CN113355290A - 一种抗肿瘤的工程化外泌体、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗肿瘤的工程化外泌体、制备方法和应用,包括外泌体,所述外泌体内包覆有抗肿瘤的核酸药物和光敏剂,相对于天然的外泌体Nex,工程化外泌体Nex@siRNA/Ce6具有以下特性:1.靶向杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无杀伤效果。2.通过沉默PLK1基因促进肿瘤细胞凋亡;通过抑制PD‑L1的表达,激活小鼠免疫系统。3.工程化外泌体中的光敏剂Ce6在光照下产生活性氧,在光照下产生的光动力效应促进肿瘤细胞的靶向杀伤;活性氧具有破坏内涵体膜的作用,促进siRNA从内涵体逃逸到细胞质中,提升癌细胞的基因抑制效果;活性氧还可以促进M2型巨噬细胞转向M1型巨噬细胞,协同增强抗肿瘤效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体是涉及到一种抗肿瘤的工程化外泌体、制备方法和应用。
背景技术
外泌体(Exosomes)是由活细胞分泌的直径约为30-150nm的小囊泡,具有典型的脂质双分子层结构。外泌体存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中,携带有多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息。近年来,随着外泌体研究的不断深入,其应用已经涉及肿瘤治疗、医学基础和免疫治疗等领域。NK细胞来源的外泌体保留了母细胞的免疫功能,可通过Fas/FasL途径发挥免疫作用,杀伤肿瘤细胞。在体内外显示出较好的抗肿瘤特性,但由于外泌体提取过程繁琐,产率极低,如何有效提升外泌体的疾病治疗效果是亟待解决的一个难题。
siRNA作为一种极具前景的基因靶向药物,理论上来讲可以沉默细胞中任何基因的表达,因此RNAi疗法在癌症等基因性疾病的治疗中具有巨大的潜力。但siRNA本身稳定性差,缺乏合适的递送载体限制了它的应用,如何提高siRNA的递送效率及内涵体逃逸能力是研究者们重点关注的方向。传统的基因药物主要依靠病毒作为递送载体,但是病毒载体可能会引起机体的免疫反应,具有安全性问题。此外,脂质体和聚合物也常被用做siRNA的递送载体。但是,无论是脂质体还是聚合物,都存在基因沉默效率低的问题。这是因为,载体携带siRNA进入到细胞质中后,进入到内涵体/溶酶体中,只有不到1%的siRNA可以从内涵体/溶酶体中逃逸出来进入到细胞质中发挥生物学功能,这大大限制了siRNA的应用和转化。
外泌体来源于细胞,是天然的囊泡结构,生物相容性好,是实现siRNA递送的理想载体。中国专利申请号为201780082770.7的专利申请公开了负载治疗剂的乳外泌体,其中所述治疗剂是生物治疗剂并且所述治疗剂不天然存在于乳外泌体中,所述生物治疗剂是核酸,核酸选自单链或双链DNA、iRNA、siRNA、shRNA、mRNA、非编码RNA ncRNA、反义RNA、LNA、吗啉代寡核苷酸或其类似物或缀合物,乳外泌体来源于奶牛、绵羊、山羊、骆驼、水牛、牦牛或人类乳或初乳,通过超声处理将外泌体用siRNA负载,外泌体只是作为治疗剂的媒剂,治疗剂为治疗的有效成分。
二氢卟吩类光敏剂在光动力疗法治疗恶性肿瘤中的研究进展,刘萍等,现代肿瘤医学,2020年01月,第28卷第01期,公开了二氢卟吩类光敏剂在恶性肿瘤中的应用,光敏剂通过和纳米技术结合或者其他治疗(包括热疗,化疗等)联合,治疗肿瘤。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抗肿瘤的工程化外泌体、制备方法和应用,本发明通过引入光敏剂,提高了药物的递送效率和抗肿瘤的效果。
本发明的内容包括一种抗肿瘤的工程化外泌体,包括外泌体,所述外泌体内包覆有抗肿瘤的核酸药物和光敏剂。
