CN103159854B - 抗体与微珠连接方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗体与微珠连接方法，包括抗体与核苷酸交联，核苷酸与微珠结合，核苷酸互补链杂交等流程。抗体与核苷酸交联包括抗体的修饰与脱盐、核苷酸的修饰与脱盐、修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化等步骤。本发明是以双功能基团为核苷酸和抗体作修饰，通过醛基与氨基使其结合形成腙键结合。在本发明中，核苷酸与微珠的结合是由微珠上包被的亲和素与核苷酸链上修饰的生物素特异性吸附完成的；核苷酸互补链杂交通过特定的杂交液在一定温度条件下完成；通过Cy3标记的二抗等在特定温度条件下孵育鉴定微珠上反应是否成功。本发明以寡核苷酸作为“支撑臂”，将抗体与磁珠表面隔开一定距离，有利于避免抗体遭结构破坏，保护抗体活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗体与微珠连接方法。
背景技术
自1979年将聚苯乙烯微珠成功磁化并与抗体连接后，即成为一种效果极佳的分离方法，引发了生物分离技术上的一次革命。该方法具有以下优点：（1）分离速度快、效率高、可重复性好；（2）操作简单、不需要昂贵的仪器设备；（3）比表面积大，可提高检测灵敏度；（4）不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能。
随着科学技术的发展以及纳米技术的推广，纳米材料已在生命科学研究领域发挥了重要作用。磁性纳米微珠作为一种新型的纳米技术，已经成功应用于核酸提取、废水处理、靶向药物、食品安全检测等系统上，并取得一定的进展。包被技术的进步能大大扩展磁性微珠的应用范围。因此，研究微珠表面的连接技术与方法，将使其运用至更广阔的分离、检测领域，并将极大地提高检测灵敏度。
食品安全事关广大人民群众的身体健康，受到政府和老百姓的高度关注。近年来食品质量问题十分突出，非法使用违禁药物、滥用抗生素，超量超范围使用兽药等都对群众身体健康造成了很大危害。针对以上问题，一方面要加强监管；另一方面要开发特异性的快速分离、检测方法。对磁性微珠表面包被特异性的抗体将是一种较为简便且高效的检测方面。包被方法多样，较为常用的是将抗体直接通过基团作用固定至微珠表面。然而此种方法灵敏度有限，抗体在微珠上的非特异性吸附将大大降低其检测效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能提高检测灵敏度的抗体与微珠连接方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗体与微珠连接方法，包括以下步骤：
1）、抗体与核苷酸交联：
A、抗体的修饰与脱盐：
25～100μg免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称IgG）稀释成浓度为2～8mg/mL后与SANH（Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone）均匀混合后，于20～30℃的摇床中孵育修饰2～6小时，SANH与免疫球蛋白的摩尔比为10～70：1；
将所得的抗体修饰产物经洗涤、离心过滤，以除去多余的SANH；得脱盐后的抗体修饰产物；测IgG的蛋白浓度，待用（目的是：计算修饰、脱盐步骤后抗体的回收率，避免因为超滤膜或操作问题导致样品过分损失。）
B、核苷酸的修饰与脱盐：
用pH7.0～7.6的磷酸缓冲液将核苷酸（寡核苷酸）稀释至6～12mg/mL，加入SFB（Succinimidyl 4-formylbenzoate）均匀混合，于20～30℃的摇床中孵育修饰2～6小时，SFB与核苷酸（寡核苷酸）的摩尔比为10～70：1；
备注说明：上述核苷酸序列为GGGAA ATCTC TGCAG GCAAA TGTGA（5’～3’），3’端修饰了氨基；
