CN108368468A

CN108368468A - 细胞培养装置

Info

Publication number: CN108368468A
Application number: CN201680040370.5A
Authority: CN
Inventors: 陈勇; 汤亚东; 汪莉; 石剑
Original assignee: Pierre And Marie Curie University (university Of Paris Vi); Paris Science And Literature General Assembly - Latin America; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Pierre And Marie Curie University (university Of Paris Vi); Paris Science And Literature General Assembly - Latin America; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2015-07-08
Filing date: 2016-07-08
Publication date: 2018-08-03
Also published as: EP3320081A1; US20180195033A1; WO2017005927A1

Abstract

本发明涉及包含由生物相容性聚合物制成网状物的细胞培养装置；以及包含生物相容性材料或由生物相容性材料制成的顶部栅格，并铺设在所述网状物上；网状物是交联的单层纳米纤维；顶部栅格包括单个网格和分开的开口阵列，通过具有宽度的分区进行分隔；顶部栅格的每个开口具有相同的几何结构；顶部栅格包括围绕开口的边界，所述边界的厚度至少是所述的分区厚度的两倍。本发明还涉及一种生产所述细胞培养装置，细胞生长或分化的方法细胞培养系统。

Description

细胞培养装置

技术领域

本发明涉及组织或细胞培养装置领域。特别是，本发明涉及包含一层纳米纤维的细胞培养装置。本发明还涉及细胞培养装置的生产，细胞生长和细胞分化以及细胞培养系统的方法。

背景技术

组织或细胞培养和细胞分化包含一系列复杂过程，需要模仿体内各种生理条件。用现有的细胞或组织培养和细胞分化技术，将细胞放在平面支撑上，如玻璃基板或塑料底物，细胞缺少从下部的细胞培养基的扩散：仅表面的一部分的细胞与周围的培养基接触。即使传统的方法能够培养一些细胞群落，特别是多能干细胞，如胚胎干细胞和诱导多能干细（iPSC），需要更充分模仿的体内条件，即每个细胞的所有表面与细胞外基质接触。

在各种新的细胞培养装置中，纳米纤维的使用已经被研究了20年。例如，国际专利申请WO2015/007797公开了一种三维细胞培养支架。这种三维细胞培养支架是生物兼容的，由三维纳米纤维支架覆盖有微组织制成，如藻酸盐包含活细胞的水凝胶。用这样的装置，组织再生深入到脚手架的核心。

美国专利申请2014/0207248公开了一种多尺度纤维支架，其包括：纳米纤维和微米纤维，并为细胞生长提供三维环境。微米纤维提供机械支持和利于细胞浸润的大孔隙，而纳米纤维为细胞粘附提供表面。

国际专利申请WO2013/007224也公开了一种细胞培养基底，包括沉积在网状结构承载层上的纳米纤维层。所述纳米纤维层由生物相容的聚合物形成，如明胶，聚己内酯或聚酰胺，填充并覆盖承载层的孔隙。所述承载层提供给纳米纤维层足够的机械强度，否则纳米纤维层将没有足够的机械强度并会在润湿后收缩甚至卷曲。为了防止纳米纤维层的机械损伤，所述纳米纤维层可以用聚乙烯箔覆盖。

WO2015/007797，US2014/0207248和WO2013/007224旨在提供纳米纤维支架用于细胞分化和细胞生长。无论以何种方式，他们公开了三维纳米纤维的支架。 WO2015/007797公开的一种支架厚度大于50μm，甚至可以达到50mm；US2014/0207248和WO2013/007224描述了通过静电纺丝生产纳米纤维层：所述制造过程来创建三维结构。在这样的三维外源环境中，细胞并没有完全浸入细胞培养基中。这样的要求是必要的，特别是对于多能干细胞。实际上，用现有技术的培养装置，多能干细胞仍然有重要染色体异常和高致瘤风险。因此，本发明的目的是提供一种模拟体内环境的细胞培养装置，具有增强的渗透性，减少外源性接触而增加与细胞培养基接触面积。

US2014/0295553公开了一种粘合到微型模板上包含交联水凝胶层的细胞培养装置。

在US2014/0295553中，培养装置由水凝胶层制成，因为缺乏三维微环境不能提供最佳细胞培养条件。即使培养基可能会通过水凝胶层扩散，但细胞和培养基之间物质交换总是有限的。

本发明的第二个目的是提供一种细胞培养装置，能够均匀地接种和生长细胞群。本发明提供了有效和原创性的解决方案，使用一个网状开口并用一层纳米纤维均匀覆盖后用于细胞的均匀接种和生长并在单一装置中培养不同的细胞群。

此外，如WO2015/007797和US2014/0207248中所公开的那样叠加层强烈地限制了细胞成像。

概要

为此目的，本发明的细胞培养装置包含交联的单层纳米丝层，其孔隙的稍小于要培养的细胞。因此，作为一个网络，细胞仅仅停留在纳米纤维单层上。细胞覆盖住孔沿着孔的边界并只与纳米纤维接触；从而优化与其细胞表面接触培养基：根据本发明，除了在孔的边界上，细胞确实在整个表面上与细胞培养基接触。根据申请人所述，这种新的纳米纤维单层模拟体内细胞外基质的组织并考虑到体内细胞环境的流体动力学的性质；从而允许显着增加细胞增殖速度和精确调整iPSC克隆形状。

