JP2000171466A - 二基質結合性ペプチド及びこれを用いた均一系免疫測定法 - Google Patents
二基質結合性ペプチド及びこれを用いた均一系免疫測定法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 容易に調製することが可能であり、分子構造
の均一性においても優れている二基質結合性ペプチド、
及び、これを用いることによって、生体成分、環境汚染
物質等の分析において固液分離操作を必要としない均一
系免疫測定法を提供する。 【解決手段】 ２つのペプチド領域を有し、シングルペ
プチドである二基質結合性ペプチドであって、上記２つ
のペプチド領域は、互いに異なる２種の基質に結合活性
を有するものである二基質結合性ペプチド。
の均一性においても優れている二基質結合性ペプチド、
及び、これを用いることによって、生体成分、環境汚染
物質等の分析において固液分離操作を必要としない均一
系免疫測定法を提供する。 【解決手段】 ２つのペプチド領域を有し、シングルペ
プチドである二基質結合性ペプチドであって、上記２つ
のペプチド領域は、互いに異なる２種の基質に結合活性
を有するものである二基質結合性ペプチド。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、二基質結合性ペプ
チド、及び、これを用いることによって、生体成分、環
境汚染物質等の分析において、固液分離操作を必要とし
ない均一系免疫測定法に関する。
チド、及び、これを用いることによって、生体成分、環
境汚染物質等の分析において、固液分離操作を必要とし
ない均一系免疫測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】免疫測定においては、２種のモノクロー
ナル抗体を使用する、１−ステップＲＩＡ（ラジオイム
ノアッセイ）法や１−ステップＥＩＡ（エンザイムイム
ノアッセイ）法等が実用化されている。即ち、固相化さ
れたモノクローナル抗体（ＭＡｂ１）に、抗原を含む溶
液、及び、標識したモノクローナル抗体（ＭＡｂ２）を
含む溶液を混合、免疫反応させ、洗浄後、ＭＡｂ１−抗
原−ＭＡｂ２複合体を検出する方法であるが、これらの
方法は、固液分離のための洗浄操作が必要であった。こ
のような洗浄操作は、時間の浪費であり、結果のばらつ
きの原因ともなっていたが、これを回避するには、特殊
な付加設備が必要であった。そのため、洗浄操作不要な
均一系免疫測定法の開発が望まれていた。
ナル抗体を使用する、１−ステップＲＩＡ（ラジオイム
ノアッセイ）法や１−ステップＥＩＡ（エンザイムイム
ノアッセイ）法等が実用化されている。即ち、固相化さ
れたモノクローナル抗体（ＭＡｂ１）に、抗原を含む溶
液、及び、標識したモノクローナル抗体（ＭＡｂ２）を
含む溶液を混合、免疫反応させ、洗浄後、ＭＡｂ１−抗
原−ＭＡｂ２複合体を検出する方法であるが、これらの
方法は、固液分離のための洗浄操作が必要であった。こ
のような洗浄操作は、時間の浪費であり、結果のばらつ
きの原因ともなっていたが、これを回避するには、特殊
な付加設備が必要であった。そのため、洗浄操作不要な
均一系免疫測定法の開発が望まれていた。
【０００３】洗浄操作不要な均一系免疫測定法の開発例
として、マーカー酵素の活性変化を利用した技術が近年
報告されている。β−ガラクトシダーゼ等のある種の酵
素は、それ自身を酵素ドナーと酵素アクセプターに分割
しても、インキュベーションによって酵素活性が回復す
ることが知られている。特開平７−１７９４９５号公報
には、このような酵素ドナーと酵素アクセプターを用い
る均一系免疫測定法が開示されている。この測定法は、
酵素ドナーと抗原との融合ポリペプチド、酵素アクセプ
ター及び抗原に対する抗体と、抗原を含む検体とを反応
させ、融合ポリペプチド中の抗原と抗体との結合が生じ
ることによる酵素活性の発現の阻害を利用し、酵素活性
減少量を測定することによって検体中の抗原量を検出す
るものである。
として、マーカー酵素の活性変化を利用した技術が近年
報告されている。β−ガラクトシダーゼ等のある種の酵
素は、それ自身を酵素ドナーと酵素アクセプターに分割
しても、インキュベーションによって酵素活性が回復す
ることが知られている。特開平７−１７９４９５号公報
には、このような酵素ドナーと酵素アクセプターを用い
る均一系免疫測定法が開示されている。この測定法は、
酵素ドナーと抗原との融合ポリペプチド、酵素アクセプ
ター及び抗原に対する抗体と、抗原を含む検体とを反応
させ、融合ポリペプチド中の抗原と抗体との結合が生じ
ることによる酵素活性の発現の阻害を利用し、酵素活性
減少量を測定することによって検体中の抗原量を検出す
るものである。
【０００４】特開平４−５０５２１０号公報には、ター
ゲット分子とマーカー酵素の両方を認識できる２分子認
識モノクローナル抗体（ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
３０５巻、５３７〜５４０頁、１９８３年）を２種類調
製し、この２種類の２分子認識モノクローナル抗体及び
これらに対するエピトープを有するマーカー酵素と、タ
ーゲット分子を含む検体とを反応させて四次免疫複合体
を形成させた後、遊離のマーカー酵素を不活性化させ、
四次免疫複合体中のマーカー酵素の量を測定することに
よって、ターゲット分子を検出する方法が開示されてい
る。
ゲット分子とマーカー酵素の両方を認識できる２分子認
識モノクローナル抗体（ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
３０５巻、５３７〜５４０頁、１９８３年）を２種類調
製し、この２種類の２分子認識モノクローナル抗体及び
これらに対するエピトープを有するマーカー酵素と、タ
ーゲット分子を含む検体とを反応させて四次免疫複合体
を形成させた後、遊離のマーカー酵素を不活性化させ、
四次免疫複合体中のマーカー酵素の量を測定することに
よって、ターゲット分子を検出する方法が開示されてい
る。
【０００５】特開昭６１−６２８６３号公報には、ター
ゲット抗原に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ１）と
マーカー酵素に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ２）
とのハイブリッド抗体を細胞融合法等を用いて作製し、
このハイブリッド抗体、マーカー酵素及びターゲット抗
原を含む検体とを反応させ、ターゲット抗原とハイブリ
ッド抗体とが結合するとその立体障害によりマーカー酵
素のハイブリッド抗体への結合が制限されることを利用
して、ターゲット分子を検出する方法が開示されてい
る。
ゲット抗原に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ１）と
マーカー酵素に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ２）
とのハイブリッド抗体を細胞融合法等を用いて作製し、
このハイブリッド抗体、マーカー酵素及びターゲット抗
原を含む検体とを反応させ、ターゲット抗原とハイブリ
ッド抗体とが結合するとその立体障害によりマーカー酵
素のハイブリッド抗体への結合が制限されることを利用
して、ターゲット分子を検出する方法が開示されてい
る。
【０００６】特開昭６１−８００４９号公報には、抗体
と酵素との結合物を作成し、この結合物及びターゲット
抗原（１）を含む検体と、酵素の基質である高分子化合
物を結合させることにより高分子化したターゲット抗原
（２）とを反応させて、高分子化合物に対する酵素活性
を測定することにより検体中のターゲット抗原（１）を
定量する方法が開示されている。この方法は、ターゲッ
ト抗原（１）と高分子化したターゲット抗原（２）を抗
体に対して競争反応させることによって、ターゲット抗
原（１）と反応しなかった抗体には、高分子化したター
ゲット抗原（２）が反応し、高分子化したターゲット抗
