KR20050119207A - 자성체 내포 입자 및 그의 제조 방법, 면역 측정용 입자,및 면역 측정 방법 - Google Patents

자성체 내포 입자 및 그의 제조 방법, 면역 측정용 입자,및 면역 측정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 목적은 균일한 자성을 갖고, 분산 안정성이 우수하며, 입경 분포가 좁은 자성체 내포 입자 및 그의 제조 방법, 그것을 이용하여 이루어지는 면역 측정용 입자, 및 이들 자성체 내포 입자 또는 면역 측정용 입자를 사용하는 면역 측정 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 유기 고분자 물질과 평균 입경이 1 내지 30 nm인 자성체를 포함하는 자성체 내포 입자이며, 상기 자성체는 분산된 상태로 입자 내부에 포함되어 있는 자성체 내포 입자이다.

Description

자성체 내포 입자 및 그의 제조 방법, 면역 측정용 입자, 및 면역 측정 방법{Particle Having Magnetic Material Incorporated Therein, Process for Producing the Same, Particle for Immunoassay and Method of Immunoassay}
본 발명은 균일한 자성을 갖고, 분산 안정성이 우수하며, 입경 분포가 좁은 자성체 내포 입자 및 그의 제조 방법, 그것을 이용하여 이루어지는 면역 측정용 입자, 및 이들 자성체 내포 입자 또는 면역 측정용 입자를 사용하는 면역 측정 방법에 관한 것이다.
종래, 자성체 함유 고분자 입자의 제조 방법으로서 (1) 제조를 끝낸 고분자 입자에 철 이온을 함유시켜 자성체를 제조하는 방법, (2) 단량체로부터 고분자 입자를 중합하는 과정에서 제조를 끝낸 자성체 입자를 함유시키는 방법(일본 특허 공개 (평)9-208788호 공보 참조), (3) 별개로 제조한 고분자 입자와 자성체 입자를 복합화시키는 방법(일본 특허 공개 (평)6-231957호 공보 참조)이 알려져 있다. 또한, 그 밖에 (4) 자성체 입자를 고분자 등으로 피복하는 방법(일본 특허 공개 (평)6-92640호 공보 참조)이 있다.
(1)의 방법은 철 이온을 고분자 입자에 흡수시키기 때문에 표면에 자성체가 노출되어 자성체가 산화된다는 과제가 있었다. 또한, (2)의 방법은 자성체 입자가 균일하게 고분자 입자에 취입되지 않는다는 과제나, 입경의 제어가 곤란하여 입경 분포가 넓은 것이 된다는 과제가 있었다. 또한, (3)의 방법은 고분자 입자가 응집되기 때문에, 입경이 작은 입자에는 사용할 수 없다는 과제가 있었다. 또한, (4)의 방법은 피복이 균일하게 되지 않기 때문에 부유성이나 분산성이 불량하고, 자성체 입자 표면의 일부가 노출되는 경우가 있었다.
한편, 미량 면역 측정 방법으로서는 방사 면역 측정 방법, 효소 면역 측정 방법, 형광 면역 측정 방법 등이 종래부터 알려져 있으며, 이미 실용화되어 있다. 이들 방법은 각각 동위 원소, 효소, 형광 물질 등을 표지로서 부가한 항원 또는 항체를 사용하여, 이와 특이적으로 반응하는 항체 또는 항원의 유무를 검출하는 방법이다. 이러한 면역 측정 방법에 있어서, 자성체 내포 입자는 효율적으로 간편하게 B/F 분리를 행하기 위해 사용되고 있다. 또한, B/F 분리 이외의 사용(일본 특허 공개 제2000-88852호 공보 참조)이나, 자성체 내포 입자 자체를 표지 재료로 하는 면역 측정 방법(일본 특허 공개 (평)6-148189호 공보, 일본 특허 공개 (평)7-225233호 공보, 일본 특허 공표 제2001-524675호 공보 참조)이 개시되어 있다.
자성체 내포 입자 자체를 표지로 하는 면역 측정 방법에 있어서, 그 측정 정밀도는 자성체 내포 입자의 균질성, 즉 입자마다의 자성체 함유량의 균일성에 의존한다. 그러나, 시판되고 있는 자성체 내포 입자는 자성체 함유량에 변동이 있어, 종래 공지된 자성체 내포 입자의 제조 방법으로는 자성체 함유량의 균일성을 제어하기가 곤란하였다.
자성체 내포 입자를 면역 측정 방법에 사용할 때, 항원이나 항체를 결합시키는 공정이나 피검출 물질과 혼합하는 공정에 있어서, 자성체 내포 입자를 완충액 등에 분산한 분산액으로서 취급하는 경우가 발생한다. 따라서, 자성체 내포 입자에는 분산액 상태로 입자가 자연 침강하지 않는 분산 안정성이 높은 것이 바람직하다. 그러나, 시판되고 있는 자성체 내포 입자는 분산액 상태로 잠시 방치하면, 그 일부가 침강하는 등과 같이 취급성면에 있어서 문제가 있었다.
도 1은 실시예 2에서 얻어진 자성체 내포 입자(평균 입경; 자성체 내포 입자 0.21 ㎛, 자성체 5 nm)의 TEM 사진이다.
<발명의 상세한 개시>
이하에 본 발명을 상술한다.
본 발명의 자성체 내포 입자는, 유기 고분자 물질과 평균 입경이 1 내지 30 nm인 자성체를 포함하는 것이다.
상기 유기 고분자 물질은 입자의 코어를 형성하기 위한 친수기를 갖지 않는 단량체와, 수중에서 안정적으로 분산되는 입자를 형성하면서 입자의 쉘을 형성하기 위한 친수기를 갖는 단량체를 포함하는 중합체를 주 구성 성분으로 하는 것이다.
<친수기를 갖지 않는 단량체>
상기 친수기를 갖지 않는 단량체로서는, 예를 들면, 스티렌, α-메틸스티렌, p-메틸스티렌, p-클로로스티렌, 클로로메틸스티렌 등의 스티렌계 단량체; 염화 비닐; 아세트산 비닐, 프로피온산 비닐 등의 비닐 에스테르류; 아크릴로니트릴 등의 불포화 니트릴류; 메틸 (메트)아크릴레이트, 에틸 (메트)아크릴레이트, 부틸 (메트)아크릴레이트, 2-에틸헥실 (메트)아크릴레이트, 스테아릴 (메트)아크릴레이트, 에틸렌글리콜 (메트)아크릴레이트, 트리플루오로에틸 (메트)아크릴레이트, 펜타플루오로프로필 (메트)아크릴레이트, 시클로헥실 (메트)아크릴레이트, 글리시딜 (메트)아크릴레이트, 테트라히드로푸르푸릴 (메트)아크릴레이트 등의 아크릴계 단량체 등을 들 수 있다. 이들 친수기를 갖지 않는 단량체는 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 병용할 수도 있다.
상기 친수기를 갖지 않는 단량체로서는, 바람직하게는 메틸 (메트)아크릴레이트, 에틸 (메트)아크릴레이트, 부틸 (메트)아크릴레이트, 2-에틸헥실 (메트)아크릴레이트, 스테아릴 (메트)아크릴레이트, 에틸렌글리콜 (메트)아크릴레이트, 트리플루오로에틸 (메트)아크릴레이트, 펜타플루오로프로필 (메트)아크릴레이트, 시클로헥실 (메트)아크릴레이트, 글리시딜 (메트)아크릴레이트, 테트라히드로푸르푸릴 (메트)아크릴레이트 등의 아크릴계 단량체가 사용된다.
상기 친수기를 갖지 않는 단량체로서는, 보다 바람직하게는 중합에 의한 입자 형성과 자성체 형성을 동시에 진행시키기 위해, 입자 중합 중에 고농도로 금속 이온을 취입하는 능력이 우수한 글리시딜기를 갖는 아크릴계 단량체가 사용된다. 상기 아크릴계 단량체 중에서도, 특히 글리시딜 메타크릴레이트(GMA)는 철 이온 및 마그네타이트와의 친화성이 높기 때문에 특히 바람직하게 사용된다.
또한, 상기 글리시딜기를 갖는 아크릴계 단량체와 스티렌계 단량체를 병용하는 것도 바람직하다.
상기 친수기를 갖지 않는 단량체로서, 글리시딜기를 갖는 아크릴계 단량체와 스티렌계 단량체를 병용하는 경우, 상기 유기 고분자 물질 중의 스티렌계 단량체로부터 유래하는 단량체 단위의 비율은 5 내지 90 중량％인 것이 바람직하다. 5 중량％ 미만이면, 얻어지는 입자의 수중에서의 분산 안정성이 낮아지고, 중합 중에 자기(自己) 응집되기 쉬워지며, 또한 90 중량％를 초과하면, 자성체의 전구체인 금속 이온과의 친화성이 낮아져 입자 내에 형성하는 자성체가 적어진다.
상기 글리시딜기를 갖는 아크릴계 단량체와 스티렌계 단량체를 병용할 때, 추가로 메틸 메타크릴레이트를 병용할 수도 있다.
또한, 용도에 따라서는 상기 친수기를 갖지 않는 단량체로서 가교성 단량체가 사용되며, 상기 유기 고분자 물질이 가교될 수도 있다.
상기 가교성 단량체로서는, 예를 들면, 디비닐벤젠, 디비닐비페닐, 디비닐나프탈렌, 에틸렌글리콜 디(메트)아크릴레이트, 1,6-헥산디올 디(메트)아크릴레이트, 네오펜틸글리콜 디(메트)아크릴레이트, 트리메틸올프로판 트리(메트)아크릴레이트, 테트라메틸올메탄 트리(메트)아크릴레이트, 테트라메틸올프로판 테트라(메트)아크릴레이트, 디알릴프탈레이트 및 그의 이성체, 트리알릴이소시아누레이트 및 그의 유도체 등을 들 수 있다. 이들 가교성 단량체는 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 병용할 수도 있다.