本发明的细胞培养装置还包括纳米纤维单层顶部具有开口的格栅，允许在每个开口内接种细胞。因此，本发明是一种易于操作和多功能的细胞培养装置，包含生物相容性聚合物制成网；在该网上有生物相容性聚合物制成的格栅；而网是一层单层的交联纳米纤维并具有20%〜40%的特定表面；顶部的格栅包括单个格栅和具有特定厚度并将其分开的开口阵列；顶部栅格的每个开口具有相同的几何形状；顶部栅格包括围绕开口的边界，而边界的厚度至少是所述分区的厚度的两倍。

根据一个实施例，开口的所述几何构型是多边形，优选为正三角形或正六边形等正多边形。

根据一个实施例，分隔开口的顶部栅格的每个分区具有相同的横截面，优选正方形的横截面，其宽度范围为5〜500μm。

根据一个实施例，顶部栅格具有比顶部栅格分区更厚的边界。

根据一个实施例，细胞培养装置包括顶部栅格和网之间的粘合剂，所述粘合剂最好是金。

根据一个实施例，超过50%的网状物的孔隙面积为0.01〜20μm²。

根据一个实施例，顶部栅格的开口尺寸范围为15〜1000μm。

根据一个实施例，网状物的交联纳米纤维材料为水凝胶，优选明胶；或者为掺纳米碳管的明胶。

根据一个实施例，顶部栅格由水凝胶制成，优选聚（乙二醇）或（乙二醇）二丙烯酸酯。

根据一个实施例，细胞培养装置还包含位于所述顶部栅格的开口的干细胞。

本发明还包含一种细胞培养系统，包括至少一个本发明的细胞培养装置，和培养基。

根据一个实施例，所述至少一个细胞培养装置的网状物和顶部栅格由水凝胶制成，使得该培养装置可以悬浮在细胞培养基内。

根据一个实施例，所述细胞培养系统还包括进口，出口和微通道，其中，所述培养基和所述至少一个细胞培养装置包含在微通道内。

本发明还涉及制造细胞培养装置的方法。

根据本发明，包括以下步骤：

通过软光刻生产由生物相容性聚合物制成的顶部栅格；

通过溅射在网格上沉积结合剂；

通过静电纺丝在网格上沉积纳米纤维层；

将所述纳米纤维交联。

本发明还涉及干细胞生长或分化的方法，包括以下步骤：

提供根据本发明的细胞培养装置或细胞培养系统；

用糖蛋白如玻连蛋白或纤连蛋白等涂覆细胞培养装置；

在细胞培养装置的开口内接种至少一种类型的干细胞，并培养在含有ROCK抑制剂的培养基中；

去除ROCK抑制剂。

定义

在本发明中，以下术语具有以下含义：

术语“约”在本文中用来表示大约，大致，围绕或在...中区。当术语“约”与数字范围结合使用时，通过延伸数字上下的边界来修改该范围。术语“约”在本文中用于修饰数值时，代表在该数值上下20%，优先是5%的差异，最优是1%。

“交联剂”是指能与特定官能团（伯胺，巯基等）发生化学反应并将它们结合在一起的多官能分子。

“培养基”是指用于培养微生物，组织或细胞的液体或凝胶状物质。

“删格”指的是一个包含开口规则的三维结构。删格被定义为它的开口在微米尺度。

“水凝胶”是指在整个体积内包含水的非流体聚合物网络。

“单层”是指具有一个尺度（高度或厚度）较小的层，即比其他尺度（长度和宽度；或直径）。就本发明而言，最小尺寸（高度或厚度）小于另一个尺度（长度和宽度；或直径）的系数至少5，10，15或20。

“纳米纤维”是指直径小于1μm的纤维。

“开口”是指从整个材料的一个面到另一个面贯穿的孔。

“孔隙度”是指开口所占整体面积的百分比。本发明中，孔隙度是指表面孔隙度。

“比面积”是指纳米纤维的投影面积与整个网格面积之比。

“悬浮培养装置”是指在液体的表面和底部两者之间培养的装置。这里悬浮代表一旦设备已经定位在液体中，装置不会下沉也不会浮到表面。

“多功能”是指实现一个或多个细胞系进行培养的材料。

详细说明

本发明是一种易于操作和多功能的细胞培养装置，包括：

包含生物相容性聚合物或由生物相容性聚合物制成的网状物；和

包含或由生物相容性聚合物制成的顶部栅格，敷设在其上的为上述网状物；

其中，

网状物是单层的交联纳米纤维，并具有特定的比面积，从20％〜40％；

顶部栅格包括单个网格和由其分开的开口阵列并具有一定宽度；

顶部栅格的开口具有相同的几何形状；

顶部栅格包括围绕开口的边界，而边界的厚度至少是所述分区的厚度的两倍。

如图1所示，细胞培养装置1包括网状物11和顶部栅格12及包括边界的顶部栅格121。本发明的网状物11由生物相容性材料制成。上述生物相容性材料可以是合成的或天然的。根据一个实施例，纳米纤维为水凝胶，优选明胶或掺杂水凝胶制成，如用碳纳米管掺杂的明胶。掺杂的水凝胶，例如用碳纳米管掺杂的明胶，增强了网状物11的导电性和机械性能。

