으로 세포 수를 계측하여, 생존율을 산정하였다. 생존율이 90% 이상인 것이 확인된 후, NPL 배지에서 5 만개/㎖가 되도록 세포 수를 희석하여, 피브로넥틴 코팅된 24 웰 플레이트, I 형 콜라겐 코팅된 24 웰 플레이트, 알부민 코팅된 24 웰 플레이트 및 무처리의 24 웰 플레이트에, 1 ㎖/웰의 양으로 접종하였다
접종한 플레이트를 27℃, 5% 이산화탄소 조건에서 5 일간 배양하여, 배양 중의 각 세포의 접착의 유무를 도립위상차현미경 하에서 관찰하였다(배율 40 배).
(3) 결과
각 플레이트에 배양 5 일째의 세포 형태를 도 3에서 나타낸다. 세포의 형태는, 피브로넥틴 코팅된 플레이트(패널 B), I 형 콜라겐 코팅된 플레이트(패널 C) 및 알부민 코팅된 플레이트(패널 D) 중 어느 것도, 무 혈청의 플레이트(패널 A)와 동일한 형태의 집괴상의 형태를 나타내어, 접착하지 않고 부유할 수 있어, 차이가 보여지지 않았다. 세포가 한 번 배양기에 접착하여, 그 후 포화(confluent)가 되어 배양기에서 세포가 박리(剝離, Peeling off)되어 있는 가능성도 부정할 수 없었으므로, 계속적인 관찰을 수행하였다. 그러나, NPLAd CHO 세포가 배양 초기에서 배양기에 접착하는 것이 아닌, 증식되고 있는 것이 관찰되었다. 이상의 결과로부터, 순화 세포주의 부유화는 ECM의 부족에 의한 것이 아닌 것으로 생각되었다.
순화 세포에 있어서 접착성의 소실이 ECM의 결핍에 기인하는 것이 아닌 경우, 인테그린 등의 세포 접착 인자의 형성 불량이 생각될 수 있다. 다음으로 생각되는 것은 세포막 구조의 변화이다. 인지질(phospholipid)을 포함하는 지질류는, 당(sugar)에서 생합성 되는 것 외에, 혈청 중의 항체 단백질인 알부민을 통해서 세포 내에 받아들여 세포막 등에 이용된다. 순화 세포주의 경우, 장기간의 지질 결핍으로 세포막 구조가 변화하여, 이러한 것이 세포의 접착성에 영향을 주었다는 가능성이 생각될 수 있다.
3.
무단백질
·무지질 배지 순화
CHO
세포의 형질(形質) 변화의 가능성의 검증
원주 CHO 세포는, 무단백질·무지질 배지에서 증식하는 것이 가능하지 않지만, 순화 세포주는, 배지에 순화한 것으로서 부족한 영양상태에서도 증식하는 것이 가능하게 되었다. 이러한 형질의 변화는, 어떠한 유전자 변이로부터 증식 가능하게 된 클론(clone)의 세포가 배양에 반하여 우성(dominant)이 되는 형질이 변화하였기 때문이라는 가능성이 있다. CHO 세포의 형질변화가 유전자 변이에 의한 것이라면, 유전자의 점 돌연변이(point mutation), 염색체의 일부 탈락에 의한 유전자의 결실(欠失)이나 염색체의 결손(欠損) 등으로 예측되지 않는 형질 전환을 따르는 가능성이 있어, 세포 기능의 바로 그것에 장해가 일어나는 경우도 생각될 수 있다. 그러한 세포는 생산 계(生産系)의 세포로서 안정성이 보증되지 않는다. 추가로, 같은 수법을 사용하여도 같은 성질을 가지는 주(株)가 수득되는 것은 한정하지 않으며, 배지 순화법의 재현성도 보증되지 않는 것이 된다. 거기서, 수립된 순화 세포주의 형질변화는 유전자 변이를 따르고 있는가를 보증하기 위하여, 그 형질 변화가 가역적인가, 즉 순화 세포주를 다시 혈청 첨가의 배지에 되돌려, 원주 CHO 세포와 같은 형태, 증식 속도로 되돌아 가는가를 검토하였다.
(1) 실험 방법
(1-1) DMAd CHO 세포, NPLAd CHO 세포의 역(逆) 순화 배양
세포는 수립 후 30 계대를 경과한 DMAd CHO 세포, 및 수립 후 280 계대를 경과한 NPLAd CHO 세포를 사용하였고, 배지는 10% FBS 첨가 DMEM 배지를 사용하였다.
DMAd CHO 세포 및 NPLAd CHO 세포를 DMEM으로 2 회 세척한 후, DMEM 배지에 현탁하여 세포 집괴를 풀어낸 다음에, 개량 뉴바우어 혈구계산반(neubauer hemocytometer) 및 트리판블루(trypan blue)를 사용하여 색소배제 법으로 세포 수를 계측하여, 생존율을 산정하였다. 그런 다음에, 10만 개/㎖의 세포수가 되도록 10% FBS 첨가 DMEM 배지를 사용하여 희석하였다. 이 세포 희석액을 25 cm2의 배양 플라스크(culture flask)에 5 ㎖ 접종하여, 37 도, 5% 이산화탄소 조건에서 배양을 수행하였다. 포화가 되는 단계에서, 같은 수순으로 계대 배양을 수행하였다.
세포가 접착하여 있던 경우에는, 부유하여 있던 세포를 회수한 후에, 트립신(trypsin)을 사용하여 세포를 박리, 분산(分散)하였다. 특정의 경향을 가지는 세포를 선택하지 않도록 하므로, 세포의 재접종에는 부유 세포와 접착 세포를 혼합하여 사용하였다. 이러한 역순화 배양을 거친 DMAd CHO 세포 및 NPLAd CHO 세포를, 각각 역순화 DMAd CHO 세포 및 역순화 NPLAd CHO 세포로 이름하였다.
(1-2) 역순화 세포주의 증식률 측정
원주 CHO 세포, DMAd CHO 세포 및 역순화 배양을 25 계대 이상 수행한 역순화 DMAd CHO 세포를 사용하였다. 배지는, 원주 CHO 세포 및 역순화 DMAd CHO 세포에는 10% FBS 첨가 DMEM 배지를, DMAd CHO 세포에는 DMEM을 사용하였다.
