CN102539772B - 基于免疫磁酶的检测伏马毒素b1的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测伏马毒素B1的方法，包括以下步骤：将FB1半抗原与OVA偶联，得到偶联物FB1-OVA；将抗FB1单克隆抗体与免疫磁珠结合；将抗体-磁珠结合物加入EP管中，洗涤，将待侧样品的萃取液加入上述管中，震荡；去除上清液，洗涤，将OVA-FB1加入上述管中，震荡；去除上清液，洗涤，将抗FB1单克隆抗体加入上述管中，震荡；去除上清液，洗涤，将HRP标记羊抗鼠二抗加入上述管中，震荡；去除上清液，洗涤，加入发光底物，震荡，测定发光值；制作标准曲线，再根据待测样品的发光值，通过标准曲线得到对应的FB1浓度。本发明采用抗FB1单克隆抗体，与其他谷物中的真菌毒素无交叉反应，特异性强，减少了假阳性率。

Description

基于免疫磁酶的检测伏马毒素B1的方法

技术领域

本发明涉及一种生物检测工程技术领域的方法，具体是一种快速检测谷物类、谷物类相关产品、饲料中伏马毒素B1的方法。

背景技术

伏马毒素B1(Fumonisin B1，FB1)是串珠镰刀菌在一定湿度和温度条件下繁殖所产生的次级代谢产物，在全世界范围内分布广泛。1988年，Gelderblom等首次从串珠镰刀菌培养液中分离出伏马毒素。伏马毒素能够对玉米及其制品造成污染，而且在以谷物为原料的一些产品中如面条、啤酒、调味品，甚至在芦笋中也检测到了伏马毒素。据报道，伏马毒素与马脑白质软化症，猪的肺水肿症候群，大鼠肝癌等疾病有关。除上述疾病外，在南非的特兰斯凯地区和中国林县地区研究发现，食用伏马毒素污染的玉米制品与人类食道癌相关。串珠镰刀菌产生的毒素已经被国际癌症研究会(InternationalAgency for Research on Cancer，IARC)划分到2B类--可能的人类致癌物。加入WTO之后，农产品及相关食品的国际贸易量日益增加，随之对进出口产品的生物安全性的要求也越来越高，为了保证这类产品的顺利上市和食用者的健康，出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等部门迫切需要一种特异、快速、简便的伏马毒素检测方法。

化学发光(Chemiluminescence，CL)早在19世纪80年代就得到证实，即在化学反应过程中瞬间以释放光子的形式放出能量。后发展出放射免疫分析技(Radioimmunoassay，RIA)，因其高灵敏度和高特异性而受到普遍应用。CLIA是在RIA基本理论的基础上，以标记发光剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法。近年来发展迅猛，是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高几个数量级，显著优于放射免疫分析和酶联免疫分析。

化学发光酶免疫分析(Chemiluminescent Enzyme Immunoassay，CLEIA)属酶免疫分析，只是酶反应的底物是发光剂，操作步骤与酶免疫分析完全相同：以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。在酶促化学发光免疫分析中可供标记的酶有很多，目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)。

免疫磁酶技术是将IgG标记在标记有Protein A的磁珠上，进行酶联免疫方法的技术。其优势是利用磁珠的富集作用，检测较大体积溶液中的微量抗原。

关于伏马毒素B1毒素检测，国内外已建立了多种方法。目前检测FB1的方法主要为高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱-质谱联用法(GC-MS)，液谱和质谱联用法(LC-MS)和ELISA方法。然而，这些方法需要对检测样品进行严格的预处理，还需要高效液相色谱仪等贵重仪器，同时要求有专业的操作人员，不利于现场常规检测使用。已有的检测伏马毒素B1毒素的ELISA试剂盒，在检测灵敏度上不及本发明的化学发光ELISA方法，因此本方法对保障谷物类食品的安全具有更重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于免疫磁酶的检测伏马毒素B1的方法。本发明检测对象针对性强，准确率高，灵敏度较市售ELISA检测试剂盒高，并且由于本发明采用抗伏马毒素B1单克隆抗体，与其他谷物中的真菌毒素无交叉反应，较市售的以多克隆抗体为基础的ELISA试剂盒有更强的特异性，减少了假阳性率。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于免疫磁酶的检测伏马毒素B1的方法，该方法包括以下步骤：