所述网状物11是交联纳米纤维的单层。

根据一个实施例，网状物11在Z方向上的厚度在约20至约2500nm，优选从约50至约1500nm，更优选从约100至约500nm。

根据一个实施例，网状物11在Z方向上的厚度小于1μm。

根据一个实施例，细胞培养装置1仅包含纳米纤维而不包含微米纤维。

根据一个实施例，纳米纤维的直径范围为约20到约1500nm，优选约100至约500nm。

网状物11的比面积如图2c）所示。根据一位实施例，网状物11的比面积不大于40%，35%，30%或25%。根据一个实施例，网状物11的比表面不小于20%，15%或10%。

根据一个实施例，网状物11的比面积为从20%到40%。

根据申请人所述，比面积低于40%允许良好渗透性，高透明度和足够的细胞培养支持。比面积高于40%时，沉积到网状物11上细胞在不能保持物质循环的最佳状态，而比面积低于20%时网状无不能提供足够的支持用于细胞培养。

根据一个实施例，网状物11包括孔隙。根据一个实施例，超过50%孔隙的大小从约0.01μm²至约20μm²，优选至约5μm²。

根据一个实施例，所述网状物11垂直于微小尺寸的维度上（也称为平面内或x-y平面）其比面积不小于60%。

根据一个实施例，网状物11比面积如图2c）所示。

根据一个实施例，网状物11比面积不小于50%，55%60%，65%，70%或75%。

根据一个实施例，网状物11比面积不超过80%，85%或90%。

根据一个实施例，网状物11比面积从60%到80%。根据申请人所述，60%以上的孔隙率允许良好渗透性，高透明度和足够的细胞培养支持。比孔隙率低于60%时，沉积到网状物11上细胞在不能保持物质循环的最佳状态，而比孔隙率高于80%时网状无不能提供足够的支持用于细胞培养。

根据一个实施例，超过50%的所述网状物11的孔隙面积为从约0.01至约20μm²，优选至约5μm²。

本发明的顶部栅格12由生物相容性材料制成。所述生物相容性材料可以是合成的或天然的。根据一个实施例，顶部栅格12由水凝胶制成，优选聚（乙二醇）或（乙二醇）二丙烯酸酯。

所述顶部栅格12包括单个格栅和由其隔开的开口阵列分区。根据一个实施例，分区在x-y平面中具有一定宽度为约5〜500nm，优选约20μm至约100μm，更优选约50μm。

根据一个实施例，顶部栅格12在z轴范围内具有厚度为约5至约500μm，优选约40μm至约80μm，更优选约40μm至约80μm，最优约50μm。

根据一个实施例，所述顶部栅格12的每个分区具有相同的横截面，优选正方形横截面。

根据一个实施例，所述顶部栅格12可以采取任何形式，优选为圆盘。

顶部栅格12的所述开口具有相同的几何构型。

根据一个实施例，开口的所述几何构型是多边形，最好是规则的多边形，如等边三角形或正六边形（如图2a所示）。

根据一个实施例，所述开口的尺寸为约200至约1000μm。

所述顶部栅格12包括围绕开口阵列的边界121，在x-y平面中的宽度至少比所述开口分区的宽度大两倍。该所述特征使得处理本发明的细胞培养装置更容易。

根据一个实施例，所述边界121在x-y平面中的宽度至少比所述开口分区的宽度大2，4，5，10，15，20，25，50倍。

根据一个实施例，边界121在z轴范围内具有厚度为约10至约5000μm，优选约50μm至约500μm，最优选约100μm。

根据一个实施例，边界121在Z方向上具有相同的厚度。

根据一个实施例，边界121在Z方向上具有的厚度比顶部栅格12厚2至50倍。

根据一个实施例，边界121在Z方向上具有的厚度比顶部栅格12厚 2，3，4，5，10，15，20，或50倍。

根据一个实施例，所述边界121在z轴范围内具有厚度，在x-y平面内的内径在约2mm至约50mm的范围内，优选约5毫米到约20毫米，更优选约9毫米，外径在约5mm到约60mm，优选从约7mm到约25mm，更优选地约5mm到约13mm。