원주 CHO 세포 및 역순화 DMAd CHO 세포는 접착하고 있으므로, 트립신으로 박리, 분산시켜, 개량 뉴바우어 혈구계산반 및 트리판블루를 사용하여 색소배제법으로 세포 수를 계측하여, 생존율을 산정하였다. DMAd CHO 세포는 DMEM 배지에 현탁하여 세포 집괴를 풀어낸 다음에, 개량 뉴바우어 혈구계산반 및 트리판블루를 사용하여 색소배제법으로 세포 수를 계측하여, 생존율을 산정하였다.
원주 CHO 세포,DMAd CHO 세포 및 역순화 DMAd CHO 세포는 각각의 계대 배지에서 5 만개/㎖의 세포 수가 되도록 희석하여, 전체의 세포를 24 웰 플레이트(well plate)에 1 ㎖/웰의 양으로 희석하였다. 희석한 플레이트를 37 도, 5% 이산화탄소 조건에서 7 일간 배양하여, 일정 기간마다 세포 수를 개량 뉴바우어 혈구계산반 및 트리판 블루를 사용한 색소배제법(色素排除法)으로 세포수를 계측하여, 생존률을 산정하였다. NPLAd CHO 세포 및 역순화 NPLAd CHO 세포에 대하여도 동일 형태에 배양하여, 생존률을 산정하였다.
(2) 결과
원주 CHO 세포, DMAd CHO 세포 및 NPLAd CHO 세포, 혈청을 가한 DMEM배지에서 역순화 배양한 역순화 DMAd CHO 세포 및 역순화 NPLAd CHO 세포의 형태를 도 4에서 나타낸다. 세포 형태의 변화를, 도립위상차현미경으로 배율 40 배에서 관측하였다. 역순화 배양을 개시한 DMAd CHO 세포 및 NPLAd CHO 세포는, 배지에 혈청을 가하여 배양을 개시한 직후로부터, 일부에 접착하는 세포가 관찰되었다. 계대 배양을 계속하는 것으로 접착성 세포 형태로 이행하여, 3 계대 째 역순화 DMAd CHO 세포(패널 B) 및 2 계대 째 역순화 NPLAd CHO 세포(패널 E)에는 접착 형태와 구형의 부유형태의 세포가 혼합하여 존재하였다. 20 계대 째의 역순화 DMAd CHO 세포(패널 C), 9 계 대째 역순화 NPLAd CHO 세포(패널 F)는, 원주 CHO 세포(패널 G)와 비교하여 형태적인 차이를 나타내지 않았다.
각자의 세포의 증식율을 도 5에서 나타낸다. 역순화 DMAd CHO 세포(-●-) 및 원주 CHO 세포(-○―)는 DMAd CHO 세포(-×-)보다도 세포 증식률이 높아, 거의 필적하는세포 증식률을 나타내었다. 역순화 DMAd CHO 세포와 원주 CHO 세포는, 배양 3 일 째까지의 첫 시작은 증식율이 일치함으로써, 배양 7 일째에는 약간 역순화 DMAd CHO 세포의 증식이 양호하였으나, 유의적인 차이는 없었다. NPLAd CHO 세포에 있어서도 같은 결과를 수득하였다(결과 미기재).
수립한 무단백질·무지질 배지 순화 CHO 세포주의 형질의 변화는 가역적인 것으로, 혈청을 가하여 배양하는 것에서 원주 CHO 세포와 동질의 세포 형태 및 증식성으로 돌아가는 것이 가능하였다. 사용한 DMAd CHO 세포주 및 NPLAd CHO 세포는, 각각 수립 후 30 계대 및 수립 후 280 계대를 넘은 것으로서, 그 형질의 변화가 장기간 계대 배양하여도 고정화된 것이 아닌 것을 확인할 수 있다. 더욱이, 400 계대를 경과한 NPLAd CHO 세포에 있어서도 혈청 첨가에 의한 역순화에 따른 원주의 형태로 돌아가는 것이 확인되었다(결과 미기재). 이러한 것으로부터 수립된 무단백질·무지질 배지 순화 CHO 세포주의 형질의 변화는, 유전자의 변이에 따르는 비가역적인 변화가 아닌 것으로 여겨질 수 있다.
본 발명의 순화 세포주는, 유전자 변이를 따르지 않고, 우연히 수득된 형질인 가능성이 낮고, 본 발명의 방법으로서 같은 형질의 세포주를 재현성 좋게 수립하는 것이 가능하다고 여겨진다. 따라서, 본 발명의 순화 세포 및 이의 제조 방법은, 재조합 단백질, 또한 바이오 의약품의 생산에 있어서 안전성이나 생산성의 점에서 중요한, 유전자 변이에 따른 상정(想定)할 수 없는 형질의 변화가 없는 것이 바람직한 형질을 실현한 것으로서, 안정적인 바이오 의약품의 생산을 위한 세포주 및 이를 만들어 내는 방법으로서 유용하다.
4. 단백질·무 지질 배지 순화
CHO
세포의 세포 증식인자에 대한 반응성
산업 용도로 사용되는 세포주로는 고증식능, 고물질생산능이 요구된다. 본 발명의 순화 세포주의 세포 증식속도를 향상시키기 위하여, 세포 증식인자에 대한 응답성을 검토하였다.
일반적으로, CHO 세포는 배지 중의 혈청이나 생체분자 중에서 공급되는 증식인자에 의존하여 증식하는 것으로 여겨지나, 순화 배양에 사용하는 무단백질·무지질 배지는 혈청이나 생체 성분을 전혀 포함하지 않으므로, 배지에서 이들의 증식인자는 공급되지 않는다. 이로 인해, 순화 세포주는 자가분비(오토크라인, autocrine)적으로 증식인자를 생산하여, 증식하는 것으로 생각된다. 또한, 순화 세포는 무단백질·무지질 배지에 대하여 순화되어온 장기간의 지질의 결핍 상태에 따라, 막 구조의 변화가 일어날 수 있는 가능성이 있다. 따라서, 순화 세포주의 증식능은, 세포의 증식인자의 발현을 증대시키거나, 또는, 막 구조를 정상화하여 증식인자의 신호(signal)을 충분히 받아들일 수 있도록 하는 것으로 개선될 수 있는 가능성이 여겨진다.