步骤一，将FB1半抗原与OVA偶联，得到FB1的偶联物FB1-OVA；

步骤二，将抗FB1单克隆抗体与免疫磁珠结合，得到抗体-磁珠结合物；

步骤三，将所述抗体-磁珠结合物加入EP管中，使用洗涤液洗涤，将待侧样品进行萃取，得到萃取液，该萃取液稀释后加入所述管中，震荡；

步骤四，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将所述OVA-FB1加入所述管中，震荡；

步骤五，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将抗FB1单克隆抗体加入所述管中，震荡；

步骤六，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将HRP标记羊抗鼠二抗加入所述管中，震荡；

步骤六，去除上清液，使用洗涤液洗涤，加入发光底物，震荡，测定发光值；

步骤七，根据已知不同浓度FB1与抗FB1单克隆抗体加入后得到的发光值，制作标准曲线，再根据待测样品的发光值，通过标准曲线得到对应的FB1浓度。

优选地，在所述步骤一中，所述FB1半抗原与所述OVA的偶联通过活泼酯法完成。

优选地，在所述步骤三中，所述洗涤液为pH为7.4的0.01M磷酸盐缓冲液。

优选地，在所述步骤三中，所述萃取液的稀释倍数为5倍。

优选地，在所述步骤三中，所述萃取的方法为：取样品，按照重量体积比1∶10的比例加入70％甲醇-PBS溶液，剧烈震荡15min，静置30min，将上清液通过快速定性滤纸过滤，即得萃取液。

进一步优选地，所述稀释液为pH 8.2的0.1M磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液含有体积比为0.01％的Tween-20。

优选地，在所述步骤三中，所述震荡步骤为室温震荡30分钟。

优选地，在所述步骤六中，所述震荡步骤为室温震荡1分钟。

优选地，在所述步骤四中，所述上清液的去除使用磁力架完成。

优选地，在所述步骤七中，所述标准曲线的做法为：以加入FB1浓度的对数值为横坐标，以加入不同浓度FB1所得到的不同发光值除以不加入FB1所得到的发光值为纵坐标，通过Microsoft Excel软件，做出散点图并添加趋势线公式和R²。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明是鉴于待测样品若有FB1毒素，由于FB1和免疫磁珠上的抗FB1单克隆抗体特异性结合，而卵清蛋白(OVA)与FB1和的偶联物OVA-FB1加入反应体系中后，可以和未被FB1结合的单克隆抗体结合。再次加入抗FB1单克隆抗体后，抗体可以和OVA-FB1结合。而且在加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗后，HRP再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。由于待测样品中含有的FB1的量与发光检测结果有线性关系，因此可以通过标准曲线算出待测样品中含有的FB1的量。本发明检测对象针对性强，准确率高，灵敏度较市售ELISA检测试剂盒高。并且由于本发明采用抗伏马毒素B1单克隆抗体，与其他谷物中的真菌毒素无交叉反应，较市售的以多克隆抗体为基础的ELISA试剂盒有更强的特异性，减少了假阳性率。

附图说明

图1为本发明实施例原理的示意图；

图2为本发明实施例检测的示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

步骤一，伏马毒素B1完全抗原(OVA-FB1)的制备

将2.5mg卵清白蛋白(OVA)溶于0.1ml 0.01M的PB缓冲液中，加入10μl50％(V/V)戊二醛(GA)，室温搅拌过夜。4℃条件下用PBS透析过夜，除去多余GA。0.5mg FB1溶于0.2ml 25％(V/V)乙醇，将其加入到激活的OVA透析物(约0.15ml)中，加入0.1ml1M碳酸缓冲液(pH 9.5)，4℃搅拌过夜。加入0.05ml 1M赖氨酸(pH 7)，4℃反应3h。最后用PBS透析72h，2次换液，-20℃保存。

步骤二，抗FB1单克隆抗体与免疫磁珠结合

取免疫磁珠50μl，使用洗涤液(0.01M磷酸盐缓冲液，pH 7.4)洗涤3次后，加入含5μg抗FB1单克隆抗体的结合缓冲液(0.1M磷酸缓冲液，pH 8.2，含0.01％Tween-20)200μl，室温震荡反应30分钟。再使用洗涤缓冲液洗涤3次，最后加入结合缓冲液，-4℃保存。

步骤三，化学发光ELISA检测待测样品萃取液

(1)将抗体-磁珠结合物稀释至一定浓度后取50μl加入EP管中，使用洗涤液洗涤3次。取0.3g样品，加入3ml 70％甲醇-PBS溶液，剧烈震荡15min，静置30min。上清液通过快速定性滤纸过滤，使用结合缓冲液(0.1M磷酸缓冲液，pH 8.2，含0.01％Tween-20)稀释5倍后，取1ml加入含有抗体-磁珠的管中，室温震荡反应30分钟，其中在标准曲线孔中依次加入10、5、1、0.5、0.1、0.01、0ng/ml的FB1纯品1ml，并做3次重复；在待测孔中加制备的待测样品萃取液1ml，并做3次重复，空白孔中不加入抗体-磁珠结合物，如图2所示。

