CN115737901A - 一种明胶复合水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
一种明胶复合水凝胶及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种明胶复合水凝胶及其制备方法和应用。通过将特定比例的细胞外基质与明胶复合,通过静电纺丝技术纺成膜,用戊二醛交联后再使其吸水获得水凝胶。本发明的明胶复合水凝胶具有可调节的物理化学性能,相较于传统的细胞外基质产品的弹性与机械性能极佳,可根据需求裁剪成各种形状;相对传统明胶产品,本发明水凝胶降解缓慢,利于伤口修复。同时,本发明的明胶复合水凝胶具有良好的生物活性和生物相容性,在促进细胞增殖、亲水性、皮肤缺损修复方面都具有应用价值。
Description
技术领域
本发明属于医用水凝胶材料技术领域,尤其涉及一种明胶复合水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官,在人体和外界环境间起着物理屏障作用,能够控制水、电解质及其他各种物质进出体内,并能有效地隔离外界有害生物,抵御紫外辐射、有毒物质和力学冲击。近年来,难以修复的慢性伤口已经在全球范围内造成了巨大的经济负担。
皮肤组织中有多种信号传导、细胞以及调节因素参与皮肤创伤的修复,其中细胞外基质构成的三维网状结构在人体皮肤组织中极为重要,其参与组织构成,对细胞产生支撑作用以保护细胞。不仅如此,细胞外基质还起到微环境的调节、营养细胞、引导干细胞的分化以及促进细胞迁移等作用。细胞外基质有利于细胞的聚集与增殖,加速伤口愈合。因此,无论是创伤修复的临床应用或是科学研究中,细胞外基质一直是关注的焦点,如何在皮肤受创的急性期快速恢复其细胞外基质的框架结构也是重点。然而,细胞外基质存在着机械强度差的弱点,是当前医疗研发过程中遇到的问题之一。
明胶通常由鱼类或偶蹄类动物的结缔组织或骨组织制成,生物相容性好,广泛应用在食用和医用领域,能构成一种具有三维网络结构的亲水聚合物体系,同时富含包括7种人体必需氨基酸在内的18种氨基酸,同时具有亲水性、粘性、稳定性等特性。医用的明胶与人体的胶原蛋白纤维结构极为相似,如前文所述那样具有良好的生物相容性的同时,也可止血、促进细胞增殖并诱导巨噬细胞参与抗菌。故成为当今医药产业中止血海绵、敷料等产品的首选材料。但是传统的明胶水凝胶产品降解速度快,不利于伤口的持续修复。
因此,急需寻求一种既能弥补缺损的皮肤组织、成为良好的物理网络、可在创伤表面缓慢降解直到伤口修复、具备弹性、机械强度等力学性能,又具有促生长修复、辅助免疫的生物学功能,而且可以形成良好的保护屏障,抵御病原体和异物的入侵的水凝胶材料。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明第一个方面提出一种明胶复合水凝胶,具有良好的生物活性,弹性与机械性能极佳,能够根据需求裁剪成各种形状。
本发明的第二个方面提出了一种明胶复合水凝胶的制备方法。
本发明的第三个方面提出了一种明胶复合水凝胶的应用。
根据本发明的第一个方面,提出了一种明胶复合水凝胶,制备原料包括明胶和细胞外基质,所述明胶和细胞外基质组装成超分子结构。
在本发明的一些实施方式中,所述明胶与细胞外基质的质量比为(1~4):(4~1)。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述明胶与细胞外基质的质量比为(1~4):1。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述细胞外基质为从动物皮下组织或皮肤细胞培养提取的细胞外基质。
在本发明的一些更优选的实施方式中,所述细胞外基质为从小鼠皮肤成纤维细胞培养后获取的细胞外基质。
根据本发明的第二个方面,提出了一种明胶复合水凝胶的制备方法,包括如下步骤:
将细胞外基质、有机溶剂、明胶混合,得到明胶-细胞外基质溶液,静电纺丝成膜,戊二醛蒸汽交联,得到明胶复合水凝胶。