여기서 먼저, 순화 세포주에서 있어서 자가분비 인자의 관여를 검토하기 위하여, 중화항체에 의한 증식인자의 수용체로의 저지(prevent) 시험을 수행하였다. 순화주의 자가분비 인자로서는 EGF를 주목하였다. 이것은 CHO 세포를 포함하는 많은 상피계 세포에서 EGF가 증식인자로서 활동하고 있음의 공지가 있기 때문이다(Fisher 등，Mead Johnson Symp Perinat Dev Med., 1988; 33-40.). 여기서, 항 EGF 중화항체에 의한 EGF가 수용체에 결합하는 것을 방해(阻害)하는 것으로 증식이 제어(制御)되는가를 검토하였다. EGF 중화항체에 의한 증식성이 방해된다면, EGF가 자가분비 인자로서 순화주의 증식에 관여하는 것으로 판단할 수 있다.
다음으로, 순화 세포주의 증식을 더욱 유도하기 위하여 내분비(엔도크라인, endocrine) 인자의 첨가를 고려하였다. 엔도쿠린 인자로서 인슐린에 주목하였다. 인슐린은 췌장의 랑게르한스 섬(islet of Langerhans)의 베타 세포에 의해 생산되는 전형적인 내분비 인자이며, 다양한 세포에 대하여 불가결(不可欠)한 성장인자로, CHO 세포에 대해서도 인슐린이 증식에 기여하는 것으로 보고되어 있다(Chun 등，Biotechnol Prog., 2003; 19: 52-7.).
인슐린은, 증식 인자임과 동시에 당뇨병의 치료약으로서 1922 년에 제품화되었다(Rosenfeld，Clin Chem., 2002; 2270-88.). 유전자 재조합 의약품으로서는 가장 오래 전부터 있던 것의 한 가지로서, 다른 단백질성 증식인자보다 안정성이 높고, 생산량이 많으므로 다른 유전자 재조합의 증식인자와 비교하여 가격이 저렴하다. 이러한 이유로부터 본 검토에 있어서 인슐린을 사용하였다.
(1) 항 EGF 중화항체에 대하여 NPLAd CHO 세포의 증식의 영향 및 인슐린에 의한 세포 증식 유도
항 EGF 중화항체(R&D Systems, Inc.) 및 유전자 재조합 인슐린(Sigma-Aldrich)은 시판되는 것을 사용하였다.
세포는 NPLAd CHO 세포를, 배지는 NPL 배지를 사용하였다. NPL 배지에 유지되어 있는 NPLAd CHO 세포를, NPL 배지에 2 회 세척하였다. 세척 후, NPL 배지에 현탁하여 세포 집괴를 풀어낸 다음에, 개량 뉴바우어 혈구계산반 및 트리판블루(trypan blue)를 사용하여 색소 배제법으로 세포 수를 계측하여, 생존율을 산정하였다. 생존율이 90% 이상인 것이 확인된 후, NPL 배지에서 5 만개/㎖가 되도록 세포 수를 희석하여, 24 웰 플레이트에 1 ㎖/웰의 양으로 접종하였다. 세포를 접종한 웰의 절반에 항 EGF 중화항체를 5 mg/㎖이 되도록 가하였다.
항 EGF 중화항체 첨가 및 미첨가의 세포 접종 웰에, 각각 인슐린을 0, 1, 2, 5, 및 10 mg/㎖이 되도록 가하였다. 접종한 플레이트를 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 5 일간 배양하여, 개량 뉴바우어 혈구계산반 및 트리판블루(trypan blue)를 사용하여 색소 배제법으로 세포 수를 계측하여, 생존율을 산정하였다.
(2) 인슐린 첨가 NPLAd CHO 세포 및 원주 CHO 세포의 증식비교
원주 CHO 세포 및 NPLAd CHO 세포를 이용하였다. NPLAd CHO 세포에는 10 mg/ℓ의 인슐린(Sigma-Aldrich)을 첨가하여 NPL 배지를 사용하였다. 또한, 원주 CHO 세포에는 10% FBS 첨가 DMEM 배지를 사용하였다.
원주 CHO 세포는 접착세포이므로, 트립신으로 박리, 분산시켜, 개량 뉴바우어 혈구계산반 및 트리판블루를 사용하여 색소배제법으로 세포 수를 계측하여, 생존율을 산정하였다. NPLAd CHO 세포는 현탁하여 세포 집괴를 풀어낸 다음에, 개량 뉴바우어 혈구계산반 및 트리판블루를 사용하여 색소배제법으로 세포 수를 계측하여, 생존율을 산정하였다.
원주 CHO 세포는 10% FBS 첨가 DMEM 배지에서, NPLAd CHO 세포는 인슐린 첨가 NPL 배지에서, 각각 5 만개/㎖의 세포수로 희석하여, 전부의 세포를 24 웰 플레이트에 1 ㎖/웰의 양으로 접종하였다. 접종한 플레이트를 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 5 일간 배양하여, 세포수를 개량 뉴바우어 혈구계산반 및 트리판블루를 사용하여 색소배제법으로 세포 수를 계측하여, 생존율을 산정하였다. 세포수의 유의차검정(有意差檢定)에는 스튜던트 t-검정을 사용하였다.
(3) 결과
EGF, 및 CHO 세포에 대하여 증식 유도의 효과가 있는 것으로 보이는 인슐린이 순화세포의 증식에 미치는 영향을 검사하였다. NPLAd CHO 세포의 배양 ５ 일째에 인슐린 농도 의존적 세포 증식을 도 6에 나타내었다.