将所得的核苷酸修饰产物经洗涤、离心、过滤，以除去多余的SFB；得脱盐后的核苷酸修饰产物；测核苷酸浓度，待用（目的是计算修饰、脱盐步骤后寡聚核苷酸的回收率，避免因为超滤膜或操作问题导致样品过分损失。）
C、修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化
将脱盐后的抗体修饰产物（为修饰成功的脱盐后的抗体修饰产物）和脱盐后的核苷酸修饰产物（为修饰成功的脱盐后的核苷酸修饰产物）按照1:8～12的摩尔比均匀混合，于2～8℃充分反应8～24小时，
将所得的交联后产物经洗涤、离心、过滤，除去游离寡核苷酸并进行脱盐；得纯化后的抗体—核苷酸交联体；
在350nm下测定吸光值，待用（抗体和寡核苷酸的修饰基团在交联的过程中生成稳定存在的腙键，该腙键在350nm下有特异吸收峰；因此测定350nm是否有明显吸收峰生成是验证交联成功的有力证明；通过测定350nm下特异吸收峰值，可进一步计算出交联产物的浓度）；
2）、抗体—核苷酸交联体与微珠作用：
微珠先经洗涤液洗涤，然后静置；
将1～9×10-11mol biotin修饰的核苷酸（序列为TCACA TTTGC CTGCA GAGATTTCCC5’～3’,3’biotin修饰）加入5～15μl的Neutravidin包被的磁珠，于20～30℃的摇床孵育10～30分钟，接着用洗涤液洗涤；随后加入上述5～10×10-13mol纯化后的抗体—核苷酸交联体，在6×SSPE缓冲液（pH6.0）条件下于20～30℃的摇床孵育1～4小时，再用洗涤液洗涤；得微珠体系；
所述洗涤液为将BSA用PBS溶液（pH7.4）稀释至质量浓度为0.1～0.5%而得。
备注说明：
步骤A所得的脱盐后的抗体修饰产物和步骤B所得的脱盐后的核苷酸修饰产物分别通过对硝基苯甲醛与2-肼吡啶二盐酸盐鉴定基团修饰是否成功；方法为各取少量脱盐后的抗体修饰产物或脱盐后的核苷酸修饰产物，分别加入过量对硝基苯甲醛、2-肼吡啶二盐酸盐，避光孵育后，测定产物基团在特定波长下的吸光值。当抗体鉴定产物在390nm下有特异吸收峰，则判定修饰成功；当寡核苷酸鉴定产物在350nm下有特异吸收峰，则判定为修饰成功。
作为本发明的抗体与微珠连接方法的改进：
将所得的微珠体系进行如下步骤：
在Cy3标记的荧光二抗或转基因蛋白中加入微珠体系，在20～30℃条件下摇床孵育1～4小时；接着用PBS（pH7.4）洗去未结合的荧光二抗或转基因蛋白，最后用荧光显微镜观察结果。
备注说明：在荧光显微镜下观察到荧光信号，则证明抗体已成功通过寡核苷酸的“联系”连接到了磁珠的表面。
作为本发明的抗体与微珠连接方法的进一步改进：
Cy3标记的荧光二抗与PBS缓冲液（pH7.4）的体积比为：1:10～30。
作为本发明的抗体与微珠连接方法的进一步改进：
步骤1）A中：摇床的转速为50～150转/分；用pH8的0.1mM的EDTA溶液进行洗涤；
步骤1）B中：摇床的转速为50～150转/分；用pH8的0.1mM的EDTA溶液洗涤；
步骤1）C中：将所得的交联后产物用pH8的0.1mM的EDTA溶液洗涤。
在步骤1）的A中：
孵育完后收集修饰产物，将产物移入密理博的YM-100（截留分子量大于10000KDa的生物分子）滤管里面，用pH8的0.1mM的EDTA溶液洗涤、离心过滤2～4次，除去多余的SANH修饰剂，然后倒扣滤管离心，收集脱盐后的修饰产物。测IgG的蛋白浓度，待用。
在步骤1）的B中：
孵育完后收集修饰产物，将产物移入密理博的YM-3（截留分子量大于3000KDa的生物分子）滤管里面，用pH8的0.1mM的EDTA溶液洗涤、离心过滤2～4次，除去多余的SFB修饰剂，然后倒扣滤管离心，收集脱盐后的核苷酸修饰产物。测核苷酸浓度，待用。
在步骤1）的C中：
由于交联后产物需要再次纯化，交联完后收集交联后产物，将产物移入密理博的YM-100（截留分子量大于10000KDa的生物分子）滤管里面，用pH8的0.1mM EDTA溶液洗涤、离心过滤2～4次，除去未交联的多余的核苷酸单体，然后倒扣滤管离心，收集纯化后交联产物。在350nm下测定吸光值，待用。