根据一个实施例，所述边界121与顶部栅格12由相同的材料制成。

根据一个替代实施例，所述边界121由与顶部栅格12不同的材料组成。

根据一个实施例，所述边界121包含或由水凝胶制成，优选聚（乙二醇）或聚（乙烯二醇）二丙烯酸酯。

根据一个实施例，顶部栅格12通过静电相互作用固定在纳米纤维网11上。

根据一个实施例，并如图3所示，顶部栅格12通过结合剂13固定在纳米纤维网上，优选为金。

根据一个实施例，结合剂13的厚度在z轴约为10nm。

根据一个实施例，如图3所示，顶部栅格12包括围绕开口的边界121，所述边界高度至少比所述分区高两倍。

根据一个实施例，干细胞2优选多能干细胞（PSC），例如诱导干细胞（iPSC）位于所述顶部栅格12的开口内。

根据一个实施例，培养装置1被覆盖或涂覆有糖蛋白如玻连蛋白或纤连蛋白等涂覆细胞培养装置以促进干细胞在网状物11上的粘附，优选PSC，更优选iPSC。

根据一个实施例，如前所述的至少一个细胞培养装置1可以与培养基3组合以形成细胞培养系统4。

根据一个实施例，并且如图4所示，所述至少一个细胞培养装置1，细胞培养装置1含有网状物11和包含或由水凝胶制成的顶部栅格12，细胞培养装置1，可以无需外部支持，可以悬浮在细胞培养基3内。

根据一个实施例，如图5所示，所述细胞培养系统包括一个入口，一个出口和一个微通道5，其中所述的培养基3和至少一个细胞培养装置1在微通道内。

根据一个实施例，如图6所示，由明胶制成的网状物11，通过结合剂13（金）固定到由PEGDA（聚（乙二醇）二丙烯酸酯）制成的顶部栅格12上，使得在分区物之间培养干细胞2。

另外，本发明涉及制造细胞培养装置1的方法，包括：

通过软光刻制造由水凝胶制成的顶部栅格12；

通过溅射在顶部栅格12上沉积结合剂13；

通过静电纺丝在顶部栅格12上沉积纳米纤维层；

将所述纳米纤维交联。

关于上述方法的第一步，顶部栅格12由水凝胶制成，通过软光刻，优选由聚（乙二醇）或聚（乙二醇）二丙烯酸酯制成。

根据一个实施例，水凝胶溶液，优选PEGDA溶液，填充部分由硅胶，优选聚二甲基硅氧烷（PDMS），与玻璃一起制成的印章。然后，所述水凝胶溶液暴露于UV。

根据一个实施例，所述边界121按类似的方式制备。

上述方法的可选第二步包括溅射结合剂13，如金，在任何一个x-y表面上。

根据一个实施例，顶部栅格12在一个x-y平面的一面上具有边界121，而金被溅射在x-y平面具有边界121的另一面上。

根据一个实施例，顶部栅格12不具有边界121，结合剂13溅射在顶部栅格12x-y平面的任何表面上。

根据一个实施例，结合剂13的厚度在Z方向上的是大约10nm。

上述方法的可选第三步是通过静电纺丝，在顶部栅格12在一个x-y平面上沉积纳米纤维层，优选由水凝胶，更优选明胶制成。

根据一个实施例，通过调整静电纺丝参数及静电纺丝时间，可以控制纳米纤维单层特定表面或孔隙率和孔尺寸。

上述方法的最后一步是纤维交联。

根据一个实施例，纳米纤维通过交联剂交联。

根据一个实施例，考虑到生物相容性，交联剂选自双组分体系，包含碳化二亚胺和琥珀酰亚胺，优选EDC（1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺）和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）。

根据一个实施例，纳米纤维通过将其表面浸泡再交联溶液中交联。

根据一个实施例，所述交流溶液为（1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺）和NHS（NH-羟基琥珀酰亚胺）的乙醇溶液。

根据一个实施方式，纳米纤维不通过自由基交联。

根据申请人所述，以现有技术静电纺丝制成的纳米纤维层交联后具有减薄效果，并且可以达到与单层相当的厚度。

有利的是，所述的交联纳米纤维的方法不引入任何自由基。

交联的纳米纤维不包含任何自由基，使生物相容性聚合物避免了对细胞的破坏。

所述的交联纳米纤维的过程是通用的。

事实上，本发明的过程允许交联任何生物相容性聚合物纳米纤维，只要该聚合物同时具有羧基和氨基；特别是，本发明的方法允许交联来自任何生物相容性聚合物的纳米纤维，而不需要在交联前改变所述聚合物的化学结构。

有利的是，该交联单层纳米纤维的过程会形成由纳米纤维相互连接制成的网状结构。

本发明还提供了通过所述方法获得的细胞培养装置。

本发明还涉及干细胞生长和干细胞分化的方法，包括以下步骤：

提供根据权利要求1至10中任一项所述的细胞培养装置；

该设备在紫外线下灭菌；

细胞培养装置1可以用一种糖蛋白，如：

纤连蛋白或玻连蛋白；

在顶部栅格12的开口内接种至少一种类型的干细胞装置在任何含有Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂的培养基中；

可选地，去除ROCK抑制剂。

附图简要说明

图1是本发明的一个实施例中，细胞培养装置1在z轴上的截面示意图。

图2是本发明的一个实施例中，在x-y平面上的SEM图像的多尺度分析图，即从顶部栅格放大到单层纳米纤维，图2a是顶部栅格12的视图，图2b是顶部栅格12的一个开口的视图，图2c是纳米纤维单层11的视图。