NPL 배지에 항 EGF 중화항체를 첨가하는 경우(―○―), 인슐린의 첨가에 관계없이 NPLAd CHO 세포의 증식이 억제되었다. 특히, 인슐린을 첨가하지 않고, 항 EFG 중화항체를 첨가한 경우, 그 세포수(―●―의 인슐린 농도 0 mg/ℓ)는 23.5 만개/㎖인 것에 비하여, 인슐린을 첨가하지 않았을 때, 항 EGF 중화항체를 가하지 않은 경우의 세포수(―○―의 인슐린 농도 0 mg/ℓ)는 15.5 만개/㎖로서, 약 35% 증식이 억제되었다. 이러한 결과는, 인슐린의 유무와 관계없이, NPLAd CHO 세포의 증식은 EGF에 의존하고 있다는 것을 나타낸다. 또한, NPL 배지는 EGF를 포함하지 않으므로, 항 EGF 중화항체에 의하여 수용체로의 결합이 방해되었던 EGF는, NPLAd CHO 세포 자신이 생산하였던 것, 다시 말해 자가분비 증식인자인 것을 나타낸다. 그러나, 항 EGF 중화항체에 대하여 결합을 방해하여도, 세포 접종 수(5 만개/㎖)에 대하여, 배양 5 일째에 3 배 정도의 세포 증가가 나타나는 것으로부터, EGF 이외의 자가분비(autocrine) 인자가 증식에 관여하는 것이 생각될 수 있다.
NPLAd CHO 세포는 인슐린의 농도 의존적으로 증식하였다(―●―). 세포 수는, 인슐린 농도가 2 mg/ℓ에서는 40 만개/㎖, 10 mg/ℓ에서는 53 만개/㎖가 되어, 인슐린 미첨가의 세포수에 대하여 10 mg/ℓ의 농도에서 2 배 이상의 세포의 증식이 나타났다. 인슐린을 첨가하는 것으로 인해서 원주 CHO 세포와 비교하여 어느 정도까지 증식이 증대하는가를 검정하였다. 그 결과, 배양 5 일째에 10 mg/ℓ의 인슐린을 첨가하여 NPL 배지를 사용한 NPLAd CHO 세포에서는 55 만개/㎖ 정도까지 증대하였으나, 원주 CHO 세포의 세포수는 80 만개/㎖을 넘었다(P<0.005)(도 7). 이런 결과로부터, NPLAd CHO 세포의 증식 속도는 NPL 배지에 인슐린을 첨가하는 것만으로는 원주 CHO 세포의 증식 속도에는 미치지 못하는 것이 나타나는 것으로, 인슐린의 농도 의존적으로 NPLAd CHO 세포의 증식을 유도하는 결과를 확인할 수 있다.
이상으로써, NPLAd CHO 세포주는, 근거리분비(파라크라인, paracine) 인자인 인슐린의 첨가 농도에 의존적으로 세포 증식성이 상승하는 것으로 나타내며, 또한 배지에 EGF를 첨가하지 않는 것에도 불구하고, EGF 중화항체에 의해서 세포의 증식이 억제되는 것이 확인되었다. 또한, 인슐린 자극(stimulation)에 의해 유도된 세포 증식에 있어서도, EGF를 중화항체로 방해하는 것에서 세포 증식이 억제되는 것이 명백하게 되었다. 배지에 EGF를 첨가하지 않으므로, EGF 중화항체에 대하여 수용체로의 결합이 중화된 EGF는 순화 세포주 스스로로부터 생산된 자가분비(autocrine) 증식인자로서, EGF-EGF 수용체의 자가분비 루프(autocrine loop) 없이 자기의 증식을 유도하고 있는 것으로 생각된다.
EGF는 53 아미노산 잔기로부터 형성되는 6,045 Da의 분자량을 가지는 단백질로서, 세포 표면에 존재하는 EGF 수용체에 결합하여 세포의 증식을 제어하고 있다. 상피계 세포를 포함하는 다양한 세포에 있어서 자가분비 증식인자로서 EGF-EGF 수용체의 자가분비 루프 없이 자기의 증식을 유도하는 것으로 보고되어 있다(Shvartsman등, Am J Physiol Cell Physiol., 2002; 282: C545-59；DeWitt등，J Cell Sci., 2001; 114: 2301-13.). EGF를 포함하는 EGF 패밀리(family)의 증식인자는 처음부터 분비형으로서 합성되어지는 것이 아닌, 세포 내에서 전구체로서 발현된다. 번역(Translation) 후, 막을 관통하여 세포 표면으로 나온 후, 세포 표면에서 프로테아제(protease)에 의해 절단 되어서, 분비형의 증식 인자가 되도록 하여진다. 도 8에 나타난 바와 같이, 세포 내에서 생성되어진 EGF는 세포막에 묻혀 포함되어 있는 막통과 단백질로서 세포 표면에 존재(막결합형 EGF)한다. 프로테아제에게 절단되면, 세포 바깥 도메인(domain)이 유리되고, 분비형 EGF가 되어 EGF 수용체에 결합한다. EGF 수용체에 분비형 EGF가 결합하는 것으로서, EGF 수용체의 막-통과 도메인(transmembrane domain)을 통해서 세포 내로 신호(signal) 전달이 진행되어, 세포 증식이 유도된다. 본 실험에서 사용한 항 EGF 중화항체는 EGF에 직접 결합하여 수용체로의 결합을 방해하는 것이므로, 항 EGF 중화항체에 의하여 순화 세포주의 세포증식의 억제가 생겼다는 것은, 수용체로부터의 증식 신호의 전달이 이루어지지 않기 때문인 것으로 추측된다(도 8). 또한, 본 발명의 순화 세포주에 있어서 EGF 중화항체의 증식 억제는 자기의 증식뿐만 아니라, 근거리분비(paracrine) 증식인자인 인슐린에 의한 증식도 억제하고 있다. 그러나, 순화 세포주에 있어서 EGF의 자가분비적인 생산은 자기의 증식을 위하여 언제나 중요한 요소이다.
이상과 같이, 순화 세포주에 대하여는 EGF의 신호 전달이 세포 증식에 대해 중요한 것으로 여겨진다. 여기서, 이후의 실험에서는 EGF의 신호 전달 효율을 올리는 것으로 순화 세포주의 증식 속도를 촉진할 수 있는가를 확인하였다.