在本发明中，任意一种抗体均可被固定到微珠上；与抗体交联的寡核苷酸长度一般在20-23个碱基，3’端修饰氨基，从而能够通过本发明所述的方法与抗体交联。选用的磁珠预先包被了抗生物素蛋白；与磁珠表面连接的寡核苷酸必须与抗体交联的寡核苷酸对应互补，并在3’端修饰有生物素，从而能够如本发明的方法与磁珠表面连接。
具体而言，本发明开发了一种新型的抗体与微珠相连的方法，成功的对抗体与核苷酸进行交联，并保持其良好活性。本发明的连接方法是将带有生物素（biotion）的互补核苷酸链与包被有亲和素（Neutravidin）微珠连接后，通过两条核苷酸链杂交的方式，将抗体-核苷酸交联体连接到微珠表面来完成抗体与微珠的相连，最后以Cy3标记的二抗鉴定是否连接成功。具体原理如图1所示。
本发明的抗体与微珠交联方法：包括抗体与核苷酸交联，核苷酸与微珠结合，核苷酸互补链杂交等流程。抗体与核苷酸交联包括抗体的修饰与脱盐、核苷酸的修饰与脱盐、修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化等步骤。本发明是以双功能基团为核苷酸和抗体作修饰，通过醛基与氨基使其结合形成腙键结合。在本发明中，核苷酸与微珠的结合是由微珠上包被的亲和素与核苷酸链上修饰的生物素特异性吸附完成的；核苷酸互补链杂交通过特定的杂交液在一定温度条件下完成；通过Cy3标记的二抗在特定温度条件下孵育鉴定微珠上反应是否成功。
本发明的抗体与微珠连接方法，具有如下优点：
1、寡核苷酸作为“支撑臂”，将抗体与磁珠表面隔开一定距离，有利于避免抗体遭结构破坏，保护抗体活性。
2解决了抗体固定于固相载体时的活性基团衍向问题。
3、提高抗体与其他物质反应的灵活性。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为抗体与微珠交联方法原理图。
图2为抗体与微珠成功交联后荧光二抗鉴定图像。
具体实施方式
实施例1、兔免疫球蛋白(IgG)与磁珠的连接：
1）、兔免疫球蛋白(IgG)与核苷酸交联
A、兔免疫球蛋白(IgG)的修饰与脱盐
将50μg的兔免疫球蛋白（Rabbit Immunoglobulin，简称Rabbit IgG）用修饰缓冲液（100mM磷酸盐、150mM氯化钠，pH7.2-7.4）稀释成浓度为6mg/mL；然后用SANH溶液（浓度为6.89×10-2mol/L）修饰，SANH与Rabbit IgG的摩尔比为60：1。将SANH溶液与Rabbit IgG溶液均匀混合后，放置于25℃的摇床中，以100转/分钟的转速孵育修饰4小时。孵育完后将产物移入密理博的YM-100滤管里面，用pH8的0.1mM EDTA溶液洗涤、离心（5000转/分）过滤3次，以除去多余的SANH修饰剂，然后倒扣滤管离心（5000转/分），收集脱盐后的抗体修饰产物。测Rabbit IgG的蛋白浓度为2.44mg/mL，待用。
将以上步骤所得的脱盐后的抗体修饰产物取少量，通过与对硝基苯甲醛(4-nitrobenzaldehyde)反应鉴定基团修饰是否成功（反应如下）；
操作步骤：
（1）设置反应组和对照组，在反应组中取1μL修饰后抗体溶液，加入5μL4-nitrobenzaldehyde（0.5mM）混合；对照组中取1μL空白修饰缓冲液，加入5μL4-nitrobenzaldehyde（0.5mM）混合，将两组均置于37℃，避光，反应30min。
（2）用Nanodrop进行UV测定，以对照组作为“blank”后，测定反应组的UV吸收光谱，得到390nm处吸收峰。如有特异吸收峰出现，可判定为修饰成功。若没有特异吸收峰，则无法判定是否修饰成功，需要重新优化修饰方法。但在对某种特定的抗体样品（Rabbit IgG等）修饰方法已经成熟且可重复操作时，为节省样品可省略鉴定的步骤。
备注说明：SANH，Succinimidyl4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone，即，琥珀酰亚胺基4-肼基烟酸盐丙酮腙。购自美国SoluLink公司S-HyNic（SANH）Kit货号(S-9002-2)。产品原为粉末状，用DMF（N,N-Dimethylformamide，N-甲酰二甲胺）溶剂溶解为溶液。
