KR20190036505A - 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 분석 방법 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 세포밖 소포체 분석 방법은 크기 배제 크로마토그래피의 크기별 분획능과 세포밖 소포체에 특이적으로 결합하는 탐침의 특성을 이용한 것으로서, 이를 이용하여 시료 중 포함된 세포밖 소포체의 정량 분석, 세포밖 소포체의 물리화학적 특성 분석, 세포밖 소포체에 포함된 구성성분의 종류 및 정량 분석, 세포밖 소포체 구성 성분에 대한 탐침의 결합 특이성 또는 친화도 분석을 빠르고 용이하게 할 수 있다. 또한 본 발명의 분석 방법을 이용하면 시료의 정제 또는 전처리 과정 없이 시료 중 세포밖 소포체를 정확하게 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 탐침의 종류에 따라 세포밖 소포체의 구성성분을 간단하고 정확하게 분석할 수 있기 때문에 세포밖 소포체를 이용한 진단 효율을 향상시킬 수 있다. 또한 탐침의 특이성 및 친화도 분석을 이용하여 세포밖 소포체 특이적 항체 스크리닝, 단백질 스크리닝, 화학물질 스크리닝 등에 활용할 수 있다.

Description

크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 분석 방법 및 이의 용도{Method for the analysis of extracellular vesicles using size exclusion chromatography and use thereof}
본 발명은 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 분석 방법 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 크기 배제 크로마토그래피의 크기별 분획능과 세포밖 소포체에 특이적으로 결합하는 탐침을 이용하여 시료 중 포함된 세포밖 소포체를 분석하는 방법에 관한 것이다.
세포밖 소포체(extracellular vesicles)는 세포의 보편적인 기작으로, 생체 내 또는 시험관 내의 여러 종류의 세포로부터 분비되는 나노 크기의 생체 입자로서 혈액, 소변, 침, 눈물 등과 같은 체액에 존재하고 세포에서 유래한 지질이중층을 포함하며, 20 ~ 1,000 nm 범위의 다양한 크기를 갖는 막 구조의 소포체이다.
이들 세포밖 소포체는 다양한 생명 현상에서 여러 중요한 기능에 관여한다. 진핵세포에서 유래한 세포밖 소포체의 경우, 적혈구 분화, 면역반응 조절 등에 관여하며, 특히 암세포 미세환경에서는 암의 진행, 전이, 혈관형성 등에 관련된 많은 기능들이 밝혀짐으로써 암을 포함한 다양한 질병의 진단 마커로의 활용에 있어 높은 관심을 받고 있다.
원핵세포로부터 분비되는 세포밖 소포체는 진핵세포의 세포밖 소포체와 유사하게 원핵세포의 구성물을 함유하고 있으며, 인체에서는 전신염증을 비롯, 유입 경로에 따라 급성 폐염증 질환을 유도하고, 피부의 경우, 국소 피부 조직의 염증반응을 만성적으로 유도하여 현대인의 대표 질병 중 하나인 아토피성 피부염(atopic dermatitis)의 원인이 될 수 있음이 보고되었다. 또한 인체에서 박테리아 유래 세포밖 소포체가 암을 비롯한 다양한 질환과 연관성이 있다는 점이 보고됨에 따라 원핵세포 유래 세포밖 소포체 또한 높은 관심을 받고 있다.
세포밖 소포체는 단백질, 지질, 핵산, 아미노산 등 모세포로부터 유래한 물질로 구성되어 있으며, 생체에서는 이러한 물질들을 전달하는 운송체 역할을 하기 때문에 세포밖 소포체를 구성하는 단백질, 지질, 아미노산, 핵산 등을 분석함으로써 모세포의 생리적, 병리적 특성을 알 수 있는 중요한 근거가 된다. 따라서 다양한 시료에 존재하는 세포밖 소포체의 구성 성분 분석은 기초 및 의학 분야에서 높은 관심을 받고 있다.
또한, 세포밖 소포체에 포함되어 있는 핵산, 성장호르몬, 단백질 등은 세포막 형태의 인지질에 의해 보호되고 있어, 가용성 형태의 성장인자 및 사이토카인보다 안정적인 기능을 수행할 수 있다는 점이 알려지면서, 세포밖 소포체의 중요성이 점차 증대되고 있으며, 세포밖 소포체에 포함된 물질을 분석하여 질병의 진단, 치료를 포함한 다양한 용도로의 활용 가능성이 기대되고 있다.
최근 비 침습적 액체 생검(liquid biopsy)을 질병 진단에 활용하는 방안이 다각도로 전개되고 있고, 더 나아가 체액 내 세포밖 소포체를 활용하여 새로운 질병 진단 마커를 발굴하고 이를 이용해 진단 방법을 개발하려는 노력들이 시도되고 있다. 진단 방법 개발에 있어서 핵심요소는 탐침을 이용하여 소량의 시료에서 빠르고 정확하게 대상 물질을 정량하는 기술 개발에 있다. 따라서 생물학적 시료에 존재하는 세포밖 소포체의 구성 성분을 탐침을 이용해 분석하는 방법이 매우 중요한데, 이러한 세포밖 소포체의 구성 성분 분석은 단계가 복잡하고 효율이 떨어지는 초원심분리 기술을 통한 정제에 기반하여 이루어지고 있으며 이러한 초원심분리법에서는 세포밖 소포체 분리 수율이 낮고 세포밖 소포체와 결합하지 않은 탐침의 제거가 효율적으로 이루어지지 않기 때문에, 상대적으로 제한된 양과 높은 복잡성을 나타내는 체액의 경우 상기 방법으로 정량적인 분석을 하기란 거의 불가능하다. 따라서 통상의 세포밖 소포체 분석법과는 차별화되는 신속하고 과정이 단순한 신규한 기술개발이 시급하다.
본 발명의 목적은 (a) 세포밖 소포체의 구성성분과 특이적으로 결합하는 결합부 및 검출 가능한 신호부를 포함하는 탐침 및 세포밖 소포체를 포함하는 시료를 혼합하여 반응시키는 단계, (b) 상기 혼합 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 전개시키는 단계 및 (c) 상기 전개된 시료로부터 세포밖 소포체-탐침 복합체 및 자유 탐침을 검출하는 단계를 포함하는 세포밖 소포체의 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 세포밖 소포체의 구성성분과 특이적으로 결합하는 결합부 및 검출 가능한 신호부를 포함하는 탐침 및 세포밖 소포체를 포함하는 시료를 혼합하여 반응시키는 단계, (b) 상기 혼합 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 전개시키는 단계 및 (c) 상기 크기 배제 크로마토그래피 컬럼으로부터 세포밖 소포체-탐침 복합체를 분리하는 단계 및 (d) 상기 분리된 세포밖 소포체-탐침 복합체에서 탐침을 검출하는 단계를 포함하는 세포밖 소포체의 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 세포밖 소포체의 구성성분과 특이적으로 결합하는 다양한 물질을 탐침으로 사용하여 시료와 반응시킴으로써 세포밖 소포체-탐침 복합체를 형성하고, 이를 크기 배제 크로마토그래피로 전개시킨 후 탐침을 검출함으로써 세포밖 소포체를 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 "크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC)"라 함은 다양한 크기의 용질이 다공성 매트릭스를 통과하는 속도(투과도)를 기반으로 혼합물을 분리하는 기술을 의미한다. 즉 분석대상 시료를 젤, 매트릭스, 구슬(bead)과 같은 다공성 정지상(stationary phase)이 채워진 컬럼을 통과시키면, 컬럼의 구멍을 통과할 수 없는 큰 분자들은 구멍에 들어가지 못하고 주변의 빈 공간을 통해 빠르게 컬럼을 빠져 나오는 반면, 작은 분자들은 컬럼의 구멍을 통해 나오면서 상대적으로 천천히 이동하여 컬럼을 빠져 나오는 원리를 이용한 것이다. 이 방법은 일반적으로 완충액 교환(buffer　exchange)을 위한 탈염화(desalting), 정제를 위한 분리 또는 용질 크기에 따른 분자량 측정에 사용된다.