또한, EGF 이외의 자가분비 인자로서, IGF-1(Insulin-like Growth Factor-1)는 세포의 증식을 유도하는 것의 보고가 있다(Pak 등, Cytotechnology, 1996; 22: 139-46.). 여기서 NPLAd CHO 세포에는 항 IGF-1 중화항체에 의한 결합 방해를 수행하지 않았으나, 세포 증식의 윽제는 나타나지 않았다는 것으로부터, 순화주의 자가분비적인 증식에 대하여 IGF-1의 관여는 없다고 볼 수 있다. 그러나, 항 EGF 중화항체에 대하여 결합을 방해하여도, 순화 세포주의 세포 증식이 완전히 억제되지 않았다고 하는 결과로부터, IGF-1 이외의 증식인자가 자가분비 인자로서 순화 세포주의 증식에 관여하고 있을 가능성이 충분이 있다고 생각될 수 있다.
5. 무단백질·무지질 배지 순화 CHO 세포의 증식에 대하여 GM3의 영향
세포막은, 주로 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 스핑고미엘린(sphingomyelin), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidyletanolamine), 포스파티딜 세린(phosphatidylserine) 등의 인지질(phospholipid)이 무수하게 나란이 형성되어진 지질 이중막층으로 형성되어 있어, 이들 간에 막통과 단백질(transmembrane protein)이나 고정 단백질(anchor protein) 등의 각종 단백질 등이 이어져 형성되어 있다. 지질뗏목(lipid raft)은, 구체적으로 스핑고지질, 스핑고당지질(sphingoglycolipid) 및 콜레스테롤(cholesterol)을 많이 포함하는 막의 구조물로서, 수용체의 막통과 단백질이 집중하여 있는 것으로부터, 세포 내의 정보전달이 수행되는 것으로 되고 있다(도 9). 구체적으로, 지질뗏목의 스핑고당지질인 갱글리오시드(ganglioside)가 신호 절단의 제어에 관여한다고 말하는 보고는 많다. 그러나, EGF의 수용체도 지질뗏목이 국소부위에 존재하는 것이 보고되어 있다(Balbis 등，J Cell Biochem., 2010; 109(6): 1103-8.). 따라서, 이러한 지질뗏목의 형성이 불충분한 경우에는, 수용체로의 정보전달이 충분하게 수행되지 않을 가능성이 있다.
상기와 같이, 무단백질·무지질 배지에서 장기로 계대된 순화 세포주는 지질류의 부족으로 인해서 세포막 구조가 변화되는 가능성이 있어, 순화 세포주는 지질 뗏목의 형성이 불충분하여, EGF 수용체로부터의 정보전달이 충분히 수행되지 않을 가능성을 생각할 수 있다. 여기서, 지질 뗏목의 구성에 중요한 역할을 하고 있는 스핑고당지질인 갱글리오시드 GM3에 주목하여, GM3의 첨가가 순화 세포의 세포 형태 및 증식 속도에 미치는 영향에 대하여 실험하였다. 또한, GM3을 첨가하는 것으로 인해 세포막 구조가 재구축되어, 세포 접착성이 회복하는 가능성, GM3의 유무나 첨가 농도에 의해 세포 형태의 변화, 특히 접착성 세포의 증가나 세포 집괴의 크기의 변동이 있을 가능성을 조사하였다.
(1) 무단백질·무지질 배지 순화 CHO 세포의 형태에 대한 GM3의 영향
갱글리오시드 GM3(Neu5A, Enzo Life Sciences)는 시판되는 것을 사용하였다. 세포는 NPLAd CHO 세포를 사용하였다. NPLAd CHO 세포는 NPL 배지에 현탁하여 세포 집괴를 풀어낸 다음, 개량 뉴바우어 혈구계산반 및 트리판블루(trypan blue)를 사용하여 색소 배제법으로 세포 수를 계측하여, 생존율을 산정하였다.
NPLAd CHO 세포는, 10 mg/ℓ이 되도록 인슐린을 가한 NPL 배지에 5 만개/㎖의 세포수가 되도록 희석하여, 전부의 세포를 24 웰 플레이트에 1 ㎖/웰의 양으로 접종하였다. 그런 다음, 세포 접종 플레이트에 갱글리오시드 GM3을, 0, 250, 1,250, 또는 2,500 ng/㎖이 되도록 가하였다.
접종한 플레이트를 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 5 일간 배양하여, 세포의 형태 변화를 도립위상차현미경 하에서 관측하였다. 다음으로, 세포 수를 개량 뉴바우어 혈구계산반 및 트리판블루를 사용하여 색소 배제법으로 세포 수를 계측하여, 생존율을 산정하였다. 세포 수를 유의차로 검정하는 것에는 스튜던트의 t-검정을 사용하였다.
(2) 인슐린 및 GM3 첨가 NPLAd CHO 세포와 원주 CHO 세포와의 증식 속도의 비교
세포는, NPLAd CHO 세포와 원주 CHO 세포를 사용하였다. 원주 CHO 세포는, 접착하여있으므로, 트립신으로 박리·분산시켜, 개량 뉴바우어 혈구계산반 및 트리판블루(trypan blue)를 사용하여 색소 배제법으로 세포 수를 계측하여, 생존율을 산정하였다. NPLAd CHO 세포는, NPL 배지에서 현탁하여 세포 집괴를 풀어낸 후에, 개량 뉴바우어 혈구계산반 및 트리판블루를 사용하여 색소 배제법으로 세포 수를 계측하여, 생존율을 산정하였다.
원주 CHO 세포는 10% FBS 첨가 DMEM 배지에서, NPLAd CHO 세포는 10 mg/ℓ의 인슐린 및 2,500 ng/㎖의 GM3를 가한 NPL 배지에서, 각각 5 만개/㎖의 세포수가 되도록 희석하여, 전부의 세포를 24 웰 플레이트에 1 ㎖/웰의 양으로 접종하였다. 접종한 플레이트를 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 5 일감 배양하여, 일정기간의 것으로 세포 수를 개량 뉴바우어 혈구계산반 및 트리판블루를 사용하여 색소 배제법으로 세포 수를 계측하여, 생존율을 산정하였다. 세포 수를 유의차로 검정하는 것에는 스튜던트의 t-검정을 사용하였다.
(3) 결과
GM3의 첨가에 의한 세포 형태의 변화에 대하여는 관측 결과를 도 10에 나타낸다. GM3의 첨가 유무 및 농도(2,500 ng/㎖까지)에 제한되지 않고, 접착성 세포의 증가나 세포 집괴의 크기의 변동적인 형태의 변화가 관측되지 않았다.