이들 가교성 단량체 중에서도 에틸렌글리콜 디(메트)아크릴레이트는 철 이온 및 마그네타이트와의 친화성이 높기 때문에 바람직하게 사용된다.
<친수기를 갖는 단량체>
상기 친수기를 갖는 단량체로서는, 예를 들면 아크릴산, 메타크릴산, 이타콘산, 푸마르산, 말레산 등의 중합성 불포화 결합을 갖는 카르복실산; 중합성 불포화 결합을 갖는 인산 에스테르; 중합성 불포화 결합을 갖는 술폰산 에스테르; 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트 4급염, 디에틸아미노에틸 메타크릴레이트 4급염 등의 아크릴로일기를 갖는 아민의 염이나, 비닐 피리딘 등의 비닐기를 갖는 질소 함유 화합물의 염과 같이 양이온기를 갖는 비닐계 단량체; 2-히드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 (메트)아크릴레이트, (메트)아크릴아미드, 메틸올 아크릴아미드, 글리세롤 메타크릴레이트(GLM) 등의 비이온성 비닐계 단량체 등의 일반적으로 친수성 단량체라고 불리우고 있는 것 외에, 친수기를 갖는 반응성 유화제 등을 들 수 있다. 이들 친수기를 갖는 단량체는 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 병용할 수도 있다.
상기 친수기를 갖는 반응성 유화제로서는, 예를 들면 하기 화학식 2 내지 9로 표시되는 반응성 유화제류를 들 수 있다.
<화학식 2>
상기 친수기를 갖는 단량체 중에서도, 하기 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 (메트)아크릴레이트나, 상기 화학식 2로 표시되는 반응성 유화제는 수중에서 입자를 안정적으로 분산하는 능력이 높고, 자성체의 생성을 방해하지 않기 때문에 바람직하게 사용된다.
<화학식 1>
CH2=CR-COO-(CH2-CH2-O)n-H
(식 중, R은 H 또는 CH3을 나타내고, n은 1 내지 20의 정수를 나타낸다.)
상기 화학식 2 중 n은 3 내지 30의 정수를 나타내고, 바람직하게는 5 내지 20의 정수를 나타낸다.
본 발명의 자성체 내포 입자는 자성체 함유량의 변동이 작은 것이 바람직하다. 자성체 내포 입자의 자성체 함유량의 변동을 평가하는 방법으로서는 SEM-EDX를 이용하는 방법, 동기 발광 분석을 이용하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 SEM-EDX는 SEM 관찰을 행하고 있는 미소 영역의 EDX 분석(정성 분석, 정량 분석, 맵핑, 입자 해석 등)을 행하는 장치이며, 자성체 함유량의 변동을 측정할 수 있다.
상기 동기 발광 분석을 이용하는 측정 장치로서는, 예를 들면, 입자 분석기(DP-1000, 호리바 세이사꾸쇼 제조)가 시판되고 있다. 입자 분석기는 흡인 펌프에 의해 샘플링한 고체 미립자에 헬륨 마이크로파 유도 플라즈마의 높은 여기 에너지를 조사하여 고체 미립자 1개씩의 동기 발광을 계측하는 구조이며, 고체 미립자의 폭 넓은 용도 원소의 분석, 및 여러가지 성분의 혼재 상태를 해석하는 것이 가능하다.
자성체 내포 입자의 자성체 함유량의 변동은, 유기 고분자 물질을 구성하는 탄소 원소와 자성체를 구성하는 금속 원소의 동기 발광을 측정하여, 입자마다의 탄소 원소와 금속 원소의 혼재 비율의 변동으로부터 산출한 측정 데이타의 분산 상태를 나타내는 편차값(절대 편차)으로 비교 평가할 수 있다. 상기 편차값은 그 수치가 작을 수록 자성체 함유량의 변동이 작고, 즉, 자성체 내포 입자의 균일성이 높고, 그 수치가 클 수록 자성체 함유량의 변동이 큰, 즉, 자성체 내포 입자의 균일성이 낮은 것을 나타낸다.
본 발명의 자성체 내포 입자는, 유기 고분자 물질을 구성하는 탄소 원소와 자성체를 구성하는 금속 원소와의 구성 비율의 절대 편차가 0.3 이하인 것이 바람직하다. 0.3을 초과하면, 면역 측정 방법에 사용했을 경우, 측정 재현성이나 정량성이 낮아져 측정 정밀도가 악화되고, 얻어지는 측정 데이타의 신뢰성이 낮아진다. 보다 바람직하게는 0.27 이하이고, 더욱 바람직하게는 0.25 이하이며, 가장 바람직하게는 0.20 이하이다.
상기 자성체는, 자성체 내포 입자를 형성하는 중합 과정에 있어서 입자 내부에서 금속 이온이 산화되어 형성된 것인 것이 바람직하다.
<금속 이온>
상기 금속 이온은 자성체를 형성하는 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 철 이온, 코발트 이온, 니켈 이온 등이고, 보다 바람직하게는 철 이온이다. 자성체인 마그네타이트는 염화제2철을 산화제 등으로 산화하여 얻을 수 있다. 중합 개시제에 의해, 상술한 단량체의 중합을 개시함과 동시에 2가 철 이온의 산화(마그네타이트화)를 행함으로써 자성체(마그네타이트) 내포 입자가 제조된다.
상기 자성체의 평균 입경은 1 내지 30 nm이다. 1 nm 미만이면, 자성체의 자성 응답 특성이 감소하여, 즉, 자성체 내포 입자의 자성 응답 특성이 감소하여 면역 측정에 사용했을 때의 측정 감도가 저하된다. 또한, 30 nm를 초과하면, 입자 내에서의 분산성이 저하된다. 바람직하게는 2 내지 20 nm이고, 보다 바람직하게는 2 내지 10 nm이다.
본 발명의 자성체 내포 입자에 있어서, 상기 자성체는 분산된 상태로 자성체 내포 입자 내부에 포함되어 있다. 즉, 본 발명의 자성체 내포 입자에 있어서는, 자성체가 입자 표면에 노출되는 경우 없이 입자 내부에 분산된 상태로 존재한다.
본 발명의 자성체 내포 입자의 자성체 함유량은 0.1 내지 50 중량％의 범위에서 조정하는 것이 바람직하다. 0.1 중량％ 미만이면, 자성체 내포 입자의 자성 응답 특성이 감소하여, 면역 측정에 사용했을 때의 측정 감도가 저하된다. 또한, 50 중량％를 초과하면, 입자의 중합 조작성이 저하하여, 입자 중합 중에 금속 이온을 취입하기 곤란해진다. 보다 바람직하게는 0.1 내지 40 중량％이고, 더욱 바람직하게는 1 내지 30 중량％이다.
또한, 본 발명의 자성체 내포 입자는, 필요에 따라, 입자 표면에 카르복실기, 수산기, 에폭시기, 아미노기, 트리에틸암모늄기, 디메틸아미노기, 술폰산기 등의 관능기를 가질 수도 있다. 이들 관능기를 통해 항원이나 항체와 공유 결합을 행할 수 있다.
상기 관능기는 각각의 관능기를 갖는 단량체를 중합용 단량체 혼합물에 미리 배합하거나, 또는 중합 도중에 첨가함으로써 자성체 내포 입자의 표면에 도입할 수 있다. 상기 관능기를 갖는 단량체로서, 예를 들면, 카르복실기를 갖는 단량체로서는 (메트)아크릴산 등을 들 수 있고, 수산기를 갖는 단량체로서는 2-히드록시에틸 (메트)아크릴레이트 등을 들 수 있고, 에폭시기를 갖는 단량체로서는 글리시딜 (메트)아크릴레이트 등을 들 수 있고, 트리에틸암모늄기를 갖는 단량체로서는 트리에틸암모늄 (메트)아크릴레이트 등을 들 수 있고, 디메틸아미노기를 갖는 단량체로서는 디메틸아미노 (메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다.
본 발명의 자성체 내포 입자는, 필요에 따라 입자 표면에 항원 또는 항체와 공유 결합이 가능한 관능기를 갖는 링커가 결합될 수도 있다.
<링커>
상기 링커란, 자성체 내포 입자를 면역 측정에 사용했을 때, 유기 고분자 물질을 포함하는 입자와 항원, 항체 등의 화합물과의 사이에 존재하게 되는 화학 물질이다. 상기 링커는 입체 장해가 발생하지 않는 길이를 갖고, 비특이적 흡착이 발생하지 않는 화합물이며, 유기 고분자 물질을 포함하는 입자 및 항원, 항체 등의 화합물과 결합하기 전에는 그 분자 말단에, 예를 들면 아미노기, 카르복실기, 에폭시기, 토실기, 티올기 등의 항원 또는 항체와 공유 결합이 가능한 관능기를 갖는 것이 바람직하다. 본 발명에서의 링커로서는, 입자 표면의 글리시딜기 함유 단량체 유래의 에폭시기, 또는 에폭시기의 개환에 의해 발생하는 수산기, 아미노기 등을 항원, 항체 등과 적당한 거리를 두고 결합시킬 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는 에폭시기를 복수 말단에 갖는 화합물, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜에테르, 폴리프로필렌글리콜 디글리시딜에테르, 네오펜틸글리콜 디글리시딜에테르, 트리메틸올프로판 폴리글리시딜에테르 등을 들 수 있다. 보다 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜에테르를 들 수 있다.
이러한 링커를 자성체 내포 입자의 입자 표면에 도입함으로써, 예를 들면 자성체 내포 입자에 결합되는 항원, 항체, 시약 등의 반응성을 높일 수 있게 되고, 즉, 양호한 감도로 정밀한 측정이 가능해지며, 또한 자성체 내포 입자의 입자 표면이 단백질에 대하여 비흡착성인 것이라도, 링커가 단백질과의 결합성을 갖기 때문에 항원 또는 항체를 자성체 내포 입자에 확실하게 결합시킬 수 있게 된다.