본 발명에서는 세포밖 소포체를 포함하는 다양한 시료에 특이적으로 결합하는 탐침을 반응시켜 세포밖 소포체-탐침 복합체를 형성하고, 이를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 통과시킴으로써, 상기 복합체와 자유 탐침을 빠르고 쉽게 분획할 수 있으며, 다음 단계에서 이렇게 분리된 용출물을 분석함으로써 세포밖 소포체의 정량 분석 및 구성성분 분석을 용이하고 효율적으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "세포밖 소포체"는 고세균(Archaea), 원핵생물(Prokarya) 또는 진핵생물(Eukarya)의 세포로부터 유래한 생체 나노입자를 통칭하며, 세포밖 소포체(exosome), 아그로좀(argosomes), 덱소좀(dexosomes), 엑토좀(ectosomes), 엑소베지클(exovesicle), 온코좀(oncosome), 프로미노좀(prominosome), 프로스타좀(prostasome), 톨레로좀(tolerosome), 미세입자(microparticle), 미세소포(microvesicle), 나노소포(nanovesicle), 수포성 소포(blebbing vesicle), 출아성 소포(budding vesicle), 세포밖 소포체-유사 소포(exosome-like vesicle), 매트릭스 소포(matrix vesicle), 막 소포(membrane vesicle), 탈피성 소포(shedding vesicle), 막 입자(membrane particle), 탈피성 미세소포(shedding microvesicle), 막 수포(membrane bleb), 에피디디모좀(epididimosome), 프로미니노좀(promininosome), 텍소좀(texosome) 또는 아키오좀(archeosome)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 세포밖 소포체 분석 방법을 도 1에 모식적으로 나타내었다.
본 발명의 세포밖 소포체 분석 방법은 세포밖 소포체의 구성성분과 특이적으로 결합하는 결합부 및 검출 가능한 신호부를 포함하는 탐침 및 세포밖 소포체를 포함하는 시료를 혼합하여 반응시키는 단계[(a) 단계]를 포함한다.
본 발명의 용어 "탐침(probe)"은 세포밖 소포체를 구성하는 성분과 특이적으로 결합함과 동시에 분광학적, 물리화학적, 양자화학적, 효소학적 분석 방법 등을 이용하여 검출 및 분석이 가능한 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서 상기 탐침은 i) 세포밖 소포체의 구성성분과 특이적으로 결합하는 결합부 및 검출 가능한 신호부를 포함하는 단일 물질 또는 ii) 세포밖 소포체의 구성성분과 특이적으로 결합하는 결합부를 포함하는 물질에 분석 가능한 하나 이상의 신호부를 포함하는 물질이 결합된 복합 물질일 수 있다.
세포밖 소포체는 이중지질막으로 둘러싸여 있고, 단백질, 지질, 핵산, 아미노산 등 모세포로부터 유래한 물질로 구성되어 있으며, 이들은 성분에 따라 세포밖 소포체의 막 표면, 세포밖 소포체의 막 또는 세포밖 소포체의 내부에 분포한다. 본 발명에 있어서 상기 탐침의 결합부는 상기와 같은 세포밖 소포체의 막 표면 성분, 세포밖 소포체의 막 성분 및 세포밖 소포체의 내부 성분으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성분과 특이적으로 결합하는 특징을 갖는다.
본 발명의 상기 탐침은 세포밖 소포체를 구성하는 성분 중 하나 이상의 물질과 특이적으로 결합하는 단백질, 항체, 항체 유래 물질, 펩티드, 핵산, 핵산-아미노산 복합체, 효소, 효소 기질, 화학적 리간드 및 이들의 화합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 탐침은 세포밖 소포체 구성성분과 특이적으로 결합함과 동시에 검출 단계에서 검출 가능한 물질일 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 세포밖 소포체 내부 성분인 에스테르분해효소(esterase)의 기질 중 하나인 VPD450 또는 CFDA-SE를 탐침으로 사용하였다. 상기 기질은 세포밖 소포체 중 에스테르분해효소와 특이적으로 결합함과 동시에, 효소 활성에 의해 형광물질로 변환될 수 있어 별도의 표지 없이 형광 신호 검출이 가능하다.
본 발명의 상기 탐침은 세포밖 소포체를 구성하는 성분 중 하나 이상의 물질과 특이적으로 결합하는 물질에 검출 가능한 신호부를 추가로 포함할 수 있다. 상기 탐침의 신호부는 형광 물질, 효소 기질, 효소, 단백질, 펩티드, 핵산, 비오틴, 금속 및 방사성동위원소로 이루어진 군에서 하나 이상이 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일실시예에 따르면 세포밖 소포체의 막 표면 단백질을 인식하는 항체에 형광 표지를 부착한 탐침을 사용하였다.
본 발명의 용어 "시료"는 세포밖 소포체를 포함하는 생체 시료 또는 세포 배양액, 조직 시료 등을 포함하는 것으로서, 구체적으로 포유동물 세포 배양 배지, 박테리아 세포 배양 배지, 효모 배양 배지, 조직 추출물, 암 조직, 혈청, 혈장, 침, 눈물, 안방수, 땀, 소변, 대변, 뇌척수액(CSF, cerebrospinal fluid), 복수(ascite), 양수(amniotic fluid), 정액, 유(milk), 먼지, 담수, 해수, 토양 및 발효식품으로 이루어진 군에서 하나 이상이 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 세포밖 소포체 분석 방법은 상기 혼합 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 전개시키는 단계[(b) 단계]를 포함한다.
본 발명의 용어 "컬럼"은 크기 배제 크로마토그래피에 사용되는 다공성 고정상이 채워진 단위이며, 상기 고정상은 분자량에 따라 물질을 분획하기 위한 다양한 크기의 구멍이 있는 입자를 의미한다. 상기 고정상에 존재하는 구멍의 크기에 따라 시료 내 존재하는 분자들의 분자 크기에 따른 분리 해상능이 변하게 된다. 예로, 고정상에 존재하는 구멍이 큰 경우는 상대적으로 큰 분자들의 분리에 효율적이고 상대적으로 작은 분자는 분리되지 않고 용출된다. 반면, 고정상에 존재하는 구멍의 크기가 작은 경우 큰 분자들의 분리 정도는 낮게 용출되지만, 일정 크기 이상과 이하의 분자를 분리하는 데는 효율적일 수 있다. 따라서 통상적으로는 분리하고자 하는 분자의 크기와 시료 내 오염물질의 크기를 고려하여 최적의 분리 효율을 제공하는 크기의 구멍을 가진 고정상을 선택하게 된다. 크기 배제 크로마토그래피에서 가장 널리 사용되는 젤은 세파로즈(Sepharose; GE Healthcare), 수퍼로즈(Superose; GE Healthcare), 세파덱스(Sephadex;　Pharmacia),　Bio-Gel　P(Bio-Rad)와 TSKgel® (silica-based; Sigma) 등의 계열이며, 본 발명의 일실시예에서는 나노 입자인 세포밖 소포체를 다양한 크기의 단백질과 분리할 수 있는 크기의 구멍을 가진 세파크릴(Sephacryl) S500 고정상을 사용하였지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 크기 배제 크로마토그래피 전개 방식은 펌프식, 회전식, 중력식 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 세포밖 소포체 분석 방법은 상기 전개된 시료로부터 세포밖 소포체-탐침 복합체 및 자유 탐침을 검출하는 단계[(c) 단계]를 포함한다.
본 발명의 상기 검출 단계는 상기 크기 배제 크로마토그래피를 통해 분리된 세포밖 소포체-탐침 복합체뿐만 아니라 세포밖 소포체와 결합하지 않은 자유 탐침을 동시에 검출함으로써 목적하는 분석 결과를 얻을 수 있다.
본 발명의 상기 검출 단계는 특정 파장에 대한 흡광 크로마토그램을 검출함으로써 세포밖 소포체를 정량하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 특정 파장은 200 nm ~ 800 nm 범위에서 선택되는 하나 이상의 값이 선택될 수 있다. 본 발명에서 상기 특정 파장은 330 내지 450 nm 범위 중 하나 이상의 파장, 230 nm, 260 nm 또는 280 nm의 파장 중에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 상기 검출 단계는 탐침의 신호부를 검출하여 탐침을 정량하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 탐침의 신호부를 검출하는 단계는 탐침의 신호부 종류에 따라 적합한 검출 및 분석 방법을 선택할 수 있으며, 분광학적 분석(흡광, 형광, 산란, 방사성), 물리화학적 분석, 양자화학적 분석, 효소학적 분석, 비오틴 분석 및 핵산 분석으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 탐침 검출 단계는 탐침의 신호부의 성질에 따라 직접적 분석 또는 간접적 분석을 포함한다. 탐침이 가지는 빛의 파장에 따른 직접적인 분광학적 분석이 가능한 경우, 탐침의 형광 신호, 흡광 신호, 산란 신호, 또는 발광 및 방사성 신호를 검출하여 분석할 수 있다. 탐침의 신호부에 부가적인 처리가 필요한 경우, 비오틴 분석, 항체 분석, 효소 분석, 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR) 분석 등을 이용하여 간접적으로 분석할 수 있다.