GM3의 첨가에 의한 세포 증식에 대한 영향의 결과를 도 11에 나타낸다. NPLAd CHO 세포의 배양액에 GM3를 1,250 ng/㎖ 가하면, 미첨가에 비해서 유의적으로 세포수가 증가하였다(P<0.05). 이 효과는 GM3의 농도 의존적이었다. GM3를 2,500 ng/㎖로 첨가하는 경우, 미첨가의 약 2 배인 100 만개/㎖ 정도의 세포수가 증가하였다. 따라서M3에는 NPLAd CHO 세포의 증식을 유도하는 효과가 있는 것이 명백하게 되었다.
다음으로, 인슐린과 GM3의 첨가에 의한 증식 촉진을 실험하였다. 결과를 도 12에 나타낸다. NPL 배지에 인슐린(10 mg/ℓ)과 GM3(2,500 ng/㎖)을 가했던 경우, NPLAd CHO 세포(―○―)는 혈청 첨가 배지의 원주 CHO 세포(―●―)와 거의 같은 정도의 세포 증식률을 나타낸다. 따라서, PLAd CHO 세포는, 배지에 인슐린과 GM3를 첨가하는 것으로 CHO 세포에 필적하는 증식 속도를 가지는 것이 나타났다.
이상에 있어서, GM3의 첨가에 의한 NPLAd CHO 세포의 증식이 유도되며, 추가로, 인슐린과의 병용에 의해 정치 배양에 있어서도 원주 CHO 세포와 같은 정도까지 증식 속도를 높이는 것이 가능하다. 또한, 세포 형태에는 변화가 나타나지 않았다. 따라서, 세포 부유화에 관해서는 GM3의 부족은 관여하지 않는 것으로 생각된다.
GM3는 지질 뗏목의 주요 구성 성분인 것과 동시에, 세포의 신호 전달에도 관여하는 것으로 여겨진다. 그러나, GM3의 신호 전달의 관여에 관해서는 억제적에도 유도적에도 움직인다는 모순으로 보고가 나타나있다. Bremer 등은 EGF 수용체를 과잉으로 발현하는 A431 세포나 KB 세포에 있어서, 외인성의 GM3의 첨가가 EGF 수용체의 티로신 키나아제(tyrosine kinase)의 자기 인산화를 억제하는 것으로 신호 전달을 제어하여, EGF 의존성의 세포 증식을 억제하므로, GM3은 EGF 수용체의 제어인자인 것으로 여겨진다(Bremer 등，J Biol Chem., 1986; 261: 2434-40). 또한, Ji 등은 같은 A431 세포에 대하여, 살아있는 세포 표면의 스핑고당 지질을 생리적 조건 하에서 절단할 수 있는 엔도글라이코실세라미다제(Endoglycosylceramidase)를 사용하여, 세포 표면의 갱글리오시드를 제거하면, EGF 수용체의 티로신 키나아제의 EGF 수용체의 자기 인산화가 저하되는 것을 공지하고 있다(Ji 등，Glycobiology, 1995; 5: 343-50). 또한, Swiss 3T3 선유아세포(線維芽細胞, fibroblast)에 글라이코실세라미드(glycosylceramide)의 합성저해제인 D-l-트레오-1-페닐-2-헥사데카노실아미노-3-파이롤리디노-1-프로판올-염산(D-l-threo-1-phenyl-2-hexadecanoylamino-3- pyrrolidino-1-propanol-HCl, D-PPPP) 염산을 사용하여, 갱글리오시드를 제거하면, EGF 수용체뿐만 아니라, FGF, IGF-1, PDGF 등의 증식 인자 및 이의 수용체인 티로신 키나아제의 활성이 저해되어, 증식이 억제되나, 외인성의 갱글리오시드를 가하면 억제가 제거되어서 증식이 회복된다는 보고도 있다(Li 등, J Biol Chem., 2000; 275: 34213-23). 상기의 언뜻 보기에 모순된 보고로부터, 갱글리오시드는 증식 인자와 수용체의 기능 발현에는 불가결한 요소로서, 특히 갱글리오시드가 결핍되면 각종 증식인자의 수용체의 기능이 손상되나, EGF 수용체가 과잉으로 발현을 하고 있는 것 같은 세포주에 있어서, 외인성의 GM3를 가하는 것은 기능을 억제하는 방향으로 움직이는 것으로 생각될 수 있다. 최근의 당뇨병 연구에 있어서, TNF-a 자격에 의한 GM3 합성 항진(亢進)이 지질 뗏목의 기능 이상을 야기하여, 인슐린의 대사성 신호를 선택적으로 억제하는 것으로 보고가 있다(Tagami 등，J Biol Chem., 2002; 277: 3085-92；이노구치，비만연구, 2006; 12: 260-2). 이것은, 과잉의 GM3가 인슐린 저항성을 야기한다는 것이다. 이러한 사실로부터, 지질 뗏목 형성에 필요한 량의 GM3는 증식에 대하여 촉진적으로 작용하나, 과잉의 GM3은 억제적으로 작용하는 것으로 여겨진다.
본 발명의 무단백질·무지질 배지 순화 세포주는, 장기간 어어진 지질류, 특히 갱글리오시드의 결핍 상태에 나타나고 있으며, 지질 뗏목 상의 수용체가 영향을 받는 가능성이 생각된다. 지질 결핍 상태의 순화 세포주에서는 GM3를 가하는 것으로 인해, 지질 뗏목 상의 수용체의 기능이 정상화되여, 증식을 유도하는 방향으로 일하는 것으로 생각된다(도 13).
６． 무단백질 ·무지질 배지 순화 CHO 세포의 유전자 재조합 단백질의생산
물질의 생산계의 실험에 있어서 과도상태법(transient method)를 사용하여, 무단백질·무지질 배지 순화 세포주가 원주 CHO 세포에 대하여 어느 정도의 유전자 재조합 단백질의 생산능력이 있는가를, 도 14에 나타나는 수순으로 수행하여 분리형 루시퍼라제의 발현을 지표로 비교실험하였다.