본 발명의 자성체 내포 입자의 평균 입경은, 그 중합 조건에 따라 0.05 내지 1 ㎛의 범위에서 조정하는 것이 바람직하다. 0.05 ㎛ 미만이면, 응집되기 쉬워져 분산 안정성이 저하되고, 1 ㎛를 초과하면, 예를 들어, 자성체 내포 입자를 현탁액 중에서 사용하는 경우에는 자성체 내포 입자가 침전하기 쉬워지며, 또한, 면역 크로마토법과 같이 자성체 내포 입자를 다공성 담체 중에서 사용하는 경우에는 다공성 담체 중에서 자성체 내포 입자가 이동하기 어려워지는 등, 시약으로서의 취급성이 저하된다. 보다 바람직하게는 0.06 내지 0.8 ㎛이고, 더욱 바람직하게는 0.07 내지 0.5 ㎛이다.
본 발명의 자성체 내포 입자는, 수계 용매 중에서 상기 친수기를 갖지 않는 단량체 및(또는) 친수기를 갖는 단량체를 중합하여 입자를 형성하는 공정, 및 상기 입자 중에 금속 이온을 취입하면서 상기 금속 이온을 산화하여 자성체를 형성하는 공정을 포함하고, 상기 입자를 형성하는 공정과 자성체를 형성하는 공정을 동시에 진행시키는 방법에 의해 제조된다.
수계 용매 중에서 친수기를 갖지 않는 단량체 및(또는) 친수기를 갖는 단량체를 중합하여 입자를 형성하는 공정에 있어서는 중합 개시제가 사용된다.
<중합 개시제>
상기 중합 개시제로서는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 수용성 유기 아조 화합물, 무기 과산화물, 유기 과산화물 등을 들 수 있다.
상기 중합 개시제의 바람직한 예로서는 과황산칼륨(이하,「KPS」라고 함; 중합 온도 70 ℃), 아조비스아미디노프로판 염산염(중합 온도 70 ℃), 2,2-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디히드로 클로라이드(중합 온도 60 ℃), 과황산암모늄(중합 온도 70 ℃) 등을 들 수 있다. 그 중 과산화물계 중합 개시제인 KPS나 과황산암모늄은 중합 개시와 함께 2가 철 이온의 산화에 기여하는 것이 기대되며, KPS나 과황산암모늄을 사용했을 경우에는 단량체와 철 이온에 의한 중합과 마그네타이트 생성이 동시에 진행되는 것이 상정된다. 아조비스아미디노프로판 염산염 및 2,2-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디히드로 클로라이드는 산화력이 약하여, 2가 철 이온의 완만한 산화 반응에 관여하는 중합 개시제가 된다. 또한, 아조비스아미디노프로판 염산염으로서는 상품명 「V-50」(와꼬 쥰야꾸 고교사 제조)이, 2,2-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디히드로 클로라이드로서는 상품명 「VA-044」(와꼬 쥰야꾸 고교사 제조)가 시판되고 있다.
상기 중합 개시제는 Fe2 +의 산화에 의해 소비되거나, Fe3 +에 의해 라디칼 활성을 잃는 경우가 있기 때문에, 입자 성장을 촉진할 목적으로 입자 성장 과정에 후첨가하는 것이 유효하다. 이 경우, 새로운 2차 입자는 형성되지 않으며, 입자 표면이 중합체로 피복된다.
<pH 조정제>
본 발명에 있어서, 중합과 동시에 자성체를 제조하기 위해서는 중합계 내의 pH는 염기성으로 조정되는 것이 바람직하다. 상기 중합 개시제로서 KPS나 과황산암모늄을 사용한 계에서는 수중에서의 분산 안정성이 양호하여 입경 분포가 좁은 단분산 입자를 얻을 수 있다는 장점이 있지만, 산화력 제어가 불가능하여 중합계 내가 산성이 되기 때문에 자석으로의 이끌림이 약한 입자가 된다는 단점이 있다. 한편, 상기 중합 개시제로서 산화력을 갖지 않는 2,2-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디히드로 클로라이드를 사용한 계에서는 중합계 내의 pH가 거의 중성이라는 장점이 있다.
중합계 내의 pH를 약염기성으로 유지하기 위해서는 일반적인 염기를 사용할 수 있다. 바람직하게는 NH4OH가 pH 조정제로서 사용된다.
상기 pH 조정제는 필요에 따라 몇회 첨가할 수 있다.
<중합 방법>
본 발명의 자성체 내포 입자는 현탁 중합, 분산 중합, 유화 중합, 무비누(soap free) 유화 중합 등의 입자 중합 방법에 의해 제조할 수 있지만, 최종적으로 얻어지는 자성체 내포 입자의 Cv값이 5 ％ 이하인 것이 바람직하기 때문에, 입경 분포의 제어가 우수한 무비누 유화 중합에 의해 바람직하게 제조된다.
이하, 무비누 유화 중합에 의한 자성체 내포 입자의 제조 방법을 예시하지만, 이 방법으로 한정되는 것은 아니다.
대표적인 중합 조성은 친수기를 갖는 단량체 및 친수기를 갖지 않는 단량체를 포함하는 단량체 조성물: 3 g 및 H2O: 100 g을 포함한다. 사구 플라스크에 상기 단량체 조성물 및 물을 칭량한다. 각각의 구에는 교반 막대, 환류 냉각관을 부착한다. 이어서, 계를 항온조에 넣고, 교반하면서 계 내를 질소 치환한다. 항온조는 첨가하는 중합 개시제의 중합 온도로 조정하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 중합 개시제로서 KPS, 아조비스아미디노프로판 염산염 또는 과황산암모늄을 사용하는 경우에는 70 ℃로 하는 것이 바람직하고, 중합 개시제로서 2,2-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디히드로클로라이드를 사용하는 경우에는 50 내지 60 ℃로 하는 것이 바람직하다. 그 후, 물에 용해한 중합 개시제를 주사기로 계 내에 주입한다. 이 시점을 중합 개시 시점으로 하고, 소정 시간 후에 주사기를 이용하여 자성원이 되는 FeCl2ㆍ4H2O의 수용액을 주입한다. FeCl2ㆍ4H2O는 중합 개시제의 1/3 내지 4배 몰을 물 5 g에 용해한 것을 사용한다. 즉, 중합 개시제에 의해 상술한 단량체의 중합을 개시함과 동시에, 2가 철 이온의 산화(마그네타이트화)를 행함으로써 입자를 제조한다.
중합은 개시로부터 2 시간 내지 24 시간 행하는 것이 바람직하다. 적절한 산화력을 얻기 위해 중합 도중에 NH4OH를 첨가할 수도 있으며, 또한 중합에 의한 입자의 성장을 촉진하기 위해 중합 도중에 중합 개시제를 첨가할 수도 있다. 이와 같이 하여 자성체를 분산 상태로 함유하는 유기 고분자 물질을 포함하는 입자를 얻을 수 있다.
상기 단량체 조성물에는, 공중합 단량체로서 반응성 유화제를 첨가할 수도 있다.
<반응성 유화제>
상기 반응성 유화제로서는, 예를 들면, 하기 화학식 2 내지 10으로 표시되는 반응성 유화제류를 들 수 있다.
<화학식 2>
<화학식 3>
<화학식 4>
<화학식 5>
<화학식 6>
<화학식 7>
<화학식 8>
<화학식 9>
이들 반응성 유화제는 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 병용할 수도 있다. 제조한 입자는 잔존 단량체, 중합 개시제, 미반응의 철 이온 등을 제거하기 위해 원심 분리ㆍ재분산을 증류수로 반복적으로 행하여 정제한다. 원심 분리를 행한 후, 상청액을 따라내어 버리고, 증류수를 첨가하여 유리 막대에 의해 재분산을 행한다. 정제 후, 얻어진 자성체 내포 입자는 유리병으로 옮겨 뚜껑ㆍ파라 필름으로 밀폐ㆍ보존한다.
본 발명의 자성체 내포 입자의 입자 표면에의 링커 도입은, 예를 들면, 링커 미도입의 자성체 내포 입자를 알칼리성 수용액 중에 분산시키고, 이어서 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜에테르 등의 링커가 되는 화학 물질을 첨가하여 24 시간 정도 혼합함으로써 이룰 수 있다.
상술한 바와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 자성체 내포 입자는 입도 분포가 좁고, 자성체 함유량의 변동이 작기 때문에 매우 균질하다. 따라서, 본 발명의 자성체 내포 입자는 분산 안정성이 높아 취급성이 우수하다. 또한, 본 발명의 자성체 내포 입자는 평균 입경이 비교적 작기 때문에 콜로이드 안정성이 양호하다. 또한, 본 발명의 자성체 내포 입자는, 내포하는 자성체가 미소한 크기로 분산되어 함유되어 있기 때문에 자화되었을 때에도 잔류 자기가 없고, 그에 기인하는 자기(自己) 응집에 의한 침강도 발생하지 않는다.
본 발명의 자성체 내포 입자에 항원 또는 항체를 흡착 또는 결합시킴으로써 면역 측정용 입자를 얻을 수 있다. 항체 또는 항원을 자성체 내포 입자에 흡착 또는 결합시키는 방법으로서는, 물리 흡착법이나 카르보디이미드를 이용한 화학 결합법 등의 공지된 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 자성체 내포 입자의 입자 표면에 에폭시기를 갖는 링커가 도입되어 있는 경우에는, 링커를 통해 항원 또는 항체의 아미노기나 티올기 등과 화학 결합시켜 면역 측정용 입자를 제조할 수 있다. 이러한 본 발명의 자성체 내포 입자에 항원 또는 항체가 결합되어 이루어지는 면역 측정용 입자도, 또한 본 발명 중 하나이다.
