CN104910256A

CN104910256A - 一种自组装短肽及其对金电极修饰的应用

Info

Publication number: CN104910256A
Application number: CN201510403870.8A
Authority: CN
Inventors: 徐晓帆; 陈振银; 李润土; 李萌萌; 张慧楠; 罗忠礼
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2015-09-16

Abstract

本发明公开了一种自组装短肽及其对金电极修饰的应用，该自组装短肽的氨基酸序列为：Tyr Val Asn Lys Pro Arg Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala。本发明所述自组装短肽能够在金电极表面上自组装修饰金电极，可以在纳米材料的生物传感器领域，作为一种新的生物传感器材料。

Description

一种自组装短肽及其对金电极修饰的应用

技术领域

本发明属于纳米生物材料领域，具体涉及一种自组装短肽及其在修饰金电极中的应用。

背景技术

分子自组装指的是分子在不受外力介入的情况下，能够进行自我组织，自我聚集形成一种规则的结构，即能够从一个杂乱无序的状态转变成一个有序的状态。在最近的十几年里，分子自组装系统(如氨基酸)已经成为分子生物学、化学以及材料学等学科的交汇点，尤其是手性自组装短肽，已经发展成为了一类新兴的纳米生物材料。由它们构成的纳米纤维，作为细胞三维培养的基质材料，同时一些特殊的短肽可以修饰金电极，作为一种新的纳米传感器材料，具有高纯度、可降解及无免疫反应的突出优点，已被成功应用于细胞工程、生物传感器及生物医学工程等领域。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的自组装短肽，增加自组装短肽的种类，使之可在修饰金电极作为传感器材料使用。

本发明的技术方案为：一种自组装短肽，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.1，具体是：Tyr Val Asn Lys Pro Arg Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala。命名为GFS-15，下文中的描述均采用该名称。

GFS-15，其分子量为1407.68。其自组装原理是通过分子之间非共价键相互作用，形成结构明确且稳定，并具有某些理化性质的超分子结构或分子聚集体。

一种自组装短肽对金电极修饰的应用。

具体地，本发明所述短肽在金属盐离子、细胞培养基等环境下，能进行自组装形成纳米纤维。

另一具体应用实施例中，本发明所述自组装短肽及其形成的纳米纤维，能与金结合在金电极表面上形成膜结构。所以，此自组装短肽可成为修饰金电极的一种新材料。

本发明具有以下有益效果：

1、提供了一种新型自组装短肽，增加自组装短肽类型。

2、提供了一种新型的自组装纳米生物材料，这种新型生物材料能够广泛的应用到纳米生物传感器工程、细胞工程及生物工程及等领域，并具有明显的经济及其社会效益。

3、提供了一种修饰金电极的纳米支架材料，可广泛应用于生物传感器领域。

附图说明

图1是本发明所述L型氨基酸构成的自组装短肽GFS-15的分子结构示意图。

图2是本发明所述自组装短肽GFS-15高效液相(HPLC)色谱图。

图3是本发明所述自组装短肽GFS-15质谱(MS)图。

图4是本发明所述自组装短肽GFS-15的圆二色谱图,新型短肽GFS-15常温下的二级结构特征是在216nm处有一强负峰，在195nm处有一强正峰，峰形完好。

图5是本发明所述自组装短肽GFS-15的原子力显微图(AFM),图中：A表示0h时短肽GFS-15自组装形成细而短的纳米纤维丝；B表示24h后纳米纤维的长度增加，数量增多并交织在一起,形成三维的纳米纤维网络支架。

图6是本发明所述组装短肽GFS-15与纳米金混合24h形成纳米纤维丝并与纳米金包裹链接在的透射电镜扫描图(TEM)，其中A图的放大倍数×(4000)倍图。B图的放大倍数×(8000)。

图7是本发明所述自组装短肽组装不同时间修饰金电极表面的循环伏安曲线，把打磨好干净的金电极放入5000uM的短肽溶液中分别浸泡不同时间后，用电化学工作站测其循环伏安，发现随着时间的增加，氧化还原峰值也逐渐增加，说明该短肽在金电极表面上形成的纳米纤维结构可能成为了一种催化剂促进了电子的转移。

图8是本发明所述自组装短肽GFS-15不同浓度下组装修饰金电极的循环伏安曲线。把处理好的金电极分别浸入到由去离子水配制成的不同浓度的短肽溶液在(1-100uM)，自组装48后，测其循环伏安曲线。发现随着浓度的增加，氧化还原峰值逐渐减小，证明该短肽在金电极表面上形成了一层膜，阻止了电子的转移。