본 발명은 또한 시료로부터 세포밖 소포체-탐침 복합체를 분리한 후 이를 분석함으로써 세포밖 소포체를 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명의 세포밖 소포체 분석 방법은 세포밖 소포체의 구성성분과 특이적으로 결합하는 결합부 및 검출 가능한 신호부를 포함하는 탐침 및 세포밖 소포체를 포함하는 시료를 혼합하여 반응시키는 단계[(a) 단계] 및 상기 혼합 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 전개시키는 단계[(b) 단계]를 포함한다.
본 발명의 탐침, 시료 또는 크기 배제 크로마토그래피에 관한 상세한 설명은 상기한 바와 같다.
본 발명의 세포밖 소포체 분석 방법은 상기 크기 배제 크로마토그래피 컬럼으로부터 세포밖 소포체-탐침 복합체를 분리하는 단계[(c) 단계]를 포함한다.
본 발명의 세포밖 소포체-탐침 복합체 분리 단계는 크기 배제 크로마토그래피의 크기별 분획능을 이용한 것으로서, 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 통과시키면 시료 중 포함된 세포밖 소포체와 기타 불순물이 크기가 큰 순서대로 시간 순으로 용출된다. 나노 입자인 세포밖 소포체를 다양한 크기의 단백질과 분리할 수 있는 크기의 구멍을 가진 고정상을 사용하면, 세포밖 소포체는 분자의 크기가 1,000 kDa 이상으로 자유 탐침 또는 다른 불순물에 비해 크기가 큰 입자에 속하기 때문에 상대적으로 빠르게 용출된다. 본 발명에서 시료에 혼합시킨 탐침 중 일부는 세포밖 소포체와 특이적으로 반응하여 복합체를 형성하고 나머지는 세포밖 소포체와 결합하지 않는 자유 탐침으로 남으며, 상대적으로 크기가 큰 세포밖 소포체-탐침 복합체가 자유 탐침에 비해 빠르게 용출되어 분리된다. 각 물질의 용출 시간은 다공성 정지상의 크기 및 구멍 크기, 컬럼의 길이, 이동상의 유속 등에 따라 상이하며, 동일한 조건에서는 특정 시간에 용출된다.
본 발명의 세포밖 소포체 분석 방법은 상기 분리된 세포밖 소포체-탐침 복합체에서 탐침을 검출하는 단계[(d) 단계]를 포함한다.
본 발명의 상기 검출 단계에 관한 상세한 설명은 상기한 바와 같다.
본 발명의 상기 검출 단계에서는 세포밖 소포체의 정량 분석, 세포밖 소포체와 결합한 탐침의 양을 분석할 수 있으며, 탐침의 종류에 따라 세포밖 소포체에 대한 특이성 또는 친화도를 분석하여 탐침의 성능 평가에 활용할 수 있다.
본 발명의 세포밖 소포체 분석 방법은 크기 배제 크로마토그래피의 크기별 분획능과 세포밖 소포체에 특이적으로 결합하는 탐침의 특성을 이용한 것으로서, 이를 이용하여 시료 중 포함된 세포밖 소포체의 정량 분석, 세포밖 소포체의 물리화학적 특성 분석, 세포밖 소포체에 포함된 구성성분의 종류 및 정량 분석, 세포밖 소포체 구성 성분에 대한 탐침의 결합 특이성 또는 친화도 분석을 빠르고 용이하게 할 수 있다. 또한 본 발명의 분석 방법을 이용하면 시료의 정제 또는 전처리 과정 없이 시료 중 세포밖 소포체를 정확하게 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 탐침의 종류에 따라 세포밖 소포체의 구성성분을 간단하고 정확하게 분석할 수 있기 때문에 세포밖 소포체를 이용한 진단 효율을 향상시킬 수 있다. 또한 탐침의 특이성 및 친화도 분석을 이용하여 세포밖 소포체 특이적 항체 스크리닝, 단백질 스크리닝, 화학물질 스크리닝 등에 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 세포밖 소포체 분석 방법에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 대장암 세포주 SW480으로부터 표본 세포밖 소포체의 분리 모식도 및 분리한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 형광물질로 표지된 마우스 항체 (Normal mouse IgG)와 표본 세포밖 소포체의 결합 양상을 확인한 UV(a) 및 형광(b) 크로마토그램이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 형광물질로 표지된CD63항체(anti-CD63 antibody)와 표본 세포밖 소포체의 결합 양상을 확인한 UV(a) 및 형광(b) 크로마토그램이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 형광물질로 표지된CD81항체(anti-CD63 antibody)와 표본 세포밖 소포체의 결합 양상을 확인한 UV(a) 및 형광(b) 크로마토그램이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 표본 세포밖 소포체에서 형광 표지된 CD63 항체의 특이성을 확인한 형광 크로마토그램이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 기원이 다른 세포밖 소포체에서 CD81 세포밖 소포체 마커의 발현 양상을 확인한 UV(a) 및 형광(b) 크로마토그램이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 TNFa(Tumor necrosis factor alpha) 가 대장암세포에서 분비되는 세포밖 소포체의 ICAM1 단백질 발현에 미치는 영향을 분석한 UV (a) 및 형광 (b, c) 크로마토그램이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 형광이 표지된 CD63 항체를 이용하여 대장암 세포 배양액으로부터 세포밖 소포체의 분리 과정 없이 세포밖 소포체를 확인한 형광 크로마토그램이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 형광이 표지된 CD81 항체를 이용하여 대장암 세포 배양액으로부터 세포밖 소포체의 분리 과정 없이 세포밖 소포체를 확인한 UV(a) 및 형광(b) 크로마토그램이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 형광이 표지된 CD81 항체를 이용하여 배양 시간을 달리한 대장암 세포 배양액으로부터 세포밖 소포체의 분리 과정 없이 시료내 세포밖 소포체를 나노입자농도(a) 및 UV(b), 형광(c) 크로마토그램으로 분석한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 에스테르분해효소 활성에 의하여 형광을 나타내는 막투과성VPD450(violet proliferation dye450)과 표본 세포밖 소포체 내 에스테르분해효소 활성을 이용한 세포밖 소포체의 분석을 나타낸 UV(a) 및 형광(b, c) 크로마토그램이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 에스테르분해효소 활성에 의하여 형광을 나타내는 막투과성VPD450(violet proliferation dye450)과 세포밖 소포체 내 에스테르분해효소 활성을 이용하여 대장암 세포 배양액으로부터 세포밖 소포체의 분리 과정 없이 시료내 세포밖 소포체를 UV(b) 및 형광(c) 크로마토그램으로 분석한 결과이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 에스테르분해효소 활성에 의하여 형광을 나타내는 막투과성VPD450(violet proliferation dye450)과 회전식 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 형광물질이 결합된 표본 세포밖 소포체를 UV 및 형광(b) 크로마토그램으로 분석한 결과이다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 에스테르분해효소 활성에 의하여 형광을 나타내는 막투과성CFDA-SE(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester)　와 회전식 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 형광물질이 결합된 표본 세포밖 소포체를 UV 및 형광(b) 크로마토그램으로 분석한 결과이다.
도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 비오틴-콜레스테롤(Biotin-cholesterol)과 반응시킨 표본 세포밖 소포체를 회전식 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분리한 비오틴-콜레스테롤-세포밖 소포체 복합체의 양을 분석한 결과이다.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따른 DiI(Lipophilic dye)과 반응시킨 표본 세포밖 소포체를 HPLC를 이용하여 분석한 형광 크로마토그램이다.
도 18은 본 발명의 일실시예에 따른 DiI(Lipophilic dye)과 반응시킨 대장균 유래 세포밖 소포체를 HPLC를 이용하여 분석한 형광 크로마토그램이다.
도 19는 본 발명의 일실시예에 따른 비오틴-콜레스테롤(Biotin-cholesterol)과 반응시킨 대장암 세포 배양액을 회전식 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분리한 비오틴-콜레스테롤-세포밖 소포체 복합체의 양을 분석한 결과이다.
도 20은 본 발명의 일실시예에 따른 비오틴-콜레스테롤(Biotin-cholesterol)과 반응시킨, 인간 오줌(b), 인간 혈청(c)을 회전식 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분리한 비오틴-콜레스테롤-세포밖 소포체 복합체의 양을 분석한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 표본 세포밖 소포체의 정제 및 분석
대장암 세포주 SW480 배양액을 500 xg에서 10분, 2,000 xg에서 20분 간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 상기 상층액에 존재하는 세포밖 소포체를 1차 정제 및 침전하기 위하여, 세포밖 소포체를 폴리에틸렌글리콜 용액(8.4% Polyethylene Glycol 6000, 250 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH7.4)을 첨가하여 16시간 동안 냉장 보관한 후, 12,000 xg에서 30분간 원심분리하여 침전된 세포밖 소포체를 수확 후 HEPES 완충용액(HEPES-buffered saline, 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH7.4)에 침전물을 녹였다.