본 발명의 자성체 내포 입자나 면역 측정용 입자는 면역 측정 방법에 사용할 수 있다. 본 발명의 자성체 내포 입자나 면역 측정용 입자를 사용하는 면역 측정 방법도, 또한 본 발명 중 하나이다.
본 발명의 면역 측정 방법으로서는, 자성체 내포 입자를 담체로서 사용한 방사 면역 측정 방법, 효소 면역 측정 방법 등의 공지된 방법을 들 수 있으며, 샌드위치법이나 경합법에 의해 목적하는 항원 또는 항체를 측정할 수 있다. 또한, 상기 방법의 표지 물질인 동위 원소, 효소 등 대신에, 자성체 내포 입자를 표지로서 사용할 수 있다. 본 발명의 자성체 내포 입자는 자성체를 균일하게 분산 함유하는 입경 분포가 좁은 입자이기 때문에, 면역 측정 방법에서 표지로서 사용함으로써 양호한 감도로 정밀한 측정을 행할 수 있다.
본 발명의 자성체 내포 입자를 표지로서 사용하는 면역 측정 방법의 구체예로서는, 종래부터 형광 물질, 착색 입자, 금속 콜로이드 등이 표지로서 사용되어 온 면역 측정 방법을 들 수 있다. 그 중에서도, 최근 간편하고 신속하게 피검출 물질을 검출하는 방법으로서 자주 이용되고 있는 면역 크로마토법이 바람직하다. 상기 면역 크로마토법은 2종 이상의 항체를 사용한 샌드위치법을 이용하고 있다. 상기 샌드위치법에 있어서, 한쪽 항체는 액상 중에서 이동 가능한 상태로 표지되고, 다른쪽 항체는 크로마토 담체에 영구적으로 고정화되어 있다. 상기 샌드위치법의 시약에 시료를 첨가하면, 우선 표지된 항체와 피검출 물질이 반응하고, 그 후 표지 항체와 피검출 물질의 복합체가 크로마토 담체를 통해 이동하며, 크로마토 담체에 항체가 고정화된 고정화부에 오면, 거기에서 고정화된 항체에 트래핑된다. 통상적으로 면역 크로마토법에 사용되는 크로마토 담체는 포어 크기가 5 내지 20 ㎛이고, 현재 일반적인 샌드위치법은 표지로서 금속 콜로이드나 착색 입자가 사용되며, 고정화부의 착색(표지물의 포착 상태)을 육안으로 관찰하는 정성 검사로서 이용되고 있다.
그러나, 시판되고 있는 자성체 내포 입자는 크로마토 담체 중에 체류하거나, 전개시키는 측의 크로마토 선단 부위 부근에 불균일하게 잔류하기도 하는 등의 문제점을 가지며, 금속 콜로이드나 착색 입자에 비하여 크로마토 전개성이 크게 떨어지기 때문에 면역 크로마토법에 대한 적합성이 없다.
이에 대하여, 본 발명의 자성체 내포 입자는 포어 크기에 비하여 충분히 작은 입경이기 때문에, 모세관 현상으로 크로마토 담체 안을 전개(이동)할 수 있다. 즉, 본 발명의 자성체 내포 입자는 평균적인 포어 크기(10 내지 12 ㎛)의 크로마토 담체에 전개했을 경우, 상술한 바와 같은 불균일한 체류가 확인되지 않으며, 크로마토 전개성이 매우 우수하다. 이것은 본 발명의 자성체 내포 입자는, 1) 입도 분포가 좁고, 2) 자성체 함유량이 균일하며, 3) 잔류 자기에 의한 자기(自己) 응집이 발생하지 않기 때문이라고 추측된다. 즉, 본 발명의 자성체 내포 입자는, 종래의 자성체 내포 입자와 달리 면역 크로마토법에 대한 적합성을 갖고 있다.
본 발명은 상기 과제를 감안하여 균일한 자성을 갖고, 분산 안정성이 우수하며, 입경 분포가 좁은 자성체 내포 입자 및 그의 제조 방법, 그것을 이용하여 이루어지는 면역 측정용 입자, 및 이들 자성체 내포 입자 또는 면역 측정용 입자를 사용하는 면역 측정 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 유기 고분자 물질과 평균 입경이 1 내지 30 nm인 자성체를 포함하는 자성체 내포 입자이며, 상기 자성체는 분산된 상태로 입자 내부에 함유되어 있는 자성체 내포 입자이다.
본 발명의 자성체 내포 입자에 있어서, 유기 고분자 물질을 구성하는 탄소 원소와 자성체를 구성하는 금속 원소의 구성 비율의 절대 편차가 0.3 이하인 것이 바람직하다.
본 발명의 자성체 내포 입자에 있어서, 자성체는 자성체 내포 입자를 형성하는 중합 과정에서 금속 이온이 입자 내부에서 산화하여 형성된 것인 것이 바람직하다. 또한, 상기 금속 이온은 철 이온인 것이 바람직하다.
본 발명의 자성체 내포 입자에 있어서, 상기 유기 고분자 물질은 아크릴계 단량체를 포함하는 중합체를 주 구성 성분으로 하는 것이 바람직하며, 상기 아크릴계 단량체는 글리시딜기를 갖는 단량체인 것이 바람직하다.
또한, 상기 유기 고분자 물질은, 글리시딜기를 갖는 단량체와 스티렌계 단량체를 포함하는 중합체를 주 구성 성분으로 하는 것도 바람직하다. 이 경우, 상기 유기 고분자 물질 중의 스티렌계 단량체로부터 유래하는 단량체 단위의 비율은 5 내지 90 중량％인 것이 바람직하다.
또한, 상기 유기 고분자 물질은 하기 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 (메트)아크릴레이트 또는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 중합체의 단량체 성분으로서 갖는 것도 바람직하다. 특히, 글리시딜기를 갖는 단량체, 또는 글리시딜기를 갖는 단량체 및 스티렌계 단량체에 공중합 성분으로서 첨가되는 것이 바람직하다.
CH2=CR-COO-(CH2-CH2-O)n-H
(식 중, R은 H 또는 CH3을 나타내고, n은 1 내지 20의 정수를 나타낸다.)
(식 중, X는 H 또는 SO3 -NH4 +를 나타내고, n은 3 내지 30의 정수를 나타낸다.)
본 발명의 자성체 내포 입자에 있어서, 상기 유기 고분자 물질은 가교되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 자성체 내포 입자는, 입자 표면에 카르복실기, 수산기, 에폭시기, 아미노기, 트리에틸암모늄기, 디메틸아미노기 및 술폰산기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 관능기를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 자성체 내포 입자는 평균 입경이 0.05 내지 1 ㎛인 것이 바람직하다.
본 발명의 자성체 내포 입자에 있어서, 자성체의 함유량은 0.1 내지 50 중량％인 것이 바람직하다.
본 발명의 자성체 내포 입자가 함유하는 자성체의 평균 입경은 1 내지 10 nm인 것이 바람직하다.
본 발명의 자성체 내포 입자는, 입자 표면에 항원 또는 항체와 공유 결합이 가능한 관능기를 갖는 링커(linker)가 결합되어 있는 것이 바람직하다. 상기 관능기는 에폭시기인 것이 바람직하며, 상기 링커는 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜에테르인 것이 바람직하다.
본 발명의 자성체 내포 입자는 수계 용매 중에서 친수기를 갖지 않는 단량체 및(또는) 친수기를 갖는 단량체를 중합하여 입자를 형성하는 공정, 및 상기 입자 중에 금속 이온을 취입하면서 상기 금속 이온을 산화하여 자성체를 형성하는 공정을 포함하고, 상기 입자를 형성하는 공정과 자성체를 형성하는 공정을 동시에 진행시키는 방법에 의해 제조할 수 있다.
상기 친수기를 갖지 않는 단량체는 글리시딜기를 갖는 아크릴계 단량체, 또는 글리시딜기를 갖는 아크릴계 단량체 및 스티렌계 단량체인 것이 바람직하다. 또한, 친수기를 갖지 않는 단량체 및 친수기를 갖는 단량체를 중합하여 입자를 형성하는 것도 바람직하며, 친수기를 갖는 단량체는 하기 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 (메트)아크릴레이트 또는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 것이 바람직하다.
<화학식 1>
CH2=CR-COO-(CH2-CH2-O)n-H
(식 중, R은 H 또는 CH3을 나타내고, n은 1 내지 20의 정수를 나타낸다.)
<화학식 2>
(식 중, X는 H 또는 SO3 -NH4 +를 나타내고, n은 3 내지 30의 정수를 나타낸다.)
또한, 상기 입자를 형성하는 공정에서는, 공중합 단량체로서 반응성 유화제를 첨가할 수도 있다. 또한, 중합 개시제를 후첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명의 자성체 내포 입자에 항원 또는 항체가 흡착 또는 결합되어 이루어지는 면역 측정용 입자도, 또한 본 발명 중 하나이다.
또한, 본 발명의 자성체 내포 입자 또는 면역 측정용 입자를 사용하는 면역 측정 방법도 본 발명 중 하나이다.
또한, 본 발명의 자성체 내포 입자를 표지로서 사용하는 면역 측정 방법도 본 발명 중 하나이다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1 내지 7>
200 mL의 사구 플라스크에 하기 표 1에 나타낸 각종 단량체 및 물 90 g을 칭량하였다. 각각의 구에는 교반 밀봉부와 교반 막대, 환류 냉각관, 세럼(CERAM) 고무를 부착하였다. 계를 70 ℃의 항온조에 넣어 200 rpm으로 교반하면서 계 내를 30 분간 질소 치환하였다. 그 후, 물에 용해된 중합 개시제인 KPS 0.06 g을 10 g의 물에 용해하고 주사기로 계 내에 주입하였다. 이 시점을 중합 개시 시점으로 하고, 적절한 산화력을 얻기 위해 중합 도중에 NH4OH 수용액(NH4OH 0.165 g을 물 5 g에 용해)을 첨가하였다. 또한, 중합 개시로부터 2 분 후에 주사기를 이용하여 FeCl2ㆍ4H2O 수용액(FeCl2ㆍ4H2O 0.165 g을 물 5 g에 용해)을 주입하였다. 중합은 중합 개시로부터 20 시간 행하였다.