原（２）の立体障害を利用するものである。
と酵素との結合物を作成し、この結合物及びターゲット
抗原（１）を含む検体と、酵素の基質である高分子化合
物を結合させることにより高分子化したターゲット抗原
（２）とを反応させて、高分子化合物に対する酵素活性
を測定することにより検体中のターゲット抗原（１）を
定量する方法が開示されている。この方法は、ターゲッ
ト抗原（１）と高分子化したターゲット抗原（２）を抗
体に対して競争反応させることによって、ターゲット抗
原（１）と反応しなかった抗体には、高分子化したター
ゲット抗原（２）が反応し、高分子化したターゲット抗
原（２）の立体障害を利用するものである。
【０００７】しかしながら、これらの均一系免疫測定法
では、モノクローナル抗体を用いるものであり、モノク
ローナル抗体は細胞融合技術によって作製されたハイブ
リドーマから生産されるため、株の維持、ハイブリドー
マの培養、モノクローナル抗体の精製等繁雑な操作が必
要であった。更に、得られたモノクローナル抗体同士を
化学的に架橋したり、抗体や抗原にマーカー分子を化学
結合させたりするため、調製法も繁雑であり、更に、設
計通りに化学結合される率は少なく、結合活性、特異性
の両面での性能低下は避けられないという問題点があっ
た。
では、モノクローナル抗体を用いるものであり、モノク
ローナル抗体は細胞融合技術によって作製されたハイブ
リドーマから生産されるため、株の維持、ハイブリドー
マの培養、モノクローナル抗体の精製等繁雑な操作が必
要であった。更に、得られたモノクローナル抗体同士を
化学的に架橋したり、抗体や抗原にマーカー分子を化学
結合させたりするため、調製法も繁雑であり、更に、設
計通りに化学結合される率は少なく、結合活性、特異性
の両面での性能低下は避けられないという問題点があっ
た。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、容易に調製することが可能であり、分子構造の均
一性においても優れている二基質結合性ペプチド、及
び、これを用いることによって、生体成分、環境汚染物
質等の分析において固液分離操作を必要としない均一系
免疫測定法を提供することを目的とする。
鑑み、容易に調製することが可能であり、分子構造の均
一性においても優れている二基質結合性ペプチド、及
び、これを用いることによって、生体成分、環境汚染物
質等の分析において固液分離操作を必要としない均一系
免疫測定法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、２つのペプチ
ド領域を有し、シングルペプチドである二基質結合性ペ
プチドであって、上記２つのペプチド領域は、互いに異
なる２種の基質に結合活性を有するものである二基質結
合性ペプチドである。
ド領域を有し、シングルペプチドである二基質結合性ペ
プチドであって、上記２つのペプチド領域は、互いに異
なる２種の基質に結合活性を有するものである二基質結
合性ペプチドである。
【００１０】本発明の二基質結合性ペプチドは、２つの
ペプチド領域を有するものである。本明細書中におい
て、二基質結合性ペプチドとは、二種類の基質に対して
結合性を有するペプチドであってシングルペプチドであ
るものを意味する。上記２つのペプチド領域は、互いに
異なる２種の基質に結合活性を有するものである。
ペプチド領域を有するものである。本明細書中におい
て、二基質結合性ペプチドとは、二種類の基質に対して
結合性を有するペプチドであってシングルペプチドであ
るものを意味する。上記２つのペプチド領域は、互いに
異なる２種の基質に結合活性を有するものである。
【００１１】上記ペプチド領域はそれぞれ、既知の結合
性ペプチド、動物由来抗体、並びに、新たにペプチドラ
イブラリー及び抗体ライブラリーからスクリーニングさ
れたもの等から選択されるアミノ酸配列が使用できる。
性ペプチド、動物由来抗体、並びに、新たにペプチドラ
イブラリー及び抗体ライブラリーからスクリーニングさ
れたもの等から選択されるアミノ酸配列が使用できる。
【００１２】上記ペプチドライブラリーには、マルチピ
ン法、１ビーズ１ペプチド法等の化学合成ライブラリー
（バイオサイエンスとバイオインダストリー，５４，３
３３−３３７，１９９６）のほか、微生物表層にランダ
ムな配列の６〜３０ｍｅｒのペプチドがファージ外膜タ
ンパク質、鞭毛タンパク質等との融合タンパク質として
提示される大腸菌ペプチドライブラリー等が挙げられる
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７，
２２８，１９９３；Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１
３，３３６，１９９５）。上記ペプチドライブラリーと
して、数残基のシステインを配列内に導入することによ
って作成した環状ペプチドライブラリーも挙げられる
（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５９，８１９，１９９
６）。
ン法、１ビーズ１ペプチド法等の化学合成ライブラリー
（バイオサイエンスとバイオインダストリー，５４，３
３３−３３７，１９９６）のほか、微生物表層にランダ
ムな配列の６〜３０ｍｅｒのペプチドがファージ外膜タ
ンパク質、鞭毛タンパク質等との融合タンパク質として
提示される大腸菌ペプチドライブラリー等が挙げられる
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７，
２２８，１９９３；Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１
３，３３６，１９９５）。上記ペプチドライブラリーと
して、数残基のシステインを配列内に導入することによ
って作成した環状ペプチドライブラリーも挙げられる
（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５９，８１９，１９９
６）。
【００１３】上記抗体ライブラリーとしては、マウス脾
臓、ヒト白血球、Ｂリンパ球等で産生された抗体遺伝子
を出発物として構築されるものが挙げられる。上記抗体
ライブラリーの場合、（Ｆａｂ）2 領域、Ｆａｂ領域、
ＶH 領域、並びに、ＶH 領域及びＶL 領域がペプチドで
連結され一本鎖となったｓｃＦＶ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈ
ａｉｎ Ｆｖ）といった抗体断片が、大腸菌ライブラリ
ーと同様のシステムで細胞表層提示可能である（Ｃｕｒ
ｒ．Ｏｐｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，８，５０３，１９９
７）。スクリーニングは、例えば大腸菌ファージペプチ
ドライブラリーや抗体ライブラリーから目的のクローン
をスクリーニングする場合、通常パニング法（Ｐａｒｍ
ｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７３，３０５−３１
８）と呼ばれる方法で行うことができる。マイクロタイ
タープレート等に本発明に用いるターゲット分子又はマ
ーカー分子を結合させ、適当なブロッキング剤でブロッ
クした後、大腸菌ファージライブラリーを加え、リン酸
緩衝液等で洗浄した後、溶出する。この操作を複数繰り
返すことによって、特異性の高い結合性ペプチド又は抗
体が選択され得る。
臓、ヒト白血球、Ｂリンパ球等で産生された抗体遺伝子
を出発物として構築されるものが挙げられる。上記抗体
ライブラリーの場合、（Ｆａｂ）2 領域、Ｆａｂ領域、
ＶH 領域、並びに、ＶH 領域及びＶL 領域がペプチドで
連結され一本鎖となったｓｃＦＶ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈ
ａｉｎ Ｆｖ）といった抗体断片が、大腸菌ライブラリ
ーと同様のシステムで細胞表層提示可能である（Ｃｕｒ
