JP2019215174A

JP2019215174A - 免疫測定用粒子及び免疫測定方法

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Publication number: JP2019215174A
Application number: JP2018110984A
Authority: JP
Inventors: 田中　俊行; Toshiyuki Tanaka; 俊行田中
Original assignee: Tamagawa Seiki Co Ltd
Current assignee: Tamagawa Seiki Co Ltd
Priority date: 2018-06-11
Filing date: 2018-06-11
Publication date: 2019-12-19

Abstract

【課題】免疫測定用粒子が少ない場合であっても抗原量を定量することができる免疫測定用粒子及び免疫測定方法を提供する。【解決手段】磁性粒子２０と、磁性粒子２０の表面に結合された検出用抗体３０ａと、磁性粒子２０の表面に結合された酵素４０ａとを備える免疫測定用粒子１０ａであって、検出用抗体３０ａと酵素４０ａとの合計結合量に対し、検出用抗体３０ａの結合量の割合が４０〜６０質量％である免疫測定用粒子を作成する。【選択図】図２

Description

本発明は免疫測定用粒子及び免疫測定方法に関し、特に、酵素活性を用いる免疫測定用粒子及び免疫測定方法に関する。

マイクロプレート上において抗原に対して酵素標識された検出用抗体を反応させ、その後洗浄し、洗浄後にマイクロプレートに残る酵素活性を検出することで、検体中の抗原量を定量する酵素免疫測定法が一般に知られている。従来の酵素免疫測定法としては、例えば以下の非特許文献１及び非特許文献２に記載された酵素免疫測定法が知られている。非特許文献１及び非特許文献２に記載された酵素免疫測定法は、酵素標識された検出用抗体の代わりに、検出用抗体と酵素とが表面に結合された免疫測定用粒子を用いている。

ＫｕｒｔＧ．Ｉ．Ｎｉｌｓｓｏｎ、"ＪｏｕｒｎｏｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ"、（オランダ）、１９８９年９月、１２２巻、ｐ．２７３〜２７７ＬｉｌｉＣｈｅｎ、他４名、"ＳｅｎｓｏｒｓａｎｄＡｃｔｕａｔｏｒｓＢ"、（オランダ）、２０１１年１月、１５５巻、ｐ．５５７〜５６１

しかしながら、従来の酵素免疫測定法に用いている免疫測定用粒子では、粒子表面に結合反応させる際の検出用抗体及び酵素の量は非特許文献１に記載されているが、実際に粒子表面に結合されている検出用抗体及び酵素の量は明確ではなく、そのため免疫測定において最も酵素活性を得られる条件が明確ではないために、免疫測定用粒子が少ない場合に抗原量を定量しにくいという問題点があった。

この発明はこのような課題を解決するためになされたものであり、酵素免疫測定法において、免疫測定用粒子が少ない場合であっても抗原量を定量することができる免疫測定用粒子及び免疫測定方法を提供することを目的とする。

上記の課題を解決するために、この発明に係る免疫測定用粒子は、磁性粒子と、磁性粒子の表面に結合された検出用抗体と、磁性粒子の表面に結合された酵素とを備える免疫測定用粒子であって、検出用抗体と酵素との合計結合量に対し、検出用抗体の結合量の割合が４０〜６０質量％であり、また、検出用抗体と酵素との合計結合量に対し、検出用抗体の結合量の割合が４５〜５５質量％であり、また、酵素は、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼであり、また、粒子がシリカあるいはポリマーにより組成され、また、飽和磁化値が１０〜５０ｅｍｕ／ｇである。

また、この発明に係る免疫測定方法は、上記免疫測定用粒子を用い、また、免疫測定用粒子を磁気により誘導する。

本発明に係る免疫測定用粒子によれば、磁性粒子の表面に結合された検出用抗体と、磁性粒子の表面に結合された酵素とを備え、免疫測定において最も酵素活性を得られる検出用抗体と酵素との結合量の割合の条件が明確であるために、免疫測定用粒子が少ない場合であっても抗原量を定量することができる。

また、本発明に係る免疫測定方法によれば、前記免疫測定用粒子を用いることで、免疫測定用粒子が少ない場合であっても抗原量を定量することができる。

本発明の実施の形態に係る免疫測定用粒子の概略図である。本発明の実施の形態に係るＰＳＡ定量のための免疫測定用粒子の概略図である。図２に示す免疫測定用粒子と抗原とが混合した溶液を示す概略図である。図３に示す免疫測定用粒子と抗原とが結合した状態を示す概略図である。抗体固相化プレートに分注された図４に示す免疫測定用粒子を示す概略図である。図５に示す抗体固相化プレートに磁気捕集された免疫測定用粒子を示す概略図である。図６に示す抗体固相化プレート上で基質液を分注された免疫測定用粒子を示す概略図である。粒子サンプル毎の吸光度を示すグラフである。粒子サンプル３を使用した場合の、溶液中の抗原量に対する吸光度の関係を示したグラフである。