밀도 및 부력을 이용하여 세포밖 소포체를 2차 정제하기 위하여 상기 시료에 대하여 30% - 20% - 5% 옵티프랩(Optiprep) 부력 밀도 구배 초원심분리를 200,000 xg에서 2 시간 동안 수행하였다. 초원심분리 후 세포밖 소포체와 상등 밀도(1.08 ~ 1.12 g/ml) 영역을 수확하였다. 상기 정제된 세포밖 소포체를 3차 정제하기 위하여, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 세파크릴(Sephacryl) S500으로 충전된 컬럼(10 x 100 mm)에 주입하고 분자 크기 배제 크로마토그래피를 통해 최종 세포밖 소포체 정제하였고 본 표본 세포밖 소포체 분리 과정을 도 2(a)에 나타내었다.
상기 2차 정제 방법의 부력 밀도 구배 초원심분리 후 얻은 시료의 표면으로부터 10개의 영역의 분획물을 수확하였고, 각 분획물에서 세포밖 소포체 마커 (Alix, CD9, CD81, CD63)들의 분포를 웨스턴블럿을 통하여 확인한 후 이를 도 2(b)에 나타내었다. 상기 3차 정제 방법을 따라 최종 분리한 표본 세포밖 소포체를 투과 전자 현미경(TEM)을 이용하여 관찰한 결과 정제한 표본 세포밖 소포체의 모양 및 크기(약 50 ~ 200 nm)를 확인할 수 있었다(도 2(c)).
실시예 2. 펌프식 크기 배제 크로마토그래피와 형광으로 표지된 항체를 이용한 표본 세포밖 소포체의 분석
크기 배제 크로마토그래피의 크기별 분획능과 세포밖 소포체의 구성 성분을 인식하는 다양한 탐침의 양을 정량함으로써 세포밖 소포체의 구성성분의 양을 분석할 수 있음을 규명하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
2-1. 형광 표지된 마우스 항체(normal mouse IgG)
정제된 표본 세포밖 소포체와 형광 표지된 마우스 항체(normal mouse IgG)를 혼합하여 37℃에서 30분 간 반응시킨 후 세파크릴 S500으로 채워진 컬럼에 주입하고 HPLC 시스템을 이용해 전개하면서 280 nm 흡광 크로마토그램(도 3(a))과 형광 크로마토그램(도 3(b))을 분석하였다.
그 결과, 흡광 크로마토그램 결과로부터 표본 세포밖 소포체가 6.5 분에 검출되고, 14.5분에 항체가 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 형광 크로마토그램에서 14.5분에 형광 표지된 항체의 형광 밴드는 검출되었으나, 6.5분 분획에 해당하는 표본 세포밖 소포체의 형광 밴드가 나타나지 않았다. 이는 표본 세포밖 소포체와 마우스 항체가 해당 조건에서 비특이적 결합을 하지 않음을 의미하며, 또한 함께 주입된 표본 세포밖 소포체와 마우스 항체의 혼합물은 크기 배제 크로마토그래피에 의하여 효과적으로 분리되어 용출되었다는 것을 알 수 있었다.
2-2. 형광 표지된 항CD63 및 항CD81 항체(aCD63 and aCD81 antibody)
상기 정제된 다양한 양의 표본 세포밖 소포체와 세포밖 소포체의 막 단백질(membrane surface protein) CD63을 인식하는 형광 표지된 항CD63 항체(aCD63 antibody)를 혼합하여 37℃에서 30분 간 반응시킨 후 세파크릴 S500으로 채워진 컬럼에 주입하고 HPLC 시스템을 이용해 전개하면서 280 nm 흡광 크로마토그램(도 4(a))과 형광 크로마토그램(도 4(b))을 분석하였다.
또한, 상기 정제된 다양한 양의 표본 세포밖 소포체와 세포밖 소포체의 또 다른 막 단백질 CD81을 인식하는 형광 표지된 항CD81 항체(aCD81 antibody)를 혼합하여 상기와 동일한 조건으로 크기 배제 크로마토그래피를 전개하면서 280 nm 흡광 크로마토그램(도 5(a))과 형광 크로마토그램(도 5(b))을 분석하였다.
그 결과, 해당 컬럼에서 6.5 분에 검출되는 표본 세포밖 소포체의 280 nm 흡광 밴드와 동일한 검출 시간에 형광 밴드가 나타나고 검출된 밴드의 면적은 표본 세포밖 소포체의 주입량과 높은 상관관계를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 14.5분에 검출되는 형광 표지된 자유 항체의 형광 밴드 면적이 주입된 표본 세포밖 소포체의 양에 반비례하여 감소하는 것을 알 수 있었다. 이는 표본 세포밖 소포체에 혼합한 항체가 세포밖 소포체의 구성성분(CD63, CD81)을 특이적으로 인식하여 각각 CD63 또는 CD81과 결합함으로써 "세포밖 소포체-항체 복합체"를 형성하고, 상대적으로 분자량이 작은 형광 표지된 항체(14.5분에 검출)가 거대 분자인 세포밖 소포체와 함께 전개되어 세포밖 소포체의 검출 시간(6.5분)에 형광 밴드가 검출되었음을 뜻한다. 또한 형광 표지된 자유 항체의 검출 시간에 검출되는 형광 밴드의 면적은 시료에 혼합한 항체의 총량에서 세포밖 소포체와 결합한 항체의 양을 제외한 자유 항체의 양을 반영함을 알 수 있다.
2-3. 항CD63 항체 경쟁적 결합
상기에서 형광 표지된 항CD63 항체가 표본 세포밖 소포체에 존재하는 CD63을 특이적으로 인식하여 복합체를 형성할 때 형광 표지가 특이적 결합에 미치는지 여부를 확인하기 위해, 형광 표지된 항CD63 항체와 표지 없는 항CD63 항체를 혼합하여 반응시켰다. 구체적으로, 상기 표본 세포밖 소포체에 형광 표지된 항 CD63 항체를 혼합한 군과, 표본 세포밖 소포체에 형광 표지된 항 CD63 항체와 형광 표지되지 않은 항 CD63 항체를 1:10의 비율로 함께 혼합하여 반응시킨 군에서 크기 배제 크로마토그래피를 통한 형광 크로마토그램을 비교하였다.
그 결과, 상기 형광 표지되지 않은 과량의 항 CD63항체를 추가로 첨가한 군에서 세포밖 소포체-항체 복합체의 형광 밴드가 크게 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 6). 이는 과량의 형광 표지되지 않은 항 CD63항체가 세포밖 소포체의 CD63과 결합하여 형광 표지된 항 CD63 항체의 결합을 방해함으로써 세포밖 소포체에 결합된 형광 표지된 항 CD63 항체의 양이 크게 줄었음을 의미하고, 이는 세포밖 소포체와 항 CD63 항체의 결합이 매우 특이적이며 형광 표지가 항 CD63 항체의 기능에 영향이 없음을 알 수 있었다.
2-4. 서로 다른 모세포에서 분비된 세포밖 소포체와 형광 표지된 항CD81 항체
동량의 서로 다른 모세포(SW480, HMEC1)에서 분비된 세포밖 소포체에 동량의 형광 표지된 항 CD81 항체를 혼합하여, 각 세포밖 소포체에서 CD81 단백질의 발현 양상을 상기 크기 배제 크로마토그래피 방법을 이용하여 280 nm 흡광 크로마토그램(도 7(a))과 형광 크로마토그램(도 7(b))으로 분석하였다.
그 결과, 해당 컬럼에서 6.5 분에 검출되는 각 세포밖 소포체의 280 nm 흡광 밴드의 면적이 동일한 반면, 동일 검출 시간(6.5분)에서 각 세포밖 소포체와 항 CD81 항체 복합체의 형광 밴드의 면적이 상이하게 나타났다. SW480 대장암 세포 유래 세포밖 소포체에 비하여 HMEC1 세포 유래 세포밖 소포체에서 크게 낮았고, 반면 8.5 분의 자유 항체의 형광 밴드 면적은 HMEC1 세포 유래 시료에서 더 높게 나타남을 관찰할 수 있었다. 이는 모세포의 종류에 따라 단위 시료당 세포밖 소포체의 양이 상이하기 때문이며, 이로부터 본 발명의 분석법에 의하여 여러 종류의 세포밖 소포체의 분석에 있어 단위 세포밖 소포체 당 각 구성 성분의 상대량을 빠르게 분석할 수 있음을 알 수 있었다.
