JP2023012403A - 高感度免疫接合体、この製造方法、これを含む体外診断試薬及び体外診断キット - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の高感度免疫接合体は、a)第1のナノ粒子-DNA結合体と、第一抗体-DNA結合体を含み、第1のナノ粒子-DNA結合体と第一抗体-DNA結合体のDNAが相補的に結合した第1のナノ粒子免疫接合体;及びb)第2のナノ粒子-DNA結合体と、第二抗体-DNA結合体を含み、第2のナノ粒子-DNA結合体と第二抗体-DNA結合体のDNAが相補的に結合した第2のナノ粒子免疫接合体;を含む。
第1のナノ粒子-DNA結合体は、第1のナノ粒子にDNA断片が結合したものである。
第一抗体-DNA結合体は、第一抗体にDNA断片が結合したものである。
図1を参照すると、第1のナノ粒子-DNA結合体と前記第一抗体-DNA結合体とが結合して、第1のナノ粒子免疫接合体を形成する。第1のナノ粒子-DNA結合体と前記第一抗体-DNA結合体のDNA断片は、互いに相補的な配列を含めており、混成化(hybridization)して結合することができる。例えば、表2の第1のNH2-DNA断片(図1の第1のナノ粒子-DNA結合体に含まれたDNA断片)と、第1のSMCC-DNA断片(図1の第一抗体-DNA結合体に含まれたDNA断片)は、互いに相補的な塩基配列を持つ。
図1を参照すると、第2のナノ粒子-DNA結合体は、第2のナノ粒子が蛍光ラテックスであるものと、DNA断片の配列を除いては、第1のナノ粒子-DNA結合体の製造方法と同様であってもよい。
第二抗体-DNA結合体は、第二抗体にDNA断片が結合したものである。
図1を参照すると、第2のナノ粒子の表面のカルボキシル基に第2のNH2-DNA断片が結合した第2のナノ粒子-DNA結合体に、第2の抗体-DNA結合体(図2bのように製造)が相補的に結合して第2のナノ粒子免疫接合体を形成する。
本発明の高感度免疫接合体は、前記第1のナノ粒子免疫接合体と第2のナノ粒子免疫接合体を混合して製造される。
本発明は、前記高感度免疫接合体を含む体外診断試薬を提供する。
本発明は、前記高感度免疫接合体を含む体外診断キットを提供する。
以下では、本発明を具体的に説明するために実施例を挙げて詳説することとする。しかしなから、本発明による実施例は、種々の異なる形態に変形され得、本発明の範囲が後述する実施例に限定されるものと解釈されてはならない。本発明の実施例は、当業界における平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
以下、製造例及び実施例の免疫接合体に用いられた材料を表1に、免疫接合体に用いられたDNA配列を表2に示した。
図2a及び図2bは、第一抗体-DNA結合体及び第二抗体-DNA結合体の製造方法の模式図を示したものであり、第一抗体-DNA結合体と、第二抗体-DNA結合体の製造方法は、同一である。図2a及び図2bを参照すると、抗体-DNA結合体は、(1ステップ)NH2-DNAでSMCC-DNAを製造、(2ステップ)抗体に-SH作用基の導入、(3ステップ)SMCC-DNAと抗体-SHの反応で抗体-DNA結合体を形成させて製造する。
NH2-DNA100μl(35nmol)とスルホ-SMCC(10mg/ml)10μlを1.5mlチューブに入れて、常温で1時間反応させた。反応後、Sephadex LH20クラム精製によって反応せずに残ったスルホ-SMCCを除去して、SMCC-DNAのみを得た後に濃度を確認した。
抗体100μl(0.5mg)と2-イミノチオランパウダー1mgをチューブに入れて、常温で1時間反応した。反応後、Sephadex LH20クラムで抗体-SHと反応した後に残ったイミノチオランを分離して、クラムを介して得られた抗体-SHの濃度を確認した。
製造例1.1で準備したSMCC-DNA断片を投入したチューブに1XPBSを100μl入れて、vortex混合後、製造例1.2で準備した抗体-SHを1:1割合で入れた。常温で30分間反応させた後、Sephadex LH20クラムで精製して、抗体-DNA結合体を得た。