在本发明的一些实施方式中,所述明胶-细胞外基质溶液的总质量浓度为2%~10%。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述明胶-细胞外基质溶液的总质量浓度为5%~10%。
在本发明的一些更优选的实施方式中,所述明胶-细胞外基质溶液的总质量浓度为8%~10%,进一步优选为10%。
在本发明的一些实施方式中,所述有机溶剂选自六氟异丙醇、甲醇、乙醇中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中,所述有机溶剂为六氟异丙醇。
在本发明的一些实施方式中,所述混合液中细胞外基质与明胶的质量比为(1~4):(4~1),优选(1~4):1。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述混合液中细胞外基质与明胶的质量比为(1~4):1。
在本发明的一些更优选的实施方式中,所述混合液中细胞外基质与明胶的质量比为4:1。
在本发明的一些实施方式中,所述戊二醛蒸汽交联的时间为45min。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述戊二醛蒸汽交联后还包括水浸泡,温度为10℃~35℃。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述戊二醛蒸汽交联后还包括水浸泡,温度为20℃~30℃。
在本发明的一些优选的实施方式中,上述水浸泡的时间为0.5h~3h。
在本发明的一些更优选的实施方式中,上述水浸泡的时间为0.5h~1h。
在本发明的一些实施方式中,所述静电纺丝的负电压为-3kV;正电压为18kV~25kV。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述静电纺丝的正电压为19kV~21kV。
在本发明的一些更优选的实施方式中,所述静电纺丝的正电压为20kV。
在本发明的一些实施方式中,所述静电纺丝中注射泵推进速度为0.5mL/h~1mL/h。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述静电纺丝中注射泵推进速度为0.7mL/h~0.9mL/h。
在本发明的一些更优选的实施方式中,所述静电纺丝中注射泵推进速度为0.8mL/h。
在本发明的一些实施方式中,所述静电纺丝中承载滚筒转速为200rpm~3000rpm。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述静电纺丝中承载滚筒转速为500rpm~1000rpm。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述静电纺丝中承载滚筒转速为800rpm。
在本发明的一些实施方式中,所述静电纺丝成膜的厚度为50.0μm~1.0mm。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述静电纺丝成膜的厚度为50.0μm~80μm。
根据本发明的第三个方面,提出了一种明胶复合水凝胶在制备皮肤缺损修复材料中的应用。
本发明的有益效果为:
本发明的明胶复合水凝胶具有可调节的物理化学性能,弹性与机械性能极佳,可根据需求裁剪成各种形状;降解缓慢,利于伤口修复。同时,具有很好的生物活性和生物相容性,在促进细胞增殖、亲水性、皮肤缺损修复方面都具有应用价值。且本发明的制备方法简单,原料易得。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明,其中:
图1为不同交联时间得到的产品的实物图;
图2为实施例1~4和对比例1、2的水凝胶在不同放大倍数下的电镜扫描图;
图3为实施例1~4和对比例1、2的水凝胶在戊二醛交联后的电镜扫描图;