2-5. TNFa 처리 유무에 따른 세포밖 소포체 성분 변화
본 발명의 방법을 이용하여 TNFa가 대장암 세포로부터 분비되는 세포밖 소포체의 구성 성분 변화에 미치는 영향을 분석하였다. 구체적으로 대장암 세포 배양 시 TNFa를 24시간 처리한 군(TNFa+)과 처리하지 않은 군(TNFa-)으로 나누고, 각 배양액에서 세포밖 소포체를 종래의 방법으로 정제하였다. 각 군에서 정제한 세포밖 소포체에 형광(FITC) 표지된 항 CD81 항체와 형광(PE) 표지된 항 ICAM1 항체를 혼합하여 반응시키고, 상기 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 전개하면서 280 nm 흡광 크로마토그램(도 8(a)) 및 형광 크로마토그램(도 8(b, c))을 분석하였다.
그 결과, 해당 컬럼에서 3.6 분에 검출되는 각 세포밖 소포체의 280 nm 흡광 밴드의 면적(a)과 CD81 형광 밴드의 면적(b)이 유사한 반면, 동일 검출 시간(3.6분)에 ICAM1의 형광 밴드(c)가 TNFa+ 군에서TNFa- 군에 비하여 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 TNFa의 처리 후 세포밖 소포체 중의 CD81 단백질의 양은 변화가 거의 없었으나, ICAM1의 양은 크게 증가한다는 사실을 알 수 있었다. 이로부터 동종의 세포라 하더라도 세포의 상태, 환경 또는 외부 인자에 의해 야기된 세포의 생리적 변화가 이로부터 분비된 세포밖 소포체의 구성 성분 변화를 이끌어 냄을 알 수 있었으며, 본 발명의 방법으로 쉽게 분석할 수 있다는 점을 확인할 수 있었다.
종합하여, 본 분석 방법을 통하여 간편하고 신속하게 시료 내 세포밖 소포체의 총량 및 세포밖 소포체의 성분 분석뿐 아니라, 세포밖 소포체의 구성 성분에 대한 항체 및 리간드의 특이성 및 친화도 분석에도 활용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3. 펌프식 크기 배제 크로마토그래피와 형광으로 표지된 항체를 이용한 세포 배양액 내 세포밖 소포체의 분석
3-1. 형광 표지된 항C63 항체
본 발명의 분석 방법을 이용하여 세포 배양액에서 세포밖 소포체의 양 또는 구성 성분을 분석하기 위하여, SW480 대장암 세포를 RPMI 배양 배지에서 24시간 배양하여 세포 배양액을 수확하였다. 세포를 배양하지 않은 RPMI 배양 배지와 형광 표지된 항 CD63 항체를 혼합한 군, 대장암 세포 배양액과 형광 표지된 항 CD63 항체를 혼합한 군 각각을 37℃에서 30분 간 반응시키고 TSK6000 HPLC컬럼에 주입한 후 HPLC 시스템을 이용해 전개하면서 형광 크로마토그램을 분석하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 RPMI 배양 배지와 형광 표지된 항 CD63 항체를 혼합한 군에서는 22 분에 검출되는 자유 항체의 형광 밴드만 검출된 반면, 대장암 세포 배양액과 형광 표지된 항 CD63 항체를 혼합한 군에서는 22 분에 검출되는 자유 항체의 형광 밴드와 더불어 17분에 검출되는 형광 밴드가 추가로 검출되었다. 또한, 대장암 세포 배양액이 포함된 시료에서 22 분에 검출된 형광 밴드의 면적이 RPMI 배양 배지와 형광 표지된 항 CD63 항체를 혼합한 군의 형광 밴드 면적의 약 50% 임을 확인할 수 있었다. 이는 형광 표지된 항 CD63 항체의 약 50% 가량이 대장암 세포 배양액 내 세포밖 소포체의 CD63 단백질과 특이적으로 결함하여 "세포밖 소포체-항체 복합체"를 형성하여 세포밖 소포체와 함께 전개되었기 때문에 17분의 형광 밴드가 형성된 것이다. 따라서 상기 분석 방법을 이용하면 세포 배양액으로부터 세포밖 소포체를 별도로 정제하지 않고도 세포 배양액 내 세포밖 소포체의 성분을 분석할 수 있음을 알 수 있었다.
3-2. 형광 표지된 항CD81 항체
상기 3-1과 유사하게, 상기 대장암 세포의 배양액과 형광 표지된 항 CD81항체를 혼합하여 37℃에서 30분 간 반응시키고 세파크릴 S500 컬럼에 주입한 후 HPLC 시스템을 이용해 전개하면서 280 nm 흡광 크로마토그램(도 10(a)) 및 형광 크로마토그램(도 10(b))을 분석하였다.
그 결과, 해당 컬럼에서 3.5분에 280 nm 흡광 밴드와 형광 밴드가 동시에 검출되었다. 이는 CD81 단백질을 발현하는 세포밖 소포체임을 알 수 있었고, 별도의 세포밖 소포체 정제 과정 없이 시료내 세포밖 소포체 구성 성분을 분석할 수 있음을 확인하였다.
3-3. 배양 시간에 따른 세포밖 소포체 분석
세포가 자라는 동안 분비되는 세포밖 소포체의 양상을 분석하기 위하여, 배양 시간을 달리한 대장암 세포 배양액에 각각 동량의 형광 표지된 항 CD81항체를 혼합하여 37℃에서 30분 간 반응시키고 세파크릴 S500 컬럼에 주입한 후 HPLC 시스템을 이용해 전개하였다. 각 세포 배양액에 대해 나노 입자 농도 분석(도 11(a)), 상기 크기 배제 크로마토그래피를 통한 280 nm 흡광 크로마토그램(도 11(b)) 및 형광 크로마토그램(도 11(c))을 분석하였다.
그 결과, 나노 입자 농도 분석을 통하여 대장암 세포의 배양 시간이 증가함에 따라 배양액 내 나노 입자 농도가 증가되는 것을 알 수 있었다. 아울러 크기 배제 크로마토그래피 결과, 대장암 세포 배양 시간이 증가함에 따라 세포밖 소포체가 용출되는 3.6분에 280 nm 흡광 밴드 및 CD81 항체 형광 밴드가 동시에 증가하는 것을 확인하였고, 이는 배양액 내 나노 입자 농도 증가와 높은 상관관계를 가짐을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 방법을 이용하면 세포밖 소포체의 추가 분리 과정 없이 시료 내 세포밖 소포체의 상대량 및 구성 성분의 분석을 동시에 할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. 펌프식 크기 배제 크로마토그래피와 막 투과성 효소 기질을 이용한 표본 세포밖 소포체의 분석
본 발명의 방법에 있어서 세포밖 소포체의 내부 성분을 인식하는 탐침 또는 효소를 사용함으로써 세포밖 소포체 구성성분 정량 분석의 가능성을 확인하기 위해 세포밖 소포체 내부에 존재하는 효소 중 하나인 에스테르분해효소(esterase)의기질로서 막 투과성이 있고 효소 활성에 의해 형광물질로 변환되는 물질인 VPD450을 사용하였다. 구체적으로 상기 정제된 표본 세포밖 소포체와 형광 표지된 항 CD81항체 및 다양한 농도의 VPD450을 혼합하여 37℃에서 30분 간 반응시키고 세파크릴 S500 컬럼에 주입한 후 HPLC 시스템을 이용해 전개하면서 280 nm 흡광 크로마토그램(도 12(a)) 및 형광 크로마토그램(도 12(b, c))을 분석하였다.
그 결과, 280 nm 흡광 밴드를 통해 해당 컬럼에서 표본 세포밖 소포체는 3.5분에 검출되는 것을 알 수 있었으며, 형광 크로마토그램 결과에서 같은 용출시간 대에 항 CD81 항체의 형광 밴드 및 VPD450의 형광 밴드가 동시에 나타났다. 이로써, 상기 표본 세포밖 소포체는 CD81 단백질과 에스테르분해효소를 모두 발현함을 알 수 있었다. 더불어 VPD450의 형광 밴드의 면적은 VPD450의 농도에 비례하였으며, VPD450 농도가 증가함에 따라 형광을 띄는 효소 활성 산물이 세포밖 소포체 내에 누적됨을 알 수 있었다. 한편, 자연적인 가수분해에 의하여 생성된 VPD450의 형광 산물(도 12(c) 중 늦게 나오는 피크)은 분자의 크기가 작아 크기 배제 크로마토그래피 방법을 통하여 명확하게 구분됨을 알 수 있었다.