所述外泌体为免疫细胞来源的外泌体,优选为NK细胞、T细胞、B细胞或者DC细胞来源的外泌体,本申请的外泌体不能为肿瘤细胞来源的外泌体。本申请的外泌体可以是人源的外泌体,也可以是鼠源的外泌体。
所述抗肿瘤的核酸药物是长度为15-200个核苷酸的核酸药物。优选为siRNA、micro RNA、shRNA、piRNA或ASO。siRNA更优选为靶向PLK1基因的siRNA(siPLK1)或靶向PD-L1基因的siRNA(siPD-L1)。
所述光敏剂为二氢卟吩类光敏剂,优选为Ce6。
一种抗肿瘤的工程化外泌体的制备方法,包括如下步骤,培养细胞,收集外泌体;然后将核酸药物装载入外泌体中,通过超滤除去游离的核酸药物,得到前工程化外泌体;将前工程化外泌体与光敏剂进行混合孵育,通过超滤除去游离的光敏剂,得到工程化外泌体。
一种所述的抗肿瘤的工程化外泌体在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的有益效果是,本发明提供的外泌体(Nex,Natural Killer cell-derivedexosomes)本身可以作为抗肿瘤药物。首先提供了Nex的制备流程与方法,随后在细胞水平上验证了Nex杀伤肿瘤细胞的能力,并验证了Nex使肿瘤细胞通过Fas/FasL途径发生凋亡。在此基础上,通过电穿孔的方式将siRNA电转进入Nex中,制备得到Nex@siRNA。随后又利用光敏剂的疏水特性将Ce6嵌入到外泌体膜上,得到工程化的外泌体Nex@siRNA/Ce6。
相对于天然的Nex,工程化外泌体Nex@siRNA/Ce6具有以下特性:
1.靶向杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无杀伤效果。
2.通过沉默PLK1基因促进肿瘤细胞凋亡;通过抑制PD-L1的表达,激活小鼠免疫系统。
3.工程化外泌体中的光敏剂Ce6在光照下产生活性氧,在光照下产生的光动力效应促进肿瘤细胞的靶向杀伤;此外,活性氧具有破坏内涵体膜的作用,confocal共定位数据显示,实验组经过光照后siRNA与内涵体定位减少,表明其促进siRNA从内涵体逃逸到细胞质中发挥作用,提升癌细胞的基因抑制效果;活性氧还可以促进M2型巨噬细胞转向M1型巨噬细胞,激活免疫系统,协同增强抗肿瘤效果。
本发明结合外泌体及RNAi疗法目前的优势与缺陷,对NK细胞来源的外泌体进行改造,将siRNA装载入外泌体中,提升外泌体的抗肿瘤及免疫作用的同时,进一步提高了siRNA的递送效率。但是由于siRNA内涵体逃逸效率低的问题仍然存在,影响其在细胞中的基因沉默效果。因此,我们进一步在上述体系中引入了光敏剂,得到工程化的外泌体。当工程化外泌体进入到细胞后,在光照条件下,工程化外泌体中的光敏剂可以同时破坏外泌体膜和内涵体膜,促进siRNA释放到细胞质中发挥作用。工程化的外泌体不仅提升了siRNA的基因沉默效果,更重要的是由光敏剂诱发的光动力治疗显示出与外泌体及siRNA均非常理想的协同治疗效果。本发明提供的工程化外泌体协同RNAi疗法与光动力疗法,为肿瘤治疗提供了新的治疗策略与应用前景。
附图说明
图1为实施例1的纳米颗粒跟踪分析结果。
图2为实施例1的Nex的透射电镜结果(Scale bar=100nm)。
图3为实施例2中Nex杀伤肿瘤细胞的效果,其中图3A为Nex在HepG2-luc肿瘤细胞上的杀伤效果,图3B为Nex在CT26肿瘤细胞上的杀伤效果。
图4为实施例2中Nex处理CT26肿瘤细胞后,细胞内凋亡相关蛋白表达情况。
图5为实施例3中Nex@siRNA/Ce6在细胞水平上的胞吞情况。
图6为实施例4中Nex@siRNA/Ce6在光照和非光照条件下ROS的产生情况。
图7为实施例4中Nex@siRNA/Ce6在光照和非光照条件下内涵体逃逸情况。
图8为对图7中siRNA以及内涵体的荧光信号进行皮尔森系数分析,代表内涵体逃逸效果。
图9为实施例4中分别用PBS,Nex,Nex@Ce6+L(光照),Nex@siPLK1,Nex@siPLK1/Ce6+L(光照)处理荷瘤小鼠,并记录小鼠肿瘤生长情况。