图3按本发明的一个实施例中，细胞培养装置1的z轴的截面图，显示了纳米纤维网状物11和顶部栅格12之间的结合剂。

图4是本发明的一个实施例中，细胞培养系统4的截面图，包括悬浮在细胞培养基3中的细胞培养装置1，用于培养干细胞2。

图5是本发明的一个实施例中，细胞培养系统4的截面图，包括悬浮在细胞培养基3中的细胞培养装置1，用于培养干细胞2，干细胞培养基通过微通道5进入。

图6是本发明的一个实施例中，细胞培养装置1的俯视图（A），全局剖视图（B）和局部剖视图（C），包括PEGDA删格12和边界121，一层结合剂金13和一层单层明胶纳米纤维11，其中干细胞2粘附在单层明胶纳米纤维11上。

图7显示了三个尺度的SEM图像（a：顶部栅格尺度，b：顶部栅格的开口尺度和c：纳米纤维层）的三个不同静电纺丝时间（从7到30分钟）的单层明胶纳米纤维11，交联的纳米纤维表面具有显着的区别。

图8是两种明胶纳米纤维单层11的孔径的直方图，其孔径取决于静电纺丝时间，静电纺丝时间7分钟（a）的大部分孔从大约0到大约20μm²，静电纺丝时间15分钟（b）的大部分孔从大约0到大约5μm²。

图9是NIH-3T3和HeLa细胞的明场（BF），荧光图像：鬼笔环肽为细胞骨架F-actin和DAPI为核，并有合并图像。

图10为根据本发明的一个实施例的培养装置（黑色曲线）和正常培养皿（灰色曲线）上培养NIH-3T3细胞72小时，细胞数量增加的曲线，显示细胞增殖速率存在显著差异。

图11为一个PEGDA格子的开口中心形成的hiPSC克隆的显微照片，显示其均匀分布和圆顶状形态。

图12是明场照片，hiPSC克隆的SEM图像和显示了菌落直径分布的直方图。PEGDA格子的开口中心形成的hiPSC克隆，呈现圆顶状和圆盘状的形态，可以通过改变ROCK抑制剂处理的时间来控制。

图13是在PEGDA栅格的开口中心形成的hiPSC克隆的荧光和明场图像，显示hiPSC的大部分是存活的。

图14是hiPSC克隆在PEGDA /纳米纤维单层网状物上分化为心肌的示意图。接种细胞后，使用ROCK抑制剂处理，可使hiPSC克隆在每一个PEGDA格子的开口中心形成。随后，添加心脏分化因子后获得心肌细胞。

图15是在PEGDA栅格和单层纳米纤维制成的细胞培养装置上hiPSC分化心肌的步骤示意图。

图16是在PEGDA栅格开口中心形成的hiPSC分化心肌细胞的荧光图像（DAPI，ɑ-actinin，cTnT2），表明形成了肌节结构。

图17是在PEGDA栅格开口中心形成的hiPSC分化为运动神经元祖细胞的荧光图（DAPI，Olig2和Tubulin），表明相对较高分化率。

图18是本发明的一个实施例中，一个细胞培养装置1的俯视图照片。

标记

1—细胞培养装置

11—网状物

12—顶部栅格

121—边界

13—结合剂

2—干细胞

21—hiPSC克隆

3—培养基

4—细胞培养系统

5—微通道。

实施例

以下讨论提出了本发明某些非限制性实施例，包括本发明的方法，装置和系统。本领域的普通技术人员可以认识到，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。

通过以下实施例进一步说明本发明的装置或用途：

材料与方法

SEM观察

样品用含有4％甲醛的PBS中固定30分钟。然后用PBS缓冲液冲洗两次，浸入30％乙醇（在蒸馏水（DI）中）中30分钟。之后，将样品用乙醇分级系列脱水，分别为50％，70％，80％，90％，95％和100％，每个10分钟，并用氮气流干燥。在观察之前，2纳米厚的金层通过溅射沉积在样品上。扫描电子显微镜（Hitachi S-800）在10kV下观察样品。

免疫荧光染色和观察

首先，圆顶状hiPSC克隆用含有4％v/v多聚甲醛室温固定30分钟后，用0.5％v/vTriton X-100（在磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中）在4℃过夜通透化后，用含有5％v/v正常山羊血清，5％v/v正常驴血清，3％v/v牛血清白蛋白和0.1％v/v吐温20的DPBS溶液的封闭溶液，在4℃过夜封闭。细胞随后与0.5v/v％Triton X-100的DPBS溶液中含有一抗（即抗OCT4（2μg/ mL），抗NANOG）孵育（9.4μgmL-1），抗SOX17（20μgmL-1），抗微管蛋白III（6μg/ mL）或抗α平滑肌肌动蛋白（2μg/ ml））过夜孵育。与一抗孵育与，再与封闭液中含有相应二抗，如DyLight-649抗兔IgG（0.375或3μg/ mL）或DyLight-488抗小鼠IgG（1.5μgmL-1），室温封闭1小时。最后，细胞核用300nM的4_6-二脒基-2-苯基吲哚5（DAPI）在室温染色30分钟。纳米纤维单层上分化的心肌细胞先用含有4％v/v多聚甲醛室温固定15分钟。然后将细胞用0.2％Triton X-100的 DPBS渗透1小时，然后加入1％牛血清白蛋白（BSA）的DPBS中在4℃过夜以阻断非特异性结合。之后，将细胞与抗-A-肌动蛋白（肌节）和抗TnnT2的一抗一起4°C过夜孵育。