以下、この発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明する。
図１に、この実施の形態で用いられる免疫測定用粒子１０の構成を示す。免疫測定用粒子１０は、シリカにより組成された磁性粒子２０と、前記磁性粒子２０の表面に共に結合された検出用抗体３０及び酵素４０とから構成されている。

前記磁性粒子２０は、内部にフェライト粒子２１を有している。すなわち、磁性体を構成する前記フェライト粒子２１は、前記磁性粒子２０を組成するシリカにより被覆されて内包されている。また、前記フェライト粒子２１は、例えばマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、マグヘマイト（γ−Ｆｅ２Ｏ３）及びその中間体等で構成されている。また、前記フェライト粒子２１は、マグネタイトやマグヘマイト及びその中間体等のＦｅを一部置換して、Ｌｉ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ及びＺｎなどの各種元素を含有させることで、その特性を目的に応じて適正に制御した強磁性粒子であってもよい。いずれにせよ、前記フェライト粒子２１は、前記免疫測定用粒子１０が使用される温度で強磁性を有することが好ましい。そして、この前記フェライト粒子２１を有する前記磁性粒子２０の飽和磁化値は例えば１０〜５０ｅｍｕ／ｇであることが好ましい。なお、前記磁性粒子２０はシリカにより組成されたものに限定されず、例えばポリマーにより組成されていてもよい。

前記磁性粒子２０の表面に結合された前記検出用抗体３０は、特定の抗原に選択的に結合される任意の種類の検出用抗体を用いることができる。すなわち、前記検出用抗体３０はリガンドとして作用する。また、前記磁性粒子２０の表面に結合された前記酵素４０は、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨｏｒｓｅＲａｄｉｓｈＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＨＲＰ）等のペルオキシダーゼ、又はアルカリホスファターゼ等の、酵素免疫測定法において酵素反応により酵素基質を発色又は発光などをさせることのできる任意の種類の酵素を用いることができる。

次に、この実施の形態の前記免疫測定用粒子１０を用いた免疫測定方法について説明する。
この実施例においては、定量対象の抗原として前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を定量する。図２に示すように、免疫測定用粒子１０ａにおいて、検出用抗体３０ａをＰＳＡに選択的に結合可能な検出用抗体とし、酵素４０ａをＨＲＰとして前記免疫測定用粒子１０ａを作成する。なお、前記免疫測定用粒子１０ａの大きさが２００ｎｍとなるように作成する。なお、前記酵素４０ａはアルカリホスファターゼを用いてもよい。

このとき、前記免疫測定用粒子１０ａに結合された前記検出用抗体３０ａ及び酵素４０ａの合計結合量に対する、前記検出用抗体３０ａの結合量の割合をそれぞれ異なる値とした、免疫測定用粒子１０ａのサンプル１〜４を作成した。表１に、各サンプルにおける前記検出用抗体３０ａ及び酵素４０ａの合計結合量と、前記検出用抗体３０ａの結合量及び前記酵素４０ａの結合量を示す。各サンプルにおける、前記検出用抗体３０ａ及び酵素４０ａの合計結合量に対する前記検出用抗体３０ａの結合量の割合は、サンプル１は２７％、サンプル２は３２％、サンプル３は４８％、サンプル４は５８％である。なお、前記検出用抗体３０ａの結合量は、前記検出用抗体が結合した前記免疫測定用粒子１０ａを用いて免疫沈降法により過剰量の抗原を含む溶液から回収した抗原量から推定した。

次に、図３に示すように、前記免疫測定用粒子１０ａを分散させた溶液と、抗原５０ａとしてＰＳＡを含む溶液とを分注して５分間混合する。前記免疫測定用粒子１０ａと、定量対象の抗原５０ａとが混合することで、図４に示すように前記抗原５０ａが前記免疫測定用粒子１０ａの前記検出用抗体３０ａに結合する。次に、図５に示すように、ＰＳＡと選択的に結合可能な捕捉用抗体３１を表面に固相化した９６ウェル透明プレートである抗体固相化プレート６０に、前記免疫測定用粒子１０ａと抗原５０ａとが混合した液体を分注する。前記抗体固相化プレート６０は透明な素材で形成されたプレートであり、底部に前記抗原５０ａと結合可能な前記検出用抗体３０ａが固相化されて設けられている。なお、この実施の形態では前記抗体固相化プレート６０に、予め前記免疫測定用粒子１０ａと前記抗原５０ａとが混合した液体を分注したが、前記免疫測定用粒子１０ａを分散させた溶液と、前記抗原５０ａの溶液とを前記抗体固相化プレート６０に分注して、５分間混合してもよい。

