JP5031924B2 - 選択的に機能化されたトランスデューサーマイクロアレイ - Google Patents
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Description
マイクロアレイの技術は、1つのサンプル中に存在する複数の試料のアッセイを可能にする、強力な研究ツールである(多重アッセイ形式)。このようなアッセイを行うために、マイクロアレイは、異なる生物学的な成分によって修飾された複数のトランスデューサー(transducer)を備える必要がある。特定のトランスデューサーへ所望の生物学的な成分を選択的に結合させることは、マイクロアレイ技術における最も偉大な挑戦の1つである。現在、マイクロアレイを多重化(multiplexing)させるための主な方法は、(i)アレイ上に異なる生物学的な成分をスポット(spotting)する方法、(ii)ナノ流体の接続のセットによってトランスデューサーを物理的に分離するとともに、予め選択されたトランスデューサーを狙って、当該トランスデューサーへ生物学的な成分を送達する方法、(iii)生物学的なタグを特異的に捕捉し得る薬剤にて修飾されたアレイの表面上で、タグが付された生物学的な成分を自己集合(self-assembling)させる方法、および、(iv)トランスデューサーの表面上で、生物学的な成分の合成を制御する方法、である。これらの方法には全て、費用および大量生産の容易さの観点から、限界がある。
本願には、pHにて固定化を制御することによって、マイクロアレイの選択されたトランスデューサー上へ生物学的な成分を結合させるための方法および器具が開示されている。上記方法は、個別にアドレス可能な電極を各トランスデューサーの近傍に配置すること、または、トランスデューサーの表面への電気入力を直接的に可能にするトランスデューサーを設計すること、を利用している。pHの制御は、トランスデューサーの近傍にて、電気化学的にプロトンまたはヒドロキシル基(hydroxyls)を形成することに基づいている。pHが制御されている状況下における、様々な生物学的な成分の連続的な固定化は、所望の形態のアレイを製造することを可能にする。
(トランスデューサーおよび検出部)
トランスデューサーは、トランスデューサーの表面の近傍における生物学的な環境または化学的な環境の変化に応じて物理的な信号(出力)を生成することができる検出器である。上記信号は、例えば、視覚的な信号、または電気的な信号であり得る。これらの変化は、トランスデューサーの表面へ結合された予め選択された生物学的な成分が、標的の試料(analyte)と特異的に相互作用したときに生じる(生物学的な認識工程)。生物学的な成分と一体化したトランスデューサーは、バイオセンサーの検出部を形成する。
生物学的な認識に関与する上記生物学的な成分は、標的である試料へ特異的に結合すること、標的である試料を特異的に変換すること、または、これらの両方が可能である分子である。試料は、分析操作(例えば、滴定など)によって決定された基質または化学物質である。例えば、免疫学的なアッセイにおいては、上記試料は、リガンドまたは結合剤(binder)であり得、血糖値試験(blood glucose testing)では、上記試料は、グルコースである。医薬では、用語「試料(analyte)」は、しばしば患者に施される試験のタイプを意図し、当該試験は、例えば、ヒトの体内の化学物質を決定している。試料は、通常は測定され得ず、試料の測定可能な特性が測定される。例えば、グルコースは測定され得ないが、グルコースの濃度は測定され得る。この例では、”グルコース”が上記成分であり、”濃度”が上記特性である。実験室および門外漢では、用語「特性(property)」は、しばしば省略されるが、当該省略は、どの特性が測定されるかということに関する不明確さを生じることはない。
上記トランスデューサーの表面は、導電性(conductive)、半導体性(semi-conductive)、または、非導電性(non-conductive)であり得る。上記表面の材料は、金属または合金(例えば、金、プラチナ、アルミニウム若しくはクロム)、シリカ、炭素体(例えば、グラファイト若しくはガラス質の炭素(glassy carbon))、ガラス、セラミック、複合材料(例えば、窒化ケイ素若しくはインジウムスズ酸化物(ITO))、または、プラスチック(例えば、ポリスチレン若しくはナイロン)であり得る。