B、核苷酸的修饰与脱盐
核苷酸序列为GGGAA ATCTC TGCAG GCAAA TGTGA（5’～3’），3’端修饰了氨基。用pH7.4的PBS将核苷酸稀释至10mg/mL，然后用SFB溶液（浓度为8.094×10-2mM）修饰。SFB与核苷酸之间的摩尔比为60：1。将SFB溶液与核苷酸溶液均匀混合后，放置于25℃的摇床中，以100转/分钟的转速孵育修饰4小时。孵育完将产物移入密理博的YM-3滤管里，用pH8的0.1mM EDTA溶液洗涤、离心（13000转/分）过滤3次，以除去多余的SFB修饰剂，然后倒扣滤管离心（13000转/分），收集脱盐后的核苷酸修饰产物，测得核苷酸的浓度为3-4ug/Ul3.42ug/uL；待用。
将上述步骤所得的脱盐后的核苷酸修饰产物通过与2-肼吡啶二盐酸盐（2-hydrazinopyridine）鉴定基团修饰是否成功（反应如下）；
操作步骤：
（1）设置反应组和对照组，在反应组中取1μL修饰后寡核苷酸溶液，加入5μL2-hydrazinopyridine（0.5mM）混合；对照组中取1μL空白修饰缓冲液，加入5μL2-hydrazinopyridine（0.5mM）混合，将两组均置于37℃，避光，反应30min。
（2）用Nanodrop进行UV测定，以对照组作为“blank”后，测定反应组的UV吸收光谱，得到350nm处吸收峰。如有特异吸收峰出现，可判定为修饰成功。
备注说明：SFB：Succinimidyl 4-formylbenzoate，即琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯。购自美国SoluLink公司S-HyNic（SANH）Kit货号(S-9002-2)。产品原为粉末状，用DMF（N,N-Dimethylformamide，N-甲酰二甲胺）溶剂溶解为溶液。
C、修饰后兔免疫球蛋白(IgG)与核苷酸的交联与纯化
将经脱盐后并鉴定修饰成功的抗体（即经判定修饰成功的脱盐后的抗体修饰产物）与寡核苷酸（经判定修饰成功的脱盐后的核苷酸修饰产物）以1:10摩尔比均匀混合，放置4℃下充分反应12小时。其形成的基团在350nm波长下有明显的吸收峰，测得OD350=0.083，证明交联成功。
交联后产物需要再次纯化，将其移入密理博的YM-100滤管里面，用pH8的0.1mMEDTA溶液洗涤、离心（5000转/分）过滤3次，以除去未交联的多余的核苷酸单体，倒扣滤管离心（5000转/分）收集。产物在350nm下测定吸光值，得到纯化后的交联产物浓度，在损失较少且体系体积保持一致的情况下，纯化后的交联体浓度与纯化前的大致相同，或稍偏低（在本实施例中为1.28mg/mL）。
2）、抗体—核苷酸交联体与微珠作用：
A、微珠与互补核苷酸的连接
将BSA用PBS溶液（pH7.4）稀释至质量浓度为0.1～0.5%；以此为洗涤液对Neutravidin包被微珠进行洗涤（共3次），静置20分钟。将2×10-11mol biotin修饰的核苷酸（序列为TCACA TTTGC CTGCA GAGAT TTCCC5’～3’,3’biotin修饰）加入5μl Neutravidin包被的磁珠，25℃摇床孵育15分钟，用上述洗涤液洗涤3次，得到核苷酸包被的磁珠。
备注：微珠可通过市购的形式获得，例如可购自BioQ Technologies公司的UniQ磁珠，包被Neutravidin，直径300nm。
B、抗体—核苷酸交联体与微珠的连接
取抗体-核苷酸交联体约0.1μl（即8.5×10-13mol的步骤1所得的纯化后交联产物）加入上述核苷酸包被的磁珠，在6×SSPE缓冲液（pH6.0）条件下摇床孵育2小时（25℃），用上述洗涤液洗涤3次。
实验1、磁珠表面连接抗体对Cy3荧光标记二抗的捕获
将1μl Cy3荧光标记二抗以PBS（pH7.4）1：20稀释，然后加入微珠体系（即上述步骤“抗体—核苷酸交联体与微珠作用”所得的产物），在25℃条件下摇床孵育2小时。然后用PBS（pH7.4）洗涤，目的是为了洗去未结合的荧光二抗。最后用荧光显微镜观察结果，证实微珠表面的抗体成功捕获二抗。如图2所示：