제조한 입자를 원심 분리ㆍ재분산을 증류수로 4회 반복적으로 행함으로써 정제하였다. 이 때, 원심 분리는 20 ℃, 13500 rpm으로 행하였다. 원심 분리를 행한 후, 상청액을 따라내어 버리고, 증류수를 첨가하여 유리 막대에 의해 재분산을 행하여 자성체 내포 입자를 수득하였다.
실시예 GMA EGDM AAm PE-90 PE-350 NE-20 SE-20 FeCl2ㆍ4H2O
1 2.835 0.015 0.15 - - - - 0.088
2 2.835 0.015 - 0.15 - - - 0.176
3 2.685 0.015 - 0.3 - - - 0.176
4 2.835 0.015 - - 0.15 - - 0.176
5 2.685 0.015 - - 0.3 - - 0.176
6 2.835 0.015 0.05 - - 0.15 - 0.088
7 2.835 0.015 0.15 - - - 0.06 0.176
(단위: g)
표 중의 기재는 하기와 같다.
GMA: 글리시딜 메타크릴레이트
EGDM: 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트
AAm: 아크릴 아미드
PE-90: 폴리에틸렌글리콜 메타크릴레이트(n=2)
PE-350: 폴리에틸렌글리콜 메타크릴레이트(n=8)
NE-20:
(식 중, X는 H를 나타낸다.)
SE-20:
(식 중, X는 SO4NH4를 나타낸다.)
수득한 자성체 내포 입자 분산액에 대하여, 육안으로 입자의 분산 상태를 관찰하였다. 또한, 정제한 자성체 내포 입자를 물로 희석하고, 금속 메쉬로 지지한 콜로디온막 상에 침착 고정하여 투과형 전자 현미경(TEM)에 의해 입자의 형태를 관찰하였다.
실시예 1에서 수득한 자성체 내포 입자는 일부 응집 덩어리가 확인되고, 시간이 경과함에 따라 자성체 내포 입자가 침강하는 분산 안정성이 약간 낮은 것이었기 때문에 초음파 처리에 의해 재분산시켰다. 한편, 친수기를 갖는 단량체로서 폴리에틸렌글리콜 메타크릴레이트를 사용한 실시예 2 내지 5, 및 반응성 유화제를 사용한 실시예 6, 7은 모두 응집 덩어리가 확인되지 않고, 분산 안정성이 높은 자성체 내포 입자를 수득할 수 있었다. 특히, 반응성 유화제를 사용한 실시예 6, 7에서 수득한 자성체 내포 입자는 입자 크기가 작고, 분산 안정성이 우수한 것임이 확인되었다. 또한, 실시예 1 내지 7에서 수득한 자성체 내포 입자는, 모두 자성체 내포 입자 내부에 자성체를 분산 상태로 포함하며, 입자 표면이 깨끗한 윤곽을 갖는 것이 관찰되었다. 도 1에 실시예 2의 자성체 내포 입자의 TEM 사진(평균 입경; 자성체 내포 입자 0.21 ㎛, 자성체 5 nm)을 나타내었다. 또한, 실시예 1 내지 7에서의 자성체 내포 입자의 자성체 평균 입경을 하기 표 2에 나타내었다.
실시예 평균입경 (nm)
1 5
2 5
3 6
4 6
5 8
6 3
7 5
또한, 실시예 1 내지 7에서 제조한 자성체 내포 입자가 자석에 이끌려지는 것을 확인하기 위해, 1.5 mL의 마이크로 튜브에 자성체 내포 입자의 분산액을 소량 취하고, 증류수로 적당하게 희석하여 자석이 부착된 마이크로 튜브 세움 장치[다이날(DYNAL)사 제조, MPC(등록 상표)-M]에 튜브를 세워 분산되어 있는 자성체 내포 입자가 자석에 이끌려지는 것을 육안으로 확인하였다. 특히, 친수기를 갖는 단량체로서 폴리에틸렌글리콜 메타크릴레이트를 사용한 실시예 2 내지 5는, 다른 실시예 1, 6, 7에 비하여 자력이 큰 것을 알 수 있었다.
<실시예 8>
200 mL의 사구 플라스크에 하기에 나타낸 각종 단량체 및 물을 칭량하였다.
GMA/EGDM/AAm/H2O=2.835/0.015/0.15/90(단위: g)
각각의 구에는 교반 밀봉부와 교반 막대, 환류 냉각관, 세럼 고무를 부착하였다. 계를 70 ℃의 항온조에 넣어 200 rpm으로 교반하면서 계 내를 30 분간 질소 치환하였다. 그 후, 물에 용해된 중합 개시제인 KPS 0.06 g을 10 g의 물에 용해하고 주사기로 계 내에 주입하였다. 이 시점을 중합 개시 시점으로 하고, 중합 개시 1 분 후에 적절한 산화력을 얻기 위해 NH4OH 수용액(NH4OH 0.165 g을 물 5 g에 용해)을 첨가하였다. 또한, 중합 개시로부터 2 분 후에 주사기를 이용하여 FeCl2ㆍ4H2O 수용액(FeCl2ㆍ4H2O 0.165 g을 물 5 g에 용해)을 주입하였다. 중합은 중합 개시로부터 2 시간 행하였다.
제조한 입자를 원심 분리ㆍ재분산을 증류수로 4회 반복적으로 행함으로써 정제하였다. 이 때, 원심 분리는 20 ℃, 13500 rpm으로 행하였다. 원심 분리를 행한 후, 상청액을 따라내어 버리고, 증류수를 첨가하여 유리 막대에 의해 재분산을 행하여 자성체 내포 입자를 수득하였다.
<실시예 9>
중합 개시 후, 하기 물질의 첨가를 이하의 소정 시간으로 변경하고, 중합 시간을 중합 개시로부터 3 시간으로 한 것 이외에는 실시예 8과 동일하게 하여 자성체 내포 입자를 수득하였다.
NH4OH 수용액(NH4OH 0.165 g을 물 5 g에 용해): 중합 개시 30 분 후
KPS(KPS 0.165 g을 물 5 g에 용해): 중합 개시 60 분 후
<실시예 10>
중합 개시 후, 하기 물질의 첨가를 이하의 소정 시간으로 변경하고, GMA를 추가로 후첨가하며, 중합 시간을 중합 개시로부터 3 시간으로 한 것 이외에는 실시예 8과 동일하게 하여 자성체 내포 입자를 수득하였다.
KPS(KPS 0.165 g을 물 5 g에 용해): 중합 개시 60 분 후
FeCl2ㆍ4H2O 수용액(FeCl2ㆍ4H2O 0.165 g을 물 5 g에 용해): 중합 개시 60 분 후
GMA 0.5 g: 중합 개시 120 분 후(또한, 중합 개시 전에는 실시예 8과 동일하게 GMA 2.835 g을 사구 플라스크에 첨가하였음)
NH4OH 수용액(NH4OH 0.165 g을 물 5 g에 용해): 중합 개시 120 분 후
<실시예 11>
중합 개시 후, 하기 물질의 첨가를 이하의 소정 시간으로 변경하고, 중합 시간을 중합 개시로부터 4 시간으로 한 것 이외에는 실시예 8과 동일하게 하여 자성체 내포 입자를 수득하였다.
중합 개시 1 분 후 NH4OH/H2O=0.165/5(g)
NH4OH 수용액(NH4OH 0.165 g을 물 5 g에 용해): 중합 개시 1 분 후
KPS(KPS 0.165 g을 물 5 g에 용해): 중합 개시 120 분 후
실시예 8 내지 11에서 수득한 자성체 내포 입자에 대하여, 실시예 1과 동일하게 하여 TEM에 의한 자성체 내포 입자의 형태 관찰을 행하였다.
실시예 9, 10은 모두 실시예 8보다 많은 자성체를 포함하며, 입경이 증대되어 있는 것이 확인되었다. 또한, 실시예 11에서는 내부에 실시예 9, 10과 동일한 정도의 자성체를 포함하고, 입자 표면이 깨끗한 윤곽을 갖는 것이 관찰되었다.
이제까지의 실험으로부터, 입자 성장의 초기 단계에서 NH4OH를 첨가하는 것은 성장을 저해하는 요인이 된다는 것으로 추측되었다. 한편, 중합 개시제의 후첨가는 중합률이 거의 100 ％가 되며, 또한 2차 입자가 형성되지 않고 입자 표면이 중합체로 피복되어 있는 것이 관찰되어 유효한 수단인 것이 확인되었다. 실시예 8 내지 11에서의 자성체 내포 입자의 자성체의 평균 입경을 하기 표 3에 나타내었다.
실시예 평균입경 (nm)
8 8
9 8
10 10
11 8
<실시예 12>
실시예 2에서 수득한 자성체 내포 입자 1.0 g을 10 ％ 암모니아수 50 mL에 투입하고, 70 ℃에서 20 시간 교반하였다. 이어서, 이온 교환수를 이용하여 원심 세정을 3회 행하고, 50 mL의 이온 교환수에 분산시켰다. 이어서, 에틸렌글리콜 디글리시딜에테르 30 g을 첨가 혼합하고, 수산화나트륨 수용액을 이용하여 pH를 11로 조정한 후, 실온에서 24 시간 교반하였다. 반응 후, 이온 교환수를 이용하여 원심 세정을 3회 행하여, 에폭시기를 갖는 링커가 결합된 자성체 내포 입자를 수득하였다.