再将细胞用DPBS洗涤3次，每次5分钟。然后，将细胞浸入含驴抗小鼠cy3和驴抗山羊cy5的二抗中，暗处室温孵育1.5小时。细胞清洗后，细胞核用300nM的4_6-二脒基-2-苯基吲哚5（DAPI）在室温染色15分钟后再将细胞用DPBS洗涤3次，每次5分钟。

最后，最后用组织学封片剂（Sigma，Fluoroshield TM，F6182）封片。用配备数码CCD相机（Evolution QEI）的倒置光学显微镜（Zeiss，Axiovert200）获得荧光图像。

活/死检测

通过活/死检测来研究细胞活力。简言之，将2μMCalcein AM和2μMEthD-1分别加在纳米纤维单层具有圆顶状iPS细胞团上。在37℃和5％CO 2下孵育30分钟后，如上所述的细胞用荧光显微镜分析。细胞活力为活细胞数除以细胞总数。

示例1：栅格掩模制造过程

正六边形网络阵列的铬掩模由微型图案生成器（μPG101，海德堡仪器公司）制造。正六角形在x-y平面上有周期约为500μm的正六边形的开口并有线宽度约为50μm的分区。之后，将PDMS-玻璃组件置于干燥器中进行除气15分钟。

示例2：PEGDA栅格制造工艺

将PEGDA溶液与1 v/v％Irgacure 2959（1-[4-（2-羟基乙氧基）-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮）溶液混合。所述溶液倒入中玻璃载玻片上的PDMS开口处并通过除气引起的微吸气吸，然后是UV光以9.1 mW /cm²曝光30 s。PDMS模具剥离，而PEGDA网络固化。约100μm厚的PEGDA边界（外径13毫米，内径9毫米）以类似的方式制备。

示例3： PEGDA网格上明胶纳米纤维静电纺丝工艺

将10wt％明胶粉末（G2625，Sigma-Aldrich，法国）的溶液溶解于乙酸，乙酸乙酯和蒸馏水的混合物，体积比为21:14:10。静电纺丝前16小时制备溶液。在PEGDA格栅的一个x-y表面溅射约10nm厚的Au以增强明胶纳米纤维在PEGDA栅格上的粘附。具有Au层的PEGDA栅格被放置在硅晶圆上用作收集器。将明胶溶液装入注射器中，通过使用注射泵（KD Scientific），在距离所述收集器在约10cm处，以0.2ml/h的速度通过喷丝头不锈钢23号针头排出溶液。

喷丝头连接到高压电源的阳极（TechDempaz，日本），偏置电压为11KV，收集器连接到负极。静电纺丝后，将样品真空干燥过夜除去的剩余溶剂。之后，电纺的明胶纳米纳米纤维浸入含有0.2M EDC（1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳化二亚胺）和0.2M NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）的乙醇溶液交联反应4小时。交联后，样品用乙醇冲洗三次并真空干燥来摆脱剩余的化学物质，最后得到PEGDA蜂窝结构支撑的单层纳米纤维。

通过该工艺得到的明胶纳米纤维的直径范围为100-500nm。在其他条件不变的情况下，为了优化纳米纤维层的特定表面和开口，使用了不同的静电纺丝时间。三个不同静电纺丝时间：7分钟，15分钟和30分钟。纳米纤维单分子膜的特定表面的SEM图像如图7所示。静电纺丝7分钟和15分钟，可获得单层纳米纤维。静电纺丝时间为30分钟或以上，无法获得单层纳米纤维且纤维之间几乎没有孔。孔径大小由ImageJ软件分析静电纺丝时间为7分钟和15分钟的SEM图像，结果如图8所示。静电纺丝时间7min和15min的孔隙率分别为约79.8±0.8％和约63.65±1.35％。两个都足够透明，且可用于最后的悬浮培养体系。静电纺丝7min，大部分孔隙面积为0〜20μm²，其中有些甚至超过100μm²，这对细胞来说太大了。纺丝15min的孔隙主要小于5μm²，几乎不超过20μm²，可以保持高透明度和足够的细胞培养支持。

示例4：HeLa和NIH 3T3细胞离底培养

NIH 3T3细胞悬浮液的制备：将NIH 3T3细胞在37℃，5％CO 2下培养5在补充有10％胎儿牛血清（FBS，Bioscicence），1％谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素（P / S）（GIBCO）的达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM，Sigma）中直到细胞长满。用0.25％胰蛋白酶-EDTA（GIBCO）中解离后离心，以1×10⁶个mL-1的细胞密度重悬细胞。