图4中A为实施例1~4和对比例1、2的水凝胶的拉伸试验测试应力-应变曲线;B为拉伸试验测试最大值结果,为原料中随着细胞外基质浓度增加而产生的成品机械强度变化;C为实施例1的水凝胶在不同交联时间得到的水凝胶的拉伸试验测试结果;
图5为实施例1和对比例1、2的水凝胶的降解实验结果;
图6为在实施例1和对比例1、2的水凝胶表面种植细胞后的增殖率,*为P<0.5;
图7为依次在实施例1~4的水凝胶表面种植细胞后的电镜扫描图;
图8为在实施例1和对比例1的水凝胶表面种植细胞后的细胞活死染色图;
图9为实施例1和对比例1的水凝胶的皮下植入效果实物图;
图10为实施例1和对比例1的水凝胶皮下植入14天后皮肤及肌肉组织取材的HE染色结果,其中a为实施例1植入后小鼠皮层组织,b为对比例1植入后小鼠皮层组织,c为实施例1皮下植入后小鼠肌层组织,d为对比例1皮下植入后小鼠肌层组织;
图11为实施例1和对比例1、2的水凝胶的缺损皮肤修复效果实物图,其中A为实验小鼠皮肤缺损的初始状态,B为不同时间后的皮肤修复效果图;
图12中A为实施例1和对比例1、2修复缺损皮肤14天后的皮肤修复效果,B为皮肤组织取材切片后HE染色结果,B中a为实施例1的组织取材切片后HE染色结果,b为a放大2倍图,B中c为空白对照组的组织取材切片后HE染色结果,d为c放大2倍图,B中e为对比例1的组织取材切片后HE染色结果,f为e放大2倍图,B中f为对比例2的组织取材切片后HE染色结果,g为f放大2倍图;
图13为实施例1~4和对比例1、2的水凝胶在不同时间下的吸胀率;
图14为实施例1~4和对比例1、2的水凝胶的接触角实验图,其中A为水凝胶的接触角角度变化曲线;B为随时间变化,水凝胶上接触的水滴的变化。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述,以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然,所描述的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部实施例,基于本发明的实施例,本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例,均属于本发明保护的范围。
以下各实施例中的细胞外基质由此方法获得:
将二甲基硅氧烷用丙酮清洗3~4次,75%乙醇浸泡30min,用300W强紫外线照射灯灭菌30min,移入细胞培养超净台,用磷酸缓冲盐溶液清洗2~3次,在每个二甲基硅氧烷培养皿中加入5mL浓度为20ng/mL的纤维连接蛋白溶液,放置于恒温培养箱内12h,温度控制在37℃,湿度99.9%,二氧化碳5v/v%。
取出-80℃冰箱中冻存的小鼠成纤维细胞,在37℃恒温水浴锅中浸泡10min解冻。解冻后进入细胞培养超净台,用移液枪移入15mL离心管,置入含5%胎牛血清和1%双抗体(青霉素、链霉素)的完全培养基,1000r/min离心5min。弃去上清液,加入含5%胎牛血清和1%双抗体的完全培养基,制成细胞悬液后移入10cm培养皿中,放置于恒温箱培养,每2天换液一次。
细胞长至培养皿的80%~90%时,使用磷酸缓冲盐溶液清洗2~3次,在培养皿中注入2mL的2.5%胰蛋白酶,37℃恒温箱内放置45s,使细胞脱离培养皿。将细胞移入15mL离心管,置入5mL含5%胎牛血清和1%双抗体的完全培养基,1000r/min速度离心机离心5min。弃上清液,接种于二甲基硅氧烷培养皿上,接种密度为0.5×105/cm2~1×105/cm2。该步骤重复4~5次,得到大量细胞。收集细胞,将细胞悬液置入50mL离心管冰冻,室温溶解,反复冰冻溶解5次以上,使其脱细胞,获取细胞外基质。
实施例1
本实施例制备了一种明胶复合水凝胶,具体过程为:
(1)将200mg上述细胞外基质加入到10mL六氟异丙醇溶剂中,室温下放置到磁力搅拌机上,800r/min的转速下搅拌1d~3d,使其充分融入溶剂,再加入800mg明胶继续搅拌1d。获得明胶-细胞外基质共混溶液。共混溶液中,明胶质量百分比为8wt.%,细胞外基质的质量百分比为2wt.%。