图9是本发明所述自组装短肽GFS-15溶液添加不同离子组装修饰金电极的循环伏安曲线。把处理好的金电极分别浸入到由生理盐水和PBS溶液配制成的1000uM的短肽溶液中，自组装48后，测其循环伏安曲线。发现添加的两中溶液都可使，氧化还原峰值逐渐减小，证明该短肽在金电极表面上形成了一层膜，阻止了电子的转移，并且添加生理盐水的效果更好。

具体实施方式

实施例1：由L-氨基酸构成的自组装短肽GFS-15的制备

1、材料

Fmoc-D-Tyr-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-酪氨酸)、Fmoc-D-Val-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-缬氨酸)、Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH(芴甲氧羰酰基D-天冬氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-赖氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-D-Pro-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-脯氨酸)、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-精氨酸-γ-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-D-Cys-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-半胱氨酸)、Fmoc-L-Ala(Boc)-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-丙氨酸)、HBTU(O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT(1-羟基苯并三氮唑)；哌啶，乙酸酐，溶剂：DMF(N、N-二甲基甲酰胺)、TFA(三氟乙酸)、DCM(二氯甲烷)、NMM(N-甲基吗啉)。

2、制备方法

采用Fmoc(芴甲氧羰基)保护的固相合成法，工艺步骤如下:

(1)称取0.5mmol/g树脂(Rink amide resin)20g于肽合成器中，用200mlDCM浸泡树脂30分钟后，再用400mlDMF分三次清洗树脂，每次清洗时间为3min，抽滤干洗涤液。经过10-20分钟用100ml 20％哌啶/DMF震荡反应30分，反应结束后，抽滤干洗涤液，用400mlDMF清洗树脂5次，每次清洗3min，洗完后取少许树脂做茚三酮检查，树脂呈阳性，然后向反应器中加入原料:

加入后震荡反应30分钟，用400mlDMF清洗5次，每次清洗3min，取少许树脂做茚三酮检查，树脂呈阴性。

上述原料加完后，反应40min,抽滤，用30mlDMF洗涤树脂4次，每次3分钟，取少许树脂做茚三酮检查，树脂呈阴性。

(2)向合成器皿中加入5ml 20％哌啶/DMF震荡反应30分钟，反应结束后，抽滤出反应液，再用40mlDMF分4次洗涤树脂，然后在取少许树脂做茚三酮检查，树脂呈阳性，向反应器皿中加入以下原料：

上述原料加完后，震荡反应40分钟，反应结束后，用30mlDMF分4次洗涤，每次3分钟，取少许树脂做茚三酮检查，树脂呈阴性。

变换步骤(2)中(a)原料，(b)(C)(d)原料及加入量不变，重复步骤(2)的操作：步骤(2)中(a)原料依次替换为):Fomc-L-Ala-OH(4.455g×4次)、Fomc-D-Cys-OH(12.12g×2次)、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH(8.71g)、Fmoc-D-Pro-OH(5.755g)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(7.31g)、Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH(6.605g)、Fmoc-D-Val-OH(5.855g)、Fmoc-D-Tyr-OH(9.06g)。

(3)再重复一次(1)(2)(3)步骤的操作，各步骤的原料及用量不变；最后一个结束后，脱出Fmoc-保护基，20％哌啶/DMF(体积浓度)反应30分钟，洗净树脂，加入160ml 50％乙酸酐/DMF(乙酸酐的体积浓度)反应30分钟，用40mlDMF洗净树脂，再用甲醇洗涤树脂4次，抽滤干，真空干燥8小时。将50ml 90％TFA/DCM(TFA的体积浓度)加入盛有肽树脂的容器中，反应3小时，抽滤，浓缩滤液，向残留液中加乙醚，析出白色固体，抽滤固体，即得到粗肽，通过HPLC(高效液相色谱法)纯化，经冷冻干燥即得本发明所述短肽GFS-15，氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所述。

实施例2：短肽GFS-15的高效液相色谱和质谱检测与三维分子模型绘制

对实施例1制备的短肽GFS-15采用普通画图软件(Hyperchem7.5,www.hyper.com)绘制得到分子结构示意图，见图1，由图可看出氨基酸的空间分布。

将实施例1制备的短肽GFS-15利用高效液相色谱(HPLC)检测，参见图2，由图2中的谱峰面积可计算其纯度已达到95％。将实施例1制备的短肽GFS-15采用质谱(MS)检测，参见图3，说明其分子量为1407.68是正确的。

实施例3：自组装短肽GFS-15的圆二色性检测和原子力显微镜(AFM)检测

用去离子水配制100μM短肽GFS-15溶液，圆二色谱仪(AVIV 400CDspectrometer)对短肽GFS-15进行CD检测，参数设置：扫描波长为190-260nm，光径为2mm。本发明短肽GFS-15常温下的二级结构特征是在216nm处有一强负峰，在195nm处有一强正峰，峰形完好(见图4)。这一结果表明，新型短肽GFS-15具有稳定的β-sheet二级结构，在特定的条件下发生自组装，形成纳米纤维。