図1は、ナノ粒子免疫接合体の製造方法の模式図を示したものであって、第1のナノ粒子免疫接合体及び第2のナノ粒子免疫接合体の製造過程は、同一であり、第2のナノ粒子が蛍光ラテックスである点でのみ相違する。図1を参照すると、(1ステップ)ナノ粒子-DNA結合体を製造し、(2ステップ)ナノ粒子-DNA結合体に、製造例1で製造された抗体-DNA結合体を反応させて製造した。
2%ナノ粒子100μlとNH2-DNA(20nmole、50μl)をチューブに入れて、MESバッファーを200μl添加した。EDC(200mg/ml)を50μl入れて、常温で2時間反応させた。13000rpmで遠心分離した後、上層液を除去したうえで、ナノ粒子-DNA結合体をペレット状に得た。
製造例2.1の第1のナノ粒子-DNA結合体を1XPBS1mlに分散させて、vortexした後、製造例1で製造された第一抗体-DNA結合体(第一抗体-DNA結合体と第1のナノ粒子-DNA結合体のDNA断片は、相補的配列を持つ)を投入して、常温で30分間反応させた。
第2のナノ粒子として蛍光ラテックスを用いたことと、DNA断片の配列及び抗体を除いては、前記製造例2.1~製造例2.2と同じく行った。
製造例1で製造された抗体-DNA結合体と、図3のように製造された抗体-蛍光免疫接合体を1:1で混合して使用した。
製造例2.2で製造された第1のナノ粒子免疫接合体と、製造例2.3で製造された第2のナノ粒子免疫接合体を1:1で混合して、二次(高感度)免疫接合体として使用した。
抗体-酵素免疫接合体を用いたELISA(酵素免疫測定法)方法により血液サンプル内のトロポニンTを検出した。図5aに示したELISA方法と同様に行った。
1)トロポニンTキャプチャー抗体(capture antibody)をcarbonate/bicarbonateバッファー(ph9.6)を利用して、(1-10μg/mL)濃度で準備した後、PVCマイクロタイタープレートに分注した。2)プレート蓋を覆って、4℃で12時間培養した。3)コーティング溶液を除去して、200μL PBSで2回洗浄した。4)プレートを払い落として、残った洗浄溶液を除去した。5)残っている溶液は、ペーパータオルで気を付けて除去した。
1)残っているprotein-binding sitesをブロッキングするために、コーティングされたウェルプレートに200μLのブロッキングバッファー(5%non-fat dry milk/PBS)をそれぞれのウェルに入れた。2)常温で2時間インキュベーションした。3)試料サンプル#1~#7まで100μLずつウェルプレートに入れて、standards curveのためのサンプルを100μLずつウェルプレートに入れた。4)37℃で90分間インキュベーションした(未知の試料は、常にstandard curveと比較する)。5)サンプルを除去して、200μLのPBSで3回洗浄した。
1)希釈された二次抗体を100μLずつそれぞれのウェルに入れた。2)二次抗体が標的タンパク質に対してキャプチャー抗体と異なる部位に結合するか確認した。3)プレート蓋を覆って、常温で2時間インキュベーションした。4)PBSで4回洗浄過程を施した。5)ブロッキングバッファーで希釈した検出抗体を100μLずつウェルに入れた。6)プレート蓋を覆って、常温で2時間インキュベーションした。7)PBSで4回洗浄過程を施した。
検出用酵素としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)を用いて、検出抗体-HRP免疫結合体の吸光度を測定した。各ウェルにTMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)溶液を200μlずつ入れて、常温で30分間培養した後、停止液(2M H2SO4)を200μl入れて、450nmの吸光度を測定した。
実施例1で製造された一次免疫接合体を用いて、図6aの方法によりトロポニンTを検出した。1)血液プラズマサンプル#1~#7まで、それぞれ10μlをマイクロチューブに入れた。2)一次免疫接合体溶液(一次免疫接合体及び抗体-蛍光免疫接合体の混合物)を100μl入れて、常温で10分間培養した。3)Rバッファーを60μl入れて、側方流動方式のmembrane stripに170μlを10分間展開させた。4)洗浄溶液を170μl入れて、10分間洗浄した。5)Membrane strip専用スキャナー(BMT 1D scanner)でスキャンして検出した。