ｒ．Ｏｐｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，８，５０３，１９９
７）。スクリーニングは、例えば大腸菌ファージペプチ
ドライブラリーや抗体ライブラリーから目的のクローン
をスクリーニングする場合、通常パニング法（Ｐａｒｍ
ｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７３，３０５−３１
８）と呼ばれる方法で行うことができる。マイクロタイ
タープレート等に本発明に用いるターゲット分子又はマ
ーカー分子を結合させ、適当なブロッキング剤でブロッ
クした後、大腸菌ファージライブラリーを加え、リン酸
緩衝液等で洗浄した後、溶出する。この操作を複数繰り
返すことによって、特異性の高い結合性ペプチド又は抗
体が選択され得る。
【００１４】さらに、既知又は新規にスクリーニングさ
れたペプチドや抗体断片をコードする遺伝子をもとに、
ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ等によって無作為変異
導入を施し、その増幅産物のライブラリーを作製後、こ
れよりスクリーニングすることによって、さらに強力な
結合活性を有するペプチドや抗体断片を得ることも可能
である（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２，
４３３，１９９４）。
れたペプチドや抗体断片をコードする遺伝子をもとに、
ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ等によって無作為変異
導入を施し、その増幅産物のライブラリーを作製後、こ
れよりスクリーニングすることによって、さらに強力な
結合活性を有するペプチドや抗体断片を得ることも可能
である（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２，
４３３，１９９４）。
【００１５】本発明の２つのペプチド領域は、１つの基
質結合部位が２次構造をとり得る最低の残基数であるこ
と、及び、抗体断片を用いる場合ＦａｂやｓｃＦＶの分
子量が約２５〜７０ｋＤａであることから、それぞれ５
〜７００アミノ酸残基であることが好ましい。
質結合部位が２次構造をとり得る最低の残基数であるこ
と、及び、抗体断片を用いる場合ＦａｂやｓｃＦＶの分
子量が約２５〜７０ｋＤａであることから、それぞれ５
〜７００アミノ酸残基であることが好ましい。
【００１６】上記２つのペプチド領域は、それぞれのペ
プチド領域の基質結合活性が維持されていれば、直接連
結されている場合であってもよく、又は、スペーサーペ
プチド領域を介して連結されているものであってもよ
い。上記２つのペプチド領域を連結するスペーサーペプ
チド領域の配列は、それぞれのペプチド領域の基質結合
活性に対して阻害する等の悪影響を及ぼさないアミノ酸
配列であれば特に限定されず、例えば、配列表の配列番
号１の１５アミノ酸配列（Ｖｉｊａｙ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ，３３９，３９４，１９８９）等が挙げら
れる。
プチド領域の基質結合活性が維持されていれば、直接連
結されている場合であってもよく、又は、スペーサーペ
プチド領域を介して連結されているものであってもよ
い。上記２つのペプチド領域を連結するスペーサーペプ
チド領域の配列は、それぞれのペプチド領域の基質結合
活性に対して阻害する等の悪影響を及ぼさないアミノ酸
配列であれば特に限定されず、例えば、配列表の配列番
号１の１５アミノ酸配列（Ｖｉｊａｙ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ，３３９，３９４，１９８９）等が挙げら
れる。
【００１７】上記スペーサーペプチド領域の大きさとし
ては、１〜１０００アミノ酸残基が好ましい。１０００
アミノ酸残基を超えると、一方のペプチド領域とこれに
対する基質との結合が、他方のペプチド領域とこれに対
する基質との結合を立体障害により阻害しない場合があ
り、均一系免疫測定法を行うのに適当でないことがあ
る。
ては、１〜１０００アミノ酸残基が好ましい。１０００
アミノ酸残基を超えると、一方のペプチド領域とこれに
対する基質との結合が、他方のペプチド領域とこれに対
する基質との結合を立体障害により阻害しない場合があ
り、均一系免疫測定法を行うのに適当でないことがあ
る。
【００１８】上記２つのペプチド領域は、一方がターゲ
ット分子に対する抗体ペプチド領域であり、他方がマー
カー分子に対する抗体ペプチド領域又はマーカー分子に
結合活性を有する阻害ペプチド領域であることが好まし
い。
ット分子に対する抗体ペプチド領域であり、他方がマー
カー分子に対する抗体ペプチド領域又はマーカー分子に
結合活性を有する阻害ペプチド領域であることが好まし
い。
【００１９】上記ターゲット分子は、検体中に含まれる
被測定物質を意味し、例えば、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗
原（ＨＢｓ）、Ｃ型肝炎ウィルス抗原（ＨＣＶ）、梅毒
抗原、癌マーカー、環境ホルモン等が挙げられる。上記
ターゲット分子に対する抗体ペプチド領域は、ターゲッ
ト分子に対して特異的に反応するものであって、抗体の
ペプチド断片からなるものである。
被測定物質を意味し、例えば、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗
原（ＨＢｓ）、Ｃ型肝炎ウィルス抗原（ＨＣＶ）、梅毒
抗原、癌マーカー、環境ホルモン等が挙げられる。上記
ターゲット分子に対する抗体ペプチド領域は、ターゲッ
ト分子に対して特異的に反応するものであって、抗体の
ペプチド断片からなるものである。
【００２０】上記マーカー分子は、マーカー分子とそれ
に対するペプチド領域との結合が、ターゲット分子がそ
れに対するペプチド領域に結合している場合に立体障害
により阻害されるものであって、かつ、二基質結合性ペ
プチドと結合していない遊離のマーカー分子の定量が容
易に行えるものであれば特に限定されず、例えば、アル
カリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、キモト
リプシン等の酵素が挙げられる。
に対するペプチド領域との結合が、ターゲット分子がそ
れに対するペプチド領域に結合している場合に立体障害
により阻害されるものであって、かつ、二基質結合性ペ
プチドと結合していない遊離のマーカー分子の定量が容
易に行えるものであれば特に限定されず、例えば、アル
カリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、キモト
リプシン等の酵素が挙げられる。
【００２１】上記マーカー分子に結合活性を有するペプ
チド領域としては、マーカー分子に対する抗体ペプチド
領域、又は、マーカー分子に結合活性を有する阻害ペプ
チド領域である。上記マーカー分子に対する抗体ペプチ
ド領域は、マーカー分子に対して特異的に反応するもの
であって、抗体のペプチド断片からなるものである。上
記阻害ペプチド領域は、マーカー分子と結合することに
よって、マーカー分子の活性を阻害するようなアミノ酸
配列を有する領域を意味する。上記マーカー分子に対す
る抗体ペプチド領域、又は、上記マーカー分子に結合活
性を有する阻害ペプチド領域のどちらであっても、マー
カー分子が結合することによってマーカー分子自体の活
性が抑制される。
チド領域としては、マーカー分子に対する抗体ペプチド
領域、又は、マーカー分子に結合活性を有する阻害ペプ
チド領域である。上記マーカー分子に対する抗体ペプチ
ド領域は、マーカー分子に対して特異的に反応するもの
であって、抗体のペプチド断片からなるものである。上
記阻害ペプチド領域は、マーカー分子と結合することに
よって、マーカー分子の活性を阻害するようなアミノ酸
配列を有する領域を意味する。上記マーカー分子に対す