装置准备：在细胞接种之前，明胶纳米纤维和PEGDA制成的细胞培养装置，在紫外线照射下灭菌30分钟以上。用0.1M NaHCO₃溶液（pH=8）中含有50μg/ mL浓度的纤连蛋白（FN）（Sigma，France）在37℃下包被细胞培养装置30分钟。然后将该装置置于培养皿中并悬浮于细胞培养基中，培养基加到微通道中。

使用本发明装置的离底细胞培养：细胞悬液（200μL）加入到细胞培养系统的开放区域。 30分钟孵育后，将更多的培养基添加到培养皿中。没有任何表面孵育，HeLa和NIH3T3细胞可以在2小时内粘附到纳米纤维上。图9显示了使用本发明的装置培养的NIH-3T3和HeLa细胞的免疫荧光图像及合并三个图像获得的图像。对于这两种细胞，细胞骨架和核分别用鬼笔环肽-FITC和DAPI染色。从明场（BF）显微镜获得的图像也被显示出来。由于PEGDA不能吸附蛋白质，几乎没有细胞固定在PEGDA网格上，这表明可以通过简单改变PEGDA网格的形状来改变细胞图案。

然后，本发明人使用本发明的装置比较了本发明和一个正常的培养皿中NIH-3T3细胞的倍增时间。如图10所示，每天使用血细胞计数器，将消化细胞计数共4天，黑线为使用本发明和灰线为使用正常的培养皿。经过计算，使用本发明装置的细胞倍增时间为15.01小时，比使用正常培养皿（19.79小时）时间短，且使用本发明装置的细胞增殖速度为0.046，比使用正常培养皿（0.0350）快。这表明用这种悬浮培养方法可以提高细胞的增殖率。本发明的装置允许三维方向上供应细胞营养，而不仅仅使用正常的培养皿在单边供应细胞营养。

示例5：hiPSCs培养

hiPSC的制备：人诱导多能干细胞用玻连蛋白（life technology）包被的培养皿及完全制备E8培养基（生命技术）于37°C，5％的二氧化碳下进行培养。培养基每天更换直到细胞生长到70％〜80％汇合。然后，用5uM EDTA DPBS解离细胞。

装置准备：为促进hiPSCs在明胶纤维上的粘附，培养装置（PEGDA格栅和明胶纳米纤维）在37℃下用1：500的比例稀释的玻连蛋白在室温下包被1小时。然后，将该装置放置在培养皿中用于细胞接种。

hiPSCs培养：将含有10μM ROCK抑制剂（Y-27632； Wako Chemicals）hiPSC细胞密度为2×10⁵的50μLE8培养基，铺在细胞培养装置表面上。然后将细胞培养装置置于培养箱中1小时，从而允许细胞贴壁。然后，轻轻地将2mL含有10μMROCK抑制剂的新鲜E8培养基加入细胞培养系统。 ROCK是调节下游效应蛋白，通过抑制肌动蛋白丝解聚和重塑肌动蛋白细胞骨架来控制细胞粘附和迁移[WORTHYLAKE等人，J.Bio。Chem，2003]。因此，抑制ROCK能促进细胞收缩和整合素介导的粘附，也防止解离诱导细胞凋亡并促进胚胎干细胞和诱导的多能干细胞生存[WATANABE等，Nature生物技术，Biotech.2007]。培养一段时间后，培养基被不含ROCK抑制剂的E8培养基代替。24小时后，hiPSC聚集体的形成圆顶状形态以确定的最佳培养条件。

hiPSCs克隆的形状控制：iPSCs可以在明胶纳米纤维上的PEGDA格栅的开口的中心处紧密聚集形成胚胎体，在PEGDA栅格上没有发现细胞，如图11所示。低浓度VN包被不足以在明胶纳米纤维保持hiPSC克隆。ROCK抑制剂处理细胞1小时内，hiPSC聚集体可以粘附到单层明胶纳米纤维，显示出来直径为250μm的圆顶状hiPSC聚集体。如从图12的图像看到的那样，随着ROCK抑制剂处理时间的延长，纳米纤维上的粘附性增强，聚集体直径增加而圆顶高度降低。2小时后，聚集体的圆顶状形态仍然保留。统计学上，ROCK抑制剂处理1或2小时，hiPSC克隆的平均直径为约220至230μm。当ROCK抑制剂处理超过4h时，克隆会呈盘状。为了评估单层明胶纳米纤维上的hiPSC克隆的生存力，圆顶状聚集体再培养两天以上，细胞用Calcein AM和EthD-1进行活/死检测。如图13所示，差不多hiPSC克隆的所有细胞都活着，只有少数死亡细胞在克隆之外，说明明胶纳米纤维单层上细胞存活率高。这个培养步骤在图14的第一步中示意性地描述。

示例6：hiPSC分化成心肌细胞

EBs（胚状体）产生24小时后，根据[LIAN等人，Nature Protocol，2013]的方案进行心脏分化。这个过程在图14的最后一步示意性地描述。简而言之，E8培养基用不含胰岛素但具有12μM CHIR99021（GSK3抑制剂）RPMI 1640 / B27培养基替换。培养24小时后，将培养基替换为不含CHIR99021的RPMI1640 / B27（第1天）。再培养48小时后，培养基替换为不含胰岛素但具有5μMIWP2（第3天）的RPMI 1640 / B27。再培养48小时后，将培养基替换为不含IWP2的RPMI 1640 / B27的培养基（第5天）。然后，培养基（RPMI / B27）每三天更换一次。通常，在8天至12天期间观察到细胞的收缩。