실 시예 5. 펌프식 크기 배제 크로마토그래피와 막투과성 효소 기질을 이용한 세포 배양액 내 세포밖 소포체의 분석
상기 실시예 4에서 증명된 세포밖 소포체의 내부에 존재하는 효소에 대한 기질을 이용하여 세포밖 소포체를 분석하는 방법이 생물학적 시료에서 세포밖 소포체의 추가 정제 없이도 가능함을 증명하고자 세포 배양액을 이용하여 실험하였다. 구체적으로 SW480대장암 세포 배양액을 상기 막 투과성 VPD450과 혼합하여 37℃에서 다양한 시간 동안 반응시킨 후 세파크릴 S500 컬럼에 주입 후 HPLC 시스템을 이용해 전개하면서 280 nm 흡광 크로마토그램(도 13(a)) 및 형광 크로마토그램(도 13(b))을 분석하였다.
그 결과, 해당 컬럼에서 3.5분에 검출되는 표본 세포밖 소포체의 280 nm 흡광 밴드의 면적은 반응 시간에 관계없이 일정한 반면 형광 밴드는 반응 시간에 따라 증가하였다. 이는 세포밖 소포체 내부의 에스테르분해효소가 반응 시간에 비례하여 세포밖 소포체의 내부로 유입된 VPD450을 형광 물질로 전환하고, 전환된 형광물질이 세포밖 소포체 내부에 축적되기 때문이다. 상기 방법을 활용하여 기질의 양 또는 반응시간을 고정하여 시료를 분석하면 세포밖 소포체의 정제 없이도 생물학적 시료에서 세포밖 소포체의 총량 분석에 활용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6. 회전식 크기 배제 크로마토그래피와 막투과성 효소 기질을 이용한 표본 세포밖 소포체의 분석
6-1. 표본 세포밖 소포체-형광VPD450 복합체
상기 막 투과성 효소 기질을 이용한 세포밖 소포체의 분석 방법에 있어서, 도 14(a)에 나타낸 모식도와 같이 세포밖 소포체와 반응하지 않은 물질로부터 세포밖 소포체-형광VPD450 복합체를 분리한 후, 분리된 복합체를 분석하였다. 구체적으로, 표본 세포밖 소포체와 막투과성 기질인 VPD450을 혼합하여 반응시킨 후, 회전식 세파크릴 S500 컬럼에 로딩하고 원심분리를 통하여 용출액을 수확하였다. 상기 용출된 세포밖 소포체-형광VPD450 복합체를 세파크릴 S500 컬럼에 주입 후 HPLC 시스템을 이용해 전개하면서 280 nm 흡광 크로마토그램 및 형광 크로마토그램(도 14(b))을 분석하였다.
그 결과, VPD450과 반응시키지 않은 표본 세포밖 소포체는 3.5 분에 280 nm 흡광 밴드만 검출되고 동일 시간에 형광 밴드는 검출 되지 않았으나, 상기 회전식 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 전처리한 시료는 3.5분에 280 nm 흡광 밴드와 강한 VPD450 형광 밴드가 검출되는 것을 확인하였다. 이로부터 세포밖 소포체와 반응하지 않은 분자량이 작은 물질들이 전처리를 통하여 효과적으로 제거됨을 알 수 있었다.
6-2. 표본 세포밖 소포체-CFDA-SE 복합체
도 15(a)의 모식도에서 나타낸 바와 같이, 다른 에스테르분해효소 기질인 CFDA-SE를 표본 세포밖 소포체와 혼합한 반응 용액을 상기 6-의 방법에 따라 전처리한 후 세파크릴 S500 컬럼에 주입하고 HPLC 시스템을 이용해 전개하면서 280 nm 흡광 크로마토그램 및 형광 크로마토그램(도 15(b))을 분석하였다.
그 결과, 해당 컬럼에서 3.5분에 280 nm 흡광 밴드가 검출되었으며 동일한 검출 시간에 형광 밴드가 검출됨으로써 CFDA-SE 또한 VPD450과 동일한 기전에 따라 막을 투과하고 세포밖 소포체 내부의 에스테르분해효소의 활성에 의하여 형광물질로 세포밖 소포체의 내부에 축적됨을 알 수 있었다.
따라서 상기 세포밖 소포체를 분리하는 단계를 포함하는 방법을 이용하여, 시료 내 세포밖 소포체의 총량을 분석할 수 있을 뿐 아니라, 정제된 탐침-세포밖 소포체 복합체를 제공하여 세포밖 소포체를 이용한 다양한 추적 연구에 활용할 수 있다.
실시예 7. 회전식 크기 배제 크로마토그래피와 콜레스테롤 탐침(biotinylated cholesterol)을 이용한 표본 세포밖 소포체의 분석
크기 배제 크로마토그래피 분석 방법을 이용해 세포밖 소포체의 구성 성분 중 지질이중층과 결합하거나 삽입(transmembrane)되는 탐침의 양을 정량함으로써 세포밖 소포체의 총량을 분석할 수 있음을 규명하기 위해, 탐침으로서 비오틴이 표지된 콜레스테롤(Biotin-cholesterol) 사용하였다.
구체적으로, 도 16(a)에 나타낸 모식도와 같이 서로 다른 양의 정제된 표본 세포밖 소포체와 비오틴이 표지된 콜레스테롤을 혼합하여 37℃에서 30분 간 반응시킨 후 세포밖 소포체와 결합하지 않은 비오틴-콜레스테롤을 제거하기 위하여 상기 각 혼합 용액을 회전식 세파크릴 S500 컬럼에 로딩하고 700 xg 5 분간 원심분리하여 용출액을 수확하였다. 대조군으로 비오틴-콜레스테롤 단일 군 또는 표본 세포밖 소포체 단일 군을 상기와 동일한 방법으로 컬럼에 로딩한 후 회전을 통하여 용출액을 수확하였다. 상기 용출액 내 비오틴의 양을 정량하기 위하여 용출액을 96-well 플레이트(microplate)에 담은 후 시료 내 물질을 플레이트에 흡착시켜 고정하였다. 이 후 스트렙타비딘-퍼옥시다아제(streptavidin-peroxidase)와 반응시키고 세척한 후 플레이트에 잔존하는 퍼옥시다아제 효소 활성에 따른 화학 발광(chemiluminescence)을 측정하였다(도 16 (b)).
그 결과, 비오틴-콜레스테롤 단일 군 또는 표본 세포밖 소포체 단일 군에서는 화학 발광이 거의 없었다. 이는 분자량이 작은 비오틴-콜레스테롤은 회전식 크기 배제 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출되지 않았음을 의미하고, 분자량이 큰 세포밖 소포체의 경우 상기 도 15의 결과와 같이 회전식 크기 배제 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출되지만, 용출된 표본 세포밖 소포체 자체에는 스트렙타비딘-퍼옥시다아제와 결합할 수 있는 비오틴이 존재 하지 않음을 알 수 있다. 반면, 상기 표본 세포밖 소포체와 비오틴-콜레스테롤을 혼합하여 반응시킨 군에서는 높은 화학 발광이 측정되었으며 상기 발광의 세기는 표본 세포밖 소포체의 양에 비례하여 증가하였다. 이는 분자량이 상대적으로 작은 비오틴-콜레스테롤이 세포밖 소포체를 구성하는 지질이중층에 삽입되어 분자량이 큰 세포밖 소포체와 함께 회전식 크기 배제 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출될 수 있고, 비오틴-콜레스테롤의 지질이중충에 삽입되는 정도는 세포밖 소포체의 양에 비례함을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 회전식 크기 배제 크로마토그래피와 콜레스테롤 탐침을 이용한 대장암 세포 배양액 내 세포밖 소포체의 분석
상기 실시예 7에서 표본 세포밖 소포체와 비오틴-콜레스테롤의 혼합 반응물에서 회전식 크기 배제 크로마토그래피 전처리를 통하여 비오틴-콜레스테롤-세포밖 소포체 복합체만을 효과적으로 분리할 수 있음을 증명하였다. 상기 방법을 통하여 세포밖 소포체의 정제 없이 세포 배양액 내 세포밖 소포체의 총량을 분석 할 수 있는지를 확인하기 위하여, SW480 대장암 세포 배양액과 비오틴이 표지된 콜레스테롤(Biotin-cholesterol)을 사용하였다. 구체적으로, 도 17(a)에 나타낸 모식도와 같이 서로 다른 농도의 SW480 대장암 세포 배양액과 비오틴-콜레스테롤을 혼합하여 37℃에서 30분 간 반응시켰다. 다음으로 시료 내 세포밖 소포체와 결합하지 않은 비오틴-콜레스테롤을 제거하기 위하여 상기 각 혼합 용액을 회전식 세파크릴 S500 컬럼에 로딩하고 700 xg 5 분간 원심분리하여 용출액을 수확하였다. 대조군으로 비오틴-콜레스테롤 단일 군 또는 대장암 세포 배양액 단일 군을 상기와 동일한 방법으로 컬럼에 로딩한 후 회전을 통하여 용출액을 수확하였다. 상기 용출액 내 비오틴의 양을 정량하기 위하여 용출액을 96-well 플레이트 (microplate)에 담은 후 시료 내 물질을 플레이트에 흡착시켜 고정하였다. 이 후 스트렙타비딘-퍼옥시다아제(streptavidin-peroxidase)와 반응시키고 세척한 후 플레이트에 잔존하는 퍼옥시다아제 효소 활성에 따른 화학 발광(chemiluminescence)을 측정하였다(도 17(b)).