る抗体ペプチド領域、又は、上記マーカー分子に結合活
性を有する阻害ペプチド領域のどちらであっても、マー
カー分子が結合することによってマーカー分子自体の活
性が抑制される。
【００２２】本発明の二基質結合性ペプチドの調製方法
としては、上記２つのペプチド領域をコードする遺伝子
同士を、直接に、又は、上記スペーサーペプチド領域を
コードする遺伝子を介して、遣伝子工学的に連結された
遺伝子断片を調製する。上記連結された遺伝子断片を大
腸菌等を宿主とした発現ベクターに導入し、宿主の細胞
内又は細胞外で発現させる。発現されたペプチドをカラ
ムクロマトグラフィー等の手法によって、均一に精製を
行うことによって調製することができる。
としては、上記２つのペプチド領域をコードする遺伝子
同士を、直接に、又は、上記スペーサーペプチド領域を
コードする遺伝子を介して、遣伝子工学的に連結された
遺伝子断片を調製する。上記連結された遺伝子断片を大
腸菌等を宿主とした発現ベクターに導入し、宿主の細胞
内又は細胞外で発現させる。発現されたペプチドをカラ
ムクロマトグラフィー等の手法によって、均一に精製を
行うことによって調製することができる。
【００２３】本発明の二基質結合性ペプチドの調製方法
としては、目的とする二基質結合性ペプチドが短い場合
には、ペプチド合成機によって化学的にペプチドを調製
することも可能である。簡便性及び経済性の観点から、
遣伝子工学的に二基質結合性ペプチドを調製する方法が
好ましい。
としては、目的とする二基質結合性ペプチドが短い場合
には、ペプチド合成機によって化学的にペプチドを調製
することも可能である。簡便性及び経済性の観点から、
遣伝子工学的に二基質結合性ペプチドを調製する方法が
好ましい。
【００２４】本発明においては、上記二基質結合性ペプ
チドを用いることによって、均一系免疫測定法を行うこ
とができる。上記均一系免疫測定法は、本発明の二基質
結合性ペプチドに対して、２種の基質、例えば、ターゲ
ット分子及びマーカー分子を競争反応させ、ターゲット
分子が結合するとその立体障害によりマーカー分子の二
基質結合性ペプチドへの結合が制限されることを利用す
るものである。
チドを用いることによって、均一系免疫測定法を行うこ
とができる。上記均一系免疫測定法は、本発明の二基質
結合性ペプチドに対して、２種の基質、例えば、ターゲ
ット分子及びマーカー分子を競争反応させ、ターゲット
分子が結合するとその立体障害によりマーカー分子の二
基質結合性ペプチドへの結合が制限されることを利用す
るものである。
【００２５】本発明の均一系免疫測定法においては、二
基質結合性ペプチド、検体、マーカー分子及びマーカー
分子の定量を行うための基質を混合後、一定時間反応さ
せ、発色量、発光量等を測定してマーカー分子の定量を
行い、予め濃度既知のターゲット分子が含まれる標準溶
液で実施したものと比較することによって、検体中のタ
ーゲット分子の濃度を測定することができる。
基質結合性ペプチド、検体、マーカー分子及びマーカー
分子の定量を行うための基質を混合後、一定時間反応さ
せ、発色量、発光量等を測定してマーカー分子の定量を
行い、予め濃度既知のターゲット分子が含まれる標準溶
液で実施したものと比較することによって、検体中のタ
ーゲット分子の濃度を測定することができる。
【００２６】上記反応時間及び温度としては特に限定さ
れず、通常免疫反応を実施する際に行われるものが挙げ
られ、例えば、４〜４０℃にて１分〜４８時間等が挙げ
られる。上記反応溶液としても特に限定されず、例え
ば、ウシ血清アルブミンを０．１〜２％添加したリン酸
緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等が挙げられる。
れず、通常免疫反応を実施する際に行われるものが挙げ
られ、例えば、４〜４０℃にて１分〜４８時間等が挙げ
られる。上記反応溶液としても特に限定されず、例え
ば、ウシ血清アルブミンを０．１〜２％添加したリン酸
緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等が挙げられる。
【００２７】上記均一系免疫測定法において、例えば、
上記マーカー分子としてキモトリプシンを使用し、上記
二基質結合性ペプチドとしてターゲット分子に対する抗
体ペプチド領域とキモトリプシンの阻害ペプチド領域と
からなるものを使用する場合、上記二基質結合性ペプチ
ド、ターゲット分子、及び、ｐ−ニトロアニリドが結合
したキモトリプシン基質合成ペプチドを混合した後、キ
モトリプシンを反応させ、ｐ−ニトロアニリドの遊離を
分光学的に測定する。上記４成分、即ち、二基質結合性
ペプチド、ターゲット分子、ｐ−ニトロアニリドが結合
したキモトリプシン基質合成ペプチド、及び、キモトリ
プシンは、同時に混合することも可能である。
上記マーカー分子としてキモトリプシンを使用し、上記
二基質結合性ペプチドとしてターゲット分子に対する抗
体ペプチド領域とキモトリプシンの阻害ペプチド領域と
からなるものを使用する場合、上記二基質結合性ペプチ
ド、ターゲット分子、及び、ｐ−ニトロアニリドが結合
したキモトリプシン基質合成ペプチドを混合した後、キ
モトリプシンを反応させ、ｐ−ニトロアニリドの遊離を
分光学的に測定する。上記４成分、即ち、二基質結合性
ペプチド、ターゲット分子、ｐ−ニトロアニリドが結合
したキモトリプシン基質合成ペプチド、及び、キモトリ
プシンは、同時に混合することも可能である。
【００２８】上記二基質結合性ペプチド中のターゲット
分子抗体ペプチド領域にターゲット分子が結合すること
によって、キモトリプシン阻害ペプチド領域に対するキ
モトリプシンの結合が阻害され、キモトリプシン阻害活
性が抑制される。従って、検体中のターゲット分子濃度
が多いほど、キモトリプシン阻害活性が抑制され、遊離
のキモトリプシンは増加することとなる。遊離のキモト
リプシンは、ｐ−ニトロアニリドが結合したキモトリプ
シン基質合成ペプチドに作用し、反応液中に遊離のｐ−
ニトロアニリド量が増加する。ｐ−ニトロアニリド遊離
に起因する３９０〜４１０ｎｍの吸収増加を測定するこ
とによって、ターゲット分子濃度を測定することが可能
となる。
分子抗体ペプチド領域にターゲット分子が結合すること
によって、キモトリプシン阻害ペプチド領域に対するキ
モトリプシンの結合が阻害され、キモトリプシン阻害活
性が抑制される。従って、検体中のターゲット分子濃度
が多いほど、キモトリプシン阻害活性が抑制され、遊離
のキモトリプシンは増加することとなる。遊離のキモト
リプシンは、ｐ−ニトロアニリドが結合したキモトリプ
シン基質合成ペプチドに作用し、反応液中に遊離のｐ−
ニトロアニリド量が増加する。ｐ−ニトロアニリド遊離
に起因する３９０〜４１０ｎｍの吸収増加を測定するこ
とによって、ターゲット分子濃度を測定することが可能
となる。
【００２９】本発明の二基質結合性ペプチドは、シング
ルペプチドであるので、大腸菌等の系を用いる組み換え
ＤＮＡ技術によって１種類の遺伝子から製造することに
より、又は、ペプチド合成により、従来使用されてきた
修飾されたモノクローナル抗体よりもはるかに容易に安
価で提供でき、また、分子構造の均一性においても、従
来技術によって提供される修飾されたモノクローナル抗
体よりも優れたものである。本発明の二基質結合性ペプ
チドは、均一系免疫測定法による疾病、環境の診断に応
用可能である。
ルペプチドであるので、大腸菌等の系を用いる組み換え
ＤＮＡ技術によって１種類の遺伝子から製造することに
より、又は、ペプチド合成により、従来使用されてきた
修飾されたモノクローナル抗体よりもはるかに容易に安
価で提供でき、また、分子構造の均一性においても、従
来技術によって提供される修飾されたモノクローナル抗
体よりも優れたものである。本発明の二基質結合性ペプ
チドは、均一系免疫測定法による疾病、環境の診断に応
用可能である。
【００３０】
【実施例】以下に本発明の実施例を掲げて更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。