图10为实施例4中,抑瘤实验终点时小鼠肿瘤组织中PLK1基因沉默效果。
图11为实施例4中分别用PBS,Nex,Nex@Ce6+L(光照),Nex@siPD-L1,Nex@siPD-L1/Ce6+L(光照)处理荷瘤小鼠,并记录小鼠肿瘤生长情况。
图12为实施例4中,抑瘤实验终点时小鼠肿瘤组织中PLK1基因沉默效果。
图13为实施例4中,抑瘤实验终点时小鼠肿瘤组织中M1和M2巨噬细胞的比例。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明所述抗肿瘤的工程化外泌体的制备及应用做进一步说明。以下实施案例只用于对本发明作进一步说明,但本发明的实施方式不限于此,不能理解为对本发明保护范围的限制,所属领域技术人员根据上述发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整进行具体实施,仍属于发明保护的范围。
实施例1 Nex的提取与鉴定
用无外泌体培养基或无血清培养基培养NK92MI细胞(购买自中科院细胞库),当细胞处于对数生长期时,300g离心10分钟收集上清(该上清可在-80℃保存一周)。
将上述上清(若从-80℃取出,需在冷水中解冻)进行如下操作:2000g离心15分钟去除死细胞,收集上清弃去沉淀;10000g离心30分钟去除细胞碎片,收集上清弃去沉淀;用0.22μm的滤膜过滤上清去除粒径较大的微囊泡。将得到的滤液转移至100kD超滤管中,3000g离心20分钟,弃去下层滤液,得到培养上清浓缩液。将浓缩液转移至超速离心管中,100000g离心70分钟,弃上清,用10ml灭菌后的PBS重悬沉淀,反复吹打使外泌体均匀分散在PBS中,得到外泌体悬液。将外泌体悬液继续10 0000g离心70分钟得到纯化的Nex沉淀,根据沉淀量加入适量的PBS缓冲液,得到Nex悬液,可保存于-80℃。用纳米颗粒跟踪分析仪(Zetaview)检测Nex的颗粒浓度,并用BCA试剂盒(CWBIO)测定蛋白浓度进行定量。取10μLNex滴加在铜网上,静置10分钟。洗掉表面多余液体,用2%醋酸双氧铀染色3次,每次1分钟,PBS洗3遍。待铜网充分晾干后,使用透射电镜(HT7700)观察Nex的大小、形貌。
如图1纳米颗粒跟踪分析结果显示,Nex粒径主要分布在100-120nm左右,定量分析结果显示Nex浓度为3×1011个/mL。图2透射电镜结果显示,Nex形态呈盘装,粒径大小为100nm左右,属于exosomes粒径范围,说明Nex制备成功。
实施例2 Nex在细胞水平上的抗肿瘤活性
HepG2-luc和CT26细胞(购买自中科院细胞库)经胰酶消化后,分别用DMEM培养基和RPMI-1640培养基(Gibco)重悬,使得细胞密度约为1×105个/mL。向96孔板每孔中加入100μL细胞悬液,继续在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24小时。向细胞中加入不同剂量的Nex,处理48小时后,向96孔板中加入等量MTT溶液(Sigma,又称四氮唑盐),37℃孵育4小时,除去含有MTT的培养基,PBS洗涤3遍。每孔加入100μL DMSO溶液(二甲基亚砜溶液),室温静置5-10分钟。利用微孔板检测仪分别记录540nm与650nm处的吸光度值,细胞存活率以未处理对照组细胞的百分比计算。结果如图3所示,相对于空白对照组,Nex可以显著促进肿瘤细胞凋亡,且有剂量依赖性。
CT26肿瘤细胞经过Nex处理后,由于Nex表面携带的FasL蛋白可以与肿瘤细胞表面的Fas蛋白发生特异性结合,启动凋亡通路,肿瘤细胞内Caspase-3蛋白和PARP-1蛋白被剪切,最终发生凋亡。提取CT26细胞中的蛋白并用Western Blot(蛋白印迹法)检测细胞中凋亡蛋白的表达情况。实验结果如图4所示(其中对照组和32μg组进行了两次),Caspase-3蛋白和PARP-1蛋白在细胞凋亡过程中发生了剪切,表达量下降,而Cleaved-PARP-1蛋白表达量上升,这与预期结果一致。