次に、図６に示すように前記抗体固相化プレート６０のウェル底面下側から磁石６１を約１分間当て、前記免疫測定用粒子１０ａを前記９６ウェル透明プレート上に磁気捕集する。前記免疫測定用粒子１０ａの前記磁性粒子２０は前記フェライト粒子２１を内包しているため、前記免疫測定用粒子１０ａは前記磁石６１に吸引される。そして、前記免疫測定用粒子１０の前記検出用抗体３０ａに結合している前記抗原５０ａが、前記抗体固相化プレート６０の前記捕捉用抗体３１に結合する。すなわち、この磁気捕集の工程により、前記抗原５０ａと結合した前記免疫測定用粒子１０ａが、前記抗体固相化プレート６０に結合する。

次に前記抗体固相化プレート６０を洗浄し、前記抗体固相化プレート６０上の前記捕捉用抗体３１に結合しなかった前記免疫測定用粒子１０ａを除去した後に、図７に示すように基質液として、基質液成分７０を構成するテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加して数分間放置する。すると、前記９６ウェル透明プレートに結合した、前記免疫測定用粒子１０ａに結合している前記酵素４０ａであるＨＲＰの酵素活性による酸化作用により、前記基質液成分７０であるＴＭＢが反応し青色の化合物７１に変化して発色する。次に、停止液を前記抗体固相化プレート６０に添加して発色反応を停止させた後、例えばプレートリーダ等の分光器でこの青色の化合物７１を含む溶液の、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。この吸光度の測定結果に基づいて、溶液中における前記抗原５０ａの定量が行われる。

図８のグラフは、上記免疫測定方法において、溶液のＰＳＡ濃度を２０ｎｇ／ｍｌとして各サンプル１〜４の吸光度を定量した結果を比較したものである。サンプル３の前記免疫測定用粒子１０ａを用いる場合に、最も吸光度が高くなるという結果が得られた。すなわち、前記検出用抗体３０ａ及び酵素４０ａの合計結合量に対する前記検出用抗体３０ａの結合量の割合が４８％であって、合計結合量に対する前記酵素４０ａの結合量の割合が５２％であるサンプル３（表１参照）を用いたときに、最も吸光度が高くなった。したがって、前記免疫測定用粒子１０ａは前記検出用抗体３０ａ及び酵素４０ａの合計結合量に対する前記検出用抗体３０ａの結合量の割合は４０〜６０質量％であることが好ましく、また、４５〜５５質量％であることがさらに好ましい。

図９のグラフは、サンプル３の前記免疫測定用粒子１０を用いた上記免疫測定方法を実施した場合における、実施前の溶液のＰＳＡ濃度と、前記酵素４０ａと前記基質液成分７０との発色反応後の溶液の波長４５０ｎｍにおける吸光度との関係を示したものである。ＰＳＡ濃度と吸光度との間には正の相関関係があることがわかり、これにより発色反応後の溶液の吸光度を定量することで波長４５０ｎｍにおける吸光度からＰＳＡを定量することができる。

このように、前記磁性粒子２０と、前記磁性粒子２０の表面に結合された前記検出用抗体３０ａと、前記磁性粒子２０の表面に結合された前記酵素４０ａとを備える免疫測定用粒子１０ａであって、前記検出用抗体３０ａと前記酵素４０ａとの合計結合量に対し、前記検出用抗体３０ａの結合量の割合が４０〜６０質量％であるため、免疫測定において最も酵素活性を得られる検出用抗体と酵素との結合量の割合の条件が明確であり、免疫測定用粒子が少ない場合であっても抗原量を定量することができる。

また、前記検出用抗体３０ａと前記酵素４０ａとの合計結合量に対し、前記検出用抗体３０ａの結合量の割合が４５〜５５質量％であることで、さらに効率的に抗原量を定量することができる。

また、前記酵素４０ａは、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼであるので、良好な酵素活性を得ることができる。

また、前記磁性粒子２０がシリカあるいはポリマーにより組成されることにより、前記磁性粒子２０を酵素免疫測定法に適したものにすることができる。

また、前記フェライト粒子２１を有する前記磁性粒子２０の飽和磁化値が１０〜５０ｅｍｕ／ｇであることで、前記免疫測定用粒子１０ａを効率よく磁気捕集して前記抗原５０ａと前記検出用抗体３０ａとを反応させることが可能であり、迅速な免疫測定が可能となる。