【００３１】実施例１ 抗アルカリフォスファターゼ抗
体ペプチド領域とキモトリプシン阻害ペプチド領域とを
有する二基質結合性ペプチド（Ａｎｔｉ．ＡＰ／Ａｎｔ
ｉ．ＣＨ）の作製 本実施例では、二基質結合性ペプチドとして、配列表の
配列番号２のペプチドの調製法を示した。配列表の配列
番号２のペプチドにおいて、第２番目のアラニン（Ａｌ
ａ）から第１６番目のセリン（Ｓｅｒ）までの１５アミ
ノ酸からなる配列はアルカリフォスファターゼ抗体ペプ
チド領域（Ｆｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３，７
７６１−７７６６）であり、第３２番目のセリン（Ｓｅ
ｒ）から第４２番目のチロシン（Ｔｙｒ）までの１１ア
ミノ酸からなる配列はキモトリプシン阻害ペプチド領域
（ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１９９６，２５９，８１９−８２７）である。第
１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から第３１番目のセリン
（Ｓｅｒ）までのＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓ
ｅｒが３回繰り返された配列は、スペーサーペプチド領
域である。
体ペプチド領域とキモトリプシン阻害ペプチド領域とを
有する二基質結合性ペプチド（Ａｎｔｉ．ＡＰ／Ａｎｔ
ｉ．ＣＨ）の作製 本実施例では、二基質結合性ペプチドとして、配列表の
配列番号２のペプチドの調製法を示した。配列表の配列
番号２のペプチドにおいて、第２番目のアラニン（Ａｌ
ａ）から第１６番目のセリン（Ｓｅｒ）までの１５アミ
ノ酸からなる配列はアルカリフォスファターゼ抗体ペプ
チド領域（Ｆｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３，７
７６１−７７６６）であり、第３２番目のセリン（Ｓｅ
ｒ）から第４２番目のチロシン（Ｔｙｒ）までの１１ア
ミノ酸からなる配列はキモトリプシン阻害ペプチド領域
（ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１９９６，２５９，８１９−８２７）である。第
１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から第３１番目のセリン
（Ｓｅｒ）までのＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓ
ｅｒが３回繰り返された配列は、スペーサーペプチド領
域である。
【００３２】上記二基質結合性ペプチドをコードするＤ
ＮＡをＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒ
ｅａｃｔｉｏｎ）によって調製するために、配列表の配
列番号３及び４の合成鋳型ＤＮＡ、並びに、配列表の配
列番号５〜１０のプライマーＤＮＡを調製した。
ＮＡをＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒ
ｅａｃｔｉｏｎ）によって調製するために、配列表の配
列番号３及び４の合成鋳型ＤＮＡ、並びに、配列表の配
列番号５〜１０のプライマーＤＮＡを調製した。
【００３３】配列表の配列番号３及び４の合成ＤＮＡの
混合物を鋳型として、３回の連続ＰＣＲを行った。プラ
イマーの組み合わせは、１回目；配列表の配列番号５及
び６のプライマーＤＮＡ、２回目；配列表の配列番号７
及び８のプライマーＤＮＡ、３回目；配列表の配列番号
９及び１０のプライマーＤＮＡとした。１回目のＰＣＲ
反応液１μＬを２回目のＰＣＲの鋳型として加えて反応
を行い、更に、そのＰＣＲ反応液１μＬを３回目のＰＣ
Ｒの鋳型として加えた。
混合物を鋳型として、３回の連続ＰＣＲを行った。プラ
イマーの組み合わせは、１回目；配列表の配列番号５及
び６のプライマーＤＮＡ、２回目；配列表の配列番号７
及び８のプライマーＤＮＡ、３回目；配列表の配列番号
９及び１０のプライマーＤＮＡとした。１回目のＰＣＲ
反応液１μＬを２回目のＰＣＲの鋳型として加えて反応
を行い、更に、そのＰＣＲ反応液１μＬを３回目のＰＣ
Ｒの鋳型として加えた。
【００３４】このようにして増幅させた約１５０ｂｐの
ＤＮＡフラグメントを電気泳動によって回収後、これを
ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩによって消化し、それを、同様
の制限酵素処理されたｐＥＴ−１１ｄベクター（Ｎｏｖ
ａｇｅｎ社）にライゲーションし、二基質結合性ペプチ
ド（Ａｎｔｉ．ＡＰ／Ａｎｔｉ．ＣＨ）を大腸菌にて発
現させるベクターｐＴＡ−Ａ／Ｃを構築した。ｐＴＡ−
Ａ／Ｃを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、２Ｘ
Ｙ．Ｔ培地（酵母エキス１６ｇ、バクトトリプトン２０
ｇ、ＮａＣｌを５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ／１Ｌ）
にて培養した。
ＤＮＡフラグメントを電気泳動によって回収後、これを
ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩによって消化し、それを、同様
の制限酵素処理されたｐＥＴ−１１ｄベクター（Ｎｏｖ
ａｇｅｎ社）にライゲーションし、二基質結合性ペプチ
ド（Ａｎｔｉ．ＡＰ／Ａｎｔｉ．ＣＨ）を大腸菌にて発
現させるベクターｐＴＡ−Ａ／Ｃを構築した。ｐＴＡ−
Ａ／Ｃを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、２Ｘ
Ｙ．Ｔ培地（酵母エキス１６ｇ、バクトトリプトン２０
ｇ、ＮａＣｌを５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ／１Ｌ）
にて培養した。
【００３５】培養液のＯＤ６５０が１．０５の時に１ｍ
ＭＩＰＴＧを添加し、二基質結合性ペプチド（Ａｎｔ
ｉ．ＡＰ／Ａｎｔｉ．ＣＨ）遺伝子を発現させた。回収
した大腸菌培養液を超音波破砕した後、μ−Ｂｏｎｄａ
ｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８カラム（ウォーターズ社製）によ
る逆相クロマトグラフィーによって、二基質結合性ペプ
チド（Ａｎｔｉ．ＡＰ／Ａｎｔｉ．ＣＨ）を精製した。
真空遠心濃縮機によって溶媒を飛ばし、乾燥標品として
保存した。
ＭＩＰＴＧを添加し、二基質結合性ペプチド（Ａｎｔ
ｉ．ＡＰ／Ａｎｔｉ．ＣＨ）遺伝子を発現させた。回収
した大腸菌培養液を超音波破砕した後、μ−Ｂｏｎｄａ
ｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８カラム（ウォーターズ社製）によ
る逆相クロマトグラフィーによって、二基質結合性ペプ
チド（Ａｎｔｉ．ＡＰ／Ａｎｔｉ．ＣＨ）を精製した。
真空遠心濃縮機によって溶媒を飛ばし、乾燥標品として
保存した。
【００３６】実施例２ 抗β−グルクロニダーゼ抗体ペ
プチド領域とキモトリプシン阻害ペプチド領域とを有す
る二基質結合性ペプチド（Ａｎｔｉ．ＧＬＵ／Ａｎｔ
ｉ．ＣＨ）の作製 本実施例では、二基質結合性ペプチドとして、配列表の
配列番号１１のペプチドの調製法を示した。配列表の配
列番号１１のペプチドにおいて、第２番目のアスパラギ
ン酸（Ａｓｐ）から第２６番目のアルギニン（Ａｒｇ）
までの２５アミノ酸からなる配列は抗β−グルクロニダ
ーゼ抗体ペプチド領域（Ｆｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９
６，９３，７７６１−７７６６）であり、第４２番目の
セリン（Ｓｅｒ）から第５２番目のチロシン（Ｔｙｒ）
までの１１アミノ酸からなる配列はキモトリプシン阻害
ペプチド領域であり、第２７番目のグリシン（Ｇｌｙ）
から第４１番目のセリン（Ｓｅｒ）までの配列は、スペ