(2)使用磁力架将溶液上清去除，使用洗涤液洗涤3次后，将OVA-FB1使用结合缓冲液稀释至一定浓度后，取200μl加入EP管中，室温震荡反应30分钟。

(3)使用磁力架将溶液上清去除，使用洗涤液洗涤3次后，将抗FB1单克隆抗体使用结合缓冲液稀释至一定浓度后，取200ul加入EP管中，室温震荡反应30分钟。

(4)使用磁力架将溶液上清去除，使用洗涤液洗涤3次后，将HRP标记羊抗鼠二抗使用结合缓冲液稀释至一定浓度后，取200μl加入EP管中，室温震荡反应30分钟。

(5)使用磁力架将溶液上清去除，使用洗涤液洗涤后加入发光底物(鲁米诺+对碘酚)200μl，室温震荡反应1分钟后吸出，加入96孔板中，用发光信号测定仪进行发光测定，得到结果。

如图1所示，磁珠1与Protein A 2结合，抗FB1单克隆抗体3分别与Protein A2和OVA-FB14结合，抗FB1单克隆抗体5分别与OVA-FB14和HRP标记的羊抗鼠二抗6结合。

步骤四，检测FB1的标准曲线的制作与结果判定

(1)根据已知不同浓度FB1与抗FB1单克隆抗体加入后，得到的发光值，绘制标准曲线，具体做法为：以加入FB1浓度的对数值为横坐标，以加入不同浓度FB1所得到的不同发光值的平均数，除以不加入FB1(空白)所得到的发光值为纵坐标，通过Microsoft Excel软件，绘制散点图并添加趋势线公式和R²；

(2)根据待测样品的发光值的平均值，通过标准曲线所得到的趋势线公式计算，得到对应的FB1浓度。

Claims (10)

1.一种基于免疫磁酶检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，将FB1半抗原与OVA偶联，得到FB1的偶联物FB1-OVA；

步骤二，将抗FB1单克隆抗体与免疫磁珠结合，得到抗体-磁珠结合物；

步骤三，将所述抗体-磁珠结合物加入EP管中，使用洗涤液洗涤，将待测样品进行萃取，得到萃取液，该萃取液稀释后加入所述管中，震荡；

步骤四，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将所述FB1-OVA加入所述管中，震荡；

步骤五，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将抗FB1单克隆抗体加入所述管中，震荡；

步骤六，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将HRP标记羊抗鼠二抗加入所述管中，震荡；

步骤六，去除上清液，使用洗涤液洗涤，加入发光底物，震荡，测定发光值；

步骤七，根据已知不同浓度FB1与抗FB1单克隆抗体加入后得到的发光值，制作标准曲线，再根据待测样品的发光值，通过标准曲线得到对应的FB1浓度。

2.如权利要求1所述的检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，在所述步骤一中，所述FB1半抗原与所述OVA的偶联通过活泼酯法完成。

3.如权利要求1所述的检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述洗涤液为pH为7.4的0.01M磷酸盐缓冲液。

4.如权利要求1所述的检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述萃取液的稀释倍数为5倍。

5.如权利要求1所述的检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述萃取的方法为：取样品，按照重量体积比1：10的比例加入70％甲醇-PBS溶液，剧烈震荡15min，静置30min，将上清液通过快速定性滤纸过滤，即得萃取液。

6.如权利要求5所述的检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，其特征在于，所述萃取液稀释采用的稀释液为pH8.2的0.1M磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液含有体积比为0.01％的Tween-20。

7.如权利要求1所述的检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述震荡步骤为室温震荡30分钟。

8.如权利要求1所述的检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，在所述步骤六中，所述震荡步骤为室温震荡1分钟。

9.如权利要求1所述的检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，在所述步骤四中，所述上清液的去除使用磁力架完成。

10.如权利要求1至9中任一项所述的检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，在所述步骤七中，所述标准曲线的做法为：以加入FB1浓度的对数值为横坐标，以加入不同浓度FB1所得到的不同发光值除以不加入FB1所得到的发光值为纵坐标，通过MicrosoftExcel软件，做出散点图并添加趋势线公式和R2。