在510-560激发波长下用荧光显微镜(Nikon,Inc)观察，视野中均匀分布有星点状的亮点。此结果证明抗体成功连接到磁珠表面，且能够捕获Cy3荧光标记二抗。
实施例2转基因Cry1Ac蛋白单克隆抗体与磁珠表面的连接
1）、转基因Cry1Ac蛋白单克隆抗体与核苷酸交联
A、抗体的修饰与脱盐
取50μg的转基因Cry1Ac蛋白单克隆抗体（杭州宜康公司制备），将浓度调整为4mg/mL。将SANH粉末（Succinimidyl4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone，即，琥珀酰亚胺基4-肼基烟酸盐丙酮腙。购自美国SoluLink公司S-HyNic（SANH）Kit货号(S-9002-2)）用DMF（N,N-Dimethylformamide，N-甲酰二甲胺）溶剂溶解为溶液（浓度为6.89×10-2mol/L）修饰。取抗体60倍摩尔量的SANH溶液与抗体溶液混合，放置于25℃的摇床中，以100转/分钟的转速孵育修饰4小时。孵育完后将产物移入密理博的YM-100滤管里面，用pH8的0.1mM EDTA溶液洗涤、离心（5000转/分）过滤3次，以除去多余的SANH修饰剂，然后倒扣滤管离心（5000转/分），收集脱盐后的抗体修饰产物，约为20μL。测抗体浓度为2.68mg/mL，待用。
B、核苷酸的修饰与脱盐
核苷酸序列为GGGAA ATCTC TGCAG GCAAA TGTGA（5’～3’），3’端修饰了氨基。用pH7.4的PBS将核苷酸稀释至10mg/mL。将SFB粉末（Succinimidyl 4-formylbenzoate，即琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯。购自美国SoluLink公司S-HyNic（SANH）Kit货号(S-9002-2)）用DMF（N,N-Dimethylformamide，N-甲酰二甲胺）溶剂溶解为溶液，使浓度为8.094×10-2mM。SFB与核苷酸之间的摩尔比为60：1。将SFB溶液与核苷酸溶液均匀混合后，放置于25℃的摇床中，以100转/分钟的转速孵育修饰4小时。孵育完将产物移入密理博的YM-3滤管里，用pH8的0.1mM EDTA溶液洗涤、离心（13000转/分）过滤3次，以除去多余的SFB修饰剂，然后倒扣滤管离心（13000转/分），收集脱盐后的核苷酸修饰产物，测得核苷酸的浓度为3.52ug/uL；待用。
C、修饰后转基因Cry1Ac蛋白单克隆抗体与核苷酸的交联与纯化
将经脱盐后并鉴定修饰成功的抗体（即经判定修饰成功的脱盐后的抗体修饰产物）与寡核苷酸（经判定修饰成功的脱盐后的核苷酸修饰产物）以1:10摩尔比均匀混合，放置4℃下充分反应12小时。其形成的基团在350nm波长下有明显的吸收峰，测得OD350=0.083，证明交联成功。
交联后产物需要再次纯化，将其移入密理博的YM-100滤管里面，用pH8的0.1mMEDTA溶液洗涤、离心（5000转/分）过滤3次，以除去未交联的多余的核苷酸单体，倒扣滤管离心（5000转/分）收集。产物在350nm下测定吸光值，得到纯化后的交联产物浓度，在损失较少且体系体积保持一致的情况下，纯化后的交联体浓度与纯化前的大致相同，或稍偏低（在本实施例中为1.46mg/mL）。
2）、抗体—核苷酸交联体与微珠作用：
A、微珠与互补核苷酸的连接
将BSA用PBS溶液（pH7.4）稀释至质量浓度为0.1～0.5%；以此为洗涤液对Neutravidin包被微珠进行洗涤（共3次），静置20分钟。将2×10-11mol biotin修饰的核苷酸（序列为TCACA TTTGC CTGCA GAGAT TTCCC5’～3’,3’biotin修饰）加入5μl Neutravidin包被的磁珠，25℃摇床孵育15分钟，用上述洗涤液洗涤3次，得到核苷酸包被的磁珠。
B、抗体—核苷酸交联体与微珠的连接
取抗体—核苷酸交联体0.1μl（即8.5×10-13mol的步骤1所得的纯化后交联产物）加入上述核苷酸包被的磁珠中，在6×SSPE缓冲液（pH6.0）条件下摇床（25℃）孵育2小时，用上述洗涤液洗涤3次。