그 결과, 비오틴-콜레스테롤 단일 군 및 대장암 세포 배양액 단일 군에서는 화학 발광이 매우 낮거나 없었으나, 대장암 세포 배양액과 비오틴-콜레스테롤을 혼합하여 반응시킨 군에서는 높은 화학 발광을 관찰할 수 있었다. 이는 비오틴-콜레스테롤 분자가 세포 배양액 내 세포밖 소포체의 지질이중층에 삽입되어 세포밖 소포체와 함께 회전식 전처리 크기 배제 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출 되었다는 점을 증명한다.
실시예 9. 회전식 크기 배제 크로마토그래피와 콜레스테롤 탐침을 이용한 체액 내 세포밖 소포체의 분석
상기 실시예 8에서 확인한 바와 같이 세포밖 소포체의 정제 없이 세포 배양액 내 세포밖 소포체를 분석할 수 있었고, 상기 방법을 인간 체액에 적용하였다. 구체적으로, 도 18(a)의 모식도에 나타낸 바와 같이 인간 오줌 또는 인간 혈청과 비오틴이 표지된 콜레스테롤(Biotin-cholesterol)을 혼합하여 각 군을 37℃에서 30분 간 반응시킨 후 시료 내 세포밖 소포체와 결합하지 않은 비오틴-콜레스테롤을 제거하기 위하여 상기 각 혼합 용액을 회전식 세파크릴 S500 컬럼에 로딩하고 700 xg 5 분간 원심분리하여 용출액을 수확하였다. 대조 군으로 비오틴-콜레스테롤 단일 군 또는 각 생물학적 시료 단일 군을 상기와 동일한 방법으로 컬럼에 로딩한 후 회전을 통하여 용출액을 수확하였다. 상기 용출액 내 비오틴의 양을 정량하기 위하여 용출액을 96-well 플레이트 (microplate)에 담은 후 시료내 물질을 플레이트에 흡착시켜 고정하였다. 이 후 스트렙타비딘-퍼옥시다아제(streptavidin-peroxidase)와 반응시키고 세척한 후 플레이트에 잔존하는 퍼옥시다아제 효소 활성에 따른 화학 발광(chemiluminescence)을 측정하였다(도 18(b, c)).
그 결과, 비오틴-콜레스테롤 단일 군 및 대장암 세포 배양액 단일 군에서는 화학 발광이 매우 낮거나 없었으나, 생물학적 시료(오줌, 혈청)와 비오틴-콜레스테롤을 혼합하여 반응시킨 군에서는 높은 화학 발광을 관찰할 수 있었다. 이는 비오틴-콜레스테롤 분자가 생물학적 시료 내 세포밖 소포체의 지질이중층에 삽입되어 세포밖 소포체와 함께 회전식 전처리 크기 배제 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출되었으며, 이를 통해 여러 다양한 체액 내 존재하는 세포밖 소포체의 총량을 측정하는데 활용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 10. 회전식 크기 배제 크로마토그래피와 친유성 탐침 (DiI)을 이용한 표본 세포밖 소포체의 분석
세포밖 소포체의 구성 성분 중 지질이중층과 결합하거나 삽입되는 탐침으로서 콜레스테롤 대신 형광 표지된 친유성 DiI를 사용하여 추가 실험을 실시하였다. 구체적으로, 도 19(a)에 나타낸 모식도와 같이 형광 표지된 친유성 DiI 단일 군 또는 표본 세포밖 소포체와 형광 표지된 친유성 DiI를 혼합한 군을 37℃에서 30분 간 반응시킨 후 세포밖 소포체와 결합하지 않은 형광 표지된 친유성 DiI를 제거하기 위하여 상기 각 혼합 용액을 회전식 세파크릴 S500 컬럼에 로딩하고 700 xg 5 분간 원심분리하여 용출액을 수확하였다. 이 후 상기 용출액을 세파크릴 S500 컬럼에 주입하고 HPLC 시스템을 이용해 전개하면서 280 nm 흡광 크로마토그램 및 형광 크로마토그램(도 19(b))을 분석하였다.
그 결과, 분자량이 작은 형광 표지된 친유성 DiI는 회전식 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에서 용출되지 못하여 형광 밴드가 검출되지 않는 반면, 형광 표지된 친유성 DiI와 표본 세포밖 소포체를 혼합한 군에서는 세포밖 소포체의 용출 시간인 3.5분에서 높은 형광 밴드를 확인할 수 있었다. 따라서 분자량이 작은 형광 표지된 친유성 DiI가 세포밖 소포체의 지질이중층에 삽입되어 회전식 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에서 세포밖 소포체와 함께 용출되는 것을 알 수 있었다.
실시예 11. 회전식 크기 배제 크로마토그래피와 친유성 탐침(DiI)을 이용한 대장균 유래 세포밖 소포체의 분석
상기 실시예 10과 동일한 탐침을 대장균 유래 세포밖 소포체에 적용하여 분석하였다. 구체적으로, 도 20(a)에 나타낸 모식도와 같이 형광 표지된 친유성 DiI 단일 군 또는 대장균 유래 세포밖 소포체와 형광 표지된 친유성 DiI를 혼합한 군을 37℃에서 30분 간 반응시킨 후 세포밖 소포체와 결합하지 않은 형광 표지된 친유성 DiI를 제거하기 위하여 상기 각 혼합 용액을 회전식 세파크릴 S500 컬럼에 로딩하고 700 xg 5 분간 원심분리하여 용출액을 수확하였다. 이 후 상기 용출액을 세파크릴 S500 컬럼에 주입하고 HPLC 시스템을 이용해 전개하면서 280 nm 흡광 크로마토그램 및 형광 크로마토그램(도 20(b))을 분석하였다.
그 결과, 분자량이 작은 형광 표지된 친유성 DiI는 회전식 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에서 용출되지 못하여 형광 밴드가 검출되지 않는 반면, 형광 표지된 친유성 DiI와 대장균 유래 세포밖 소포체를 혼합한 군에서는 세포밖 소포체의 용출 시간인 3.5분에서 높은 형광 밴드를 확인할 수 있었다. 따라서 분자량이 작은 형광 표지된 친유성 DiI가 대장균 유래 세포밖 소포체의 지질이중층에 삽입되어 회전식 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에서 대장균 유래 세포밖 소포체와 함께 용출되는 것을 알 수 있었다.
이로부터 박테리아 유래 세포밖 소포체 역시 지질이중층으로 구성되어 있음을 확인하였으며, 본 분석 방법은 세포밖 소포체의 총량 뿐 아니라 세포밖 소포체의 특성 분석에도 활용될 수 있음을 시사한다.