<실시예 13>
200 mL의 사구 플라스크에 스티렌 3.0 g, 글리시딜 메타크릴레이트 3.0 g, 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트 0.03 g, 폴리에틸렌글리콜 메타크릴레이트 0.3 g 및 물 200 g을 칭량하였다. 각각의 구에는 교반 밀봉부와 교반 막대, 환류 냉각관, 세럼 고무를 부착하였다. 계를 70 ℃의 항온조에 넣어 200 rpm으로 교반하면서 계 내를 30 분간 질소 치환하였다. 그 후, 물에 용해된 중합 개시제인 KPS 0.1 g을 20 g의 물에 용해하고 주사기로 계 내에 주입하였다. 이 시점을 중합 개시 시점으로 하고, 2 분 후에 주사기를 이용하여 FeCl2ㆍ4H2O 수용액(FeCl2ㆍ4H2O 0.2 g을 물 20 mL에 용해)을 주입하였다. 적절한 산화력을 얻기 위해 중합 도중에 NH4OH 0.4 g을 첨가하였다. 중합은 중합 개시로부터 20 시간 행하였다.
제조한 입자를 원심 분리ㆍ재분산을 증류수로 4회 반복적으로 행함으로써 정제하였다. 이 때, 원심 분리는 20 ℃, 13500 rpm으로 행하였다. 원심 분리를 행한 후, 상청액을 따라내어 버리고, 증류수를 첨가하여 유리 막대에 의해 재분산을 행하여 자성체 내포 입자를 수득하였다.
<실시예 14>
스티렌 2.0 g, 글리시딜 메타크릴레이트 4.0 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 13과 동일하게 하여 자성체 내포 입자를 제조하였다.
<실시예 15>
스티렌 4.0 g, 글리시딜 메타크릴레이트 1.0 g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 13과 동일하게 하여 자성체 내포 입자를 제조하였다.
<실시예 16>
실시예 13에서 제조한 자성체 내포 입자 1.0 g을 10 ％ 암모니아수 50 mL에 투입하고, 70 ℃에서 20 시간 교반하였다. 이어서, 이온 교환수를 이용하여 원심세정을 3회 행하고, 50 mL의 이온 교환수에 분산시켰다. 이어서, 에틸렌글리콜 디글리시딜에테르 30 g을 첨가 혼합하고, 수산화나트륨 수용액을 이용하여 pH를 11로 조정한 후, 실온에서 24 시간 교반하였다. 반응 후, 이온 교환수를 이용하여 원심 세정을 3회 행하여, 에폭시기를 갖는 링커가 결합된 자성체 내포 입자를 수득하였다.
<실시예 17 및 18>
2000 mL의 사구 플라스크에 하기 표 4에 나타낸 각종 단량체 및 물 800 g을 칭량하였다. 각각의 구에는 교반 밀봉부와 교반 막대, 환류 냉각관, 세럼 고무를 부착하였다. 계를 70 ℃의 항온조에 넣어 200 rpm으로 교반하면서 계 내를 30 분간 질소 치환하였다. 그 후, 물에 용해된 중합 개시제인 과황산암모늄 0.2 g을 10 g의 물에 용해하고 주사기로 계 내에 주입하였다. 이 시점을 중합 개시 시점으로 하고, 적절한 산화력을 얻기 위해 중합 도중에 NH4OH 수용액(NH4OH 0.5 g을 물 10 g에 용해)을 첨가하였다. 또한, 중합 개시로부터 2 분 후에 주사기를 이용하여 FeSO4ㆍ7H2O 수용액(FeSO4ㆍ7H2O 1.3 g을 물 20 g에 용해)을 주입하였다. 중합은 중합 개시로부터 20 시간 행하였다.
제조한 입자를 원심 분리ㆍ재분산을 증류수로 4회 반복적으로 행함으로써 정제하였다. 이 때, 원심 분리는 20 ℃, 13500 rpm으로 행하였다. 원심 분리를 행한 후, 상청액을 따라내어 버리고, 증류수를 첨가하여 유리 막대에 의해 재분산을 행하여 자성체 내포 입자를 수득하였다.
실시예 GMA EGDM St MMA HS-10
17 25.6 1.2 2.0 - 0.8
18 22.7 1.2 2.0 2.0 0.8
(단위: g)
표 중의 기재는 하기와 같다.
GMA: 글리시딜 메타크릴레이트
EGDM: 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트
St: 스티렌
MMA: 메틸 메타크릴레이트
HS-10:
(식 중, X는 SO3 -NH4 +를 나타내고, n은 10을 나타낸다.)
<실시예 19>
실시예 17에서 수득한 자성체 내포 입자 1.0 g을 10 ％ 암모니아수 50 mL에 투입하고, 70 ℃에서 20 시간 교반하였다. 이어서, 이온 교환수를 이용하여 원심세정을 3회 행하고, 50 mL의 이온 교환수에 분산시켰다. 이어서, 에틸렌글리콜 디글리시딜에테르 30 g을 첨가 혼합하고, 수산화나트륨 수용액을 이용하여 pH를 11로 조정한 후, 실온에서 24 시간 교반하였다. 반응 후, 이온 교환수를 이용하여 원심세정을 3회 행하여, 에폭시기를 갖는 링커가 결합된 자성체 내포 입자를 수득하였다.
<실시예 20>
실시예 2에서 수득한 자성체 내포 입자로부터 면역 측정용 입자를 제조하였다.
실시예 2에서 수득한 자성체 내포 입자 30 mg에 인산 완충액(100 mmol/L, pH 7.5) 6 mL를 첨가하고, 15000 rpm으로 20 분간 원심 분리하였다. 수득한 잔사에 항 HBsAg 모노클로날 항체를 0.25 mg/mL의 농도가 되도록 인산 완충액(100 mmol/L, pH 7.5)에 용해한 용액을 1 mL 첨가하고, 실온에서 20 시간 교반 혼화하였다. 그 후, 미반응의 항 HBsAg 모노클로날 항체를 제거하기 위해 15000 rpm으로 20 분간 원심 분리하고, 추가로, 수득한 잔사를 인산 완충액(100 mmol/L, pH 7.5) 6 mL에 현탁시켜 다시 15000 rpm으로 20 분간 원심 분리하였다. 그 후, 수득한 잔사를, 소 혈청 알부민을 1 중량％의 농도가 되도록 인산 완충액(100 mmol/L, pH 7.5)에 용해한 용액 6 mL에 현탁시키고, 실온에서 1 시간 교반하여 블록킹 처리를 행함으로써 항 HBsAg 모노클로날 항체가 자성체 내포 입자에 결합된 면역 측정용 입자를 수득하였다.
이어서, 수득한 면역 측정용 입자를 냉장 보존하기 위해 15000 rpm으로 20 분간 원심 분리하고, 수득한 잔사를, 소 혈청 알부민을 농도가 1 중량％가 되도록 인산 완충액(100 mmol/L, pH 7.5)에 용해하고, 추가로 아지드화 나트륨을 0.01 중량％의 농도가 되도록 용해한 용액 6 mL에 현탁시켜 곧 바로 냉장 보존하였다.
<실시예 21, 22 및 23>
실시예 12, 16 및 19에서 수득한 링커가 결합된 자성체 내포 입자로부터 면역 측정용 입자를 제조하였다.
실시예 12, 16 및 19에서 제조한 링커가 결합된 자성체 내포 입자 12 mg에 0.1 M 붕산 완충액 1 mL를 첨가하고, 15000 rpm으로 10 분간 원심 분리하여 상청액을 제거하였다. 수득한 잔사에 0.1 M 붕산 완충제 380 μL, 항 α-hCG 모노클로날 항체 용액(5.0 mg/mL) 20 μL를 첨가하고, 충분히 혼화하여 실온에서 20 시간 교반하였다. 반응액은 15000 rpm으로 10 분간 원심 분리하고, 미반응의 항 α-hCG 모노클로날 항체를 제거하였다. 또한, 자성체 내포 입자로의 항 α-hCG 모노클로날 항체의 결합량은, 상청인 단백질 농도의 측정으로부터 투입량의 55 ％인 것을 확인하였다. 수득한 잔사는 100 mM 인산 완충액(pH 7.5) 1 mL에 현탁시키고, 다시 원심 분리하였다. 상기 잔사를, 100 mM 인산 완충액(pH 7.5)에 소 혈청 알부민을 5 ％(w/v)의 농도가 되도록 용해한 용액 900 μL에 현탁시키고, 37 ℃에서 1 시간 교반하여 블록킹 처리하였다. 그 후, 15000 rpm으로 20 분간 원심 분리하고, 잔사에 0.1 M 붕산 완충액 1 mL를 첨가하여 초음파로 분산시켰다. 이어서, 100 mM 인산 완충액(pH 7.5)에 소 혈청 알부민 및 글리세롤을 각각 5 ％(w/v)의 농도가 되도록 용해하고, 추가로 아지드화 나트륨을 0.01 ％(w/v)의 농도가 되도록 용해한 용액 1 mL에 현탁시켜 면역 측정용 입자를 수득하였다.
<비교예 1 내지 3>
비교예로서 에스타폴(Estapor) M1-030/40(머크사 제조)의 3 로트를 사용하였다.
<비교예 4>
비교예 1의 자성체 내포 입자로부터 면역 측정용 입자를 제조하였다.