对比例1 Nex@Ce6的制备
具体步骤为:
(1)取实施例1中纯化的Nex悬液(1mg/mL)100μL于1.5mL EP管中,放置在冰上。
(2)将100μg Nex与100μg Ce6(二氢卟吩e6)进行混合,室温条件下孵育30分钟。用3kD超滤管除去游离的Ce6分子,即可得到外泌体Nex@Ce6。
实施例3 Nex@siRNA/Ce6的制备及入胞效果分析
具体步骤为:
(1)取实施例1中得到的纯化好的Nex悬液(1mg/mL)100μL于1.5mL EP管中,放置在冰上。
(2)用DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶解PLK1(Polo-like Kinase 1,Polo样激酶1)siRNA干粉(siPLK1,苏州瑞博生物技术股份有限公司),使其浓度为1mg/mL。
(3)取100μL siPLK1溶液加入至Nex中,轻轻吹打均匀,将200μL混合液转移至预冷好的0.4cm电转杯中。
(4)向电转杯中加入200μL PBS,轻轻吹打均匀,使得体系总体积为400μL。
(5)使用Bio-RAD电转仪进行电转,设置电转参数为:200V,125μF,200Ω。
(6)从电转杯中吸出混合液转移至新的EP管中,37℃孵育30分钟促进外泌体的膜恢复。
(7)将(6)所得液体转移至50kD超滤管,3000×g离心15分钟超滤除去未进入外泌体中的siRNA,得到Nex@siRNA。
(8)将100μg Nex@siRNA与100μg Ce6(二氢卟吩e6)进行混合,室温条件下孵育30分钟。用3kD超滤管除去游离的Ce6分子,即可得到工程化外泌体Nex@siRNA/Ce6。
为了进一步判断工程化外泌体是否成功制备,我们分别对外泌体、siRNA进行荧光标记并成像,结果如图5所示,Nex以及siRNA的荧光重叠在一起,表明Nex@siRNA/Ce6制备成功。此外Nex和siRNA的荧光均紧密围绕着细胞核,表明Nex@siRNA/Ce6被细胞胞吞。
实施例4 Nex@siRNA/Ce6的抗肿瘤活性检测
(1)Nex@siRNA/Ce6在光照下产生ROS
将HepG2细胞均匀铺在6孔板(2×105个/孔)中,24小时后对细胞进行如下处理:阴性对照组细胞不做任何处理;阳性对照组细胞用Rosup(试剂盒提供)刺激(通常刺激后1小时左右可以观察到显著的活性氧水平升高)1小时;按照实施例3的方法制备Nex@siRNA/Ce6,并转染至肿瘤细胞。转染4小时后,吸弃培养上清,PBS洗涤3遍后加入新鲜培养基,继续在细胞培养箱中培养4小时(Nex@siRNA/Ce6组)或者将细胞置于660nm近红外激光下照射2分钟后继续在细胞培养箱中培养4小时(Nex@siRNA/Ce6+L组)。使用ROS检测试剂盒(YEASEN)检测肿瘤细胞ROS产生情况,并用流式细胞仪进行分析(每个样品检测10000个细胞)。结果如图6所示,阴性对照组细胞无ROS产生,阳性对照组有约36%的细胞产生了ROS,而转染了Nex@siRNA/Ce6的两组细胞中,非光照组(Nex@siRNA/Ce6)细胞不产生ROS,光照组(Nex@siRNA/Ce6+L)中有约63.8%的细胞产生了ROS。
(2)Nex@siRNA/Ce6内涵体逃逸效果
将HepG2细胞均匀铺在6孔板(2×105个/孔)中,继续培养24小时后对细胞进行如下处理:对照组细胞不进行任何处理;Lipo组用Lipofectamine2000(阳离子脂质体,常用作阳性转染试剂)包裹Cy5标记的siRNA转染细胞;Nex@siRNA/Ce6组按照实施例3的方法制备荧光标记的Nex@siRNA/Ce6,转染至肿瘤细胞。Nex@siRNA/Ce6+L组按照实施例3的方法制备荧光标记的Nex@siRNA/Ce6,转染至肿瘤细胞。所有实验组转染4小时后,吸弃培养上清,PBS洗涤3遍后加入新鲜培养基后继续再细胞培养箱培养4小时。其中,将Nex@siRNA/Ce6+L组细胞置于660nm近红外激光下照射2分钟,继续培养4小时。