实验2、磁珠表面抗体对转基因蛋白Cry1Ac的检测
1）对转基因水稻进行转基因蛋白提取。
将转基因检测样品经蛋白提取和纯化后得到样品检测液。蛋白提取和纯化为公知技术，可参考发表于《浙江大学学报（农业与生命科学版）》2001年02期的《从转基因水稻中提取Bt毒蛋白的方法与效率》。
2）磁珠对转基因蛋白的捕获
将转基因蛋白溶液加入微珠体系（即上述步骤得到的磁珠-抗体连接物），在25℃条件下摇床孵育1小时。然后用PBS（pH7.4）洗涤，目的是为了洗去未结合的转基因蛋白。
3）对转基因蛋白的检测
将生物素标记的Cry1Ac兔多克隆抗体（兔多克隆抗体由杭州宜康公司制备，生物素标记由上海友科生物公司制备），加入磁珠体系，在25℃条件下摇床孵育1小时。然后用PBS（pH7.4）洗涤，目的是为了洗去未结合的生物素标记Cry1Ac兔多克隆抗体。将Cy3标记的链霉亲和素加入磁珠体系，在25℃条件下摇床孵育30min，用PBS（pH7.4）洗涤，目的是为了洗去未结合的Cy3标记的链霉亲和素。
在510-560激发波长下用荧光显微镜(Nikon,Inc)观察，视野中均匀分布有星点状的亮点。此结果证明磁珠表面能够成功检测转基因蛋白。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.抗体与微珠连接方法，其特征是包括以下步骤：
1)、抗体与核苷酸交联：
A、抗体的修饰与脱盐：
50μg免疫球蛋白稀释成浓度为6mg/mL后与SANH均匀混合后，于25℃的摇床中孵育修饰4小时，SANH与免疫球蛋白的摩尔比为60：1；
将所得的抗体修饰产物经洗涤、离心过滤，以除去多余的SANH；得脱盐后的抗体修饰产物；
B、核苷酸的修饰与脱盐：
用pH 7.4的磷酸缓冲液将核苷酸稀释至10mg/mL，加入SFB均匀混合，于25℃的摇床中孵育修饰4小时，SFB与核苷酸的摩尔比为60：1；
核苷酸序列为GGGAA ATCTC TGCAG GCAAA TGTGA(5’～3’)，3’端修饰了氨基；
将所得的核苷酸修饰产物经洗涤、离心、过滤，以除去多余的SFB；得脱盐后的核苷酸修饰产物；
C、修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化
将脱盐后的抗体修饰产物和脱盐后的核苷酸修饰产物按照1:10的摩尔比均匀混合，于4℃充分反应12小时，
将所得的交联后产物经洗涤、离心、过滤，除去游离寡核苷酸并进行脱盐；得纯化后的抗体—核苷酸交联体；
2)、抗体—核苷酸交联体与微珠作用：
微珠先经洗涤液洗涤，然后静置；
将2×10-11mol biotin修饰的核苷酸加入5μl的Neutravidin包被的磁珠，于25℃的摇床孵育15分钟，接着用洗涤液洗涤；随后加入上述8.5×10-13mol纯化后的抗体—核苷酸交联体，在pH 6.0的6×SSPE缓冲液条件下于25℃的摇床孵育2小时，再用洗涤液洗涤；得微珠体系；
所述核苷酸的序列为TCACA TTTGC CTGCA GAGAT TTCCC 5’～3’,3’biotin修饰；
所述洗涤液为将BSA用pH 7.4的PBS溶液稀释至质量浓度为0.1～0.5％而得。
2.根据权利要求1所述的抗体与微珠连接方法，其特征是：
将所得的微珠体系进行如下步骤：
在Cy3标记的荧光二抗或转基因蛋白中加入微珠体系，在20～30℃条件下摇床孵育1～4小时；接着用pH 7.4的PBS洗去未结合的荧光二抗或转基因蛋白，最后用荧光显微镜观察结果。
3.根据权利要求1或2所述的抗体与微珠连接方法，其特征是：
所述步骤1)A中：摇床的转速为50～150转/分；用pH 8的0.1mM的EDTA溶液进行洗涤；
所述步骤1)B中：摇床的转速为50～150转/分；用pH 8的0.1mM的EDTA溶液洗涤；
所述步骤1)C中：将所得的交联后产物用pH 8的0.1mM的EDTA溶液洗涤。
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