(2)将步骤(1)获得的明胶-细胞外基质共混溶液放入10mL注射器,通过注射泵缓慢喷射,置入静电纺丝仪器,导入静电纺丝应控制在负电压-3kV,正电压18~25kV的高压电。通过静电纺丝技术纺织成膜。注射泵推进速度控制在0.5~1mL/h,静电纺丝36h,可获得面积25cm2,厚度50μm的电纺膜半成品。
(3)在容积约10L的密闭箱子的底部放入5mL 4%戊二醛,中间置入支架,将步骤(2)得到的电纺膜放入支架上架空。在戊二醛蒸汽中交联45min,取出成品后在蒸馏水中放置2h时间,可获得明胶复合水凝胶,标记为Gel/ECM4:1。
实施例2
本实施例制备了一种明胶复合水凝胶,具体过程与实施例基本相同,本实施例中明胶溶液的浓度为6wt.%,细胞外基质溶液的浓度为4wt.%,标记为Gel/ECM3:2。
实施例3
本实施例制备了一种明胶复合水凝胶,具体过程与实施例基本相同,本实施例中明胶溶液的浓度为4wt.%,细胞外基质溶液的浓度为6wt.%,标记为Gel/ECM2:3。
实施例4
本实施例制备了一种明胶复合水凝胶,具体过程与实施例基本相同,本实施例中明胶溶液的浓度为2wt.%,细胞外基质溶液的浓度为8wt.%,标记为Gel/ECM1:4。
对比例1
本对比例制备了一种明胶水凝胶,与实施例1的区别在于,不添加细胞外基质,具体过程为:
(1)将明胶加入到六氟异丙醇溶剂中,室温下放置到磁力搅拌机上,800r/min.加入明胶继续搅拌1d,获得明胶溶液。明胶溶液的浓度为5wt.%。
(2)将步骤(1)获得的明胶溶液放入10mL注射器,通过注射泵缓慢喷射,置入静电纺丝仪器,导入静电纺丝应控制在负电压-3kV,正电压18~25kV的高压电。通过静电纺丝技术纺织成膜。注射泵推进速度控制在0.5~1mL/h,静电纺丝36h,可获得面积25cm2,厚度50μm的电纺膜半成品。
(3)在容积约10L的密闭箱子的底部放入5mL 4%戊二醛,中间置入支架,将步骤(2)得到的电纺膜放入支架上架空。在戊二醛蒸汽中交联45min.,取出成品后在蒸馏水中放置一段时间,可获得明胶水凝胶,标记为Gel/ECM5:0。
对比例2
本对比例制备了一种细胞外基质水凝胶,与实施例1的区别在于,不添加明胶,具体过程为:
(1)将细胞外基质混合溶液放入10mL注射器,通过注射泵缓慢喷射,置入静电纺丝仪器,导入静电纺丝应控制在负电压-3kV,正电压18~25kV的高压电。通过静电纺丝技术纺织成膜。注射泵推进速度控制在0.5~1mL/h,静电纺丝36h,可获得面积25cm2,厚度50μm的电纺膜半成品。
(2)在容积约10L的密闭箱子的底部放入5mL 4%戊二醛,中间置入支架,将步骤(2)得到的电纺膜放入支架上架空。在戊二醛蒸汽中交联45min,取出成品后在蒸馏水中放置一段时间,可获得细胞外基质水凝胶,标记为Gel/ECM0:5。
对比例3
本对比例制备了一种细胞外基质水凝胶,与实施例1的区别在于,戊二醛蒸汽交联时间不同,本对比例交联60min,其余过程参考实施例1。
对比例4
本对比例制备了一种细胞外基质水凝胶,与实施例1的区别在于,不进行戊二醛蒸汽交联,其余过程参考实施例1。
试验例
1.外观观察
按实施例1的原料浓度比例和步骤,分别在不同戊二醛交联时间下交联,取出成品分别放置在蒸馏水中,结果如图1所示,可以看出,不同戊二醛交联固化时间下,加入水中后电纺膜的形态不同,交联0min的电纺膜在水中迅速融化,显然不能用于伤口修复;交联10~35min的电纺膜容易卷缩并且不能吸水;交联60min时,电纺膜展平但无法形成水凝胶,无法吸收充足水分;交联45min的电纺膜入水后形成水凝胶,可以用于伤口修复。
2.微观结构
将实施例1~4和对比例1、2制备的水凝胶干燥并用扫描电镜测试其形貌,结果如图2所示。从图2可以看出,实施例的水凝胶都具有丰富的多孔结构,且实施例1~4和对比例1、2在戊二醛蒸汽中交联固化后,如图3所示,凝胶的纤维变得更粗大。
3.拉伸强度测试
将实施例1~4和对比例1、2制备的水凝胶进行拉伸实验,具体步骤为:
将实施例1~4和对比例1、2制备的水凝胶成品各裁剪成1.0mm厚×1.0cm宽×10.0cm长的长条状,两端固定于拉伸测试仪,将两端以0.1mm/s的速度向相反方向拉伸,测得其对抗拉伸的强度,即应力(kPa),并同时观测其随着机械拉伸水凝胶自身能变形的长度变化,即应变(%)。图4中A为实施例1~4和对比例1、2的成品水凝胶的拉伸试验测试结果,在对比例1、实施例1~4、对比例2几组中,随着细胞外基质浓度的上升,机械强度和应变能力成比例下降,在无细胞外基质添加的对比例1上可以测得更好的机械强度和应变能力,实施例1比对比例1几乎相同。
图4中B为实施例1~4和对比例1、2的水凝胶的拉伸试验测试最大值结果,为原料中随着细胞外基质浓度增加而产生的成品机械强度变化,在对比例1、实施例1~4、对比例2几组中,随着细胞外基质浓度的上升,机械强度和应变能力成比例下降,在无细胞外基质添加的对比例1上可以测得更好的机械强度和应变能力,实施例1比对比例1几乎相同。
如图4中C所示,制备实施例1同配方但交联60min与未交联(交联0min)的半成品,以10mm/min的速度分别拉伸实施例1水凝胶以及实施例1同配方交联60min.与未交联的产品,进行测试,实施例1交联45min后的水凝胶在拉伸试验中最高可抵抗148kPa的力,相比实施例1同配方交联60min与未交联的产品有更好的机械性。说明实施例1的水凝胶具有很好的强度。
4.降解性能测试
将实施例1、对比例1、2制备的水凝胶分别置于37℃的磷酸缓冲溶液中,分别在不同时间点(2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d)检测其降解率,结果见图5。
结果显示实施例1制备的明胶复合水凝胶的理化性能稳固,不易降解,这对于长期伤口修复具有重要意义。实施例1在DMSO/水体系中能够以一种超分子结构而存在,其结构网络十分稳定,可以根据实际应用切割成各种形态而保持稳定。
5.促细胞增殖能力测试
将实施例1、对比例1、2制备的水凝胶裁成直径2mm大小,分别置入3个96孔板中,并留出3个空孔做空白对照组。在水凝胶表面以及空白对照组各植入10万个小鼠成纤维细胞并注入0.5mL由水、L-谷氨酰胺、葡萄糖和酚红制成的细胞培养液在37℃、湿度99.9%并且二氧化碳5v/v%的恒温箱进行细胞培养。分别在3d、5d、7d三个时间点取出。每孔加入100μLCCK-8试剂,37℃孵育2h后,将100mL在之前所述细胞培养液基础上加入了青霉素、链霉素和胎牛血清的最终培养液转入96孔板,在467nm波长下,用微孔板读数测定吸光度,根据朗伯-比尔定律的公式A=lg I0/I=-lgT计算细胞存活率,其中A为吸光率,T为透光率,I0为入射光强,I为透过光强。如图6所示,对比种植了细胞的无干预措施的细胞培养皿而言,实施例1的水凝胶在7天内可促进细胞增殖约3.7倍,对比例1的水凝胶细胞增殖约3倍,对比例2使细胞增殖约3.3倍,空白对照组细胞增殖约2.3倍。说明实施例1的水凝胶有更优的促细胞生长能力。
6.细胞亲和能力测试
将实施例1的水凝胶裁成直径1cm大小,在水凝胶表面各植入30万小鼠成纤维细胞并注入0.5mL由水、青霉素、链霉素、胎牛血清L-谷氨酰胺、葡萄糖和酚红制成的细胞培养液在37℃、湿度99.9%并且二氧化碳5v/v%的恒温箱进行细胞培养。每2-3天进行换液。7天后取出,用电镜可观察,如图7所示,水凝胶表面可观察到成纤维细胞。说明本产品水凝胶有很好的细胞亲和性。
7.材料内细胞活性测试
将实施例1与对比例1的水凝胶裁成直径5mm大小,各裁3张,分别置入3个96孔板中,并留出3个空白作空白对照组,在水凝胶表面及空孔各植入10万成纤维细胞并注入0.5mL由水、青霉素、链霉素、胎牛血清L-谷氨酰胺、葡萄糖和酚红制成的细胞培养液在37℃、湿度99.9%并且二氧化碳5v/v%的恒温箱进行细胞培养7天。将5μL黄钙绿素以及5μL的碘化吡啶加入5mL去离子无菌水中混匀,静置10min.,各取1mL加入96孔板中。染色实施例1、对比例1以及空白对照组的细胞群后,如图8所示,实施例1的水凝胶相比对比例1、空白对照组的细胞群,表面可以看到更多的活细胞被黄钙绿素染色,实施例1的水凝胶死细胞较少,有维护细胞活性的效果。