对所有实验组的细胞进行细胞核(Hoechst33342)和内涵体(Lysotracker Green)染色,在激光共聚焦显微镜下观察Nex@siRNA/Ce6的内涵体逃逸效果。结果如图7所示,对照组细胞由于没有进行转染,故没有siRNA荧光信号;Lipo组细胞siRNA与内涵体荧光信号有明显的共定位,表明siRNA进入到内涵体中且很少发生逃逸;Nex@siRNA/Ce6组细胞siRNA与内涵体荧光信号有较为明显的共定位情况,表明Nex@siRNA/Ce6进入到细胞中的内涵体中且无法从内涵体中逃逸;而经过光照处理的Nex@siRNA/Ce6组(Nex@siRNA/Ce6+L)细胞,内涵体与siRNA荧光信号共定位明显减少,表明光照处理后ROS促进了内涵体膜的破裂,使siRNA从内涵体逃逸到细胞质中。图8为对图7的定量分析结果,皮尔森相关系数越小,表明荧光共定位情况越少,则内涵体逃逸效果越好。结果显示,Nex@siRNA/Ce6+L组内涵体逃逸效果最佳。
(3)Nex@siPLK1/Ce6体内动物水平抗肝癌肿瘤活性检测
将传代获得的HepG2-luc细胞,经过PBS清洗两遍后,重悬于PBS中并在显微镜下观察计数,用PBS调整细胞浓度为2×107个/mL,并收集在15mL的离心管中备用。然后分别按每只小鼠0.1mL细胞悬液的量注射于雌性裸鼠右上肢腹股沟处,随后每天观察成瘤情况,并记录。
根据瘤体大小,随机将负荷肝癌的小鼠分成5组,每组6只并编号。5组分别为:PBS组、Nex组、Nex@Ce6+L组(注射Nex@Ce6并进行光照处理)、Nex@siPLK1组、Nex@siPLK1/Ce6+L组(注射Nex@siPLK1/Ce6并进行光照处理)。待小鼠肿瘤增长到50mm3体积后,按照siRNA1mg/kg的给药量进行给药,给药后对Nex@Ce6+L组以及Nex@siPLK1/Ce6+L组小鼠肿瘤部位进行660nm激光照射5分钟。每隔一天给药一次,每次给药前用游标卡尺测量小鼠的肿瘤长和宽来统计各组小鼠肿瘤生长情况。
应用Graphpad Prism8软件对各组肿瘤体积进行统计分析,单组数据间使用t检验,多组数据间使用oneway-ANOVA分析,p<0.05为有统计学意义。结果如图9所示,在小鼠体内,Nex@siPLK1/Ce6+L组与其他实验组相比可明显抑制肝癌肿瘤增殖。而Nex也具有一定抑制肿瘤组织增殖的效果,但是与Nex@siPLK1/Ce6相比,抑制作用明显较弱。这个结果也进一步说明相比于天然的Nex,工程化的外泌体Nex@siPLK1/Ce6对肝癌肿瘤有更强的杀伤性(p<0.05)。
在给药终点时,取各组肿瘤组织进行匀浆,提取组织的总RNA并进行PLK1基因抑制分析。结果如图10所示,Nex@siLK1/Ce6+L组基因抑制效果显著提升。
(4)Nex@siRNA/Ce6体内动物水平抗结肠癌肿瘤活性检测
将传代获得的CT26细胞经过PBS清洗两遍后,用PBS重悬并在显微镜下观察计数,用PBS调节细胞浓度为2×107个/mL,并收集在15mL的离心管中备用。然后按每只小鼠0.1mL细胞混悬液的量注射于BABL/c小白鼠右上肢腹股沟处,随后每天观察成瘤情况并记录。
将负荷结肠癌的小鼠随机分成5组,每组6只并编号。5组小鼠分别为:PBS组、Nex组、Nex@Ce6+L组(光照处理)、Nex@siPD-L1组、Nex@siPD-L1/Ce6+L组(光照处理)。待小鼠肿瘤体积增长到50mm3后,按照siRNA 1mg/kg的给药量进行给药,给药后对Nex@Ce6+L组以及Nex@siRNA/Ce6+L组小鼠肿瘤部位进行660nm激光照射5分钟。每隔一天给药一次,其中光照组进行光照一次。每次给药前用游标卡尺测量小鼠的肿瘤长和宽来统计各组小鼠肿瘤生长情况。
应用Graphpad Prism8软件对各组肿瘤体积进行统计分析,单组数据间使用t检验,多组数据间使用oneway-ANOVA分析,p<0.05为有统计学意义。结果如图11所示,在小鼠体内,Nex@siPD-L1/Ce6+L组与其他实验组相比可明显抑制结肠癌肿瘤增殖。(p<0.05)。