トランスデューサーの表面の最初の修飾では、別の生物学的な成分を検出部へ結合させることができる官能基(functional group)を導入する。トランスデューサーの表面に対する官能基の導入は、下記方法の1つにて行われ得る。つまり、(i)トランスデューサーの表面を、直接、化学的に変換する方法。例えば、炭素体の表面(carbon-based surface)は、酸素プラズマまたは酸化剤(例えば、硝酸)によって酸化され得る。(ii)自身の構造内に官能基を有するポリマーを用いてコーティングすることによる、表面の修飾。上記ポリマーによるコーティングは、トランスデューサーの表面上へ官能基を導入する。上記ポリマーは、バイオポリマー(多糖、ゼラチンなど)、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ハイドロゲル(ポリビニルアルコール、シリカゲルなど)、ナイロンなどであり得る。
機能化(Functionalization)は、試料分子に対する特異的な生物学的認識が可能なバイオプローブ分子の結合による、トランスデューサーの表面の修飾を意図する。生物学的認識は、バイオプローブ分子が試料分子へ特異的に結合する能力、または、バイオプローブ分子が試料分子を触媒作用によって変換する能力である。
官能基は、分子内の原子のうちの特定の群を意図しており、これらの原子は、これら分子の化学反応の特性に関与する。同じ官能基は、当該官能基を部分として含む分子の大きさにかかわらず、同じまたは類似の化学反応を生じる。しかしながら、上記官能基の相対的な反応性は、近隣の官能基によって変更され得る。
活性化とは、対応する化学的条件および物理的条件を形成することによって、官能基が互いに相互作用できる工程である。例えば、カルボキシル基およびアミノ基は、互いに結合し得る。しかしながら、結合するためには、(i)カルボジイミドが存在すること、および、(ii)媒体(medium)が特定のpHであること、の両方が必要である。それ故に、これらの条件の何れか1つが欠けている条件では、カルボキシル基は、アミノ基に結合できるようには活性化されない。カルボジイミドが存在するとともに媒体が特定のpHである場合にのみ、カルボキシル基が活性化される。幾つかの官能基は、第2の官能基へ結合するために、更なる化学的成分を必要としない。例えば、アルデヒド基は、更なる化学的成分を何一つ加えることなく、アミノ基へ結合することができる。しかしながら、ほとんどの場合、結合できるように官能基を活性化させるために、上記媒体のpHは、幾つかの特定の値に調節される必要がある。
機能分子(functional molecule)とは、対応する官能基を有する別の分子へ結合し得る官能基を含む分子である。
図2は、図1A、図1B、図1Cまたは図1Dの機能化されたトランスデューサーと、生物学的な成分200との相互作用を示す概略図である。官能基Xによってトランスデューサー102の表面が予め修飾された後、次いで、当該官能基Xが生物学的な成分200の官能基Zと相互作用することによって、X−Z結合またはX−Z複合体が形成される。上記官能基Zは、(i)上記生物学的な成分である分子の一部分として、元々存在するもの(タンパク質のアミノ基およびカルボキシル基);(ii)化学的/生物学的な修飾を介して、上記生物学的な成分である分子へ導入されるもの(タンパク質へ結合されたオリゴヌクレオチドタグ);または、(iii)上記生物学的な成分を化学的に合成する幾つかの工程において上記分子内へ導入されるもの(合成オリゴヌクレオチドのアミノ基)、であり得る。上記官能基Zは、アミノ、カルボキシル、アルデヒド、オキシ、チオール、ビオチン、オリゴヌクレオチド、ペプチドまたはストレプトアビジンなどであり得る。
化学結合または複合体の形成の何れかに帰着する官能基の相互作用は、反応媒体(reaction medium)のpHに依存する。例えば、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)は、相対的に狭い低pH(例えば3.5〜4.5)にて、カルボキシル基と反応し得る(Nakajima N, Ikada Y, Bioconjug Chem., Mechanism of amide formation by carbodiimide for bioconjugation in aqueous media, 1995 Jan-Feb;6(1):123-30)。高いpH値では、EDCによるカルボキシル基の活性化は起こらない。それ故に、カルボキシル基とアミノ基との間の相互作用は、N−C結合を形成するために、特定のpHの反応媒体中にて行われる必要がある。例えば、図3Bに記載されている固定化工程は、狭いpHの領域内でのみ行われる。オリゴヌクレオチドタグのハイブリダイゼーションに基づいた生物学的な成分の固定化(図4)はまた、反応媒体のpHに対して非常に敏感である。中性よりも若干高い値のpHでさえ、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは起こらない。更に、オリゴヌクレオチドタグのハイブリダイゼーションに基づいた生物学的な成分の固定化は、可逆的な工程である。pHが高ければ、オリゴヌクレオチドの2重へリックスの水素結合が変性して、固定化された複合体の解離が生じる。それ故に、反応媒体のpHは、好適または限定的(favorable or restricting)の何れかであり得、トランスデューサーの表面上における生物学的な成分の固定化は、トランスデューサーの表面の近傍のpHを操作することによって調節され得る。