ーサーペプチド領域である。
プチド領域とキモトリプシン阻害ペプチド領域とを有す
る二基質結合性ペプチド（Ａｎｔｉ．ＧＬＵ／Ａｎｔ
ｉ．ＣＨ）の作製 本実施例では、二基質結合性ペプチドとして、配列表の
配列番号１１のペプチドの調製法を示した。配列表の配
列番号１１のペプチドにおいて、第２番目のアスパラギ
ン酸（Ａｓｐ）から第２６番目のアルギニン（Ａｒｇ）
までの２５アミノ酸からなる配列は抗β−グルクロニダ
ーゼ抗体ペプチド領域（Ｆｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９
６，９３，７７６１−７７６６）であり、第４２番目の
セリン（Ｓｅｒ）から第５２番目のチロシン（Ｔｙｒ）
までの１１アミノ酸からなる配列はキモトリプシン阻害
ペプチド領域であり、第２７番目のグリシン（Ｇｌｙ）
から第４１番目のセリン（Ｓｅｒ）までの配列は、スペ
ーサーペプチド領域である。
【００３７】上記ペプチドをコードするＤＮＡは、配列
表の配列番号１２及び１３の合成鋳型ＤＮＡ、並びに、
配列表の配列番号１４〜２１のプライマーＤＮＡを合成
し、それを用いたＰＣＲによって調製した。
表の配列番号１２及び１３の合成鋳型ＤＮＡ、並びに、
配列表の配列番号１４〜２１のプライマーＤＮＡを合成
し、それを用いたＰＣＲによって調製した。
【００３８】配列表の配列番号１２及び１３の合成ＤＮ
Ａの混合物を鋳型として、４回の連続ＰＣＲを行った。
プライマーの組み合わせは、１回目；配列表の配列番号
１４及び１５のプライマーＤＮＡ、２回目；配列表の配
列番号１６及び１７のプライマーＤＮＡ、３回目；配列
表の配列番号１８及び１９のプライマーＤＮＡ、４回
目；配列表の配列番号２０及び２１のプライマーＤＮＡ
とした。ＰＣＲ反応液１μＬを次のＰＣＲの鋳型として
加えた。
Ａの混合物を鋳型として、４回の連続ＰＣＲを行った。
プライマーの組み合わせは、１回目；配列表の配列番号
１４及び１５のプライマーＤＮＡ、２回目；配列表の配
列番号１６及び１７のプライマーＤＮＡ、３回目；配列
表の配列番号１８及び１９のプライマーＤＮＡ、４回
目；配列表の配列番号２０及び２１のプライマーＤＮＡ
とした。ＰＣＲ反応液１μＬを次のＰＣＲの鋳型として
加えた。
【００３９】このようにして増幅させた約１８０ｂｐの
ＤＮＡフラグメントを電気泳動によって回収後、これを
ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩによって消化し、それを、同様
の制限酵素処理されたｐＥＴ−１１ｄベクター（Ｎｏｖ
ａｇｅｎ社）にライゲーションし、二基質結合性ペプチ
ド（Ａｎｔｉ．ＧＬＵ／Ａｎｔｉ．ＣＨ）を大腸菌にて
発現させるベクターｐＴＡ−Ｇ／Ｃを構築した。ｐＴＡ
−Ｇ／Ｃを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、２Ｘ
Ｙ．Ｔ培地にて培養した。
ＤＮＡフラグメントを電気泳動によって回収後、これを
ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩによって消化し、それを、同様
の制限酵素処理されたｐＥＴ−１１ｄベクター（Ｎｏｖ
ａｇｅｎ社）にライゲーションし、二基質結合性ペプチ
ド（Ａｎｔｉ．ＧＬＵ／Ａｎｔｉ．ＣＨ）を大腸菌にて
発現させるベクターｐＴＡ−Ｇ／Ｃを構築した。ｐＴＡ
−Ｇ／Ｃを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、２Ｘ
Ｙ．Ｔ培地にて培養した。
【００４０】培養液のＯＤ６５０が１．２５の時に１ｍ
ＭＩＰＴＧを添加し、二基質結合性ペプチド（Ａｎｔ
ｉ．ＧＬＵ／Ａｎｔｉ．ＣＨ）遺伝子を発現させた。回
収した大腸菌培養液を超音波破砕した後、μ−Ｂｏｎｄ
ａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８カラム（ウォーターズ社製）に
よる逆相クロマトグラフィーによって、二基質結合性ペ
プチド（Ａｎｔｉ．ＧＬＵ／Ａｎｔｉ．ＣＨ）を精製し
た。真空遠心濃縮機によって溶媒を飛ばし、乾燥標品と
して保存した。
ＭＩＰＴＧを添加し、二基質結合性ペプチド（Ａｎｔ
ｉ．ＧＬＵ／Ａｎｔｉ．ＣＨ）遺伝子を発現させた。回
収した大腸菌培養液を超音波破砕した後、μ−Ｂｏｎｄ
ａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８カラム（ウォーターズ社製）に
よる逆相クロマトグラフィーによって、二基質結合性ペ
プチド（Ａｎｔｉ．ＧＬＵ／Ａｎｔｉ．ＣＨ）を精製し
た。真空遠心濃縮機によって溶媒を飛ばし、乾燥標品と
して保存した。
【００４１】実施例３ 均一系免疫測定法によるアルカ
リフォスファターゼの定量（１） ターゲット分子であるアルカリフォスファターゼを１、
０．８、０．６、０．４、０．２及び０μｇ／ｍＬ含む
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１００μＬ、１
％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミンを含む５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）を８００μＬ、実施例１で調製した
１５０ｎＭＡｎｔｉ．ＡＰ／Ａｎｔｉ．ＣＨを１０μ
Ｌ、０．５０７ｍＭＮ−ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａｎｉ
ｎｅ−Ａｌａｎｉｎｅ−Ｐｒｏｌｉｎｅ−Ｐｈｅｎｙｌ
ａｌａｎｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（Ｎ−
ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ；シ
グマ社製）を３３μＬ混合した後、マーカー酵素である
キモトリプシン溶液（４μｇ／ｍＬ ５０ｍＭリン酸緩
衝液、ｐＨ７．５）を１０μＬ添加混合し、３０℃で１
５分間インキュベーションした。反応終了後４１０ｎｍ
の吸収を測定した。結果を表１及び図１に示す。表１及
び図１に示されるように、サンプル中のアルカリフォス
ファターゼ量に依存してｐＮＡの遊離が増大した。
リフォスファターゼの定量（１） ターゲット分子であるアルカリフォスファターゼを１、
０．８、０．６、０．４、０．２及び０μｇ／ｍＬ含む
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１００μＬ、１
％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミンを含む５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）を８００μＬ、実施例１で調製した
１５０ｎＭＡｎｔｉ．ＡＰ／Ａｎｔｉ．ＣＨを１０μ
Ｌ、０．５０７ｍＭＮ−ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａｎｉ
ｎｅ−Ａｌａｎｉｎｅ−Ｐｒｏｌｉｎｅ−Ｐｈｅｎｙｌ
ａｌａｎｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（Ｎ−
ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ；シ
グマ社製）を３３μＬ混合した後、マーカー酵素である
キモトリプシン溶液（４μｇ／ｍＬ ５０ｍＭリン酸緩
衝液、ｐＨ７．５）を１０μＬ添加混合し、３０℃で１
５分間インキュベーションした。反応終了後４１０ｎｍ
の吸収を測定した。結果を表１及び図１に示す。表１及
び図１に示されるように、サンプル中のアルカリフォス
ファターゼ量に依存してｐＮＡの遊離が増大した。
【００４２】
【表１】
【００４３】実施例４ 均一系免疫測定法によるアルカ