在给药终点时,摘除各组肿瘤组织并进行下游分析。提取组织总RNA并进行PD-L1基因抑制情况分析,结果如图12所示,与Nex@siPD-L1组相比,Nex@siPD-L1/Ce6+L组基因抑制效果明显提升,表明光照可以明显提升siRNA的基因沉默效果。M1型巨噬细胞在抗肿瘤过程中发挥重要作用,而M2型巨噬细胞在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用。利用试剂盒提取肿瘤组织中的M1与M2巨噬细胞并进行流式分析,结果如图13所示,Nex@siPD-L1/Ce6+L及Nex@Ce6+L组M1/M2的比率明显提升,表明光照产生的ROS可以促进肿瘤组织中M2巨噬细胞向M1型巨噬细胞转型,提高了小鼠机体抗肿瘤免疫反应。
所属领域的普通技术人员应当理解:以上任何实施例的讨论仅为示例性的,并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子;在本公开的思路下,以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合,步骤可以以任意顺序实现,并存在如上所述的本申请中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化,为了简明它们没有在细节中提供。
本申请中一个或多个实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此,凡在本申请中一个或多个实施例的精神和原则之内,所做的任何省略、修改、等同替换、改进等,均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗肿瘤的工程化外泌体,其特征是,包括外泌体,所述外泌体内包覆有抗肿瘤的核酸药物和光敏剂。
2.如权利要求1所述的抗肿瘤的工程化外泌体,其特征是,所述外泌体为免疫细胞来源的外泌体。
3.如权利要求2所述的抗肿瘤的工程化外泌体,其特征是,所述外泌体为NK细胞、T细胞、B细胞或者DC细胞来源的外泌体。
4.如权利要求1所述的抗肿瘤的工程化外泌体,其特征是,所述抗肿瘤的核酸药物是长度为15-200个核苷酸的核酸药物。
5.如权利要求4所述的抗肿瘤的工程化外泌体,其特征是,所述抗肿瘤的核酸药物为siRNA、micro RNA、shRNA、piRNA或ASO。
6.如权利要求5所述的抗肿瘤的工程化外泌体,其特征是,所述抗肿瘤的核酸药物为靶向PLK1基因的siRNA或靶向PD-L1的siRNA。
7.如权利要求1所述的抗肿瘤的工程化外泌体,其特征是,所述光敏剂为二氢卟吩类光敏剂。
8.如权利要求7所述的抗肿瘤的工程化外泌体,其特征是,所述光敏剂为Ce6。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的抗肿瘤的工程化外泌体的制备方法,其特征是,包括如下步骤,培养细胞,收集外泌体;然后将核酸药物装载入外泌体中,通过过滤除去游离的核酸药物,得到前工程化外泌体;将前工程化外泌体与光敏剂进行混合孵育,通过过滤除去游离的光敏剂,得到工程化外泌体。
10.一种如权利要求1-8任一项所述的抗肿瘤的工程化外泌体在制备抗肿瘤药物中的应用。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114042053A (zh) * | 2021-10-25 | 2022-02-15 | 北京理工大学 | siRNA输送载体及其制备方法和应用 |
CN115737830A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-03-07 | 中国人民解放军空军军医大学 | 一种时空差异化诱导肿瘤免疫原性死亡和增强抗原提呈的水凝胶疫苗及其制备方法和应用 |