図9Aおよび図9Bへ戻ると、対極806およびpH形成電極900が、上記pH形成電極へ電圧を供給することができる外部電圧源902へ連結されていることが観察され得る。上記対極が、回路を完成させるために用いられている。幾つかの場合には、上記トランスデューサー自体がpH形成電極として用いられ得(図9B)、当該トランスデューサーの表面は導電性であり、当該導電性の適用は、生化学的なトランスデューサーの機能化を妨げない。上記pH形成電極900へカソードの電圧(cathodic voltage)が与えられる場合には、下記反応1にしたがって、周囲の媒体のpHが増加する。つまり、
2H2O+2e→H2+2OH− 反応1
アノードの電圧(anodic voltage)は、下記反応2にしたがって、プロトンを生成する。つまり、
2H2O−4e→4H++O2 反応2。
Claims (14)
- トランスデューサーマイクロアレイを選択的に機能化させるための方法であって、
共通した環境へ露出された複数のトランスデューサーの領域を含むマイクロアレイを設ける工程と、
上記複数のトランスデューサーのpHに、第1の差異を形成する工程と、
上記複数のトランスデューサーのpHに応じて、当該複数のトランスデューサーに対して、第1の機能分子を選択的に結合させる工程と、を含み、
上記複数のトランスデューサーに対して、第1の機能分子を選択的に結合させる工程は、上記複数のトランスデューサーのpHに応じて、上記第1の機能分子とトランスデューサーの表面との間の結合を解離する工程を含む方法。 - 上記マイクロアレイを設ける工程は、各トランスデューサーに対応したpH形成電極、および、対極を設ける工程を含み、
上記複数のトランスデューサーのpHに、第1の差異を形成する工程は、上記pH形成電極と上記対極との間に、選択的に電位を与える工程と、上記複数のトランスデューサーに隣接した領域内に、pHの差異を形成する工程とを含む、請求項1に記載の方法。 - 上記環境へ上記第1の機能分子を導入する工程を更に含み、
上記複数のトランスデューサーのpHに、第1の差異を形成する工程は、第2のトランスデューサーのpHを維持しながら、第1のトランスデューサーのpHを変更する工程を含み、
上記複数のトランスデューサーに対して、第1の機能分子を選択的に結合させる工程は、上記環境に由来する上記第1の機能分子を、上記第2のトランスデューサーへ結合させるが、上記第1のトランスデューサーへは結合させない工程を含む、請求項1に記載の方法。 - 上記複数のトランスデューサーに対して、第1の機能分子を選択的に結合させる工程は、上記第1の機能分子を第1のトランスデューサーおよび第2のトランスデューサーへ選択的に結合させる工程を含み、
上記方法は、更に、
上記環境へ第2の機能分子を導入する工程と、
上記第1のトランスデューサーのpHと上記第2のトランスデューサーのpHとの間に第2の差異を形成する工程と、
上記第1のトランスデューサーのpHに応じて、上記第1のトランスデューサー上で、上記第1の機能分子に対して上記第2の機能分子を選択的に結合させる工程とを含む、請求項1に記載の方法。 - 上記複数のトランスデューサーの領域を含むマイクロアレイを設ける工程は、結合した第2の分子を各々有する、第1のトランスデューサーおよび第2のトランスデューサーを設ける工程を含み、
上記方法は、更に、上記環境へ第3の分子を導入する工程を含み、
上記複数のトランスデューサーのpHに、第1の差異を形成する工程は、上記第1のトランスデューサーのpHと上記第2のトランスデューサーのpHとの間に差異を形成する工程を含み、
上記複数のトランスデューサーに対して、第1の機能分子を選択的に結合させる工程は、第3の分子によって上記第2の分子を活性化させて、上記第1のトランスデューサーに結合した上記第1の機能分子を選択的に形成する工程を含む、請求項1に記載の方法。 - 上記複数のトランスデューサーに対して、第1の機能分子を選択的に結合させる工程は、オリゴヌクレオチド、DNA、RNA、DNA断片、RNA断片、ペプチド、レセプター、抗体、酵素、全細胞、細胞断片、ビオチンおよびストレプトアビジンからなる群から選択される第1の機能分子を選択的に結合させる工程含む、請求項1に記載の方法。