비교예 1의 자성체 내포 입자 12.5 mg에 pH 9.5의 수산화칼륨 수용액 1 mL를 첨가하고, 15000 rpm으로 10 분간 원심 분리한 후 상청을 제거하고, 분산액에 첨가되어 있는 계면활성제를 제거하였다. 이어서, 수득한 잔사에 0.02 M의 인산 완충액 625 μL 및 미리 조정한 2 ％ 농도의 카르보디이미드 용액(PBS 완충액) 0.625 mL를 첨가하고, 37 ℃의 항온조 중에서 1.5 시간 교반하였다. 반응 용액을 15000 rpm으로 10 분간 원심 분리하여 상청을 제거한 후, 0.02 M 인산 완충액 1.2 mL를 첨가하여 초음파로 재분산시켰다. 상술한 원심 세정 조작을 3회 반복하여 미반응의 카르보디이미드를 제거하였다. 이어서, 수득한 잔사에 0.1 M 붕산 완충액 1.2 mL를 첨가하고, 항 α-hCG 모노클로날 항체 200 ㎍를 첨가하여 37 ℃의 항온조 중에서 하룻밤 교반하였다. 다음날, 반응 용액에 30 mM 글리신 용액(붕산 완충액) 50 μL를 첨가하고, 37 ℃의 항온조 중에서 30 분간 교반하였다. 그 후, 15000 rpm으로 10 분간 원심 분리하여 미반응의 항 α-hCG 모노클로날 항체를 제거하였다. 또한, 자성체 내포 입자로의 항 α-hCG 모노클로날 항체의 결합량은, 상청의 단백질 농도의 측정으로부터 투입량의 63 ％인 것을 확인하였다. 수득한 잔사는 100 mM 인산 완충액(pH 6.5) 1 mL에 현탁시켜 다시 원심 분리하였다. 수득한 잔사는, 소 혈청 알부민이 1 ％(w/v) 농도가 되도록 조정한 100 mM 인산 완충액(pH 6.5) 1 mL에 현탁시키고, 37 ℃의 항온조에서 30 분간 교반하여 블록킹 처리하였다. 그 후, 15000 rpm으로 10 분간 원심 분리하고, 그 잔사를 소 혈청 알부민 및 글리세롤을 각각 5 ％(w/v), 아지드화 나트륨을 0.01 ％(w/v) 농도가 되도록 조정한 100 mM 인산 완충액(pH 7.5) 1 mL에 분산시켜 면역 측정용 입자를 수득하였다.
<평가>
(1) 분산 안정성의 평가
실시예 13 내지 18에서 수득한 자성체 내포 입자 및 비교예 1 내지 3의 자성체 내포 입자를 사용하여 고형분 1 ％의 분산액을 제조하고, 초음파 분산 후 정치하여 침강 입자의 발생을 육안으로 관찰하였다. 비교예 1 내지 3의 자성체 내포 입자를 사용한 경우에는 분산 직후에 일부 침강이 확인되었다. 또한, 정치한 다음날에는 샘플병의 바닥면에 침강층이 형성되어 있어 분산 안정성이 불량한 것을 알 수 있었다. 한편, 실시예 13 내지 18의 자성체 내포 입자에서는 정치한 다음날에도 침강물은 확인되지 않아 분산 안정성이 우수한 것이 밝혀졌다.
(2) 입자 형상의 평가
실시예 13 내지 18에서 수득한 자성체 내포 입자 및 비교예 1 내지 3의 자성체 내포 입자를 물로 희석하고, 금속 메쉬로 지지한 콜로디온막 상에 침착 고정하여 투과형 전자 현미경(TEM)에 의해 입자의 형태를 관찰하였다.
TEM으로 관찰된 자성체 내포 입자와 자성체의 평균 입경을 하기 표 5에 나타내었다.
평균 입경 (nm)
자성체 내포 입자 자성체
실시예 13 230 5
실시예 14 190 6
실시예 15 320 4
실시예 16 230 5
실시예 17 115 6
실시예 18 100 8
비교예 1 370 20
비교예 2 410 21
비교예 3 520 24
표 5로부터, 실시예 13, 14, 15 및 16에서 수득한 자성체 내포 입자는 모두 균일한 입경의 구형 입자이며, 자성체를 내포하고 있는 것이 관찰되었다. 한편, 비교예 1 내지 3에서는, 모두 입경이 100 내지 1000 ㎛인 자성체 내포 입자가 혼재되어 있어 불균일하였다. 또한, 비교예 1 내지 3에서는, 모두 자성체 내포 입자 표면에 자성체가 노출되어 있는 것이 확인되었다.
또한, 제조한 자성체 내포 입자(실시예 13, 14, 15 및 16)가 자석에 이끌려지는 것을 확인하기 위해, 1.5 mL의 마이크로 튜브에 자성체 내포 입자의 분산액을 소량 취하고, 증류수로 적당하게 희석하여 자석이 부착된 마이크로 튜브 세움 장치[다이날사 제조, MPC(등록 상표)-M]에 튜브를 세워 분산되어 있는 자성체 내포 입자가 자석에 이끌려지는 것을 시각적으로 확인하였다.
(3) 자성체 함유량 변동의 평가
입자 분석기(DP-1000, 호리바 세이사꾸쇼 제조)를 이용하여, 실시예 15 내지 18 및 비교예 1 내지 3의 자성체 내포 입자에 대하여, 유기 고분자 물질을 구성하는 탄소 원소와 자성체를 구성하는 철 원소의 동기 발광을 측정하고, 그 측정 데이타의 편차값을 산출하였다. 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
시료 편차값
실시예 15 0.1160
16 0.1198
17 0.2504
18 0.2417
비교예 1 0.3451
2 0.2843
3 0.3988
실시예 및 비교예의 자성체 내포 입자의 편차값을 비교하면, 실시예 15 내지 18의 자성체 내포 입자의 편차값은 작기 때문에, 자성체 함유량의 변동이 작은 것을 알 수 있다. 한편, 비교예 1 내지 3의 자성체 내포 입자는 편차값이 커서 자성체 함유량의 변동이 큰 것을 알 수 있다.
(4) 크로마토 전개성의 평가 1
(4)-1 크로마토 전개성의 확인
실시예 21, 22 및 비교예 4의 면역 측정용 입자를 고형분 0.045 ％(w/v)가 되도록, 소 혈청 알부민 1 ％(w/v) 및 트리톤-100 0.03 ％(w/v) 농도가 되도록 조정한 생리 식염수에 분산시켰다. 각각의 분산액 30 μL를 포어 크기 10 내지 12 ㎛의 니트로셀룰로오스 멤브레인(SRHF P70, 닛본 밀리포어사 제조)에 스폿하고, 원형상으로 분산액을 전개시켰다. 전개한 분산액은 모두 직경이 약 18 mm인 원 형상이었다. 그 후, 건조시켜 자성체 내포 입자의 전개에 의해 착색된 원형의 직경을 계측하였다. 결과는 실시예 18의 면역 측정용 입자를 사용한 경우에는 16 mm이고, 실시예 19의 면역 측정용 입자를 사용한 경우에는 17 mm이며, 비교예 4의 면역 측정용 입자를 사용한 경우에는 12 mm였다.
실시예 21, 22에 있어서는, 면역 측정용 입자의 전개 영역이 매체의 전개 영역의 약 92 ％였기 때문에, 크로마토 담체 중에서 전개 매체와 함께 원활하게 전개된다는 것을 알았다. 한편, 비교예 4에서는 상기 전개 영역이 약 70 ％였기 때문에, 실시예 21, 22와 비교하면 전개성이 떨어졌다. 또한, 비교예 4에서는 스폿 중심부 부근의 착색이 짙어 불균일한 전개인 것을 알 수 있었다.
(4)-2 시험편의 제조
니트로셀룰로오스 멤브레인(SRHF P70, 닛본 밀리포어사 제조)을 폭 20 cm×길이 6 cm로 재단하고, 그 길이 방향 상단으로부터 3 cm 부위(반응 부위)에, 항 β-hCG 모노클로날 항체를 2.0 mg/mL의 농도가 되도록 트리스 염산 완충액(10 mmol/L, pH 7.4)에 용해한 용액을 폭 0.7 mm의 직선상(狀)으로 도포하였다. 그 후, 37 ℃에서 2 시간 건조한 후, 소 혈청 알부민(와꼬 쥰야꾸 고교사 제조)을 1 중량％의 농도가 되도록 인산 완충액(100 mmol/L, pH 7.5)에 용해한 용액에 1 시간 침지하여 블록킹 처리하였다. 또한, 그 후 라우릴벤젠술폰산 나트륨을 0.1 중량％의 농도가 되 도록 인산 완충액(100 mmol/L, pH 7.5)에 용해한 용액으로 세정한 후, 실리카 겔 건조기 내에서 실온하에 건조하여 항 β-hCG 모노클로날 항체를 고정화한 시험편을 수득하였다.
수득한 시험편을 폭 5 mm로 재단하고, 길이 방향 상단에 폭 5 mm×길이 20 mm의 흡수 패드(AP22 닛본 밀리포어사 제조)를, 하단에 폭 5 mm×길이 15 mm의 콘쥬게이트 패드(유리 섬유, 닛본 밀리포어사 제조)를 겹치고, 투명한 테이프로 고정하여 시험편으로 하였다.
(4)-3 면역 측정의 실시
실시예 21 내지 23 및 비교예 4의 면역 측정용 입자를 0.05 ％(w/v)의 농도가 되도록, 소 혈청 알부민 1 ％(w/v), 트리톤-100 0.03 ％(w/v) 및 hCG가 0 mIU/mL, 25 mIU/mL, 100 mIU/mL, 1000 mIU/mL 및 5000 mIU/mL 농도가 되도록 시험액을 조정한 생리 식염수에 분산시켰다.
이어서, 제조한 시험편의 콘쥬게이트 패드에 hCG가 소정 농도인 시험액 100 μL를 각각 적가하였다.
적가 10 분 후, 실시예 21 내지 23의 면역 측정용 입자를 사용한 경우에는, hCG가 0 mIU/mL인 것을 제외한 시험편은 반응 부위에 있어서 면역 측정용 입자에 기초한 착색이 확인되었다. 또한, 그 착색 정도는 hCG 농도에 의존하는 것이 확인되었다. 또한, 반응 부위에 있어서 hCG 농도에 따른 자성이 확인되고, 자성을 표지로 하는 면역 측정 방법에 유용하다는 것이 시사되었다.