(1) 실험 방법
(1-1) 분리형 루시퍼라제 유전자 발현 벡터의 도입
원주 CHO 세포는, 10% FBS 첨가 DMEM 배지에서 배양하였다. DMAd CHO 세포는, DMEM 배지에서 배양하였다. NPLAd CHO 세포는, 인슐린(10 mg/ℓ) 첨가 NPL 배지, 또는 인슐린(10 mg/ℓ)+GM3(2,500 ng/㎖) 첨가 NPL 배지 중 하나에서 배양하였다. 형질감염(transfection) 시약으로는,“TransIT-LT1 Transfection Reagent”(다카라, MIR 2304), 분비형 루시퍼라제 발현 벡터로서“NanoLuc(등록상표) reporter vector pNL1.3.CMV ［secNluc/CMV］”(프로메가, N1011)(도 15)를 각각 사용하였다.
원주 CHO 세포는 트립신 박리 후, 10% FBS 첨가 DMEM 배지에 2 회 세척하였다. 세척 후, 개량 뉴바우어 혈구계산반 및 트리판블루를 사용하여 색소배제법으로 세포 수를 계측하여, 생존율을 산정하였다. DMAd CHO 세포는 DMEM 배지로, NPLAd CHO 세포는 인슐린(10 mg/ℓ) 첨가 NPL 배지 및 인슐린(10 mg/ℓ)+GM3(2,500 ng/㎖) 첨가 NPL 배지로, 각각 세척한 후, NPL 배지에 현탁한 세포 집괴를 풀어낸 다음, 개량 뉴바우어 혈구계산반 및 트리판블루를 사용하여 색소배제법으로 세포 수를 계측하여, 생존율을 산정하였다.
생존률이 90% 이상인 것을 확인한 후, 각각의 배지에 40 만개/㎖이 되도록 세포수를 희석하여, 24 웰 플레이트에 0.5 ㎖/웰의 양으로 접종하였다. 접종한 플레이트를 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 24 시간 배양하였다.
700 ㎕의 DMEM 배지에 1 ug/uL의 “NanoLuc reporter vector pNL1.3.CMV”를 7 ㎕ 가하여 혼합한 후,“TransIT-LT1 Transfection Reagent”를 21 ㎕ 가하여 추가로 혼합하였다. 실온에서 30 분간 방치하여, 형질감염 복합체(Transfection Complex)를 제조하였다. 또한, 대조로서,“NanoLuc reporter vector pNL1.3.CMV”대신에 TE 완충액을 가하여 더미 복합체(Dummy Complex)를 동일하게 제조하였다.
세포 접종 플레이트에 제조 완료한 형질감염 복합체를 52 ㎕ 씩, 세포 및 배지의 조합(combination) 당 각 3 웰 분산한 후에, 천천히 흔들어 혼합하였다. 또한, 동일하게 더미 복합체를 세포 및 배지 당에 각 1 웰 분산하여, 천천히 흔들어 혼합하였다. 혼합 후, 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 5 일간 배양하였다.
이후, 인슐린(10 mg/ℓ) 첨가NPL 배지에 배양하여, 형질감염한 NPLAd CHO 세포를 “GM3 비첨가 NPLAd CHO 세포”로, 인슐린(10 mg/ℓ)+GM3(2,500 ng/㎖) 첨가 NPL 배지에 배양하여, 형질감염한 NPLAd CHO 세포를 “GM3 첨가 NPLAd CHO 세포”로 각각 명명하였다.
(1-2) 루시퍼라제 상대활성(relative activity)의 측정
루시퍼라제 분석 키트(luciferase assay kit)로서, “Nano-Glo Luciferase Assay System”(프로메가, N1110)을 사용하였다.
세포를 접종하여, 형질감염이 끝난 플레이트로부터 5, 24, 48, 72 및 120 시간 마다 상층액을 10 uL 분리하여, 상층액 중의 분비형 루시퍼라제의 활성을 “Nano-Glo Luciferase Assay System”를 사용하여, 루미노미터(Luminometer)로 측정하였다.
(1-3) 루시퍼라제 상대활성의 산정
루시퍼라제 상대활성은 시간 경과적으로 샘플링(sampling)한 것 중의 원주 CHO 세포의 배양 상층액의 발광량에 비교해서, 배양 조건 마다의 순화 세포주의 배양 상층액의 발광량을 비교한 것으로서, 계산법은 이하의 것에 따랐다.
실험은 3회 반복하였고, 결과는 모든 실험 간의 루시퍼라제 상대 활성의 평균 ± SD로 나타내어, 유의차의 검정에는 스튜던트의 t-검정을 사용하였다.
(1-4) 세포마다의 발광량 비교
세포 마다의 발광량 비교는 형질감염 후의 시간 경과적으로 샘플링한 각 세포의 배양 상층액의 발광량을, 같은 세포를 사용하여, 동일 배지 조성, 배양 조건에서 배양한 때의 시간 경과적인 세포의 증가수로 나눔으로써, 세포 하나 당의 발광량을 추정적으로 산출하였다.
(2) 결과
순화 세포주의 단백질 생산성을 실험하기 위한 목적으로, CMV 프로모터(promote)의 하류(downstream)에 분비형 루시퍼라제 cDNA를 조합하여 삽입한 플라스미드 pNL 1.3. CMV 벡터를 리포펙타민(lipofectamin)법으로 형질감염하여, 순화 세포주와 원주 CHO 세포의 배지에 분비된 루시퍼라제 활성을 발광량 정량비교하였다. 결과를 도 16에 나타낸다. GM3 첨가 NPLAd CHO 세포는, 형질감염 직후의 산생(産生)의 개시가 늦어졌으나, 120 시간 후의 원주 CHO 세포에 비교하여 루시퍼라제 상대활성이 유의차는 나타내지 않았다. 최종적으로 산생량은 원주 원주 CHO 세포와 동일하였다(-O-). 또한, DMAd CHO 세포(－▲－) 및 GM3 비첨가 NPLAd CHO 세포(－○－)는 형질감염 후 120 시간에 원주 CHO 세포의 3 배 이상의 루시퍼라제 상대활성(유의차는 각각 p<0.05, p<0.005)를 나타낸다. 따라서, 독립한 세포주의 단백질 생산성은 원주 CHO 세포보다 높은 것으로 생각될 수 있다.