- 上記マイクロアレイを設ける工程は、トランスデューサーの領域を設ける工程を含み、
上記各トランスデューサーは、隣接するpH形成電極と対応している、請求項2に記載の方法。 - 上記複数のトランスデューサーの領域を含むマイクロアレイを設ける工程は、各々が第2の分子と結合している、第1のトランスデューサーおよび第2のトランスデューサーを設ける工程を含み、
上記方法は、更に、上記環境へ上記第1の機能分子を導入する工程を含み、
上記複数のトランスデューサーのpHに、第1の差異を形成する工程は、上記第1のトランスデューサーのpHと上記第2のトランスデューサーのpHとの間に差異を形成する工程を含み、
上記複数のトランスデューサーに対して、上記第1の機能分子を選択的に結合させる工程は、上記第2の分子を選択的に修飾して、上記第1のトランスデューサーおよび上記第2のトランスデューサーからなる群から選択される1つのトランスデューサー上で、上記第1の機能分子と修飾された上記第2の機能分子とを結合させる工程を含む、請求項1に記載の方法。 - トランスデューサーマイクロアレイを選択的に機能化させるためのシステムであって、
各トランスデューサーに隣接した対応するpH形成電極を有する複数のトランスデューサーの領域、および、対極を含むマイクロアレイと、
上記複数のトランスデューサーの領域に共通した環境を提供するための空洞を有する液体チェンバーと、
上記液体チェンバーへ選択的に液体を供給するための液体デマルチプレクサーと、
上記マイクロアレイへ接続されて、上記対極と、選択されたトランスデューサーの上記pH形成電極との間に電位を形成する電圧マルチプレクサーと、を含み、
上記複数のトランスデューサーへ選択的に機能分子を結合させるために、上記複数のトランスデューサーに隣接する領域内のpHに応じて、上記複数のトランスデューサーのpHに差異が形成され、
上記電圧デマルチプレクサーは、上記複数のトランスデューサーのpHに応じて、トランスデューサーの表面へ結合した機能分子の間の結合を解離する、システム。 - 上記液体マルチプレクサーは、上記液体チェンバーへ第1の機能分子を導入し、
上記電圧デマルチプレクサーは、第2のトランスデューサーのpHを維持しながら、第1のトランスデューサーのpHを変更して、これによって、上記液体チェンバー内の上記第1の機能分子を、上記第2のトランスデューサーへ結合させるが、上記第1のトランスデューサーへは結合させない、請求項9に記載のシステム。 - 上記トランスデューサーの領域は、第1の機能分子と結合している第1のトランスデューサーと、第1の機能分子と結合している第2のトランスデューサーとを含み、
上記液体マルチプレクサーは、上記液体チェンバーの環境へ、第2の機能分子を導入し、
上記電圧デマルチプレクサーは、上記第1のトランスデューサーのpHと上記第2のトランスデューサーのpHとの間に差異を形成して、上記第1のトランスデューサー上で、上記第1の機能分子へ上記第2の機能分子を選択的に結合させる、請求項9に記載のシステム。 - 上記トランスデューサーの領域は、第2の分子と結合している第1のトランスデューサーと、第2の分子と結合している第2のトランスデューサーとを含み、
上記液体マルチプレクサーは、上記液体チェンバーへ、第3の分子を導入し、
上記電圧デマルチプレクサーは、上記第1のトランスデューサーのpHと上記第2のトランスデューサーのpHとの間に差異を形成し、上記第3の分子によって上記第2の分子を選択的に活性化させて、上記第1のトランスデューサーに結合した第1の機能分子を形成する、請求項9に記載のシステム。 - 上記複数のトランスデューサーは、オリゴヌクレオチド、DNA、RNA、DNA断片、RNA断片、ペプチド、レセプター、抗体、酵素、全細胞、細胞断片、ビオチンおよびストレプトアビジンからなる群から選択される機能分子に結合している、請求項9に記載のシステム。
- 上記トランスデューサーの領域は、第2の分子と結合している第1のトランスデューサーと、第2の分子と結合している第2のトランスデューサーとを含み、
上記液体マルチプレクサーは、上記液体チェンバーへ、第1の機能分子を導入し、
上記電圧デマルチプレクサーは、上記第1のトランスデューサーのpHと上記第2のトランスデューサーのpHとの間に差異を形成して、上記第2の分子を選択的に修飾するとともに、上記第1のトランスデューサー上で、上記修飾された第2の機能分子へ上記第1の機能分子を結合させる、請求項9に記載のシステム。
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