한편, 비교예 4의 면역 측정용 입자를 사용한 경우에는, 어느 시험편이나 반응 부위 및 반응 부위까지의 부위에서 면역 측정용 입자에 기초한 착색이 확인되었다. 특히, 콘쥬게이트 패드를 겹친 부위 부근의 착색이 강하여 면역 측정용 입자가 체류되어 있는 것이 확인되었고, hCG가 1000 mIU/mL 이상인 것에서는 그 부위가 반응 부위보다 강하게 착색되어 있는 것이 확인되었다. 비교예 4의 면역 측정용 입자를 사용한 경우에는, 1) 시험편에 면역 측정용 입자가 체류하고, 2) 피검출 물질 농도에 따라 전개되는 면역 측정용 입자량이 변동하며, 3) 피검출 물질이 존재하지 않아도(hCG: 0 mIU/mL) 비특이적으로 반응 부위에 면역 측정용 입자가 포착되기 때문에, 자성을 표지로 하는 면역 측정 방법에는 적용할 수 없다는 것이 시사되었다.
(5) 크로마토 전개성의 평가 2
(5)-1 시험편의 제조
니트로셀룰로오스 멤브레인(SRHF, 닛본 밀리포어사 제조)을 폭 30 cm×길이 6 cm로 재단하고, 그 길이 방향 상단으로부터 3 cm 부위(반응 부위)에, 실시예 20의 면역 측정용 입자에서 사용한 것과는 다른 반응 동위 원소를 갖는 항 HBsAg 모노클로날 항체를 2.0 mg/mL의 농도가 되도록 트리스 염산 완충액(10 mmol/L, pH 7.4)에 용해한 용액을 폭 0.7 mm의 직선상으로 도포하였다. 그 후, 37 ℃에서 2 시간 건조한 후, 소 혈청 알부민(와꼬 쥰야꾸사 제조)을 1 중량％의 농도가 되도록 인산 완충액(100 mmol/L, pH 7.5)에 용해한 용액에 1 시간 침지하여 블록킹 처리하였다. 또한, 그 후 라우릴벤젠술폰산 나트륨을 0.1 중량％의 농도가 되도록 인산 완충액(100 mmol/L, pH 7.5)에 용해한 용액으로 세정한 후, 실리카 겔 건조기 내에서 실온하에 건조하여 항 HBsAg 모노클로날 항체 고정화막을 수득하였다.
수득한 항 HBsAg 모노클로날 항체 고정화막을 폭 5 mm로 재단하고, 길이 방향 상단에 폭 5 mm×길이 2 cm의 흡수용 여과지(닛본 밀리포어사 제조)를 겹치고, 투명한 테이프로 고정하여 시험편으로 하였다.
(5)-2 면역 측정의 실시
인산 완충액(100 mmol/L, pH 7.5)에 실시예 20의 면역 측정용 입자를 0.1 중량％의 농도가 되도록 용해하고, 추가로 소 혈청 알부민을 1 중량％의 농도가 되 도록 용해하며, 추가로 아지드화 나트륨을 0.01 중량％의 농도가 되도록 용해한 용액을 제조하고, 이 용액 20 μL를 96웰 마이크로 플레이트(날젠 눈크 인터내셔날사 제조)의 각 웰에 첨가하였다.
이어서, HBs 항원 표준품(50 IU/mL)을 소정의 농도가 되도록 인산 완충액(100 mmol/L, pH 7.5)으로 희석하고, 각각 100 μL를 웰에 첨가 혼합한 후, 시험편을 웰 내에 넣어 입위(立位)하도록 세웠다.
30 분 후, 시험편을 취출했더니 반응 부위에서 HBs 항원 농도에 따른 자성이 확인되어, 실시예 20의 면역 측정용 입자는 자성을 표지로 하는 면역 측정 방법에 유용하다는 것이 시사되었다.
본 발명에 따르면, 친수기를 갖지 않는 단량체와 친수기를 갖는 단량체를 공중합하여 입자를 형성하는 반응, 및 입자 내에 금속 이온을 취입하면서 금속 이온을 변성시켜 자성체를 형성하는 반응을 동시에 행함으로써, 균일한 자성을 갖고 입경 분포가 좁은 자성체 내포 입자를 수득할 수 있다. 본 발명의 자성체 내포 입자에 항원 또는 항체를 흡착 또는 결합시킴으로써, 본 발명의 면역 측정용 입자를 수득할 수 있다. 또한, 본 발명의 자성체 내포 입자 또는 면역 측정용 입자를 사용하여 면역 측정 방법을 행함으로써, 양호한 감도로 정밀한 측정이 가능해진다. 또한, 본 발명의 자성체 내포 입자를 표지로서 면역 측정 방법을 행함으로써, 양호한 감도로 정밀한 측정이 가능해진다.
또한, 본 발명의 자성체 내포 입자에 링커가 도입되어 있는 경우에는, 예를 들면, 자성체 내포 입자에 결합되는 항원, 항체, 시약 등의 반응성을 높일 수 있게 되고, 즉, 양호한 감도로 정밀한 측정이 가능해져, 본 발명의 자성체 내포 입자의 입자 표면이 단백질에 대하여 비흡착성인 것이라도, 링커가 단백질과의 결합성을 갖기 때문에 항원 또는 항체를 자성체 내포 입자에 확실하게 결합시킬 수 있게 된다.

Claims (26)

  1. 유기 고분자 물질과 평균 입경이 1 내지 30 nm인 자성체를 포함하며, 상기 자성체가 분산된 상태로 입자 내부에 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자.
  2. 제1항에 있어서, 유기 고분자 물질을 구성하는 탄소 원소와 자성체를 구성하는 금속 원소의 구성 비율의 절대 편차가 0.3 이하인 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자성체가, 자성체 내포 입자를 형성하는 중합 과정에서 금속 이온이 입자 내부에서 산화하여 형성된 것임을 특징으로 하는 자성체 내포 입자.
  4. 제3항에 있어서, 금속 이온이 철 이온인 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 고분자 물질이 아크릴계 단량체를 포함하는 중합체를 주 구성 성분으로 하는 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자.
  6. 제5항에 있어서, 아크릴계 단량체가 글리시딜기를 갖는 단량체인 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 고분자 물질이, 글리시딜기를 갖는 단량체와 스티렌계 단량체를 포함하는 중합체를 주 구성 성분으로 하는 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자.
  8. 제7항에 있어서, 유기 고분자 물질 중의 스티렌계 단량체로부터 유래하는 단량체 단위의 비율이 5 내지 90 중량％인 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 고분자 물질을 구성하는 중합체의 단량체 성분으로 추가로 하기 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트 또는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 갖는 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자.
    <화학식 1>
    CH2=CR-COO-(CH2-CH2-O)n-H
    (식 중, R은 H 또는 CH3을 나타내고, n은 1 내지 20의 정수를 나타낸다.)
    <화학식 2>
    (식 중, X는 H 또는 SO3 -NH4 +를 나타내고, n은 3 내지 30의 정수를 나타낸다.)
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 고분자 물질이 가교되어 있는 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 표면에 카르복실기, 수산기, 에폭시기, 아미노기, 트리에틸암모늄기, 디메틸아미노기 및 술폰산기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 관능기를 갖는 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 평균 입경이 0.05 내지 1 ㎛인 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 자성체의 함유량이 0.1 내지 50 중량％인 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 자성체의 평균 입경이 2 내지 10 nm인 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 표면에 항원 또는 항체와 공유 결합이 가능한 관능기를 갖는 링커가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자.
  16. 제15항에 있어서, 항원 또는 항체와 공유 결합이 가능한 관능기가 에폭시기인 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 링커가 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜에테르인 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자.
  18. 수계 용매 중에서 친수기를 갖지 않는 단량체 및(또는) 친수기를 갖는 단량체를 중합하여 입자를 형성하는 공정, 및 상기 입자 중에 금속 이온을 취입하면서 상기 금속 이온을 산화하여 자성체를 형성하는 공정을 포함하고, 상기 입자를 형성하는 공정과 자성체를 형성하는 공정을 동시에 진행시키는 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자의 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서, 친수기를 갖지 않는 단량체가 글리시딜기를 갖는 아크릴계 단량체 또는 글리시딜기를 갖는 아크릴계 단량체, 및 스티렌계 단량체인 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자의 제조 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 입자를 형성하는 단량체가 친수기를 갖지 않는 단량체 및 친수기를 갖는 단량체를 포함하고, 친수기를 갖는 단량체는 하기 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 (메트)아크릴레이트 또는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자의 제조 방법.
    <화학식 1>
    CH2=CR-COO-(CH2-CH2-O)n-H
    (식 중, R은 H 또는 CH3을 나타내고, n은 1 내지 20의 정수를 나타낸다.)
    <화학식 2>
    (식 중, X는 H 또는 SO3 -NH4 +를 나타내고, n은 3 내지 30의 정수를 나타낸다.)
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 입자를 형성하는 공정에서 공중합 단량체로서 반응성 유화제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자의 제조 방법.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 입자를 형성하는 공정에서 중합 개시제를 후첨가하는 것을 특징으로 하는 자성체 내포 입자의 제조 방법.
  23. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 자성체 내포 입자에 항원 또는 항체가 흡착 또는 결합되어 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역 측정용 입자.
  24. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 자성체 내포 입자, 또는 제23항에 기재된 면역 측정용 입자를 사용하는 것을 특징으로 하는 면역 측정 방법.
  25. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 자성체 내포 입자를 표지로서 사용하는 것을 특징으로 하는 면역 측정 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 면역 크로마토법을 이용하는 것을 특징으로 하는 면역 측정 방법.
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