リフォスファターゼの定量（２） １％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミンを含む５ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）８００μＬに、ターゲット分子とし
てのアルカリフォスファターゼをそれぞれ１、０．８、
０．６、０．４、０．２及び０μｇ／ｍＬ含む５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１００μＬ、実施例１で
調製した１５０ｎＭ Ａｎｔｉ．ＡＰ／Ａｎｔｉ．ＣＨ
を１０μＬ、０．５０７ｍＭ Ｎ−ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡを３３μＬ、及び、マー
カー酵素であるキモトリプシン溶液（４μｇ／ｍＬ ５
０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５）１０μＬを同時に添
加混合し、３０℃で１５分間インキュベーションした。
反応終了後４１０ｎｍの吸収を測定した。結果を表２及
び図２に示す。
リフォスファターゼの定量（２） １％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミンを含む５ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）８００μＬに、ターゲット分子とし
てのアルカリフォスファターゼをそれぞれ１、０．８、
０．６、０．４、０．２及び０μｇ／ｍＬ含む５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１００μＬ、実施例１で
調製した１５０ｎＭ Ａｎｔｉ．ＡＰ／Ａｎｔｉ．ＣＨ
を１０μＬ、０．５０７ｍＭ Ｎ−ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡを３３μＬ、及び、マー
カー酵素であるキモトリプシン溶液（４μｇ／ｍＬ ５
０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５）１０μＬを同時に添
加混合し、３０℃で１５分間インキュベーションした。
反応終了後４１０ｎｍの吸収を測定した。結果を表２及
び図２に示す。
【００４４】表２及び図２に示されるように、サンプル
中のアルカリフォスファターゼ量に依存して、実施例３
と同様にｐＮＡの遊離がみられた。このように、ターゲ
ット分子、二基質結合性ペプチド、マーカー酵素及びマ
ーカー酵素基質の４者を同時に添加しても測定可能であ
ることがわかった。
中のアルカリフォスファターゼ量に依存して、実施例３
と同様にｐＮＡの遊離がみられた。このように、ターゲ
ット分子、二基質結合性ペプチド、マーカー酵素及びマ
ーカー酵素基質の４者を同時に添加しても測定可能であ
ることがわかった。
【００４５】
【表２】
【００４６】実施例５ 均一系免疫測定法によるβ−グ
ルクロニダーゼの定量 ターゲット分子であるβ−グルクロニダーゼをそれぞれ
１．０、０．８、０．６、０．４、０．２及び０μｇ／
ｍＬ含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１００
μＬ、１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミンを含む５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を８００μＬ、実施例２で
調製した２００ｎＭ Ａｎｔｉ．ＧＬＵ／Ａｎｔｉ．Ｃ
Ｈを１０μＬ、０．５０７ｍＭＮ−ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡを３３μＬ混合した後、
マーカー酵素であるキモトリプシン溶液（４μｇ／ｍＬ
５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５）を１０μＬ添加
混合し、３０℃で１５分間インキュベーションした。反
応終了後４１０ｎｍの吸収を測定した。結果を表３及び
図３に示す。表３及び図３に示されるように、サンプル
中のβ−グルクロニダーゼ量に依存してｐＮＡの遊離が
増大した。
ルクロニダーゼの定量 ターゲット分子であるβ−グルクロニダーゼをそれぞれ
１．０、０．８、０．６、０．４、０．２及び０μｇ／
ｍＬ含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１００
μＬ、１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミンを含む５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を８００μＬ、実施例２で
調製した２００ｎＭ Ａｎｔｉ．ＧＬＵ／Ａｎｔｉ．Ｃ
Ｈを１０μＬ、０．５０７ｍＭＮ−ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡを３３μＬ混合した後、
マーカー酵素であるキモトリプシン溶液（４μｇ／ｍＬ
５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５）を１０μＬ添加
混合し、３０℃で１５分間インキュベーションした。反
応終了後４１０ｎｍの吸収を測定した。結果を表３及び
図３に示す。表３及び図３に示されるように、サンプル
中のβ−グルクロニダーゼ量に依存してｐＮＡの遊離が
増大した。
【００４７】
【表３】
【００４８】
【発明の効果】本発明の二基質結合性ペプチドは、上述
の構成よりなるので、容易に安価で調製することがで
き、分子構造の均一性においても優れたものを得ること
が可能となった。また、それを用いることにより、固液
分離操作を必要としない均一系免疫測定法が可能とな
り、疾病、環境汚染物質等の診断が可能となった。
の構成よりなるので、容易に安価で調製することがで
き、分子構造の均一性においても優れたものを得ること
が可能となった。また、それを用いることにより、固液
分離操作を必要としない均一系免疫測定法が可能とな
り、疾病、環境汚染物質等の診断が可能となった。
【００４９】
【配列表】 <110> 積水化学工業株式会社 SEKISUI CHEMICAL CO., LTD. <120> 二基質結合性ペプチド及びこれを用いた均一系免疫測定法 <130> 98P03057 <160> 21 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト スペーサーペプチド領域の配列 <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 2 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト 実施例１の抗アルカリフォスファターゼ抗体ペプチド領域とキモトリプシン阻害 ペプチド領域とを有する二基質結合性ペプチド <400> 2 Met Ala Leu Leu Arg Tyr Gly Ser Thr Pro Vla Thr Leu Ala Ile Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 20 25 30 Cys Thr Tyr Ser Ile Pro Pro Gln Cys Tyr 35 40 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト 合成鋳型ＤＮＡ <400> 3 tctggtggtg gttctggtgg tggttctggt ggtggttctg gtggtggt 48 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト 合成鋳型ＤＮＡ <400> 4 accaccacca gaaccaccac cagaaccacc accagaacca ccaccaga 48 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト プライマーＤＮＡ <400> 5 cctgttactt tagctatttc tggtggtggt tctggt 36 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト プライマーＤＮＡ agaagaacca ccaccagaac caccaccaga accacc 36 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト プライマーＤＮＡ <400> 7 ttacgttatg gttctactcc tgttacttta gctatt 36 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト プライマーＤＮＡ <400> 8 aggaggaata gaataagtac aagaagaacc accaccaga 39 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト プライマーＤＮＡ <400> 9 ggccatggct ttattacgtt atggttctac t 31 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト プライマーＤＮＡ <400> 10 ggatccttaa taacattgag gaggaataga ataagtaca 39 <210> 11 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト 実施例２の抗β−グルクロニダーゼ抗体ペプチド領域とキモトリプシン阻害ペプ チド領域とを有する二基質結合性ペプチド <400> 11 Met Asp Pro Val Phe Tyr Val Asp Val Leu Pro Ala Leu Leu Arg Tyr 1 5 10 15 Thr Gly Ser Thr Ile Pro Thr Thr Ile Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Pro 35 40 45 Pro Gln Cys Tyr 50 <210> 12 <211> 45 <212> DNA ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ <220> <223> 配列表フリーテキスト 合成鋳型ＤＮＡ <400> 12 actactattc gtggtggtgg ttctggtggt ggttctggtg gtggt 45 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト 合成鋳型ＤＮＡ <400> 13 accaccacca gaaccaccac cagaaccacc accacgaata gtagt 45 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト プライマーＤＮＡ <400> 14 tatggttcta ctattcctac tactattcgt ggtggt 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト プライマーＤＮＡ <400> 15 accagaacca ccaccagaac caccaccaga accacc 36 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト プライマーＤＮＡ <400> 16 ttacctgctt tattacgtta tggttctact attcct 36 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト プライマーＤＮＡ <400> 17 agtacaagaa gaaccaccac cagaaccacc accaga 36 <210> 18 <211> 36 <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト プライマーＤＮＡ <400> 18 gttttttatg ttgatgtttt acctgcttta ttacgt 36 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト プライマーＤＮＡ <400> 19 ttgaggagga atagaataag tacaagaaga accacc 36 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト プライマーＤＮＡ <400> 20 ggccatggat cctgtttttt atgttgatgt t 31 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト プライマーＤＮＡ <400> 21 ggatccttaa taacattgag gaggaataga ata 33
【図１】実施例３における均一系免疫測定法によるアル
カリフォスファターゼ量と発色量との関係を示すグラフ
である。
カリフォスファターゼ量と発色量との関係を示すグラフ
である。
【図２】実施例４における均一系免疫測定法によるアル
カリフォスファターゼ量と発色量との関係を示すグラフ
である。
カリフォスファターゼ量と発色量との関係を示すグラフ
である。
【図３】実施例５における均一系免疫測定法によるβ−
グルクロニダーゼと発色量との関係を示すグラフであ
る。
グルクロニダーゼと発色量との関係を示すグラフであ
る。
Claims (4)
- 【請求項１】 ２つのペプチド領域を有し、シングルペ
プチドである二基質結合性ペプチドであって、前記２つ
のペプチド領域は、互いに異なる２種の基質に結合活性
を有するものであることを特徴とする二基質結合性ペプ
チド。 - 【請求項２】 ２つのペプチド領域は、それぞれ５〜７
００アミノ酸残基からなるものである請求項１記載の二
基質結合性ペプチド。 - 【請求項３】 ２つのペプチド領域は、一方がターゲッ
ト分子に対する抗体ペプチド領域であり、他方がマーカ
ー分子に対する抗体ペプチド領域又はマーカー分子に結
合活性を有する阻害ペプチド領域である請求項１又は２
記載の二基質結合性ペプチド。 - 【請求項４】 請求項１、２又は３記載の二基質結合性
ペプチドを用いることを特徴とする均一系免疫測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10347123A JP2000171466A (ja) | 1998-12-07 | 1998-12-07 | 二基質結合性ペプチド及びこれを用いた均一系免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10347123A JP2000171466A (ja) | 1998-12-07 | 1998-12-07 | 二基質結合性ペプチド及びこれを用いた均一系免疫測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000171466A true JP2000171466A (ja) | 2000-06-23 |
Family
ID=18388068
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10347123A Pending JP2000171466A (ja) | 1998-12-07 | 1998-12-07 | 二基質結合性ペプチド及びこれを用いた均一系免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000171466A (ja) |
-
1998
- 1998-12-07 JP JP10347123A patent/JP2000171466A/ja active Pending
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