8.皮下安全性能测试
将实施例1制备的水凝胶与对比例1制备的水凝胶分为两组,每组各裁出3张直径5mm大小的水凝胶。取3张实施例1水凝胶植入3只小鼠皮下,同样取3张对比例1水凝胶植入另外3只小鼠皮下,分别在3d、7d、14d处死观察伤口愈合,如图9所示,实施例1明胶-细胞外基质复合水凝胶与对比例1的水凝胶两组小鼠皮肤表面光滑,毛发分布均匀,无皮疹、红肿、肿胀以及皮温升高等情况产生,说明皮肤没有产生炎症反应、排斥反应。
为进一步核实如上所述内容,将植入实施例1与对比例1的水凝胶的小鼠在7d处死后组织切片HE染色观察,图10观察植入的实施例1与对比例1的水凝胶周围组织各层。观察小鼠真皮与肌肉之间的皮下组织,如图a所示,实施例1植入后,皮下组织可见饱满的脂肪组织,在HE染色切片上呈空洞状,未见炎症引起脂肪组织破坏。如图b所示,对比例1植入后,皮下组织可见饱满的脂肪组织,未见炎症引起脂肪组织破坏。皮下组织及皮肤各层见被染色呈深蓝色的细胞核分布均匀,未见散在大量杂乱的蓝紫色小颗粒,说明实施例1植入后在皮肤各层组织间未引起炎性反应。同样观察对比例1植入后,细胞核分布均匀,皮肤各层组织间未引起炎性反应。观察皮下植入后肌肉组织各层,如c所示,植入实施例1的小鼠肌层组织呈正常的淡红颜色,如有炎性渗出物或白细胞聚集,肌肉组织将弥漫大量杂乱的蓝紫色小颗粒,实施例1肌层未见异常。同样,如图d所示,对比例1植入后,小鼠肌层组织呈正常的淡红颜色,未见炎性渗出物或白细胞聚集。
综上所述包括植入物周围的小鼠肌肉组织、皮下组织、表皮组织各曾都未见白细胞聚集,无炎性渗出物,表示实施例1和对比例1的水凝胶皆满足生物材料的安全性要求,也说明本发明的明胶-细胞外基质复合水凝胶安全性好,不易引起排斥。
9.皮肤缺损修复性能测试
将实施例1、对比例1~2的水凝胶用于小鼠缺损皮肤修复。如图11A所示,将实施例1与对比例1、2的水凝胶裁成直径2cm大小,同时在4只大鼠麻醉,麻醉后背部剃毛备皮,用消毒过的手术剪刀在每只大鼠背部裁2个2cm圆形创口,再将实施例1、对比例1、2的水凝胶分别贴敷于大鼠背部创口上,1只做空白对照组。如图11B所示,在建模当天、3天、7天、14天观察伤口创面变化;可以看出,空白对照组的创口恢复速度最慢,14天后仍有血痂附着,伤口没有完全恢复;对比例1的创口在14天后基本愈合,但仍有约5mm血痂附着,说明传统明胶成分对伤口修复有一定效果。对比例2的创口完全愈合,疤痕形成,创口周围毛孔较少;实施例1的创口基本愈合,创口周围疤痕组织小,毛孔长出,说明实施例1的水凝胶有比空白对照组、对比例1的水凝胶更优伤口愈合作用,同时,比对比例2瘢痕形成更小。如图12A所示,再次对比创口造模当天和14天后的创口,空白对照组和对比例1创口仍未完全修复,实施例1的明胶-细胞外基质复合水凝胶和对比例2的水凝胶都能够更优地促进皮肤的修复,实施例1更优。
如图12中B的染色结果显示,采用实施例1的明胶-细胞外基质复合水凝胶修复后,如图a、b所示,切片HE染色后未见到染色呈弥漫大量杂乱的蓝紫色小颗粒状炎症细胞或炎性渗出物,新生的毛孔呈“凹槽状”突出皮肤表面,未见到血痂,毛孔下面圆形管状组织为新生的血管,说明实施例1具有更好的修复效果。如图c、d所示空白对照组创口表面可见血痂翘起,皮下呈弥漫大量杂乱的蓝紫色小颗粒状炎症细胞和炎性渗出物,伤口未完全愈合。如图e~h所示,对比例1、2的创口切片染色未见血痂,皮下呈弥漫少量杂乱的蓝紫色小颗粒状炎症细胞和炎性渗出物,未观察到毛孔和新生血管形成,说明对比例1、2的水凝胶对炎症反应抑制效果欠佳,促进毛孔和新生血管生成能力欠佳,总体创口修复效果劣于实施例1,但优于空白对照组。实施例1的明胶-细胞外基质复合水凝胶能够更优地促进皮肤的修复。
10.保水和吸胀性能测试