WO2023113134A1 (ko) * | 2021-12-15 | 2023-06-22 | 전남대학교산학협력단 | 약물 담지 면역세포 유래 세포 외 소포 및 이의 제조 방법 |
CN116445404A (zh) * | 2022-12-29 | 2023-07-18 | 贵州医科大学 | 一种nk细胞来源的外泌体的制备及药物装载方法与应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107789361A (zh) * | 2017-10-13 | 2018-03-13 | 天津市肿瘤医院 | 一种靶向性治疗肿瘤的药物的制备方法与应用 |
CN108486060A (zh) * | 2018-03-12 | 2018-09-04 | 上海宇玫博生物科技有限公司 | 一种用于治疗肿瘤的外泌体及其制备方法和应用 |
CN111527199A (zh) * | 2017-11-16 | 2020-08-11 | 得克萨斯大学体系董事会 | 用于制备来源于msc的外泌体的方法 |
-
2021
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107789361A (zh) * | 2017-10-13 | 2018-03-13 | 天津市肿瘤医院 | 一种靶向性治疗肿瘤的药物的制备方法与应用 |
CN111527199A (zh) * | 2017-11-16 | 2020-08-11 | 得克萨斯大学体系董事会 | 用于制备来源于msc的外泌体的方法 |
CN108486060A (zh) * | 2018-03-12 | 2018-09-04 | 上海宇玫博生物科技有限公司 | 一种用于治疗肿瘤的外泌体及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MD ABDUS SUBHAN等: "siRNA based drug design, quality, delivery and clinical translation", 《NANOMEDICINE》, vol. 29, 13 June 2020 (2020-06-13), pages 102239, XP086259372, DOI: 10.1016/j.nano.2020.102239 * |
刘萍等: "二氢卟吩类光敏剂在光动力疗法治疗恶性肿瘤中的研究进展", 《现代肿瘤医学》, vol. 28, no. 01, 31 January 2020 (2020-01-31), pages 177 - 180 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114042053A (zh) * | 2021-10-25 | 2022-02-15 | 北京理工大学 | siRNA输送载体及其制备方法和应用 |
WO2023113134A1 (ko) * | 2021-12-15 | 2023-06-22 | 전남대학교산학협력단 | 약물 담지 면역세포 유래 세포 외 소포 및 이의 제조 방법 |
CN115737830A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-03-07 | 中国人民解放军空军军医大学 | 一种时空差异化诱导肿瘤免疫原性死亡和增强抗原提呈的水凝胶疫苗及其制备方法和应用 |
CN115737830B (zh) * | 2022-11-30 | 2023-08-15 | 中国人民解放军空军军医大学 | 一种时空差异化诱导肿瘤免疫原性死亡和增强抗原提呈的水凝胶疫苗及其制备方法和应用 |
CN116445404A (zh) * | 2022-12-29 | 2023-07-18 | 贵州医科大学 | 一种nk细胞来源的外泌体的制备及药物装载方法与应用 |
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