また、免疫測定方法において前記免疫測定用粒子１０ａを用いることで、免疫測定用粒子が少ない場合であっても抗原量を効率的に定量することができる。

また、前記免疫測定方法において、前記免疫測定用粒子１０ａを磁気により誘導することで、前記免疫測定用粒子１０ａを効率よく磁気捕集して前記抗原５０ａと前記検出用抗体３０ａとを反応させることが可能であり、迅速な免疫測定が可能となる。

なお、この実施の形態においては、抗原としてＰＳＡを定量するために、ＰＳＡに結合可能な検出用抗体３０ａを用いて前記免疫測定用粒子１０ａを作成したが、これに限定されるものではなく定量対象の抗原に対応した検出用抗体を用いることにより任意の抗原を定量することができる。また、前記免疫測定用粒子１０ａの大きさを、２００ｎｍとしたが、この大きさに限定されるものではなく、定量に適した任意の大きさとすることができる。

また、前記磁性粒子２０は磁気捕集されるために内部にフェライト粒子２１を有していたが、前記磁性粒子２０はフェライト以外の強磁性体を内部に有していてもよいし、磁気捕集を行わない等の場合には内部に磁性体を有していなくてもよい。

また、この実施の形態における前記免疫測定用粒子１０ａは前記酵素４０ａとしてＨＲＰを用い、基質液成分７０としてＴＭＢを用い、ＨＲＰとＴＭＢとの酵素活性による発色反応の後に、青色の化合物７１（図７参照）を含む溶液の波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定することでＰＳＡを定量したが、前記酵素４０ａ及び前記基質液成分７０はこれに限定されるものではなく、酵素活性による発色反応を利用することのできる酵素及び基質液を適宜用いることができる。

なお、本発明による免疫測定用粒子の要旨としては、以下の通りである。すなわち、前記磁性粒子２０と、前記磁性粒子２０の表面に結合された前記検出用抗体３０ａと、前記磁性粒子２０の表面に結合された前記酵素４０ａとを備える免疫測定用粒子１０ａであって、前記検出用抗体３０ａと前記酵素４０ａとの合計結合量に対し、前記検出用抗体３０ａの結合量の割合が４０〜６０質量％であり、また、前記検出用抗体３０ａと前記酵素４０ａとの合計結合量に対し、前記検出用抗体３０ａの結合量の割合が４５〜５５質量％であり、また、前記酵素４０ａは、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼであり、また、前記磁性粒子２０がシリカにより組成され、また、前記磁性粒子２０がポリマーにより組成され、また、飽和磁化値が１０〜５０ｅｍｕ／ｇである構成である。
また、本発明による免疫測定方法の要旨としては、前記免疫測定用粒子１０ａを用い、また、前記免疫測定用粒子１０ａを磁気により誘導する方法である。

本発明による免疫測定用粒子は、粒子と、粒子の表面に結合された検出用抗体と、粒子の表面に結合された酵素とを備える免疫測定用粒子であって、検出用抗体と酵素との合計結合量に対し、検出用抗体の結合量の割合が４０〜６０質量％であるので、免疫測定用粒子が少ない場合であっても抗原量を定量することができる。
また、本発明による免疫測定方法は、前記免疫測定用粒子を用いるので、免疫測定用粒子が少ない場合であっても抗原量を定量することができる。

１０，１０ａ免疫測定用粒子
２０磁性粒子
３０，３０ａ検出用抗体
４０，４０ａ酵素

Claims

磁性粒子（２０）と、
前記磁性粒子（２０）の表面に結合された検出用抗体（３０，３０ａ）と、
前記磁性粒子（２０）の表面に結合された酵素（４０，４０ａ）と
を備える免疫測定用粒子であって、
前記検出用抗体（３０，３０ａ）と前記酵素（４０，４０ａ）との合計結合量に対し、前記検出用抗体（３０，３０ａ）の結合量の割合が４０〜６０質量％であることを特徴とする免疫測定用粒子。
前記検出用抗体（３０，３０ａ）と前記酵素（４０，４０ａ）との合計結合量に対し、前記検出用抗体（３０，３０ａ）の結合量の割合が４５〜５５質量％であることを特徴とする請求項１に記載の免疫測定用粒子。
前記酵素（４０，４０ａ）は、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼであることを特徴とする請求項１〜２のいずれか一項に記載の免疫測定用粒子。
前記磁性粒子（２０）がシリカにより組成されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫測定用粒子。
前記磁性粒子（２０）がポリマーにより組成されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫測定用粒子。
飽和磁化値が１０〜５０ｅｍｕ／ｇであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫測定用粒子。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫測定用粒子を用いることを特徴とする免疫測定方法。
前記免疫測定用粒子を磁気により誘導することを特徴とする請求項７に記載の免疫測定方法。