单层纳米纤维上的心肌细胞分化：对于心脏分化，由于与内胚层衍生物的相互作用诱导心肌形成，使用圆顶状的hiPSC可能更有利。hiPSC的心肌分化是通过使用圆顶状克隆而不改变单层的纳米纤维来实现的。不同步骤和每个步骤的SEM图像如图15所示。

15.培养2天后，将GSK3抑制剂引入使得细胞诱导进入中内胚层（胚胎组织层）分化。在这个阶段，克隆有几乎相同的形状。随后3天，加入Wnt（糖蛋白家族）信号抑制剂进行诱导其分化为心脏祖细胞。逐渐地，克隆变得不那么紧凑。随后的5天，观察到克隆扩散和细胞簇的跳动。如图16所示，最终观察到肌节的形成，说明纳米纤维单层上的心肌细胞的成熟。

示例7：hiPSC向运动神经元祖细胞分化

对于神经外胚层诱导，在单层明胶纳米纤维上培养的iPSC，按照[SUN等人Naturematerials，2014]，用含有NEAA，Glutamax，LDN1931189，SB431542和bFGF的人神经诱导DMEM/ F12培养基进行培养。在初始诱导3天后，N2培养基每两天逐渐增加。神经外胚层细胞可以在第8天获得。在视黄酸和SHH存在下连续8天处理细胞，每两天更换一次，可促使分化为运动神经元。运动神经元祖细胞可以在第16天收获。如图17所示，在单层明胶纳米纤维的孔隙中可以获得运动神经元祖细胞。

Claims

1.一种易于操作和多功能的细胞培养装置（1），包括

包含生物相容性聚合物或由生物相容性聚合物制成的网状物（11）和敷设在网状物（11）上、包含生物相容性聚合物或由生物相容性聚合物制成的顶部栅格（12）；

其特征在于：

所述的网状物（11）是单层的交联纳米纤维，并具有20%〜40%的比面积；

所述的顶部栅格（12）包括单独的网格和被具有宽度的分区分隔的开口阵列，所述的每个开口具有相同的几何结构；

所述的顶部栅格（12）还包括围绕所有开口的边界（121），所述的边界（121）厚度是所述分区厚度的至少两倍。

2.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，所述开口的几何形状是一个多边形。

3.根据权利要求1或2所述的细胞培养装置，其特征在于，每个分区分开开口的顶部格栅（12）具有相同的横截面。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞培养装置，其特征在于，所述顶部栅格（12）具有比顶部栅格（12）的分区更厚的边界（121）。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞培养装置，其特征在于，还包括：顶部栅格（12）和网状物（11）之间的结合剂（13）。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞培养装置，其特征在于，所述的网状物（11）超过50%的孔面积约为0.01〜20μm²。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的细胞培养装置，其特征在于，顶部栅格（12）的开口具有范围从大约200到大约1000μm的尺寸。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞培养装置，其特征在于，网状物（11）的交联纳米纤维优选包含水凝胶或由水凝胶制成；或者，包含掺杂的水凝胶，优选掺杂有碳纳米管的明胶。

9.根据权利要求1至8任意一项所述的细胞培养装置，其特征在于，所述的顶部栅格（12）包含水凝胶或由水凝胶制成，优选聚（乙二醇）或聚（乙二醇）二丙烯酸酯。

10.根据权利要求1至9任意一项所述的细胞培养装置，其特征在于，还包括位于所述顶部栅格（12）的开口内的干细胞（2）。

11.一种细胞培养系统，其特征在于：包括至少一个如权利要求1至10中任一项所述的细胞培养装置（1）和培养基（3）。

12.根据权利要求11所述的细胞培养系统，其特征在于：所述细胞培养装置（1）的网状物（11）和顶部栅格（12）包括水凝胶或由水凝胶制成，使得至少一个细胞培养装置（1）可以悬浮在细胞培养基（3）中。

13.根据权利要求11或12所述的细胞培养系统，其特征在于：还包括进口，出口和微通道（5），所述的培养基（3）和所述至少一个细胞培养装置（1）包含在微通道（5）内。

14.一种制造细胞培养装置的方法，其特征在于：包括以下步骤：

通过软光刻生产由生物相容性聚合物制成的顶部栅格（12）；

通过溅射将结合剂（13）沉积在顶部栅格（12）上；

通过静电纺丝在顶部栅格（12）的网格上沉积纳米纤维层；

将所述纳米纤维交联。

15.干细胞生长或分化的方法，基于权利要求1至10中任一项所述的细胞培养装置，其特征在于，包括以下步骤：

用糖蛋白覆盖住细胞培养装置（1）；

在顶部栅格（12）的开口内接种至少一种类型的干细胞（2）；

将细胞培养装置（1）置于含有ROCK抑制剂的培养基（3）内培养；和

可选地，去除ROCK抑制剂。