将实施例1~4和对比例1、2制备的水凝胶裁成1mm厚×5cm长×1cm宽长条状,分别浸泡在水中10min,达到稳定吸胀后从水中取出,吸收水后6种水凝胶重量皆在50.0±2g,再在空气中放置48h,并在吸水前、空气中静置后分别称重,对比质量变化。测得实施例1~4和对比例1、2制备的水凝胶的保水率,结果分别如图13所示。从图中可以看出,实施例1、对比例1的水凝胶具有明显更高的保水率,其中对比例1的最高。在实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例2几组中,随着细胞外基质浓度的上升,保水率成比例下降,其中对比例2的水凝胶在静置48h后重量几乎恢复到吸水前水平,说明该水凝胶保水性能较差,在48h后基本干燥,不能满足伤口修复用水凝胶对亲水性的需求。
实施例1的明胶-细胞外基质复合水凝胶比对比例2具有更好的保水性,可以更久、更好地亲和皮肤缺损表面。
11.亲水性能测试
在实施例1~4和对比例1、2的制备的水凝胶表面分别滴2mL水,分别测其0s、3s、5s、7s的接触角,如图14中A所示,观察实施例1~4和对比例1、2的水凝胶的接触角角度变化曲线,对比例1的水滴接触角角度变化缓慢,说明其吸水较慢,实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例2的亲水角角度下降更快,说明水滴吸收速度成比例上升,对比例2吸收水的速度更快。
图14中B为实施例1~4和对比例1、2的水凝胶的接触角实验中,时间变化中水滴的直观变化。对比例1的水滴变化较为缓慢,说明其吸水较慢,实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例2的水滴吸收更快,说明在实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例2几组中,随着细胞外基质浓度的上升,水滴吸收速度成比例上升,对比例2吸收水的速度更快。
实施例1的明胶-细胞外基质复合水凝胶比对比例1具有更好的亲水性,可以更好、更快地亲和皮肤缺损表面。
上面对本发明实施例作了详细说明,但是本发明不限于上述实施例,在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外,在不冲突的情况下,本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种明胶复合水凝胶,其特征在于,制备原料包括明胶和细胞外基质,所述明胶和细胞外基质组装成超分子结构。
2.根据权利要求1所述的明胶复合水凝胶,其特征在于,所述明胶与细胞外基质的质量比为(1~4):(4~1)。
3.权利要求1~2任一项所述的明胶复合水凝胶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:将细胞外基质、有机溶剂、明胶混合,得到明胶-细胞外基质溶液,静电纺丝成膜,戊二醛蒸汽交联,得到明胶复合水凝胶。
4.根据权利要求3所述的明胶复合水凝胶的制备方法,其特征在于,所述明胶-细胞外基质溶液的总质量浓度为2%~10%。
5.根据权利要求3所述的明胶复合水凝胶的制备方法,其特征在于,所述静电纺丝成膜的厚度为50.0μm~20.0mm。
6.根据权利要求5所述的明胶复合水凝胶的制备方法,其特征在于,所述交联采用戊二醛蒸汽交联,时间为45min。
7.根据权利要求3所述的明胶复合水凝胶的制备方法,其特征在于,所述交联后还包括水浸泡,温度为10℃~35℃,时间为0.5h~3h。
8.根据权利要求3所述的明胶复合水凝胶的制备方法,其特征在于,所述静电纺丝的负电压为-3kV;正电压为18kV~25kV。
9.根据权利要求3所述的明胶复合水凝胶的制备方法,其特征在于,所述静电纺丝中注射泵推进速度为0.5mL/h~1mL/h。
10.权利要求1~2任一项所述的明胶复合水凝胶在制备皮肤缺损修复材料中的应用。
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