Claims (20)

  1. (a) 세포밖 소포체의 구성성분과 특이적으로 결합하는 결합부 및 검출 가능한 신호부를 포함하는 탐침 및 세포밖 소포체를 포함하는 시료를 혼합하여 반응시키는 단계;
    (b) 상기 혼합 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 전개시키는 단계; 및
    (c) 상기 전개된 시료로부터 세포밖 소포체-탐침 복합체 및 자유 탐침을 검출하는 단계를 포함하는
    세포밖 소포체의 분석 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 탐침은
    세포밖 소포체의 구성성분과 특이적으로 결합하는 결합부 및 검출 가능한 신호부를 포함하는 단일 물질; 또는
    세포밖 소포체의 구성성분과 특이적으로 결합하는 결합부를 포함하는 물질에 분석 가능한 하나 이상의 신호부를 포함하는 물질이 결합된 복합 물질인 것인
    세포밖 소포체의 분석 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 탐침의 결합부는 세포밖 소포체의 막 표면 성분, 세포밖 소포체의 막 성분 및 세포밖 소포체의 내부 성분으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성분과 특이적으로 결합하는 것인 세포밖 소포체의 분석 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 탐침은 단백질, 항체, 항체 유래 물질, 펩티드, 핵산, 핵산-아미노산 복합체, 효소, 효소 기질, 화학적 리간드 및 이들의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 세포밖 소포체의 분석 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 탐침은 형광 물질, 효소 기질, 효소, 단백질, 펩티드, 핵산, 비오틴, 금속 및 방사성동위원소로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 신호부를 포함하는 것인 세포밖 소포체의 분석 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 검출 단계는 특정 파장에 대한 흡광 크로마토그램을 검출함으로써 세포밖 소포체를 정량하는 단계를 포함하는 것인 세포밖 소포체의 분석 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 특정 파장은 200 nm ~ 800 nm 범위에서 선택되는 하나 이상의 값인 세포밖 소포체의 분석 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 검출 단계는 탐침의 신호부를 검출하여 탐침을 정량하는 단계를 포함하는 것인 세포밖 소포체의 분석 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 탐침의 신호부를 검출하는 단계는 분광학적 분석, 물리화학적 분석, 양자화학적 분석, 효소학적 분석, 비오틴 분석 및 핵산 분석으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법을 포함하는 것인 세포밖 소포체의 분석 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 포유동물 세포 배양 배지, 박테리아 세포 배양 배지, 효모 배양 배지, 조직 추출물, 암 조직, 혈청, 혈장, 침, 눈물, 안방수, 땀, 소변, 대변, 뇌척수액(CSF, cerebrospinal fluid), 복수(ascite), 양수(amniotic fluid), 정액, 유(milk), 먼지, 담수, 해수, 토양 및 발효식품으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포밖 소포체의 분석 방법.
  11. (a) 세포밖 소포체의 구성성분과 특이적으로 결합하는 결합부 및 검출 가능한 신호부를 포함하는 탐침 및 세포밖 소포체를 포함하는 시료를 혼합하여 반응시키는 단계;
    (b) 상기 혼합 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 전개시키는 단계; 및
    (c) 상기 크기 배제 크로마토그래피 컬럼으로부터 세포밖 소포체-탐침 복합체를 분리하는 단계; 및
    (d) 상기 분리된 세포밖 소포체-탐침 복합체에서 탐침을 검출하는 단계를 포함하는 세포밖 소포체의 분석 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 탐침은
    세포밖 소포체의 구성성분과 특이적으로 결합하는 결합부 및 검출 가능한 신호부를 포함하는 단일 물질; 또는
    세포밖 소포체의 구성성분과 특이적으로 결합하는 결합부를 포함하는 물질에 분석 가능한 신호부를 포함하는 물질이 결합된 복합 물질인 것인
    세포밖 소포체의 분석 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 탐침의 결합부는 세포밖 소포체의 막 표면 성분, 세포밖 소포체의 막 성분 및 세포밖 소포체의 내부 성분으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성분과 특이적으로 결합하는 것인 세포밖 소포체의 분석 방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 탐침은 단백질, 항체, 항체 유래 물질, 펩티드, 핵산, 핵산-아미노산 복합체, 효소, 효소 기질, 화학적 리간드 및 이들의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 세포밖 소포체의 분석 방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 탐침은 형광 물질, 효소 기질, 효소, 단백질, 펩티드, 핵산, 비오틴, 금속 및 방사성동위원소로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 신호부를 포함하는 것인 세포밖 소포체의 분석 방법.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 검출 단계는 특정 파장에 대한 흡광 크로마토그램을 검출함으로써 세포밖 소포체를 정량하는 단계를 포함하는 것인 세포밖 소포체의 분석 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 특정 파장은 200 nm ~ 800 nm 범위에서 선택되는 하나 이상의 값인 세포밖 소포체의 분석 방법.
  18. 제11항에 있어서,
    상기 검출 단계는 탐침의 신호부를 검출하여 탐침을 정량하는 단계를 포함하는 것인 세포밖 소포체의 분석 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 탐침의 신호부를 검출하는 단계는 분광학적 분석, 물리화학적 분석, 양자화학적 분석, 효소학적 분석, 비오틴 분석, 방사선 분석 및 핵산 분석으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법을 포함하는 것인 세포밖 소포체의 분석 방법.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 포유동물 세포 배양 배지, 박테리아 세포 배양 배지, 효모 배양 배지, 조직 추출물, 암 조직, 혈청, 혈장, 침, 눈물, 안방수, 땀, 소변, 대변, 뇌척수액(CSF, cerebrospinal fluid), 복수(ascite), 양수(amniotic fluid), 정액, 유(milk), 먼지, 담수, 해수, 토양 및 발효식품으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포밖 소포체의 분석 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210072672A (ko) * 2019-12-06 2021-06-17 포항공과대학교 산학협력단 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 질병 진단 방법
KR20210117723A (ko) * 2020-03-20 2021-09-29 인천대학교 산학협력단 고흡습성 수지를 이용한 세포 또는 이의 분비물의 분리 및 농축방법

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220305405A1 (en) * 2019-05-01 2022-09-29 The Research Foundation For The State University Of New York System and method for isolation of intact extracellular vesicles with near-single-vesicle resolution coupled with on-line characterization
CN112444479B (zh) * 2021-02-01 2021-05-07 宁波大学 基于并行处理技术的单细胞质谱分析系统及方法
CN113092642B (zh) * 2021-03-30 2022-11-01 苏州爱宝德生物科技有限公司 一种用于细胞外囊泡的快速提取装置
CN113189067B (zh) * 2021-04-27 2023-04-25 浙江大学 一种细胞外囊泡的富集和检测方法及装置
CN115058488A (zh) * 2022-07-27 2022-09-16 苏州爱宝德生物科技有限公司 基于外周血中外泌体提取的环状rna可视化检测方法
WO2024122520A1 (ja) * 2022-12-07 2024-06-13 キヤノン株式会社 細胞外小胞の検出方法、キット、装置
CN116952811B (zh) * 2023-08-07 2024-05-31 北京恩康医药有限公司 一种基于纳米流式检测仪检测外泌体膜完整性的方法及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012006476A2 (en) * 2010-07-07 2012-01-12 Aethlon Medical, Inc. Methods and compositions for quantifying exosomes

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2166770T3 (es) * 1993-12-09 2002-05-01 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos monoclonales contra gangliosidos y sus utilizaciones en la inmunoterapia activa especifica de tumores malignos.
CA2713909C (en) 2008-02-01 2023-12-12 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in diagnosis, prognosis and treatment of medical diseases and conditions
US20130203061A1 (en) 2009-11-30 2013-08-08 Michael KLASS Methods and systems for isolating, storing, and analyzing vesicles
WO2012170711A1 (en) * 2011-06-07 2012-12-13 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L Circulating biomarkers for cancer
EP2922861A4 (en) 2012-11-26 2016-09-14 Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh BIOMARKER COMPOSITIONS AND METHODS
US9086412B2 (en) 2012-12-31 2015-07-21 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Extracellular vesicle-associated protein markers of cancer
WO2014142752A1 (en) * 2013-03-12 2014-09-18 Agency For Science, Technology And Research Pre-eclampsia biomarkers
JP6235795B2 (ja) * 2013-05-29 2017-11-22 国立大学法人 東京医科歯科大学 細胞のリプログラミングのための組成物
WO2015031694A2 (en) * 2013-08-28 2015-03-05 Caris Science, Inc. Oligonucleotide probes and uses thereof
CN106029898B (zh) * 2014-01-21 2020-02-28 莫尔豪斯医学院 外来体介导的感染和疾病的检测
KR101523249B1 (ko) * 2014-05-22 2015-05-27 서울대학교산학협력단 엑소좀을 방사성 물질로 표지하는 방법 및 그 용도
US10071133B2 (en) * 2015-03-12 2018-09-11 Mitsui Chemicals, Inc. Method for destroying exosomes, kit for destroying exosomes, and method for isolating exosomes derived from normal cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012006476A2 (en) * 2010-07-07 2012-01-12 Aethlon Medical, Inc. Methods and compositions for quantifying exosomes

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Morales-Kastresana 등, Scientific Reports, Doi:10.1038/s41598-017-01731-2.(2017.05.12.)* *
G Corso 등, Scientific Reports, DOI:10.1038/s41598-017-10646-x,(2017.09.14.)* *
R Xu 등, Analytical Chemistry, 2016, 88권, 페이지 10390-10394.(2016.09.30.)* *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210072672A (ko) * 2019-12-06 2021-06-17 포항공과대학교 산학협력단 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 질병 진단 방법
KR20210117723A (ko) * 2020-03-20 2021-09-29 인천대학교 산학협력단 고흡습성 수지를 이용한 세포 또는 이의 분비물의 분리 및 농축방법

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