実施例2で製造された二次(高感度)免疫接合体を用いて、図7aの方法によりトロポニンTを検出した。1)血液プラズマサンプル#1~#7まで、それぞれ10μlをマイクロチューブに入れた。2)二次免疫接合体溶液を100μl入れて、常温で10分間培養した。3)Rバッファーを60μl入れて、側方流動方式のmembrane stripに170μlを10分間展開させた。4)洗浄溶液を170μl入れて、10分間洗浄した。5)Membrane strip専用スキャナ(BMT 1D scanner)でスキャンして検出した。
序列番号1は、本発明の一実施例による第1のナノ粒子-DNA結合体に含まれたDNA断片の配列である。
序列番号2は、本発明の一実施例による第2のナノ粒子-DNA結合体に含まれたDNA断片の配列である。
序列番号3は、本発明の一実施例による第一抗体-DNA結合体に含まれたDNA断片の配列である。
序列番号4は、本発明の一実施例による第二抗体-DNA結合体に含まれたDNA断片の配列である。
Claims (12)
- a)第1のナノ粒子-DNA結合体と、第一抗体-DNA結合体を含み、第1のナノ粒子-DNA結合体に含まれたDNA断片と、第一抗体-DNA結合体に含まれたDNA断片とが相補的に結合した第1のナノ粒子免疫接合体;及び、
b)第2のナノ粒子-DNA結合体と、第二抗体-DNA結合体を含み、第2のナノ粒子-DNA結合体に含まれたDNA断片と、第二抗体-DNA結合体に含まれたDNA断片とが相補的に結合した第2のナノ粒子免疫接合体;を含む、
高感度免疫接合体。 - 前記第一抗体は、標的物質の一部分に特異的に結合し、
前記第二抗体は、前記標的物質の他の部分に特異的に結合することを特徴とする、
請求項1に記載の高感度免疫接合体。 - 前記第1のナノ粒子-DNA結合体に含まれたDNA断片は、
バイオチップに固定されたDNAプローブと相補的結合力を有することを特徴とする、
請求項1に記載の高感度免疫接合体。 - 前記第1のナノ粒子と第2のナノ粒子それぞれの表面は、
アミン基(-NH2)、カルボキシル基(-COOH)又はアルデヒド基(-COH)のうち一つ以上の作用基を含むことを特徴とする、
請求項1に記載の高感度免疫接合体。 - 前記第1のナノ粒子と第2のナノ粒子は、
ラテックスビーズであることを特徴とする、
請求項1に記載の高感度免疫接合体。 - 前記ラテックスビーズは、径が100~500nmであることを特徴とする、
請求項5に記載の高感度免疫接合体。 - 前記第2のナノ粒子は、蛍光物質を含有することを特徴とする、
請求項1に記載の高感度免疫接合体。 - 前記第1のナノ粒子と第2のナノ粒子それぞれに15,000~40,000個のDNA断片が結合することを特徴とする、
請求項1に記載の高感度免疫接合体。 - (i)第1のナノ粒子-DNA結合体と、第2のナノ粒子-DNA結合体を製造するステップ;
(ii)第一抗体-DNA結合体と、第二抗体-DNA結合体を製造するステップ;及び、
(iii)第1のナノ粒子-DNA結合体に含まれたDNA断片と、第一抗体-DNA結合体に含まれたDNA断片とが相補的に結合し、第2のナノ粒子-DNA結合体に含まれたDNA断片と、第二抗体-DNA結合体に含まれたDNA断片とが相補的に結合して、第1のナノ粒子免疫接合体及び第2のナノ粒子免疫接合体を製造するステップ;を含む、
高感度免疫接合体の製造方法。 - 前記第1のナノ粒子-DNA結合体と、第2のナノ粒子-DNA結合体は、
第1のナノ粒子と第2のナノ粒子それぞれの表面のカルボキシル基にDNA断片末端のNH2基が結合したことを特徴とする、
請求項9に記載の高感度免疫接合体の製造方法。 - 請求項1~請求項8のうちいずれか一項の高感度免疫接合体を含む、
体外診断試薬。 - 請求項1~請求項8のうちいずれか一項の高感度免疫接合体を含む、
体外診断キット。
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