用生理盐水配制500μM的短肽GFS-15溶液，在室温下让短肽自组装48小时，分别在0和24h时制作样本。在新撕开的云母片上滴加10μl短肽溶液，静置60s，再用1ml去离子水冲洗3次，吸干云母片上的水分，将含有检测样品的云母片置于超净的工作台上，自然晾干后，用原子力显微镜观察，扫描模式为敲打模式。0h时短肽GFS-15自组装形成细而短的纳米纤维丝；24h后纳米纤维的长度增加，数量增多，形成三维的纳米纤维网络支架(见图5)。

实施例4：自组装短肽GFS-15与纳米金混合后自组装24h的透射电镜显微镜(TEM)检查

用去离子水配制成50μL,600μM的短肽GFS-15，再加入25L的纳米金溶液和25的PBS溶液混合，放置24h后取样，用透射电镜观察并在不同的放大倍数下观察拍照(见图6)。

实施例5：短肽GFS-15自组装不同时间修饰金电极的循环伏安法曲线

用CHI600A(USA)工作站进行循环伏安实验，采用三电极体系：金电极(d＝2mm)为工作电极；铂电极为对电极；饱和甘汞为参比电极，支持电解液为5.0mM[Fe(CN)₆]3^-和0.1M KCl溶液，扫描速度为0.05mVS^-1.电压范围从-0.2到+0.5V.先把金电极分别用1.0、0.3和0.05μm的Al₂O₃悬浊液在麂皮上抛光至镜面，然后放入，然后分别在硝酸、乙醇、水中超声，在0.5M硫酸中扫描活化金电极得到标准峰后。洗净金电极浸入5000μm的短肽液中,分别不同时间点(4h,8h,12h,24h,48h)取出测其循环伏安图。发现随着自组装时间的增加，氧化还原峰值也逐渐增加，说明该短肽在金电极表面上形成的纳米纤维结构可能成为了一种催化剂促进了电子的转移(见图7)。

实施例6：不同浓度的GFS-15短肽修饰金电极的循环伏安法曲线

用CHI600A(USA)工作站进行循环伏安实验，采用三电极体系：金电极(d＝2mm)为工作电极；铂电极为对电极；饱和甘汞为参比电极，支持电解液为5.0mM[Fe(CN)₆]3^-和0.1M KCl溶液，扫描速度为0.05mVS^-1.电压范围从-0.2到+0.5V.先把金电极打磨成镜面，然后放入然后分别在硝酸、乙醇、水中超声，在0.5M硫酸中扫描活化金电极得到标准峰后。洗净金电极分别浸入到由去离子水配制成的不同浓度的短肽液中(1μm，10μm，100μm),组装48h后取出测其循环伏安图。发现随着短肽浓度的增加，氧化还原峰值也逐渐减小，证明该短肽可以与Au结合，在金电极表面上形成了一层膜，阻止了电子的转移(见图8)。

实施例7：添加不同离子的GFS-15短肽溶液修饰金电极的循环伏安法曲线

用CHI600A(USA)工作站进行循环伏安实验，采用三电极体系：金电极(d＝2mm)为工作电极；铂电极为对电极；饱和甘汞为参比电极，支持电解液为5.0mM[Fe(CN)₆]3^-和0.1M KCl溶液，扫描速度为0.05mVS^-1.电压范围从-0.2到+0.5V.先把金电极打磨成镜面，然后放入然后分别在硝酸、乙醇、水中超声，在0.5M硫酸中扫描活化金电极得到标准峰后。洗净金电极分别浸入到由生理盐水和PBS溶液配制成的1000μm短肽液中,组装48h后取出测其循环伏安图。发现不论是添加的生理盐水或是PBS溶液都可促使，氧化还原峰值逐渐减小，并且添加生理盐水组的作用效果更加明显，证明添加不同离子后的短肽同样可以与Au结合，在金电极表面上形成了一层膜，阻止了电子的转移(见图9)。

Claims

1.一种自组装短肽，其特征在于：其氨基酸序列为：SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述一种自组装短肽，其特征在于：所述自组装短肽的分子量为1407.68。

3.权利要求1所述自组装短肽对金电极修饰的应用。

4.根据权利要求3所述自组装短肽对金电极修饰的应用，其特征在于：所述自组装短肽与金结合在金电极表面上形成膜结构。

5.根据权利要求3或4所述自组装短肽对金电极修饰的应用，其特征在于：所述自组装短肽进行自组装形成纳米纤维。