또한, 세포 하나당의 발광량으로서 환산하기 위하여, 도 16에 있어서 측정한 시간 경과적인 발광량을, 동일 배지 조성, 배양 조건에서 배양한 때의 시간 경과적인 세포의 증가수로 나눈 것으로, 세포 하나당의 발광량을 추정적으로 산출하였다(도 17). 결과로서, 형질가염 후 120 시간의 DMAd CHO 세포(－△－)는, GM3 非첨가 NPLAd CHO 세포(－○－)의 세포 당 발광량과 거의 동등함으로써, 원주 CHO 세포(－×－)의 약 4 배 정도의 발광량인 것으로 어림될 수 있다. 또한, 마찬가지로 형질감염 후 120 시간 후에는 GM3 첨가 NPLAd CHO 세포의 세포 당 발광량(－●－)은, 원주 CHO 세포와 거의 동등한 것으로 어림될 수 있다.
이러한 결과로부터, 순화 세포주는 어떠한 것도 원주 CHO 세포와 동등 이상의 유전자 재조합 단백질의 생산이 가능한 것을 나타난다. DMAd CHO 세포 및 GM3 비첨가 NPLAd CHO 세포가 원주 CHO 세포와 비교하여 3 배 이상의 루시퍼라제 생산을 수행하고 있다(도 16). 또한, 세포 당의 루시퍼라제 활성을 추정하면, 형질감염 120 시간 후에 DMAd CHO 세포 및 GM3 비첨가 NPLAd CHO 세포로 원주 CHO 세포와 비교하여 4 배 활성이 높아져, GM3 첨가 NPLAd CHO 세포는 원주 CHO 세포와 거의 동등하였다(도 17).
순화 세포주는 원주 CHO 세포보다 높은 루시퍼라아제의 생산성을 나타내는 원인에 대하여는 명확히 알지 못하지만, 순화 세포주의 막구조의 변화에 의한 영향에 따른 가능성을 고려할 수 있다. 상술한 바와 같이, 순화 세포주는 무단백질·무지질 배지에 의한 계대 배양에서 장기간의 지질의 결핍 상태에 노출되었기 때문에 세포막의 구조에 변화가 생겨, 이로 인해서 형질감염(transfection)의 효율이 올라가는 가능성이 있다. 또한, 세포막으로 합성된 단백질의 막투과성은 항진(亢進)되었으므로, 더 많은 루시퍼라제 단백질이 분별되는 가능성을 생각할 수 있다.
이러한 결과로부터, 형질감염(transfection) 전의 배양에 있어서, GM3 및 인슐린을 첨가하여 충분한 양의 세포 수를 확보한 후, GM3를 제거하여 과도상태법으로 형질감염을 수행함으로써, 효율적인 재조합 단백질 생산이 가능하다는 것을 알 수 있다.
Claims (10)
- 외인성의 증식인자를 포함하지 않는 무단백질·무지질 배지에 있어서 부유상태로 증식 가능한 것을 특징으로 하는, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 유래의 무단백질·무지질 배지 순화 세포주의 세포.
- 제 1항에 있어서, 세포주는 수탁번호 NITE P-01641인, 세포.
- 주화된 CHO 세포 유래의 무단백질·무지질 배지 순화 세포를 배양하기 위한 무단백질·무지질 배지로서, 통상의 3 내지 5 배의 포도당(glucose)을 함유하는 DMEM 배지에, 추가로 푸트레신(putrescine), 티민(thymine), 히포크산틴(hypoxanthine) 및 모노에탄올아민(monoethanolamine)을 포함하는, 외인성 증식 인자를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 배지.
- 제 3항에 있어서, 2000 내지 5000 ㎎/ℓ의 포도당(glucose), 0.001 내지 2 ㎎/ℓ의 푸트레신, 0.01 내지 1 ㎎/ℓ의 티민, 0.1 내지 10 ㎎/ℓ의 히포크산틴 및 0.1 내지 5 ㎎/ℓ의 모노에탄올아민을 함유하는 무단백질·무지질 배지.
- 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 1 내지 20 ㎎/ℓ의 인슐린을 추가로 포함하는 무단백질·무지질 배지.
- 제 3 내지 5항 중 어느 한 항에 기재된 배지를 제조하기 위한 조성물로서, 배지로서 사용할 때의 각 성분의 최종농도가 DMEM 배지의 조성에, 2000 내지 5000 ㎎/ℓ의 포도당(glucose), 0.001 내지 2 ㎎/ℓ의 푸트레신(putrescine), 0.01 내지 1 ㎎/ℓ의 티민(thymine), 0.1 내지 10 ㎎/ℓ의 히포크산틴(hypoxanthine) 및 0.1 내지 5 ㎎/ℓ의 모노에탄올아민(monoethanolamine)을 함유하는 것이 되도록 이들의 각 성분을 포함하는 조성물.
- CHO 세포를, 제 3 내지 5항 중 어느 한 항에 기재된 배지에 계대 배양하는 공정을 포함하는, 제 1항에 기재된 순화 세포주의 제작 방법.
- 제 7항에 있어서, CHO 세포를, 단백질 및/또는 지질 또는 이들을 포함하는 첨가물을 함유하는 배지에 배양하는 공정 후, 제 3 내지 5항 중 어느 한 항에 기재된 배지에 계대 배양하는 공정을 포함하는 방법.
- 제 8항에 있어서, 단백질 및/또는 지질 또는 이들을 포함하는 첨가물을 함유하는 배지에 배양하는 공정을, 단백질 및/또는 지질 또는 이들을 포함하는 첨가물의 함유량을 점차로 낮추면서 수행하는, 방법.
- 제 7 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, CHO 세포를, 제 3 내지 5항 중 어느 한 항에 기재된 배지에 배양하는 공정 후, 단백질 및/또는 지질 또는 이들을 포함하는 첨가물을 함유하는 배지에 배양하는 공정을 수행하여, 그 뒤 다시 제 3 내지 5항 중 어느 한 항에 기재된 배지에 배양하는 공정을 포함하는, 방법.
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